MergedFile

Transkripcija

1 Univerza v Ljubljani Medicinska fakulteta VLOGA DOMENE D0 FLAGELINA PRI AKTIVACIJI RECEPTORJA TLR5 DOKTORSKA DISERTACIJA THE ROLE OF THE D0 DOMAIN OF FLAGELLIN IN ACTIVATION OF TLR5 DOCTORAL DISSERTATION Vida Forstnerič Ljubljana, 2017

2

3 Vida FORSTNERIČ VLOGA DOMENE D0 FLAGELINA PRI AKTIVACIJI RECEPTORJA TLR5 Imenovanje mentorja na seji senata dne Komisija za oceno in zagovor imenovana na seji senata dne Datum zagovora: Mentorica : prof. dr. Mojca BENČINA Kemijski inštitut, Odsek za sintezno biologijo in imunologijo Predsednik komisije: prof. dr. Roman JERALA Kemijski inštitut, Odsek za sintezno biologijo in imunologijo Članica: prof. dr. Ana PLEMENITAŠ Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta Član: prof. dr. Igor KRIŽAJ Inštitut Jožef Stefan, Odsek za molekularne in biomedicinske znanosti Doktorsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela, ki sem ga izvedla pod mentorstvom doc. dr. Mojce Benčina na Odseku za sintezno biologijo in imunologijo Kemijskega inštituta Slovenije. Elektronski izvod doktorske disertacije je enak tiskanemu. Vida Forstnerič

4

5 ZAHVALA Zahvaljujem se prof. dr. Romanu Jerali, da mi je omogočil delo in sodelovanje v odličnem raziskovalnem okolju. Hvala za vse odlične ideje in usmeritve. Zahvaljujem se dr. Mojci Benčina za mentorstvo tekom mojega raziskovalnega dela. Začelo se je z diplomo, nadaljevalo z doktoratom in upam, da se tukaj ne bo končalo. Menim, da sva odlično sodelovali in hvala ti za vso pomoč, nasvete, ideje in predvsem za spodbudo v kriznih časih. Upam, da bova tako dobro sodelovali še naprej. Članom komisije prof. dr. Romanu Jerali, prof. dr. Ani Plemenitaš in prof. dr Igorju Križaju se zahvaljujem za komentarje in predloge v zvezi s temo doktorske disertacije in za hiter pregled doktorske naloge. Dr. Karolini Ivičak Kocjan se zahvaljujem za uvajanje v laboratorijsko delo in za sodelovanje tekom projekta flagelin-tlr5. S skupnimi močmi je bilo velikokrat lažje in hvala ti za vse debate s TLR5 povezane in nepovezane. Tjaši Plaper in Timoteju Čepinu se zahvaljujem za pomoč pri kloniranju in izolaciji proteinov. Dr. Ajasji Ljubetič se zahvaljujem za prispevek pri modeliranju in za sodelovanje pri publikaciji. Hvala tudi za vso ostalo pomoč in debate. Zahvaljujem se vsem sedanjim in nekdanjim sodelavcem na oddelku D-12 za dobro delovno klimo in sodelovanje. Hvala, da ste naredili delovno okolje prijetno in zabavno. Posebej sem hvaležna tistim, s katerimi smo postali v času mojega dela na D-12 dobri prijatelji in sem se vedno lahko obrnila na vas. Zahvaljujem se svoji družini in prijateljem, da ste verjeli vame in me podpirali. Najlepša hvala Brankotu in Silvi za vso podporo in za skrb za najino Hano, brez vajine pomoči bi bilo pisanje doktorata neprimerno težje. Posebno zahvalo pa si zasluži Boris - hvala ti za vso ljubezen in podporo, hvala za pomoč pri oblikovanju doktorata in predvsem hvala ti za najino Hano.

6

7 KAZALO VSEBINE 1 Uvod Imunski sistem Receptorji prirojene imunosti Receptorji TLR Zgradba receptorjev TLR Signalizacija TLR Flagelin Prepoznava flagelina preko receptorja TLR Namen dela in hipoteze Materiali in metode Materiali Bakterijski sevi Plazmidi Celične kulture in njihovo gojenje Protitelesa Metode Metode molekularnega kloniranja Dvojni luciferazni test Merjenje sekretorne alkalne fosfataze SEAP Priprava in čiščenje rekombinantnih proteinov Prenos western in imunodetekcija Koimunoprecipitacija Gibljivost bakterij Meritve cirkularnega dikroizma Poravnave proteinov Programska oprema Molekularno modeliranje Rezultati Mehanizem aktivacije receptorja TLR5 s flagelinom Humani in mišji receptor TLR5 se različno odzivata na mutacije flagelina v primarnem vezavnem mestu Za aktivacijo TLR5 je ključna C-končna regija domene D Določitev aminokislinskih ostankov v predelu C-končne regije flagelina, ki vplivajo na aktivacijo TLR Mutacije v C-končni regiji flagelina ne vplivajo na primarno vezavo flagelina na TLR Vpliv mutacij v C-končni regiji flagelina na mobilnost bakterij Domena D0 se veže na sosednji monomer TLR5 v tetrameru in stabilizira aktivno obliko kompleksa flagelin-tlr Bakterija Helicobacter pylori se izogne imunski prepoznavi preko modifikacij v C-končni regiji flagelina Inhibitorni flagelin Diskusija Sklepi Literatura I

8 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1. Receptorji TLR pri človeku in njihovi ligandi... 6 Preglednica 2. Bakterijski sevi Preglednica 3. Plazmidi in genski konstrukti II

9 KAZALO SLIK Slika 1. Povezava prirojene in pridobljene imunosti... 3 Slika 2. Zgradba Toll-u podobnega receptorja... 7 Slika 3. Signalne poti receptorjev TLR Slika 4. Struktura flagelina in nalaganje flagelinskih monomerov v filament Slika 5. Zgradba flagele Slika 6. Kristalna struktura skrajšanega flagelina vezanega na del ektodomene TLR Slika 7. Shematski prikaz strukture ektodomene TLR5 in flagelina Slika 8. Interakcijske površine med flagelinom in TLR5. Povzeto po Yoon in sod Slika 9. Vezava flagelina na TLR Slika 10. Aktivnost človeškega in mišjega receptorja TLR5 ob stimulaciji s flagelinom z mutacijami v primarnem vezavnem mestu in vpliv mutacij na gibljivost bakterij Slika 11. Model humanega in mišjega receptorja TLR5 v kombinaciji z divjim tipom flagelina ali mutanto R90N-E93R Slika 12. Aktivnost himernega receptorja SF-TLR Slika 13. Aktivnost in izražanje himernih proteinov SFΔND0-TLR5 in SFΔCD0-TLR5 v celicah HEK Slika 14. Aktivnost divjega tipa TLR5 ob sočasnem izražanju SFΔD0-TLR5 in vpliv dolžine peptidnega povezovalca na aktivnost himernega receptorja SFΔCD0-TLR Slika 15. Aktivnost in izražanje himernih receptorjev z delecijami v C-končnem delu flagelina Slika 16. Poravnava aminokislinskega zaporedja flagelinov različnih bakterijskih vrst Slika 17. Aminoksline izbrane za točkovno mutagenezo v domeni CD0 flagelina Slika 18. Gelska elektroforeza izoliranega flagelina in mutiranih različic Slika 19. Prenos western in gelska elektroforeza mutantnih proteinov, podvrženim proteolitski razgradnji Slika 20. Vpliv mutacij v C-končnem delu flagelina na aktivnost humanega in mišjega receptor TLR Slika 21. Aktivacija celic A549 s flagelinom in z mutantnimi proteini Slika 22. Imunoprecipitacija in prenos western divjega tipa flagelina in mutiranih različic z ektodomeno humanega TLR Slika 23. Mutacije v C-končnem delu flagelina vplivajo na gibljivost bakterij Slika 24. Model celotne molekule flagelina v kompleksu z ektodomeno TLR Slika 25. Predviden model postavitve domene D0 flagelina v komplesu s TLR Slika 26. Shematski prikaz povezave dveh neaktivnih flagelinov SFΔD0 v aktiven dimer Slika 27. Razdalja med končnima deloma flagelina v kristalni strukturi Slika 28. Aktivnost kovalentno povezanih dimerov flagelina Slika 29. Shematski prikaz himernih receptorjev mišjega in človeškega TLR Slika 30. Aktivnost himer med mišjim in človeških receptorjem TLR5 ob stimulaciji z divjim tipom flagelina in mutiranima različicama VLSLL_5A in R467A Slika 31. Regije znotraj domene CD0 flagelina, ključne za aktivacijo TLR5, so med seboj prostorsko ločene Slika 32. Poravnava zaporedij receptorja TLR5 različnih organizmov in model ektodomene TLR5 z izbranimi aminokislinskimi ostanki, ki se nahajajo v dveh potencialnih vezavnih površinah za domeno D0 flagelina Slika 33. Vpliv mutacije znotraj hidrofobne površine na ektodomeni TLR5 na aktivnost receptorja Slika 34. Vpliv mutacij znotraj negativno nabite površine na ektodomeni TLR5 na aktivnost III

10 receptorja Slika 35. Stimulacija mutant receptorja TLR5 z dimernim flagelinom dimsfδd Slika 36. Aktivnost divjega tipa TLR5 ob sočasnem izražanju z mutantnimi receptorji Slika 37. Domena D0 prispeva k izognitvi imunske prepoznave bakterije H. pylori Slika 38. Aminokislinski ostanki znotraj domene D0, ki prispevajo k izognitvi imunske prepoznave bakterije H. pylori Slika 39. Dimerizacijska površina med flagelinom in sosednjim receptorjem TLR5 v kompleksu Slika 40. Predvidena struktura inhibitornega flagelina Slika 41. Inhibitorna sposobnost inhflic Slika 42. Model in opis inhibitornih peptidov Slika 43. Inhibitorna sposobnost kratkih peptidov Slika 44. Zanka LRR9 receptorja je ob vezavi flagelina podvržena strukturnim spremembam Slika 45. Model predvidenega načina vezave domene D0 flagelina v signalnem komplesku flagelin-tlr Slika 46. Model predvidene vloge peptidnega povezovalca v dimernem flagelinu dimsfδd Slika 47. Aminokislinski ostanki znotraj C-končnega dela domene D0, ki sodelujejo pri aktivaciji receptorja TLR IV

11 POVZETEK Toll-u podoben receptor 5 (TLR5) je receptor naravne imunosti, ki prepoznava flagelin, glavni strukturni protein bakterijskih bičkov in pomemben virulenčni faktor številnih bakterij. Flagelin je sestavljen iz štirih domen, D0, D1, D2 in D3. Domeni D0 in D1 sta dobro ohranjeni med flagelini različnih bakterijskih vrst. Ta regija flagelina je pomembna pri aktivaciji receptorja TLR5. Domeni D2 in D3 sta visoko variabilni, tako po dolžini, kot tudi po zaporedju in na aktivacijo receptorja TLR5 ne vplivata. Receptor TLR5 je transmembranski protein, sestavljeni iz ektodomene, transmembranske domene in znotrajcelične domene, odgovorne za signalizacijo. Ključna stopnja aktivacije receptorja je z ligandom inducirana dimerizacija. Za aktivacijo TLR5 sta potrebna dva monomerna flagelina, ki se vežeta vsak na svoj receptor v kompleksu. Znano je, da se flagelin veže na lasten TLR5 preko ohranjenega dela znotraj domene D1 in da tvori dodatne, šibkejše interakcije s sosednjim monomerom v kompleksu. Znano je tudi, da delecija domene D0 flagelina izniči aktivacijsko sposobnost flagelina, vendar podrobni mehanizem vloge domene D0 pri aktivaciji receptorja ni znan. V doktorski nalogi smo obravnavali vlogo domene D0 flagelina pri aktivaciji receptorja TLR5. Domena D0 sestavlja N- in C-končni del flagelina. Pokazali smo, da je C-končni del pomemben pri aktivaciji TLR5, medtem ko N-končni del domene D0 na aktivacijo receptorja ne vpliva. Identificirali smo aminokislinske ostanke znotraj C- končnega dela domene D0, ki imajo vlogo v aktivaciji receptorja. Na podlagi naših rezultatov domnevamo, da se domena D0 flagelina veže na zunanjo površino sosednjega receptorja v kompleksu in s tem stabilizira aktivno dimerno konformacijo kompleksa. Identificirali smo možna vezavna mesta za domeno D0 flagelina na zunanji površini ektodomene TLR5. Naša dognanja orišejo bolj celovit molekularni mehanizem aktivacije receptorja TLR5. Signalizacija receptorja TLR5 je povezana z nekaterimi boleznimi, kot so revmatoidni artritis, Crohnova bolezen in cistična fibroza. V drugem delu doktorske naloge smo pripravili kratek peptid, ki inhibira aktivacijo receptorja s flagelinom. Verjamemo, da ima inhibitor receptorja potencialno terapevtsko vrednost pri omenjenih boleznih. V

12 ABSTRACT Toll-like receptor 5 (TLR5) is a receptor of the innate immune system that recognises flagellin, the main structural protein of bacterial flagella and a virulence factor of several bacterial species. Flagellin is composed of four linearly connected domains, D0, D1, D2 and D3. Domains D0 and D1 play an important role in TLR5 activation and are highly conserved among bacterial species. Domains D2 and D3 are, on the other hand, dispensable for TLR5 activation and highly diverse in sequence and length. The TLR5 receptor is a transmembrane protein composed of an ectodomain, a transmembrane region and an intracellular signalling domain. The dimerization of two receptor monomers, each bound with one molecule of the ligand, leads to the activation of a down-stream signalling event. Monomeric flagellin binds to TLR5 via a conserved segment of the D1 domain and forms additional, lower affinity contacts with the opposing receptor in the complex. While it is known that a deletion of the D0 domain completely abrogates flagellin s signalling capacity, the role of the D0 domain in TLR5 activation remains unknown. In the present doctoral dissertation we assessed the role of the D0 domain of flagellin in TLR5 activation. The D0 domain composes the N- and C-terminal portions of the protein. We show that the C-terminal region of D0 is crucial for TLR5 activation, while the N-terminal portion seems to have a disposable role. We identified several amino acid residues within the C-terminal D0 domain that affect TLR5 activation. Our results suggest that the D0 domain binds to the opposing TLR5 monomer in the complex and thus stabilizes an active receptor conformation. We identified a potential binding site for the D0 domain on the outer surface of the receptor ectodomain. Our results contribute to a more fully comprehensive view of the molecular mechanism of activation of the TLR5 receptor with its ligand, flagellin. TLR5 signalling is connected with several diseases, such as rheumatoid arthritis, Crohn s disease and cystic fibrosis. In the second part of our studies, we designed a short peptide inhibitor of the TLR5 receptor, which could be potentially beneficial in the therapy of several diseases. VI

