PROCESI ODSTRANJEVANJA ANTIBIOTIKOV IZ BOLNIŠNIČNIH ODPADNIH VOD

Velikost: px
Začni prikazovanje s strani:

Download "PROCESI ODSTRANJEVANJA ANTIBIOTIKOV IZ BOLNIŠNIČNIH ODPADNIH VOD"

Transkripcija

1 Doktorska disertacija PROCESI ODSTRANJEVANJA ANTIBIOTIKOV IZ BOLNIŠNIČNIH ODPADNIH VOD April, 2018 Severina Stavbar

2 Severina Stavbar PROCESI ODSTRANJEVANJA ANTIBIOTIKOV IZ BOLNIŠNIČNIH ODPADNIH VOD Doktorska disertacija Maribor, 2018

3 Procesi odstranjevanja antibiotikov iz bolnišničnih odpadih vod Doktorska disertacija Študent: Študijski program: Študijska smer: Predvideni znanstveni naslov: Mentor: Komentor: Komentor: Severina Stavbar (rojena Aleksić) doktorski študijski program III. stopnje Kemija in kemijska tehnika Kemijska tehnika doktor/ica znanosti red. prof. dr. Sonja Šostar Turk izr. prof. dr. Mitja Kolar doc. dr. Maša Knez Hrnčič Maribor, 2018

4 MENTORSTVO Doktorska disertacija je nastala pod mentorstvom: MENTOR: red. prof. dr. Sonja Šostar Turk Univerza v Mariboru, Fakulteta za zdrastvene vede Univerza v Mariboru, Fakulteta za strojništvo KOMENTOR: izr. prof. dr. Mitja Kolar Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo KOMENTOR: doc. dr. Maša Knez Hrnčič Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo DELOVNI MENTOR: Katarina Premzl Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano, Maribor

5 Delo smo opravljali v: - Laboratoriju za separacijske procese in produktno tehniko, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, - Laboratoriju za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, - Laboratoriju za analizno kemijo, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologji, Univerza v Ljubljani, - Nacionalnem laboratoriju za zdravje, okolje in hrano, Oddelek za analitiko vod, Maribor, - Mikrobiološkem laboratoriju, Fakulteta za zdravstvene vede, Univerza v Mariboru.

6 Kazalo Kazalo... I Zahvala... IV Povzetek... V Abstract... VII Seznam tabel... IX Seznam slik... X Uporabljeni simboli in kratice... XII 1 Uvod Opredelitev problema Namen in cilji Namen doktorske disertacije Cilji doktorske disertacije Teze doktorske disertacije Predpostavke in morebitne omejitve Teoretični del Antibiotiki Amoksicilin Ciprofloksacin Uporaba antibiotikov v humani medicini Pojavnost antibiotikov v odpadnih vodah Metode naprednega čiščenja antibiotikov iz vodnih vzorcev Napredni oksidacijski procesi Ozonacija napredni oksidacijski postopek Aerobna biološka obdelava Analizne metode za zaznavanje antibiotikov v odpadnih vodah Ekstrakcija antibiotikov iz okoljskih vodnih vzorcev Kromatografske metode za določanje antibiotikov Kvantifikacija analitov z LC-MS/MS Eksperimentalni del Materiali Priprava sintetične odpadne vode I

7 3.1.2 Realna bolnišnična odpadna voda Postopek odstranjevanja s sub- in super-kritično oksidacijo Aparature Opis postopka eksperimenta odstranjevanja Določevanje procesnih parametrov Postopek čiščenja z ozonacijo Aparature Izvedba poskusa Določanje procesnih parametrov Postopek čiščenja z aerobnim reaktorjem Zagon aerobnega reaktorja in pretok eksperimenta Določanje procesnih parametrov Test inhibicije porabe kisika z aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija Aparature Priprava reagentov Postopek izvedbe Tekočinska kromatografija Kemikalije in reagenti Standardne raztopine antibiotikov Instrumentalna oprema Kromatografski pogoji Priprava standardnih raztopin in analiza vzorcev Instrumentalni pogoji Rezultati in diskusija Oksidacija v sub- in super-kritični vodi Določanje KPK in TOC Ozonacija odpadne vode Aerobni pretočni reaktor Test toksičnosti Določanje z LC-MS/MS metodo Izbira kolone na tekočinskem kromatogramu Optimizacija parametrov na masnem detektorju Linearnost kalibracijske krivulje II

8 4.6 Odstranjevanje antibiotikov iz realnega vzorca bolnišnične odpadne vode Ekstrakcija na trdni fazi Toksičnost realne bolnišnične odpadne vode Sklep Literatura Priloge Kromatogram amoksicilina in ciprofloksacina LC/MS/MS parametri za detekcijo amoksicilina in ciprofloksacina Procesni parametri sub in super kritične oksidacije ter koncentracije amoksicilina in ciprofloksacina po 2 h čiščenju Učinek različnih koncentracij H2O2 na vrednosti TOC v procesu ozonacije TOC koncentracija v procesu ozoniranja pri ph = 3,70, ph = 10,85 z dodatkom H2O2 in pri ph = 10, Koncentracija amoksicilina v realni bolnišnični odpadni vodi po čiščenju Koncentracija ciprofloksacina v realni bolnišnični odpadni vodi po čiščenju Življenjepis Znanstvena bibliografija kandidata Izjava doktorskega kandidata III

9 Zahvala Iskreno se zahvaljujem mentorici, red. prof. dr. Sonji Šostar Turk, somentorju izr. prof. dr. Mitji Kolarju in somentorici doc. dr. Maši Knez Hrnčič za zanimivo temo doktorske disertacije, zaupanje, vzpodbudo, pomoč, koristne nasvete ter posebno podporo med mojim doktorskim študijem. Zahvaljujem se tudi Katarini Premzl, za vso pomoč pri opravljanju laboratorijskega dela, znanje, strokovne nasvete, pozitivno razmišljanje, predvsem pa za sproščeno delovno vzdušje. Zahvala gre tudi doc. dr. Darji Pečar, izr. prof. dr. Andreji Žgajnar Gotvajn in doc. dr. Gabrieli Kalčikovi za vso pomoč pri laboratorijskem delu, za prejeto znanje in strokovne nasvete. Rada bi se zahvalila tudi Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS), ki mi je s svojim financiranjem v okviru programa Mladi raziskovalec omogočila izvedbo doktorske disertacije. Iz vsega srca se zahvaljujem družini in prijateljem. Posebno se zahvaljujem svojemu čudovitemu možu in staršema, ki so me ne glede na ves moj čas in trud, ki ga je bilo potrebno žrtvovati pri izdelavi te doktorske disertacije, vedno podpirali in verjeli vame. IV

10 Povzetek Ostanki antibiotikov in drugih zdravil postajajo vse resnejši problem, saj jih najdemo v izpustih iz farmacevtskih in proizvodnih obratov, bolnišnic in v odplakah iz čistilnih naprav. Različne študije so pokazale, da so ostanki antibiotikov prisotni v odpadnih in površinskih vodah, zadnje študije pa kažejo trend zviševanja tudi v tleh, podtalnici ter pitni vodi. Čeprav so izmerjene koncentracije v širokem koncentracijskem območju od ng/l do µg/l, so lahko nekateri razgradni produkti aktivnih snovi celo bolj toksični kot izvorna snov. Predhodne študije so pokazale, da so najvišje koncentracije antibiotikov v bolnišničnih odpadnih vodah. Za odstranitev takšnih onesnaževal pa obstoječe čistilne naprave niso primerne, saj velike količine antibiotikov ostajajo v vodi tudi po čiščenju. V doktorski disertaciji so predstavljeni trije procesi odstranjevanja teh onesnaževal iz bolnišničnih odpadnih vod. Glavni namen je bil poiskati napredne, izvedljive metode za odstranitev izbranih antibiotikov iz bolnišnične odpadne vode. V prvem delu smo se osredotočili na postopek čiščenja s sub in super-kritično oksidacijo, kjer smo preučili procesne parametre: vpliv temperature, tlaka, pretoka in časa na odstranitev izbranih antibiotikov. V drugem delu smo izvedli postopek ozonacije, kjer smo spremljali učinkovitost čiščenja odpadne vode s spreminjanjem ph vzorca, različnimi odmerki ozona ter dodatkom vodikovega peroksida (H2O2). V tretjem delu smo za čiščenje sintetično pripravljene bolnišnične odpadne vode uporabi aerobni reaktor, kjer smo iskali optimalen bivalni čas. Vsebnost antibiotikov smo po vsaki metodi čiščenja določali z ekstrakcijo na trdni fazi v povezavi z optimirano LC-MS/MS analizno tehniko. V zadnjem delu doktorske disertacije smo omenjene postopke čiščenja implementirali na realnem vzorcu bolnišnične odpadne vode. Vsebnost antibiotika v realnem vzorcu pred in po čiščenju smo določali z LC-MS/MS tehniko. Na koncu smo izvedli še test inhibicije porabe kisika z aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija, s katerim smo poskušali ugotoviti toksičen vpliv očiščene vode na mikroorganizme v aktivnem blatu. Rezultati so pokazali, visoko učinkovitost odstranitve amoksicilina in ciprofloksacina do kar 90 %, s pomočjo super kritične oksidacije ter z ozoniranjem z dodatkom H2O2. Prav tako, smo dokazali, da se je v vzorcu realne bolnišnične odpadne vode, toksičnost zmanjšala, med vsemi predlaganimi procesi čiščenja. V

11 Ključne besede: Antibiotiki, bolnišnična odpadna voda, sub kritična oksidacija, super kritična oksidacija, ozonacija, aerobni reaktor, LC-MS/MS, test toksičnosti. UDK: 577.1:351.77(043.3) VI

12 Abstract The residues of antibiotics and other medicines are becoming an increasingly serious problem because they can be found in discharges from pharmaceutical and manufacturing plants, hospitals and sewage from treatment plants. Various studies showed that antibiotic residues are present in wastewaters and surface waters, and recent studies show their increase in ground water, drinking water and in the soil. Although the measured concentrations are in a wide range from ng/l to µg/l, some degradation products of the active substances may be even more toxic than the parent substance. Preliminary studies have shown that the highest concentrations of antibiotics are found in hospital wastewater. For removing such pollutants existing treatment plants are not suitable, as large amounts of antibiotics remain in the water after cleaning. The doctoral dissertation presents three processes for removing these pollutants from hospital wastewater. The main purpose was to find advanced, feasible methods for the removal of selected antibiotics from hospital wastewater. In the first part, we focused on the process of purification with sub and super-critical oxidation, where we examined the process parameters: the influence of temperature, pressure, flow and time on the concentration of selected antibiotics. In the second part, we carried out the ozonation process, where we monitored the efficiency of wastewater treatment by changing the ph of the sample, the different ozone doses, and the addition of hydrogen peroxide (H2O2). In the third part, the aerobic reactor was used to clean synthetically prepared hospital wastewater, where we were looking for an optimal residence time. The antibiotic content was determined after each purification method with optimized LC-MS/MS analytical techniques. In the last part of the doctoral dissertation, all the mentioned cleaning procedures were implemented on a realistic sample of hospital wastewater. The antibiotic content in the real sample before and after purification was determined by solid phase extraction in conjunction with the optimized LC-MS/MS technique. Finally, an oxygen consumption test with an activated sludge for the oxidation of carbon and ammonia was carried out, with which we attempted to determine the toxic effect of purified water on microorganisms in the active mud. The results showed the high efficacy of amoxicillin removal in ciprofloxacin up to as much as 90% by means of super critical oxidation and ozonation. We have also proved that in the VII

13 sample of real hospital wastewater, toxicity has decreased, among all the proposed purification processes. Key words: Antibiotics, Hospital wastewater, Sub critical oxidation, Super critical oxidation, Ozonation, Aerobic reactor, LC-MS / MS, Toxicity test UDK: 577.1:351.77(043.3) VIII

14 Seznam tabel Tabela 2-1: Pomembni razredi in skupine antibiotikov glede na njihovo kemijsko zgradbo.. 9 Tabela 2-2: Količina porabe antibiotikov v Državah Evropske Unije med leti 2012 in 2016 (izražena kot DDD na 1000 prebivalcev na dan) Tabela 2-3: Antibiotiki visoke ekotoksikološke nevarnosti in njihove najvišje koncentracije (µg/l) v vzorcih vode v svetu Tabela 2-4: Lastnosti vode pri različnih tlakih in temperaturah Tabela 3-1: Priprava sintetične odpadne vode Tabela 3-2: Procesni parametri aerobnega čiščenja sintetične odpadne vode Tabela 3-3: Volumni raztopin za pripravo delovnih standardnih raztopin Tabela 3-4: Koncentracije antibiotikov v koncentracijskih nivojih Tabela 3-5: Optimalne vrednosti pogojev Tabela 4-1: Koncentracija TN, NH4 in NO3 pri eksperimentu slepe probe Tabela 4-2: Inhibicija vodnih mikroorganizmov pri različnih koncentracijah antibiotikov Tabela 4-3: Optimalni pogoji DP, CE, CXP za standarde Tabela 4-4: Rezultati optimizacije celotne metode Tabela 4-5: Uporabljeni gradient pri vpeljani metodi Tabela 4-6: Potek stopenj ekstrakcije na kolonah IX

15 Seznam slik Slika 1-1: Potencialna vstopna mesta zdravilnih učinkovin v okolje Slika 2-1: Strukturna formula amoksicilina Slika 2-2: Strukturna formula ciprofloksacina Slika 2-3: Fazni diagram vode s prikazano trojno točko (TP), točko vrelišča (BP) in kritično točko (CP) Slika 2-4: Spremembe (a) gostote vode, (b) dielektrične konstante, (c) ionskega produkta, (d) toplotna kapaciteta v temperaturnem območju od 0 o C do 700 o C pri tlakih 250 bar, 500 bar in 1000 bar Slika 3-1: Shematski prikaz visokotemperaturnega in visokotlačnega reaktorja Slika 3-2: Visokotemperaturni in visokotlačni reaktor Slika 3-3: Biološki aerobni pilotni reaktor Slika 4-1: Vpliv temperature na koncentracijo antibiotikov pri qv = 3 ml/min in p = 250 bar Slika 4-2: Vpliv temperature na koncentracijo antibiotikov pri qv = 5 ml/min in p = 250 bar Slika 4-3: Zmanjšanje vrednosti KPK v odvisnosti od časa Slika 4-4: Zmanjšanje vrednosti TOC v odvisnosti od časa Slika 4-5: TOC koncentracija in koncentracija amoksicilina/ciprofloksacina pri ph = 3, Slika 4-6: TOC koncentracija in koncentracija amoksicilina/ciprofloksacina pri ph = 10,85 z dodatkom H2O Slika 4-7: TOC koncentracija in koncentracija amoksicilina/ciprofloksacina pri ph = 10, Slika 4-8: Učinek različnih koncentracij H2O2 na zmanjšanje TOC v procesu ozonacije Slika 4-9: Kromatogrami vzorcev ciprofloksacina (levo) in amoksicilina (desno), odvzetih med postopkom ozonacije Slika 4-10: Vpliv različnih koncentracij ozona na vsebnost TOC Slika 4-11: Vsebnosti KPK na vtoku in iztoku X

16 Slika 4-12: Učinek čiščenja v odvisnosti od časa Slika 4-13: Določanje vsebnosti 24hEC50 z metodo najmanjših kvadratov Slika 4-14: Kromatografski vrhovi amoksicilina in ciprofloksacina z ASCENTIS Express C18 kolono Slika 4-15: Kromatografski vrhovi amoksicilina in ciprofloksacina s Synergie Fusion RP 100 A kolono Slika 4-16: Kromatografski vrhovi amoksicilina in ciprofloksacina s Kinetex XB-C A kolono Slika 4-17: Umeritvena krivulja amoksicilina Slika 4-18: Umeritvena krivulja ciprofloksacina Slika 4-19: Zmanjšanje toksičnosti na aktivno blato pri različnih metodah razgradnje antibiotikov Slika 4-20: Spremembe koncentracije TOC vzorca realne bolnišnične odpadne vode s časom pri različnih procesih Slika 4-21: Spremembe koncentracij amoksicilina v vzorcu realne bolnišnične odpadne vode s časom pri različnih vrstah procesov razgradnje antibiotika Slika 4-22: Spremembe koncentracij ciprofloksacina v vzorcu realne bolnišnične odpadne vode s časom pri različnih vrstah procesov razgradnje antibiotika XI

17 Uporabljeni simboli in kratice Simboli c cp koncentracija raztopine (mol/l) specifična toplotna kapaciteta (kj/kg K) fr faktor redčitve (/) I inhibicija (%) Kw ionski produkt (/) m p masa (mg) tlak (bar, MPa) Pow porazdelitveni koeficient oktanol/voda (/) r t T V reakcijska hitrost (ali proizvodnost) (mg/l h) čas (min) temperatura (K) volumen (ml) Grški simboli ε ρ dielektrična konstanta (F/m) gostota (kg/m3) η učinek čiščenja (%) η1 λ γ dinamična viskoznost (mpa s) toplotna prevodnost (mw/m K) masna koncentracija (mg/ml) Kratice AMR API ATC antimikrobna odpornost (angl. Antimicrobial Resistance) aktivne farmacevtske sestavine (angl. Active Pharmaceutical Ingredient) anatomska terapevtska kemikalija (angl. Anatomic Therapeutic Chemical) XII

