Diplomsko delo SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ ENCIMA TRANSGLUTAMINAZE Junij, 2017 Špela Lesičar

Velikost: px
Začni prikazovanje s strani:

Download "Diplomsko delo SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ ENCIMA TRANSGLUTAMINAZE Junij, 2017 Špela Lesičar"

Transkripcija

1 Diplomsko delo SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ ENCIMA TRANSGLUTAMINAZE Junij, 2017 Špela Lesičar

2 Špela Lesičar Sinteza zamreženih encimskih skupkov iz encima transglutaminaze Diplomsko delo Maribor, 2017

3 Sinteza zamreženih encimskih skupkov iz encima transglutaminaze Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje Študent: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Komentor: Špela Lesičar univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska tehnologija diplomirani/a inženir/ka kemijske tehnologije (UN) red. prof. dr. Maja Leitgeb asist. Katja Vasić, univ. dipl. inž. kem. tehnol. Maribor, 2017

4

5 Kazalo Kazalo... I Izjava... III Zahvala... V Povzetek... VI Abstract... VII Seznam tabel... VIII Seznam slik... IX Uporabljeni simboli in krajšave... XI 1 Uvod in opis problema Teoretični del Encim transglutaminaza Uporaba encimov v biokatalizi Imobilizacija encimov Imobilizacija z nosilcem Ujetje ali enkapsulacija v organski ali anorganski polimer Zamreženje encima Priprava CLEAs Obarjanje Zamreženje Lastnosti CLEAs Glutaraldehid Eksperimentalni del Materiali Laboratorijski pribor in aparature Eksperimentalne metode Priprava CLEAs iz encima transglutaminaze Analizne metode Bradfordov test za določevanje koncentracije proteinov Aktivnostni test Rezultati in diskusija Obarjanje encima TGM v izbranih obarjalnih reagentih Izbira optimalnega obarjalnega reagenta in njegove koncentracije Obarjanje in resuspendiranje v pufru TRIS Sinteza CLEAs iz transglutaminaze Optimiranje koncentracije dodanega glutaraldehida Spiranje s pufrom PBS Dodatek ogrodnega proteina BSA in optimiranje dodanega NaBH3CN Spreminjanje koncentracije TGM Dodatek ogrodnega proteina EA namesto BSA in izbira optimalne koncentracije Spreminjanje koncentracije TGM z dodatkom 100 mg/ml EA Sinteza CLEAs z dodatkom PEHA (pentaetilenheksamina) Preizkus stabilnosti CLEAs iz transglutaminaze ob večkratni uporabi Zaključek Literatura I

6 7 Priloge Umeritvene krivulje pri Bradfordovem testu Življenjepis II

7 Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: Vir: Science Direct ( Gesla: Število referenc Transglutaminase IN immobilization 802 Immobilization IN CLEAs 610 Transglutaminaze IN CLEAs 0 Vir: COBISS/OPAC ( COBIB.SI) Gesla: Število referenc Enzyme IN immobilizaton 73 Immobilization IN CLEAs 7 Transglutaminase IN CLEAs 0 Skupno število pregledanih člankov: 35 Skupno število pregledanih knjig: 5 Maribor, junij 2017 Špela Lesičar III

8 IV

9 Zahvala Zahvaljujem se svoji mentorici, red. prof. dr. Maji Leitgeb, za vso potrpežljivost in pomoč pri usmerjanju in izdelavi diplomskega dela. Prav tako se zahvaljujem somentorici univ. dipl. inž. kem. teh. Katji Vasić za pomoč in nasvete pri izvajanju eksperimentalnega dela. Še posebej se zahvaljujem svoji družini, ki mi je stala ob strani ves čas mojega študija in me spodbujala ter vsem prijateljem, ki so mi pomagali in mi dajali motivacijo ob vsaki oviri, ki sem jo srečala na svoji študijski poti. V

10 Povzetek Namen diplomske naloge je bila uspešna sinteza zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) iz encima transglutaminaze. Pri tem smo želeli doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostalo aktivnost encima transglutaminaze. Sinteza je zajemala postopek obarjanja encima v izbranem obarjalnem reagentu in zamreženja encima z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom (GA). Da bi dosegli čim boljše rezultate smo morali izbrati ustrezen obarjalni reagent ter njegovo količino. Optimirali smo parametre pri zamreženju, kot so koncentracija dodanega mrežnega povezovalca, koncentracija dodanega natrijevega cianoborohidrida (NaBH3CN), koncentracija ogrodnih proteinov govejega serumskega albumina (BSA) in jajčnega albumina (EA) ter koncentracija transglutaminaze. Iz rezultatov smo ugotovili, da je 2-propanol najbolj ustrezen obarjalni reagent za sintezo CLEAs iz transglutaminaze. Optimalni volumski procent obarjalnega reagenta je bil 92,4 % (v/v), kar znaša 1215 μl. Za optimalne rezultate smo uporabili raztopino encima s koncentracijo 150 mg/ml s 100 mg/ml EA. Encimske molekule smo zamrežili z 2 % (v/v) GA ob 3 urnem mešanju. Za boljšo stabilnost encima smo dodali 200 μl 0,1 M NaBH3CN. Ugotovili smo, da lahko tako imobilizirano transglutaminazo kot katalizator reakcije uporabimo trikrat z aktivnostjo encima nad 100 % preden se deaktivira. Ključne besede: transglutaminaza, imobilizacija, zamreženi encimski skupki, glutaraldehid, mrežni povezovalec UDK: : (043.2) VI

11 Immobilization of transglutaminase as crosslinked enzyme aggregates (CLEAs) Abstract The purpose of this diploma thesis was a successful synthesis of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) from enzyme transglutaminase. The aim was to achieve the maximum possible efficiency of immobilization and the highest remaining activity of transglutaminase. Synthesis of CLEAs consisted of precipitation of the enzyme in chosen precipitant and crosslinking of the enzyme with cross-linking reagent glutaraldehyde (GA). The best precipitant and its optimal volume for synthesis of CLEAs was selected in order to achieve the highest results and we optimized various parameters in process of crosslinking such as concentration of GA and sodium cyanoborohydride (NaBH3CN), concentracion of stabilization proteins bovine serum albumine (BSA) and egg albumin (EA) and concentration of enzyme transglutaminase. The results of diploma thesis shows that the optimal precipitant for synthesis of CLEAs from transglutaminase is 2-propanol with volume percent of 92,4 % (v/v), so the volume of percipitant is 1215 μl. 150 mg/ml of enzyme transglutaminase with 100 mg/ml of EA was used for 3 hours long process of cross-linking with 2% (v/v) GA. We added 200 μl NaBH3CN for stabilization of the enzyme. We also realized that we can reuse the immobilized transglutaminase three times before its activity falls under 100% and the enzyme deactivates. Key words: transglutaminase, immobilization, cross-linked enzyme aggregates, glutaraldehyde, cross-linking agent UDK: : (043.2) VII

12 Seznam tabel Tabela 4-1: Opis suspenzije in ocena uspešnosti obarjanja transglutaminaze v izbranih obarjalnih reagentih Tabela 4-2: Aktivnosti encima in učinkovitost imobilizacije pri preizkusu večkratne uporabe CLEAs iz transglutaminaze v reakciji VIII

13 Seznam slik Slika 2-1: Reakcije, ki jih katalizira transglutaminaza: reakcija prenosa acilnega dela, zamreženje med glutaminskim in lizinskim preostankom proteinov in deamidacija [13]... 2 Slika 2-2: Imobilizacijske metode: A - ujetje encima, B - enkapsulacija encima, C - imobilizacija z nosilcem, D - zamreženje encima [11]... 4 Slika 2-3: Molekula GA [14]... 7 Slika 3-1: Prikaz nastalega peleta pri sintezi CLEAs iz transglutaminaze Slika 3-2: Prikaz obarvanja vzorcev pri določevanju prisotnosti proteinov z Bradfordovim testom Slika 3-3: Shema, ki nam prikazuje princip določanja aktivnostnega testa za encim transglutaminazo z določenimi pogoji Slika 3-4: Prikaz obarvanosti raztopine pri določevanju aktivnosti z aktivnostnim testom Slika 4-1: Prikaz rezultatov obarjanja encima: a-uspešno obarjanje (motnost), b-neuspešno obarjanje (dve fazi), c-neuspešno obarjanje (bistra tekočina brez oborine), d-oborina pri uspešnih obarjalnih reagentih Slika 4-2: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) po obarjanju v različnih obarjalnih reagentih Slika 4-3: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM pri obarjanju z 10 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 25 % povečanjem volumna (dietil eter, n-heksan, 1-butanol, amonijev sulfat) Slika 4-4: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) pri obarjanju z 35 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 50 % povečanjem volumna (1-butanol, dimetil eter, amonijev sulfat, n-heksan) Slika 4-5: Preostanek proteinov in preostala aktivnost encima (100 mg/ml) pri obarjanju z 75 % povečanjem volumna obarjalnega reagenta Slika 4-6: Resuspendiranje oborine encima (100 mg/ml) v pufru TRIS Slika 4-7: CLEAs iz encima transglutaminaze (100 mg/ml) z dodatkom 1,027 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN Slika 4-8: CLEAs iz transglutaminaze (100 mg/ml) z dodatkom 1,521 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN Slika 4-9: CLEAs iz TGM (100 mg/ml) z dodatkom 2,015 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN Slika 4-10: CLEAs iz TGM (100 mg/ml) z dodatkom 2,28 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN Slika 4-11: Spiranje CLEAs iz transglutaminaze s pufrom PBS Slika 4-12: Primerjava učinkovitosti imobilizacije po 1. in 2. spiranju ter preostale aktivnosti CLEAs iz TGM (100 mg/ml). Obarjanje encima TGM z dodatkom BSA in brez dodanega BSA v obarjalnem reagentu 2-propanolu Slika 4-13: CLEAs iz transglutaminaze (100 mg/ml) obarjene v 2-propanolu z dodatkom 50 mg/ml BSA, zamrežene z 2,015 % (v/v) GA in dodanimi različnimi volumni 0,1M NaBH3CN IX

14 Slika 4-14: Primerjava sinteze CLEAs iz raztopine encima TGM različnih koncentracij obarjene v 2- propanolu z dodanim BSA (50 mg/ml) Slika 4-15: Primerjava sinteze CLEAs z 2,015 % (v/v) GA iz transglutaminaze (100 mg/ml) obarjene v 2-propanolu z različnimi koncentracijami dodanega BSA in EA in dodatkom 200 μl 0,1 M NaBH3CN Slika 4-16: Primerjava sinteze CLEAs iz encima TGM različnih koncentracij obarjenega v 2- propanolu z dodatkom 100 mg/ml EA in zamreženega z 2,015 % (v/v) GA ter dodanim 200 μl 0,1 M NaBH3CN Slika 4-17: Sinteza CLEAs iz transglutaminaze (250 mg/ml) oborjene v 2-propanolu z 100 mg/ml EA in 200 μl M PEHA z 2,015 % (v/v) GA in dodatkom 200 μl 0,1M NaBH3CN Slika 4-18: Večkratno merjenje aktivnosti CLEAs iz transglutaminaze Slika 7-1: Prva umeritvena krivulja za Bradfordov test Slika 7-2: Druga umeritvena krivulja za Bradfordov test Slika 7-3: Tretja umeritvena krivulja za Bradfordov test Slika 7-4: Četrta umeritvena krivulja za Bradfordov test Slika 7-5: Peta umeritvena krivulja za Bradfordov test Slika 7-6: Šesta umeritvena krivulja za Bradfordov test Slika 7-7: Sedma umeritvena krivulja za Bradfordov test X

15 Uporabljeni simboli in krajšave Simboli A M V c absorbanca (nm) molarnost (mol/l) volumen (ml, μl) množinska koncentracija (mol/l) Grški simboli φ volumski delež (% (v/v)) masna koncentracija (g/l) Krajšave BSA CBZ CLEAs CLECs CLEs EA GA NaBH3CN PBS PEHA TCA TGM TRIS goveji serumski albumin karboksibenzil zamreženi encimski skupki zamrežen kristaliziran encim zamrežen raztopljen encim jajčni albumin glutaraldehid natrijev cianoborohidrid fosfatni pufer pentaetilenheksamin trikloroocetna kislina transglutaminaza tris(hidroksimetil)aminometan pufer XI

