UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Sabina PRIMOŽIČ ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST IZVLEČKOV IZ KALJENIH SEMEN NAVADNEGA RIČ

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Sabina PRIMOŽIČ ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST IZVLEČKOV IZ KALJENIH SEMEN NAVADNEGA RIČKA (Camelina sativa L.) DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana Ljubljana, 2018

2 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO Sabina PRIMOŽIČ ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST IZVLEČKOV IZ KALJENIH SEMEN NAVADNEGA RIČKA (Camelina sativa L.) DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana ANTIOXIDANT EFFECTIVENESS OF EXTRACTS FROM GERMINATED SEEDS OF Camelina sativa L. B. SC. THESIS Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition Ljubljana, 2018

3 II Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana. Delo je bilo opravljeno na Katedri za biokemijo in kemijo živil Oddelka za živilstvo na Biotehniški fakulteti. Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr. Heleno Abramovič in za recenzentko prof. dr. Tatjano Košmerl. Mentorica: prof. dr. Helena ABRAMOVIČ Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Recenzentka: prof. dr. Tatjana KOŠMERL Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: Mentorica: Recenzentka: Datum zagovora: Sabina Primožič

4 III KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1 DK UDK :577.1: (043)=163.6 KG navadni riček, Camelina sativa L., kaljena semena, izvlečki iz kaljenih semen, antioksidativna učinkovitost, beljenje β-karotena, lovljenje DPPH AV PRIMOŽIČ, Sabina SA ABRAMOVIČ, Helena (mentorica), KOŠMERL, Tatjana (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2018 IN ANTIOKSIDATIVNA UČINKOVITOST IZVLEČKOV IZ KALJENIH SEMEN NAVADNEGA RIČKA (Camelina sativa L.) TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP VIII, 26 str., 3 pregl., 8 sl., 42 vir. IJ sl JI sl/en AI V okviru diplomskega dela smo želeli ugotoviti, ali ima kaljenje semen navadnega rička (Camelina sativa L.) vpliv na antioksidativno učinkovitost (AU) pripravljenih izvlečkov. V analizo smo dobili metanolne izvlečke iz nekaljenih in kaljenih (24, 48, 72 in 96 ur) semen. AU smo določili kot sposobnost lovljenja 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil radikala (DPPH ) in kot učinkovitost pri preprečevanju razbarvanja β- karotena v emulziji linolne kisline in vode. Rezultate pri prvi omenjeni metodi smo predstavili kot volumen izvlečka, ki je potreben za 50 % inhibicijo začetne vsebnosti DPPH v reakcijski zmesi (EV50). Pri drugi metodi pa smo učinkovitost v emulziji (AUe) izrazili kot zmanjšanje razbarvanja β-karotena v emulziji, ki vsebuje izvleček, glede na obseg razbarvanja v emulziji brez izvlečka. Vsi preiskovani izvlečki fenolnih spojin iz nekaljenih in kaljenih semen so pri obeh metodah pokazali, da imajo antioksidativno učinkovitost. Pri metodi DPPH je le izvleček iz semen, katerih kaljenje je trajalo 24 ur (EV50 = 24,8 ± 0,9 µl), pokazal večjo AU, kot jo je imel izvleček iz nekaljenih semen. V emulziji so imeli vsi izvlečki iz kaljenih semen slabšo učinkovitost od izvlečka iz nekaljenih semen (AUe = 83 ± 1 %). AUe izvlečka iz semen kaljenih 24 ur je bila blizu AUe izvlečka iz nekaljenih semen.

5 IV KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1 DC UDC :577.1: (043)=163.6 CX Camelina sativa L., germinated seeds, extracts from germinated seeds, antioxidant effectiveness, β-carotene bleaching, DPPH radical scavenging AU PRIMOŽIČ, Sabina AA ABRAMOVIČ, Helena (supervisor), KOŠMERL, Tatjana (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology PY 2018 TI ANTIOXIDANT EFFECTIVENESS OF EXTRACTS FROM GERMINATED SEEDS OF Camelina sativa L. DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO VIII, 26 p., 3 tab., 8 fig., 42 ref. LA sl AL sl/en AB In the frame of diploma work we aimed to determine whether the germination of seeds of Camelina sativa L. has an influence on the antioxidant effectiveness (AE) of prepared extracts. For analysis we obtained methanolic extracts from nongerminated and germinated (24, 48, 72 and 96 h) seeds. AE was determined as the ability to scavenge free 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH ) and as the effectiveness in preventing a discoloration of β-carotene in the emulsion of linoleic acid and water. The results of the first mentioned method were presented as the volume of the extract needed for the inhibition of 50 % of the initial DPPH amount in the reaction mixture (EV50). In the second method, the effectiveness in emulsion (AEe) was expressed as a decrease in β-carotene discoloration in the emulsion containing an extract according to the extent of discoloration in emulsion without extract. All of the investigated extracts of phenolic compounds from nongerminated and germinated seeds showed to have an antioxidant effectiveness in both methods. At DPPH method only the extract from seeds germinated for 24 h (EV50 = 24.8 ± 0.9 μl) showed higher AE than the extract from non-germinated seeds. In the emulsion all of the extracts from germinated seeds had lower effectiveness than extract from non-germinated seeds (AEe = 83 ± 1 %). The AEe of extract from seeds germinated for 24 h was close to AEe of extract from nongerminated seeds.

6 V KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA KEY WORDS DOCUMENTATION KAZALO VSEBINE KAZALO PREGLEDNIC KAZALO SLIK OKRAJŠAVE IN SIMBOLI UVOD NAMEN NALOGE DELOVNE HIPOTEZE III IV V VI VII VIII PREGLED OBJAV NAVADNI RIČEK ANTIOKSIDANTI IN FENOLNE SPOJINE Fenolne spojine v semenih navadnega rička in njihovo antioksidativno delovanje KALJENJE Vpliv kaljenja semen na antioksidativno delovanje MATERIAL IN METODE MATERIAL Reagenti in topila Pribor in aparature METODE Metoda DPPH Metoda beljenja β-karotena REZULTATI Z RAZPRAVO METODA DPPH METODA BELJENJA β-karotena 4.3 PRIMERJAVA REZULTATOV UPORABLJENIH METOD VSEBNOST KLOROFILA V IZVLEČKIH SKLEPI POVZETEK VIRI 23 ZAHVALA

7 VI KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Volumni izvlečkov iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen navadnega rička, ki jih odmerimo v reakcijsko zmes (Vp), vrednosti izmerjene absorbance pri valovni dolžini 517 nm (A517) in deleži preostalega DPPH (wpreostal DPPH) po 30 min inkubacije 14 Preglednica 2: Smerni koeficienti premic (k) in volumni izvlečkov, s katerimi znižamo vsebnost DPPH za 50 % (EV50) 15 Preglednica 3: Vrednosti absorbanc pri valovni dolžini 470 nm (A470) pri določenih časih inkubacije (t) za emulzije z izvlečki iz nekaljenih semen, 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen in kontrolni vzorec 17

8 VII KAZALO SLIK Slika 1: Prikaz barve reakcijske zmesi z različnimi volumni izvlečkov ob dodatku raztopine DPPH 10 Slika 2: Prikaz steklenih epruvet z vzorci v termostatu pri temperaturi 50 ºC 12 Slika 3: Delež preostalega DPPH (wpreostal DPPH) v reakcijski zmesi v odvisnosti od volumna pipetiranja izvlečka (Vp) iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen 13 Slika 4: Odvisnost antioksidativne učinkovitosti v emulziji (AUe) za izvlečke iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen od časa inkubacije (t) 16 Slika 5: Graf odvisnosti A 470 (t=0) A 470 (t=x), ki predstavlja količino razbarvanega β-karotena, od časa inkubacije (t) 18 Slika 6: Vrednosti antioksidativne učinkovitosti v emulziji (AUe) za izvlečke iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen pri času 120 min inkubacije (50 C) 18 Slika 7: Povezava med antioksidativno učinkovitostjo v emulzijah (AUe) pri času 120 min inkubacije in vrednostmi volumnov pipetiranja, s katerimi znižamo količino DPPH za 50 % (EV50), za izvlečke iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen 19 Slika 8: Absorbcijski spekter izvlečkov iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen pri valovni dolžini 550 nm nm 20