18 BP CAD CE CP CUR CXP DDD DP ESAC EARS-Net GS HOC HPLC IS LC MS SubCW SubCWO SCW SCWO SPE TOC TP WAO točka vrelišča (angl. Boiling Point) kolizijski plin (angl. Collision-Activated Dissociation) kolozijska energija (angl. Collision Energy) kritična točka (angl. Critical Point) sušilni plin (angl. Curtain Gas) kolozijski izhodni potencial (angl. Collision Cell Exit Potential) določen dnevni odmerek (angl. Defined Daily Dose) zmanjševanje potenciala (angl. Declustering Potential) Evropski nadzor nad protimikrobno porabo (angl. European Surveillance of Antimicrobial Consumption) Evropska mreža za nadzor nad protimikrobno odpornostjo (angl. European Antimicrobial Resistance Surveillance Network) razpršilni plin (angl. Nebulizer Gas) hidrofobna organska spojina (angl. Hydrophobic Organic Compound) tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. High Performance Liquid Chromatography) ionski razprševalec (angl. Ion Spray Source Voltage) tekočinska kromaografija (angl. Liquid Chromatography) masna spektrometrija (angl. Mass Spectrometry) subkritična voda (angl. Subritical Water) subkritična oksidacija vode (angl. Subritical Water Oxidation) superkritična voda (angl. Supercritical Water) superkritična oksidacija vode (angl. Supercritical Water Oxidation) ekstrakcija s trdno fazo (angl. Solid Phase Extraction) skupna vsebnost organskih ogljikovodikov (angl. Total Organic Carbon) trojna točna (angl. Triple Point) oksidacija v mokrem zraku (angl. Wet Air Oxidation) XIII

19

20 1 Uvod 1.1 Opredelitev problema Antibiotik je v širšem pomenu kemoterapevtsko sredstvo, ki zavira ali odpravlja rast mikroorganizmov, kot so bakterije, glive in protozoje. Tradicionalen izraz antibiotik se uporablja za opis snovi, ki je proizvedena iz mikroorganizmov in je učinkovita proti rasti drugega mikroorganizma [1, 2]. Ločimo antibiotike široke spektra, kar pomeni, da vplivajo na mnogo različnih mikroorganizmov ter na antibiotike ozkega spektra, ki delujejo specifično na eno vrsto mikroorganizmov [3]. Proizvodnja in poraba antibiotikov je v svetu zelo velika, saj se na široko uporabljajo v humani in veterinarski medicini, kot tudi v ribogojstvu za preprečevanje ali zdravljenje mikrobnih infekcij. Globalna letna poraba antibiotikov znaša t [4, 5, 6]. Razmerje porabe v humani medicini in v kmetijstvu v Evropi je približno 50:50. Pri tem se v humani medicini med 80 in 90 % antibiotikov predpisuje ambulantno in med 10 in 20 % v bolnišnicah. Od tega je poraba 20 do 50 % antibiotikov nepotrebna. Raziskave kažejo, da antibiotike vsakodnevno prejema 1 do 3 % prebivalcev. V bolnišnicah antibiotike vsakodnevno prejema med 15 in 60 % bolnikov, na nekaterih oddelkih celo več kot 90 % [4, 7, 8]. Nekateri antibiotiki se uporabljajo več kot drugi; v humani medicini predstavljajo največji delež penicilini, sulfonamidi, makrolidi in kinoloni [9, 10, 11]. Svetovna poraba antibiotikov pri ljudeh se je med letoma 2000 in 2010 povečala za 36 % [12]. Polovica te povečane uporabe se šteje za nepotrebno, npr. kadar se antibiotiki uporabljajo za zdravljenje bolezni, ki jih povzročajo virusi. Antibiotiki se uporabljajo tudi v veterinarski medicini, za preprečevanje bolezni v kmetijstvu in ribogojstvu [13]. Za zdravljenje živali se uporablja 20 % antibiotikov, 80 % antibiotikov pa za preprečevanje okužb in pospeševanje rasti. Od tega je zelo vprašljiva poraba 40 do 80 % antibiotikov. Svetovna poraba v veterinarski medicini se bo po znanstvenih ocenah od leta 2010 do leta 2030 povečala za 67 % (iz t na t) [12, 13]. Potencialna vstopna mesta zdravilnih učinkovin v okolje so prikazana na sliki

21 Slika 1-1: Potencialna vstopna mesta zdravilnih učinkovin v okolje [4]. Slovenija je po celotni porabi antibiotikov v primerjavi z drugimi državami na 5. mestu, kar je pod povprečjem EU. Kljub temu pa predpisujemo bistveno preveč amoksicilina s klavulansko kislino, makrolidov in kinolonov. V Sloveniji sta bila leta 2016 najpogosteje predpisana antibiotika amoksiklav (43 %), katerega glavna sestavina je amoksicilin, ter ciprofloksacin (13 %). Sledijo jima ostali penicilini (6 %), trimetoprim/sulfametoksazol (5 %), cefalosporini (5 %), makrolidi (4%) in aminoglikozidi (3 %) [14]. V letu 2009 je bila v Sloveniji poraba amoksicilina s klavulansko kislino 28,2 % celotne ambulantne rabe antibiotikov, na Švedskem le 1,7 % in v nekaterih drugih državah še manj. Amoksicilin s klavulansko kislino ni primarni antibiotik za zdravljenje okužb dihal, temveč ga predpisujemo šele ob neuspešnem zdravljenju z amoksicilinom ali penicilinom v primeru, ko je bolnik jemal β-laktamski antibiotik zadnje 3 mesece [15]. Zaradi obsežne porabe so antibiotiki prisotni v različnih ekosistemih, od kopenskega do vodnega okolja [10, 16, 17, 18, 19, 20]. Antibiotiki prehajajo v okolje, zlasti pa v podtalnico in površinske vode z odpadnimi vodami iz bolnišnic, farmacevtskih tovarn, živinorejskih farm, ribogojnic, ter zaradi nepravilnega odlaganja zdravil iz gospodinjstev, ali kot posledica 2

22 nepopolnega odstranjevanja zdravil v komunalnih in industrijskih čistilnih napravah. V zadnjih letih so številne študije pokazale prisotnost velikega števila antibiotikov v surovi vodi (ki je nefiltrirana, ne sterilizirana ali na kakršenkoli drugi način obdelana izvirska voda), odpadni vodi ter tudi v končni pitni vodi, v koncentracijskem območju od µg/l do ng/l [21]. Bolnišnične odpadne vode so med večjimi onesnaževali, ki lahko vstopijo v vodotoke. V odpadnih in površinskih vodah so najpogostejši antibiotiki iz skupine β-laktamov, ki predstavljajo največji delež porabe, tako v humani kot tudi v veterinarski medicini. Pojavljajo pa se tudi kinoloni in njihova podskupina fluorokinoloni, sulfonamidi ter makrolidi, saj se te skupine v vodnem okolju najtežje in najpočasneje razgradijo [21, 22]. Prisotnost ostankov antibiotikov v vodnem okolju je toksična za vodne organizme, hkrati pa njihova prisotnost prispeva k nastanku antimikrobne odpornosti (AMR). Odpornost proti antibiotikom je pojav, ko so bakterije sposobne preživeti kljub izpostavljenosti enemu ali več antibiotikom. Odpornost proti antibiotikom je velika težava, saj so antibiotiki temelj sodobne medicine in večina zdravilnih postopkov pri zdravljenju ljudi in živali se opira na delovanje le teh [23]. Glavni sistem nadzora nad protimikrobno odpornostjo v EU je Evropska mreža (EARS-Net). Zbrani podatki služijo kot pomembni kazalniki o nastanku in širjenju antimikrobne odpornosti v Evropskih državah. V omrežju EARS-Net sodeluje vseh 28 držav članic EU in dve državi Evropskega gospodarskega prostora (EEA Islandija in Norveška). V Evropi letno zaradi okužb z bakterijami odpornimi proti antibiotikom umre bolnikov. Približno dve tretjini teh smrti je posledica okužb z gramnegativnimi bakterijami, ki so odporne skoraj proti vsem znanim antibiotikom. Letni stroški v Evropi znašajo najmanj 1,5 milijarde evrov. Ambulantni podatki iz ZDA kažejo na več kot smrti letno zaradi okužb, ki jih povzročajo proti antibiotikom odporne bakterije [24, 25, 26]. Poleg vsega naštetega povzroča antimikrobna odpornost tudi dodatne zdravstvene stroške in povzroča izgubo produktivnosti. Posledično ima protimikrobna odpornost velike gospodarske stroške, ki so ocenjeni samo v ZDA na 55 milijard ameriških dolarjev na leto [24]. Letno poročilo o tveganju Svetovnega gospodarskega foruma (WEF) navaja širjenje nalezljivih bolezni, vključno z vzponom odpornih patogenov, med visokim učinkom tveganja za svetovno gospodarstvo [25]. Prisotnost antibiotikov v okolju predstavlja veliko breme, saj so zaradi metabolne stabilnosti le ti v okolju dolgo obstojni in se med čiščenjem odpadnih vod ne odstranijo [21, 27, 28]. Konvencionalni postopki čiščenja odpadnih voda niso učinkoviti pri popolni odstranitvi vseh antibiotikov iz odpadne vode, zaradi tega so bolj napredni postopki obdelave v zadnjem času 3

23 pritegnili več pozornosti. Adsorpcija na aktivnem oglju, ozonizacija ali napredne oksidacijske metode in membranske separacije so obetavni napredni postopki obdelave, ki so sposobni odstraniti veliko pogosto najdenih antibiotikov v odpadni vodi. Ozon je izredno reaktiven z nekaterimi antibiotiki, ki zaradi svojih funkcionalnih skupin in struktur takoj reagirajo z ozonom [28, 29]. Kot pri vseh oksidacijskih procesih, so tudi tukaj potrebne analize razgradnih produktov, saj so lahko ti bolj strupeni kot aktivne spojine [28]. Deegan in sod. [30], so poročali o čiščenju antibiotikov z adsorpcijo na aktivnem oglju. Splošne težave so nastale pri ločevanju aktivnega oglja iz vode. Na voljo so različne možnosti, kot na primer sedimentacija, ki zahteva uporabo obarjalnih sredstev ali membranska filtracija, kar zahteva dodatno energijo, saj stopnja filtracije zniža blokiranje mikropor spojinam z visoko molekulsko maso. Zaradi teh lastnosti je aktivno oglje primerno le za čiščenje pred obdelanih odpadnih vod ali odpadnih vod z nizko organsko obremenitvijo [28, 30]. Za čiščenje odpadnih vod, v katerih so antibiotiki, se uporabljajo tudi biološke metode, ki se lahko razdelijo na aerobne in anaerobne procese. Aerobni sistem vključuje aktivno blato, membranski šaržni reaktor in zaporedje reaktorjev. Anaerobni sistemi pa vključujejo anaerobni reaktor mulja in anaerobne filtre [30]. Membranski procesi, kot sta mikro ali ultra filtracija, na splošno niso popolnoma učinkoviti pri odstranjevanju organskih onesnaževalcev, saj je velikost por od 100 do 1000-krat večja kot so mikropolutanti, ki lahko zdrsnejo skozi membrane. V središču pozornosti raziskav so vse bolj nanofiltracije in revezna osmoza. Vendar pa so študije o uporabi teh procesov za bolnišnično odpadno vodo omejene. Problem so visoki tlaki, kar pa posledično vpliva na ekonomiko procesa. Čeprav nanofiltracija in reverzna osmoza kažeta potencial pri učinkovitem odstranjevanju zdravil iz odpadnih vod, pa ostaja velik problem odstranjeno blato, ki lahko vsebuje onesnažila v bistveno bolj koncentrirani obliki [3, 30, 31]. Zgoraj omenjeni procesi so obetavne tehnike pri odstranjevanju antibiotikov, vendar so primerjave med temi tehnologijami problematične, saj večina raziskovalcev uporablja sintetično vodo, namesto realnih vzorcev odpadnih voda. Procesi čiščenja, ki smo jih obravnavali v tej doktorski disertaciji, so nova predlagana možnost za razgradnjo antibiotikov v bolnišničnih odpadnih vodah, ki bi lahko bile boljše od konvencionalnih in naprednih postopkov, ki se uporabljajo sedaj. Uporabili smo popolnoma nov pristop z uporabo super kritične vode, ki ima edinstvene lastnosti, saj ostane v tekočem stanju in deluje kot topilo, reaktant in katalizator. Ima veliko moč raztapljanja. Voda se pri normalnih pogojih razlikuje od super kritične vode in iz tega razloga so vrste reakcij, ki se odvijajo pri procesiranju odpadkov v tej vodi zelo odvisne od temperature in tlaka. Že majhne spremembe temperature 4

24 ali tlaka lahko povzročijo velike spremembe gostote fluida in njegove sposobnosti raztapljanja, saj bistveno vplivajo na dielektrično konstanto [4, 6, 9, 29]. Drugi pristop, ki smo ga preučevali in uporabili, je ozonacija. Ozon je močan oksidant, ki se v vodi razgradi tako, da tvori hidroksilne radikale. Uporablja se za odstranjevanje biološko nerazgradljivih nečistoč. Reakcija ozona z organskimi nečistočami je odvisna od vrednosti ph. Pri nizkem ph molekule ozona direktno reagirajo z organsko molekulo. V alkalnem območju ozon razpade v hidroksilne radikale, ki so bolj reaktivni kot sam ozon. Večja reaktivnost pa pomeni manjšo selektivnost, zato uravnavamo ph glede na vrsto nečistoč, ki jih vsebujejo odpadne vode. V naših raziskavah smo v procesu ozonacije dodajali vodikov peroksid (H2O2), ki pri razpadu tvori kisik, zaradi česar njegova prisotnost v odpadnih vodah ni problematična. Pri ozonacji v kombinaciji s H2O2 smo stopnjo razgradnje antibiotikov spremljali s kemijsko porabo kisika (KPK), kar je izražalo stopnjo degradacije antibiotika [1, 3, 31]. Tehnologija, ki bi lahko ponudila primeren odgovor na problem čiščenja tovrstnih odpadnih voda, je tudi aerobni bioreaktor, ki se lahko prilagodi različnim vrstam odpadnih vod [3]. Pri različnih obratovalnih pogojih reaktorja smo želeli preučiti stopnjo biorazgradljivosti izbranih antibiotikov v sintetični in bolnišnični odpadni vodi ter na podlagi rezultatov določiti optimalne pogoje delovanja laboratorijskega reaktorja [1]. V okvirju velikega nabora antibiotikov smo se pri eksperimentalnem delu doktorske disertacije osredotočili na dva značilna antibiotika, ki se intenzivno uporabljata v medicini pri nas ter spadata med tiste antibiotike, ki so najpogosteje zaznani v bolnišničnih odpadnih vodah, kot tudi v površinskih in podzemnih vodah [21]. Uporabili smo amoksicilin iz skupine β-laktamskih antibiotikov in ciprofloksacin iz skupine fluorokinolonov. O prisotnosti amoksicilina iz družine β-laktamskih antibiotikov v bolnišnični odpadni vodi v Nemčiji, je poročal Henninger s soavtorji. Našli so ga v koncentracijah med 25 in 82,7 µg/l. Christian in sod. [3, 28] navajajo koncentracije β-laktamskih antibiotikov v površinskih vodah, ki se povzpnejo vse do 45 ng/l. Kümmerer [4] pa je določal koncentracijo β-laktamov, ki se je v bolnišnični odpadni vodi v Nemčiji gibala med 20 in 80 µg/l. Ciprofloksacin spada v drugo generacijo kinolonskih učinkovin, ki delujejo baktericidno in imajo širok spekter delovanja. V humani medicini se pogosto uporablja za zdravljenje različnih bakterijskih infekcij, vključno z infekcijami urinalnega trakta, pljučnico in okužb sinusov. Velja za enega najmočnejših in najučinkovitejših antibiotikov, ki delujejo proti gramnegativnim bakterijam. Ciprofloksacin je tudi glavni metabolit enrofloksacina, ki se na široko uporablja v veterinarski 5

25 medicini. Raziskave kažejo, da v vodi ni dobro biološko razgradljiv [22, 32]. V kliničnih raziskavah se je izkazalo, da se 19 % peroralnega odmerka izloči v obliki presnovkov v urinu in blatu. Ciprofloksacin je težko razgradljiv in netopen v vodi, zato lahko njegovo kopičenje v vodah predstavlja veliko okoljsko tveganje [32]. Ciprofloksacin vključno s fluorokinoloni so bili leta 2014 na četrtem mestu na Evropskem trgu antibiotikov. Prvi podatki o vsebnosti ciprofloksacina segajo že v leto 1999, ko je Hartmann poročal o njegovi koncentraciji (0,7 124,5 µg/l) v bolnišnični odpadni vodi [4]. Nakata in sod. [13] so leta 2005 določali vsebnost fluorokinolonskih antibiotikov v odpadni vodi. Odkrili so, da se koncentracije gibljejo med 204 ng/l v sekundarnem ter 100 ng/l v končnem iztoku odpadne vode iz čistilne naprave. Visoke koncentracije pa so bile najdene v odpadnih vodah iz čistilnih naprav v Franciji ( ng/l), Italiji ( ng/l), Grčiji (460 ng/l) in na Švedskem (120 ng/l). V Švici so bili opravljeni poskusi na primarnih in terciarnih izpustih odpadnih vod, kjer so bile najdene koncentracije med 249 in 405 ng/l. Analize bolnišnične odpadne vode poročajo o zaznani ravni ciprofloksacina med 3 in 87 µg/l [27]. 1.2 Namen in cilji Namen doktorske disertacije Namen doktorske disertacije je bil določiti vsebnosti izbranih antibiotikov v bolnišnični odpadni vodi in preučiti njihovo toksičnost. Prav tako je bil naš namen preveriti učinkovitost izbranih naprednih metod za odstranjevanje oz. znižanje koncentracije antibiotikov iz sintetično pripravljene ter realne bolnišnične odpadne vode Cilji doktorske disertacije Cilj doktorske disertacije je bil proučiti različne novejše postopke za odstranitev ciprofloksacina in amoksicilina iz sintetično pripravljene ter realne bolnišnične odpadne vode za zmanjšanje okoljskega tveganja Teze doktorske disertacije V okviru doktorske disertacije smo želeli preučiti različne pristope pri odstranjevanju antibiotikov (amoksicilina in ciprofloksacina) iz bolnišnične odpadne vode, ki vključujejo čiščenje s super kritično vodo, čiščenje z ozonacijo v kombinaciji s H2O2 ter čiščenje z aerobnim reaktorjem. Prav tako smo želeli vpeljati kvalitativno in kvantitativno analizno metodologijo za detekcijo antibiotikov v bolnišnični odpadni vodi. Naše delovne teze in cilji raziskovanja so bili: 6