16 XII

17 1 Uvod in opis problema Encimi so trajnostni biokatalizatorji, ki jih najdemo v naravi. So proteini, pridobivajo pa se iz obnovljivih virov. So biokompatibilni in biorazgradljivi. Uporabljajo se v biokatalitičnih reakcijah, kjer pospešijo hitrost reakcije. Encimske reakcije so zaželene, saj se lahko izvajajo pod milimi pogoji v vodi. Encimi so visoko selektivni, zato ni potrebe po zaščiti in aktivaciji funkcionalnih skupin, s čimer se izognemo odvečnim odpadnim snovem in naredimo proces bolj ekonomičen in energijsko učinkovit. [1] Sami encimi imajo slabo delovno stabilnost, poleg tega pa jih je težko reciklirati in ponovno uporabiti, saj so raztopljeni v vodi. To odpravimo z imobilizacijo encima. Poznamo tri tipe imobilizacije: vezava na inertno snov, ki ji pravimo nosilec, ujetje ali enkapsulacija ter imobilizacija brez nosilca z zamreženjem encima. Z imobilizacijo preprečimo kontaminacijo produkta, omogočimo lažje upravljanje z encimom, povečamo stabilnost in katalitično produktivnost encima ter omogočimo kontinuirni proces. [2] V diplomskem delu je zajeta imobilizacija in zamreženje encima transglutaminaze. Encim smo imobilizirali z zamreženjem v encimske skupke oziroma agregate, ki se drugače imenujejo CLEAs. Imobilizacija brez nosilcev zajema obarjanje z dodajanjem organskih topil v vodi in zamreženje z bifunkcionalnim reagentom. Pomemben je čas obarjanja in količina bifunkcionalnega reagenta, za katerega ponavadi uporabljamo glutaraldehid, saj je poceni in na voljo v komercialnih količinah. [3] Ta metoda imobilizacije v prvem koraku združuje postopek obarjanja in čiščenja encima, zato ne potrebujemo predhodnega postopka čiščenja, ki je drag in časovno zamuden. Poleg tega se izognemo stroškom nosilca ter povečamo operacijsko in shranjevalno stabilnost encima. Encim je enostavno ločiti od produkta in pripraviti na ponovno uporabo z centrifugiranjem ali filtriranjem. [4], [5] Namen diplomske naloge je bila uspešna sinteza CLEAs iz transglutaminaze, ki bi izboljšala stabilnost in katalitično aktivnost encima. Potrebno je bilo najti ustrezen obarjalni reagent in optimirati parametre za dosego čim večje učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti transglutaminaze. Delo zajema teoretične osnove biokatalize, imobilizacije encimov, ter priprave CLEAs iz transglutaminaze. Opisani so postopki eksperimentalnih metod, ki smo jih pri raziskovanju uporabili. Na koncu so predstavljeni rezultati in diskusija raziskovalnega dela. 1

18 2 Teoretični del 2.1 Encim transglutaminaza Transglutaminaza oziroma protein glutamin γ-glutamiltransferaza je encim, ki ga najdemo v živalskih in rastlinskih tkivih, v mikroorganizmih ter v telesnih tekočinah, kjer sodeluje pri raznih bioloških procesih, kot so strjevanje krvi in celjenje ran. [6] V preteklosti so encim lahko pridobivali le iz jeter morskega prašička, kar pomeni, da so bile njegove zaloge omejene. Pridobili so lahko le majhne količine encima, zato je bila njegova cena primerljivo višja. K visoki ceni pa je prispeval tudi dolg in drag postopek čiščenja encima. [7] Z razvojem novih tehnik, raziskavami na področju encimov kot biokatalizatorjev in vse večjimi potrebami po tem encimu v industriji, so kasneje začeli iskati nove načine pridobivanja transglutaminaze z biotehnološkimi metodami iz mikroorganizmov. Najpogostejše metode so razne fermentacije, na primer potopljena fermentacija ali fermentacija v trdnem stanju. [7], [8] Pregledali so več tisoč različnih mikroorganizmov in s pomočjo hidroksamatnega testa ugotavljali, kateri sevi so sposobni proizvajati transglutaminazo. Izkazalo se je, da so mikroorganizmi visoko produktivni glede transglutaminaze. Za proizvajanje transglutaminaze je najbolj uporaben sev Streptomyces sp., ki se lahko za proizvodnjo transglutaminaze uporablja tudi na industrijski ravni. [7] Transglutaminaza katalizira tvorbo kovalentne vezi med amino skupino lizinskega preostanka in karboksamidno skupino glutaminskega preostanka, na katerega so vezani peptidi ali proteini. Reakcija poteče tako, da karboksamidna skupina glutaminskega preostanka v proteinih, peptidih ali različnih primarnih amidih donira acilno skupino primarnim amino skupinam lizinskega preostanka. Rezultat reakcije je lizinska verižna vez oziroma izopeptidna vez, ki povzroči zamreženje in polimerizacijo proteinskih molekul, s čimer pozitivno spremenimo funkcionalnost proteina. [6][7][8] Slika 2-1: Reakcije, ki jih katalizira transglutaminaza: reakcija prenosa acilnega dela, zamreženje med glutaminskim in lizinskim preostankom proteinov in deamidacija [13] 2

19 Na delovanje transglutaminaze kot biokatalizatorja vplivajo temperatura, ph in čas shranjevanja encima. [6] Uporablja se v različnih industrijskih panogah, kot so: Prehrambena industrija, kjer se uporablja predvsem kot sredstvo za zamreženje pri proizvodnji mesnih izdelkov (vezivo v mesu), poleg tega pa pripomore k boljšim funkcionalnim lastnostim prehrambenih izdelkov, kot so tekstura, stabilnost in shranjevanje. [6] Tekstilna industrija, kjer se uporablja pri proizvodnji volnenih oblačil, in sicer ohranja barvo in njihov izgled ter jo zaščiti pred poškodbami zaradi uporabe različnih kemikalij in encimov v pralnih sredstvih v gospodinjstvu. Prepreči tudi krčenje oblačil med pranjem. [8] Farmacevtska industrija Proizvodnja biosenzorjev [7] Proizvodnja raznih gelov [6] 2.2 Uporaba encimov v biokatalizi Biokataliza je kemična pretvorba organskih snovi z uporabo encimov kot biokatalizatorjev, ki pospešijo kemijsko reakcijo. V zadnjih desetletjih je bilo veliko pozornosti namenjeno razvoju v biokatalizi, saj imajo biokatalizirane sinteze v primerjavi s klasičnimi organskimi sintezami številne prednosti. Biokatalizirana reakcija poteka v enostavnih reaktorjih pod milimi pogoji (sobna temperatura, atmosferski tlak, fiziološki ph), zato so reakcije energijsko bolj učinkovite. Za topilo pa se v večini primerov lahko uporablja voda. [2], [4] Uporaba encimov v biokemijskih reakcijah je predvsem zmanjšala količino odpadnih snovi ter omejila uporabo nevarnih in strupenih snovi. Poleg tega je selektivnost encimov omogočila boljšo kontrolo nad produkti reakcije, ti pa so tudi bolj čisti. Ker pa so prosti encimi manj stabilni pri delovanju in shranjevanju zaradi njihove občutljive tridimenzionalne strukture, poleg tega pa je encim, ki je raztopljen v vodi po reakciji težko reciklirati in ponovno uporabiti, je prišla v ospredje imobilizacija encima. [4] 2.3 Imobilizacija encimov Z imobilizacijo izboljšamo operacijsko in shranjevalno stabilnost ter povečamo življenjsko dobo encima. Encim je po imobilizaciji bolj odporen proti denaturaciji zaradi organskih topil, povišane temperature in avtolize. [4] Željeno je, da se encim po končani reakciji da reciklirati in ponovno uporabiti, saj s tem zmanjšamo stroške procesa in odpadne snovi pri reakciji. Imobilizacija encima povzroči, da se encim ne raztopi v reakcijski mešanici, kar nam omogoča lažje ločevanje encima od produktov reakcije z filtracijo ali centrifugiranjem, poleg tega pa recikliran encim obdrži svojo aktivnost in stabilnost. [4], [9] Tri različne imobilizacijske metode prikazuje slika Slika 2-2. To so imobilizacija z nosilcem, ujetje ali enkapsulacija in imobilizacija brez nosilca. 3

20 Slika 2-2: Imobilizacijske metode: A - ujetje encima, B - enkapsulacija encima, C - imobilizacija z nosilcem, D - zamreženje encima [11] Imobilizacija z nosilcem Razvila se je v drugi polovici 21. stoletja. Nosilec pozitivno spremeni lastnosti encima tako, da mu da bolj togo strukturo, ki preprečuje razvitje encima pri povišanih temperaturah ali uporabi organskih topil. Nosilci so lahko naravni ali sintetični. Kljub temu, da vezava encima na nosilec poveča njegovo stabilnost in omogoča ponovno uporabo encima, ta postopek imobilizacije ni najboljša izbira, saj nosilec poveča nekatalitično maso encima za kar 90 99%, kar povzroči zmanjšanje aktivnosti in produktivnosti. Aktivnost imobiliziranega encima se lahko zmanjša kar za 50% aktivnosti prostega encima. Encimi vezani na nosilec so tudi bolj nagnjeni k spiranju v vodi. Poleg tega pa so povečani tudi stroški procesa, saj so nekateri nosilci precej dragi. [9], [10] Encim je lahko na nosilec vezan na več načinov. Adsorpcija Vezava encima na nosilec z adsorpcijo je enostavna in poceni metoda, ki ne spremeni kemične sestave encima. Ker pa so vezi med encimom in ustreznim nosilcem šibke, se encim v vodnih medijih lahko spere z nosilca. [11] Ionska vezava na nosilec Je enostavna metoda, kjer se encimi vežejo na polisaharidne biopolimere tako, da polimeri aktivirajo svoje funkcionalne skupine za ionsko interakcijo. Vezava je lahko dvosmerna, zaradi česar je encim lažje reciklirati in ponovno uporabiti. Težava je v spiranju encima z nosilca. [11] Kovalentna vezava na nosilec Vezi, ki se tvorijo med encimom in ustreznim nosilcem so močne in stabilne, zato se pri takšni vezavi encim ne spere s površine nosilca. Če se encim deaktivira, ni možna ponovna uporaba encima in nosilca. [1] 4

21 2.3.2 Ujetje ali enkapsulacija v organski ali anorganski polimer Encim ujamemo v polimerno mrežo (organska ali anorganska) ali v membransko napravo (votla vlakna, mikrokapsule). S tem ga zaščitimo pred direktnim stikom z zunanjim okoljem. Težava te metode je v omejitvah prenosa snovi in možnosti ujetja le male količine encima naenkrat. [1], [11] Razlika med vezavo encima na nosilec in ujetjem oziroma enkapsulacijo je v tem, da se v prvem primeru encim lahko veže na vnaprej narejen nosilec na zunanjo ali notranjo površino, v drugem primeru pa se polimerna mreža sintetizira v prisotnosti encima. Encim se veže le na notranjo površino mreže. [2] Zamreženje encima Novejša metoda imobilizacije je zamreženje encima. Poznamo več različnih postopkov, ki se razlikujejo po dejanju pred samim zamreženjem Zamrežen raztopljen encim - CLEs Začetki segajo v leto 1960, ko so vodno raztopino encima združili z vodno raztopino mrežnega povezovalca glutaraldehida. Dobili so zamrežen raztopljen encim ali CLEs. Povečala se je stabilnost encima. Slabosti se kažejo v občutljivosti strukture tako imobiliziranega encima na pogoje delovanja (temperatura, ph, razmerje med encimom in mrežnim povezovalcem) in zmanjšanju aktivnosti CLEs glede na prosti encim. Encim je tudi težje ločiti od produkta in pripraviti za ponovno uporabo, ker je raztopljen v vodi. Tako zamrežen encim je želatinast in zato težaven za uporabo. Zaradi vseh težav, ki so se pojavile pri tej metodi je bila v nadaljnjih letih imobilizacija z nosilcem najboljša metoda.[4], [9] Zamrežen kristaliziran encim CLECs Metodo so razvili v 90-tih letih. Postopek je analogen pripravi delcev CLEs, le da se pred postopkom zamreženja encim kristalizira. S tem se ohrani večja aktivnost glede na prosti encim, povečana pa je tudi operacijska stabilnost v primerjavi z CLEs. S postopkom kristalizacije je možna kontrola velikosti delcev, kar omogoči večjo produktivnost biokatalizatorja. Da encim kristaliziramo pa potrebujemo visoko čistost encima, kar poveča stroške, prav tako je postopek kristalizacije v laboratoriju zamuden. [9], [10] Zamreženi encimski skupki - CLEAs Sinteza zamreženih encimskih skupkov oziroma CLEAs je eden izmed novejših načinov imobilizacije brez nosilca. Lastnosti so podobne kot pri CLECs, le da je priprava encima pred zamreženjem lažja in postopek je cenejši. [10] 2.4 Priprava CLEAs Priprava CLEAs sestoji iz dveh postopkov. Prvi je združevanje encimskih molekul v skupke oziroma agregate z obarjanjem iz vodnega pufra, sledi pa mu zamreženje encima v skupke oz. agregate z ustreznim mrežnim povezovalcem. Tako se tvorijo netopni skupki, ki ohranijo strukturo prostega encima in posledično svojo katalitično aktivnost. [4] 5