13 IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK Izvirni znanstveni članek s področja teme doktorske disertacije (Priloga 1): Forstnerič, V., Ivičak-Kocjan, K., Ljubetič, A., Jerala, R. & Benčina, M. Distinctive Recognition of Flagellin by Human and Mouse Toll-Like Receptor 5. PLoS One 11, e (2016). VII

14 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI AP-1 APC BCA CD CD0 CD1 CLR DAMP DMEM DNA DOC drtlr5 ECD EDTA EGTA FBS FLS2 FluC HEK293 HePy htlr5 IFN IgG IKK IL IL-1R IP IPTG IRAK IκB LB LisMo LPS LRR LTA MAL/TIRAP MAMP MAPK MQ mtlr5 aktivatorski protein 1 (ang. activator protein-1) antigen predstavitvene celice reagent za določanje koncentracije proteinov (ang. bicinchoninic acid) cirkularni dikroizem C-končni del domene D0 flagelina C-končni del domene D1 flagelina lektine tipa C (ang. C-type lectin receptors) molekulski vzorci značilni za okvaro (ang. danger.associated molecular patterns) gojišče za celične kulture (ang. Dulbecco's Modified Eagle's Medium) deoksiribonukleinska kislina (deoxyribonucleic acid) deoksiholat receptor TLR5 navadne cebrice (danio rerio) ektodomena (ang. ectodomain) etilendiamin tetraocetna kislina etilenglikol tetraocetna kislina serum telečjega zarodka (ang. fetal bovine serum) rastlinski receptor za flagelin (ang. flagellin-sensitive-2) kresničkina luciferaza (ang. firefly luciferase) celična linija iz človeških zarodnih ledvičnih celic (ang. human embryonic kidney cell line) flagelin bakterije Helicobacter pylori humani TLR5 interferon tipa I imunoglobulin G kompleks kinaze IκB (ang. IκB kinase complex) interlevkin (ang. interleukin) receptor za interlevkin-1 (ang. interleukin-1 receptor) inhibitorni peptid izopropil-β-d-tiogalaktopiranozid kinaza, povezana z receptorjem IL-1 (ang. IL-1 receptor-associated protein kinase) inhibitor NF-κB (ang. inhibitor of NF-κB) gojišče Luria-Bertani flagelin bakterije Listeria monocytogenes lipopolisaharid ponovitve z levcini bogatih zaporedij (ang. leucine-rich repeat lipotejhojska kislina (ang. lipoteichoic acid) adapterski protein podoben MyD88 (ang. MyD88-adapter-like protein/tirdomain-containing adaptor protein) molekulski vzorci značilni za mikroorganizme (ang. Microbe-associated molecular patterns) z mitogeni aktivirana protein kinaza (ang. mitogen-activated protein kinase) dodatno očiščena destilirana voda mišji TLR5 VIII

15 Myd88 protein primarnega odziva pri mieloidni diferenciaciji (ang. myeloid differentiation primary response gene 88) Naip5 ang. NLR family, apoptosis inhibitory protein 5 ND0 N-končni del domene D0 NEMO modulator NF-κB (ang. NF-κB essential modulator) NF-κB jedrni dejavnik κb (ang. nuclear factor κb) NK celice celice naravne ubijalke (ang. natural killer cells) NLR receptorji podobni NOD-u (ang. Nod-like receptors) NLRC4 ang. NLR family CARD domain-containing protein 4 PAMP molekulski vzorci značilni za patogene mikroorganizme (ang. Pathogenassociated molecular patterns) PBS fosfatni pufer s soljo (ang. phosphate buffered saline) PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction) PDB baza podatkov s proteinskimi strukturami (ang. protein data base) PHK poglavitni histokompatibilnostni kompleks (ang. major histocompatibility complex ali MHC) PRAT4A protein, povezan z receptorjem TLR4 (ang. a protein associated with Toll-like receptor 4) PRR receptorji za prepoznavo molekularnih vzorcev (ang. Pattern recognition receptors)u RIP1 z receptorjem interagirajoč protein 1 (ang. receptor interacting protein 1) RLE relativne luciferazne enote RLR receptorji podobni RIG-I RNA helikazi (ang. RIG-I (retinoic acidinducible gene-i)-like receptors RluC Renilla luciferaza RNA ribonukleinska kislina (ribonucleic acid) SaTy Flagelin bakterije Salmonella typhimurium SDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti SDS (ang. SDS polyacrylamide gel electrophoresis) SEAP izločena embrionalna alkalna fosfataza (ang. secreted embryonic alkaline phosphatase - SEAP) SF flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen D2 in D3 (ang. short flagelin) TAB protein, ki veže TAK1 (ang. TAK1-binding protein) TAK s transformirajočim rastnim faktorjem β aktivirana kinaza 1 (ang. transforming growth factor-β-activated kinase 1) TBK1 vezavna kinaza 1 (ang. TRAF-family-member-associated NF-κB activator (TANK)-binding kinase 1) TCR T celični receptor TIR domena Toll/IL-1R TLR Toll-u podoben receptor (ang. Toll-like receptor) TLR5-N14VLR/ FliC-ΔD0 kristalna struktura dela TLR5 navadne cebrice (LRRNT-LRR14) v kompleksu s flagelinom bakterije S. dublin (domeni D1 in D2) TRAF z receptorjem za TNF povezan dejavnik (ang. TNF receptor-associated factor) TRAM proteinu TRIF sorodna adapterska molekula (ang. TRIF-related adaptor molecule) TRIF adapter, ki vsebuje domeno TIR in inducira interferon β (ang. TIR- IX

16 TRIS UNC93B1 VLR domain-containing adaptor protein inducing IFN-β) (hidroksimetil) aminometan (ang. (hydroxymethyl) aminomethane)) pomožni protein receptorjev, ki prepoznavajo nukleinske kisline unc-93 homolog B1 (ang. uncoordinated protein 93B1) variabilni limfocitni receptor iz glenavice (ang. hagfish variable lymphocyte receptor) X

17 1 Uvod 1.1 Imunski sistem Živa bitja smo v nenehnem stiku z mikroorganizmi, s katerimi večinoma živimo v simbiozi, nekateri pa ob vdoru v gostitelja povzročijo bolezen. Tekom evolucije so živa bitja razvila različne načine zaznave mikroorganizmov, ki omogočajo po eni strani prepoznavo in uničenje patogenov in po drugi strani vzdrževanje homeostaze med gostiteljem in simbiontskimi mikrobi 1. Te mehanizme skupno imenujemo imunski sistem. Ločimo dve, med seboj tesno povezani veji imunskega sistema. Prirojena imunost je filogenetsko starejša in je prisotna pri vseh večceličnih organizmih, pridobljena imunost pa se je razvila pred 500 milijoni leti pri vretenčarjih 2. Pridobljena imunost temelji na limfocitih B in T. Vsaka celica B in T na svoji površini izraža strukturno edinstven receptor, specifičen za točno določen antigen. Limfociti T izražajo na svoji površini T celični receptor (TCR), ki prepoznava antigen, predstavljen na površini antigen predstavitvenih celic (APC) in imajo vlogo predvsem pri obrambi pred znotrajceličnimi patogeni (celično posredovana imunost). Celice B izražajo na svoji površini B celični receptor (membransko vezan imunoglobulin), ki prepozna točno določen antigen in ob aktivaciji izločajo protitelesa z isto specifiko (humoralna imunost). Celice B imajo vlogo predvsem pri obrambi pred zunajceličnimi patogeni 3. Limfocitni receptorji nastanejo s procesom somatske rekombinacije genov in prestavljajo zelo velik repertoar različnih B in različnih T celičnih receptorjev z določeno specifiko 4. Ob prvem stiku z antigenom se limfociti klonalno namnožijo in se diferencirajo v efektorske in spominske celice. Tak sistem omogoča učinkovito prepoznavo in obrambo pred ogromnim številom patogenov. Medtem ko je za ustrezen odgovor na prvo okužbo potrebnih več dni, nastali imunski spomin omogoča hiter in učinkovit odgovor na ponovno okužbo z istim patogenom 3. V prvi fazi okužbe pa je ključnega pomena prirojena imunost, ki za razliko od pridobljene imunosti deluje takoj, je neodvisna od aktivacije z antigenom in nima sposobnosti imunskega spomina. Prirojeno imunost sestavljajo različni mehanizmi. Patogen se ob prvem stiku z gostiteljem sreča s fizičnimi preprekami, ki gostitelja ločujejo od okolja. To so z epitelijem 1

18 prekrita koža in mukozne površine gastrointestinalnega trakta in respiratornega sistema. Na epitelijskih površinah se izločajo nekatere protimikrobne snovi, kot so defenzini in katelicidini. V perifernih tkivih se nahajajo neutrofilci in makrofagi, ki preko svojih receptorjev prepoznajo tujke in jih uničijo s fagocitozo. Hkrati izločajo signalne molekule, s katerimi aktivirajo in rekrutirajo druge celice na mesto infekcije. Dendritične celice imajo najpomembnejšo vlogo pri predstavitvi antigena celicam T in s tem aktivaciji pridobljene imunosti. Celice naravne ubijalke (ang. Natural killer cells ali NK cells) uničijo z mikrobi inficirane celice in celice izpostavljene drugim vrstam stresa. Celice naravne imunosti v veliki meri prepoznavajo mikrobe preko receptorjev za prepoznavo molekularnih vzorcev (ang. Pattern recognition receptors ali PRR). Med najbolje raziskane PRR spadajo Toll-u podobni receptorji (ang. Toll-like receptors ali TLR). Poleg celic naravne imunosti ima pomembno vlogo tudi t.i. humoralni del prirojene imunosti. Ta vključuje topne faktorje, ki se vežejo na mikrobe in spodbudijo fagocitozo. V to skupino uvrščamo proteine komplementa, kolektine, pentraksine in fikoline 3. Delovanje prirojene in pridobljene imunosti je medseboj tesno povezano. Dendritične celice na svoji površini izražajo receptorje TLR, preko katerih prepoznajo mikrobne vzorce. Mikroorganizme internalizirajo in iz perifernih tkiv migrirajo v limfne vozle, kjer antigene predstavijo naivnim celicam T preko poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (PHK; ang. major histocompatibility complex ali MHC) 5,6. Aktivacija receptorjev TLR je nujno za zorenje dendritičnih celic 7. Poveča se privzem, procesiranje in zmožnost predstavljanja antigenov in poviša se izražanje kostimulatornih molekul in citokinov, ki omogočijo ustrezen T celični odziv Te se razvijejo v celice T pomagalke ali citotoksične celice T. Celice T pomagalke nato aktivirajo celice B. Povezava prirojene in pridobljene imunosti je povzeta na sliki 1. Poleg aktivacije receptorjev TLR na dendritičnih celicah, je prav tako pomembna intrinzična aktivacija na celicah B, ki je v določenih primerih nujna za ustrezen protitelesni odziv in nastanek imunološkega spomina. TLR ligandi lahko celo direktno aktivirajo spominske celice B

19 Dendritična celica Citotoksična celica T PRR Predstavitev antigena Naivna celica T Celica T pomagalka celica B makrofag Kostimulatorne molekule fagocitoza citokini Prirojena imunost Pridobljena imunost Slika 1. Povezava prirojene in pridobljene imunosti Mikrobni vzorci aktivirajo celice prirojene imunosti preko receptorjev PRR. Makrofagi imajo glavno vlogo pri fagocitozi in uničenju patogenov, hkrati pa proizvajajo vnetne citokine, ki aktivirajo druge imunske celice. Dendritične celice preko PHK antigen predstavijo naivnim celicam T, ki se diferencirajo v citotoksične celice ali celice T pomagalke. Slednje imajo vlogo pri aktivaciji celic B in indukciji protitelesnega odziva. Povzeto po Miguel in sod Receptorji prirojene imunosti Receptorji naravne imunosti so kodirani v zarodnih celicah in imajo nekoliko bolj omejen repertoar kot B in T celični receptorji. Izraženi so tako na imunskih kot neimunskih celicah 3. Prepoznavajo molekulske motive, ki so ohranjeni znotraj posameznih skupin mikroorganizmov in pogosto nujni za njihovo preživetje 4. Molekulski motivi, ki jih prepoznajo PRR, so se klasično imenovali molekulski vzorci značilni za patogene mikroorganizme (ang. Pathogen-associated molecular patterns ali PAMP), saj so bili od začetka preučevani predvsem v kontekstu infekcije 14. A glede na to, da ti motivi niso značilni samo za patogene, je bolj pravilen izraz molekulski vzorci značilni za mikroorganizme (ang. Microbe-associated molecular patterns ali MAMP) 15. Primeri MAMP so virusne in bakterijske nukleinske kisline, lipopolisaharidi (ang. lipopolysaccharide; LPS) iz celične stene po Gramu negativnih bakterij, lipoproteini in lipotejhojska kislina (ang. lipoteichoic acid; LTA) iz celične stene po Gramu pozitivnih bakterij, zimosan iz celične stene gliv, z manozo bogati oligosaharidi in mnoge druge molekule 3,16. Vezava liganda na receptor PRR gostitelju sporoča prisotnost infekcije in sproži vnetne in protimikrobne odzive preko številnih signalnih poti, ki vključujejo adapterske molekule, kinaze in transkripcijske faktorje 17. Poveča se 3

20 transkripcija genov, povezanih z vnetnim odzivom, kot so citokini, interferoni tipa I (ang IFN), kemokini, protimikrobni proteini in mnogih drugih še nekarakteriziranih proteinov 18. Receptorji PRR pa imajo poleg vloge v prepoznavanju in eliminaciji patogenov tudi pomembno vlogo pri uravnavanju imunske homeostaze 14. Tudi komenzalni in simbiontski mikroorganizmi namreč izražajo MAMP-e in prekomeren odziv nanje bi bil za gostitleja lahko škodljiv. Poznamo kar nekaj primerov komenzalizma in simbioze med bakterijami in gostiteljem, v katerih so udeleženi receptorji PRR. V določenih primerih gre za ligande značilne samo za komenzalne, ne pa tudi za patogene mikroorganizme, ki s stimulacijo receptorjev PRR promovirajo kolonizacijo mikroorganizmov 19. V drugih primerih so MAMP-i komenzalnih mikroorganizmov nujno potrebni za imunski odgovor na določene patogene, saj zagotovijo začetni (t.i. priming) signal, ki skupaj s sekundarnim signalom patogenega izvora omogoča ustrezen imunski odgovor na infekcijo s patogenom 20,21. V določenih primerih receptorji PRR prepoznavajo poleg simbiontskih in patogenih mikrobnih motivov tudi lastne molekule. To so običajno molekule, ki v zdravem tkivu niso izražene, ali so izražene v nizkih koncentracijah in odražajo nefiziološka stanja, kot so nekroza ali fizične poškodbe tkiva. Takim molekulam pravimo molekulski vzorci značilni za okvaro (ang. danger.associated molecular patterns ali DAMP) 17,22. Primeri so lastna DNA ali RNA iz nekrotičnih celic, heparan sulfat, hialuronska kislina in glikoproteini iz razgrajenega ekstracelularnega matriksa 22. Prepoznava lastnih molekul je lahko problematična, saj lahko vodi v avtoimunska obolenja 23. Receptorje PRR glede na njihovo lokalizacijo uvrščamo v tri skupine; sekretorne, citosolne in membranske. Med sekretorne uvrščamo topne molekule, kot so kolektini, fikolini in pentraksini, ki se vežejo na mikrobne površine in aktivirajo klasično ali lektinsko pot komplementa in preko površinske vezave (opsonizacije) označijo mikrobe za fagocitozo 1. Med citosolne receptorje uvrščamo receptorje podobne RIG-I RNA helikazi (ang. RIG-I (retinoic acid-inducible gene-i)-like receptors ali RLR) in receptorje podobne NOD-u (ang. Nod-like receptors; NLR) 24. Receptorji RLR prepoznavajo dvoverižno RNA in so pomembni pri odgovoru na številne viruse, kot so virus hepatitisa C, respiratorni sincicijski virus in virus influence 17,25. Ob 4