26 T1: Pričakujemo, da se bo pri super kritičnem čiščenju pri temperaturah 400 o C in 500 o C vsebnost antibiotika v vodi zmanjšala. T2: V postopku čiščenja z ozonacijo se bo z dodatkom vodikovega peroksida degradacija antibiotikov povečala. T3: Uporaba aerobnega bioreaktorja je učinkovita metoda za odstranjevanje izbranih antibiotikov iz sintetično pripravljene odpadne vode. 1.3 Predpostavke in morebitne omejitve Predpostavljamo, da lahko ob čiščenju z izbranimi naprednimi metodami dobimo bolj toksičen in nevaren produkt, kot je bil začetni vzorec. Prav tako predpostavljamo, da bo pri ekstrakciji na trdni fazi ter LC/MS-MS analizni metodi, potrebna modifikacija zaradi upoštevanja: i.) možnih sinergističnih oziroma aditivnih učinkov kombinacije različnih spojin, ki so lahko prisotne v vzorcih odpadnih vod, ii.) potrebe po identifikaciji in kvantifikaciji izhodnih organskih spojin in produktov oksidativne razgradnje. iii.) ob zelo učinkovitem postopku odstranjevanja antibiotikov se lahko pojavijo težave pri identifikaciji, kadar bodo vsebnosti v bližini meje zaznavnosti (angl. Limit of detection LOD). 7

27 2 Teoretični del 2.1 Antibiotiki Prvi antibiotik penicilin je bil izoliran leta 1928, ko je škotski znanstvenik in dobitnik Nobelove nagrade Alexander Fleming odkril antibiotično delovanje glive iz rodu Penicillium [3]. Leta 1932 je bil na tržišču prvi sintetični antibiotik prontosil, ki ga je razvil Gerhard Domagk. To je bil prvi komercialno dostopen sintetični antibiotik iz skupine sulfonamidov, ki ima široko aktivnost proti grampozitivnim bakterijam, vendar ne proti enterobakterijam (gramnegativne bakterije) [33]. V svetu je registriranih približno 250 različnih antibiotikov za uporabo v medicini in veterinarstvu [4, 8]. V današnjem času se antibiotiki pridobivajo s kemično sintezo, ali s kemično modifikacijo spojin naravnega izvora. Velika večina antibiotikov so sorazmerno majhne molekule z molekulsko maso manj kot 1000 Da [16, 34, 35, 36, 37]. Antibiotike lahko delimo glede na njihovo kemijsko zgradbo (tabela 2-1) [38, 39]. Glede na učinek delovanja jih delimo na bakteristatične in baktericidne. Bakteristatični antibiotiki zavirajo rast in razvoj mikroorganizmov. Ko se antibiotik izloči, se razmnoževanje mikroorganizmov nadaljuje. Pri baktericidnih antibiotikih pa ti trajno onesposobijo mikroorganizme, da se niso več zmožni razmnoževati [10, 17, 18, 19]. V tabeli 2-1 so predstavljeni vsi pomembni razredi in skupine antibiotikov. 8

28 Tabela 2-1: Pomembni razredi in skupine antibiotikov glede na njihovo kemijsko zgradbo [38, 39]. Razred Skupina Podskupina Primer Kemijska struktura β-laktami penicilini aminopenicilin amoksicilin Formula elementa C 16H 19N 3O 5S Karboksipenicili n karbenicilin C 17H 18N 2O 6S cefalospori ni cefazolinska skupina cefazolin C 14H 14N 8O 4S 3 cefaleksinska skupina cefprozil C 18H 19N 3O 5S karbapene mi - meropenem C 17H 25N 3O 5S Kinoloni - fluorokinoloni ciprofloksacin C 17H 18FN 3O doksiciklin C 22H 24N 2O gentamicin 1c C 21H 43N 5O 7 Makrolidi - - eritromicin A C 37H 67NO 13 Tetraciklini Aminoglikozidi Sulfonamidi - - sulfametoksazol C 10H 11N 3O 3S 9

29 2.1.1 Amoksicilin Amoksicilin je kislinsko stabilna, pol sintetična učinkovina, ki pripada skupini antibiotikov penicilini iz razreda β-laktamski antibiotiki. Molekulska formula amoksicilina je C16H19N3O5S z molsko maso 365,4 g/mol in IUPAC imenom (2S,5R,6R)- 6-{[(2R)-2-amino-2-(4- hidroksifenil)-acetil]amino}-3,3-dimetil-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-24karb oksalna kislina. Strukturna formula amoksicilina, je prikazana na sliki 2-1. Slika 2-1: Strukturna formula amoksicilina Amoksicilin deluje baktericidno in je učinkovit proti širokemu spektru okužb, ki jih povzroča širok razpon grampozitivnih in gramnegativnih bakterij pri ljudeh in živalih [40, 41, 42, 43]. Je sorodnik ampicilina (pol sintetičnega aminopenicilina), ki se razlikuje od matičnega zdravila samo s hidroksilacijo fenilne stranske verige. Deluje tako, da zavira biosintezo peptido-glikanskega ogrodja bakterijske celične stene. Prav tako inhibira transpeptidazo in tako preprečuje prečno povezovanje peptidoglikanov. Zaradi takšnega mehanizma delovanja je amoksicilin učinkovit pri hitro rastočih mikroorganizmih. Po aplikaciji se hitro resorbira in že po 2 h doseže maksimalno koncentracijo v plazmi. Po intramuskularni aplikaciji hitro preide v telesna tkiva in tekočine, posebno visoko koncentracijo pa doseže v urinu, žolču, ledvicah in jetrih. Pri infekcijah dihal prodira skozi vneto pljučno sluznico, kar omogoča njegovo delovanje na povzročitelje infekcije tudi v sluzi. Večina amoksicilina se izloči v nespremenjeni obliki z urinom [41, 43]. Amoksicilin je uporaben pri zdravljenju številnih indikacij in se uporablja za zdravljenje vnetja srednjega ušesa (otitis media), grla (laringitis), žrela (faringitis), bronhijev (bronhitis), pljuč (pljučnica), sečil, kože, za zdravljenje gonoreje, pnevmonije, endokarditisa, infekcije urinarnega trakta, Lymske bolezni (stopnja 1), itd.. Dovzeten je za razgradnjo z bakterijami, ki proizvajajo β-laktamazo, zato mu lahko dodamo inhibitor β-laktamaze, kot je klavulanska kislina [43, 44, 45]. 10

30 2.1.2 Ciprofloksacin Ciprofloksacin spada v drugo generacijo kinolonskih učinkovin, imenovanih fluorokinoloni, ki delujejo baktericidno in imajo širok spekter delovanja [45]. Molekulska formula ciprofloksacina je C17H18FN3O3 z molsko maso 331,4 g/mol in IUPAC imenom 1-ciklopropil- 6-fluoro-1,4-dihidro-4-okso-7-(1-piperazinil)-3kinolinkarboksilna kislina [45]. Strukturna formula ciprofloksacina, je prikazana na sliki 2-2. Slika 2-2: Strukturna formula ciprofloksacina Ciprofloksacin deluje tako, da inhibira encim DNK girazo, ki katalizira navitje molekul DNK po delitvi celice. Inhibicija procesa nato povzroči propad bakterij. Uvajanje prvega fluoriranega kinolona, norfloksacina je vodilo v razvoj drugih članov te skupine [46], kot je ciprofloksacin, ki ima široke klinične aplikacije, boljši varnostni profil in dobro in vitro učinkovitost proti odpornim patogenim organizmom, v primerjavi z drugimi vrstami antibiotikov [47]. Je težko razgradljiv in skoraj netopen v vodi, zato lahko njegovo kopičenje v vodah predstavlja veliko okoljsko tveganje [13]. Ciprofloksacin je pri sobni temperaturi v kristalni obliki s svetlo rumeno barvo [47]. Poleg profilaktične uporabe je ciprofloksacin indiciran za zdravljenje okužb kot so: zvišana telesna temperatura kot posledica okužbe s tifusom (enterična vročina), okužbe sečil, kronični bakterijski prostatitis, za zdravljenje akutnih poslabšanj kroničnega bronhitisa, okužb kože in kožne strukture, zapletenih intra abdominalnih okužb, akutnega nezapletenega cistitisa pri ženskah, okužb spodnjih dihal, akutnega sinusitisa, okužbe kosti in sklepov, nalezljive diareje, pa tudi nezapleteno cervikalno in uretalno gonorejo, ki jih povzroča Neisseria gonorrhoeae [13, 48, 49]. 11

31 2.2 Uporaba antibiotikov v humani medicini Antibiotiki se v veliki meri uporabljajo v humani in veterinarski medicini kakor tudi v ribogojstvu za preprečitev ali zdravljenje mikrobnih okužb. V humani in veterinarski medicini se uporablja več kot sto različnih antibiotikov in antimikotičnih snovi [8, 9, 15]. Poraba antibiotikov in uporaba brez recepta [46] se med državami zelo razlikujejo [42], saj so različne ravni uporabe posameznih spojin precej pogoste. Vankomicin se na primer v ZDA pogosto uporablja, medtem ko se v Nemčiji uporablja le v primerih, ko so se vse ostale možne spojine zaradi bakterijske odpornosti proti antibiotikom izkazale kot neučinkovite. Podatke o porabi antibiotikov v Evropi zbira ESAC, kjer je mogoče najti porabo za skupine antibiotikov v humani medicini. ESAC-Net zagotavlja evropske referenčne podatke o porabi protimikrobnih sredstev. Za poročanje o porabi antibiotikov v bolnišničnem okolju in zunaj njega se uporablja mednarodno sprejeta enota za merjenje porabe antibiotikov, določeni dnevni odmerek (DDD) na 1000 prebivalcev na dan. Podatek daje grobo oceno deleža populacije, ki se dnevno zdravi z antibiotiki. Ta kazalnik upošteva količino antibiotikov (odmerkov), ki se porabijo v posamezni državi, in potencialno breme ali ekološki učinek na razvoj protimikrobne odpornosti. V Evropi znaša uporaba antibiotikov od 8,6 do 36 DDD. β- laktamski antibiotiki, vključno s podskupinami penicilinov, cefalosporinov in kot marginalna frakcija karbapenemov ter drugih, predstavljajo največji delež antibiotikov za uporabo v humani medicini v večini držav. Predstavljajo kar približno % celotne uporabe. V večini držav jim nato sledijo fluorokinoloni, sulfonamidi in makrolidi v padajočem vrstnem redu uporabe [42]. Podatki za leto 2016 kažejo (tabela 2-2), da so bili penicilini najpogosteje uporabljeni antibiotiki v vseh državah (tako kot v prejšnjih letih), in sicer v razponu od 33 % (Nemčija) do 67 % (Slovenija) celotne skupne porabe. Delež drugih skupin antibiotikov se med državami razlikuje bolj široko, npr. cefalosporini ter drugi β-laktami od 0,2 % (Danska) do 22 % (Nemčija), makrolidi, lincosamidi in streptogramini od 5 % (Švedska) do 23 % (Slovaška) ter kinoloni od 2 % (Velika Britanija) do 21 % (Ciper). Količine in trendi porabe antibiotikov v posameznih državah za obdobje 2012 do 2016 so predstavljeni v tabeli 2-2 [9, 15, 50]. Povprečna Evropska poraba se je v tem obdobju povečala iz 21,7 na 21,9 DDD na 1000 prebivalcev na dan. V tem obdobju naraščanje uporabe kažeta Grčija in Španija, medtem, ko so trend upadanja pokazale Finska, Luksemburg, Norveška, Švedska in tudi Slovenija. 12

32 Tabela 2-2: Količina porabe antibiotikov v Državah Evropske Unije med leti 2012 in 2016 (izražena kot DDD na 1000 prebivalcev na dan). Država Nizozemska 11,3 10,8 10,6 10,7 10,4 Estonija 11,7 11,7 11,7 12,0 12,0 Švedska 14,1 13,0 13,0 12,3 12,0 Latvija 13,0 13,5 12,6 13,3 13,2 Avstrija 14,0 16,3 13,9 14,0 13,3 Slovenija 14,3 14,5 14,2 14,5 13,9 Nemčija 14,8 15,7 14,6 14,3 14,1 Norveška 16,9 16,2 15,9 15,8 15,2 Madžarska 1,0 15,5 16,2 17,0 15,4 Danska 16,4 16,4 15,9 16,1 15,9 Finska 19,5 18,3 18,1 17,2 16,5 Velika Britanija 20,1 20,6 20,8 20,1 19,6 Hrvaška 21,7 21,1 21,4 21,8 20,7 Španija 19,7 20,3 21,6 22,2 23,0 Italija 27,5 28,6 27,8 27,5 26,9 Luksemburg 27,7 27,7 25,8 26,3 25,5 Grčija 32,5 32,2 35,1 36,1 36,3 Belgija 29,8 29,6 28,5 29,3 27,5 Francija 29,7 30,1 29,0 29,9 30,3 V Sloveniji spremljanje porabe zdravil in analizo podatkov o porabi zdravil izvaja Nacionalni inštitut za javno zdravje (NIJZ). 13

33 2.3 Pojavnost antibiotikov v odpadnih vodah Prednosti zdravstvenega varstva antibiotikov so nesporne, vendar pa so biološke lastnosti antibiotikov in njihova prisotnost v okolju v sledeh zaradi njihove strupenosti za ne ciljne organizme zaskrbljujoči [51, 52]. Antibiotične snovi se v telesu ne presnavljajo v celoti, zato so antibiotiki izločeni z urinom in iztrebki [6, 10, 53, 54]. V nasprotju s splošnim pričakovanjem, bolnišnice niso glavni vir farmacevtskih izdelkov v komunalnih odplakah [41, 45]. Za lokalno čistilno napravo v Oslu je bilo ugotovljeno, da je manj kot 10 % nekaterih analiziranih antibiotikov iz bolnišnice. Glavni vir antibiotikov so komunalne odpadne vode, saj le % antibiotikov, ki jih uživajo ljudje, prihaja neposredno iz bolnišnic [55]. Zaradi neprekinjenega odvajanja jih običajno v okolju najdemo v nizkih koncentracijah v ng/l ali µg/l [6, 10, 53, 54, 56]. Poleg tega so nekateri antibiotiki slabo biorazgradljivi in so zato lahko obstojni v okolju, njihove toksične lastnosti proti mikroorganizmom pa lahko ostanejo tudi, kadar so v vodi prisotni le v sledovih [4, 10, 57]. Monitoring škodljivih snovi temelji trenutno na kemijskih analizah zbranih vzorcev, vendar pa kompleksna narava vzorcev okolja, nizke koncentracije, učinek redčenja in delna preobrazba izvornih spojin povzročajo, da je odkrivanje antibiotikov velik izziv. Posredne toksikološke metode lahko zagotovijo dodatna znanja o kakovosti vode in vpogled v učinke mešanic [10, 51, 52]. Najobčutljivejši okoljski organizmi na antibiotike so prokarionti, saj so protimikrobna sredstva učinkoviti zaviralci bakterijske rasti [10, 18, 55]. Vendar pa vsi antibiotiki, ki jih najdemo v okoljskih vzorcih, niso škodljivi, zato je resničen izziv identificirati tiste, ki v okolju dejansko predstavljajo tveganje. V tabeli 2-3 so navedeni antibiotiki visoke ekotoksikološke nevarnosti in najvišje koncentracije (µg/l) v vzorcih vode v svetu. Izbrani so bili na podlagi različnih parametrov: večja poraba, pogosta detekcija v vzorcih iz okolja in toksični učinki že pri nizkih koncentracijah. Ne glede na postopke čiščenja odpadnih vod, ti antibiotiki še vedno preidejo v okolje z odplakami, saj čistilne naprave niso posebej načrtovane za njihovo odstranitev [10, 11, 44, 49, 54]. 14

34 Tabela 2-3: Antibiotiki visoke ekotoksikološke nevarnosti in njihove najvišje koncentracije (µg/l) v vzorcih vode v svetu. Skupina antibiotika Ime snovi KRATICA Najvišja koncentracija (µg/l) Vrsta vode Kinoloni enrofloksacin ENR 4,2 rečna voda 1,1 odpadna voda ciprofloksacin CIP 5,9 rečna voda 3,4 odpadna voda norfloksacin NOR 1,2 rečna voda 3,7 odpadna voda Ofloksacin OFL 7,9 odpadna voda 0,2 rečna voda Trimetoprim TMP 0,03 morska voda 2,7 rečna voda 3,1 odpadna voda Makrolidi eritromicin ERY 4,0 rečna voda eritromicin- H 2O ERY- H 2O 2,8 rečna voda 4,3 odpadna voda azitromicin AZM 1,5 rečna voda 1,2 odpadna voda Penicilini amoksicilin AMOX 0,1 morska voda 0,6 rečna voda 1,7 odpadna voda Ampicilin AMP 0,3 rečna voda 0,8 odpadna voda Država detekcije Reference Kitajska [48] Kitajska [48] Kitajska [48] Kitajska [48] Avstralija [11] Kitajska [19] Kitajska [19] Francija [58] Belgija [59] Kenija [60] VB [61] Španija [62] VB [61] Kitajska [19] ZDA [63] Slovaška [64] Grčija [20] VB [61] Kitajska [19] Kenija [65] Kenija [65] 15