9 VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI AU - antioksidativna učinkovitost AUe - antioksidativna učinkovitost v emulziji DPPH - 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal wpreostal DPPH - delež preostalega DPPH EV50 - volumen izvlečka, ki je potreben za 50 % zmanjšanje DPPH ROO - alkilperoksilni radikal Vp - volumen pipetiranja izvlečka 4-VS - 4-vinilsiringol 4-VG - 4-vinilgvajakol 4-VC - 4-vinilkatehol 4-VP - 4-vinilfenol

10 1 1 UVOD Antioksidanti so v našem življenju zelo pomembni, saj imajo ugoden učinek na zdravje. Delovali naj bi proti virusom, mikrobom, vnetjem in raku. Biološka razpoložljivost antioksidantov je različna, oz. še ne dokončno določena. V našem telesu morajo biti v ravnotežju s prostimi radikali, ker v nasprotnem primeru pride do oksidativnega stresa. Naravno se nahajajo v različnih živilih. Lahko pa jih dodajo v živilske izdelke z namenom, da jim podaljšajo trajnost in izboljšajo prehransko vrednost. Antioksidante definiramo kot snovi, ki preprečujejo ali vsaj upočasnjujejo oksidacijo. Njihovo delovanje temelji na reakciji z reaktivnimi radikali. S tem ustavijo radikalske reakcije. Poznamo različne oblike antioksidantov, ki se med seboj razlikujejo po topnosti v vodi oz. v maščobah (Abramovič, 2011). Med snovi z antioksidativno učinkovitostjo (AU) sodijo tudi fenolne spojine, ki imajo redukcijsko sposobnost, reagirajo s prostimi radikali in vežejo kovinske ione v kelate. Kako dobro fenolne spojine delujejo, je odvisno od različnih dejavnikov. Ti dejavniki so: molekulska struktura, snovi, na katere delujejo, medij ter drugi antioksidanti, ki lahko nanje delujejo antagonistično ali sinergistično. Naravni viri fenolnih spojin so sadje, zelenjava, različne začimbe, zelišča, čaj, soja in tudi oljnice, ki skupaj z žitnimi semeni, vsebujejo veliko vlaknin, na katere so fenolne spojine vezane. Fenolne spojine niso samo naravno prisotne v živilih, temveč nastanejo tudi pri reakcijah, ki potečejo pri živilski obdelavi (npr. prekajevanje mesnih izdelkov, praženje semen ). Snovi z antioksidativnim učinkom pridobivajo tudi s kemijsko sintezo (Abramovič, 2011). Med kaljenjem potekajo v semenih določene spremembe. Vsi procesi so usmerjeni v rast nove rastline. Temperatura, vlažnost in čas kaljenja vplivajo na potek procesa (Kreisz, 2009). Vse se začne, ko semena dobijo dovolj vode in nabreknejo. Potrebno je zagotoviti tudi ustrezno toploto in zračnost. Potem se v semenih začnejo odvijati biokemijske aktivnosti - nastanek encimov, pretvorba hranilnih zalog, tvorba bioaktivnih spojin (Cortese, 2009). Hranilna vrednost semen se med kaljenjem poveča, ker se poveča količina vitaminov; beljakovine in maščobe pa postanejo lažje prebavljive (Fink, 1993). Navadni riček (Camelina sativa L.) je oljnica. Iz njenih semen stiskajo olje, ki ga uporabljamo kot dodatek jedem. Lahko pa ga uporabimo tudi pri težavah z želodcem, dvanajsternikom in pri različnih vnetjih (Čeh, 2009). Olje, ki je rumeno oranžne barve, je s prehranskega stališča zanimivo zaradi sestave. Olje je namreč dober vir večkrat nenasičenih in omega-3 maščobnih kislin. Stranski produkt proizvodnje olja je oljna pogača, s katero krmijo živali. Vsebuje veliko bioaktivnih komponent (antioksidanti, vitamini), zato bi lahko bila pomemben nizko cenoven vir teh snovi v živilski industriji (Hrastar in sod., 2009; Matthäus, 2002).

11 2 1.1 NAMEN NALOGE V okviru diplomskega dela smo želeli dokazati, da imajo fenolne spojine kaljenih semen navadnega rička antioksidativni učinek in opraviti primerjavo z antioksidativno učinkovitostjo nekaljenih semen. Poleg tega smo želeli ugotoviti, ali čas kaljenja (24, 48, 72 in 96 ur) vpliva na AU izvlečkov fenolnih spojin. AU smo določili v različnih sistemih, to je z metodo določitve sposobnosti lovljenja 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikala (DPPH ) in v emulziji linolne kisline v vodi z metodo beljenja β-karotena. Za tem smo rezultate obeh metod med seboj primerjali. 1.2 DELOVNE HIPOTEZE Postavili smo naslednje hipoteze: kaljenje vpliva na antioksidativno učinkovitost izvlečkov fenolnih spojin, izvlečki fenolnih spojin iz kaljenih semen bodo pokazali antioksidativno učinkovitost, čas kaljenja je ključen za tvorbo fenolnih spojin in antioksidativno učinkovitost - dlje časa bodo kalila semena, večja bo tvorba fenolnih spojin in večja bo antioksidativna učinkovitost, rezultati, pridobljeni z metodo beljenja β-karotena, bodo v korelaciji z rezultati pridobljenimi z metodo določitve sposobnosti lovljenja DPPH.

12 3 2 PREGLED OBJAV 2.1 NAVADNI RIČEK Navadni riček je enoletnica, ki sodi v družino križnic. Anleški izraz je false flax. Rastlina izvira iz Osrednje Azije in Severne Evrope. Uporaba rička sega daleč nazaj v zgodovino, in sicer v bronasto in železno dobo. V Sloveniji ga gojijo na Koroškem, kjer mu rečejo toter (Zubr, 1997; Čeh, 2009; Budin in sod., 1995). Steblo rastline zraste do 100 cm in ima dlačice. Ko dozori, postane olesenelo. Ima enostavne liste, ki so v obliki sulice. Ta oljnica sodi med samoprašnice. Cvetovi so rumeno obarvani. Semena navadnega rička, ki se nahajajo v hruškasto oblikovanem plodu, so podolgovate oblike in oranžno rdečkaste barve (Čeh, 2009). Navadni riček ni zahteven glede pogojev rasti, zato lahko raste tudi v bolj mrzlih, sušnih ali vlažnih predelih. Najbolj pa uspeva v podnebju brez ekstremov. Sorte rička so ozimne in jare. Sejejo ga zgodaj spomladi. Čas, ki je potreben, da navadni riček zraste, je od 90 do 110 dni. Služi tudi za zatiranje plevelov. Spravilo navadnega rička poteka v drugi polovici julija, ko so plodovi rumeno rjavi in še niso popokali. Zelo pomembno je, da delež vlage v semenih ni višji od 11 %. Vsebujejo približno % olja, % surovih beljakovin, nekaj vlaknin (Čeh, 2009) ter tudi precej glukozinolatov, ki delujejo proti raku (Hayes in sod., 2008). Olje, ki ga pridobijo iz semen navadnega rička, ga uporabljajo za proizvodnjo biodizelskega goriva, v industriji kozmetike, farmacije in prehrane. Olje opredeljujejo kot funkcionalno živilo, saj vsebuje veliko tokoferolov. Poleg tega kar velik delež vseh maščobnih kislin v ričkovem olju, v katerem prevladujejo večkrat nenasičene (Zubr, 1997), predstavljata dve esencialni maščobni kislini. To sta α-linolenska (omega-3) in linolna kislina (omega-6). Njuno razmerje v olju je ugodno za naše zdravje (Zubr in Matthäus, 2002). Navadni riček ima dobro perspektivo v živilstvu, saj so v semenih tudi fenolne spojine, ki poskrbijo za podaljšanje trajnosti in ohranjanje kakovosti izdelkov (Terpinc in Abramovič, 2016). 2.2 ANTIOKSIDANTI IN FENOLNE SPOJINE Antioksidante lahko delimo na različne načine. Eksogene antioksidante zaužijemo s hrano, endogene pa naše telo lahko tvori samo (Kreft in sod., 2000). Glede na način delovanja jih delimo v tri skupine - primarni, sekundarni in terciarni antioksidanti. Primarni delujejo tako, da preprečijo nastanek prostih radikalov oz. jih pretvorijo v bolj stabilne spojine, največkrat s prispevanjem svojega vodikovega atoma. Mednje sodijo fenoli in njihovi derivati. V to skupino sodijo tudi antioksidanti endogenega izvora, ustvarijo pa jih lahko