21 aktivaciji receptorjev RLR se poviša nastanek proinflamatornih citokinov in interferonov tipa I 25. Receptorji NLR lahko po vezavi ligandov sprožijo signalno kaskado, ki privede do aktivacije jedrnega dejavnika κb (ang. nuclear factor κb ali NF-κB) ali proteinskega kompleksa imenovanega inflamasom. Receptorji iz družine NLR prepoznavajo različne signale, kot so peptidoglikani, bakterijski proteini, virusne in bakterijske nukleinske kisline, različne oblike celičnega stresa (UV svetloba, okoljski onesnaževalci kot so azbest in silicijev oksid) in nekatere endogene molekule iz poškodovanih celic in tkiv (ATP, glukoza, kristali urata) 1,17,24,26. Transmembranski PRR prepoznajo mikrobne vzorce v zunajceličnem prostoru in v fagosomih in endosomih. Mednje uvrščamo lektine tipa C (ang. C-type lectin receptors ali CLR) in receptorje TLR 10. Receptorji CLR prepoznavajo ogljikove hidrate bakterij, virusov in gliv 18. Po vezavi ligandov pomagajo pri endocitozi, sprožijo oksidativni stres in vnetni odziv. Najbolj poznan je receptor dektin-1, ki prepozna β-glukan iz celične stene gliv in ima pomembno vlogo pri protiglivnem odzivu Receptorji TLR Toll-u podobni receptorji so najbolj raznolika in najbolj preučevana skupina med receptorji PRR. Razmah preučevanja TLR-jev se je zgodil v sredini 90ih let, ko so odkrili človeške homologe proteina Toll 22. Toll je transmembranski protein vinske mušice, za katerega so sprva poznali le vlogo pri dorzo-ventralnem razvoju zarodka, kasneje pa so, zaradi podobnosti s signalno potjo receptorja za interlevkin-1 (IL-1R) pri sesalcih, odkrili vlogo signalne poti Toll tudi pri protiglivnem odzivu vinske mušice 28,29. Do danes je poznanih trinajst paralogov pri sesalcih; TLR1-10 pri človeku in TLR1-9 in TLR11-13 pri miših 30. Receptorji TLR so izraženi tako na imunskih celicah, kot so makrofagi, dendritične celice in celice B in T, kot tudi na neimunskih celicah, kot so fibroblasti in epitelijske celice 6. Pri človeku so TLR1, 2, 4, 5, 6 in 10 izraženi na površini celic in z izjemo TLR5, ki kot edini TLR veže proteinski ligand, prepoznavajo lipide. TLR3, 7, 8 in 9 se nahajajo v endosomih, kjer prepoznavajo nukleinske kisline patogenov 22. Ob aktivaciji z ligandi tvorijo homo ali heterodimere. Človeški receptorji TLR in pripadajoči ligandi so povzeti v preglednici 1. 5

22 Preglednica 1. Receptorji TLR pri človeku in njihovi ligandi (Povzeto po 22,31 ) Receptor ligand TLR1/2/6 lipoproteini TLR3 Dvoverižna RNA TLR4 LPS TLR5 Flagelin TLR7 Enoverižna RNA TLR8 Enoverižna RNA TLR9 Enoverižna DNA TLR10 neznano Zgradba receptorjev TLR Receptorji TLR so transmembranski proteini tipa I, sestavljeni iz N-končne zunajcelične regije ali ektodomene (ang. ectodomain ali ECD), transmembranske regije in C-končne regije imenovane Toll/IL-1R ali domena TIR 32. Ektodomena je odgovorna za prepoznavo liganda. Sestavljena je iz ponovitev z levcinom bogatih zaporedij (ang. leucine-rich repeat ali LRR) in ima obliko podkve. Motiv LRR najdemo pri mnogih proteinih rastlinskega, živalskega in mikrobnega izvora, zlasti pri proteinih udeleženih v imunski odgovor. Posamezen LRR ektodomene tvori zanko, več zaporednih LRR-jev pa tvori obliko solenoida. Trakovi beta na konkavni površini ektodomene tvorijo paralelno β-ploskev. Tako ima ektodomena konkavno, konveksno in dve lateralni ali stranski površini. Lateralni površini sta, glede na smer potovanja verige, poimenovani ascendentna in descendentna površina. Ektodomene so na nekaterih mestih glikozilirane, vzorec glikozilacije pa se razlikuje med različnimi receptorji in med predstavniki istega receptorja različnih vrst (npr. mišji od človeškega). Na N- in C-koncu ektodomene se nahajata še značilni končni ponovitvi LRR, ki stabilizirata strukturo (LRR-NT in LRR-CT). TLR-ji so vsidrani v membrano preko transmembranske regije, ki je sestavljena iz cca. dvajsetih, večinoma nenabitih hidrofobnih aminokislin. Domena TIR je homologna domeni receptorja za interlevkin-1 (IL-1R). Sestavljena je iz osrednje β-ploskve obdane s petimi alfa vijačnicami. Nahaja se v citoplazmi in je odgovorna za signalizacijo. Pri signalizaciji je ključnega pomena BB-zanka, ki je udeležena pri dimerizaciji TIR domen in pri interakciji z adapterskimi proteini 33. Zgradba receptorjev TLR je prikazana na sliki 2. Prva je bila kristalizirana ektodomena receptorja TLR3 34,35, nato so sledile še številne študije in trenutno so poznane strukture celotne ali delne ektodomene vseh človeških receptorjev v kompleksu z ligandom, z izjemo TLR10 (TLR1- TLR2-lipopeptid, TLR2-TLR6-lipopeptid, TLR3-dsRNA, TLR4-MD2-LPS, TLR5-flagelin, 6

23 TLR7-ssRNA, TLR8-ssRNA, TLR9-CpG DNA in mišji TLR13-ssRNA) Kljub temu, da je interakcija vsakega receptorja TLR s svojim ligandom edinstvene narave, vsi aktivni dimeri tvorijo značilno oblike črke m, pri čemer je C-končni del posamezne protomere na sredini in N-končni del obrnjen navzven (slika 2, levo) 33. konveksn a površina ogljikovi hidrati Ektodomena konkavna površina Transmembranska domena desc. lateralna površina Domena TIR ascendentna lateralna površina Slika 2. Zgradba Toll-u podobnega receptorja Na sliki levo je prikazan dimer receptorja TLR3 s pripadajočim ligandom (dvoverižno RNA). Receptorji TLR so sestavljeni iz ektodomene, odgovorne za vezavo liganda, transmembranske regije in znotrajcelične domene TIR, ki je odgovorna za signalizacijo. Na desni je prikazana ektodomena receptorja TLR3. Ektodomene receptorjev TLR imajo N- in C-končne motive LRR. Terciarna struktura ektodomene ima konveksno, konkavno in dve lateralni površini, ascendentno in descendentno. Povzeto po Liu in sod. in Botos in sod. 33, Signalizacija Vezava liganda na ektodomeno povzroči dimerizacijo znotrajcelične domene TIR, ki nato deluje kot ogrodje za vezavo adapterskih molekul. Adapterske molekule prav tako vsebujejo domene TIR, ki se povežejo z receptorjem preko homotipičnih interakcij, vezava adapterskih molekul pa sproži nastanek kompleksov višjega reda 32. Medtem ko se za interakcije domen TIR domneva, da so šibke narave, tvorijo kompleksi adapterskih molekul med seboj stabilnejše interakcije 45. 7

24 Adapterske molekule, ki sodelujejo pri signalizaciji receptorjev TLR so: Myd88 (ang. myeloid differentiation primary response gene 88) MAL (ang. MyD88-adaptor-like protein) ali TIRAP (ang. TIR-domain-containing adaptor protein) TRIF (ang. TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β) ali TICAM1 (ang. TIR-domain-containing molecule 1) TRAM (ang. TRIF-related adaptor molecule ali TICAM2 (ang. TIR-domaincontaining molecule 2) Pri signalizaciji receptorjev TLR ločimo od MyD88 odvisno in od MyD88 neodvisno signalno pot. Receptorji TLR1/2, TLR2/6, TLR5, TLR7, TLR8 in TLR9 signalizirajo izključno preko od MyD88 odvisne poti. TLR2 in TLR4 potrebujejo poleg MyD88 še adaptersko molekulo MAL, ki usmeri MyD88 k ustreznemu receptorju TLR. TLR4 lahko signalizira tudi po od MyD88 neodvisni poti preko adapterskih molekul TRIF in TRAM. Signalizacija TLR4 preko MyD88 poteka iz plazemske membrane, medtem ko signalizacija preko TRIF/TRAM poteka po internalizaciji receptorja v endosome. Receptor TLR3 edini ne signalizira preko Myd88, temveč pri singalizaciji uporablja adaptersko molekulo TRIF 31, Od MyD88 odvisna signalna pot MyD88 vsebuje domeno TIR, preko katere se poveže z domeno TIR receptorja oz. vmesne adapterske molekule in domeno smrti (ang. death domain), preko katere se poveže z domeno smrti kinaze IRAK4 (ang. IL-1R-associated kinase 4). Ta fosforilira IRAK1, na katero se nato veže TRAF6 (ang. TNF receptor-associated factor 6). Kompleks TRAF6-IRAK se nato loči in tvori kompleks s TAK1 (ang. transforming growth factor β activating kinase), TAB1 (TAK1 binding protein 1) in TAB2 (TAK1 binding protein) na plazemski membrani. TAB2 in TAK1 se fosforilirata. IRAK1 gre v razgradnjo, preostali kompleks pa potuje v citosol, kjer sledi ubikvitinacija TRAF6 in aktivacija TAK1. Ta nato sodeluje s kompleksom IKK (ang. inhibitor of nuclear factor-κb (IκB)-kinase complex), ki ga sestavljata še podenoti IKKα in IKKβ in z regulatorno podenoto IKKγ ali NEMO (ang. NFκB essential modulator). Aktivacija kompleksa IKK vodi v fosforilacijo inhibitorne podenote IκB, ki se posledično označi za poliubikvitiniliranje. IκB je sicer vezan na transkripcijski faktor NF-κB in njegova razgradnja 8

25 omogoči prenos NF-κB v jedro, kar sproži prepisovanje od NF-κB odvisnih genov. TAK1 sproži tudi aktivacijo družine kinaz MAP, kar vodi do aktivacije transkripcijskega faktorja AP-1 (ang. activator protien-1). Poveča se sinteza in izločanje številnih vnetnih citokinov, kot so IL-1, IL-6, IFN-α in INF-β 6. V plazmacitoidnih dendritičnih celicah vodi aktivacija od MyD88 odvisne poti preko receptorjev TLR7 in TLR8 v aktivacijo IRF-3 in IRF-7, kar poveča sintezo in izločanje nekaterih kemokinov (RANTES (ang. regulated upon activation normally T-cell expressed and secreted), IP-10 (ang. interferon-inducible protein 10) in interferonov tipa I, ki imajo pomembno vlogo pri odgovoru na virusne infekcije 6,31 (slika 3) Od MyD88 neodvisna signalna pot Signalna pot preko adapterske molekule TRIF je značilna za TLR3 in TLR4. V primeru TLR4 se TRIF najprej veže na molekulo TRAM, medtem ko pride v primeru TLR3 do neposredne interakcije z dimerom domene TIR receptorja. TRIF se poveže z RIP1 (ang. receptorinteracting protein 1), preko katerega poteče aktivacija NF-kB. TRIF preko TRAF3 (ang. TNF Receptor Associated Factor 3) aktivira tudi TBK1 (ang. TRAF- family-member-associated NF-kB activator (TANK) binding kinase 1). TBK1 direktno fosforilira IRF-3 in IRF-7. Fosforilirana IRF-3 in IRF-7 tvorita homodimere in potujeta v jedro, kjer povročita povišano izražanje IFN-inducibilnih genov 6 (slika 3). 9

26 Slika 3. Signalne poti receptorjev TLR. Povzeto po Jiménez-Dalmaroni in sod TLR5 Receptor TLR5 prepoznava flagelin, glavni strukturni protein bakterijskih bičkov 46. Med imunske celice, ki izražajo TLR5, uvrščamo neutrofilce, monocite, nekatere dendritične celice (klasične in plazmacitoidne dendritične celice iz vranice in dendritične celice črevesne lamine proprie), mastocite, makrofage in celice T TLR5 je izražen na konvencionalnih monocitih in neutrofilcih, ki potujejo na mesto vnetja, zlasti v zgodnji fazi okužbe 47. TLR5 izražajo tudi neimunske celice, zlasti epitelijske celice gastrointestinalnega, respiratornega in urogenitalnega trakta in črevesne endotelijske celice V črevesnem epiteliju je TLR5 izražen izključno na bazolateralni, ne pa tudi na apikalni strani, kar omogoča toleranco na bakterije, ki ne prečkajo epitelijske bariere 56. Imunske in epitelijske celice mukoznih površin zaznavajo zelo nizke (pikomolarne) količine flagelina 57. Epitelijske celice, ki izražajo TLR5, ob okužbi predstavljajo glavni vir kemokinov, medtem so mukozne imunske celice glavni vir vnetnih citokinov