35 Tetraciklini tetraciklin TCN 0,8 rečna voda 1,4 odpadna voda klortetraciklin CTC 2,4 rečna voda 0,3 odpadna voda oksitetraciklin OTC 2,2 rečna voda 0,8 odpadna voda doksiciklin DXC 0,4 rečna voda 0,3 odpadna voda Kitajska [48] Kitajska [19] Kitajska [48] ZDA [27] Kitajska [48] Kitajska [19] Avstralija [11] ZDA [27] Iz tabele 2-3 je razvidno, da so bile v okolju najvišje izmerjene koncentracije enrofloksacina (ENR), ciprofloksacina (CIP), norfloksacina (NOR), trimetoprima (TMP), azitromicina (AZM), eritromicina, klortetraciklina (CTC), oksitetraciklina (OTC), ofloksacina (OFL) in amoksicilina (AMOX), ki vse presegajo koncentracije nad 1 µg/l. V nekaterih primerih (npr. CIP) lahko vidimo, da so bile vsebnosti izmerjene v površinskih vodah, višje od koncentracij izmerjenih v odpadnih vodah. Ta pojav je možno pojasniti, kot spremembe vtoka, ki jim sledi kopičenje antibiotikov (vključno z bioakumulacijo v vodnih organizmih), desorpcijski procesi iz aktivnega blata in biofilmov ter kumulativni učinek dodatnih virov (kot so kmetijske vode), ki vstopajo v površinske vode [9, 10, 11, 66, 67]. Obstojnost antibiotikov v okolju se lahko močno razlikuje, saj na razpolovni čas vplivajo različni okoljski parametri, kot so geografska lokacija, temperatura in ph [10, 31, 41, 42, 68]. Andreozzi in sod. [31] so raziskali, da je bil najdaljši razpolovni čas amoksicilina v vodi 9 d v zimskem času, najnižji pa približno 48 h v poletnem času. Lee in soavtorji [68] so poročali o razpolovnem času amoksicilina v vodi 72 h, ter za eritromicin 30 d. Braschi in sod. [41] so raziskali učinke ph na obstojnost amoksicilina v vodi, pri čemer je bila razpolovna doba od 0,5 do 5,4 d, odvisno od ph. Mitchell in sod. [42] so proučili učinke ph in temperature na antibiotično hidrolizo. Ugotovili so, da je razpolovna doba pri ph 7 in temperaturi 25 o C za cefaotin, cefoksitin in ampicilin znašala 5,3; 9,3 in 27 dni [42]. Biološka razgradljivost antibiotičnih snovi med aktivnim procesom blata vpliva na to, kako dobro se snovi odstranijo v procesih čiščenja odpadnih voda [10, 49, 59, 69]. Halling-Sørensen in sod. [59] so dokazali, da je bil razpolovni čas v reakciji z aktivnim blatom za trimetoprim 16

36 od 22 do 41 d ter od 1,6 do 2,5 d za ciprofloksacin. Dorival Garcia in sod. [49] so proučevali degradacijsko značilnost kinolonskih antibiotikov v reaktorjih z aktivnim blatom v aerobnih, nitrifikacijskih in anoksičnih pogojih. Sorpcija na blatu je najpomembnejši mehanizem pri odstranjevanju kinolonskih antibiotikov. Sorpcijski potencial je odvisen od redoksnih pogojev z najvišjim sorpcijskim potencialom v aerobnem blatu in nižjim potencialom v nitrifikacijskem in anoksičnem blatu. Wang in sod. [69] so preučevali odstranitev fluorokinolonov v procesu aktivnega blata. Fluorokinoloni so počasi bio-razgradljivi z dolgimi življenjskimi dobami (> 4 d ), vendar se biodegradacija povečuje s povišano temperaturo in pod aerobnimi pogoji [22]. 2.4 Metode naprednega čiščenja antibiotikov iz vodnih vzorcev Antibiotiki se lahko iz vodnih vzorcev odstranjujejo z različnimi biološkimi, fizikalnokemijskimi in kemijskimi postopki (napredni oksidacijski postopki). Do sedaj so se uporabili naslednji : koagulacija in sedimentacija [28], flotacija [29], adsorpcija na aktivem oglju [30], ozonacija, napredne oksidacijske metode [27], membranska separacija in biološki postopki, med katere spada membranski bioreaktor [30, 31] Napredni oksidacijski procesi Napredni oksidacijski procesi (AOPs), so procesi, ki lahko oksidirajo onesnaževala z oblikovanjem prostih radikalov. Te vrste onesnaževal pa ne moremo razgraditi z običajnimi oksidacijskimi sredstvi. Obstaja veliko vrst naprednih oksidacijskih procesov, kot so oksidacija v mokrem zraku, oksidacija v super kritični vodi, oksidacija s Fentonovim reagentom, fotokatalitska oksidacija, ultrazvočna oksidacija, elektrokemijska oksidacija in ozonacija Oksidacija v mokrem zraku Oksidacijo v mokrem zraku (WAO) je leta 1958 prvi uporabil F.J. Zimmermann v procesu čiščenja črnega tekočega papirja. Z uporabo zraka ali kisika kot oksidanta ta metoda omogoča razgradnjo organskih snovi v anorganske ali majhne molekule pri visoki temperaturi ( o C) in visokem tlaku (0,5-20 MPa). WAO se običajno uporablja pri pred obdelavi naprednega čiščenja odpadne vode. Metoda je zelo uporabna in kaže na visoko učinkovitost glede na KPK, ki lahko v ustreznih pogojih doseže tudi več kot 90 %. Ima nizko porabo energije, manj sekundarnega onesnaževanja in je enostavna za upravljanje [70]. 17

37 Oksidacija v sub in super kritični vodi Sub kritična voda (SubCW) je opredeljena kot tekoča voda, segreta pod tlakom od atmosferskega vrelišča (BP) vse do svoje kritične točke (CP) (T = 374 o C, p = 221 bar) [59] in ima drugačne fizikalne in kemijske lastnosti od vode pri okoljskih pogojih. Za razliko od visoko vezane vodikove strukture, ki je navadno prisotna pri vodi v okoljskih pogojih, postane ta vez zaradi povečanega termičnega gibanja molekul vode pri kritičnih pogojih veliko manj intenzivna [59]. Na sliki 2-3 je prikazan fazni diagram vode s prikazano trojno točko (TP), točko vrelišča (BP) in kritično tečko (CP). Nad točko vrelišča, kjer so vodikove vezi šibkejše in nastajajo v manjšem številu, so razlike v vodnih lastnostih pogostejše [28, 71]. kritični tlak Slika 2-3: Fazni diagram vode s prikazano trojno točko (TP), točko vrelišča (BP) in kritično točko (CP). S povečanjem temperature (T) se gostota tekočine (ρ) zmanjša, kot je razvidno iz slike 2-3. Najprej se s povečano temperaturo gostota SubCW postopoma zmanjšuje, ne glede na tlak sistema, vendar blizu kritične točke (374 o C), pri tlaku 500 bar gostota nenadoma pade. Na tej točki prehaja tekočina v svoje super kritično stanje, kjer so njene lastnosti med plinom in tekočino. Pri tlaku 1000 bar je stiskanje medija tako visoko, da nenadno znižanje gostote blizu kritične točke ni več prisotno in prehod v super kritično stanje ni več jasno viden. Pri temperaturah pod 300 o C, je gostota praktično neodvisna od tlaka (medij je nestisljiv), medtem ko je pri višjih temperaturah npr. v bližini kritičnih pogojev in pri super kritičnih pogojih, opazna veliko večja sprememba lastnosti, ki se spreminja s spreminjanjem tlaka [71, 72]. 18

38 Druga lastnost vode, ki se v sub in super kritičnem območju bistveno spreminja, je njena statična dielektrična konstanta (ε), ki se z naraščajočo temperaturo zelo drastično zmanjša. Pri okoljskih pogojih je dielektrična konstanta precej visoka (~ 78 F/m), zaradi česar je voda odlično topilo za raztapljanje zelo polarnih spojin. Vendar pa je pri temperaturah nad 200 o C dielektrična konstanta že manj kot polovica te vrednosti (~ 35 F/m). To pomeni, da ima voda, pri teh povišanih temperaturah polariteto bolj podobno organskemu topilu, kot sta npr. metanol in etanol [72]. Pri super kritičnih pogojih je dielektrična konstanta praviloma manjša od 2 F/m, kar ustreza polarnosti, podobni tisti, ki jo imata benzen ali heksan. Vendar pa zaradi zmanjšane dielektrične konstante voda pri super kritičnih pogojih ne raztopi več soli in drugih zelo polarnih spojin, ki so običajno topne v okoljskih pogojih [72, 73]. Odvisnost dielektrične konstante od tlaka je relativno nizka, tudi pri visokih temperaturah, čeprav lahko pri tlaku 250 bar po segrevanju medija nad njegovo kritično točko opazimo njen nenaden padec. Pri skoraj kritičnih in super kritičnih pogojih potekajo različne vrste reakcij, zato prevladujejo nad kataliziranimi reakcijami s kislino/bazo. V super kritičnih pogojih prevladujejo reakcije prostih radikalov nad kataliziranimi reakcijami kisline/baze. Preprosto lahko rečemo, da ko je ionski produkt (Kw) Kw > 10-14, bodo v mediju prevladovale ionske reakcije, medtem ko bodo pri Kw << bolj prednostne reakcije prostih radikalov [71, 73]. Poleg dielektrične konstante (slika 2-4, tabela 2-4), zmanjšano število vodikovih vezi spremeni tudi drugo kemijsko lastnost vode, in sicer ionski produkt. S povečanjem temperature se ionski produkt počasi povečuje. Približno pri 300 o C doseže svojo največjo vrednost 10-11, kar je za tri razrede (eksponente) višje od tistih pri okoljskih pogojih (10-14 ). Sub kritična voda zato predstavlja topilo z visoko koncentracijo H + in OH - ionov, s čimer spodbuja katalitske reakcije kislin/baz [71]. Pri temperaturi 300 o C se ionski produkt z nadaljnjim povišanjem temperature začne zmanjševati in po dosegu kritične točke opazimo nenadno zmanjšanje za več redov velikosti zaradi velikosti ionskega produkta pri tlaku 250 bar [73]. Voda je znana po relativno visoki toplotni kapaciteti (moč) (cp = 4,2 kj/kg K pri okoljskih pogojih) v primerjavi z drugimi tekočinami. Pri sub kritičnih pogojih se toplotna kapaciteta še povečuje s povečano temperaturo in v bližini kritične točke lahko opazimo nenadno veliko povečanje toplotne moči, ko je voda stisnjena na 250 bar. Pri tlaku 500 bar je nenadno povečanje toplotne kapacitete manj izrazito in se premika proti temperaturam nad 400 o C. Pri tlaku 1000 bar lahko opazimo samo majhno povečanje toplotne moči pri temperaturah nad 19

39 500 o C. Ogrevalna voda nad svojo kritično točko zato zahteva visoko vhodno energijo, vendar se lahko te zahteve nekoliko znižajo, če se uporabljajo višji tlaki [71, 72, 73]. Slika 2-4: Spremembe (a) gostote vode, (b) dielektrične konstante, (c) ionskega produkta, (d) toplotna kapaciteta v temperaturnem območju od 0 o C do 700 o C pri tlakih 250 bar, 500 bar in 1000 bar [74]. Tabela 2-4: Lastnosti vode pri različnih tlakih in temperaturah [74]. Voda Para Sub kritična voda Super kritična voda T (K) p (MPa) 0,1 0, ρ (g/cm 3 ) 1 0,0 0,8 0,2 0,6 ε (/) 78,5 1 27,1 5,9 10,5 pkw (/) 14,0 / 11,2 19,4 11,9 cp (kj/kg K) 4,2 2,1 4,9 13,0 6,8 η (mpa s) 0,9 0,0 0,1 0,0 0,0 λ (mw/m K)

40 2.4.2 Ozonacija napredni oksidacijski postopek Ozonacija je tehnika kemijske obdelave vode, ki temelji na infuziji ozona v vodo. Ozon je plin, sestavljen iz treh atomov kisika (O3) in je eden najmočnejših oksidantov. Ozonacija je vrsta naprednega oksidacijskega procesa, ki vključuje proizvodnjo zelo reaktivnih vrst kisika, ki lahko reagirajo s široko paleto organskih spojin in vsemi mikroorganizmi. Obdelava vode z ozonom ima široko uporabnost, saj je učinkovita za razkuževanje in za degradacijo organskih in anorganskih onesnaževal. Ozon se proizvaja z uporabo energije z izpostavitvijo kisika (O2) visoki električni napetosti ali UV sevanju [75, 76]. Ozon se za obdelavo vode uporablja že od konca 19. stoletja, danes pa se uporablja pretežno za dezinfekcijo vode ter za degradacijo organskih in anorganskih onesnaževal v odpadnih vodah [76]. Čeprav sam ozon ne ustvarja nobenih stranskih produktov, se pojavljajo nekateri pomisleki glede stranskih produktov oksidacije, kadar se z ozonom čisti voda, ki vsebuje organske snovi in ione, kot so bromidni, jodidni in kloridni ioni. Učinkovitost ozona je posledica njegovega močnega oksidacijskega učinka na kemikalije in mikroorganizme, ki jih povzroča nastajanje reaktivnih vrst kisika med pretvorbo ozona v kisik. Ozon pa lahko oksidira tudi kovinske ione, kot so Fe(II), Me(II) in As(II), ki proizvajajo netopne trdne okside, ki jih je mogoče enostavno ločiti od vode s filtracijo ali sedimentacijo. Ozonacijski sistem je praviloma sestavljen iz ozonskega generatorja in reaktorja, kjer se ozon uvede v vodo, ki jo je treba obdelati [76]. Ozon neposredno reagira s površino mikroorganizmov in uniči njihove celične stene. Celice torej izgubijo svojo citoplazmo in se ne morejo ponovno aktivirati [75]. Zaradi relativno kratkega razpolovnega časa, je ozon generiran na samem mestu, kjer bo potekalo ozoniranje s pomočjo generatorja ozona. Obdelava z ozonom ne zahteva toplote, zato je sistem varčen. Energija, potrebna za ustvarjanje 1000 g ozona, se lahko giblje med 6 in 8 kwh. Gibalna sila za prenos snovi se razlikuje med že raztopljeno koncentracijo ozona in samo topnostjo ozona. Tlak znotraj generatorja ozona je pomemben, saj se mora zagotoviti enak tlak tudi pri dovajanju v vodo [75, 76]. 21

41 2.4.3 Aerobna biološka obdelava Uporaba biološkega postopka čiščenja z aktivnim blatom je danes razširjena po vsem svetu. Postopek temelji na razgradnji organskih in anorganskih spojin z mikroorganizmi, kjer pri aerobnih pogojih v reaktor dovajamo kisik, ki ga bakterije potrebujejo za razgradnjo. V aktivnem blatu prevladujejo bakterije, prisotne pa so tudi praživali, mnogoceličarji in glive. Bakterije v procesu razgradijo organske snovi s pomočjo ekstracelularnih encimov. Glive, ki prav tako razgradijo organske snovi, se pojavijo pri nizki ph vrednosti. Praživali (protozoa) se prehranjujejo z bakterijami, glivami in suspendiranimi snovmi ter so pomemben del sekundarnega usedanja v čistilnih napravah. Mnogoceličarji (metazoa) pa se v glavnem pojavljajo v biofilmih in nižje obremenjenih čistilnih napravah [77, 78]. Z biološko obdelavo se znižata vrednost in prisotnost dušikovih ter ogljikovih spojin. Biološko čiščenje poteka v čistilnih napravah s pritrjeno ali razpršeno biomaso. Pri tem se simulirajo biološki procesi, ki potekajo v naravi [79]. Pri samem procesu nastopi proces nitrifikacije, pri katerem prevladujejo nitrifikatorji (avtotrofne bakterije kot so Nitrosomonas in Nitrobacter). Za učinkovito izvedbo biološkega čiščenja morajo biti zagotovljeni ustrezni pogoji. Predvsem pomembna sta vrednost ph in temperatura. Zagotoviti moramo zadostno količino raztopljenega kisika za aerobne mikroorganizme in dober prenos snovi v reaktorju. Za pravilno delovanje biološke čistilne naprave potrebujemo zadostno koncentracijo biomase in optimalno razmerje hranil [80]. Razmerje in vrsta bakterij v aktivnem blatu sta odvisna od: sestave odpadne vode, količine raztopljenega kisika, hitrosti rasti bakterij, sposobnost usedanja blata, ph in temperature [79, 80, 81]. Sposobnost tvorjenja kosmov in združevanje bakterij v skupine sta pomembni lastnosti bakterij pri biološkem čiščenju vode. Večji, gosti kosmi se hitreje usedejo. Usedljivost blata pa je pomembna pri biološkem procesu čiščenja, saj pomaga vzdrževati veliko število raznovrstnih bakterij v reaktorju [77]. Kosmi so po obliki veliki, rahlo povezani, porozni skupki, ki vsebujejo kanale in votla mesta, skozi katera se pretakajo hranila in kisik, pomembni za rast mikroorganizmov. Pri določenih pogojih se lahko tvorijo tudi granule, ki imajo boljšo sposobnost usedanja, kot kosmi, saj so okrogle oblike in tvorijo gosto, trdno in kompaktno mikrobno strukturo. So dobro odporne na toksične organske kemikalije in težke kovine. Za tvorbo granul mora biti prisotno mešanje, kar omogoči boljši medsebojni stik [78]. Temperatura pomembno vpliva na aktivno blato in bistveno na bioaktivnost bakterij. Kadar je temperatura nizka (8 o C ali manj), so sinteza, rast, tvorjenje kosmov in aktivnost bakterij nizki. Pri temperaturi nad 12 o C, se začnejo kosmi tvoriti hitreje in organske snovi se 22