22 2.4.1 Obarjanje Če raztopini encima dodamo soli, organska topila ali neionske polimere, poteče proces obarjanja. Pri obarjanju je pomembno, da izberemo ustrezni obarjalni reagent, saj je od tega odvisno, kako se bo obnašal encim kot katalizator. Pri obarjanju se topne molekule encima v raztopini združijo, oborijo in tvorijo agregate oziroma skupke, povezane z nekovalentnimi vezmi. Ti agregati pri tem obdržijo enako strukturo kot jo ima encim pred obarjanjem. Skupki so nestabilni in se lahko ponovno raztopijo v vodi. Obarjanje je ena izmed pogostih tehnik čiščenja proteinov, zato za tvorbo CLEA ne potrebujemo popolnoma očiščenega encima. Lahko bi uporabili tudi surov encimski ekstrakt. S tem se izognemo dragemu in zamudnemu čiščenju encima v laboratoriju. [4], [9] Zamreženje Obarjanju sledi zamreženje encimskih skupkov z ustreznim mrežnim povezovalcem. S tem nastanejo netopni skupki encima, ki se jim ohrani prvotna struktura in katalitična aktivnost. [4] Pomembni parametri zamreženja so: - Čas zamreženja, ki narekuje, kako dolgo se encim obarja. Čas obarjanja pred zamreženjem vpliva na aktivnost in mikrostrukturo encima. [11] - Izbira ustreznega mrežnega povezovalca za katerega najpogosteje izberemo glutaraldehid, saj je poceni in na voljo v komercialnih količinah. Pomembna je tudi koncentracija mrežnega povezovalca. Če ga dodamo premalo pride do nižje stabilnosti, ker so molekule encima preveč prožne. V obratnem primeru so encimske molekule preveč toge in pride do znižanja aktivnosti. Potrebno je določiti optimalno koncentracijo mrežnega povezovalca. [10] Reakcija zamreženja poteče med prostimi amino skupinami lizinskega preostanka na površini dveh bližnjih encimskih molekul in med polimeri ali oligomeri glutaraldehida, ki nastanejo z aldolno kondenzacijo. [4] 2.5 Lastnosti CLEAs Ker encim imobiliziramo brez nosilca, ne pride do zmanjšanja aktivnosti katalizatorja zaradi nekatalitične mase, izognemo pa se tudi stroškom samega nosilca. Katalitična aktivnost CLEAs je v nekaterih primerih celo višja kot aktivnost prostega encima. Temu pojavu pravimo hiperaktivacija. Pojavi se zaradi boljše dostopnosti posameznih encimskih molekul, ki so bolj urejeno razporejene, kot pri prostem encimu. [1], [5] CLEAs imajo izboljšano shranjevalno in delovno stabilnost v nasprotju z prostim encimom, torej so bolj odporni na toplotno denaturacijo, organska topila in avtolizo. Spiranja v vodnem mediju skoraj ni. Zanje je značilna visoka katalitična produktivnost (kg produkta/kg encima), ker je encim enostavno ločiti od produkta in ga ponovno uporabiti v procesu. S to metodo lahko koimobiliziramo dva ali več encimov v tako imenovane»kombi CLEAs«. Tako imobilizirani encimi lahko katalizirajo več biotransformacij hkrati ali v kaskadnem procesu. [5] 6

23 2.6 Glutaraldehid Glutaraldehid je brezbarvna organska spojina ostrega vonja in oljnatega videza. Topen je v vodi, alkoholih in organskih topilih. Na sliki Slika 2-3 je prikazana formula tega dialdehida z petimi ogljikovimi atomi. Slika 2-3: Molekula GA [14] Njegova najpogostejša funkcija je kot mrežni povezovalec za zamreženje proteinov, saj je enostaven za uporabo, zelo reaktiven, dostopen v komercialnih količinah in cenovno ugodnejši od drugih aldehidnih mrežnih povezovalcev. Poleg imobilizacije encimov ima tudi druge uporabne funkcije v encimskih reakcijah, imunokemijskih raziskavah, pri afinitetni kromatografiji in izdelavi biosenzorjev. [15] Slabost glutaraldehida kot mrežnega povezovalca se kaže le v primeru nekaterih encimov, kjer glutaraldehid reagira z ostanki aminske skupine in s tem povzroči znižanje aktivnosti encima. V tem primeru je potrebno izbrati druge alternative, ki bolje ustrezajo določenemu encimu. [3] Najpogostejša načina vezave GA sta tvorba intermolekularno zamrežene tridimenzionalne mreže in vezava na nosilec, kot so najlon ali zamreženi proteini (BSA, želatina in razni polimeri z aminsko funkcionalno skupino). [16] Molekula GA prodre v protein in reagira z ostanki amino skupin na njegovi površini, ki so pomembne za aktivnost encima. Pomembno je razmerje med proteinom in mrežnim povezovalcem, saj premajhne koncentracije GA pomenijo nezadostno zamreženje, saj vse amino skupine ne zreagirajo, molekula je zato preveč prožna in nestabilna proti izpiranju v vodi. V obratnem primeru previsoka koncentracija GA povzroči popolno izgubo prožnosti zamreženega encima in posledično njegove aktivnosti.[4], [5] 7

24 3 Eksperimentalni del 3.1 Materiali Pri delu smo uporabili naslednje materiale: Transglutaminaza, BDF Natural Ingredients 1-propanol, Merck n-heksan, Merck 2-propanol, Sigma-Aldrich Dimetil eter, Sigma-Aldrich Metanol, Carlo Erba reagents Aceton, Carlo Erba reagents Acetonitril, Sigma-Aldrich Amonijev sulfat, Fluka Chemika Etanol, Sigma-Aldrich 1-butanol, Merck Trizma Base, Sigma Aldrich CBZ Glutaminilglicin (CBZ Gln Gly), Zedira Hidroksilamin hidroklorid (H3NO) Sigma - Aldrich Glutation, Sigma-Aldrich Kalcijev klorid dihidrat (CaCl2 x 2H2O), Chemika L - Glutaminska kislina γ monohidroksamat, Sigma - Aldrich Coomassie Brilliant Blue G250, Merck Trikloroocetna kislina (TCA), Sigma - Aldrich Železov triklorid heksahidrat (FeCl3 x 10H2O), Merck Klorovodikova kislina (HCl), Merck Natrijev hidroksid (NaOH), Merck Fosforna kislina (H3PO4), Merck Deionizirana voda Goveji serumski albumin (BSA), Sigma Aldrich Jajčni albumin (EA), Sigma Aldrich Glutaraldehid (GA), Sigma Aldrich Natrijev cianoborohidrid (NaBH3CN), Merck Pentaetilenheksamin (PEHA), Sigma Aldrich 8

25 3.2 Laboratorijski pribor in aparature Steklene bučke (50 ml, 100 ml) z zamaški Steklene čaše (20 ml ml) Merilni valji (5 ml, 10 ml) Lopatica za tehtanje Steklena palčka Steklene shranjevalne posode z zamaški (50 ml, 100 ml) Mikrocentrifugirke (1,5 ml, 2 ml) Centrifugirke (50 ml) Stojalo za centrifugirke in mikrocentrifugirke Spatula Puhalka Kapalke Magnet Lijak Grelnik Pipete z nastavki (0,1 ml - 5 ml) Tehtnica, Sartorius (Nemčija) Magnetno mešalo z grelnikom, Rotamix (Slovenija) Centrifuga, Eppendorf Centrifuge 5804R (Nemčija) ph meter, Hanna Instruments (Madžarska) Stresalnik, Heidolph Unimax 1010 (Nemčija) UV-VIS Spektrofotometer, Varian Cary 50 Probe Vorteks, Mikro+Polo (Slovenija) 9

26 3.3 Eksperimentalne metode Priprava CLEAs iz encima transglutaminaze Postopek sinteze sestoji iz dveh korakov: - Obarjanje encima v vodnem pufru - Zamreženje encimskih molekul Obarjanje transglutaminaze Najprej smo izbrali deset obarjalnih reagentov, ki bi bili dobri kandidati za obarjanje encima TGM: 1-propanol 2-propanol Aceton n-heksan Etanol Amonijev sulfat Acetonitril Metanol Dimetil eter 1-butanol Pripravili smo raztopino encima transglutaminaze v vodi s koncentracijo 100 mg/ml. Raztopino encima smo obarjali v obarjalnem reagentu v volumskem razmerju 1:9. V centrifugirke smo odpipetirali 900 μl posameznega reagenta in počasi po kapljicah s pipeto dodali 100 μl raztopine encima. Centrifugirko smo na stresalniku mešali 40 minut na sobni temperaturi. Vzorce smo centrifugirali 10 minut pri rpm/min, nato smo pazljivo odpipetirali supernatant. Supernatantu smo z Bradfordovo metodo za določevanje proteinov določili koncentracijo proteinov in z testom aktivnosti določili aktivnost encima. Aktivnost encima smo določili tudi v oborini. Za izračune smo potrebovali tudi vsebnost proteinov in aktivnost raztopine prostega encima. Na podlagi opažanj in rezultatov smo izločili neustrezne obarjalne reagente. Postopek obarjanja smo ponovili z različnimi volumni obarjalnega reagenta. Volumen regentov smo povečali za 10 %, 25 %, 35 % in 50 % začetnega volumna. Odvzetemu supernatantu smo z Bradfordovo metodo določili koncentracijo proteinov. Aktivnost smo določili tako supernatantu kot tudi nastali oborini. Glede na dobljene rezultate smo se določili za optimalno količino obarjalnega reagenta Resuspendiranje oborine v pufru Ponovili smo postopek obarjanja z optimalnim volumnom obarjalnega reagenta kot je opisano v poglavju , le da smo po odpipetiranju supernatanta nastalo oborino resuspendirali v pufru, da bi dokazali, da obarjanje oziroma agregacija ne denaturira proteina. Po centrifugiranju in odvzemu supernatanta smo na oborino odpipetirali 900 μl pufra TRIS in zmešali na vorteksu, da se je oborina raztopila. Raztopini in supernatantu smo določili aktivnost encima in vsebnost proteinov. 10

27 Postopek resuspendiranja smo ponovili še s 75% večjim volumnom obarjalnega reagenta od začetnega in primerjali rezultate Zamreženje oz. tvorba zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) CLEAs nastanejo s postopkom obarjanja, ki mu sledi zamreženje z bifunkcionalnim reagentom glutaraldehidom. Najprej smo po postopku, opisanem v poglavju obarjali encim TGM s koncentracijo 100 mg/ml v optimalni količini obarjalnega reagenta, ki smo ga predhodno določili. Uporabili smo naslednje obarjalne reagente: - Aceton - Etanol - 1-propanol - 2-propanol - Acetonitril - Metanol - 1- butanol K obarjalnemu reagentu z volumnom 1215 μl smo dodali 100 μl raztopine encima in konstantno mešali 40 minut na stresalniku. Oborjeni suspenziji smo dodali 1% (v/v) GA in konstantno mešali 3 ure na sobni temperaturi. Sledil je dodatek 100 μl 0,1M NaBH3CN in mešanje še nadaljnjih 40 minut. Po pretečenem času smo vzorec centrifugirali 5 minut pri rpm/minuto. Odvzeli smo supernatant. Nastali pelet kaže slika Slika 3-1. Določili smo aktivnost encima v supernatantu in na nastalem peletu ter vsebnost proteinov v supernatantu. Slika 3-1: Prikaz nastalega peleta pri sintezi CLEAs iz transglutaminaze 11

28 Spiranje s pufrom PBS Nastale zamrežene skupke encima smo dvakrat spirali s fosfatnim pufrom z NaCl (PBS), da smo ugotovili, kako so CLEAs stabilni proti spiranju s pufrom. Pripravili smo 0,1 M raztopino pufra PBS. Ponovili smo postopek sinteze CLEAs iz poglavja , le da smo po centrifugiranju odvzeli supernatant in na pelet odpipetirali 900 μl pufra. Vzorec smo ponovno centrifugirali 5 minut na rpm/minuto. Postopek smo ponovili dvakrat. Določili smo preostanek proteinov in aktivnost encima v supernatantih po vsakem spiranju, ter aktivnost encima na peletu po drugem spiranju. Iz rezultatov smo razbrali koliko encima se spere iz zamreženih agregatov po dveh spiranjih in izbrali obarjalni reagent, ki je najbolj stabilen proti spiranju Optimiranje parametrov za izboljšanje lastnosti CLEAs Da bi dosegli čimvečjo aktivnost in učinkovitost imobilizacije imobilizirane TGM smo optimirali naslednje parametre: Optimiranje koncentracije glutaraldehida Koncentracija dodanega mrežnega povezovalca je zelo pomembna, saj prevelika koncentracija pomeni zmanjšanje stabilnosti, premajhna koncentracija pa zmanjšanje aktivnosti CLEAs. Postopek sinteze CLEAs iz poglavja smo ponovili s povečanjem volumskega procenta glutaraldehida na 1,521 % (v/v), 2,015 % (v/v) in 2,280 % (v/v). Ostali parametri so ostali enaki. Z dobljenimi rezultati smo določili optimalno količino glutaraldehida. Dodajanje ogrodnega proteina BSA (goveji serumski albumin) BSA je ogrodni protein, ki omogoča zamreženje encimskih skupkov v primeru, ko je koncentracija encima nizka ali pa je aktivnost encima občutljiva na visoko koncentracijo glutaraldehida. Dodatek BSA poveča stabilnost encima, kar posledično poveča tudi aktivnost imobiliziranega encima. [12] Pripravili smo raztopino encima (100 mg/ml) in raztopino BSA (50 mg/ml). V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 100 μl TGM in 100 μl BSA ter kontinuirno mešali 40 minut. S tako pripravljenim encimom smo ponovili postopek sinteze CLEAs, kot je opisano v poglavju Optimiranje koncentracije natrijevega cianoborohidrida (NaBH3CN) Dodatek NaBH3CN zagotovi, da se kovalentna vez med molekulami encima in mrežnim povezovalcem ne prekine s hidrolizo. [5] Ponovili smo postopek sinteze CLEAs iz poglavja z različnimi volumni 0,1 M NaBH3CN (100 μl, 150 μl, 200 μl, 250 μl) in izbrali optimalno količino. Povečevanje koncentracije TGM Postopek iz poglavja smo ponovili z raztopinami encima z različnimi koncentracijami (100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml) in na podlagi rezultatov nadaljevali delo s koncentracijo 100 mg/ml. 12