13 4 tudi mikroorganizmi. Sekundarni antioksidanti ne reagirajo direktno s prostimi radikali, ampak odstranijo dejavnike, ki povzročajo oksidacijo (reakcija s kovinskimi ioni in kisikom, razgradnja hidroperoksidov, absorpcija svetlobe). Tisti, ki reagirajo s kisikom, so t.i. odjemalci kisika. Kovinske ione vežejo v kelatne komplekse t.i. sekvestranti. V terciarno skupino pa sodijo popravljalci škode na dednem zapisu, ki so jo napravili radikali (Raspor in sod., 2000). AU spojin v živilih z večjim deležem maščob je odvisna od vseh prisotnih antioksidantov, ki med seboj lahko delujejo antagonistično ali sinergistično, od sestave maščob (delež nenasičenih maščobnih kislin) in topnosti antioksidantov v vodni in oljni fazi (Skvarča, 2000). Terpinc in sod. (2012) so poročali, da so z izbiro topila pri pripravi ekstraktov pomembno vplivali na količino ekstrahiranih spojin. V metanolne ekstrakte so pridobili več fenolnih spojin kot v etanolne. Kar je skladno s trditvijo, da naj bi se količina fenolnih spojin v ekstraktih z večjo polarnostjo topila povečevala (Matthäus, 2002). A kljub temu so Terpinc in sod. (2012) pridobili rezultate, pri katerih so etanolni ekstrakti pokazali boljše delovanje v emulziji kot metanolni ekstrakti. Kar kaže na to, da imajo ekstrakti z etanolom, kot manj polarnim topilom od metanola, večjo vsebnost manj polarnih spojin, ki bolje delujejo v emulziji. Moure in sod. (2000) namreč navajajo, da v emulziji olja v vodi ostanejo polarne spojine v vodni fazi, medtem ko se manj polarne spojine porazdelijo v lipidno fazo in so zato bolj učinkovite pri zaščiti lipidnih spojin pred oksidacijo. Rastlina je izpostavljena okoljskim stresom. Nastanejo lahko poškodbe rastlinskega tkiva in prosti radikali, zato se rastlina ustrezno zaščiti s tvorbo sekundarnih metabolitov (Kreft in sod., 2000). Velika vsebnost večkrat nenasičenih maščobnih kislin semen oljnic prispeva k bogatosti z antioksidanti, saj ti ščitijo maščobne kisline pred oksidacijo (Obied in sod., 2005). Fenolne spojine sodijo med sekundarne metabolite rastlinske celice. Kot fenolne spojine poimenujemo tiste, ki imajo v svoji strukturi vsaj en aromatski obroč, na katerega je vezana ena ali več hidroksilnih skupin (Abram in Simčič, 1997). Zaradi vsebnosti hidroksilnih in karboksilnih skupin (nekatere vsebujejo tudi slednje) lahko fenolne spojine tvorijo estre in etre. V celicah se nahajajo v prosti, topni konjugirani ali netopni vezani obliki. Netopne fenolne spojine so povezane skupaj z gradniki celične stene (arabinoksilan, lignin - kompleksna ogljikova hidrata) (Adom in Liu, 2002). Topne konjugirane fenolne spojine so v vakuoli citoplazme. Povezujejo se z organskimi kislinami, alkoholi, ogljikovimi hidrati, ostalimi fenolnimi spojinami in alkaloidi. Ostale fenolne spojine so proste (Liyana-Pathirana in Shahidi, 2006). V posameznih delih semen oljnic so fenolne spojine različno porazdeljene. Med fenolnimi spojinami semen oljnic so derivati hidroksicimetne in hidroksibenzojske kisline, lignini, kumarini in flavonoidi. Največ jih je v bolj zunanjih ovojnicah, ki so sestavni del otrob.

14 5 Vsebnost fenolnih spojin je odvisna od vrste oljnice, njene zrelosti, podnebnih razmer za rast in časa skladiščenja (Oomah in sod., 1995; Rahman in sod., 2017). Fenolna spojina reagira z radikalom tako, da mu odda vodikov atom ali elektron in nastane fenolni radikal. Kako dober antioksidant je fenolna spojina, je odvisno od stabilnosti njenega radikala; čimbolj je stabilen, bolj je učinkovita. AU fenolne spojine je odvisna tudi, kako hitro reagira z radikalom in mu s tem prepreči, da bi preko odvzema elektrona reagiral z drugo spojino (oksidacija). Oddajanje vodikovega atoma fenolnih spojin radikalu poteka v bolj nepolarnih topilih, saj hidroksilne skupine ne tvorijo vodikove vezi skupaj s takim topilom. V polarnih topilih se tvori omenjena vodikova vez in zato v njih prihaja do prenosa elektrona (Abramovič, 2011) Fenolne spojine v semenih navadnega rička in njihovo antioksidativno delovanje Semena navadnega rička vsebujejo določene fenolne spojine. Med njimi so flavonoidi: katehin, rutin, kvercetin in njegov glikozid (Terpinc in sod., 2011a). Rahman in sod. (2017) so kot glavna flavonoida določili prav tako rutin in tudi daidzein v prosti obliki, ki jima po vsebnosti sledi, poleg že omenjenega kvercetina, tudi miricetin, ki je prisoten v vseh oblikah. Semena navadnega rička vsebujejo tudi fenolne kisline, ki se delijo v dve skupini. Med hidroksibenzojske kisline sodijo salicilna, p-hidroksibenzojska in protokatehujska kislina. Med hidroksicimetne kisline spada sinapinska kislina, ki je edina izmed njih prisotna v semenih navadnega rička. Je ena izmed najbolj zastopanih fenolnih spojin v navadnem ričku (Terpinc in sod., 2011a). Sinapinsko kislino so tudi Rahman in sod. (2017) določili kot glavno fenolno kislino v semenih navadnega rička. Matthäus (1997) navaja, da je v semenih križnic najbolj pomemben fenolni ester sinapin, ki nastane iz sinapinske kisline ter holina. Vendar kot lovilec prostih radikalov deluje slabše v primerjavi s sinapinsko kislino (Vuorela in sod., 2004; Nićiforović in sod., 2017). Naslednja izmed kislin je elagna kislina, ki vsebuje štiri hidroksilne skupine, zato ima dobro sposobnost lovljenja prostih radikalov (Terpinc in sod., 2011a; Hayes in sod., 2009). V majhni količini so Rahman in sod. (2017) identificirali tudi galino kislino v netopni vezani obliki. Zadnje omenjene spojine, a zato nič manj pomembne, so 4-vinil derivati hidroksicimetnih kislin. To so: 4-vinilfenol (4-VP), 4-vinilgvajakol (4-VG), 4-vinilkatehol (4-VC) in 4- vinilsiringol (4-VS) ali drugače imenovan kanolol. Nastanejo z dekarboksilacijo hidroksicimetnih kislin s pomočjo encimov ali toplote (Vanbeneden in sod., 2008). Nastanek le-teh je pomemben v različnih panogah živilske industrije, saj prispevajo k aromi izdelkov, ker so zelo hlapni. Ti so prisotni tudi v semenih navadnega rička (Terpinc in sod., 2011a; Fallico in sod., 1996; Koski in sod., 2003; Vanbenedan in sod., 2008). Terpinc in sod. (2011b) so ugotovili, da je med 4-vinil derivati v heterogenem sistemu