42 učinkoviteje odstranjujejo. Optimalna temperatura je v območju od 18 o C do 22 o C. Pri temperaturah pod 18 o C imajo bakterije manjšo sposobnost tvorjenja kosmov, ki bi se hitro usedli [80]. Pri višjih temperaturah (nad 38 o C) zaradi nižje biološke aktivnosti bakterij in slabše usedljivosti aktivnega blata začnejo kosmi razpadati. Temperatura ima pomemben vpliv tudi na stopnjo nitrifikacije in rast nitrifikacijskih bakterij. V območju od 8 o C do 30 o C stopnja rasti nitrifikacijskih bakterij narašča linearno. Pri zelo nizkih temperaturah nitrifikacijske bakterije ne rastejo. Nitrifikacija in denitrifikacija potekata optimalno v temperaturnem območju med 15 o C in 22 o C [82]. 2.5 Analizne metode za zaznavanje antibiotikov v odpadnih vodah Ekstrakcija antibiotikov iz okoljskih vodnih vzorcev Ker se antibiotiki pojavljajo v okolju v zelo nizkih koncentracijah (t.j. v ng/l oz. µg/l), je za kemijsko analizo in biološke poizkuse potrebno predhodno koncentriranje spojin iz vodnih vzorcev. To opravimo z različnimi postopki ekstrakcije, med katerimi je največkrat uporabljen postopek ekstrakcije na trdni fazi v kolonski izvedbi (SPE postopek) [83, 84]. Osnovni princip ekstrakcije na trdni fazi je, da se vzorec prefiltrira skozi trdno fazo. Trdna faza zadrži analit, kasneje pa ga eluiramo z majhnim volumnom. Prednosti te tehnike so: visoke koncentracije končnega ekstrakta, selektivnost, velika izbira trdnih faz, možnost avtomatizacije in sklopitve s kromatografijo. Komponenta, ki jo želimo ekstrahirati je porazdeljena med trdno in tekočo fazo. Mobilno fazo (vzorec), ki vsebuje merjeno komponento, nanesemo na ekstrakcijsko kolono s stacionarno fazo (primerno topilo). Ko je ravnotežna porazdelitev merjene komponente med obema fazama dosežena, fazi ločimo s filtracijo ali odlitjem tekoče faze. Polnilo nato osušimo, tako da ga prepihamo z zrakom (plinom), v naslednji fazi pa analit speremo (eluiramo) iz kolone z organskim topilom [83, 84, 85, 86]. 23

43 Postopek ekstrakcije na trdni fazi poteka po naslednjih zaporednih korakih: Kondicioniranje kolone: Aktivacijo kolone izvedemo z nanosom primarnega topila, ki kondicionira površino trdne faze. Največkrat je izvedena z acetonitrilom ali s čistim metanolom, odvisno vrste SPE oz. kartuše. V tem koraku se površina polnila aktivira, zaradi česar se merjena komponenta bolje veže [83, 84, 85,86]. Nanos vzorca: Vzorec odpadne vode nanesemo na ne preveč posušen sorbent. Polnilo bo zadržalo merjeno komponento. Pri izkoristku ekstrakcije, igra volumen vzorca pomembno vlogo. Pomembna je tudi hitrost pretoka vzorca, saj je od nje odvisna kvantitativnost vezave analita na polnilo [83, 84, 85, 86]. Spiranje: Nastale interferenčne komponente, odstranimo iz kolone s spiranjem z vodo ali s primarnim pufrom. Tukaj moramo biti pozorno predvsem nato, da ne izperemo tudi analita [83, 84, 85, 86]. Sušenje: Elucija: Pomembno je, da fazo pred elucijo s topilom, posušimo. Običajno to naredimo z zrakom ali prepihovanjem s suhim dušikom. Sušenje traja nekaj minut [83, 84, 85, 86]. Zadnja stopnja ekstrakcije je elucija, kjer želeni analit speremo iz sorbenta. Elucija poteka počasi, največkrat pa topilo kar samo teče skozi kolono. Izkoristek ekstrakcije je močno odvisen od hitrosti pretoka [83, 84, 85, 86]. Dobljen ekstrakt nato po potrebi dodatno obdelamo in analiziramo z ustrezno kromatografsko tehniko. 24

44 2.5.2 Kromatografske metode za določanje antibiotikov Kromatografija je separacijski proces, kjer najprej ločimo posamezne komponente vzorca in jih nato detektiramo. Za ločevanje analitov se večinoma uporabljajo analitske kolone C18. Pri separaciji antibiotikov iz odpadnih vod s tekočinsko kromatografijo je značilno, da se kot mobilna faza uporablja zmes acetonitrila ali metanola z vodo. Potekali so številni poskusi, za izboljšanje ionizacije analitov ter občutljivosti detekcije MS v analizi antibiotikov, s spremembo mobilne faze, ki je bila opravljena z dodatki, mravljične kisline (FAc), ocetne kisline (AcAc) in amonijevega acetata (AmAc) v različnih razmerjih. Za detekcijo antibiotikov v odpadnih vodah se v mobilni fazi uporabljata tudi oksalna kislina in acetonitril [58, 87, 85]. Za določanje spojin iz različnih razredov zdravil se lahko uporabi tudi tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti (UHPLC). Ta metoda se uspešno uporablja v laboratorijih po vsem svetu za najbolj zahtevne separacije. Pomemben del UHPLC tehnologije je v stacionarni fazi, katere velikost delcev je 1,7 µm ali manj. Kolone, ki se uporabljajo pri tej metodi, so dolge do 10 cm. Uporaba tako majhnih delcev poveča hitrost analize, resolucijo in občutljivost. Zaradi boljše ločitve komponent so tudi vrhovi na kromatogramu ostrejši [58] Kvantifikacija analitov z LC-MS/MS Masna spektrometrija (MS) je učinkovita tehnika za identifikacijo snovi na osnovi analize ionov, nastalih iz osnovne molekule. Za detekcijo antibiotikov iz odpadnih vod se največkrat uporablja tekočinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrijo (LC-MS/MS). Pomembna lastnost te tehnike je, da hkrati uspešno ločuje med učinkovinami z zelo podobnimi fizikalnimi in kemijskimi lastnostmi. Prvi korak pri detekciji tandema masne spektrometrije (MS/MS) je izbira prekurzorja (predhodnika). Prekurzor je ion oz. nabita molekula, ki je predstopnja druge molekule. Splošno velja, da so psevdo-molekularni ioni [M+H] + najboljši prekurzorji, razen za makrolidni antibiotik, eritromicin [58, 72, 82]. Za LC-MS in LC-MS/MS analizo zdravil, sta zaradi njune občutljivosti in trdnosti najpogosteje uporabljeni dve vrsti ionizacije. To sta elektrosprej ionizacija (ESI) in kemijska ionizacija pri atmosferskem tlaku (APCI), pri katerih določamo protonirane [M+H] + ali deprotonirane [M-H] - molekule. Obe tehniki delujeta pri atmosferskem tlaku, ki je primeren za povezavo z LC sistemom. ESI je kot ugodna ionizacijska tehnika prednostna pri določanju ostankov antibiotikov, zaradi večje občutljivosti in boljše obnovljivosti. Še posebej je primerna za polarne in nepolarne ter za toplotno neobstojne analite [58]. Za detekcijo amoksicilina in ciprofloksacina se najpogosteje uporablja elektrosprej ionizacija (ESI) v pozitivnem načinu ter MRM načinu [58]. 25

45 3 Eksperimentalni del Namen doktorske disertacije je bil določiti vsebnosti izbranih antibiotikov v bolnišnični odpadni vodi, in opredeliti njihovo toksičnost ter preveriti učinkovitost izbranih naprednih metod za čiščenje antibiotikov iz bolnišnične odpadne vode. Prav tako smo preizkusili analizno metodo za določevanje amoksicilina in ciprofloksacina in bolnišničnih odpadnih vod. Eksperimentalni del doktorske disertacije smo opravljali v Nacionalnem laboratoriju za zdravje, okolje in hrano, Maribor, na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerze v Mariboru ter na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerze v Ljubljani. 3.1 Materiali Priprava sintetične odpadne vode Pri vseh postopkih čiščenja smo kot vhodno substanco uporabili sintetično odpadno vodo, ki je poleg biološko razgradljivih nečistoč vsebovala tudi hranila in pufrne raztopine. Sintetično odpadno vodo smo pripravili tako, da smo v destilirani vodi raztopili ustrezne količine spojin (Tabela 3-1). ph tako pripravljene raztopine znaša 7,5 ± 0,5. 26

46 Tabela 3-1: Priprava sintetične odpadne vode Spojina pepton goveji ekstrakt urea natrijev klorid (NaCl) kalcijev klorid dihidrat (CaCl 2 2H 2O) magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO 4 7 H 2O) brezvodni kalijev monohidrogen fosfat (K 2HPO 4) osnovna standardna raztopina amoksicilina osnovna standardna raztopina ciprofloksacina deionizirana ali destilirana voda Koncentracija 160 mg/l 110 mg/l 30 mg/l 7 mg/l 4 mg/l 2 mg/l 28 mg/l 1 ml/l 1 ml/l 1 L Realna bolnišnična odpadna voda Vzorce realne bolnišnične odpadne vode smo pridobili iz Splošne bolnišnice Dr. Jožeta Potrča, Ptuj. Vzorce smo zbirali v 1 L rjave steklenice, ter jih takoj po odvzemu, prefiltrirali skozi ustrezen filter papir. 3.2 Postopek odstranjevanja s sub- in super-kritično oksidacijo Aparature Uporabili smo naslednje aparature: Prilagojen visokotlačni in visokotemperaturni cevni reaktor (Maras, Slovenija), HPLC peristaltična črpalka (Gibson, ZDA), Indikator tlaka v reaktorskem sistemu (Hottinger Baldwin Messtechnik, Nemčija), Grelec (Anton Paar, Avstrija), Termostat (Parker Autoclave Engineers, ZDA). 27

47 3.2.2 Opis postopka eksperimenta odstranjevanja Oksidacijo sintetično pripravljene odpadne vode smo izvedli v laboratorijskem visokotlačnem visokotemperaturnem reaktorju. Reaktor (slika 3-1 in slika 3-2) je sestavljen iz reaktorske cevi dolžine 2,5 m in prostornine 4,6 cm 3, zavite v spiralo ter vstavljene v električni grelnik. Cev je izdelana iz železa, niklja in kroma, kar ji daje visoko mehansko in korozijsko obstojnost do temperature 873 K (600 o C). Električni grelec smo regulirali s termostatom. Za črpanje vzorcev vode skozi reaktorski sistem smo uporabili peristaltično črpalko, proizvajalca Gibson HPLC (ZDA), s prilagoditvijo pretoka od 0,05 ml/min do 5 ml/min. Oksidacija s sub-kritično vodo je bila izvedena v temperaturnem območju od 373 K do 647 K pod dovolj visokim tlakom (20-30 MPa), da je voda ostala v tekočem stanju. Oksidacijo s super-kritično vodo smo izvajali pri temperaturah od 647 K do 773 K. Tlak, ki je bil potreben za ohranitev vode v tekočem stanju pri uporabljenih sub in super kritičnih temperaturah, je bil določen s pomočjo parnih tabel. Slika 3-1: Shematski prikaz visokotemperaturnega in visokotlačnega reaktorja. Slika 3-2: Visokotemperaturni in visokotlačni reaktor. Eksperimenti so potekali pri dveh pretokih, in sicer pri 3 ml/min ter 5 ml/min. Čas oksidacije je bil 120 min, vzorčili smo v intervalu 20 min in po 50 ml vzorca. 28

48 3.2.3 Določevanje procesnih parametrov TOC in KPK smo merili s pomočjo Hach Lange kivetnih testov LCK 381 ter LCK Postopek čiščenja z ozonacijo Glavni namen tega dela disertacije je bil raziskati učinek odmerka ozona in H2O2 na učinkovitost čiščenja sintetične odpadne vode, ki vsebuje dodane antibiotike v koncentraciji 1 g/l Aparature Uporabili smo naslednje aparature: Generator ozona Wedeco (Xylem Water Solution, Herford GmbH) tip OCS Modular 8 HC, TOC analizatorja Shimadzu 5000 A (Shimadzu, USA), ph meter (Mettler Toledo) Izvedba poskusa Eksperimente ozonacije smo izvajali v stekleni 250 ml laboratorijski koloni z mehurčki. Višina kolone je bila 20 cm, notranji premer reaktorja 9 cm. Za proizvodnjo ozona smo uporabili čisti kisik, ki se uporablja kot dovodni plin, z generatorjem ozona Wedeco. Ozon je bil s plinskim pražilcem uveden v reaktor na dnu. Za proizvodnjo ozona smo uporabili konstantni pretok kisika 50 L/h in delovni tlak 0,5 bar. Za določanje učinkovitosti odstranjevanja smo kot glavni parameter uporabili skupni organski ogljik (TOC), ki sledi popolni mineralizaciji organskih sestavin. Koncentracijo TOC smo merili v določenih časovnih obdobjih. Reakcijski časi izpostavljenosti ozonaciji so bili 1, 10, 15, 30, 60, 90 in 120 min. 5 ml tekočega vzorca smo ročno odvzemali v intervalih po 30 min in jih prenesli v majhne 10 ml steklene bučke. Analize smo izvedli v dveh paralelkah ter ponovili trikrat. Za merjenje koncentracije ozona v tekoči fazi smo uporabili kolorimetrično metodo hitrega testa (118755, Merck Ozone Test). Ozonacijo smo izvedli pri 55 in 100 mg/l ozona. Poskuse smo izvajali pri sobni temperaturi (20 ± 1 o C). Koncentracijo TOC (mg/l) smo določili v skladu z DIN EN 1484, z uporabo TOC analizatorja Določanje procesnih parametrov Pred ozoniranjem smo ph sintetične odpadne vode naravnali na vrednost 3 z dodatkom žveplove kisline (H2SO4) ter na vrednost 10 s pomočjo natrijevega hidroksida (NaOH). Merili smo s ph metrom (Mettler Toledo). 29

49 V sistem smo dozirali vodikov peroksid (30 % m/m, Ph.Eur., USP, farmacevtski razred AppliChem, Darmstad, Nemčija). Uporabljen odmerek je bil 0,02 mol/l 0,04 mol/l ter 0,06 mol/l H2O Postopek čiščenja z aerobnim reaktorjem Za simulacijo procesa čiščenja biološke čistilne naprave smo uporabili pilotni aerobni reaktor, proizvajalca Armfield (USA). Biološki aerobni pilotni reaktor in vsi njegovi sestavni deli so prikazani na sliki 3-3. Kadar uporabimo maksimalni nivo reaktorske posode, ima le ta skupno prostornino 12,5 L. Regulator nivoja nam omogoča spreminjanje prostornine z odvijanjem ustreznega vijaka in premikanjem preliva v izbrano lego. Dejanska delovna prostornina reaktorja je bila 8 L. Ta je znotraj cilindričnega prepustnega valja, ki zadržuje suspendirano biomaso in prepušča vodo. Vzorec odpadne vode tako pronica skozi pore valja in zapolni prostor v reaktorju med prepustnim valjem in steno reaktorja. Obdelana odpadna voda nato odteka skozi iztok na dnu. Silikonsko tesnilo na dnu reaktorja omogoča tok vode v obroč, pokrov reaktorja pa pritiska valj na tesnilo in zagotavlja tesnost. Reaktor smo napajali s pomočjo peristaltične črpalke, skozi potopljeno cev. Maksimalna hitrost črpanja je 30 obratov/min. Dva grelnika z močjo 100 W, ki sta nameščeni znotraj prepustnega valja na dnu reaktorja, sta vzdrževala temperaturo reaktorja nad temperaturo okolice. Zrak, ki zrači biomaso, smo v reaktor uvajali z majhno zračno črpalko, nameščeno na zunanjem delu upravljalne enote. Zrak vstopa v podnožje reaktorja in prehaja skozi štiri šobe v obliki majhnih mehurčkov, ki so enakomerno porazdeljeni skozi celotno vsebino reaktorja. Pretok zraka v reaktor smo uravnavali z regulacijskim merilnikom pretoka. Slika 3-3: Biološki aerobni pilotni reaktor 30

50 3.4.1 Zagon aerobnega reaktorja in pretok eksperimenta Aerobni reaktor napolnimo s pripravljenim aktivnim blatom (do 8 L aktivne prostornine), ki smo ga pridobili iz obstoječe komunalne čistilne naprave Dogoše, v jesenskem času. Aktivno blato smo ob konstantni temperaturi 24 o C in pretoku zraka 1,7 L/min zračili 12 h. Nato smo začeli s postopkom uvajanja sintetične odpadne vode (γ KPK = mg/l) v reaktor. Po navodilih pripravljena sintetična odpadna voda (razdelek ) ima γ KPK = mg/l, zato jo je bilo pred uvajanjem v aerobni reaktor potrebno razredčiti v razmerju 1:4 (sintetična odpadna voda:destilirana voda). Pretok razredčene sintetične odpadne vode smo naravnali na 2,0 L/d, kar je ustrezalo bivalnemu času 4 d. Hitrost pretakanja skozi vhodno cevko je bila 0,165 cm/s. S pomočjo termostata smo vzdrževali temperaturo raztopine, T = 23,8 o C. Ob tem smo ves čas uravnavali masno koncentracijo suhe snovi (γ ss = 2,5 mg/l). V primeru previsoke koncentracije smo odvečno odpadno blato odstranili skozi ventil, ki se nahaja na spodnji strani reaktorja. Eksperiment smo pri konstantnih pogojih kontinuirno izvajali 4 d. Razredčeno sintetično odpadno vodo smo hranili v posodi (V = 10 L) ob reaktorju in jo vsak dan zamenjali z novo. Tabela 3-2, prikazuje procesne parametre aerobnega čiščenja. Tabela 3-2: Procesni parametri aerobnega čiščenja sintetične odpadne vode. t (h) T ( o C) ρv,z (L/min) γ ss (mg/l) γkpk-v (mg/l) γkpk-iz (mg/l) ph vtok ph iztok η KPK (%) 24 23,8 2 2, ,2 7, ,7 2,3 2, ,3 7, ,8 2,3 2, ,3 7, ,6 2,4 2, ,2 7, ρ (L/d) Iz tabele 3-2 je razvidno, da je proces tekel štiri dni. Med obratovanjem pretočnega reaktorja nam je s pomočjo termostata uspelo uravnavati temperaturo, ki je bila ključnega pomena pri eksperimentu. Nihanje temperature bi namreč lahko vplivalo na aktivnost mikroorganizmov. Da je aerobna reakcija potekla, je bilo potrebno dodatno prepihovanje z zrakom. 31