29 Dodajanje ogrodnega proteina EA (jajčni albumin) BSA smo zamenjali z EA, ki prav tako kot BSA stabilizira encim in mu posledično poveča aktivnost. Pripravili smo raztopino EA s koncentracijo 50 mg/ml in raztopino encima s koncentracijo 100 mg/ml. V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 100 μl EA in 100 μl encima ter konstantno mešali 40 minut. S tako pripravljenim encimom smo ponovili postopek sinteze CLEAs iz poglavja Optimiranje koncentracije ogrodnih proteinov Raztopini encima (100 mg/ml) smo dodali različne koncentracije BSA in EA: - 50 mg/ml BSA mg/ml BSA - 25 mg/ml EA - 50 mg/ml EA mg/ml EA mg/ml EA Kombinacije: - 50 mg/ml BSA + 25mg/ml EA - 50 mg/ml BSA + 50 mg/ml EA - 50 mg/ml BSA mg/ml EA Iz rezultatov smo razbrali, kateri ogrodni protein je najbolj ustrezen in katera koncentracija tega proteina daje najboljše rezultate. Optimiranje koncentracije encima TGM Spreminjali smo koncentracijo raztopine encima TGM z dodatkom optimalne koncentracije ogrodnega proteina EA (100 mg/ml). Pripravili smo vzorce: - 50 mg/ml TGM mg/ml EA mg/ml TGM mg/ml EA mg/ml TGM mg/ml EA mg/ml TGM mg/ml EA mg/ml TGM mg/ml EA Izbrali smo kombinacijo encima TGM in EA z najboljšimi rezultati. Dodatek pentaetilenheksamina (PEHA) Dodatek PEHA v postopku sinteze CLEAs poveča število prostih amino skupin, ki se nahajajo na zunanji površini encima, kar omogoča popolnejše zamreženje. Tako imobiliziran encim je zato stabilnejši in bolj odporen proti spiranju v vodnem mediju. [5] Po postopku iz poglavja smo ponovili postopek sinteze CLEAs, le da smo v začetno mešanico 100 μl encima (250 mg/ml) in 100 μl EA (100 mg/ml) dodali 200 μl 0,1 M PEHA. 13

30 Ponovna uporaba encima Na koncu smo naredili preizkus uporabnosti imobilizirane transglutaminaze za večkratno uporabo v šaržnem procesu. Želeli smo ugotoviti, kolikokrat lahko encim ponovno uporabimo kot katalizator reakcije, da še obdrži visoko aktivnost. Po postopku, ki smo ga opisali v poglavju , smo sintetizirali CLEAs. Po končanem postopku sinteze z dvakratnim spiranjem smo peletu določili aktivnost encima, odvzetim supernatantom po vsakem spiranju pa aktivnost encima in vsebnost proteinov. Pelet smo nato zopet sprali s pufrom PBS in ponovili meritve na peletu in v supernatantu. Postopek smo ponavljali tako dolgo, da je bilo opaziti padec v aktivnosti encima na peletu. Iz rezultatov smo razbrali, kolikokrat je smiselno tako imobiliziran encim ponovno uporabiti v procesu. 14

31 3.4 Analizne metode Uporabili smo dve analizni metodi. Z Bradfordovim testom smo določili vsebnost proteinov v vzorcu, aktivnost pa smo določili z aktivnostnim testom za transglutaminazo Bradfordov test za določevanje koncentracije proteinov Brafordov test nam pove koncentracijo proteinov v vzorcu na osnovi kompleksa, ki se tvori med barvo v Bradfordovem reagentu in proteini v vzorcu. Ta kompleks povzroči spremembo absorbance pri valovni dolžini 595 nm. Bradfordov reagent smo pripravili tako, da smo 100 mg Coomassie Brilliant Blue raztopili v 100 ml fosforne kisline z 85 % (v/v) in 50 ml 95 % etanola. Mešanico smo razredčili z deionizirano vodo do skupnega volumna 1 l. Reagent smo umerili z ogrodnim proteinom BSA. Zatehtali smo 10 mg BSA in ga zmešali z 1 ml deionizirane vode, da smo dobili koncentracijo 10 mg/ml. Z redčenjem smo nato pripravili več raztopin BSA v koncentracijskem območju med 0 mg/ml in 1 mg/ml: 0,0 mg/ml (samo deionizirana voda) 0,2 mg/ml (20 μl 10 mg/ml BSA z 980 μl deionizirane vode) 0,4 mg/ml (40 μl 10 mg/ml BSA z 960 μl deionizirane vode) 0,6 mg/ml (60 μl 10 mg/ml BSA z 940 μl deionizirane vode) 0,8 mg/ml (80 μl 10 mg/ml BSA z 920 μl deionizirane vode) 1,0 mg/ml (100 μl 10 mg/ml BSA z 900 μl deionizirane vode) Pripravljenim vzorcem smo izmerili vsebnost proteinov po sledečem postopku: 1. Odpipetirali smo 1 ml pripravljenega Bradfordovega reagenta v mikrocentrifugirke. 2. Dodali smo 20 μl vzorca. 3. Mešanico smo zvorteksirali in inkubirali na sobni temperaturi 15 minut. 4. S spektrofotometrom smo izmerili absorbanco pri 595 nm. Skonstruirali smo ustrezno umeritveno krivuljo absorbance pri 595 nm v odvisnosti od koncentracije BSA in z linearno interpolacijo določili premico, ki poteka skozi eksperimentalne točke. Odvzetim supernatantom pri sintezi CLEA smo vsebnost proteinov pomerili po identičnem postopku kot vzorcem za pripravo umeritvene krivulje. V postopku smo 20 μl vzorca zamenjali z 20 μl deionizirane vode, da smo dobili slepi vzorec. Prisotnost proteinov je povzročila spremembo barve raztopine kot kaže slika Slika 3-2. Levo je vzorec s prostim encimom, desno pa slepi vzorec. 15

32 Slika 3-2: Prikaz obarvanja vzorcev pri določevanju prisotnosti proteinov z Bradfordovim testom Izračun učinkovitosti imobilizacije Iz vrednosti absorbanc, ki smo jih izmerili vzorcem pri Bradfordovem testu, smo določili učinkovitost imobilizacije, s katero ugotovimo, koliko encima se je uspelo zamrežiti v encimske skupke. Enačba, s katero izračunamo učinkovitost imobilizacije, je prikazana spodaj: c c ci i s % 100 (3.1) Kjer je: cs koncentracija encima v supernatantu (mg/ml) ci koncentracija prostega encima (mg/ml) ρ učinkovitost imobilizacije (%) Aktivnostni test Akitvnost smo določali glede na to, koliko encima transglutaminaze katalizira nastanek 1 μmola CBZ - glutaminske kisline γ monohidroksamata iz CBZ - glutaminilglicina in hidroksilamina na minuto pri 37 C, kot je prikazano na sliki Slika 3-3. Slika 3-3: Shema, ki nam prikazuje princip določanja aktivnostnega testa za encim transglutaminazo z določenimi pogoji 16

33 Najprej smo pripravili reagente: Reagent A smo pripravili tako, da smo 1 M pufer TRIS raztopili v 50 ml deionizirane vode. Pri 37 C smo umerili raztopino na ph vrednost 6,0 z ocetno kislino. Za reagent B smo uporabili CBZ glutaminilglicin (CBZ-Gln-Gly) v trdnem stanju Reagent C je bilo potrebno pripraviti sveže vsak dan. Naredili smo raztopino 0,2 M hidroksilamina in 0,02 M glutationa v 10 ml deionizirane vode. Reagent D smo pripravili tako, da smo 1 M kalcijev klorid raztopili v 1 ml deionizirane vode. Za reagent E smo 0,01 M glutaminsko kislino γ monohidroksamat raztopili v 10 ml deionizirane vode. Reagent F smo pripravili z 12 % (v/v) trikloroocetne kisline (TCA) v deionizirani vodi v 100 ml bučki. Reagent G smo pripravili tako, da smo železov triklorid raztopili v 100 ml reagenta H, ki ga je sestavljalo 100 ml 0,1 M klorovodikove kisline z deionizirano vodo. Reagent I je bila raztopina encima, ki smo jo pripravili vsak dan sproti. Koncentracijo te raztopine smo spreminjali v območju od 50 mg/ml do 250 mg/ml. Za izvedbo aktivnostnega testa smo iz pripravljenih reagentov zmešali reakcijski koktejl. Zatehtali smo 120 mg reagenta B, mu dodali 5 ml svežega reagenta C in 2 ml reagenta A in mešali ob rahlem segrevanju na grelniku z magnetnim mešalom. Med mešanjem smo dodali še 50 μl reagenta D. Raztopino smo z 1 M NaOH umerili na ph 6,00 pri 37 C. Nato smo dodali deionizirano vodo do skupnega volumna 10 ml. Vzorcem smo aktivnost merili po naslednjem postopku. V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 200 μl reakcijskega koktejla in segreli na 37 C. Dodali smo 30 μl raztopine encima, zvorteksirali in 10 minut inkubirali pri 37 C. Po pretečenem času smo dodali 500 μl reagenta F in 500 μl reagenta G. Slepo probo smo pripravili tako, da smo s pipeto v mikrocentrifugirko odpipetirali 200 μl reakcijskega koktejla, 500 μl reagenta F, 30 μl vzorca in 500 μl reagenta G. Med vsakim dodajanjem smo zmešali na vorteksu. Za standard smo v mikrocentrifugirko odpipetirali 100 μl reagenta E, 500 μl reagenta F in 500 μl reagenta G. Zmešali smo na vorteksu. Slepa proba za standard pa je bila pripravljena tako, da smo skupaj zmešali 100 μl deionizirane vode, 500 μl reagenta F in 500 μl reagenta G. Vse pripravljene raztopine smo centrifugirali 5 minut pri rpm/min. S spektrofotometrom smo raztopinam izmerili absorbanco pri 525 nm. Večja kot je bila izmerjena aktivnost bolj oranžno se je obarvala raztopina. Raztopine z nizko aktivnostjo so ostale rumene barve kot vidimo na sliki Slika

34 Slika 3-4: Prikaz obarvanosti raztopine pri določevanju aktivnosti z aktivnostnim testom Izračun preostanka aktivnosti Aktivnost smo izračunali z enačbo: U/ml encima = A A 0 A A 1,1 10 1, 23 st st0 Kjer so: Av absorbanca vzorca (pri 525 nm) A0 absorbanca slepe probe (pri 525 nm) Ast absorbanca standardne raztopine (pri 525 nm) Ast0 absorbanca slepe probe za standard (pri 525 nm) 1,1 volumen standardne raztopine (ml) 10 reakcijski čas (min) 1,23 volumen barvne mešanice (ml) Preostalo aktivnost smo izračunali po spodnji enačbi: v (3.2) aktivnost CLEAs A% 100 (3.3) aktivnost prostega encima 18

35 4 Rezultati in diskusija 4.1 Obarjanje encima TGM v izbranih obarjalnih reagentih Encim TGM smo obarjali tako, da smo 100 μl raztopine encima po kapljicah dodajali k 900 μl obarjalnega reagenta. Suspenzijo smo centrifugirali, da smo ločili nastalo oborino od supernatanta. Uspešnost obarjanja smo že pred centrifugiranjem lahko določili z opazovanjem motnosti nastale suspenzije. Bela motnost je pomenila uspešno obarjanje, bistra tekočina brez oborine pa neuspešno obarjanje. V treh vzorcih sta se pojavili dve fazi, kar smo ocenili kot neuspešno obarjanje. Po centrifugiranju smo pri vzorcih z uspešno obarjenim encimom opazili belo oborino. Motna suspenzija je bila vidna pri acetonu, 1-propanolu, 2-propanolu, acetonitrilu, metanolu in etanolu. V primeru amonijevega sulfata ni bilo opaziti motnosti. Dve fazi sta se pojavili pri n-heksanu, 1-butanolu in dimetil etru. Pri zadnjih dveh smo opazili mehurček. Rezultati obarjanja TGM so prikazani v tabeli Tabela 4-1 in na sliki Slika 4-1. Tabela 4-1: Opis suspenzije in ocena uspešnosti obarjanja transglutaminaze v izbranih obarjalnih reagentih OBARJALNI REAGENT OPIS SUSPENZIJE OCENA OBARJANJA aceton motna suspenzija uspešno etanol motna suspenzija uspešno 1-propanol motna suspenzija uspešno 2-propanol motna suspenzija uspešno acetonitril motna suspenzija uspešno metanol motna suspenzija uspešno 1-butanol dve fazi, mehurček neuspešno dimetil eter dve fazi, mehurček neuspešno n-heksan dve fazi neuspešno amonijev sulfat bistra tekočina neuspešno 19