15 6 emulzije linolne kisline v vodi pri preprečevanju razbarvanja β-karotena, najboljši 4-VG, v polarnem homogenem sistemu pri lovljenju DPPH pa se je najbolj izkazal 4-VC. Omenjene fenolne spojine se v semenih navadnega rička nahajajo v različnih oblikah. V semenih navadnega rička je najmanj zastopana prosta oblika fenolnih spojin in največ zastopana vezana oblika. Protokatehujska kislina, salicilna kislina, elagna kislina, katehin, 4-VC, 4-VS in 4-VP se večinoma nahajajo v netopni vezani obliki. Za razliko od teh je rutin skoraj v celoti prisoten v prosti obliki, v taki obliki je večinoma prisoten tudi kvercetin, medtem ko je 4- VG, ki je izmed teh spojin najmanj polaren, večinoma v obliki topnih konjugatov (Terpinc in sod., (2011c). Sinapinska kislina se tudi v največji meri nahaja v topni konjugirani obliki (Terpinc in sod., (2011c), kot so poročali tudi Rahman in sod. (2017). Avtorji Terpinc in sod. (2011c) predpostavljajo, kot je že omenjeno, da tvori s holinom ester sinapin. V raziskavi Terpinc in sod. (2011c) so se med fenolnimi spojinami v semenih navadnega rička kot najboljši lovilci DPPH izkazale proste fenolne spojine, ki so jim zelo blizu sledile fenolne spojine v konjugirani obliki, najslabše pa so bile fenolne spojine v netopni vezani obliki. Slednje so se najbolj izkazale kot lovilci lipidnih radikalov v emulziji, kjer so bile malo slabše fenolne spojine v prosti obliki, znatno slabši pa so bili topni konjugati. 2.3 KALJENJE Pri kaljenju dihanje v semenih postane hitrejše. Primerne temperature za kalitev so od 18 do 22 ºC. Zelo pomembno je tudi, da sta zrak in voda v pravem razmerju (Fink, 1993). Za sintezo antioksidantov je zelo pomembna faza nabrekanja (Cevallos-Casals in Cisneros- Zevallos, 2010). Spremembe se nadaljujejo v tankih plasteh med endospermom in kalčkom. V alevronski plasti, ki obdaja celoten endosperm, se tvorijo ustrezni encimi. Odgovorni so za razgradnjo rezervnih snovi (škrob, beljakovine) v endospermu na enostavne molekule - sladkorje, aminokisline, ki predstavljajo energijo za rast kalčka. Pomembni so tudi kovinski ioni in fosfati (Kreisz, 2009). Cortese (2009) navaja, da imajo nekaljena semena 10 % vode, med kaljenjem pa se vsebnost vode poveča za okoli 60 %, zato se jim energijska vrednost zmanjša (Fink, 1993). Pride pa pri kaljenju semen do sinteze novih komponent, ki so bioaktivne, kar so Ha in sod. (2016) dokazali s svojo raziskavo. Na novo se sintetizirajo fenolne spojine. S pomočjo že omenjenih encimov se hidrolizirajo tudi polisaharidi celične stene, kar povzroči sprostitev fenolnih spojin, ki so vezane na celično steno (Cevallos-Casals in Cisneros-Zevallos, 2010; Cáceres in sod., 2014). Prisotni minerali postanejo lažje dostopni in jih bolje izkoristimo v našem telesu. V semenih križnic nastanejo tudi glukozinolati oz. žveplo vsebujoče spojine (Cortese, 2009) Vpliv kaljenja semen na antioksidativno delovanje

16 7 Ha in sod. (2016) so raziskovali vpliv kalitvenega časa na vsebnost fenolnih spojin v semenih ječmena in njihovo AU, ki so jo določili z metodo DPPH. Ječmenova semena so kalili 18,5, 24, 30, 48 in 67 ur pri 90 % relativne vlage. Vsebnost fenolnih spojin in AU sta se s časom kaljenja postopoma povečevali. Pri 48 urah sta dosegli svoj maksimum, potem sta se začeli zmanjševati. Dognanja omenjene raziskave so potrdila, da imajo izvlečki fenolnih spojin iz ječmena antioksidativno učinkovitost in da se le-ta spreminja premo sorazmerno s količino fenolnih spojin v izvlečkih. Dokazali so pozitivni vpliv kaljenja semen na AU. Med kaljenjem so fenolne spojine postajale bolj dostopne in so se lažje ekstrahirale (Ha in sod., 2016). Zmanjšanje AU pri kaljenju, ki je daljše od 48 ur, pa pripisujejo začetku lignifikacije. Sumijo, da se fenolne spojine preoblikujejo v lignane ali lignin. Zato so mnenja, da je potrebno proces kaljenja z namenom povečanja vsebnosti fenolnih spojin in AU strogo nadzorovati in ustaviti pred začetkom lignifikacije. Tudi Terpinc in sod. (2016) so ugotovili, da kaljenje semen ajde bistveno vpliva na vsebnost fenolnih spojin in AU. Poročajo, da se AU (ki so jo določili z metodo DPPH ) in vsebnost fenolnih spojin nista bistveno spreminjali v času 16 ur kaljenja. Po 64 urah pa sta se začeli povečevati in svoj maksimum dosegli pri 88 urah kaljenja semen. Zelo majhne spremembe v semenih v času 16 ur kaljenja pripisujejo preoblikovanju fenolnih spojin v druge komponente ali pa tvorbi netopnih kompleksov z drugimi molekulami, kar je vplivalo na njihovo ekstrakcijo.

17 8 3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL Naš material so bili metanolni izvlečki fenolnih spojin, ki so jih že predhodno pripravili v okviru drugega diplomskega dela. Pripravili so jih iz zmletih, posušenih in razmaščenih nekaljenih in kaljenih (24, 48, 72 in 96 ur) semen navadnega rička. Izvlečke smo do analize hranili v hladilniku Reagenti in topila reagent DPPH (Aldrich) metanol (Merck KGaA) β-karoten (čistost 93 %, Sigma-Aldrich) etanol (96 %, Honeywell Riedel-de Haën) kloroform (Sigma-Aldrich) linolna kislina (čistost 99 %, Sigma) Tween 20 - polioksietilen sorbitan monolavrat (Sigma) Raztopine in emulzije smo pripravljali z uporabo bidestilirane vode Pribor in aparature ladjica za zatehto spatula analitska tehtnica (Mettler Toledo AT201) bučka (100 ml) aluminijasta folija parafilm magnet čaše kapalke magnetno mešalo (IKA RH basic KT/C) steklene epruvete zamaški za epruvete stojalo za epruvete vrtinčnik (VWR) avtomatske pipete (Eppendorf) nastavki za pipete (Eppendorf) kivete (2,5 ml PS) spektrofotometer (Hewlett- Packard) štoparica erlenmajerica (100 ml) merilni valj (100 ml) bučka za rotavapor (100 ml) rotavapor (Büchi Rotavapor r144) epica termostat (Dry bath system, StarLab) čašice hladilnik (Gorenje) centrifugirke (15 in 50 ml) stojalo za kivete