51 3.4.2 Določanje procesnih parametrov Obratovalna temperatura je bila 25 o C. Koncentracije dušikovih, amonijevih in nitratnih ionov, smo določali s Hach Lange kivetnimi testi LCK 338, LCK 304 in LCK 339. Vrednosti KPK smo določali po COD tetrimetrični metodi 410. Standardizacija amonijevega železo (II) sulfata V 500 ml bučko z okroglim dnom smo odpipetirali 10,0 ml raztopine kalijevega dikromata (c = 0,040 mol/l) in razredčili s 100 ml raztopine žveplove (VI) kisline (c = 4 mol/l). Raztopini smo dodali 2 do 3 kapljice prej pripravljenega feroinskega indikatorja. Tako pripravljeno raztopino smo titrirali z raztopino amonijevega železo (II) sulfata (c = 0,12 mol/l). Koncentracijo amonijevega železo (II) sulfata smo nato v mol/l izračunali po naslednji enačbi (3.1) 10,0 0, ,4 c = = (3.1) V V kjer je: V c volumen porabljene raztopine amonijevega železo (II) sulfata (ml) koncentracija raztopine amonijevega železo (II) sulfata (mol/l). Določitev vrednosti KPK V nadaljevanju opisana metoda za določanje vrednosti KPK je primerna v območju med 30 mg/l in 700 mg/l (O2), zato smo naše vzorce morali predhodno razredčiti. V 500 ml bučko z okroglim dnom smo odpipetirali 10,00 ml razredčenega vzorca, dodali 5,00 ml raztopine kalijevega dikromata in vrelne kamenčke. Zmes smo dobro premešali in počasi dodajali 15 ml raztopine srebrovega sulfata in žveplove (VI) kisline. Vsebino bučke smo premešali in jo hitro povezali s povratnim vodnim hladilnikom. S peščeno kopeljo smo vsebino bučke v 10 min segreli do vrelišča in nadaljevali s segrevanjem še nadaljnjih 110 min. Po 2 h smo bučko na hitro ohladili z vodo do 60 o C, hladilnik sprali z majhno količino destilirane vode in ga odstranili. V bučko smo dodali 45 ml destilirane vode (da je bil skupen volumen 75 ml) in ohladili na sobno temperaturo. Nato smo dodali 2 kapljici feroinskega indikatorja ter titrirali z raztopino amonijevega železo (II) sulfata. Pri slepi meritvi smo namesto 10,00 ml vzorca uporabili 10,00 ml destilirane vode. 32

52 Vrednost KPK, izraženo v mg/l, smo izračunali po enačbi 3.2: 8000 c ( V 1 + V 2 ) fr γkpk = (3.2) V 0 kjer je: γ KPK V1 masna koncentracija KPK (mg/l) volumen porabljene raztopine amonijevega železovega (II) sulfata pri slepi meritvi (ml) V2 V0 volumen porabljene raztopine amonijevega železovega (II) sulfata pri vzorcu (ml) volumen razredčenega vzorca (ml) fr faktor redčitve (/) Najpomembnejši parameter, s katerim smo opisali učinek biološkega čiščenja odpadne vode, je učinek čiščenja glede na KPK (%), ki smo ga podali v procentih glede na vtok odpadne vode in ga določili po naslednji enačbi 3.3: γkpk, vtok - γkpk, iztok η KPK = 100 (3.3) γkpk, vtok 3.5 Test inhibicije porabe kisika z aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija Aparature Uporabili smo naslednje aparature: Posoda za merjenje koncentracije kisika: 300 ml Winklerjeve stekleničke Galvanska kisikova sonda CellOx 325 (WTW, ZDA), ph meter MA 5740 (Iskra, Slovenija), običajna laboratorijska steklovina Priprava reagentov Pripravili smo si naslednje reagente: N-alil tiosečnina (ATU) (c = 11,6 mg/l) 33

53 Referenčna raztopina (c = 1 g/l) Testna raztopina anorganski del: Pripravili smo si raztopino, ki je vsebovala 3 g sečnine CO(NH2)2; 0,7 NaCl; 0,4 g CaCl2 2H2O; 0,2 g MgSO4 7H2O; 2,8 g K2HPO4 v 1000 ml deionizirane vode. Lahko biorazgradljiva snov (20 g/l): Raztopili smo 20,0 g peptona (Sigma Aldrich, Nemčija) v 1000 ml deionizirane vode. Raztopina HgCl2 (10 g/l) Postopek izvedbe Aktivno blato za test smo pridobili iz komunalne biološke čistilne naprava v Ljubljani v zimskem času. Blato smo trikrat sprali z vodovodno vodo, da smo ločili odpadno vodo od aktivnega blata. Blato smo nato prezračevali in mešali 24 h. Pred izvedbo poskusov smo določili koncentracijo aktivnega blata, in sicer tako, da smo 10 ml prefiltrirali skozi filtrni papir in ga posušili pri 105 o C do konstantne mase. V pet 50 ml steklenih bučk smo odpipetirali po 1,6 ml pripravljene raztopine peptona in 1,6 ml pripravljenega anorganskega dela testne raztopine. V tri bučke smo nato odpipetirali različne koncentracije testiranega vzorca in v zadnjo bučko, kjer smo imeli abiotski vzorec, dodali 0,5 ml HgCl2, zato da preprečimo biološko razgradnjo. Tik pred pričetkom testa, smo v bučko s slepim vzorcem dodali izračunano količino aktivnega blata, razredčili z deionizirano vodo do oznake, da smo dobili koncentracijo aktivnega blata c = mg/l. Nato smo slepi vzorec prezračevali z zrakom na magnetnem mešalniku, 30 min. Ostalim vzorcem smo blato dodajali v 7 min intervalu. Po 30 min smo vsako mešanico prelili v kisikovo stekleničko, vanjo namestili kisikovo elektrodo tako, da je bil sistem neprodušno zatesnjen. Koncentracijo raztopljenega kisika smo nato s kisikovo elektrodo merili 6 min, ter 30 s odčitali rezultat. Postopek smo ponovili še s preostalimi testnimi zmesmi z različnimi koncentracijami vzorca. Abiotski vzorec smo prezračevali brez dodatka aktivnega blata. Test smo izvajali pri temperaturi 20 ± 2 o C. Iz danih rezultatov smo nato narisali diagram odvisnosti koncentracije kisika od časa, za vse koncentracije vzorca, slepi test in abiotski test ter izračunali naklone premic. Nato smo iz naklonov izračunali inhibicije pri posameznih koncentracijah. Za izračun koncentracije snovi (EC50), ki povzroča 50 % inhibicijo porabe kisika vseh mikroorganizmov aktivnega blata in tako določitev 30minEC50, smo narisali diagram inhibicije v odvisnosti logaritma koncentracij in koncentracijo izračunali iz enačbe premice. 34

54 Specifično hitrost porabe kisika v slepem vzorcu izračunamo po enačbi (3.4): QO 2 = r γ ss (mg/g h) (3.4) kjer je: QO2 specifična hitrost porabe kisika v slepem vzorcu (mg/g h) r γ ss totalna hitrost porabe kisika v slepem vzorcu (mg/l h) masna koncentracija aktivnega blata (g/l) Inhibicijo porabe kisika vseh mikroorganizmov, heterotrofnih in nitrifikacijskih, smo izračunali po naslednjih enačbah 3.5, 3.6 ter 3.7: rt - rta I = (1- ) 100 (3.5) rtb kjer je: I inhibicija porabe kisika vseh mikroorganizmov (%) r T r TA r TB totalna hitrost porabe kisika v vzorcu (mg/l h) totalna hitrost porabe kisika v abiotskem vzorcu (mg/l h) totalna hitrost porabe kisika v slepem vzorcu (mg/l h). rh - rha IH = (1- ) 100 (3.6) rhb kjer je: IH inhibicija porabe kisika heterotrofnih mikroorganizmov (%) r H r HA r HB totalna hitrost porabe kisika heterotrofnih mikroorganizmov v vzorcu (mg/l h) totalna hitrost porabe kisika heterotrofnih mikroorganizmov v abiotskem vzorcu (mg/l h) totalna hitrost porabe kisika heterotrofnih mikroorganizmov v slepem vzorcu (mg/l h) rt - rh II = (1- ) 100 (3.7) rtb - rhb kjer je: II inhibicija porabe kisika nitrifikacijskih mikroorganizmov (%). 35

55 3.6 Tekočinska kromatografija Namen doktorske naloge je bil preizkusiti in uporabiti analizno metodo za določevanje ciprofloksacina in amoksicilina. Uporabili smo metodo internega standarda, ki omogoča izboljšanje natančnosti. Optimirali smo kolono, mobilno fazo ter pripravo vzorca. Eksperiment smo izvedli v Nacionalnem laboratoriju za zdravje, okolje in hrano, Maribor Kemikalije in reagenti Vsi reagenti in topila so bili ustrezne kvalitete in analitske čistosti. Uporabili smo: nano Pure destilirano vodo (18,2 MΩcm), metanol (99,9 %, HPLC grade, Merck), acetonitril (99,9 %, HPLC grade, Merck), mravljično kislino ( %, Reag. ACS., Fluka) in klorovodikovo kislino (37 %, Reag. ACS., Fluka) Standardne raztopine antibiotikov Uporabili smo osnovni standardni spojini amoksicilina (Amoxicillin:3H2O, C16H19N3O5S 3H2O, M = 419,45 g/mol, 85 % čistost) proizvajalca Sigma-Aldrich (Nemčija) in ciprofloksacina (Ciprofloxacin C17H18FN3O3, M = 331,34 g/mol, 98 % čistost) proizvajalca Sigma-Aldrich (Nemčija). Kot interni standard pri določanju amoksicilina smo uporabili (Amoxicillin:3H2O Phenyl-13C6, *C6C10H19N3O5S 3H2O, M = 425,37 g/mol, 95 % čistosti) proizvajalca Cambridge Isotope Laboratories (ZDA). Pri določanju ciprofloksacina pa smo kot interni standard, uporabili (Ciprofloxacin-d8 hydrochloride hydrate, C17D8H10FN3O3 HCl xh2o, M = 375,85 g/mol, 98 % čistost) proizvajalca Sigma-Aldrich (Nemčija). Pri delu smo uporabili: ekstrakcijske kolone: SPE cartridge, 60 mg/3 ml, proizvajalca Phenomenex (ZDA), analitsko kolono: Synergi Fusion-RP 100 A (50 mm x 2,0 mm I.D., 2,5 µm) proizvajalca Phenomenex (ZDA) in kromatografske steklene viale (V = 2 ml) Instrumentalna oprema Pri izvajanju poskusov, smo uporabili naslednjo opremo: 36

56 analitska tehtnica, Mettler Toledo (Švica), avtomatske pipete BRAND, laboratorijska centrifuga Eppendorf (Nemčija), sistem za trdno-fazno ekstrakcijo, ultrazvočna kopel, tekočinski kromatograf (HPLC) Agilent Technologies 1260 Infinity (ZDA), tandemski masni spektrometer (MS/MS), Triple quadrupole API 2000 (ZDA), računalniška oprema Analyst Software (ZDA) Kromatografski pogoji Za kromatografsko separacijo smo uporabili Synergi Fusion-RP 100 A analitsko kolono (50 mm x 2,0 mm I.D., 2,5 µm) proizvajalca Phenomenex. Kolona je bila pri sobni temperaturi, medtem ko je bila temperatura injektorja naravnana na 23 o C. Mobilna faza A je bila sestavljena iz 0,1 % mravljične kisline v mešanici topil acetonitril/voda v volumskem razmerju 5:95. Kot mobilno fazo B smo uporabili 0,1 % mravljično kislino v mešanici topil metanol/acetonitril v volumskem razmerju 50:50. Pretok skozi kolono je bil 300 µl/min, čas analize pa 17 min. Začeli smo s 100 % mobilne faze A in nadaljevali s 100 % mobilne faze B do 7 min in nato spet uporabili 100 % A Priprava standardnih raztopin in analiza vzorcev Pripravili smo osnovni standardni raztopini amoksicilina in ciprofloksacina s koncentracijo 1 mg/l. Kot topilo smo uporabili raztopino metanol/voda v razmerju 1:1 za amoksicilin, ter raztopino metanol/voda v razmerju 1:1 z dodatkom 0,2 % klorovodikove kisline za ciprofloksacin. Iz obeh osnovnih standardnih raztopin smo pripravili S1-MIX, kjer smo v 20 ml stekleno bučko, odpipetirali 500 µl So,ciprofloksacin in 500 µl So,amoksicilin ter do oznake napolnili z metanolom. Tako smo pripravili koncentracijo ciprofloksacina 25 µg/ml ter amoksicilina 20,94 µg/ml. Po enakem postopku smo si pripravili tudi osnovni standardni raztopini internih standardov amoksicilina in ciprofloksacina, kar smo poimenovali S2-MIX. V tabeli 3-3 so prikazani potrebni volumni za pripravo delovnih standardnih raztopin (STD), ki smo jih uporabili za umeritveno krivuljo. 37

57 Tabela 3-3: Volumni raztopin za pripravo delovnih standardnih raztopin. SPOJINA STD-005 V(µL)/20 ml STD-1 V(µl)/20 ml STD-2 V(µl)/20 ml STD-3 V(µl)/20 ml STD-4 V(µl)/20 ml STD-5 V(µl)/20 ml S1-MIX S2-MIX Zapisane volumne S1-mix ter S2-mix smo pripravili v 20 ml bučkah, ki smo jih nato do oznake dopolnili s topilom. Kot topilo smo uporabili mobilno fazo A (0,1 % mravljične kisline v mešanici 5 % acetonitril/voda). Koncentracije standardnih raztopin antibiotikov, ki smo jih pripravili, prikazuje tabela 3-4. Raztopine so bile obstojne do 14 d v hladilniku pri temperaturi 4 o C. Tabela 3-4: Koncentracije antibiotikov v koncentracijskih nivojih. SPOJINA STD-005 (µg/l) STD-1 (µg/l) STD-2 (µg/l) STD-3 (µg/l) STD-4 (µg/l) STD-5 (µg/l) Amoksicilin ciprofloksacin Amoksicilininterni standard ciprofloksacininterni standard Z upoštevanjem postopka priprave vzorcev in koncentracij raztopin smo študirali linearnost s LC-MS/MS v območju od 50 do 1000 ng/ml. Za določanje izbranih antibiotikov smo razvili metodo tekočinske kromatografije sklopljene s tandemsko masno spektrometrijo, tako da smo uporabili metodo izotopskega redčenja, kjer smo kot interni standard uporabili Amoxicillin:3H2O (Phenyl-13C6) ter Ciprofloxacine-d8-hydrochloride hydrate. S tem, ko smo uporabili interni standard, smo se izognili tudi vplivu matriksa. Vpliv matriksa je namreč pomemben pri analizah realnih vzorcev, saj zaradi vpliva matriksa lahko pride do povečanja ali zmanjšanja odziva analita Instrumentalni pogoji Pri eksperimentih smo uporabili tekočinski kromatograf Agilent Technologies 1260 Infinity, povezan s tandemskim trojno-kvadropolnim masnim spektrofotometrom API Osnovni 38

58 pogoji na masnem detektorju so bili: ionizacija ESI+, kapilarna napetost 2,9 kv, napetost na stožcu 43,0 V, temperatura izvora 120 o C, desolvacijska temperatura 220 o C, plin na stožcu 96 L/h. Za detekcijo izbranih antibiotikov v odpadni vodi smo si najprej pripravili standardno raztopino s koncentracijo 1 mg/ml. Optimizacijo (tabela 3-5) fragmentacije smo izvedli z neposrednim injiciranjem spojine s pretokom 50 µl/min. Tabela 3-5: Optimalne vrednosti pogojev. Spojina Starševski ion (m/z) Hčerinski ion (m/z) CE (V) Starševski ion (m/z) Hčerinski ion (m/z) CE (V) Amoksicilin 366, , , ,2 19 Ciprofloksacin 332, , , ,2 23 Amoksicilin- 372, , , , C6 Ciprofloksacind8 340, , , ,4 23 Starševski in hčerinski ioni so podani v enoti m/z, kjer je m masa ionov in z število polnjenja ionov. Analize so bile izvedene z porabo multirezidualnega MRM načina (Multiple Reaction Monitoring). 39

59 4 Rezultati in diskusija Amoksicilin in ciprofloksacin smo iz sintetične bolnišnične odpadne vode odstranjevali s tremi metodami: sub in super kritično oksidacijo, ozonacijo ter aerobno. Vsebnost antibiotikov pred in po čiščenju smo določevali s tekočinsko kromatografijo (LC) s tandemskim masnim spektrometrom (LC/MS-MS). Prav tako smo spremljali TOC in KPK vsebnost. Rezultate vsebnosti antibiotika, smo predstavili s pomočjo računalniškega programa Analyst Software. 4.1 Oksidacija v sub- in super-kritični vodi Za določanje vpliva temperature na koncentracijo amoksicilina in ciprofloksacina smo izvedli poskuse pri različnih oksidacijskih temperaturah, in sicer 473 K, 573 K, 673 K in 773 K in tlaku 250 bar. Stopnja degradacije antibiotikov v odvisnosti od temperature je prikazana na sliki 4-1 pri qv = 3 ml/min ter na sliki 4-2 pri qv = 5 ml/min. γ (µg/l) Slika 4-1: Vpliv temperature na koncentracijo antibiotikov pri q v = 3 ml/min in p = 250 bar. 40