27 TLR5 spada med površinsko izražene TLR-je. Za pravilno znotrajcelično lokalizacijo TLR5 je pomemben šaperon PRAT4A (ang. protein associated with TLR4 A) 47. PRAT4A je rezidenčni protein endoplazemskega retikuluma (ER), ki v kompleksu z šaperonom gp96 pomaga nekaterim receptorjem TLR potovati iz ER v golgijev aparat in od tam na ustrezno lokacijo v celici. PRAT4A se povezuje tako z endosomalnimi, kot tudi s površinskimi receptorji TLR 59. Nekoliko bolj presenetljivo pa je bilo odkritje o vlogi molekule UNC93B1 (ang. unc-93 homolog B1) pri razvrščanju TLR5 na plazemsko membrano 60, saj je bilo do nedavnega splošno sprejeto da se UNC93B1 povezuje le z endosomalnimi TLR-ji 61,62. TLR5 iz plazemske membrane signalizira preko od MyD88 odvisne poti in za razliko od ostalih površinsko izraženih TLR-jev pri signalizaciji ne uporablja adapterske molekule MAL/TIRAP 63. Ena raziskava kaže tudi na signalizacijo TLR5 preko adapterske molekule TRIF v črevesnih epitelijskih celicah, kar naj bi vodilo v aktivacijo NF-κB in kinaz MAP 64. TLR5 prepoznava flageline številnih bakterij, kot so Salmonella, E. coli, Pseudomonas, Listeria, Legionella, Clostridia, in Vibrio 57. Po drugi strani pa so nekatere bakterije, kot sta Helicobacter pylori in Campylobacter jejuni, flageline modificirale na način, da so zmožni zaobit prepoznavo s strani TLR5, a hkrati ohranjajo gibljivost 65. Prepoznava flagelina preko receptorja TLR5 igra pomembno vlogo pri okužbi s patogeni na mukoznih površinah. Izbitje gena za TLR5 v miškah vodi v povečan obseg okužbe in v nastanek tkivnih poškodb pri oralni okužbi z bakterijo Salmonella typhimurium 66. Podobno vodi odsotnost TLR5 pri miškah do povečanega vnetja pljuč pri okužbi z bakterijo Legionella pneumophila, poslabšanega odziva pri okužbi pljuč z bakterijo Pseudomonas aeruginosa in do povečanega števila uropatogenih bakterij Escherichia coli pri okužbi sečil Pri človeku vodi okvara receptorja TLR5 v večjo dovzetnost za pljučnico, ki je posledica okužbe z bakterijo Legionella pneumophila 70. Poleg direktne obrambe pred določenimi patogeni ima TLR5 pomembno vlogo pri vzrdževanju ugodne črevesne mikroflore 71,72. Novejše raziskave vedno bolj kažejo na vpliv mikroflore na zdravje gostitelja, predvsem na razvoj in homeostazo imunskega sistema in na vlogo pri okužbah gostitelja s patogeni 21, Miške z izbitim genom za TLR5 razvijejo spontani kolitis ali metabolični sindrom, ki je posledica sprememb v sestavi črevesne mikroflore 71,72,78. Raziskava Oh J. Z. in sod. kaže na vlogo TLR5 in črevesne mikroflore pri odzivu na cepivo proti virusu influence v miškah 79. Prav tako je imel flagelin protektivno 11

28 vlogo preko aktivacije receptorja TLR5 in inflamasoma NLRC4 pri okužbi mišk z rotavirusom 80. Poleg protektivne vloge pa je delovanje receptorja TLR5 povezano tudi z nekaterimi boleznimi. Že dalj časa je znana vloga signalizacije flagelina preko TLR5 pri cistični fibrozi, Crohnovi bolezni in tropski bolezni melioidozi Novejše raziskave pa kažejo tudi na povezavo TLR5 z revmatoidnim artritisom, arterosklerozo, nekaterimi vrstami raka in z razvojem alergijske astme Flagelin Flagelin je glavni strukturni protein bakterijskega bička oz. flagele. Ima obliko velike grške črke gama (Γ) in je sestavljen iz štirih medseboj linearno povezanih domen, D0-D3. Domena D0 zaobsega N- in C-končni del proteina in je sestavljena iz dveh alfa vijačnic, ki v flagelarnem filamentu tvorita obvito vijačnico, medtem ko je ta del flagelina v monomerni obliki nestrukturiran Domeni D0 in D1 sta medseboj povezani preko dveh krajših antiparalelnih verig, imenovanih spoke regija. N-končni del domene D1 se prične z dvema alfa vijačnicama (ND1a in ND1b) in se nadaljuje v dve beta zanki in beta lasnico. C-končni del D1 tvori ena alfa vijačnica 91. Flagelin se v bakterijah nalaga v flagelarni filament preko aksialnih in lateralnih povezav med domenami D0 in D1 sosednjih monomerov 94. Domene D0, D1 in predvsem spoke regija so med bakterijskimi vrstami dobro ohranjene. Za aktivacijo TLR5 je odgovoren motiv znotraj domene D1 95. Domeni D2 in D3 sta sestavljeni pretežno iz beta trakov in sta med bakterijskimi vrstami variabilni, tako v zaporedju, kot tudi v dolžini 96. Domeni D2 in D3 imenujemo hipervariabilna regija. Ta del flagelina je pomemben za nastanek protiteles in je v flagelarnem filamentu obrnjen navzven 91,97. Struktura flagelina in nalaganje flagelina v filament je prikazana na sliki 4. 12

29 Vezava na TLR5 Flagelin Vzdolžni prerez flagelarnega filamenta Prečni prerez flagelarnega filamenta Slika 4. Struktura flagelina in nalaganje flagelinskih monomerov v filament Flagelin je sestavljen iz štirih med seboj linearno povezanih domen D0-D3, pri čemer domena D0 obsega N- in C-končni del proteina. Preko ohranjenih domen D0 in D1 se flagelin helikalno nalaga v flagelarni filament. TLR5 prepoznava ohranjeno regijo flagelina znotraj domene D1. Hipervariabilni del flagelina, ki vključuje domeni D2 in D3, je v filamentu obrnjen navzven. Povzeto po Lu in sod. 98 Flagelarni filamenti so tubularne strukture z notranjim kanalom, preko katerega se prenašajo flagelinski monomeri, ki se nalagajo na distalni konec flagele. Filamenti zrastejo v dolžino do 20 µm in so sestavljeni iz do podenot flagelina 96,99. Sestava filamentov se razlikuje med bakterijami; pri bakteriji Salmonella typhimurium filament sestavlja 11 protofilamentov, medtem ko je pri bakterijah Campylobacter jejuni in Helicobacter pylori filament sestavljen iz 7ih protofilamentov

30 Filament Kavelj Bazalno telo Zunanja membrana Periplazma Citoplazemska membrana Slika 5. Zgradba flagele Povzeto po Haiko in sod. 101 Glede na način nalaganja flagelina v protofilament, ta zavzame eno od dveh diskretnih stanj, levo ali desno sučno orientacijo 102. Znotraj enega filamenta lahko obstaja heterogena populacija protofilamentov levo in desno orientiranih, ki se nekoliko razlikujejo v dolžini, kar vodi v ukrivljenost filamenta 103. Preko kavlju podobne strukture so filamenti povezani z bazalnim telesom v notranjosti celice (slika 5) 104. Motor v bazalnem telesu vrti tako ukrivljen filament, ki deluje kot propeler in omogoča premikanje bakterij. Ko vsi flagelarni motorji vrtijo flagele v eno smer se bakterija premika na način swim, ali plavanje, zasuk nekaterih motorjev v drugo smer pa povzroči premikanje bakterije na način tumble, ali kotaljenje 103. Poleg gibanja, ki omogoča kolonizacijo določenih bioloških niš v gostitelju, imajo flagele nekaterih patogenih bakterij vlogo tudi pri adheziji in invaziji gostiteljskih celic, tvorbi biofilmov in pri sekreciji drugih virulenčnih proteinov Prepoznava flagelina preko receptorja TLR5 Delecijske študije in študije mutageneze so pokazale, da so za aktivacijo TLR5 ključni trije alfa heliksi in beta lasnica znotraj domene D1, s poudarkom na predelu aminokislinskih ostankov flagelina bakterije Salmonelle typhimurium in da hipervariabilna regija 14

31 flagelina ne vpliva na aktivacijo TLR5 65,95,105,106. Prav tako so s študijami mutageneze in delecije skušali opredeliti predel na TLR5, pomemben za vezavo flagelina. Mizel in sod. poročajo o pomenu predela aminokislinskih ostankov (LRR14 LRR15) 107, kasneje pa Andersen-Nissen in sod. pokažejo pomen osrednje regije med aminosklinskimi ostanki (LRR6 LRR14) za vrstno specifično prepoznavo flagelina med mišjim in človeškim TLR5 in predlagajo, da se v tem predelu veže ohranjena regija flagelina 108. Slika 6. Kristalna struktura skrajšanega flagelina vezanega na del ektodomene TLR5 (PDB koda 3V47) Povzeto po Yoon in sod. 40 Skupini Yoon in sod. je leta 2012 uspelo kristalizirati del ektodomene TLR5 od navadne cebrice (Danio rerio) v kompleksu s skrajšano obliko flagelina bakterije Salmonella dublin (Slika 6). Kompleks se imenuje TLR5-N14 VLR /FliC-ΔD0. Zaradi lažje ekspresije večjih količin topne in biološko aktivne oblike ektodomene TLR5, potrebnih za kristalizacijo, so v raziskavi pripravili fuzijo TLR5 z variabilnim limfocitnim receptorjem iz glenavice (ang. hagfish variable lymphocyte receptor ali VLR). Skupina je uspešno kristalizirala začetni del TLR5 od LRRNT do začetka LRR14 skupaj z domenama D1 in D2 flagelina. V kristalu manjka 262 C-končnih aminokislin ektodomene TLR5 (LRR14 do LRRCT) in domeni D0 in D3 flagelina (slika 7). Flagelin se veže preko ohranjene domene D1 na ascendentno lateralno stran TLR5 in tvori primarno vezavno mesto. Dva heterodimera nadalje dimerizirata v simetričen tertamer s stehiometrijo 2:2. TLR5 iz prvega heterodimera tvori dodatne, šibkejše interakcije s flagelinom in TLR5 iz drugega heterodimera (FliC in TLR5 ). To interakcijsko površino imenujejo sekundarna dimerizacijska površina 40. Na sliki 8 so prikazane 15

32 interakcijske površine v kompleksu. Stehiometrija kompleksa, določena v kristalu, je bila potrjena tudi na človeških celicah 109. Slika 7. Shematski prikaz strukture ektodomene TLR5 in flagelina S shematskim prikazom je ponazorjena domenska struktura ektodomene receptorja TLR5 (TLR5-ECD) in flagelina bakterije S. dublin (FliC). Z rdečo barvo je označen del molekul, ki sestavlja kristalno strukturo TLR5- N14 VLR /FliC-ΔD0. Povzeto po Yoon in sod. 40 V primarnem vezavnem mestu pride do interakcije med lateralno površino TLR5 v predelu od LRRNT do LRR10 in tremi alfa vijačnicami domene D1 flagelina. Primarno vezavno mesto je razdeljeno na vmesni površini A in B. Vmesno površino A tvori TLR5 od LRRNT do LRR6 in spodnji (C-končni) del vijačnice CD1 flagelina in je pretežno hidrofilne narave. Vmesno površino B tvori osrednji del TLR5 (LRR7 do LRR10) in vijačnice ND1a in ND1b flagelina (sliki 8 in 9). Vmesna površina B vključuje t.i. hot spot vezave flagelina in TLR5. Ta se nahaja v zanki v LRR9, ki ob vezavi flagelina spremeni konformacijo in tvori žleb, kamor se vežeta ohranjena aminokislinska ostanka flagelina R90 in E

33 Slika 8. Interakcijske površine med flagelinom in TLR5. Povzeto po Yoon in sod. 40 Sekundarna dimerizacijska površina je sestavljena iz treh vmesnih površin. Na vmesni površina α pride do kontakta med flagelinom prvega heterodimerom in TLR5 drugega (FliC- TLR5 ). Vmesna površina α označuje interakcijo med TLR5 in FliC. Vmesna površina β označuje interakcijo med receptorjema TLR5 v kompleksu (TLR5-TLR5 ) (slika 8). Med monomeroma flagelina ne pride do kontakta. Manjkajoča domena D0 flagelina praktično ne vpliva na vezavo flagelina na TLR5, medtem ko zniža aktivacijo receptorja za faktor Primarna vmesna površina A Primarna vmesna površina B Dimerizacijska površina α Hipervariabilna domena D2 Ohranjena domena D1 C-konec N-konec Slika 9. Vezava flagelina na TLR5 Povzeto po Yoon in sod

34 Flagelin je v bakterijah naložen v flagele, za aktivacijo TLR5 pa je odgovorna monomerna oblika flagelina. Mehanizmi, kako pride do prisotnosti monomernega flagelina v tkivu gostitelja, so različni. V nekaterih primerih se domneva, da gre zgolj za depolimerizacijo distalnega konca flagele, pri čemer se odcepljajo monomeri flagelina. V drugih primerih je dokazana celo de novo sinteza in izločanje flagelina v odgovor na nekatere molekule gostitelja in aktivna translokacija na bazolaterelno stran epitelijskega sloja. Po drugi strani pa so sposobne nekatere bakterije, kot so predstavniki rodov Helicobacter in Vibrio, svoje flagele zaščititi, kar vodi v zmanjšano depolimerizacijo in morda predstavlja dodatno evolucijsko prilagoditev, s katero obidejo imunsko prepoznavo 57, Poleg receptorja TLR5 prepozna flagelin tudi znotrajcelični receptorski kompleks Naip/NLRC4 in rastlinski receptor FLS2. Inflamasom Naip5/NLRC4 pri miškah in Naip/NLRC4 pri človeku prepozna terminalnih 35 aminokislin ohranjene C-končne regije flagelina, medtem ko receptor FLS2 prepozna motiv dolg 22 aminokislinskih ostankov v domeni D1 blizu N-končnega dela flagelina