36 preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] Slika 4-1: Prikaz rezultatov obarjanja encima: a-uspešno obarjanje (motnost), b-neuspešno obarjanje (dve fazi), c-neuspešno obarjanje (bistra tekočina brez oborine), d-oborina pri uspešnih obarjalnih reagentih Uspešno oborjenim vzorcem smo s spektrofotometrom določili aktivnost encima in preostanek proteinov. Izračunali smo, koliko proteinov je ostalo v oborini in koliko se je spralo v supernatant, ter kako obarjanje vpliva na aktivnost encima. Iz slike Slika 4-2 lahko povzamemo, da so se aktivnosti oborjenega encima gibale med 100 % in 300 %. Izjema je oborjen encim v obarjalnem reagentu acetonu, kjer je bila aktivnost le 10 %. Najvišjo aktivnost encima smo zasledili pri obarjanju v 1-propanolu, in sicer 282,62 %. V supernatantih se je aktivnost encima gibala od 0 % do 1,3 %, kar pomeni, da je nekaj encima ostalo neobarjenega. Na grafu vidimo, da je v oborini pri večini vzorcev ostalo okoli 90 % proteinov. Izjema je acetonitril, kjer je preostalo 68 % proteinov preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-2: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) po obarjanju v različnih obarjalnih reagentih 20

37 preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] 4.2 Izbira optimalnega obarjalnega reagenta in njegove koncentracije Da bi se prepričali o neustreznosti obarjalnih reagentov, kjer je bilo obarjanje ocenjeno kot neuspešno, smo povečali koncentracijo obarjalnega reagenta. V primeru amonijevega sulfata, n-heksana, 1-butanola in dimetil etra smo povečali volumen obarjalnega reagenta za 25 %, tako da je končni volumen reagenta znašal 1125 μl. Obarjanje smo ocenili kot neuspešno. Uspešnim obarjalnim reagentom smo želeli izboljšati aktivnost, zato smo povečali volumen reagenta za 10 %, tako da je končni volumen obarjalnega reagenta znašal 990 μl. Iz slike Slika 4-3 vidimo, da so se s povečanjem koncentracije obarjalnega reagenta povečale tudi aktivnosti encima, ki so sedaj med 250 % in 350 %. Najvišjo aktivnost zasledimo pri obarjanju encima v obarjalnem reagentu 2-propanolu s 351,64 %, najnižjo pa še vedno v reagentu acetonu, in sicer okoli 1 %. V supernatantih smo še vedno zasledili aktivnost encima do 10 %. Procent preostalih proteinov v oborini se je pri obarjanju v reagentih acetonu, etanolu, acetonitrilu in metanolu povečal malo nad 90 %, pri 1-propanolu in 2-propanolu pa je ostal približno enak preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-3: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM pri obarjanju z 10 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 25 % povečanjem volumna (dietil eter, n-heksan, 1-butanol, amonijev sulfat) Obarjalnim reagentom z neuspešnim obarjanjem encima smo povečali volumen za 50 %, tako da je končni volumen obarjalnega reagenta znašal 1350 μl, obarjalnim reagentom z uspešnim obarjanjem encima pa za 35 %, da smo dosegli končni volumen 1215 μl. Pri obarjanju encima v reagentu 1-butanolu smo opazili motnost suspenzije, zato smo ocenili obarjanje kot uspešno. Pri obarjanju encima v dimetil etru, n-heksanu in amonijevem sulfatu nismo opazili sprememb. Iz slike Slika 4-4 vidimo, da so se aktivnosti encima gibale med 250 % in 450 %. Najvišjo aktivnost encima smo dosegli v primeru obarjanja v 1-propanolu, in sicer 430 %. Aktivnost oborjenega encima v 2-propanolu se je znižala za 50 %. Najnižjo aktivnost encima je še vedno bilo opaziti pri obarjanju v acetonu, in sicer 10 %. Obarjanje encima v 1-butanolu je doseglo 350 % aktivnost. Aktivnosti encima v supernatantih so bile skoraj 0 %. Odstotki preostanka proteinov v oborini so se še vedno gibali okoli 90 %, le v primeru obarjanja v 1-butanolu je bila vrednost nižja, in sicer 68 %. 21

38 preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-4: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) pri obarjanju z 35 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 50 % povečanjem volumna (1-butanol, dimetil eter, amonijev sulfat, n-heksan) Volumen obarjalnega reagenta smo povečali še za 75 % do končnega volumna 1575 μl pri obarjalnih reagentih z uspešnim obarjanjem encima in za 50 % do volumna 1350 μl pri obarjalnih reagentih z neuspešnim obarjanjem encima. V Dimetil etru, n-heksanu in amonijevem sulfatu se encim še vedno ni oboril. Iz slike Slika 4-5 je razvidno, da so aktivnosti encima padle pod 320 %. Najvišjo aktivnost ima encim, oborjen v 1-propanolu z 314,8 %, najnižjo pa v acetonu in sicer 4,89 %. V vseh primerih je padla aktivnost encima za 50 % ali več. Preostanek proteinov je znašal okoli 90 %, le pri obarjanju v 1-butanolu se je povišal na 80,36 % preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-5: Preostanek proteinov in preostala aktivnost encima (100 mg/ml) pri obarjanju z 75 % povečanjem volumna obarjalnega reagenta 22

Diplomsko delo DOLOČEVANJE AKTIVNOSTI NEKATERIH ENCIMOV V GRANATNEM JABOLKU september, 2018 Tamara Kobale

Diplomsko delo DOLOČEVANJE AKTIVNOSTI NEKATERIH ENCIMOV V GRANATNEM JABOLKU september, 2018 Tamara Kobale Diplomsko delo DOLOČEVANJE AKTIVNOSTI NEKATERIH ENCIMOV V GRANATNEM JABOLKU september, 2018 Tamara Kobale Tamara Kobale Določevanje aktivnosti nekaterih encimov v granatnem jabolku Diplomsko delo Maribor,

Prikaži več

10. Vaja: Kemijsko ravnotežje I a) Osnove: Poznamo enosmerne in ravnotežne kemijske reakcije. Za slednje lahko pišemo določeno konstanto kemijskega ra

10. Vaja: Kemijsko ravnotežje I a) Osnove: Poznamo enosmerne in ravnotežne kemijske reakcije. Za slednje lahko pišemo določeno konstanto kemijskega ra 10. Vaja: Kemijsko ravnotežje I a) Osnove: Poznamo enosmerne in ravnotežne kemijske reakcije. Za slednje lahko pišemo določeno konstanto kemijskega ravnotežja (K C ), ki nam podaja konstantno razmerje

Prikaži več

ALKOHOLI

ALKOHOLI ALKOHOLI Kaj je alkohol? Alkohol je bistvena učinkovina v alkoholnih pijačah, ter alkoholi so pomembna skupina organskih spojin. V kemiji je alkohol splošen pojem, ki ga uporabljamo za vsako organsko spojino,

Prikaži več

DELOVANJE KATALIZATORJEV Cilji eksperimenta: Opazovanje delovanja encima katalaze, ki pospešuje razkroj vodikovega peroksida, primerjava njenega delov

DELOVANJE KATALIZATORJEV Cilji eksperimenta: Opazovanje delovanja encima katalaze, ki pospešuje razkroj vodikovega peroksida, primerjava njenega delov DELOVANJE KATALIZATORJEV Cilji eksperimenta: Opazovanje delovanja encima katalaze, ki pospešuje razkroj vodikovega peroksida, primerjava njenega delovanja z delovanjem nebeljakovinskih katalizatorjev in

Prikaži več

1

1 1. Pojme na desni poveži z ustreznimi spojinami in ioni na levi strani glede na njihove lastnosti in uporabo pri vaji določevanja glukoze in saharoze v skupnem vzorcu! Ni nujno, da si vsi pojmi povezani!

Prikaži več

AMIN I

AMIN I AMI I Kaj so Amini Amini so zelo razširjene spojine v naravnih ali umetnih organskih snoveh.kemijsko so vezani v barvilih, zdravilih,alkaloidih in polimerih.prosti amini se redko pojavljajo v naravi, nastanejo

Prikaži več

IZBIRNI PREDMET KEMIJA 2. TEST B Ime in priimek: Število točk: /40,5t Ocena: 1.) 22,4 L kisika, merjenega pri 0 o C in 101,3 kpa: (1t) A im

IZBIRNI PREDMET KEMIJA 2. TEST B Ime in priimek: Število točk: /40,5t Ocena: 1.) 22,4 L kisika, merjenega pri 0 o C in 101,3 kpa: (1t) A im IZBIRNI PREDMET KEMIJA 2. TEST B Ime in priimek: 8. 1. 2008 Število točk: /40,5t Ocena: 1.) 22,4 L kisika, merjenega pri 0 o C in 101,3 kpa: (1t) A ima maso 16,0 g; B ima maso 32,0 g; C vsebuje 2,00 mol

Prikaži več

Kmetijska šola Grm Sevno Novo mesto PROIZVODNJA IN UPORABA ENCIMOV Marec, 2007

Kmetijska šola Grm Sevno Novo mesto PROIZVODNJA IN UPORABA ENCIMOV Marec, 2007 Kmetijska šola Grm Sevno 13 8000 Novo mesto PROIZVODNJA IN UPORABA ENCIMOV Marec, 2007 O ENCIMIH So najpomembnejša skupina beljakovin, so biokatalizatorji, znanih je okoli 3000, znižujejo aktivacijsko

Prikaži več

Slide 1

Slide 1 Slide 1 OBDELAVA ODPADNE VODE Slide 2 KAKO POVRNITI PORUŠENI EKOSITEM V PRVOTNO STANJE? KAKO POVRNITI PORUŠENI EKOSITEM V PRVOTNO STANJE?! uravnavanje ph, alkalnosti! odstranjevanje ali dodajanje elementov!

Prikaži več

Microsoft PowerPoint vaja-salen

Microsoft PowerPoint vaja-salen Sinteza mimetika encima SD 1. stopnja: H 2 salen 18/11/2010 Vaje iz Farmacevtske kemije 3 1 Sinteza N,N - bis(saliciliden)etilendiamina Predlagajte orositveni reagent za detekcijo poteka reakcije in za

Prikaži več

ELEKTROKEMIJA 1. Izračunajte potencial inertne elektrode v raztopine, ki jo dobimo, če zmešamo 5,0 ml 0,1 M Ce 4+ in 5,0 ml 0,3 M raztopine Fe 2+! (E

ELEKTROKEMIJA 1. Izračunajte potencial inertne elektrode v raztopine, ki jo dobimo, če zmešamo 5,0 ml 0,1 M Ce 4+ in 5,0 ml 0,3 M raztopine Fe 2+! (E ELEKTROKEMIJA 1. Izračunajte potencial inertne elektrode v raztopine, ki jo dobimo, če zmešamo 5,0 ml 0,1 M Ce 4+ in 5,0 ml 0,3 M raztopine Fe 2+! (E o Fe 2+ /Fe 3+ = 0,771 V) Rez.: 0,735 V 2. Izračunajte

Prikaži več

Kolokvij iz biokemije za biologe

Kolokvij iz biokemije za biologe Kolokvij BIOKEMIJA, 9.1. 2004 1.) Kako bi po obarjanju s 95% etanolom preverili če so v supernatantu še prisotni proteini? ( 4T ) 2.) Od česa je odvisna različna hitrost potovanja snovi pri tankoplastni

Prikaži več

1 EKSPERIMENTALNI DEL 1.1 Tkanina Pri pranju smo uporabili pet tkanin, od katerih je bila ena bela bombažna tkanina (B), preostale tkanine (E101, E111

1 EKSPERIMENTALNI DEL 1.1 Tkanina Pri pranju smo uporabili pet tkanin, od katerih je bila ena bela bombažna tkanina (B), preostale tkanine (E101, E111 1 EKSPERIMENTALNI DEL 1.1 Tkanina Pri pranju smo uporabili pet tkanin, od katerih je bila ena bela bombažna tkanina (B), preostale (E101, E111, E114 in E160) pa so bile zamazane z različnimi umazanijami

Prikaži več

Odgovori na vprašanja za anorgansko kemijo

Odgovori na vprašanja za anorgansko kemijo Odgovori na vprašanja za anorgansko kemijo 1. Zakon o stalnih masnih razmerjih Masno razmerje reagentov, v katerem se reagenti spajajo, je neodvisno od načina reakcije ter vedno isto. 2. Zakon o mnogokratnih

Prikaži več

Microsoft Word doc

Microsoft Word doc [ifra kandidata: Dr `av ni iz pitni center *M* PREDPREZKUS KEMJA zpitna pola Marec / minut Dovoljeno dodatno gradivo in pripomo~ki: kandidat prinese s seboj nalivno pero ali kemi~ni svin~nik svin~nik B