18 9 3.2 METODE Metoda DPPH Z metodo DPPH smo določili, kakšno sposobnost lovljenja DPPH imajo fenolne spojine prisotne v izvlečkih iz različno dolgo kaljenih in nekaljenih semen navadnega rička. Izvedli smo jo po opisu Brand-Williamsa in sod. (1995). Princip metode DPPH je, da antioksidant daruje svoj vodikov atom DPPH. Ko DPPH prejme vodikov atom, postane nereaktiven, saj se spremeni v DPPH2 (1,1-difenil-2- pikrilhidrazin). Gre za spektrofotometrično metodo, pri kateri izkoristimo zmožnost DPPH absorpcije svetlobe pri valovni dolžini 517 nm. Določitev izvedemo tako, da spremljamo znižanje absorbance; večje znižanje absorbance pomeni boljšo AU (Brand- Williams in sod., 1995). To opazimo v spremembi barve, ko vijolična barva preide v rumeno (Abramovič, 2011). Pri pripravi raztopine DPPH v metanolu smo na analitski tehtnici stehtali ustrezno maso (3,94 mg) reagenta DPPH. Kvantitativno smo ga prenesli v čašo z metanolom. Po 10 min mešanja v čaši, ki smo jo ovili z aluminijasto folijo, smo raztopino DPPH kvantitativno prenesli v 100 ml bučko in jo prav tako obdali z aluminijasto folijo, ker je DPPH občutljiv na svetlobo. Raztopino DPPH smo pripravljali sproti. Izvlečke smo pred uporabo temperirali na sobno temperaturo in premešali. V zavite z aluminijasto folijo in pravilno označene steklene epruvete smo odpipetirali različne volumne izvlečka (Vp), dodali topilo do 0,1 ml in nato 2,9 ml raztopine DPPH. Epruvete smo zamašili in vsebino premešali na vrtinčniku. Enako smo pripravili tudi kontrolni vzorec, ki je vseboval 0,1 ml metanola in 2,9 ml raztopine DPPH. Spektrofotometer smo umerili s slepim vzorcem, ki je bil v našem primeru samo metanol. Kontrolnemu vzorcu in vzorcem (raztopina DPPH in razredčeni izvlečki) smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 517 nm po 30 min inkubacije. Na koncu analize smo kontrolnemu vzorcu ponovno izmerili absorbanco. Delali smo v dveh ponovitvah. Za vsak vzorec smo izračunali delež preostalega DPPH (wpreostal DPPH), ki je bil še vedno prisoten v reakcijski zmesi po 30 min inkubacije: wpreostal DPPH (%) = ( Avz 517 (t= 30 min) / Ak 517 ) 100 (1) A vz 517 (t= 30 min) - izmerjena absorbanca vzorca po 30 min inkubacije pri valovni dolžini 517 nm A k izmerjena absorbanca kontrolnega vzorca pri valovni dolžini 517 nm

19 10 Boljšo sposobnost lovljenja radikala imajo prisotne fenolne spojine, manjši je wpreostal DPPH. V kontrolnem vzorcu, to je vzorcu, ki ne vsebuje izvlečka in s tem fenolnih spojin, ki bi lovile radikale, je največji (100 %) možni delež preostalega DPPH. Za določitev AU vsakega izvlečka smo s pomočjo programa Exel narisali graf odvisnosti wpreostal DPPH od Vp (volumen izvlečka, ki smo ga odmerili v reakcijsko zmes). V predposkusu smo ugotovili, da je linearna odvisnost wpreostal DPPH od Vp prisotna le v določenem območju. Naprej pa sledi, da tudi če povečujemo Vp in s tem koncentracijo fenolnih spojin v reakcijski zmesi (), ne dosežemo več linearnega zmanjšanja wpreostal DPPH. Z linearno regresijsko analizo z metodo najmanjših kvadratov smo pridobili smerni koeficient premice (k), s pomočjo katerega smo izračunali volumen izvlečka, ki je potreben, da prvotno količino DPPH zmanjšamo za polovico (EV50): EV50 = - 50 % / k (2) Manjši kot je EV50, večja je AU. Slika 1: Prikaz barve reakcijske zmesi z različnimi volumni izvlečkov ob dodatku raztopine DPPH Metoda beljenja β-karotena AU izvlečkov iz nekaljenih in različno dolgo kaljenih semen navadnega rička smo preverili tudi v modelnem sistemu emulzije linolne kisline v vodi skupaj z β-karotenom, kjer smo s povišano temperaturo povzročili, da se je linolna kislina oksidirala in nastal je alkilperoksilni radikal (ROO ). Ko ROO pride v kontakt z β-karotenom, se β-karoten razbarva, oranžno rdeča barva izgine. Ob dodatku izvlečkov, ki so vsebovali fenolne spojine, so le-te preprečile reakcijo med ROO in β-karotenom. Kako dobro sposobnost lovljenja ROO so imele fenolne spojine, smo določili s spektrofotometrom pri valovni dolžini 470 nm. Boljše kot je bilo njihovo delovanje v emulziji, manjše je bilo razbarvanje β-karotena in večja je bila izmerjena absorbanca.

20 11 Emulzijo za slepi vzorec smo pripravili v 100 ml erlenmajerici zaščiteni z aluminijasto folijo, kamor smo odpipetirali 20 µl linolne kisline in 200 µl Tweena 20 ter z merilnim valjem dolili 50 ml bidestilirane vode. Vsebino smo zaprli in premešali. Raztopino β-karotena v kloroformu smo pripravili tako, da smo na analitski tehtnici zatehtali 2 mg β-karotena in ga raztopili z 10 ml kloroforma v čašici oviti z aluminijasto folijo, saj je reagent občutljiv na svetlobo. Vse skupaj smo pazljivo premešali. Emulzijo z β-karotenom smo naredili tako, da smo v 100 ml bučko za rotavapor, ki smo jo ovili v aluminijasto folijo, odpipetirali 1 ml kloroformne raztopine β-karotena, 20 µl linolne kisline ter 200 µl Tweena 20. Vse skupaj smo previdno premešali. Dobili smo oranžno barvo emulzije. Nato smo na rotavaporju odparili ves kloroform. Potem smo v bučko z merilnim valjem počasi dodajali 50 ml bidestilirane vode, jo zaprli in dobro pretresli. Pripravili smo tudi slepi vzorec za kontrolo, kontrolni vzorec, slepi vzorec z izbranim izvlečkom iz semen ter vzorce (emulzije z izvlečki). Vse smo pripravili v steklenih epruvetah, ki smo jih zaščitili z aluminijasto folijo. Slepi vzorec za kontrolo je vseboval 5 ml emulzije za slepi vzorec in 200 µl 96 % etanola. Za kontrolni vzorec smo odpipetirali 5 ml emulzije z β-karotenom in 200 µl 96 % etanola. Slepi vzorec z izvlečkom je vseboval 5 ml emulzije za slepi vzorec, 150 µl 96 % etanola in 50 µl izbranega izvlečka. Vzorci (emulzije z izvlečki) pa so vsebovali 5 ml emulzije z β- karotenom in 200 µl izvlečka. Delali smo v dveh ponovitvah. Merjenje je potekalo pri določenih časih (0 min in po 30, 60, 90 ter 120 min) od trenutka, ko smo epruvete postavili v termostat s temperaturo 50 C. Vsebino epruvete smo prelili v kiveto in po merjenju absorbance nazaj v epruveto. Vsakokrat smo najprej umerili spektrofotometer z ustreznim slepim vzorcem. Antioksidativno učinkovitost v emulziji (AUe) smo izračunali: AUe (% ) = [ 1 ( Avz 470 (t=0) Avz 470 (t=x) ) / ( Ak 470 (t =0) Ak 470 (t =x) )] 100 (3) A vz 470 (t=0) - absorbanca vzorca pri valovni dolžini 470 nm ob času 0 A k 470 (t =0) - absorbanca kontrole pri valovni dolžini 470 nm ob času 0 A vz 470 (t=x) - absorbanca vzorca pri valovni dolžini 470 nm po določenem času A k 470 (t=x) - absorbanca kontrole pri valovni dolžini 470 nm po določenem času Količina β-karotena, ki se je razbarval v vzorcu (emulzija z izvlečkom), je sorazmerna razliki (Avz 470 (t=0) Avz 470 (t=x)). Količina β-karotena, ki se je razbarval v kontroli, je sorazmerna razliki (Ak 470 (t =0) Ak 470 (t =x)).