35 2 Namen dela in hipoteze Receptor TLR5 je izražen na številnih imunskih in neimunskih celicah in igra pomembno vlogo pri obrambi pred patogeni na mukoznih površinah 116. Poleg direktne obrambne vloge je receptor TLR5 pomemben pri oblikovanju in vzdrževanju ugodne črevesne mikroflore, ki pomembno vpliva na zdravje gostitelja 71,72. Aktivacija TLR5 je povezana tudi z nekaterimi boleznimi, kot so cistična fibroza, Crohnova bolezen, melioidoza, revmatoidni artritis, arteroskleroza in nekatere vrste raka Flagelin ima širok potencialen spekter uporabe v medicini; ima protektivno vlogo pri radioaktivnem sevanju in pri okužbi z nekaterimi patogeni in v kombinaciji z različnimi antigeni deluje kot dober adjuvans Podrobno znanje o načinu aktivacije receptorja TLR5 s flagelinom je tako izjemnega pomena, prvič zaradi osnovnega razumevanja delovanje tega dela prirojene imunosti in drugič zaradi širokega potenciala za razvoj agonistov in antagonistov receptorja TLR5. Kristalna struktura TLR5 s flagelinom dobro okarakterizira stehiometrijo vezave in površine primarne in sekundarne vezave flagelina na TLR5 40. Vendar pa fragment flagelina, ki je vključen v kristalno strukturo, receptorja TLR5 ne aktivira, kljub temu da se nanj dobro veže. Delecija domene D0 flagelina namreč praktično popolnoma izniči aktivacijsko sposobnost flagelina. Z namenom celovite pojasnitve modela aktivacije smo se v doktorski nalogi osredotočili na vlogo domene D0 pri aktivaciji receptorja TLR5. V nekaterih primerih ima lahko signalizacija preko TLR5 negativen vpliv pri napredovanju bolezenskega stanja. Cistična fibroza (CF) je dedna bolezen s pogostim smrtnim izidom, ki je posledica prekomernega in kroničnega vnetnega odziva pljučnega tkiva na okužbo z bakterijo Pseudomonas aeruginosa 120. Signalizacija preko TLR5 ima pri CF pomembno vlogo, saj je inhibicija TLR5 na celicah pacientov s CF znižala prekomerni vnetni odziv pljučnih epiteljnih celic ob okužbi, kar ponuja možnost tarčne inhibicije receptorja kot možno terapijo pri zdravljenju pacientov s CF 53. Drug primer je Crohnova bolezen (CB), boleze prebavil ki poteka kronično in običajno doživljensko in je posledica prekomernega in kroničnega vnetnega odziva na črevesno mikrofloro 121. Pri CB je opažen povišan tako prirojeni kot tudi pridobljeni imunski odziv na flagelin, kar izpostavlja signalizacijo preko TLR5 kot pomembno tarčo pri obvladovanju kroničnega vnetja 121,122. Namen doktorske naloge je priprava inhibitorne oblike flagelina, ki bi imela potencialno terapevtsko vrednost pri CF, CB 19

36 in drugih boleznih. Hipoteze: 1. Predvidevamo, da se domena D0 flagelina veže na C-končen del ektodomene TLR5 v sosednjem receptorju in s tem stabilizira nastanek aktivnega signalnega kompleksa s stehiometrijo 2:2. 2. Predvidevamo, da se bo inhibitorni flagelin, načrtovan glede na znano strukturo aktivnega signalnega kompleksa flagelina in receptorja TLR5, vezal na TLR5 in hkrati preprečil aktivacijo signalne poti. 20

37 3 Materiali in metode 3.1 Materiali Bakterijski sevi Preglednica 2. Bakterijski sevi Sev Genotip uporaba Vir DH5α F - / supe44, ΔlacU169 (80 laczδm15) hsdr17 reca1 enda1 gyra96, thi-1, rela1 pomnoževanja plazmidov in molekularno kloniranje Zbirka sevov na Kemijskem inštitutu Ljubljana BL21(DE3)pLysS F - ompt gal dcm lon hsds B (r - B m - B ) λ(de3) plyss(cm R ) priprava proteinov Zbirka sevov na Kemijskem inštitutu Ljubljana S. typhimurium FliC-/FljB- test gibljivosti bakterij Edward Miao, Institute for Systems Biology, Seattle Plazmidi Preglednica 3. Plazmidi in genski konstrukti Plazmid / genski Opis konstrukt Plazmidi za dvojni luciferazni test pelam-1 luciferaza Plazmid z zapisom za kresničkino luciferazo pod NFκB-odzivnim promotorjem. phrl-tk Plazmid z zapisom za Renilla luciferazo pod konstitutivnim promotorjem. pcdna3 Kontrolni plazmid brez vključka, uporabljen za Invitrogen izenačevanje mase transficirane DNA v sesalskih celicah. Plazmidi z zapisom za TLR5 puno-htlr5 Plazmid z zapisom za humani receptor TLR5. Invivogen puno-mtlr5-ha Plazmid z zapisom za mišji receptor TLR5 z označevalcem HA na C-končnem delu. puno-htlr5-ha Plazmid z zapisom za humani receptor TLR5 z označevalcem HA na C-končnem delu. Plazmidi z zapisom za himerne receptorje, sestavljene iz flagelina in TLR5 SF-TLR5/pFLAG-CMV3 Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen (vključuje ak 1-176, 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) povezan s 27 ak dolgim peptidnim povezovalcem s humanim TLR5 (ak ). Konstrukt je pripravljen v vektorju pflag-cmv3 in ima na N-končnemu delu preprotripsinsko sekvenco, ki ji sledi peptidni označevalec FLAG. SFΔD0-TLR5/pFLAG- CMV3 Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen in brez domene D0 (vključuje ak , 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) povezan s 27 ak dolgim peptidnim povezovalcem s humanim TLR5 (ak Vir Carsten Kirschning, Institute of Medical Microbiology, University of Duisburg-Essen, Nemčija Promega Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut Karolina Ivičak-Kocjan, Kemijski Inštitut 109 Karolina Ivičak-Kocjan, Kemijski Inštitut 109

38 SFΔND0-TLR5/pFLAG- CMV3 SFΔCD0-TLR5/pFLAG- CMV3 SFΔCD0-l 57 - TLR5/pFLAG-CMV3 SFΔC 10 D0-TLR5/pFLAG- CMV3 SFΔC 20 D0-TLR5/pFLAG- CMV3 858). Konstrukt je pripravljen v vektorju pflag- CMV3 in ima na N-končnemu delu preprotripsinsko sekvenco, ki ji sledi peptidni označevalec FLAG. Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen in N-končne domene D0 (vključuje ak , 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) povezan s 27 ak dolgim peptidnim povezovalcem s humanim TLR5 (ak ). Konstrukt je pripravljen v vektorju pflag- CMV3 in ima na N-končnemu delu preprotripsinsko sekvenco, ki ji sledi peptidni označevalec FLAG. Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen in C-končne domene D0 (vključuje ak 1-176, 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) povezan s 27 ak dolgim peptidnim povezovalcem s humanim TLR5 (ak ). Konstrukt je pripravljen v vektorju pflag- CMV3 in ima na N-končnemu delu preprotripsinsko sekvenco, ki ji sledi peptidni označevalec FLAG. Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen in C-končne domene D0 (vključuje ak 1-176, 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) povezan s 57 ak dolgim peptidnim povezovalcem s humanim TLR5 (ak ). Konstrukt je pripravljen v vektorju pflag- CMV3 in ima na N-končnemu delu preprotripsinsko sekvenco, ki ji sledi peptidni označevalec FLAG. Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen in z delecijo zadnjih 10ih ak C-končne domene D0 (vključuje ak 1-176, 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) povezan s 57 ak dolgim peptidnim povezovalcem s humanim TLR5 (ak ). Konstrukt je pripravljeni v vektorju pflag-cmv3 in ima na N-končnemu delu preprotripsinsko sekvenco, ki ji sledi peptidni označevalec FLAG. Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilnih domen in z delecijo zadnjih 20ih ak C-končne domene D0 (vključuje ak 1-176, 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) povezan s 57 ak dolgim peptidnim povezovalcem s humanim TLR5 (ak ). Konstrukt je pripravljeni v vektorju pflag-cmv3 in ima na N-končnemu delu preprotripsinsko sekvenco, ki ji sledi peptidni označevalec FLAG. Plazmidi z zapisom za himerne receptorje, sestavljene iz človeškega in mišjega TLR5 H-LRR16-M/pUNO Himera med človeškim (1-391) in mišjim ( ) receptorjem. Fuzija je znotraj ohranjene regije LRR16. Konstrukt vsebuje označevalec HA na C- končnem delu. M-LRR16-H/pUNO Himera med mišjim (1-391) in človeškim ( ) receptorjem. Fuzija je znotraj ohranjene regije LRR16. Konstrukt vsebuje označevalec HA na C- končnem delu. H-LRR17-M/pUNO Himera med človeškim (1-434) in mišjim ( ) receptorjem. Fuzija je znotraj ohranjene regije LRR16. Konstrukt vsebuje označevalec HA na C- končnem delu. M-LRR17-H/pUNO Himera med mišjim (1-434) in človeškim ( ) 22 Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut

39 receptorjem. Fuzija je znotraj ohranjene regije LRR16. Konstrukt vsebuje označevalec HA na C- končnem delu. H-LRR18-M/pUNO Himera med človeškim (1-474) in mišjim ( ) receptorjem. Fuzija je znotraj ohranjene regije LRR16. Konstrukt vsebuje označevalec HA na C- končnem delu. M-LRR18-H/pUNO Himera med mišjim (1-474) in človeškim ( ) receptorjem. Fuzija je znotraj ohranjene regije LRR16. Konstrukt vsebuje označevalec HA na C- končnem delu. Plazmidi z zapisom za TLR5 s točkovnimi mutacijami L198T/pUNO Plazmid z zapisom za humani TLR5 s peptidnim M226T/pUNO označevalcem AU1 na N-končnem delu in s točkovno A249T/pUNO mutacijo v ektodomeni. Konstrukt je pripravljen v A255T/pUNO vektorju za izražanje v sesalskih celicah puno. F256T/pUNO E471A/pUNO E471R/pUNO E476A/pUNO E476H/pUNO D496A/pUNO D496R/pUNO Plazmidi z zapisom za flagelin SaTy/pET19b Genski konstrukt zapisa za flagelin bakterije S. typhimurium v vektorju za izražanje v bakterijah, pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS. SaTy/pRP4 Zapis za flagelin bakterije S. typhimurium v vektorju za testiranje gibljivosti. Plazmidi z zapisom za točkovne mutante flagelina R90N/pET19b Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. E93R/pET19b typhimurium, ki vsebuje točkovno mutacijo v R90N-E93R/pET19b primarnem vezavnem mestu, v vektorju pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS. D455A/pET19b Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. D457A/pET19b typhimurium, ki vsebuje točkovno mutacijo v C- Y458A/pET19b končni domeni D0, v vektorju za izražanje v T476A/pET19b bakterijah pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS in C-končni označevalec strep. R476A/pET19b Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium, ki vsebuje točkovno mutacijo v C- končni domeni D0, v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS. L479A/pET19b Q484A/pET19b P486A/pET19b N488A/pET19b S491A/pET19b R494E/pET19b VLSLL_5A/pET19b Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium z substitucijo petih aminokislin (ak ) v C-končni domeni D0 v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS. R90N/pRP4 Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. E93R/pRP4 typhimurium z mutacijo v primarnem vezavnem R90N-E93R/pRP4 mestu v vektorju za testiranje gibljivosti bakterij, prp4. D455A/pRP4 Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. D457A/pRP4 typhimurium z mutacijo v C-končni domeni D0 v Y458A/pRP4 vektorju za testiranje gibljivosti bakterij, prp4. Vida Forstnerič, Tjaša Plaper, Kemijski Inštitut Karolina Ivičak-Kocjan, Kemijski inštitut Edward Miao, Institute for Systems Biology, Seattle Karolina Ivičak-Kocjan, Kemijski inštitut 123 Vida Forstnerič, Tjaša Plaper, Kemijski Inštitut Vida Forstnerič, Tjaša Plaper, Kemijski Inštitut Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut 123,124 Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut 23

40 R476A/pRP4 T467A/pRP4 L479A/pRP4 Q484A/pRP4 P486A/pRP4 N488A/pRP4 S491A/pRP4 R494E/pRP4 VLSLL_5A/pRP4 Plazmidi z zapisom za modificirane variante flagelina SFΔD0/pET19b Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilne domene in brez domene D0 (vključuje ak , 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS. dim-l 15 -SFΔD0/pET19b Plazmid z zapisom za dimerni flagelin SFΔD0. Prvi SFΔD0 (opisan zgoraj) je povezan preko svojega C- končnega dela s peptidnim povezovalcem dolgim 15 ak z N-končnim delom naslednjega flagelina SFΔD0. Konstrukt je pripravljen v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS. dim-l 27 -SFΔD0/pET19b Plazmid z zapisom za dimerni flagelin SFΔD0. Prvi SFΔD0 (opisan zgoraj) je povezan preko svojega C- končnega dela s peptidnim povezovalcem dolgim 27 ak z N-končnim delom naslednjega flagelina SFΔD0. Konstrukt je pripravljen v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b. Vsebuje N-končni označevalec HIS. dim-l 71 -SFΔD0/pET19b Plazmid z zapisom za dimerni flagelin SFΔD0. Prvi SFΔD0 (opisan zgoraj) je povezan preko svojega C- končnega dela s peptidnim povezovalcem dolgim 71 ak z N-končnim delom naslednjega flagelina SFΔD0. Konstrukt je pripravljen v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b. Vsebuje N-končni označevalec SaTy-CD0(HePy) /pet19b SaTy- CD0(HePy) mut /pet19b HIS. Plazmid z zapisom za flagellin bakterije S. typhimurium (SaTy; ak 1-454) z spoke regijo in domeno D0 flagelina bakterije H. pylori (HePy; ak ). Konstrukt je pripravljen v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b in vsebuje N-končni označevalec HIS. Plazmid z zapisom za flagellin bakterije S. typhimurium (SaTy; ak 1-454) s spoke regijo in domeno D0 flagelina bakterije H. pylori (HePy; ak ). V C-končnem delu proteina smo uvedli zamenjavo petih ak HePy v ak, ki se na teh mestih pojavljajo pri SaTy (R454E, E460T, Y477S, R491S, T494R; štetje se nanaša na SaTy). Konstrukt je pripravljen v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b in vsebuje N-končni označevalec HIS. Plazmidi z zapisom za inhibitorne različice flagelina inhflic/pet19b Plazmid z zapisom za flagelin bakterije S. typhimurium brez variabilne domene in brez domene D0 (vključuje ak , 13 ak dolg peptidni povezovalec in ak ) v vektorju za izražanje v bakterijah pet19b. Vsebuje točkovne mutacije Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut 124 Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut 124 Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut Vida Forstnerič, Kemijski Inštitut 24