Prikaži več

HALOGENI ELEMENTI

HALOGENI ELEMENTI HALOGENI ELEMENTI Halogeni elementi so elementi 7. skupine periodnega sistema elementov (ali VII. skupine). To so fluor, klor, brom in jod. Halogeni spadajo med nekovine. V elementarnem stanju obstajajo

Prikaži več

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO HELENA KERIN DIPLOMSKA NALOGA UNIVERZITETNI PROGRAM FARMACIJA Ljubljana, 2014

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO HELENA KERIN DIPLOMSKA NALOGA UNIVERZITETNI PROGRAM FARMACIJA Ljubljana, 2014 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO HELENA KERIN DIPLOMSKA NALOGA UNIVERZITETNI PROGRAM FARMACIJA Ljubljana, 214 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO HELENA KERIN VPLIV ph IN ČASA ZADRŽEVANJA

Prikaži več

FIZIKALNA STANJA IN UREJENOST POLIMERNIH VERIG Polimeri se od nizkomolekularnih spojin razlikujejo po naravi fizikalnega stanja in po morfologiji. Gle

FIZIKALNA STANJA IN UREJENOST POLIMERNIH VERIG Polimeri se od nizkomolekularnih spojin razlikujejo po naravi fizikalnega stanja in po morfologiji. Gle FIZIKALNA STANJA IN UREJENOST POLIMERNIH VERIG Polimeri se od nizkomolekularnih spojin razlikujejo po naravi fizikalnega stanja in po morfologiji. Glede na obliko in način urejanja polimernih verig v trdnem

Prikaži več

Kako potekajo reakcije oksidacije in redukcije z manganati (VII) v nevtralni do zmerno alkalni raztopini

Kako potekajo reakcije oksidacije in redukcije z manganati (VII) v nevtralni do zmerno alkalni raztopini VPRAŠANJA ZA ANALIZNO KEMIJO 1.) Kako potekajo reakcije oksidacije in redukcije z manganati(vii) v nevtralni do zmerno alkalni raztopini? Izberite si ustrezen reducent in napišite reakcijo! 2.) Kako reagirajo

Prikaži več

Microsoft Word - sia_s_fluoridno_2006.doc

Microsoft Word - sia_s_fluoridno_2006.doc Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop Analizna kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2006 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar

Prikaži več

LABORATORIJSKE VAJE IZ FIZIKE

LABORATORIJSKE VAJE IZ FIZIKE UVOD LABORATORIJSKE VAJE IZ FIZIKE V tem šolskem letu ste se odločili za fiziko kot izbirni predmet. Laboratorijske vaje boste opravljali med poukom od začetka oktobra do konca aprila. Zunanji kandidati

Prikaži več

UREDBA KOMISIJE (EU) 2018/ z dne 28. septembra o spremembi Priloge II k Uredbi (ES) št. 1333/ Evropskega parlamen

UREDBA  KOMISIJE  (EU)  2018/ z dne  28. septembra o spremembi  Priloge  II  k Uredbi  (ES)  št. 1333/ Evropskega  parlamen 1.10.2018 L 245/1 II (Nezakonodajni akti) UREDBE UREDBA KOMISIJE (EU) 2018/1461 z dne 28. septembra 2018 o spremembi Priloge II k Uredbi (ES) št. 1333/2008 Evropskega parlamenta in Sveta ter Priloge k

Prikaži več

Specifikacija obračuna - GoSoft

Specifikacija obračuna - GoSoft Poročilo o izvedeni nalogi Spremljanje zdravstvene ustreznosti pitne vode - Pomurski vodovod krak A Evidenčna oznaka: 2141a-14/8024-17/46560 14.05.62276 EKO-PARK D.O.O. LENDAVA, JAVNO PODJETJE OKO-PARK

Prikaži več

Pripravki granulocitov iz polne krvi (buffy coat)

Pripravki granulocitov iz polne krvi (buffy coat) Pripravki granulocitov iz polne krvi (buffy coat) - KLZ Podčetrtek, 8. 1 0. 2 0 16 AV TO R I C A : A n d r e j a H r a š o v e c - L a m p r e t, d r. m e d., s p e c. t r a n s f. m e d. S O AV TO R :

Prikaži več

Microsoft Word - M docx

Microsoft Word - M docx Državni izpitni center *M1180314* SPOMLADANSKI IZPITNI ROK Izpitna pola Modul gradbeništvo NAVODILA ZA OCENJEVANJE Četrtek, 14. junij 01 SPLOŠNA MATURA RIC 01 M11-803-1-4 IZPITNA POLA Modul gradbeništvo

Prikaži več

Diapozitiv 1

Diapozitiv 1 ZAHTEVE TENIŠKE IGRE V tej predstavitvi bomo... Analizirali teniško igro z vidika fizioloških procesov Predstavili energijske procese, ki potekajo pri športni aktivnosti Kako nam poznavanje energijskih

Prikaži več

Microsoft Word - M doc

Microsoft Word - M doc Š i f r a k a n d i d a t a : ržavni izpitni center *M12143111* SPOMLNSKI IZPITNI ROK K E M I J Izpitna pola 1 Četrtek, 7. junij 2012 / 90 minut ovoljeno gradivo in pripomočki: Kandidat prinese nalivno

Prikaži več

PERIODNI SISTEM 1. skupina

PERIODNI SISTEM 1. skupina PERIODNI SISTEM 1. skupina OSNOVNA DEJSTVA & POJMI Vsi elementi so zelo reaktivni, zato jih hranimo pod pertolejem in vsi so mehke, srebrno bele kovine Vse spojine so ionske in topne Vsi elementi, oz.

Prikaži več

Poskusi s kondenzatorji

Poskusi s kondenzatorji Poskusi s kondenzatorji Samo Lasič, Fakulteta za Matematiko in Fiziko, Oddelek za fiziko, Ljubljana Povzetek Opisani so nekateri poskusi s kondenzatorji, ki smo jih izvedli z merilnim vmesnikom LabPro.

Prikaži več

Poročilo o izvedeni nalogi, ver.1.4

Poročilo o izvedeni nalogi, ver.1.4 Poročilo o izvedeni nalogi Spremljanje zdravstvene ustreznosti pitne vode - Pomurski vodovod sistem A Evidenčna oznaka: 2141a-14/8024-19/24348 07.04.43056 EKO-PARK D.O.O. LENDAVA, JAVNO PODJETJE OKO-PARK

Prikaži več

Microsoft Word - A-3-Dezelak-SLO.doc

Microsoft Word - A-3-Dezelak-SLO.doc 20. posvetovanje "KOMUNALNA ENERGETIKA / POWER ENGINEERING", Maribor, 2011 1 ANALIZA OBRATOVANJA HIDROELEKTRARNE S ŠKOLJČNIM DIAGRAMOM Klemen DEŽELAK POVZETEK V prispevku je predstavljena možnost izvedbe

Prikaži več

1. Prehajanje snovi skozi celično membrano biološke membrane so izbirno prepustne (uravnavajo svojo kemijsko sestavo) membrana je o meja med celico oz

1. Prehajanje snovi skozi celično membrano biološke membrane so izbirno prepustne (uravnavajo svojo kemijsko sestavo) membrana je o meja med celico oz 1. Prehajanje snovi skozi celično membrano biološke membrane so izbirno prepustne (uravnavajo svojo kemijsko sestavo) membrana je o meja med celico oz. organeli in okoljem o regulator vstopa in izstopa

Prikaži več

Poročilo o izvedeni nalogi

Poročilo o izvedeni nalogi Poročilo o izvedeni nalogi Evidenčna oznaka: 2163-00/18228-17/40464 06.06.13140 Naročnik: JKP ŠENTJUR, JAVNO KOMUNALNO PODJETJE, D.O.O. CESTA LEONA DOBROTINŠKA 18 Izvajalci: Oddelek za okolje in zdravje

Prikaži več

PRILOGA I PARAMETRI IN MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV Splošne zahteve za pitno vodo DEL A Mikrobiološki parametri Parameter Mejna vrednost parametra (štev

PRILOGA I PARAMETRI IN MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV Splošne zahteve za pitno vodo DEL A Mikrobiološki parametri Parameter Mejna vrednost parametra (štev PRILOGA I PARAMETRI IN MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV Splošne zahteve za pitno vodo DEL A Mikrobiološki parametri (število/100 ml) Escherichia coli (E. coli) 0 Enterokoki 0 Zahteve za vodo, namenjeno za pakiranje:

Prikaži več

FIZIKA IN ARHITEKTURA SKOZI NAŠA UŠESA

FIZIKA IN ARHITEKTURA SKOZI NAŠA UŠESA FIZIKA IN ARHITEKTURA SKOZI NAŠA UŠESA SE SPOMNITE SREDNJEŠOLSKE FIZIKE IN BIOLOGIJE? Saša Galonja univ. dipl. inž. arh. ZAPS marec, april 2012 Vsebina Kaj je zvok? Kako slišimo? Arhitekturna akustika

Prikaži več

Ponudba/predračun - osnova, v.1

Ponudba/predračun - osnova, v.1 Poročilo o izvedeni nalogi Spremljanje zdravstvene ustreznosti pitne vode - Pomurski vodovod sistem A Evidenčna oznaka: 2141a-14/8024-19/48541 18.03.37635 EKO-PARK D.O.O. LENDAVA, JAVNO PODJETJE OKO-PARK

Prikaži več

Osnove gastronomije PREBAVA MAKROHRANIL IN Vpliv senzoričnih lastnosti na prebavo Barbara HERLAH, univ. dipl. inž. živ. teh.

Osnove gastronomije PREBAVA MAKROHRANIL IN Vpliv senzoričnih lastnosti na prebavo Barbara HERLAH, univ. dipl. inž. živ. teh. Osnove gastronomije PREBAVA MAKROHRANIL IN Vpliv senzoričnih lastnosti na prebavo Barbara HERLAH, univ. dipl. inž. živ. teh. PREBAVA (DIGESTIJA) IN VSRKAVANJE (ABSORPCIJA) V PREBAVILIH OH, B in M so uporabni

Prikaži več

Microsoft PowerPoint - FK3Anatgonist5HT2c.ppt [Samo za branje] [Združljivostni način]

Microsoft PowerPoint - FK3Anatgonist5HT2c.ppt [Samo za branje] [Združljivostni način] Iskanje idealnega anksiolitika Iskanje = načrtovanje, sineza in vrednotenje Iskanje idealnega anksiolitika Kaj je idealni anksiolitik? Idealni anksiolitik: - ni sedativ, - per os uporabna učinkovina -

Prikaži več

Gorivna celica

Gorivna celica Laboratorij za termoenergetiko Delovanje gorivnih celic Najbolj uveljavljeni tipi gorivnih celic Obstaja veliko različnih vrst gorivnih celic, najpogosteje se jih razvršča glede na vrsto elektrolita Obratovalna

Prikaži več

Microsoft PowerPoint - −omen_Baènik

Microsoft PowerPoint - −omen_Baènik Strupene kovine v izobraževanju kaj in kako? Andreja Bačnik, ZRSŠ Agnes Šömen Joksić, ZZV Koper Vsebina Opravimo z izrazom težke kovine Razmejimo: elementi kovine strupene kovine Biogeokemijsko kroženje

Prikaži več

PROFILES učno gradivo, navodila za učitelje

PROFILES učno gradivo, navodila za učitelje Se bom raztopil, če bo deževalo? Slika 1:diamanti (Vir: http://www.idb.it/; 18.10.2015) Slika 2: kristali kuhinjske soli (Vir: https://hr.wikipedia.org/wiki/kuhinjska _sol; 18.10.2015) Modul za poučevanje

Prikaži več

11-01

11-01 Keramični prah za vlivanje Reliefco 250 in visoko kakovosten keramični prah za vlivanje Reliefco 300 Keramični prah za vlivanje Reliefco 250 je preprost za uporabo. Odlitek ima gladko belo površino. Mešalno

Prikaži več

7. VAJA A. ENAČBA ZBIRALNE LEČE

7. VAJA A. ENAČBA ZBIRALNE LEČE 7. VAJA A. ENAČBA ZBIRALNE LEČE 1. UVOD Enačbo leče dobimo navadno s pomočjo geometrijskih konstrukcij. V našem primeru bomo do te enačbe prišli eksperimentalno, z merjenjem razdalj a in b. 2. NALOGA Izračunaj

Prikaži več

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MATIC BERGANT MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJE Ljubljana, 2016

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MATIC BERGANT MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJE Ljubljana, 2016 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MATIC BERGANT MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJE Ljubljana, 2016 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MATIC BERGANT DOLOČANJE

Prikaži več

Pravila za čezmejne pošiljke odpadkov s poudarkom na odpadkih, ki vsebujejo GFRP; izkušnje IRSOP iz izvajanja nadzora nad čezmejnim pošiljanjem odpadk

Pravila za čezmejne pošiljke odpadkov s poudarkom na odpadkih, ki vsebujejo GFRP; izkušnje IRSOP iz izvajanja nadzora nad čezmejnim pošiljanjem odpadk Pravila za čezmejne pošiljke odpadkov s poudarkom na odpadkih, ki vsebujejo GFRP; izkušnje IRSOP iz izvajanja nadzora nad čezmejnim pošiljanjem odpadkov Delavnica: Kako ravnati z odpadki iz polimernih

Prikaži več

Mehanski separacijski postopki Mehanski separacijski postopki so pogosto prvi sestavni del izolacijskih zaključnih postopkov v proizvodnih bioprocesov

Mehanski separacijski postopki Mehanski separacijski postopki so pogosto prvi sestavni del izolacijskih zaključnih postopkov v proizvodnih bioprocesov Mehanski separacijski postopki Mehanski separacijski postopki so pogosto prvi sestavni del izolacijskih zaključnih postopkov v proizvodnih bioprocesov, z njimi pa si pomagamo tudi v kombinaciji z drugimi

Prikaži več

Specifikacija obračuna - GoSoft

Specifikacija obračuna - GoSoft Poročilo o izvedeni nalogi Komunala Cerknica, d.o.o. - spremljanje zdravstvene ustreznosti pitne vode Evidenčna oznaka: 2132-1920157-1944862 08.10.21207 Naročnik: JAVNO PODJETJE KOMUNALA CERKNICA D.O.O.