21 12 Slika 2: Prikaz steklenih epruvet z vzorci v termostatu pri temperaturi 50 ºC

22 w preostal DPPH (%) 13 4 REZULTATI Z RAZPRAVO 4.1 METODA DPPH S pomočjo metode DPPH smo želeli ugotoviti, ali kaljenje (24, 48, 72 in 96 ur) vpliva na AU fenolnih spojin v semenih navadnega rička. Preglednica 1 podaja volumne izvlečkov, ki jih odmerimo v reakcijsko zmes, absorbance pri valovni dolžini 517 nm in deleže preostalega DPPH po 30 min inkubacije. Pri analizi izvlečka iz semen kaljenih 24 ur je pri Vp = 60 µl prišlo ob dodatku raztopine DPPH do takojšnjega razbarvanja reakcijske zmesi iz vijolične v rumeno. To pomeni, da je to prevelik Vp in je bila koncentracija fenolnih spojin v reakcijski zmesi prevelika. Pri določitvi smernega koeficienta nismo upoštevali absorbance pri Vp = 60 µl, saj izračunani wpreostal DPPH ni bil več v območju linearne odvisnosti od Vp. Na sliki 3 smo prikazali wpreostal DPPH v reakcijski zmesi v odvisnosti od Vp izvlečkov iz nekaljenih semen in iz različno dolgo kaljenih semen V p (µl) nekaljena semena semena kaljena 24 ur semena kaljena 48 ur semena kaljena 72 ur semena kaljena 96 ur Slika 3: Delež preostalega DPPH (w preostal DPPH) v reakcijski zmesi v odvisnosti od volumna pipetiranja izvlečka (V p) iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen Vsi izvlečki so vsebovali fenolne spojine, ki so lovile DPPH. Iz preglednice 1 je razvidno, da prav pri vseh izvlečkih s povečanjem volumna pipetiranja pada delež preostalega DPPH. Kot je razvidno tudi iz slike 3, wpreostal DPPH pada linearno z Vp. Tako smo lahko za vsako odvisnost izračunali smerni koeficient premice, s pomočjo katerega smo izračunali EV50.

23 14 Preglednica 1: Volumni izvlečkov iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen navadnega rička, ki jih odmerimo v reakcijsko zmes (V p), vrednosti izmerjene absorbance pri valovni dolžini 517 nm (A 517) in deleži preostalega DPPH (w preostal DPPH) po 30 min inkubacije VZOREC V p (µl) A 517 (1) w preostal DPPH (1) (%) A 517 (2) w preostal DPPH (2) (%) nekaljena semena kontrola ,0589 0,8582 0,7166 0,5762 0,4840 0,3877 0, ,00 81,05 67,67 54,41 45,71 36,61 9,63 1,0440 0,8933 0,7389 0,6306 0,4720 0,2766 0, ,00 85,57 70,78 60,40 45,21 26,49 8,66 semena kaljena 24 ur kontrola ,9407 0,7558 0,5473 0,4182 0,3935 0,1391 nd* 100,00 80,34 58,18 44,46 41,83 14,79 nd* 1,0440 0,8530 0,6742 0,5372 0,4072 0,2361 0, ,00 81,70 64,58 51,46 39,00 22,61 6,70 semena kaljena 48 ur kontrola ,0440 0,9169 0,7906 0,6966 0,6645 0,5028 0, ,00 87,83 75,73 66,72 63,65 48,16 25,57 1,0660 0,9572 0,8012 0,7239 0,6598 0,5384 0, ,00 89,79 75,16 67,91 61,89 50,51 24,62 semena kaljena 72 ur kontrola ,0660 0,9322 0,8194 0,7588 0,7037 0,5691 0, ,00 87,45 76,87 71,18 66,01 53,39 32,77 1,0494 0,9484 0,8324 0,7574 0,7008 0,5641 0, ,00 90,38 79,32 72,17 66,78 53,75 29,73 semena kaljena 96 ur kontrola ,0493 0,9352 0,8273 0,7896 0,7433 0,6537 0, ,00 89,13 78,84 75,25 70,84 62,30 45,50 0,9813 0,8422 0,7667 0,7038 0,6785 0,5742 0, ,00 85,82 78,13 71,72 69,14 58,51 48,39 *ni določitve

24 15 V preglednici 2 so poleg smernih koeficientov podani rezultati za povprečne volumne izvlečkov, s katerimi znižamo DPPH za 50 %. Preglednica 2: Smerni koeficienti premic (k) in volumni izvlečkov, s katerimi znižamo vsebnost DPPH za 50% (EV 50) EV 50 VZOREC Smerni koeficient premice k (µl) -1 (µl) nekaljena semena 1. -1, , , ,66 semena kaljena 24 ur 1. -2, , , ,78 semena kaljena 48 ur 1. -1, , , ,93 semena kaljena 72 ur 1. -1, , , ,69 semena kaljena 96 ur 1. -0, , , ,85 EV 50 (µl) 30,9 ± 0,3 24,8 ± 0,9 39,9 ± 0,1 43,8 ± 0,1 52,5 ± 0,6 Vemo, da večji EV50 pomeni slabše delovanje antioksidantov. Iz preglednice 2 je razvidno, da je pri metodi DPPH antioksidativno najbolj učinkovit izvleček iz semen kaljenih 24 ur, saj ima od vseh izvlečkov najnižji povprečni EV50 (24,8 ± 0,9 µl). Sledijo mu izvleček iz nekaljenih semen (30,9 ± 0,3 µl), semen kaljenih 48 ur (39,9 ± 0,1 µl) in izvleček iz semen kaljenih 72 ur (43,8 ± 0,1 µl). Pri lovljenju DPPH se je najslabše odrezal izvleček iz semen kaljenih 96 ur z največjim povprečnim EV50 (52,5 ± 0,6 µl). Izvlečki iz nekaljenih in različno dolgo kaljenih semen so bili pripravljeni iz enake mase izhodnega materiala, z enakim volumnom ekstrakcijskega topila. To pomeni, da manjši volumen izvlečka, ki je potreben za 50 % inhibicijo DPPH, vsebuje večjo količino ekstrahiranih fenolnih spojin oz. večjo količino fenolnih spojin v izhodnem materialu (to je v semenih), ali pa, da so le-te boljši lovilci radikalov. Glede na pridobljene rezultate z DPPH metodo lahko rečemo, da je kaljenje semen navadnega rička ugodno vplivalo na njihovo AU le do določenega časa kaljenja, to je do 24 ur. S podaljševanjem časa kaljenja se je namreč AU semen samo še zmanjševala. Kar se nekako ujema z raziskavo Ha in sod. (2016), saj je tudi pri njih imelo kaljenje semen ječmena pozitivni vpliv na AU le do 48 ur. Z daljšim kaljenjem je AU upadla. V našem primeru je imel celo izvleček iz nekaljenih semen višjo AU kot izvlečki iz semen kaljenih 48, 72 in 96 ur. To pa je v nasprotju z raziskavo Ha in sod. (2016), pri katerih je imel izvleček iz nekaljenih semen ječmena najslabšo AU od vseh izvlečkov kaljenih semen. Terpinc in sod. (2016) so, kot smo že omenili, poročali o zvečanju AU po 64 urah kaljenja semen ajde do dosega maksimuma pri 88 urah. Glede na razlike v rezultatih med raziskavami bi lahko trdili, da je eden izmed razlogov za razlike botanična pripadnost