41 E83R, E93R, R124D, Q128E, Q130E in K135E in N- končni označevalec HIS. IP SaTy/pcDNA3 Plazmid z zapisom za kratek peptid iz flagelina S. typhimurium (ak ) v vektorju za izražanje v sesalskih celicah, pcdna3. Peptid ima na N- končnem delu preprotripsinsko zaporedje, označevalec FLAG in zaporedje štirih ak za indukcijo nastanka alfa heliksa (SPED), v tem zaporedju. Na C- končnem delu ima zaporedje SPED in označevalec AU1. IP SaTy mut /pcdna3 Plazmid z zapisom za kratek peptid iz flagelina S. typhimurium (ak ) v vektorju za izražanje v sesalskih celicah, pcdna3. Peptid ima na N- končnem delu preprotripsinsko zaporedje, označevalec FLAG in zaporedje štirih ak za indukcijo nastanka alfa heliksa (SPED), v tem zaporedju. Na C- končnem delu ima zaporedje SPED in označevalec AU1. Peptid vsebuje točkovni mutaciji E83R in E93R. IP LisMo/pcDNA3 Plazmid z zapisom za kratek peptid iz flagelina L. monocytogenes (ak ) v vektorju za izražanje v sesalskih celicah, pcdna3. Peptid ima na N- končnem delu preprotripsinsko zaporedje, označevalec FLAG in zaporedje štirih ak za indukcijo nastanka alfa heliksa (SPED), v tem zaporedju. Na C- končnem delu ima zaporedje SPED in označevalec AU Celične kulture in njihovo gojenje Celično linijo embrionalnih ledvičnih celic, HEK293 (ang. human embryonic kidney cells HEK; ATCC CRL-157) in celično linijo pljučnih epitelijskih celic A549 (Invivogen) smo gojili v mediju DMEM z dodatkom 10-odstotnega FBS (Gibco). Celični liniji smo vzdrževali v inkubatorju pri 37 C in 5-odstotnem CO2. Celična linija HEK vsebuje potrebne komponente signalne poti receptorja TLR5 in izraža zelo nizke količine endogenega receptorja. Celična linija A549 izraža receptor TLR5 in sekretorno obliko alkalne fosfataze (SEAP) pod kontrolo od NF-κB odvisnega promotorja. 25

42 3.1.4 Protitelesa Protitelesa, uporabljena za imunodetekcijo: - primarna zajčja poliklonska protitelesa proti označevalcu FLAG (F7425, Sigma) - primarna mišja monoklonska protitelesa proti označevalcu His (34670, Qiagen) - primarna mišja monoklonska protitelesa proti označevalcu Strep (34850, Qiagen) - sekundarna kozja poliklonska protitelesa proti težki in lahki verigi zajčjih protiteles IgG, konjugirana s hrenovo peroksidazo (ab6721, Abcam) - sekundarna kozja poliklonska protitelesa proti mišjim protitelesom IgG, konjugirana s hrenovo peroksidazo (sc-2005, Santa Cruz) 3.2 Metode Metode molekularnega kloniranja Vse konstrukte, ki smo jih pripravlili za namen tega doktorskega dela, smo pripravlili z metodo lepljenja po Gibsonu (ang. Gibson assembly) 125. Z ustreznimi oligonukleotidnimi začetniki smo z verižno reakcijo s polimerazo (ang. polymerase chain reaction ali PCR) segmentom DNA, ki smo jih želeli združiti, dodali baznih parov homologije na mestih, kjer smo želeli, da se zlepijo. Pomnožke smo nato združili v ustreznih razmerjih z mešanico reagentov za lepljenje po Gibsonu, inkubirali 1 h na 50 C in transformirali v kompetentne bakterijske celice DH5α. Iz posameznih klonov smo izolirali plazmidno DNA (GeneJET, Plasmid Miniprep Kit, Fermentas) ter ustreznost zaporedja preverili z določanjem nukleotidnega zaporedja (GATC Biotech) Dvojni luciferazni test Pri testu luciferane aktivnosti v celice sočasno vnesemo dva reporterska plazmida. Aktivnost kresničkine luciferaze (FluC) odraža aktivacijo od NF- κb odvisne signalne poti. Aktivnost Renilla luciferaze (RluC) pa nam služi za normalizacijo, saj je izražena pod konstitutivnim promotorjem. Celice HEK293 smo nasadili na mikrotitersko ploščo s 96 luknjami (Corning) po 2 2,5 104 celic/luknjo (0,1 ml). 24 h po nasaditvi smo celice s transfekcijskim reagentom jetpei (Polyplus Transfection) transficirali z ELAM1-luciferazo (Fluc) (50 ng/luknjo) in phrl-tk (Rluc) (5 ng/luknjo) ter s plazmidi z zapisom za receptor TLR5 ali njegove različice. S praznim plazmidom pcdna3 smo v vseh lunkjnah izenačili celokupno količino transficirane DNA. 24 ur po transfekciji smo celice stimulirali s flagelinom oziroma z različicami flagelina in jih po 18 h lizirali v pasivnem liznem pufru (Promega). V celičnih 26

43 lizatih smo izmerili luciferazno aktivnost z luminometrom Orion (Berthold Technologies). Rezultat luciferazne aktivnosti je podan v relativnih luciferaznih enotah (RLE), kot povprečje razmerja FluC/RluC za vsaj tri luknjice. Vsak poskus je bil ponovljen v vsaj treh neodvisnih ponovitvah Merjenje sekretorne alkalne fosfataze SEAP Celice A549, ki izražajo od NF-κB odvisni reporter SEAP, smo nasadili na mikrotitersko ploščo s 96 luknjami (Corning) po celic/luknjo (0,1 ml) in jih stimulirali s flagelinom. Alkalna fosfataza se izloča v medij, zato smo po 10 urah pobrali supernatante, jih inkubirali 1 h na 65 C in določili aktivnost alkalne fosfataze SEAP z reagentom Quanti Blue po navodilih proizvajalca (Invivogen). Vsak poskus smo izvedli v vsaj treh neodvisnih ponovitvah Priprava in čiščenje rekombinantnih proteinov Genske konstrukte z zapisom za rekombinantne proteine smo transformirali v bakterijski sev Escherichia coli BL21 (DE3) plyss, ki smo jih gojili pri 37 C v mediju Luria-Bertani (LB) z dodatkom ampicilina (50 µg/ml). Prekonočne kulture smo precepili v svež medij, jih gojili do optične gostote ~0.8 (merjeno pri 600 nm), in z dodatkom 1 mm IPTG (izopropil-β-dtiogalaktopiranozid) inducirali nastajanje proteinov. Celice smo gojili pri 37 C 4-8 h. Nato smo celice centrifugirali in lizirali v liznem pufru (10 mm TRIS ph 7.5, 1 mm EDTA, 0.1% DOC), ki smo mu dodali mešanico proteaznih inhibitorjev (Sigma P8849). Celice smo dodatno razbili s soniciranjem. Proteine s peptidnim označevalcem HIS smo nanesli na Ni- NTA kolono (Qiagen), jih s kolone eluirali v pufru s 50 mm imidazolom in 50 mm Tris (ph 8) ter dializirali proti pufru (20 mm HEPES, ph 7,5). Točkovne mutante flagelina, ki so bile v postopku priprave bolj podvržene proteolizi (D455A, D457A, Y458A, and T476A), smo dodatno očistili preko peptidnega označevalca Strep na C-končnem delu proteina. Proteine smo nanesli na sefarozno kolono Strep-Tactin (Iba) in očistili po navodilih proizvajalca. Koncentracijo proteinov smo izmerili z reagentom BCA (Pierce). Čistost proteinov smo preverili z gelsko elektroforezo SDS-PAGE in z imunodetekcijo Prenos western in imunodetekcija Celice HEK293T smo nacepili na ploščo s šestimi luknjami (Techno Plastic Products) po celic na luknjo. Prihodnji dan smo celice transficirali z 2 µg plazmida z zapisom za TLR5 ali fuzijske konstrukte na luknjo s transfekcijskim reagentom Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific). 48 h po transfekcije smo celice lizirali v liznem pufru (50 mm Tris-HCl 27

44 (ph 8), 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 137 mm NaCl, 1% Triton X-100, 1% natrijev deoksiholat (DOC), 10% glicerol, 1 mm Na 3 VO 4 in 50 mm NaF) ki smo mu dodali mešanico proteaznih inhibitorjev (Roche). Ostanke celic smo odstranili s centrifugiranjem (13200 rpm, 15 min). Celokupno koncentracijo proteinov v vzorcu smo določili z reagentom BCA (Pierce). Proteine smo ločili z SDS-PAGE elektroforezo in prenesli na nitrocelulozno membrano Hybond ECL (GE Healthcare). Membrano smo sprali (1 PBS pufer) in inkubirali v pufru za blokiranje (1 PBS, 0.1% Tween 20, 0.2% I-Block (Tropix)) preko noči na 4 C ali 1 h na sobni temperaturi. Membrane smo nato inkubirali z ustreznimi primarnimi protitelesi, redčenimi v blokirnem pufru v razmerju 1: min. Po inkubaciji smo membrane sprali (1 PBS, 0.1% Tween 20) in jih inkubirali z sekundarnimi protitelesi (1:4000) 45 min na sobni temperaturi. Po spiranju smo detektirali prisotnost sekundarnih protiteles z reagentom ECL (GE Healthcare) po navodilih proizvajalca. Primarna in sekundarna protitelesa, uporabljena v raziskavi, so navedena v poglavju Koimunoprecipitacija S koimunoprecipitacijo smo merili vezavo flagelina na TLR5. Topno ektodomeno humanega receptorja TLR5 v fuziji s Fc regijo humanega imunoglobulina IgG1 (htlr5-fc; Invivogen) smo vezali na magnetne kroglice Dynabeads, konjugirane s proteinom A (Thermo Fisher Scientific) po navodilih proizvajalca. 10 µg htlr5-fc redčenega v vodi MQ ali samo vodo MQ kot kontrolo smo inkubirali s 40 µl kroglic 1 h na sobni temperaturi in nato sprali 3 krat s pufrom (1 PBS, 0.02% Tween 20, ph 7.5). Nato smo kroglicam dodali 20 µg divjega tipa flagelina ali mutirane različice, inkubirali 1 h na sobni temperaturi in 3 krat sprali s pufrom za spiranje. Vezane proteine smo eluirali iz kroglic v 0.1% SDS pri 95 C 5 min. Flagelin v vzorcih smo detektirali s prenosom western s protitelesi proti označevalcu HIS Gibljivost bakterij Divji tip ali mutirano različico flagelina v vektorju prp4 smo s pomočjo elektroporacije (2.5 kv, 200 Ω in 25 µf v 10% glicerolu) vnesli v sev bakterije S. typhimurium z izbitim genom za flagelin (S. typhimurium FliC FljB ATCC 14028s). Bakterije smo gojili preko noči na 37 C na trdnih gojiščih LB s 50 μg/ml ampicilina in posamezne kolonije naslednji dan precepili na gojišče za testiranje gibljivosti (LB 0.3% agar, 1 mm IPTG in 50 μg/ml). Na vsako ploščo smo nacepili kolonijo transformirano z mutantnim protienom, z divjim tipom flagelina in s praznim vektorjem kot kontrolo. Plošče smo gojili preko noči na sobni temperaturi. Izmerili 28

45 smo premer vidne cone gibljivosti bakterij in rezultat podali kot odstotek ohranjene gibljivosti glede na divji tip Meritve cirkularnega dikroizma Z meritvami cirkularnega dikroizma (CD) smo določali sekundarno strukturo rekombinantnih proteinov. CD smo merili v območju med 195 in 280 nm na spektrometru Chirascan CD (Applied Photophysics) pri temperaturi 20 C. Koncentracija proteinov je bila med mg/ml v vodi MQ in širina kivete 1 mm Poravnave proteinov Zaporedja proteinov smo pridobili iz baze podatkov UniProt ( in jih poravnali s programom Clustal Omega ( Poravnave smo grafično obdelali s programom CLC Sequence Viewer ( Programska oprema Za izdelavo sliko molekul in za meritve razdalj med atomi smo uporabili program UCSF Chimera 1.10 ( Za izdelavo grafov smo uporabili program Origin 8.1 ( in program Microsoft Excel Molekularno modeliranje Strukturna modela ektodomen humanega (ak ) in mišjega (ak ) TLR5 sta bila pripravljena s programom MODELLER v na podlagi strukture TLR5 navadne cebrice (PDB oznaka 3V47). Strukturne modele in simulacijo molekularne dinamike je za namen tega doktorskega dela pripravil dr. Ajasja Ljubetič. Strukturni model človeške ektodomene TLR5 (ak ) je bil pripravljen s programom I-TASSER ( 128 na podlagi naslednjih struktur: ektodomena človeškega TLR3 (PDB koda 1ZIW in 2A0Z 34,129 ), goveji TLR4 (PDB koda 3RG1 131 ), človeški TLR4 (PDB koda 3B2D 130 ) in mišji TLR4 (PDB koda 3VQ2 132 ). Strukturni model človeškega TLR5 je pripravila doc. dr. Mojca Benčina. 29

46 4 Rezultati Za aktivacijo TLR5 je odgovoren ohranjen del flagelina, ki vključuje domeni D0 in D1 65,95,105,106. Medtem ko je vloga domene D1 pri aktivaciji receptorja TLR5 dobro okarakterizirana, ostaja vloga domene D0 neznanka. V prvem delu poglavja so prikazani rezultati raziskav, s katerimi smo dodatno potrdili vlogo domene D1 pri aktivaciji TLR5 in pomen te regije za funkcionalnost flagelina. Nadalje smo podrobno analizirali pomen domene D0 pri aktivaciji TLR5. Receptor TLR5 ima v gostitelju zaščitno vlogo pri okužbah s patogeni, po drugi strani pa je v nekaterih bolezenskih stanjih aktivacija TLR5 povezana s slabšim izidom pri bolnikih 53, Uravnavanje aktivnosti receptorja tako predstavlja potencialno tarčo za terapijo. V drugem delu poglavja je prikazano načtrovanje in priprava inhibitornega flagelina, ki ima potencialno terapevtsko vrednost pri terapiji nekaterih bolezni, kot sta cistična fibroza in Crohnova bolezen. 4.1 Mehanizem aktivacije receptorja TLR5 s flagelinom Humani in mišji receptor TLR5 se različno odzivata na mutacije flagelina v primarnem vezavnem mestu Flagelin se veže na TLR5 navadne cebrice (drtlr5) preko primarnega vezavnega mesta, ki je razdeljen na primarno vezavno površino A in B. Od obeh površin ima površina B k vezavi večji doprinos in naj bi bila tudi strukturno bolj ohranjena med človeškim in cebričinim receptorjem 40. K vezavni površini B ima največji prispevek regija okoli aminokislinskega ostanka R90 v flagelinu, ki interagira z aminokislinskimi ostanki v zanki LRR9 receptorja. Zanka LRR9 je ob vezavi flagelina podvržena strukturnim spremembam. Obe regiji, ki sodelujeta v površini B, sta med vrstami dobro ohranjeni, tako na strani liganda, kot tudi na strani receptorja. Kljub temu je mišji receptor na mutacije flagelina v primarnem vezavnem mestu manj občutljiv kot človeški 108,123. Z namenom iterpretacije razlik v odzivnosti mišjega in humanega receptorja, smo na podlagi kristalne strukture TLR5-N14 VLR /FliC-ΔD0 pripravili homologni model humanega in mišjega receptorja v kombinaciji s flagelinom bakterije Salmonella typhimurium (SaTy) v predelu primarnega vezavnega mesta. Tako kot v kristalni strukturi drtlr5 je tudi v našem modelu prišlo pri obeh receptorjih do interakcije ohranjenega dela flagelina v okolici aminokislinskega ostanka R90 z zanko LRR9 receptorja TLR5. Predvsem zanimivi sta bili mutaciji v flagelinu R90N in E93R, ki vsaka zase nista 30