Prikaži več

Atomska spektroskopija PROSTI ATOMI VZBUJENI ATOMI Marjan Veber Metode atomske/elementne masne/ spektrometrije Elektronska konfiguracija Mg

Atomska spektroskopija PROSTI ATOMI VZBUJENI ATOMI Marjan Veber Metode atomske/elementne masne/ spektrometrije Elektronska konfiguracija Mg Atomska spektroskopija PROSTI ATOMI VZBUJENI ATOMI Metode atomske/elementne masne/ spektrometrije Elektronska konfiguracija Mg Mg e 1s 2s2p 3d 4s 3p 3s e Po dogovoru ima osnovno elektronsko stanje energijo

Prikaži več

DNH4 Dozirna naprava za kemikalije Voda.Dezinfekcija.Higiena. PPV2013

DNH4 Dozirna naprava za kemikalije Voda.Dezinfekcija.Higiena. PPV2013 DNH4 Dozirna naprava za kemikalije Voda.Dezinfekcija.Higiena. PPV2013 PRIPRAVA VODE JE LAHKO TEŽKA NALOGA. DOVOLITEM, DA VAM POMAGAMO. Priprava in obdelava vode je lahko težka in kompleksna naloga. Znanje,

Prikaži več

DISTRIBUCIJA

DISTRIBUCIJA DISTRIBUCIJA ZDRAVILNIH UČINKOVIN V ORGANIZMU Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo doc. dr. Mojca Kerec Kos Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani (L)ADME SISTEM MESTO DELOVANJA OSTALA TKIVA

Prikaži več

5.VAJA RAZMERJE MED HITROSTJO DIFUZIJE IN VELIKOSTJO CELICE

5.VAJA RAZMERJE MED HITROSTJO DIFUZIJE IN VELIKOSTJO CELICE 5.VAJA RAZMERJE MED HITROSTJO DIFUZIJE IN VELIKOSTJO CELICE UVOD Celica, kateri smo se posvetili pri laboratorijskem delu, je osnovna gradbena enota vsakega živega bitja ali pa že ena sama predstavlja

Prikaži več

KEMAMIX G

KEMAMIX G KEMAMIX G Grobi apnenocementni omet in malta za zidanje Dober oprijem na podlago Pravilna in kontrolirana sestava Ustreza skupini ometov GP CS IV po SIST EN 988-1:2017 Malta za zidanje po SIST EN 988-2:2017

Prikaži več

Termostatska glava Halo Termostatske glave Z vgrajenim tipalom

Termostatska glava Halo Termostatske glave Z vgrajenim tipalom Termostatska glava Halo Termostatske glave Z vgrajenim tipalom IMI HEIMEIER / Termostatske glave in radiatorski ventili / Termostatska glava Halo Termostatska glava Halo Termostatska glava Halo se uporablja

Prikaži več

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO Katja Ciglar Analiza občutljivosti v Excel-u Seminarska naloga pri predmetu Optimizacija v fina

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO Katja Ciglar Analiza občutljivosti v Excel-u Seminarska naloga pri predmetu Optimizacija v fina UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO Katja Ciglar Analiza občutljivosti v Excel-u Seminarska naloga pri predmetu Optimizacija v financah Ljubljana, 2010 1. Klasični pristop k analizi

Prikaži več

VARNOSTNI LIST

VARNOSTNI LIST MEGLIO WC DEO Lavanda Varnostni list 1. IDENTIFIKACIJA SNOVI/PRIPRAVKA IN PODATKI O DOBAVITELJU 1.1. Identifikacija snovi ali pripravka: MEGLIO WC DEO Lavanda. 1.2. Podatki o dobavitelju: ARONA TRGOVINA

Prikaži več

Zavod sv. Stanislava Škofijska klasična gimnazija VPLIV KISLEGA DEŽJA NA RASTLINE poskus pri predmetu biologija

Zavod sv. Stanislava Škofijska klasična gimnazija VPLIV KISLEGA DEŽJA NA RASTLINE poskus pri predmetu biologija Zavod sv. Stanislava Škofijska klasična gimnazija VPLIV KISLEGA DEŽJA NA RASTLINE poskus pri predmetu biologija KAZALO: 1 UVOD...3 2 MATERIAL...4 POSTOPEK...4 3 SKICA NASTAVITVE POSKUSA...5 4 REZULTATI...6

Prikaži več

NAVODILA ZA KALIBRACIJO IN VZDRŽEVANJE WTW QuadroLine ph 296 Oxi 296 Kratka navodila za rokovanje z instrumentom. Pred uporabo dobro preberi tudi orig

NAVODILA ZA KALIBRACIJO IN VZDRŽEVANJE WTW QuadroLine ph 296 Oxi 296 Kratka navodila za rokovanje z instrumentom. Pred uporabo dobro preberi tudi orig NAVODILA ZA KALIBRACIJO IN VZDRŽEVANJE WTW QuadroLine ph 296 Oxi 296 Kratka navodila za rokovanje z instrumentom. Pred uporabo dobro preberi tudi originalna navodila, posebej za uporabo vseh možnih funkcij!

Prikaži več

Microsoft Word doc

Microsoft Word doc [ifra kandidata: r`avni izpitni center *M* PREPREZKUS KEMJ zpitna pola Marec / minut ovoljeno dodatno gradivo in pripomo~ki: kandidat prinese s seboj nalivno pero ali kemi~ni svin~nik svin~nik H ali plasti~no

Prikaži več

Microsoft Word - M docx

Microsoft Word - M docx Š i f r a k a n d i d a t a : ržavni izpitni center *M18243121* JESENSKI IZPITNI ROK K E M I J Izpitna pola 1 Sreda, 29. avgust 2018 / 90 minut ovoljeno gradivo in pripomočki: Kandidat prinese nalivno

Prikaži več

No Slide Title

No Slide Title Interakcije zdravil Marija Bogataj Interakcije zdravil: farmacevtske: fizikalna ali kemijska inkompatibilnost običajno napovedljive skoraj vedno se jim je mogočeizogniti parenteralne oblike, peroralne:

Prikaži več

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Tehnološki izzivi proizvodnja biometana in njegovo injiciranje v plinovodno omrežje prof. dr. Iztok Golobič Predstojnik Katedre za toplotno in procesno tehniko Vodja Laboratorija za toplotno tehniko Fakulteta

Prikaži več

Uvod

Uvod U N I V E R Z A V L J U B L J A N I F A K U L T E T A Z A F A R M A C I J O B o š t j a n P i l t a v e r DOLOČANJE PLAZEMSKIH KONCENTRACIJ LAMOTRIGINA IN NJEGOVIH METABOLITOV Z VALIDIRANO METODO TEKOČINSKE

Prikaži več

Training

Training Svetovalna pisarna Drago Dretnik 2016 Namen Svetovalne pisarne je nuditi strokovno pomoč planinskim društvom na naslednjih področjih: sistemi za ravnanje z odpadno vodo vodooskrbni sistemi energetski sistemi

Prikaži več

KATALOG SREBROVIH SPAJK

KATALOG SREBROVIH SPAJK KATALOG SREBROVIH SPAJK UNIVERZALNE SREBROVE SPAJKE BREZ KADMIJA Spajka Sestava % Območje Natezna Standardi Delovna Gostota taljenja trdnost Ag Cu Zn Ostalo temp. g/cm3 EN 17672 DIN 8513 N/mm2 Ag 56Sn

Prikaži več

Poročilo o izvedeni nalogi, ver.1.4

Poročilo o izvedeni nalogi, ver.1.4 Poročilo o izvedeni nalogi Hydrovod, d.o.o. - spremljanje zdravstvene ustreznosti pitne vode Evidenčna oznaka: 2132-17/19433-18/18890 06.02.18415 Naročnik: HYDROVOD D.O.O., DRUŽBA ZA KOMUNALNO DEJAVNOST

Prikaži več

KATALOG SREBROVIH SPAJK PIKAS d.o.o. Brunov drevored 11 SI TOLMIN Tel.: Fax: Internet:

KATALOG SREBROVIH SPAJK PIKAS d.o.o. Brunov drevored 11 SI TOLMIN Tel.: Fax: Internet: KATALOG SREBROVIH SPAJK PIKAS d.o.o. Brunov drevored 11 SI - 5220 TOLMIN Tel.: 05 381 03 84 Fax: 05 381 03 87 E-mail: pikas@pikas.si Internet: www.pikas.si UNIVERZALNE SREBROVE SPAJKE BREZ KADMIJA Spajke

Prikaži več

Večna pot 2, SI-1000 Ljubljana VABILO Otrokov svet je svež, nov in lep, poln vznemirjenj, čudenja in presenečenj in prav tak je slovenski gozd! Gozdar

Večna pot 2, SI-1000 Ljubljana VABILO Otrokov svet je svež, nov in lep, poln vznemirjenj, čudenja in presenečenj in prav tak je slovenski gozd! Gozdar VABILO Otrokov svet je svež, nov in lep, poln vznemirjenj, čudenja in presenečenj in prav tak je slovenski gozd! je v zadnjih letih pridobil številne izkušnje in znanja za podporo privlačnejšemu vzgojnoizobraževalnemu

Prikaži več

Milan Repič Učinki sprememb gnojenja z dušičnimi gnojili pri pridelavi-LD [Združljivostni način]

Milan Repič Učinki sprememb gnojenja z dušičnimi gnojili pri pridelavi-LD [Združljivostni način] Učinki sprememb gnojenja z dušičnimi gnojili pri pridelavi poljščin v praksi Milan Repič, ŽIPO Lenart Drago Majcen, Karsia Dutovlje d.o.o Draga Zadravec KGZS-Zavod Maribor Razlogi za spremembe Strokovno

Prikaži več

Microsoft PowerPoint - 3_MACS+_Pozarni_testi_slo.ppt [Compatibility Mode]

Microsoft PowerPoint - 3_MACS+_Pozarni_testi_slo.ppt [Compatibility Mode] Obnašanje jeklenih in sovprežnih stropnih konstrukcij v požaru Vsebina novih požarnih testov Izvedeni so bili požarni preizkusi v okviru projektov FRACOF (ISO požar) COSSFIRE (ISO požar) FICEB (Naravni

Prikaži več

Uredba Komisije (EU) št. 1179/2012 z dne 10. decembra 2012 o merilih za določitev, kdaj odpadno steklo preneha biti odpadek na podlagi Direktive 2008/

Uredba Komisije (EU) št. 1179/2012 z dne 10. decembra 2012 o merilih za določitev, kdaj odpadno steklo preneha biti odpadek na podlagi Direktive 2008/ 11.12.2012 Uradni list Evropske unije L 337/31 UREDBA KOMISIJE (EU) št. 1179/2012 z dne 10. decembra 2012 o merilih za določitev, kdaj odpadno steklo preneha biti odpadek na podlagi Direktive 2008/98/ES

Prikaži več

Vsebina Energija pri gorenju notranja energija, entalpija, termokemijski račun, specifična toplota zgorevanja specifična požarna obremenitev

Vsebina Energija pri gorenju notranja energija, entalpija, termokemijski račun, specifična toplota zgorevanja specifična požarna obremenitev Vsebina Energija pri gorenju notranja energija, entalpija, termokemijski račun, specifična toplota zgorevanja specifična požarna obremenitev P i entropija, prosta entalpija spontani procesi, gorenje pri

Prikaži več

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJA BIOTEHNOLOŠKI TEHNIKUM: učbenik za vaje Aleš PODGORNIK, Maja PAŠ, Peter RASPOR Ljublj

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJA BIOTEHNOLOŠKI TEHNIKUM: učbenik za vaje Aleš PODGORNIK, Maja PAŠ, Peter RASPOR Ljublj UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJA BIOTEHNOLOŠKI TEHNIKUM: učbenik za vaje Aleš PODGORNIK, Maja PAŠ, Peter RASPOR Ljubljana, 2013 Naslov: Avtorji: Založnik: Recenzenta: BIOTEHNOLOŠKI