60 γ (µg/l) Slika 4-2: Vpliv temperature na koncentracijo antibiotikov pri q v = 5 ml/min in p = 250 bar. Kot je prikazano na sliki 4-1 ter sliki 4-2, se je koncentracija analitov znižala s povišanjem temperature, s čimer se je povečala učinkovitost njihove razgradnje; 97,90 % pri 573 K in 97,20 % pri 773 K za amoksicilin in ciprofloksacin. Veliko učinkovitost čiščenja amoksicilina smo dosegli že pri sub kritičnih pogojih (250 bar in 473 K), medtem ko smo do maksimalnega odstranjevanja ciprofloksacina prišli pri super kritični temperaturi. Razlog za doseganje takšne učinkovitosti pri temperaturah blizu kritične točke vode je mogoče pojasniti s povečanjem topnosti organskih spojin v vodi zaradi zmanjšane dielektrične konstante vode. Le-ta je bila povečana že s hidrolizno reakcijsko močjo, ki temelji na maksimalnem ionskem produktu vode. Iz danih rezultatov lahko ugotovimo, da temperatura pomembno vpliva na končno koncentracijo amoksicilina in ciprofloksacina. V primerjavi s ciprofloksacinom je amoksicilin degradiral približno 2-krat hitreje. Ciprofloksacin se je izkazal kot termično stabilna spojina do 673 K, medtem, ko se je amoksicilin skoraj popolnoma razgradil že pri 473 K. Ugotovimo lahko, da sta višja temperatura in nižji pretok izboljšala topnost amoksicilina in ciprofloksacina, tako da sta se spojini odstranili hitreje. Višja temperatura povzroča povišanje viskoznosti pri plinih in zmanjšanje viskoznosti pri tekočinah, ki povzročajo visoko pretočnost, visoko molekularno mobilnost in posledično visoko toplotno prevodnost vode [101]. Prav tako se dielektrična konstanta vode, ki kaže lastnosti topil in ionsko disociacijo soli v vodi, s povečanjem temperature in upadajočo gostoto znižuje, kar povzroča povečanje topnosti hidrofobnih organskih spojin (HOC) [88, 89, 90, 91]. Super kritična voda je torej odlično topilo za homogene medije brez faznih meja, prav tako pa zagotavlja hitro in popolno 41

61 reakcijo [105, 106]. Navsezadnje ta proces lahko štejemo za zeleno in okolju prijazno tehnologijo, saj ne oddaja škodljivih snovi v okolje [92, 93, 94, 95, 96]. S sub in super kritično oksidacijo so že izvedli obdelavo nekaterih materialov, kot so metan [97, 98, 99], metanol [100, 101, 102, 103, 104], etanol [105, 106], dušik [107] in fenol [108, 109, 110, 111]. Poleg tega so bile v sub in super kritični vodi učinkovito odstranjene tudi spojine, ki so vključevale benzen [112], bifenil [93, 113, 114, 115], amin [116, 117] in piridin [118, 119]. Tavakolia in sod. [120] so tehnologijo sub in super kritične oksidacije uporabili za vodo kontaminirano s tremi farmacevtskimi spojinami (karbamazepin, metoprolol in sulfametoksazol). Študirali so vpliv spreminjanja temperature in časa na odstranjevanje teh spojin v šaržnem reaktorju. Temperatura je bila v območju od 473 K do 773 K ter časi zadrževanja od 5 min do 50 min. Rezultati, so pokazali veliko učinkovitost odstranjevanja, saj se je uničilo 90,27 % karbamazepina, 99,99 % metoprolola in 98,84 % sulfametaksazola po 20 min izpostavljenosti 623 K, 673 K in 573 K. V primerjavi z običajnimi metodami obdelave farmacevtskih odpadov, zagotavlja ta tehnologija večjo učinkovitost razgradnje (približno %), saj jo je mogoče doseči v krajšem obdobju Določanje KPK in TOC Oksidativna razgradnja organskih spojin je zelo hitra pri super-kritičnih pogojih. S pomočjo KPK ter TOC meritev smo določili količino oksidanta, ki je reagiral z našim vzorcem pod nadzorovanimi in konstantnimi pogoji. Slika 4-3 predstavlja odvisnost koncentracije TOC glede na čas. Slika 4-3: Zmanjšanje vrednosti KPK v odvisnosti od časa. 42

62 Iz slike 4-3 lahko vidimo, da je bila začetna koncentracija KPK na vstopu v reaktor okrog 2000 mg/l. Najučinkovitejša je bila temperatura 773 K, pri kateri se je KPK znižal za 76 %. Najmanjši učinek je bil opazen pri sub-kritičnih pogojih, pri temperaturi 473 K, kjer je KPK padel le za 3 %. Vidimo lahko, da smo dosegli visoko učinkovitost čiščenja, ki se je intenzivirala s povečano temperaturo. Domnevamo, da smo tako visoko stopnjo čiščenja dosegli v tako kratkem času zaradi majhne kapacitete reaktorja in zelo majhnega pretoka sintetične odpadne vode. V nadaljevanju predstavlja slika 4-4 odvisnost koncentracije TOC glede na čas. Slika 4-4: Zmanjšanje vrednosti TOC v odvisnosti od časa. Učinkovitost zmanjšanja TOC (mg/l) v sintetični odpadni vodi je prikazana na sliki 4-4. Kot je bilo pričakovano se je s povečanjem reakcijske temperature znižala vrednost skupnega organskega ogljika v vodi, kar pomeni da se je večina antibiotika razgradila v CO2 in H2O [88]. 4.2 Ozonacija odpadne vode V reaktor smo ozon dovajali skozi dno reaktorja, kar pomeni da smo na dnu imeli višje koncentracije ozona, neodvisno od koncentracije onesnaževal. Višje koncentracije stimulirajo ozonske reakcije z drugimi snovmi v vodi, kar lahko prispeva k nastanku stranskih produktov (bromatov) [29]. Hidroksilne radikale smo generirali pri sobni temperaturi in atmosferskem tlaku. Razkroj ozona in s tem hitrejšo transformacijo hidroksilnih radikalov lahko umetno pospešimo s povečanjem ph. V primeru, da je vrednost ph v območju od 8 do 10, se lahko poveča koncentracija ozona. Stopnja degradacije amoksicilina in ciprofloksacina ter proizvodnja njunih stranskih produktov je bistveno odvisna od vrednosti ph. Ozon lahko reagira 43

63 neposredno z amoksicilinom in ciprofloksacinom, lahko pa se razgrajuje in proizvaja hidroksilne radikale. Kislinske razmere (ph med 1 in 7) preferirajo neposredne reakcije ozona, medtem ko alkalni pogoji (ph med 7 in 14) podpirajo nastanek HO radikalov. Na naslednjih slikah je predstavljena TOC koncentracija in koncentracija amoksicilina/ciprofloksacina pri ph = 3,70 (slika 4-5), ph = 10,85 z dodatkom H2O2 (slika 4-6) in ph = 10,85 (slika 4-7). Slika 4-5: TOC koncentracija in koncentracija amoksicilina/ciprofloksacina pri ph = 3,70. Slika 4-6: TOC koncentracija in koncentracija amoksicilina/ciprofloksacina pri ph = 10,85 z dodatkom H 2O 2. c (µg/l) c (µg/l) c (µg/l) Slika 4-7: TOC koncentracija in koncentracija amoksicilina/ciprofloksacina pri ph = 10,85. Učinek ozoniranja amoksicilina in ciprofloksacina smo uspešno ocenili ob upoštevanju dveh spremenljivk, ph vrednosti in dodatka vodikovega peroksida. Rezultati so pokazali, da se je 44

64 ob času povečanja ozonacije, zmanjšala koncentracija iskanih antibiotikov. Kot je prikazano, je ozonacija učinkovita pri odstranjevanju amoksicilina in ciprofloksacina iz sintetične bolnišnične odpadne vode. Degradacija s pomočjo vodikovega peroksida (H2O2) je bila hitrejša in učinkovitejša. Če primerjamo, se je po dovajanju enakega odmerka ozona pri ph 3,70 razgradilo le 15 % amoksicilina in ciprofloksacina. Do tega je prišlo zato, ker je ob začetku reakcije pri ph 3,70 molekularni ozon v glavnem razgradil molekule amoksicilina in ciprofloksacina, medtem ko so pri ph 10,85 hidroksilni radikali lahko razgradili molekule amoksicilina, ciprofloksacina ter njunih razgradnih produktov. Za oba iskana antibiotika (amoksicilin in ciprofloksacin), katerih začetna koncentracija je bila in mg/l, je bila razgradnja najbolj izrazita pri ph 10,85, kjer je dosegla > 80 %. Celotna koncentracija ciprofloksacina je ostala konstantna v prvih 10 min in nato padla na 41 % pri 30 min ozoniranju. Koncentracija amoksicilina se je zmanjšala za 95 % že po 30 min ozoniranja. Enako smo opazili tudi pri meritvah TOC, ki je padel s približno 350 mg/l na 50 mg/l v 120 min ozonacijskem času. Učinek koncentracije H2O2 v prisotnosti ozoniranja pri razgradnji antibiotika je prikazan na sliki 4-8. Slika 4-8: Učinek različnih koncentracij H 2O 2 na zmanjšanje TOC v procesu ozonacije. Iz slike 4-8, vidimo, da se je v procesu ozon/h2o2 učinkovitost razkroja amoksicilina in ciprofloksacina v primerjavi z neposrednim ozoniranjem povečala že pri nizkih začetnih koncentracijah H2O2 (0,02 mol/l). Efektivna degradacijska učinkovitost se je postopoma povečevala s povečano koncentracijo H2O2. Iz vseh navedenih poskusov je ugotovljeno, da je optimalna koncentracija H2O2 0,02 mol/l, pri kateri se 96 % amoksicilina in 95 % ciprofloksacina absorbira iz suspenzije pri ph 10,85 po 60 in 120 min ozoniranja. Po ozonaciji 45

65 so bile vse glavne sestavine prvotnih vzorcev vode skoraj popolnoma degradirane. Vzorce smo iz reaktorja jemali v določenem časovnem obdobju ozonacije (30, 60, 90 ter 120 min). Uporaba vodikovega peroksida kot oksidanta pri ozoniranju je običajno izpostavljena kot zanimiva strategija za izboljšanje učinkovitosti procesa. Pravzaprav H2O2 skozi reakcijo z ozonom spodbuja proizvodnjo hidroksilnih radikalov. Medtem ko so ob prisotnosti vodikovega peroksida potrebne tri molekule O3 potrebne za eno HO, lahko samo ena molekula ozona tvori en hidroksilni radikal [121]. Ta proces velja za učinkovitega in poceni [121]. Saquib s sod. so ugotovili, da je sistem O3/H2O2 učinkovit za odstranjevanje atrazina iz vode in ima višji potencial za razgradnjo obstojnih onesnaževal iz pitne vode kot posamezno ozoniranje. Duguet in sod. so ugotovili, da vodikov peroksid izboljšuje odstranjevanje organskih snovi in prenašanje mase ozona pri čiščenju pitne vode. Kljub temu pa je potrebno skrbno izbrati koncentracijo H2O2, saj se morajo upoštevati tudi stroški H2O2. Poleg tega pa lahko presežek H2O2 delujejo kot radikalni čistilec, ki zmanjša učinkovitost procesa. Vasconcelos je izvedel študijo, ki proučuje rezultate delovanja foto-indukcijske oksidacije, heterogene fotokatalize, ozonizacije in peroksona pri razgradnji fluorokinolonskega protimikrobnega ciprofloksacina v bolnišnični odpadni vodi. Za spremljanje zmanjšanja koncentracije ciprofloksacina so uporabili tekočinsko kromatografijo z detekcijo fluorescence (LC-FLD). Kot je pričakovano, je bila foto-indukcijska oksidacija veliko počasnejša od ostalih procesov pri popolni degradaciji ciprofloksacina. Heterogena fotokataliza in perokson sta pripeljala do skoraj popolne degradacije ciprofloksacina po 60 min obdelave. Kot najboljši postopek se je izkazala ozonacija, saj je bila popolna degradacija dosežena v 30 min. Ugotovljeno je bilo, da so stranski produkti, nastali med uporabo procesov, zelo podobni. Poleg tega na podlagi podatkov, dobljenih iz literature [85, 122], obstajajo nekateri dokazi, da stranski produkti izhajajo iz oksidacije piperazinske skupine. Na sliki 4-9 so prikazani LC- MS/MS kromatogrami raztopin, odvzetih v različnih časovnih obdobjih ozoniranja. 46

66 Intenziteta (cps) Intenziteta (cps) t (min) t (min) Slika 4-9: Kromatogrami vzorcev ciprofloksacina (levo) in amoksicilina (desno), odvzetih med postopkom ozonacije. Vidimo, da daljši reakcijski čas vodi do zmanjšanja signala. N (4) amin v ciprofloksacinu je eno izmed pričakovanih mest ozonskega napada, njegova deprotonacija pa uravnava reaktivnost ciprofloksacina na ozon pri visokem ph. Zato se verjetno tvorijo oksidacijski produkti piperazinskega dela. Glede na to, da je značilen kinolonski del odgovoren za protimikrobno delovanje fluorokinolov, bo obdelana odpadna voda ohranila svoj okoljski pomen, v primeru da se tvorijo oksidacijski produkti piperazinske skupine [29]. Ahmed in sod. [123, 124] so ugotovili, da je ozonacija zelo učinkovita za razgradnjo endokrinih spojin in pesticidov. To vedenje je bilo povezano z visokim porazdelitvenim koeficientom (Kow) in občutljivostjo za reakcijo z ozonom. Tudi če je ta postopek zmožen odstraniti veliko farmacevtskih spojin, so med njimi tudi perindopril, fenitoin, sertralin in ketoprofen, ki se v manjšem obsegu odstranijo z oksidacijo ozona. Ozon običajno reagira s hidrofobnimi frakcijami organskih spojin, kot so hidrofobna kislina in nevtralne vrste. Po obdelavi se aromatični značaj zmanjša, medtem ko se alifatski in ketonski značaj povečata. Huber s sod. [125] je pokazal učinek ozoniranja na 9 testiranih farmacevtskih spojin (bezafibrat, karbamazepin, diazepam, diklofenak, 17-etinilestradiol, ibuprofen, iopromid, sulfametoksazol in roksitromicin). Avtorji so ugotovili, da se kinetične konstante, določene med oksidacijo z uporabo ultrazvočne vode, lahko uporabijo za napovedovanje obnašanja farmacevtskih izdelkov, medtem ko se razgradijo v drugem matriksu, kot so naravne vode, ki se uporabljajo kot vir pitne vode. Ternes in soavtorji [126] so potrdili, da 0,5 mg O3/L zmanjša 47

67 do 90 % diklofenaka in karbamazepina, medtem ko je za 50 % razgradnje brezafibrata potrebnih 150 mg O3/L. Po drugi strani je bila klofibrinska kislina stabilna tudi pri uporabi 30 mg O3/L. Ozonizacija je na splošno sposobna odstraniti mikroonesnaževalce, hkrati pa tudi inaktivirati bakterije in viruse pri nizkih odmerkih ozona, kot je 260 mg O3/L. Rosal in sod. [127] so ugotovili, da čeprav se s konvencionalno biološko obdelavo odpadne vode lahko odstrani le manj kot 20 % večine farmacevtskih spojin, se je z ozonacijo z odmerki ozona, manjšimi od 36 mg O3/L uspešno odstranila večino spojin, vključno s tistimi, ki so odporne na biološko razgradnjo. Preučili smo tudi, različne vsebnosti ozona na učinek odstranitve TOC, kar je prikazano na sliki Slika 4-10: Vpliv različnih koncentracij ozona na vsebnost TOC. Volumen plina je odvisen od temperature in tlaka. Podana enota Nm 3 pomeni, da je bil volumen merjen pri normalnih pogojih, torej pri tlaku 101,325 kpa ter 273 K. Enota g/nm 3 je zato enaka enoti mg/l. Vidimo, da smo najvišjo učinkovitost dosegli pri koncentraciji ozona 100 mg/l. Rosal in sod. [128] so analizirali alkalno ozoniranje (ph ~ 8) in ozon s pomočjo procesov vodikovega peroksida pri obdelavi sekundarnega čiščenja komunalnih odplak. V raziskavi so uporabili 33 organskih spojin (farmacevtski izdelki in metaboliti) v koncentracijskem območju ng/l. Učinkovitost odstranjevanja posameznih spojin je bila po 5 minutah vedno večja od 90 %. Vendar pa je potrebno med ozoniranjem vode, ki vsebuje naravne organske snovi ali 48

68 karbonatne ione, paziti, saj lahko ph, odvisno od koncentracije in raztopine, spodbuja ali zavre reakcije hidroksilnih radikalov [129] in tako neposredno vpliva na vlogo ozona med čiščenjem. Z odstranjevanjem oksidanta [130] lahko preprečimo učinek matriksa. Zwiener in Frimmel [130] sta dosegla razgradne vrednosti 98 % klofibrinske kisline, ibuprofena in diklofenaka, pri čemer sta uporabila 5,0 mg O3/L in 1,8 mg H2O2/L. 4.3 Aerobni pretočni reaktor Pri danih obratovanjih je bila vrednost ph ves čas približno enaka, in ni prešla v območje kislosti ali bazičnosti. Iz tega lahko sklepamo, da so bili mikroorganizmi aktivni tudi po 96 h, saj je bilo v reaktorju še vedno nevtralno območje. Slika 4-11 nam predstavlja vsebnosti KPK na vtoku in iztoku iz aerobnega pretočnega reaktorja. Medtem, ko slika 4-12 predstavlja, učinek čiščenja glede na čas obratovanja. Slika 4-11: Vsebnosti KPK na vtoku in iztoku. Slika 4-12: Učinek čiščenja v odvisnosti od časa. Iz slike 4-12 vidimo, da smo že po enem dnevu dosegli visoko učinkovitost čiščenja, ki se je stopnjevala do zadnjega dne. Kot pri ostalih predlaganih postopkih čiščenja, tudi tukaj predvidevamo, da je do tako visoke stopnje čiščenja v tako kratkem času prišlo zaradi majhne 49