47 vplivali na aktivacijo mišjega in humanega receptorja. Po drugi strani je kombinacija obeh mutant delovala sinergistično na humani, ne pa tudi na mišji receptor (slika 10A). Obe mutaciji se nahajata v ohranjeni regiji flagelina in vplivata na njegove funkcionalne lastnosti in s tem na gibljivost bakterij (slika 10B). A B Slika 10. Aktivnost človeškega in mišjega receptorja TLR5 ob stimulaciji s flagelinom z mutacijami v primarnem vezavnem mestu in vpliv mutacij na gibljivost bakterij (A) Vpliv posameznih (R90N in E93R) in dvojne (R90N-E93R) mutacije flagelina na aktivnost človeškega (htlr5) in mišjega (mtlr5) receptorja v primerjavi s stimulacijo z divjim tipom flagelina (SaTy) (B) Mutacije v primarnem vezavnem mestu flagelina vplivajo na gibljivost bakterij. Na vsaki sliki je na levi prikazana gibljivost mutante, na desni divjega tipa flagelina in spodaj negativna kontrola. Povzeto po Forstnerič in sod. 123 Razlik v odzivnosti mišjega in humanega receptorja si ni bilo mogoče razložiti na podlagi homolognega modela, zato smo pripravili simulacijo molekularne dinamike obeh receptorjev v kombinaciji z divjim tipom flagelina ali z mutantnim proteinom R90N-E93R. V skladu z eksperimentalnimi podatki smo opazili odstopanje le pri kombinaciji humanega receptorja z dvojno mutanto R90N-E93R, pri kateri je prišlo do spremembe konformacije zanke LRR9 (slika 11). Iz rezultatov mutageneze in iz strukturnega modela sklepamo, da je interakcija v primarnem vezavnem mestu med cebrico, človekom in mišjo podobna. Iz simulacij je razvidno, da je na strani receptorja, prav tako kot pri cebrici, tudi pri človeku in miši pomembna postavitev zanke LRR9, vendar je v mišjem receptorju vezava zanke bolj robustna. 31

48 htlr5 htlr5 + divji tip flagelina htlr5 + R90N-E93R zanka LRR9 mtlr5 mtlr5 + divji tip flagelina mtlr5 + R90N-E93R zanka LRR9 Slika 11. Model humanega in mišjega receptorja TLR5 v kombinaciji z divjim tipom flagelina ali mutanto R90N-E93R Flagelin v modelu je obarvan oranžno in TLR5 belo. Zanka LRR9 receptorja je obarvano modro. Prikazana je površina aminokislinskih ostankov na mestih 90 in 93 v flagelinu. (A) Model humanega receptorja TLR5 v kombinaciji z divjim tipom flagelina (levo) in mutanto R90N-E93R (desno) (B) Model mišjega receptorja TLR5 v kombinaciji z divjim tipom flagelina (levo) in mutanto R90N-E93R (desno). Povzeto po Forstnerič in sod Za aktivacijo TLR5 je ključna C-končna regija domene D0 Za aktivacijo receptorja TLR5 je ključna ohranjena, ne pa tudi hipervariabilna regija flagelina 142 (slika 12A). Konstrukt z zapisom za himerni protein SF-TLR5, v katerem je flagelin brez hipervariabilne regije (SF) preko peptidnega povezovalca povezan na N-končni del humanega receptorja TLR5, je v celicah HEK293 konstitutivno aktiven (slika 12B), medtem ko je himerni protein brez domene D0 (SFΔD0-TLR5) neaktiven, tudi ob dodatni stimulaciji s flagelinom (slika 12C)

49 A B SF-TLR5 C SFΔD0-TLR5 D2, D3 D1 D0 SF-TLR5 [ng] SFΔD0-TLR5 [ng] C N Slika 12. Aktivnost himernega receptorja SF-TLR5 (A) Na strukturi flagelina (PDB koda 1UCU) je prikazan ohranjen in hipervariabilen del molekule. (B,C) Zgoraj: shematski prikaz himernih proteinov SF-TLR5 in SFΔD0-TLR5. Spodaj: aktivnost himernih receptorjev v celicah HEK293 (B) SF-TLR5 je konstitutivno aktiven v celicah HEK293. (C) Delecija domene D0 v himernem receptorju (SFΔD0-TLR5) aktivacijo izniči (povzeto po Ivičak-Kocjan in sod. 109 ). Domena D0 flagelina bakterije S. typhimurium je sestavljena iz N- in C-končnega dela (ND0 in CD0) in vključuje aminokislinske ostanke od 1-42 in od (slika 13A). Da bi podrobneje locirali predel domene D0, odgovoren za aktivacijo TLR5, smo v konstruktu SF- TLR5 odstranili zapis za N- ali C-končni del domene D0 (SFΔND0-TLR5 in SFΔCD0- TLR5). Variabilni domeni D2 in D3, ki za aktivacijo receptorja nista ključni, sta v himernih receptorjih nadomeščeni s krajšim peptidnim povezovalcem (slika 13A). Različne količine plazmidov z zapisom za himerne proteine smo s transfekcijo vnesli v celice HEK293. Z gelsko elektroforezo in prenosom po Westernu smo preverili izražanje proteinov v celicah. Vsi himerni receptorji so se v celicah izražali v primerljivih količinah (slika 13D). Z dvojnim luciferaznim testom smo preverili aktivacijo himernih receptorjev. Delecija N-končnega dela domene D0 ni imela vpliva na aktivnost receptorja, medtem ko je delecija C-končnega dela aktivnost popolnoma izničila (slika 13B in 13C). 33

50 NF-κB (RLE) kontrola NF-κB (RLE) Flag tag A N C Flagelin S. typhimurium (SaTy) SFΔD0-TLR5 SFΔND0-TLR5 SFΔCD0-TLR5 SF-TLR5 B SFΔND0-TLR5 C D SFΔCD0-TLR5 Slika 13. Aktivnost in izražanje himernih proteinov SFΔND0-TLR5 in SFΔCD0-TLR5 v celicah HEK293 (A) Shematski prikaz domen flagelina bakterije S. typhimurium in himernih proteinov SF-TLR5, SFΔD0-TLR5, SFΔND0-TLR5 in SFΔCD0-TLR5. (B,C) Levo shematski prikaz himernih proteinov SFΔND0-TLR5 in SFΔCD0-TLR5. Desno aktivnost himernih receptorjev izraženih v celicah HEK293. Celice HEK293 smo transficirali z različnimi količinami (0,1-1,6 ng) plazmidov z zapisom za SF-TLR5 (pozitivna kontrola), SFΔD0- TLR5 (negativna kontrola), SFΔND0-TLR5 in SFΔCD0-TLR5 ter z reporterskimi plazmidi. Po 18ih urah smo v celičnih lizatih pomerili luciferazno aktivnost. (D) Prenos western himernih proteinov izraženih v celicah HEK293. Celice smo transficirali s plazmidi z zapisom za himerne receptorje ali s kontrolnim plazmidom in izražene proteine v celičnih lizatih detektirali s protitelesi anti-flag. Neaktivnost SFΔCD0-TLR5 bi lahko bila posledica napačnega zvitja ali lokalizacije himernega receptorja. Da bi to možnost izključili, smo v celicah HEK293 sočasno izrazili divji tip humanega receptorja TLR5 (htlr5) in naraščajoče količine SFΔCD0-TLR5. Rezultati kažejo, da himerni receptor tvori dimere z divjim tipom, saj koncentracijsko odvisno inhibira njegovo aktivacijo s flagelinom, kar nakazuje na pravilno strukturo in lokalizacijo SFΔCD0-TLR5 (slika 14B). Dodatni razlog za neaktivnost SFΔCD0-TLR5 bi lahko bile sterične ovire pri vezavi flagelina na primarno vezavno mesto, saj smo z delecijo C-končnega dela flagelina skrajšali razdaljo med domeno CD1 flagelina in receptorjem. Flagelin je v 34

51 NF-κB (RLE) NF-κB (RLE) Flag tag himernih konstruktih preko svojega C-končnega dela povezan na TLR5 s peptidnim povezovalcem dolgim 27 aminokislinskih ostankov. Peptidni povezovalec smo podaljšali na 57 aminokislinskih ostankov (SFΔCD0-l 57 -TLR5) (slika 14A). SFΔCD0-l 57 -TLR5 je bil v celicah izražen v primerljivi količini kot pozitivna kontrola SF-TLR5 (slika 15C). Himerni receptor SFΔCD0- l 57 -TLR5 je bil kljub podaljšanju peptidnega povezovalce neaktiven (slika 14C). Skupaj lahko na podlagi teh rezultatov sklepamo, da je neaktivnost himernega receptorja SFΔCD0-TLR5 direktna posledica delecije domene CD0 in ne steričnih ovir vezave flagelina na TLR5, napačnega zvitja ali znižanega nivoja izražanja himernega receptorja. A Flagelin S. typhimurium (SaTy) SF-TLR5 SFΔCD0-TLR5 / SFΔCD0- l 57 -TLR5 B C Slika 14. Aktivnost divjega tipa TLR5 ob sočasnem izražanju SFΔD0-TLR5 in vpliv dolžine peptidnega povezovalca na aktivnost himernega receptorja SFΔCD0-TLR5 (A) Shema himernega receptorja SFΔCD0-TLR5 z dvema različnima dolžinama peptidnega povezovalca (27 in 57 ak) (B) Aktivnost TLR5 ob sočasnem izražanju s himernim receptorjem SFΔD0 in stimulaciji s flagelinom. Celice HEK293 smo hkrati transficirali s plazmidom z zapisom za TLR5 (1 ng) in naraščajočimi količinami plazmida z zapisom za himerni receptor SFΔCD0-TLR5 (1-25 ng). 18 h po stimulaciji s flagelinom (2 ng/ml) smo celičnim lizatom pomerili luciferazno aktivnost. (C) Vpliv dolžina peptidnega povezovalca med SF in TLR5 na aktivnost himernega receptorja. Celice HEK293 smo transficirali z različnimi količinami plazmidov (0,2-1,6 ng) z zapisom za SF-TLR5, SFΔCD0-TLR5, SFΔCD0-l 57 -TLR5 in SFΔD0-TLR5 in 18 h po transfekciji v celičnih lizatih preverili luciferazno aktivnost. Konstrukt smo nadalje modificirali tako, da smo C-končni del domene D0 skrajšali za 10 ali 20 terminalnih aminokislinskih ostankov (SFΔC 10 D0-TLR5 in SFΔC 20 D0-TLR5; slika 15A). Luciferazna aktivnost je pokazala znižanje aktivacije himernih receptrojev, ki je bila v korelaciji z velikostjo delecija, vendar je bila aktivnost primerljiva z negativno kontrolo (SFΔD0-TLR5) le ob delecije celotne domene CD0 (slika 15B). Himerni receptorji so se v celicah HEK293 izražali v primerljivih količinah (slika 15C). 35

52 BNF-κB (RLE) Flag tag A Flagelin S. typhimurium (SaTy) SF-TLR5 SFΔCD0-TLR5 SFΔC 10 D0-TLR5 SFΔC 20 D0-TLR5 C Slika 15. Aktivnost in izražanje himernih receptorjev z delecijami v C-končnem delu flagelina. (A) Shematski prikaz himernih proteinov SF-TLR5, SFΔCD0-TLR5, SFΔC 10 D0-TLR5 in SFΔC 20 D0-TLR5. (B) Vpliv delecij v C-končnem delu flagelina na aktivnost himernih receptorjev. Celice HEK293 smo transficirali z naraščajočimi količinami (0,2-1,6 ng) himernih receptorjev SF-TLR5, SFΔC 10 D0-TLR5, SFΔC 20 D0-TLR5, SFΔCD0-TLR5 in SFΔD0-TLR5. Po 18 h smo v celičnih lizatih pomerili luciferazno aktivnost. (C) Prenos western himernih receptorjev izraženih v celicah HEK h po transfekciji smo v celičnih lizatih preverili izražanje proteinov s protitelesi anti-flag Določitev aminokislinskih ostankov v predelu C-končne regije flagelina, ki vplivajo na aktivacijo TLR Izbor aminoskislinskih ostankov flagelina za točkovno mutagenezo Aminokislinsko zaporadje v C-končnem delu flagelina je dobro ohranjeno tako med bakterijskimi vrstami, ki receptor TLR5 aktivirajo, kot tudi med tistimi, ki se prepoznavi izognejo 65,96. Da bi locirali posamezna mesta znotraj domene CD0, ki imajo vlogo v aktivaciji TLR5, smo na podlagi poravnave zaporedja flagelinov različnih bakterijskih vrst določili aminokislinske ostanke za točkovno mutagenezo. Kot kriterij pri izboru smo upoštevali tako razlike med aktivirajočimi in neaktivirajočimi flagelini, kot tudi ohranjenost aminokislinskih ostankov med vrstami. Poravnava C-končne domene D0 in spoke regije je prikazana na sliki 16. Za mutagenezo znotraj spoke regije smo izbrali ohranjene aminokislinske ostanke D455, D457 in Y458. Mesta znotraj domene CD0 R467, T476, L479 in N488 so med vrstami ohranjena, ali pa se na tem mestu pri različnih vrstah nahajo podobne aminokisline. Prav tako je med vrstami dobro ohranjen hidrofobni motiv na mestu , 36

53 VLSLL, zlasti trije levcini znotraj motiva. Po drugi strani se na mestih P486, S491 in R494 pojavljajo razlike med vrstami, ki TLR5 aktivirajo in tistimi, ki se imunski prepoznavi izognejo. Aminokisline, izbrane za točkovno mutagenezo in regija, izbrana za substitucijo, so prikazane na sliki 16 in sliki Slika 16. Poravnava aminokislinskega zaporedja flagelinov različnih bakterijskih vrst Za poravnavo smo uporabili zaporedja flagelina različnih bakterij s sledečimi oznakami iz baze podatkov UniProt: Salmonella typhimurium; P06179, Salmonella dublin; Q06971, Serratia marcescens; P13713, Escherichia coli; P04949, Shigella flexneri; Q08860, Legionella pneumophila; Q5ZVV0, Pseudomonas aeruginosa; P21184, Campylobacter coli; P27053, Campylobacter jejuni; P22251, Helicobacter pylori; P0A0S1, Helicobacter hepaticus; Q7VF81, Helicobacter felis; Q9XB38 in Wolinella succinogenes; Q7M7N1. Nad zaporedjem so s puščicami označeni aminokislinski ostanki izbrani za točkovno mutagenezo. S črto nad poravnavo je označena hidrofobna regija določena za substitucijo ( ). V zgornjem delu poravnave so prikazani flagelini bakterij, ki TLR5 aktivirajo in v spodnjem delu flagelini bakterij, ki se prepoznavi preko TLR5 izognejo