25 AU e (%) 16 (vrsta) semen. Je pa res, da je raziskave težko med seboj primerjati tudi zaradi razlik pri kaljenju, obdelavi semen in zaradi podajanja rezultatov v različnih enotah. 4.2 METODA BELJENJA β-karotena Uporabili smo tudi metodo beljenja β-karotena, saj smo želeli preveriti AU različno dolgo kaljenih in nekaljenih semen navadnega rička tudi v emulziji in s tem pridobiti bolj realen in celoten vpogled na delovanje njihovih fenolnih spojin. V preglednici 3 smo prikazali vrednosti absorbanc, ki smo jih izmerili pri valovni dolžini 470 nm za emulzije z izvlečki iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen. Vsi izvlečki fenolnih spojin so pokazali učinkovitost tudi v emulziji. Iz preglednice 3 je razvidno, da absorbanca pri valovni dolžini 470 nm s časom inkubacije pada. Kontrolnemu vzorcu (emulzija brez izvlečka) je absorbanca znatno bolj padala kot vzorcem (emulzije z izvlečki), kar je razumljivo, saj kontrolni vzorec ni vseboval fenolnih spojin, ki bi preprečevale razbarvanja β-karotena. Slika 4 prikazuje, kako se s časom inkubacije pri temperaturi 50 C spreminja AUe preiskovanih izvlečkov. Vidimo, da antioksidativna učinkovitost upada s časom inkubacije pri vseh vzorcih. Najmanj intenziven padec AUe s časom inkubacije je viden pri izvlečku iz nekaljenih semen. Krivulji izvlečkov iz kaljenih semen 48 ur in 96 ur se skorajda prekrivata, zato bi lahko rekli, da je njuno antioksidativno delovanje podobno. Hkrati pa imata bolj intenziven padec AUe kot ostali preiskovani izvlečki t (min) kontrola nekaljena semena semena kaljena 24 ur semena kaljena 48 ur semena kaljena 72 ur semena kaljena 96 ur Slika 4: Odvisnost antioksidativne učinkovitosti v emulziji (AU e) za izvlečke iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen od časa inkubacije (t) Slika 5 prikazuje rezultate, ki so drugače interpretirani kot rezultati na sliki 4. Slika 5 ponazarja, kako se količina razbarvanega β-karotena s časom inkubacije povečuje. Večje je antioksidativno delovanje fenolnih spojin, manjši je obseg razbarvanja β-karotena.

26 17 Preglednica 3: Vrednosti absorbanc pri valovni dolžini 470 nm (A 470) pri določenih časih inkubacije (t) za emulzije z izvlečki iz nekaljenih semen, 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen in kontrolni vzorec VZOREC t (min) A 470 (1) A 470 (2) A 470 nekaljena semena ,5288 0,4768 0,4681 0,4305 0,4412 0,5257 0,4839 0,4766 0,4340 0,4511 0,5273±0,0015 0,4804±0,0036 0,4724±0,0043 0,4323±0,0018 0,4462±0,0050 semena kaljena 24 ur ,5241 0,4645 0,4509 0,4049 0,4108 0,5223 0,4628 0,4468 0,4064 0,4153 0,5232±0,0009 0,4637±0,0008 0,4489±0,0020 0,4057±0,0008 0,4131±0,0023 semena kaljena 48 ur ,5409 0,4360 0,3789 0,2969 0,2871 0,5390 0,4447 0,3945 0,3266 0,3251 0,5400±0,0009 0,4404±0,0044 0,3867±0,0078 0,3118±0,0149 0,3061±0,0190 semena kaljena 72 ur ,5339 0,4408 0,3976 0,3309 0,3181 0,5275 0,4377 0,3950 0,3319 0,3294 0,5307±0,0032 0,4393±0,0015 0,3963±0,0013 0,3314±0,0005 0,3238±0,0057 semena kaljena 96 ur ,5293 0,4387 0,3818 0,3099 0,3044 0,5316 0,4290 0,3634 0,2994 0,2858 0,5305±0,0012 0,4339±0,0048 0,3726±0,0092 0,3047±0,0052 0,2951±0,0093 kontrola ,4993 4, , , ,

27 AU e (%) 18 S slikama 4 in 5 lahko potrdimo, da sta si AUe in količina razbarvanega β-karotena v vzorcih obratno sorazmerna. 0,6 A 470(t=o) - A 470(t=x) 0,5 0,4 0,3 0,2 0, kontrola nekaljena semena semena kaljena 24 ur semena kaljena 48 ur semena kaljena 72 ur semena kaljena 96 ur t (min) Slika 5: Graf odvisnosti A 470 (t=0) A 470 (t=x), ki predstavlja količino razbarvanega β-karotena, od časa inkubacije (t) Slika 6 ponazarja rezultate AUe izvlečkov iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen pri času 120 min inkubacije v termostatu pri 50 C. Iz slike 6 lahko razberemo, da ima najboljšo učinkovitost v emulziji linolne kisline z vodo izvleček iz nekaljenih semen (83 ± 1 %), ki mu padajoče sledijo izvlečki iz semen kaljenih 24 ur (77 ± 1 %), semen kaljenih 72 ur (57 ± 2 %), semen kaljenih 48 ur (51 ± 4 %) in semen kaljenih 96 ur (51 ± 2 %) nekaljena semena semena kaljena 24 ur semena kaljena 48 ur semena kaljena 72 ur semena kaljena 96 ur Slika 6: Vrednosti antioksidativne učinkovitosti v emulziji (AU e) za izvlečke iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen pri času 120 min inkubacije (50 C) Izvleček iz nekaljenih semen je imel višjo AUe od izvlečkov iz kaljenih semen. Najbolj se mu je približal le izvleček iz semen kaljenih 24 ur. Ker smo v vseh petih primerih v emulzijo odmerili enak volumen izvlečka, vsebuje izvleček z najvišjo učinovitostjo v emulziji najverjetneje največjo količino ekstrahiranih fenolnih spojin, ali pa so le-te boljši lovilci lipidnih radikalov v emulziji.