Prikaži več

Add title text here

Add title text here ž Branka Viltužnik Aljoša Košak Aleksandra Lobnik Vsebina predavanj Težke kovine v okolju Adsorpcija težkih kovin Magnetni nanodelci kot adsorbenti Priprava CoFe 2 O 4 magnetnih nanodelcev Karakterizacija

Prikaži več

DISTRIBUCIJA

DISTRIBUCIJA PORAZDELITEV (DISTRIBUCIJA) ZDRAVILNIH UČINKOVIN V ORGANIZMU Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo dr. Igor Locatelli doc. dr. Mojca Kerec Kos Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani (L)ADME

Prikaži več

ELEKTRIČNI NIHAJNI KROG TEORIJA Električni nihajni krog je električno vezje, ki služi za generacijo visokofrekvenče izmenične napetosti. V osnovi je "

ELEKTRIČNI NIHAJNI KROG TEORIJA Električni nihajni krog je električno vezje, ki služi za generacijo visokofrekvenče izmenične napetosti. V osnovi je ELEKTRIČNI NIHAJNI KROG TEORIJA Električni nihajni krog je električno vezje, ki služi za generacijo visokofrekvenče izmenične napetosti. V osnovi je "električno" nihalo, sestavljeno iz vzporedne vezave

Prikaži več

RAZMERJE MED HITROSTJO DIFUZIJE in VELIKOSTJO CELICE

RAZMERJE MED HITROSTJO DIFUZIJE in VELIKOSTJO CELICE RAZMERJE MED HITROSTJO DIFUZIJE in VELIKOSTJO CELICE UVOD Celica, kateri smo se posvetili pri laboratorijskem delu, je osnovna gradbena enota vsakega živega bitja ali pa že ena sama predstavlja organizem

Prikaži več

Gospodarjenje z energijo

Gospodarjenje z energijo 1 Alternativne delovne snovi A Uvod Vir toplote za delovne krožne procese je običajno zgorevanje fosilnih goriv ali jedrska reakcija, pri katerih so na razpolago relativno visoke temperature, s tem pa

Prikaži več

EVROPSKA KOMISIJA Bruselj, C(2018) 7942 final UREDBA KOMISIJE (EU) / z dne o spremembi prilog I, III, VI, VII, VIII, IX, X, XI in

EVROPSKA KOMISIJA Bruselj, C(2018) 7942 final UREDBA KOMISIJE (EU) / z dne o spremembi prilog I, III, VI, VII, VIII, IX, X, XI in EVROPSKA KOMISIJA Bruselj, 3.12.2018 C(2018) 7942 final UREDBA KOMISIJE (EU) / z dne 3.12.2018 o spremembi prilog I, III, VI, VII, VIII, IX, X, XI in XII k Uredbi (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta

Prikaži več

KEMASAN 590 F

KEMASAN 590 F KEMASAN 590 F Fini sanirni omet na osnovi Romanskega apna Za stalno razvlaževanje zelo vlažnih zidov Difuzijska odprtost Za ročni nanos Ustreza zahtevam za omet R po EN 998-1:2004 Odpornost na vlago, soli

Prikaži več

Matematika Diferencialne enačbe prvega reda (1) Reši diferencialne enačbe z ločljivimi spremenljivkami: (a) y = 2xy, (b) y tg x = y, (c) y = 2x(1 + y

Matematika Diferencialne enačbe prvega reda (1) Reši diferencialne enačbe z ločljivimi spremenljivkami: (a) y = 2xy, (b) y tg x = y, (c) y = 2x(1 + y Matematika Diferencialne enačbe prvega reda (1) Reši diferencialne enačbe z ločljivimi spremenljivkami: (a) y = 2xy, (b) y tg x = y, (c) y = 2x(1 + y 2 ). Rešitev: Diferencialna enačba ima ločljive spremenljivke,

Prikaži več

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Laboratorij za termoenergetiko Jedrska elektrarna 1 Zanimivosti, dejstva l. 1954 prvo postrojenje (Obninsk, Rusija): to postrojenje obratovalo še ob prelomu stoletja; ob koncu 2001 so jedrske elektrarne

Prikaži več

POVZETEK GLAVNIH ZNAČILNOSTI ZDRAVILA

POVZETEK GLAVNIH ZNAČILNOSTI ZDRAVILA POVZETEK GLAVNIH ZNAČILNOSTI ZDRAVILA 1. IME ZDRAVILA DICYNONE 125 mg/ml raztopina za injiciranje 2. KAKOVOSTNA IN KOLIČINSKA SESTAVA Dva ml raztopine za injiciranje (ena ampula) vsebuje 250 mg etamsilata.

Prikaži več

(Microsoft PowerPoint - Poroèilo o pitni vodi - Ravne 2017 [Samo za branje] [Združljivostni naèin])

(Microsoft PowerPoint - Poroèilo o pitni vodi - Ravne 2017 [Samo za branje] [Združljivostni naèin]) NA OBMOČJU OBČINE RAVNE NA KOROŠKEM - 2017 Na območju občine Ravne na Koroškem se za 8834 uporabnikov pitna voda dobavlja iz 3 sistemov za oskrbo s pitno vodo: VS ŠUMC, VS Kotlje-Ravne in VS Strojna. Upravljavec

Prikaži več

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Sabina PRIMOŽIČ ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST IZVLEČKOV IZ KALJENIH SEMEN NAVADNEGA RIČ

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Sabina PRIMOŽIČ ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST IZVLEČKOV IZ KALJENIH SEMEN NAVADNEGA RIČ UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Sabina PRIMOŽIČ ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST IZVLEČKOV IZ KALJENIH SEMEN NAVADNEGA RIČKA (Camelina sativa L.) DIPLOMSKO DELO Univerzitetni

Prikaži več

Microsoft Word - PR18-HoceZrak-letno2018.docx

Microsoft Word - PR18-HoceZrak-letno2018.docx DAT: DANTE/NL/COZ/MB/212A/PR18-HoceZrak-letno2018.docx POROČILO O MERITVAH DELCEV PM10 V OBČINI HOČE-SLIVNICA V LETU 2018 Maribor, marec 2019 Naslov: Izvajalec: Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje

Prikaži več

FLAŠKE

FLAŠKE FLAŠKE ZAKAJ NALGENE FLAŠKA? Podjetje, ki proizvaja flaške Nalgene je del večjega podjetja Thermo Fisher Scientific, vodilnega v proizvodnji laboratorijskih produktov (čaše, skodelice pipete ), pri čemer

Prikaži več

UNIVERZA V LJUBLJANI

UNIVERZA V LJUBLJANI UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Saša JERŠIN IZOLACIJA IN KARAKTERIZACIJA BETA-GLUKANOV IZ JEČMENOVE MOKE MAGISTRSKO DELO Magistrski študij 2. stopnja Živilstvo Ljubljana,

Prikaži več

ŠTEVCI PROMETA IN NJIHOVA UPORABA ZA NAMENE STATISTIK ČRT GRAHONJA

ŠTEVCI PROMETA IN NJIHOVA UPORABA ZA NAMENE STATISTIK ČRT GRAHONJA ŠTEVCI PROMETA IN NJIHOVA UPORABA ZA NAMENE STATISTIK ČRT GRAHONJA Navdih Poizvedovanje po BD podatkovnih virih, ki imajo časovno dimenzijo in so dostopni. Večji promet pomeni večje število dobrin in močnejšo

Prikaži več

Zaporedna številka Registrirano ime, generično ime 3581 AMORON indapamid 3582 AMPHOCIL 100 amfotericin 3583 AMPHOCIL 50 amfotericin 3584 AQUA PRO INJE

Zaporedna številka Registrirano ime, generično ime 3581 AMORON indapamid 3582 AMPHOCIL 100 amfotericin 3583 AMPHOCIL 50 amfotericin 3584 AQUA PRO INJE 3581 AMORON indapamid 3582 AMPHOCIL 100 amfotericin 3583 AMPHOCIL 50 amfotericin 3584 AQUA PRO INJECTIONE 3585 BUSCOL injekcije butilskopolamin 3586 CHLORAMPHENICOL 1% kloramfenikol 3587 DEXAMETHASON deksametazon

Prikaži več

MATERIALI

MATERIALI KEMIJSKA REAKCIJSKA TEHNIKA II Navodila za opravljanje laboratorijskih vaj Darja Pečar Andreja Goršek Maribor, 2019 VSEBINA 1. vaja - DOLOČANJE PRESNOVE V KATALITSKEM REAKTORJU Z NASUTIM SLOJEM... 1 NAMEN

Prikaži več

03C

03C Državni izpitni center *M14158112* GLASBA Izpitna pola A SPOMLADANSKI IZPITNI ROK NAVODILA ZA OCENJEVANJE Četrtek, 15. maj 2014 SPLOŠNA MATURA RIC 2014 2 M141-581-1-2 Navodila za izpolnjevanje ocenjevalnega

Prikaži več

PARTICULARS TO APPEAR ON <THE OUTER PACKAGING> <AND> <THE IMMEDIATE PACKAGING>

PARTICULARS TO APPEAR ON <THE OUTER PACKAGING> <AND> <THE IMMEDIATE PACKAGING> Navodilo za uporabo 1,5 mg/5 mg v 1 ml oralno pršilo, raztopina benzidaminijev klorid/cetilpiridinijev klorid Pred začetkom uporabe zdravila natančno preberite navodilo, ker vsebuje za vas pomembne podatke!

Prikaži več

Microsoft PowerPoint - OVT_4_IzolacijskiMat_v1.pptx

Microsoft PowerPoint - OVT_4_IzolacijskiMat_v1.pptx Osnove visokonapetostne tehnike Izolacijski materiali Boštjan Blažič bostjan.blazic@fe.uni lj.si leon.fe.uni lj.si 01 4768 414 013/14 Izolacijski materiali Delitev: plinasti, tekoči, trdni Plinasti dielektriki

Prikaži več

Podatkovni list o okoljski trajnosti Sto-Turbofix Mini Enokomponentna lepilna pena za lepljenje izolacijskih plošč Za opis izdelka glejte tehnični lis

Podatkovni list o okoljski trajnosti Sto-Turbofix Mini Enokomponentna lepilna pena za lepljenje izolacijskih plošč Za opis izdelka glejte tehnični lis Enokomponentna lepilna pena za lepljenje izolacijskih plošč Za opis izdelka glejte tehnični list (če je ta na voljo) Podatki za certificiranje zgradb po DGNB (različica 2012) Stopnja kakovosti (ENV 1.2)

Prikaži več

NAVODILO ZA UPORABO

NAVODILO ZA UPORABO NAVODILO ZA UPORABO DICYNONE 125 mg/ml raztopina za injiciranje etamsilat Pred začetkom uporabe natančno preberite navodilo! - Navodilo shranite. Morda ga boste želeli ponovno prebrati. - Če imate dodatna

Prikaži več

Podatkovni list o okoljski trajnosti Sto-Vorlegeband Keramik Tračni profil za izoblikovanje fug na polietilenski osnovi Za opis izdelka glejte tehničn

Podatkovni list o okoljski trajnosti Sto-Vorlegeband Keramik Tračni profil za izoblikovanje fug na polietilenski osnovi Za opis izdelka glejte tehničn Tračni profil za izoblikovanje fug na polietilenski osnovi Za opis izdelka glejte tehnični list (če je ta na voljo) Podatki za certificiranje zgradb po DGNB (različica 2012) Stopnja kakovosti (ENV 1.2)

Prikaži več

2

2 Drsni ležaj Strojni elementi 1 Predloga za vaje Pripravila: doc. dr. Domen Šruga as. dr. Ivan Okorn Ljubljana, 2016 STROJNI ELEMENTI.1. 1 Kazalo 1. Definicija naloge... 3 1.1 Eksperimentalni del vaje...

Prikaži več

Microsoft Word - PR17-PtujZrak-letno_vmesno.docx

Microsoft Word - PR17-PtujZrak-letno_vmesno.docx DAT: DANTE/NL/COZ/MB/212A/PR17-PtujZrak-letno_vmesno.docx POROČILO O MERITVAH DELCEV PM10 TER BENZO(A)PIRENA V DELCIH PM10 V OBČINI PTUJ V LETU 2017 Maribor, februar 2018 Naslov: Poročilo o meritvah delcev

Prikaži več

ZAŠČITNA IZOLACIJA BREZ VSEBNOSTI HALOGENIH SNOVI ZA ZMANJŠEVANJE KOROZIVNIH UČINKOV IN TOKSIČNOSTI DIMA V PRIMERU POŽARA Powered by TCPDF (

ZAŠČITNA IZOLACIJA BREZ VSEBNOSTI HALOGENIH SNOVI ZA ZMANJŠEVANJE KOROZIVNIH UČINKOV IN TOKSIČNOSTI DIMA V PRIMERU POŽARA Powered by TCPDF ( ZAŠČITNA IZOLACIJA BREZ VSEBNOSTI HALOGENIH SNOVI ZA ZMANJŠEVANJE KOROZIVNIH UČINKOV IN TOKSIČNOSTI DIMA V PRIMERU POŽARA Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Brez vsebnosti halogenih snovi Majhna količina

Prikaži več