69 prostornine aerobnega pretočnega reaktorja in zelo majhnega dotoka sintetične odpadne vode. Mikroorganizmi so se po prenosu v laboratorijski reaktor hitro prilagodili, saj so bili pogoji v njem naravnani podobno, kot v njihovem primarnem okolju. Iz danih rezultatov lahko sklepamo, da je reakcija potekala zelo hitro. Pri obratovanju aerobnega pretočnega reaktorja smo pri slepi probi vzorcem sintetične odpadne vode določili koncentracijo skupnega dušika, amonija in NO3, katere vrednosti so prikazane v tabeli 4-1. Tabela 4-1: Koncentracija TN, NH 4 in NO 3 pri eksperimentu slepe probe. Oznaka t (h) γ TN (mg/l) γ NH4 + (mg/l) γ NO3- (mg/l) vtok ,4 / iztok 6 5,4 0,2 3 iztok 24 2,6 0,2 < 0,5 vtok ,6 / iztok 30 1,5 0,2 < 0,5 iztok 45 2,6 0,1 < 0,5 Iz tabele 4-1 ugotovimo, da je bila koncentracija skupnega dušika na vtoku v aerobni pretočni reaktor približno 96 mg/l. Predvidevamo, da je do nihanja vrednosti koncentracije skupnega dušika prišlo zaradi dodatka peptona, katerega natančna sestava ni znana, vendar pa vsebuje dušikove spojine. Upoštevajoč, da smo vsak dan pripravili svežo sintetično odpadno vodo, je morda do nihanja vsebnosti organskega dušika prišlo zaradi prisotnosti različnih koncentracij peptona že v vedru. Koncentracija skupnega dušika je hitro padla, zato lahko sklepamo, da so se mikroorganizmi zelo hitro prilagodili novemu okolju. Dotok sintetične odpadne vode je bil 1,39 ml/min. Koncentracija amonijevih ionov je bila na vtoku višja, kot na iztoku, kar smo pričakovali saj med samim procesom čiščenja nastajajo tako nitratni in nitritni ioni. Malo je bilo tudi NO3, čeprav smo po 6 h lahko opazili nekoliko višjo vrednost. 50

70 4.4 Test toksičnosti Strupenost vodnih vzorcev smo ugotavljali z mešano mikrobno združbo aktivnega blata. Aktivno blato iz obstoječe čistilne naprave smo najprej izpostavili različnim koncentracijam amoksicilina in ciprofloksacina, da smo ugotovili, pri kateri koncentraciji sta antibiotika škodljiva vodnim mikroorganizmom (tabela 4-2). Tabela 4-2: Inhibicija vodnih mikroorganizmov pri različnih koncentracijah antibiotikov. vzorec (mg/l) I (%) Sintetična odpadna voda, ki je vsebovala pod 15 mg/l vsakega od izbranih antibiotikov ni imela velikega negativnega vpliva na testne mikroorganizme. Ob dodatku odpadne vode, ki je vsebovala višje koncentracije kot 15 mg/l smo zaznali zmanjšanje mikrobne aktivnosti. Pri testu je bila zaviralna koncentracija (IC50). V preliminarnem testu smo določili, da ima sintetična odpadna voda specifičen vpliv na mikroorganizme v aktivnem blatu med koncentracijami 20 in 80 mg/l. Izbrali smo koncentracije, ki povzročajo inhibicijo od 30 do 90 % (koncentracije od 10 do 40 mg/l). Te vrednosti smo logaritmirali in z metodo najmanjših kvadratov določili vrednost 24hEC50 (slika 4-13). Slika 4-13: Določanje vsebnosti 24hEC 50 z metodo najmanjših kvadratov. 51

71 Iz enačbe premice smo izračunali koncentracijo x (oz. logaritem koncentracije), ki povzroči 50 % inhibicijo (y = 50). Koncentracija 17 mg/l je 24hEC50, saj povzroči imobilnost 50 % organizmov. Rezultat lahko podamo tudi v obliki strupenostnih enot (TU), ki za naš primer znaša 81 in smo jo izračunali po enačbi : 100 TU = (4.1) EC 50 Ob prisotnosti lahko razgradljivih snovi je aktivno blato porabljajo raztopljen kisik, hitrost porabe pa je bila odvisna od koncentracije mikroorganizmov v aktivnem blatu. Ko smo k aktivnemu blatu dodali antibiotik, se je hitrost porabe kisika bistveno zmanjšala. 4.5 Določanje z LC-MS/MS metodo Želeli smo razviti metodo, ki bi hkrati identificirala ciprofloksacin in amoksicilin. Vsebnost amoksicilina in ciprofloksacina smo v odpadni vodi določali s tekočinsko kromatografijo s tandemskim masnim spektrometrom. Metoda se je izkazala za zelo selektivno ter visoko občutljivo tehniko. Dobljene rezultate smo obdelali s pomočjo računalniškega programa Analyst Software Izbira kolone na tekočinskem kromatogramu Za razvoj metode smo pripravili standardne raztopine antibiotikov in jih neposredno injicirali v masni spektrometer (AB Sciex API 2000). Pri tem smo optimirali pogoje tudi na masnem detektorju (ionizacija, kapilarna napetost, temperatura izvora, kolozijska energija). Pri optimizaciji smo težili k temu, da smo dobili najintenzivnejši odziv tako pri osnovnem, kot tudi pri fragmentnem ionu. Analize so potekale na naslednjih kolonah: ASCENTIS Express C18 (50 mm x 2,1 mm I.D., 2,7 µm) proizvajalca Supelco. Synergie Fusion RP 100 A (50 mm x 2,0 mm I.D., 2,5 µm) proizvajalca Phenomenex. Kinetex XB-C A (50 mm x 2,1 mm I.D., 2,6 µm) proizvajalca Phenomenex. Razvoj instrumentalne metode ter vso optimizacijo smo izvajali s čisto raztopino amoksicilina in ciprofloksacina koncentracije 200 ng/ml v topilu 0,1 % mravljične kisline v mešanici CH3OH : CH3CN (1:1). Pri pretoku 0,3 ml/min smo posneli kromatograme z vsemi kolonami (slika 4-14, slika 4-15, slika 4-16). 52

72 Slika 4-14: Kromatografski vrhovi amoksicilina in ciprofloksacina z ASCENTIS Express C 18 kolono. Slika 4-15: Kromatografski vrhovi amoksicilina in ciprofloksacina s Synergie Fusion RP 100 A kolono. Slika 4-16: Kromatografski vrhovi amoksicilina in ciprofloksacina s Kinetex XB-C A kolono. 53

73 Na x-osi je naveden retenzijski čas, na y-osi pa intenziteta signala. Ta ustreza odzivu, ki ga ustvarjata naša dva analita, ko zapuščata sistem. Zadrževalni čas amoksicilina je bil 500 ms, medtem, ko je bil zadrževalni čas ciprofloksacina 150 ms. Kolone dajejo zelo podobno sliko kromatografskih vrhov. Pri primerjavi kromatografskih vrhov na kolonah, lahko vidimo da se retenzijski časi spreminjajo glede na kolono, zaradi različne polarnosti stacionarnih faz. Oblika kromatografskih vrhov je primerljiva, le intenziteta vrhov je s kolono Synergi Fusion- RP 100 za približno 20 % višja. Glede na potek razvoja metode smo analize nadaljevali na koloni Synergie Fusion-RP 100 (50 mm x 2,0 mm I.D., 2,5 µm). To je kolona s posebnim polarno vgrajenim C18 s trimetilsililom in je zasnovana tako, da doseže učinkovitost delcev velikosti 2,5 µm. Trimetilsilil se v kromatografiji uporablja za nadomestitev dostopnih silinolnih skupin v vezani stacionarni fazi s trimetilsililnimi skupinami. Izbrana kolona poveča retenzijo zelo polarnih in aromatskih spojin. Vsebuje visoko ponovljivo in stabilno fenilno fazo. Izboljša polarno ločljivost v 100 % puferskih mobilnih fazah. Kot mobilno fazo smo uporabili 0,1 % mravljično kislino v mešanici CH3OH : CH3CN (1:1) pri pretoku 0,3 ml/min Optimizacija parametrov na masnem detektorju Za določitev amoksicilina in ciprofloksacina v bolnišnični odpadni vodi smo morali najprej pripraviti standardno raztopino antibiotikov s koncentracijo 10 mg/ml. Naslednji korak je bil poiskati prehode starševskih in hčerinskih ionov. Optimizacijo fragmentacije smo izvajali z neposrednim injiciranjem spojin s pretokom 50 µl/min. Optimirali smo naslednje parametre: zmanjševanje potenciala (DP), kolizijsko energijo (CE) in kolizijski izhodni potencial (CXP). Rezultati so prikazani v tabeli 4-3. Tabela 4-3: Optimalni pogoji DP, CE, CXP za standarde. Spojina Tranzicija DP (V) CE (V) CXP (V) Ciprofloksacin 332,160/231, Ciprofloksacin 332,160/288, Amoksicilin 366,171/114, Amoksicilin 366,171/208, Po določitvi osnovnih parametrov, smo optimirali parametre metode: sušilni plin (CUR), katerega namen je odpihniti vse, kaj je vstopilo v masni detektor in ni nabito; razpršilni plin (GS), ki določa velikost kapljic v razpršilcu; napetost ionskega razprševala (IS), temperaturo (T) in kolizijski plin (CAD). Optimalni rezultati so prikazani v tabeli

74 Tabela 4-4: Rezultati optimizacije celotne metode. CUR (psi) GS1 (psi) GS2 (pis) IS (V) T ( o C) CAD (psi) Po optimizaciji smo izbrali sledeče parametre: kolona: Synergi Fusion-RP 100 A (50 mm x 2,0 mm I.D., 2,5 µm) mobilna faza A: 0,1 % mravljična kislina v mešanici topil acetonitril/voda v volumskem razmerju 5:95. mobilno faza B: 0,1 % mravljična kislina v mešanici topil metanol/acetonitril v volumskem razmerju 50:50. gradient: pretok 300 µl/min, začeli smo s 100 % A in nadaljevali s 100 % B do 7 min in zaključili s 100 % A, kot je prikazano v tabeli 4-5. Tabela 4-5: Uporabljeni gradient pri vpeljani metodi. t (min) qv (µl/min) Mobilna faza A (%) Mobilna faza B (%) , Linearnost kalibracijske krivulje Linearnost metode smo preverjali z risanjem umeritvene krivulje na šestih koncentracijskih nivojih. Iz izmerjenih ploščin kromatografskih vrhov smo pripravili kalibracijske krivulje tako, da smo na x-os nanašali razmerje koncentracij standarda in internega standarda in na y- os pripadajoče razmerje ploščin. Po naslednji enačbi smo dobili kalibracijsko funkcijo: y = b x + a (4.2) 55

75 kjer je: y b x a razmerje ploščine vrha spojine in ploščine vrha internega standarda pri kalibraciji naklon umeritvene krivulje spojine razmerje koncentracije spojine in koncentracije internega standarda (ng/ml) odsek na ordinati. Za kvantizacijo z umeritveno krivuljo smo se odločili, zaradi velikega števila vzorcev, katerih koncentracije so bile v širšem razponu. Dobljena linearna kalibracijska funkcija za amoksicilin (slika 4-17) in ciprofloksacin (slika 4-18), sta prikazani v nadaljevanju. Slika 4-17: Umeritvena krivulja amoksicilina. Območje umeritvene krivulje amoksicilina: 40 µg/l, 80 µg/l, 200 µg/l, 400 µg/l, 600 µg/l in 800 µg/l. 56

76 Slika 4-18: Umeritvena krivulja ciprofloksacina. Območje umeritvene krivulje ciprofloksacina: 50 µg/l, 100 µg/l, 250 µg/l, 500 µg/l, 750 µg/l in 1000 µg/l. Izračunani parametri za kalibracijsko funkcijo amoksicilina so: a = -839, b = 1,1 10 3, r 2 = 0,9998 in za ciprofloksacin: a = -1, , b = 2, , r 2 = 0,9998. Iz podanih izračunov, kjer smo r 2 v obeh primerih dobili približno 1, je razvidno, da so izpolnjene vse zahteve pri optimizaciji linearnosti metode. 57

77 4.6 Odstranjevanje antibiotikov iz realnega vzorca bolnišnične odpadne vode V zadnjem delu doktorske disertacije, smo predlagani metodi odstranjevanja, s sub in super kritično vodno oksidacijo ter ozonacijo brez in z dodatkom H2O2, preizkusili na realnem vzorcu bolnišnične odpadne vode, ki smo ga odvzeli v Splošni bolnišnici Dr. Jožeta Potrča, Ptuj. Realni vzorec smo očistili s super kritično oksidacijo pri temperaturi 773 K in pri ozonaciji z dodatkom H2O2 (c = 0,02 mol/l). Kot učinek čiščenja smo izmerili TOC vrednost, možno toksičnost na mikroorganizme v aktivnem blatu ter koncentraciji izbranih antibiotikov pred in po obdelavi. Zaradi nizkih vsebnosti amoksicilina in ciprofloksacina v realnem vzorcu smo za pred koncentriranje uporabili ekstrakcijo na trdni fazi Ekstrakcija na trdni fazi Razvoj metode ekstrakcije na trdni fazi smo si zastavili tako, da smo izhajali iz osnov SPE metode in glede na dobljene rezultate po potrebi spreminjali in optimirali posamezne stopnje postopka. Ekstrakcije smo izvajali na naslednjih kolonah: VARIAN: Bond Elut Plexa 60 mg/3 ml OASIS HLB 200 mg/6 ml SUPELCO HLB Select 60 mg/ 3 ml Stopnje postopkov, ki potekajo na posameznih kolonah, prikazuje tabela

78 Tabela 4-6: Potek stopenj ekstrakcije na kolonah. Kolona VARIAN: Bond Elut Plexa 60 mg/ 3mL OASIS HLB 200 mg/6 ml SUPELCO HLB select 60 mg/ 3mL Zaporedni SPE koraki Kondicioniranje 3 ml MeOH 6 ml MeOH 3 ml MeOH Kondicioniranje 3 ml H2O 6 ml H2O 3 ml H2O Nanos vzorca 200 ml (ph = 7,13) 200 ml (ph = 7,31) 200 ml (ph = 7,32) Spiranje 3 ml 10 % MeOH v H2O 6 ml 5 % MeOH v H2O 5 ml H2O Sušenje Vakuum, 5 min Vakuum, 5 min Vakuum, 5 min Elucija 5 ml MeOH 5 ml MeOH 5 ml MeOH : H2O (50:50) Elucija 5 ml MeOH 5 ml MeOH 5 ml MeOH : H2O (50:50) Elucija 5 ml MeOH 5 ml MeOH 5 ml MeOH : H2O (50:50) Elucija 5 ml MeOH 5 ml MeOH 5 ml MeOH : H2O (50:50) Ekstrakcija na trdni fazi je potekala preko Oasis HLB 60 mg kolone. Postopek je bil naslednji: ml vzorca odpadne vode smo nastavili ph na 8 z 0,05 M NH4OH, ter dodali 10 µl ISTD MIX 2 (c = 200 ng/ml). 2. Kondicioniranje SPE kolone, je potekalo tako, da smo skozi koloni najprej spustili 3 volumne MeOH ter 3 volumne Mili-Q vode (kateri smo predhodno uravnali ph 8). 3. Nato smo pričeli z nanosom vzorca na kondicionirane kolone (s pomočjo vakuuma) 4. Po nanosu vzorca smo kolono sprali s 10 ml 10 % MeOH v vodi. Nato smo kolono posušili s pomočjo vakuuma. 5. Po sušenju kolon je potekalo eluiranje kolon z 2 volumnoma metanola. Vsebino smo zbirali v plastične 10 ml epruvete. 6. Eluat smo nato skoncentrirali pod dušikom do cca. 300 µl. 7. Vzorec smo nato v epruveti dopolnili do 1 ml s topilom, ki je bil Milli-Q voda + zmes metanola in acetonitrila (1:1) v razmerju 95:5. 8. Na koncu smo vzorec še centrifugirali 10 min pri 4000 obr./min. 59

79 Priprava slepega matriksa in standard postopka: Sl.matriks: Mili-Q voda + 10 µl ISTD (ph = 8) STD-postopek: Mili-Q voda + 10 µl ISTD + 30 µl S1 MIX Reagent: kolono samo skoncentriramo in eluiramo + 10 µl ISTD MIX 2 Vzorci: 200 ml + 10 µl ISTD MIX Toksičnost realne bolnišnične odpadne vode Eden od ciljev doktorske naloge je bil oceniti toksičnost realnih vzorcev bolnišnične odpadne vode po čiščenju s super-kritično oksidacijo ter po ozoniranju, saj bi med procesom razgradnje antibiotikov lahko nastali neželeni produkti, ki bi morda bili bolj strupeni od analitov. Toksičnost (slika 4-19) smo opravili z vzorci, ki so bili segreti do 773 K pri super kritični oksidaciji ter pri ph 10,85 pri ozoniranju in ozoniranju z dodatkom H2O2. Vzorec bolnišnične odpadne vode je pokazal velik vpliv na heterotrofne mikroorganizme, medtem ko so nitrifikacijski mikroorganizmi bili manj občutljivi. Slika 4-19: Zmanjšanje toksičnosti na aktivno blato pri različnih metodah razgradnje antibiotikov. Rezultati še kažejo, da je toksičnost za heterotrofne mikroorganizme popolnoma zmanjšana pri ozoniranju z dodatkom vodikovega peroksida (H2O2). Primerljivo zmanjšanje toksičnosti za nitrifikacijske mikroorganizme dosežemo z ozoniranjem in super kritično oksidacijo 60