28 AU e (%) PRIMERJAVA REZULTATOV UPORABLJENIH METOD Če primerjamo rezultate obeh uporabljenih metod, lahko ocenimo, da so rezultati, ki smo jih pridobili z metodo DPPH in rezultati metode beljenja β-karotena v linearni zvezi. Na sliki 7 prikazujemo povezavo med AUe preiskovanih izvlečkov in njihovimi EV50. Vidimo, da gre za negativno povezavo z naklonom premice -1,1998 (r 2 = 0,7293). Upoštevati moramo, da nižji EV50 pomeni boljše antioksidativno delovanje. Zato bi lahko potrdili, da večja sposobnost lovljenja DPPH napoveduje višjo učinkovitost v emulziji. Pri obeh metodah sta pokazala najboljšo AU izvlečka iz nekaljenih semen in semen kaljenih 24 ur, slabšo AU pa so pokazali izvlečki iz semen kaljenih več kot 24 ur y = -1,1998x + 109,77 R² = 0, EV 50 (µl) Slika 7: Povezava med antioksidativno učinkovitostjo v emulzijah (AU e) pri času 120 min inkubacije in vrednostmi volumnov pipetiranja, s katerimi znižamo količino DPPH za 50 % (EV 50), za izvlečke iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen Fenolne spojine niso edini antioksidanti v semenih preiskovane oljnice. Poleg teh so prisotni tudi tokoferoli, karotenoidi, askorbinska kislina (Magalhaes in sod., 2006). To je tudi v skladu z mnenjem Moureja in sod. (2001). Razlog zmanjšanja AU v obeh medijih za izvlečke iz semen po 48 urah kaljenja bi lahko pripisali pretvorbi spojin med kaljenjem. Rahla odstopanja v AU, ki smo jih za preiskovane izvlečke določili v dveh različnih medijih, bi lahko deloma pripisali tudi spremembam v razporeditvi antioksidantov v semenih tekom kaljenja. Proste fenolne spojine imajo najboljšo sposobnost lovljenja DPPH, najslabšo pa netopne vezane fenolne spojine in slednje imajo najboljšo sposobnost zaviranja oksidacije v emulziji, najslabšo pa topne konjugirane (Terpinc in sod., 2011c). Lahko pa bi tudi mi kot razlog navedli lignifikacijo in potrdili, da je potrebno proces kaljenja nadzorovati in ustaviti pred lignifikacijo, kot so navedli Ha in sod. (2016). 4.4 VSEBNOST KLOROFILA V IZVLEČKIH Preverili smo tudi vpliv časa kaljenja na vsebnost klorofila v vseh izvlečkih, zato smo jim spektrofotometrično določili absorbcijski spekter pri valovni dolžini od 550 nm do 750 nm. Klorofil najintenzivneje absorbira svetlobo približno pri 650 nm (Vrtačnik in sod., 2014).

29 absorbanca ,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, semena kaljena 96 ur semena kaljena 72 ur semena kaljena 48 ur semena kaljena 24 ur nekaljena semena valovna dolžina (nm) Slika 8: Absorpcijski spekter izvlečkov iz nekaljenih semen in 24, 48, 72 ter 96 ur kaljenih semen pri valovni dolžini 550 nm nm Spektrofotometrične določitve (slika 8) so pokazale, da ima najvišji absorpcijski vrh pri 650 nm izvleček iz semen kaljenih 96 ur, najmanjši pa je pri izvlečku iz nekaljenih semen. S tem bi lahko potrdili raziskavo, ki so jo opravili Yiming in sod. (2015), kjer so prišli do ugotovitev, da se s podaljševanjem časa kaljenja semen tatarske ajde vsebnost klorofila povečuje, vendar do določenega časa. V njihovi raziskavi je kaljenje potekalo 7 dni, najvišjo vsebnost so določili po 5 dneh kaljenja, potem je vsebnost klorofila začela rahlo padati.

30 21 5 SKLEPI Iz naše raziskave določitve AU nekaljenih in različno dolgo kaljenih semen navadnega rička lahko sklepamo: Kaljenje ima vpliv na AU izvlečkov fenolnih spojin. Vsi preiskovani izvlečki fenolnih spojin, tako iz semen kaljenih 24, 48, 72 in 96 ur kot tudi iz nekaljenih semen, imajo antioksidativno učinkovitost, ki smo jo določili pri metodi določitve sposobnosti lovljenja DPPH in metodi beljenja β-karotena. Čas kaljenja semen navadnega rička ima vpliv na AU izvlečkov fenolnih spojin. Pri lovljenju DPPH ima kaljenje pozitivni učinek le do 24 ur; izvlečki iz semen, ki kalijo dlje, imajo slabšo AU, slabšo tudi od izvlečkov iz nekaljenih semen. Najboljšo učinkovitost pri lovljenju lipidnih radikalov v emulziji linolne kisline z vodo imajo izvlečki iz semen, ki ne kalijo; izvlečki iz 24-urno kaljenih semen imajo nekoliko slabšo učinkovitost; znatno slabšo učinkovitost imajo izvlečki iz semen kaljenih dlje od 24 ur. Rezultati, pridobljeni z metodo beljenja β-karotena, so v pozitivni korelaciji z rezultati pridobljenimi z metodo določitve sposobnosti lovljenja DPPH. Pridobljeni rezultati našega dela so delno potrdili postavljene hipoteze.

31 22 6 POVZETEK Iz semen navadnega rička (Camelina sativa L.) pridobivajo olje, ki deluje blagodejno pri raznovrstnih zdravstvenih težavah. Z užitjem olja pridobimo v svoje telo večkrat nenasičene, omega-3 maščobne kisline in fenolne spojine, ki delujejo antioksidativno oz. preprečujejo oksidativni stres, saj pomagajo pri vzpostavitvi ravnovesja s prostimi radikali. S kaljenjem semen se zgodijo razne spremembe. Med njimi sta tudi nastanek encimov in pretvorba hranilnih zalog. Poleg tega se hranilna vrednost semen izboljša s količinskim povečanjem vitaminov in tvorbo bioaktivnih spojin. V sklopu diplomskega dela smo preverili antioksidativno učinkovitost (AU) izvlečkov fenolnih spojin iz kaljenih (24, 48, 72 in 96 ur) semen navadnega rička, jo primerjali z AU izvlečkov iz nekaljenih semen in raziskali, ali se s podaljševanjem časa kaljenja izboljšuje AU izvlečkov. Izvlečkom smo določili sposobnost lovljenja prostega 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil radikala (DPPH ) in jo izrazili kot volumen izvlečka, ki je potreben za 50 % inhibicijo prvotne količine DPPH (EV50). Večji EV50 pomeni slabšo AU. Izvlečkom smo določili tudi učinkovitost pri preprečevanju razbarvanja β-karotena v emulziji linolne kisline z vodo. Pričakovali smo, da bodo imeli izvlečki fenolnih spojin iz kaljenih semen navadnega rička AU, kar smo tudi dokazali. Vsi preiskovani izvlečki fenolnih spojin iz 24, 48, 72 in 96 ur kaljenih in tudi nekaljenih semen so namreč pokazali učinek pri obeh metodah (DPPH in beljenje β-karotena). Kaljenje je imelo vpliv na AU izvlečkov fenolnih spojin. Vendar rezultati niso v skladu s postavljeno hipotezo, da naj bi se AU povečevala s časom kaljenja semen. Pri metodi DPPH je le izvleček iz semen, katerih kaljenje je trajalo 24 ur (EV50 = 24,8 ± 0,9 µl), pokazal večjo AU, kot jo je imel izvleček iz nekaljenih semen (EV50 = 30,9 ± 0,3 µl). Vsi ostali izvlečki so pokazali slabšo AU. V emulziji pa so imeli vsi izvlečki iz kaljenih semen slabšo sposobnost zaviranja lipidne oksidacije kot izvleček iz nekaljenih semen (AUe = 83 ± 1 %). Nekoliko slabšo učinkovitost je pokazal izvleček iz semen kaljenih 24 ur (AUe = 77 ± 1 %). Ostali izvlečki so imeli znatno slabšo učinkovitost. Rezultati obeh metod so si bili v pozitivni zvezi. Pri preverjanju vsebnosti klorofila v vseh izvlečkih smo prišli do ugotovitev, da se je s podaljševanjem časa kaljenja semen navadnega rička povečala vsebnost klorofila v izvlečkih. Na podlagi naših rezultatov lahko zaključimo, da je čas kaljenja res ključen pri tvorbi fenolnih spojin in antioksidativni učinkovitosti izvlečkov, saj se s kaljenjem semen navadnega rička, ki je daljše od 24 ur, AU izvlečkov znatno poslabša. Zato je zelo pomembno, da je proces kaljenja časovno strogo nadzorovan.