54 SaTy st D455A D457A Y458A R467A T467A L479A Q484A P486A N488A S491A VLSLL_5A R494E Y458 D455 R467 D457 T476 L479 Q484 P486 N488 L490 V489 S491 L492 L493 R494 Slika 17. Aminoksline izbrane za točkovno mutagenezo v domeni CD0 flagelina Priprava rekombinantnih proteinov Posamezne aminokislinske ostanke smo v flagelinu bakterije S. typhimurium zamenjali v alanin. Poleg točkovnih mutacij smo pripravili tudi mutanto z zamenjavo hidrofobnega motiva na mestu (VLSLL) s petimi alanini (VLSLL_5A). Divji tip flagelina (SaTy) in mutantne proteine smo izrazili v bakterijah in jih očistili s pomočjo afinitetne kromatografije (slika 18). Slika 18. Gelska elektroforeza izoliranega flagelina in mutiranih različic Divji tip flagelina bakterije S. typhimurium (SaTy) in mutirane različlice smo izrazili v bakterijah, očistili z afinitetno kromatografijo in očiščene proteine (2 ng) ločili z gelsko elektroforezo. 38

55 Proteine smo izolirali z afinitetno kromatografijo preko histidinske oznake na N-končnem delu proteina. Nekateri mutantni proteini so bili v postopku izolacije močno podvrženi proteolizi in tako neprimerni za nadaljne poskuse. Mutacija arginina na mestu 494 v alanin (R494A) je povzročila visoko stopnjo razgradnje proteina, medtem ko je zamenjava naboja na tem mestu (R494E) protein stabilizirala (slika 19B). V nadaljnih poskusih smo zato uporabili mutantni protein R494E. Ostalim mutatnim proteinom, podvrženim proteolizi (D455A, D457A, Y458A in T476A), smo dodali peptidni označevalec strep na C-končni del. Z imunodetekcijo smo ugotovili, da se proteini cepijo v C-končnem delu, saj s protitelesi proti označevalcu strep nismo zaznali razgradnjih produktov, medtem ko smo s protitelesi proti označevalcu his zaznali več lis proteina (slika 19A). Uvedli smo dodatno stopnjo čiščenja proteinov z afinitetno kromatografijo preko označevalca na C-končnem delu, s čimer smo se izognili kontaminaciji z razgradnjimi produkti (slika 19C). A st Y485A D4572 T476A D455A st Y485A D4572 T476A D455A B anti HIS C anti strep st R494A R494E st D455A D457A Y458A T476A Slika 19. Prenos western in gelska elektroforeza mutantnih proteinov, podvrženim proteolitski razgradnji Mutantni proteini D455A, D457A, Y458A in T476A so označeni z N-končnim oznalčevalcem his in s C- končnim označevacem strep. Na gelsko elektroforezo smo nanesli po 2 ng posameznega proteina. (A) Prenos western in imunodetekcija mutantnih proteinov. Imunodetekcija s protitelesi proti N-končemu označevalcu his (anti his, levo) je pokazala več lis posameznega mutantnega proteina, medtem ko je imunodetekcija s protitelesi proti označevalcu strep (anti strep, desno) pokazala le eno liso pri velikosti cca 50kDa. (B) Gelska elektroforeza mutantnih proteinov R494A in R494E. R494A je bil podvržen proteolitski razgradnji, medtem ko je bil R494E nerazgrajen. (C) Gelska elektroforeza mutantih proteinov D455A, D457A, Y458A in T476A, izoliranih z afinitetno kromatografijo preko C-končnega ozačevalca strep. 39

56 Stimulacija humanega in mišjega receptorja TLR5 s točkovnimi mutantami flagelina Vpliv posameznih mutacij na aktivacijsko sposobnost flagelina smo z dvojnim luciferaznim testom preverili na celicah HEK293, transficiranih z mišjim (mtlr5) ali humanim (htlr5) receptorjem (slika 20). Mutaciji v spoke regiji na mestih D457 in zlasti Y458 so znižale aktivacijo humanega receptorja. Mutacija v zgornjem delu domene CD0, R467A, je prav tako močno znižala aktivacijo htlr5, medtem ko mutacije v osrednji regiji CD0 (T476A, L479A, Q484A in P486A) na aktivacijo niso vplivale ali pa so imele manjši vpliv. Zamenjava hidrofobnega motiva VLSLL v terminalnem delu CD0 v alanine je popolnoma izničila aktivacijo htlr5, medtem ko sama sprememba serina znotraj tega motiva (S491A) na aktivnost ni vplivala. Vpliv mutantnega proteina VLSLL_5A lahko torej v celoti pripišemo hidrofobnim aminokislinskim ostankom. Tudi mutacija v končnem delu flagelina, N488A, je močno znižala aktivacijo htlr5, medtem ko zamenjava naboja zadnjega aminokislinskega ostanka, R494E, na aktivacijo ni vplivala. Za razliko od humanega receptorja je bil mišji receptor veliko manj občutljiv na vse mutacije v flagelinu. Aktivacijo mišjega receptorja močneje zniža le mutacija tirozina v spoke regiji (Y458A). Ostale mutacije na aktivacijo mišjega receptorja ne vplivajo ali imajo manjši vpliv. Slika 20. Vpliv mutacij v C-končnem delu flagelina na aktivnost humanega in mišjega receptor TLR5 Celice HEK293 smo transficirali z 1 ng humanega ali mišjega receptorja TLR5 (htlr5 zgoraj, mtlr5 - spodaj) in jih naslednji dan stimulirali z divjim tipom flagelina (SaTy) ali mutantami (0,8 in 1,6 ng). Po 18 h smo v celičnih lizatih pomerili luciferazno aktivnost. 40

57 Akt. NF-κB (A630 nm) Akt. NF-κB (A630 nm) Akt. NF-κB (A630 nm) Akt. NF-κB (A630 nm) Aktivacijsko sposobnost flagelina in nekaterih mutiranih različic smo preizkusili tudi na človeški celični liniji pljučnih epitelijskih celic A549 (slika 21). Celice A549 izražajo od NFκB odvisno sekretorno obliko alkalne fosfataze SEAP. Celice A549 smo stimulirali z divjim tipom flagelina (SaTy) ali z mutantnimi proteini in v supernatantih pomerili količino alkalne fosfataze SEAP in s tem aktivacijo transkripcijskega faktorja NF-κB. Rezultati se ujemajo s stimulacijo celic HEK293 transficiranih s humanim receptorjem TLR5. S tem smo dodatno potrdili vpliv amimnokislinskih ostankov v spoke regiji (D457 in Y458), v osrednjem delu (R467) in na koncu domene CD0 (N488 in motiv VLSLL na mestu ). A B C D v v Slika 21. Aktivacija celic A549 s flagelinom in z mutantnimi proteini Celice A549 smo stimulirali z različnimi koncentracijami (0, 1, 2,5, 5 in 50 ng/ml) divjega tipa flagelina (SaTy) ali mutantnimi proteini in po 10 h v supernatantih pomerili količino izločene alkalne fosfataze SEAP Mutacije v C-končni regiji flagelina ne vplivajo na primarno vezavo flagelina na TLR5 Iz literature je razvidno, da delecija domene D0 flagelina močno zniža aktivacijo receptorja, medtem ko na vezavo flagelina na TLR5 v kompleksu s stehiometrijo 1:1 nima bistvenega vpliva 40. V študijah vezave spremljemo vezavo flagelina na lasten TLR5, torej tvorbo kompleksa s stehiometrijo 1:1. Z imunoprecipitacijo smo želeli preveriti, ali mutacije v C- končni regiji flagelina vplivajo na vezavo na TLR5. Topno ektodomeno humanega receptorja TLR5 v fuziji s Fc regijo humanega protitelesa IgG1 smo vezali na kroglice, konjugirane s proteinom A. Preverili smo vezavo divjega tipa flagelina (SaTy) in mutantnih proteinov na kroglice s TLR5 in na kontrolne kroglice brez TLR5. Vsi mutantni proteini so se specifično 41

58 standard D455A D457A Y458A R467A SaTy standard T476A L479A Q484A P486A standard N488A S491A VLSLL_A R494E vezali na TLR5, primerljivo z divjim tipom flagelina (slika 22). Pokazali smo, da kljub močnemu vplivu nekaterih mutacij na aktivacijo receptorja, na vezavo flagelina na TLR5 v heterodimeru ne vplivajo. 72 kda 55 kda 36 kda 25 kda IP: htlr5-fc IB: Anti-His IP: - IB: Anti-His Slika 22. Imunoprecipitacija in prenos western divjega tipa flagelina in mutiranih različic z ektodomeno humanega TLR5 Na kroglice, konjugirane s proteinom A, smo vezali humani TLR5 v fuziji s Fc regijo humanega protitelesa IgG (htlr5-fc; zgoraj) ali pufer (kontrola; spodaj). Kroglice smo po spiranju inkubirali z divjim tipom flagelina (SaTy) ali mutantnimi proteini, označenimi z označevalcem his. Po spiranju in eluciji kroglic smo v vzorcih detektirali prisotnost flagelina ali mutiranih različic s protitelesi anti-his. Ti rezultati skupaj kažejo na prevladujočo vlogo spoke regije, arginina na mestu 467 in končnega dela domene CD0, ki vključuje asparagin na mestu 488 in hidrofobni motiv valina na mestu 489 in treh leucinov na mestih 490, 492 in 493 pri aktivaciji humanega receptorja TLR5. Zanimivo je, da je visoko ohranjeni hidrofobni motiv treh terminalnih leucinov odgovoren tudi za prepoznavo flagelin preko citosolnega inflamasomskega kompleksa NAIP5/NLRC Mutacije ne vplivajo na vezavo flagelina na TLR5, saj je ta predvsem odvisna od interakcij med domeno D1 flagelina in TLR5 v primarnem vezavnem mestu 40. Skladno z literaturo je mišji receptor na mutacije v flagelinu veliko manj občutljiv kot človeški 108, Vpliv mutacij v C-končni regiji flagelina na mobilnost bakterij Aminokisline v C-končnem delu flagelina so evolucijsko dobro ohranjene med bakterijskimi vrstami, saj interagirajo s sosednjimi monomerami v flageli in sestavljajo notranjo površino kanala, skozi katerega poteka prenos flagelinskih monomerov do distalnega konca pri elongaciji flagele. S testom gibljivost smo želeli preveriti vpliv uvedenih mutacij na funkcionalnost flagelina in povezavo med funkcijo in imunostimulatornimi lastnostmi. Divji tip flagelina bakterije S. typhimurium (wt) in mutantne proteine smo izrazili v sevu bakterije S. typhimurium z izbrisanim genom za flagelin (S. typhimurium FliC-/FljB-) in preverili 42

59 gibljivost na mehkih agarnih ploščah (slika 23). Učinek gibljivosti bakterij glede na divji tip smo uvrstili v tri kategorije: mutacije, ki močno zmajšajo gibljivost (+), mutacije s zmernim vplivom na gibljivost (++) in mutacije, ki povečajo gibljivost bakterij (+++). Izmed mutacij, ki imajo velik vpliv na aktivacijo TLR5, sta mutacija Y458A v spoke regiji in substitucija VLSLL_5 v končnem predelu flagelina močno vplivali tudi na gibljivost, medtem ko je imela mutacija R467 na gibljivost zmerni vpliv. Zamenjava na mestu 488 iz asparagina v alanin (N488A), ki je aktivacijo TLR5 bistveno znižala, pa je gibljivost bakterij celo povečala. Po drugi strani so nekatere mutacije, ki na aktivacijo TLR5 niso vplivala, imele na gibljivost znatni vpliv (T476A, L479A). Iz teh rezultatov lahko zaključimo, da kljub temu, da spremembe v ohranjeni domeni CD0 flagelina vplivajo na njegovo funkcionalnost in s tem na gibljivost bakterij, ni mogoče potegniti direktnih vzporednic z vplivom teh aminokislin na aktivacijo TLR5. A B Slika 23. Mutacije v C-končnem delu flagelina vplivajo na gibljivost bakterij (A) V sev bakterije S. typhimurium z izbitim genom za flagelin (S. typhimurium FliC-/FljB-) smo z elektroporacijo vnesli plazmid z zapisom za divji tip flagelina (wt) ali mutirano različico. Bakterije smo nacepili na gojišče z zmanjšanim deležem agarja in po prekonočni inkubaciji ocenili vpliv mutacije na gibljivost. Na vsako ploščo smo nacepili bakterije z divjim tipom flagelina (levo) in mutanto (desno). Mutacije smo uvrstili v tri kategorije; mutacije, ki močno zmajšajo gibljivost (+), mutacije s zmernim vplivom na gibljivost (++) in mutacije, ki povečajo gibljivost bakterij (+++). (B) V tabeli je prikazan učinek posamezne mutacije na gibljivost bakterij in na aktivacijo TLR5. Učinek mutacije smo izračunali kot odstotek premera cone gibljivosti glede na divji tip. Aktivacija je izračunana kot odstotek luciferazne aktivnosti glede na divji tip (podatki na sliki 20). V tabeli so označene mutacije, pri katerih smo opazili korelacijo med vplivom na gibljivost in imunostimulatornimi lastnostmi. 43

60 4.1.6 Domena D0 se veže na sosednji monomer TLR5 v tetrameru in stabilizira aktivno obliko kompleksa flagelin-tlr5 Domena D0 zavzema v kristalni strukturi flagelina konformacijo, kot jo ima v flageli, čeprav je znano, da je domena D0 v monomerni obliki flagelina nestrukturirana 93. V naših raziskavah smo na podlagi znanih kristalnih struktur humanega TLR3 in TLR4 in kristalne strukture receptorja TLR5 navadne cebrice (danio rerio) v kompleksu s flagelinom pripravili model celotne ektodomene TLR5. Preko skrajšanega flagelina bakterije S. dublin iz kristalne strukture TLR5-N14 VLR /FliC-ΔD0 smo nalegali celotni flagelin bakterije S. Typhimurium in opazili, da bi ob vezavi flaglina na TLR5 iztegnjena konformacija domene D0 povzročila sterične ovire s plazemsko membrano (slika 24). O enakih opažanjih je poročala skupina Yoon in sod, ki je uspešno kristalizirala kompleks TLR5 s skrajšanim flagelinom 40. Plazemska membrana Slika 24. Model celotne molekule flagelina v kompleksu z ektodomeno TLR5 S programom I-tasser smo na podlagi struktur TLR3, TLR4 in kristalne strukture flagelina in TLR5 (TLR5- N14 VLR /FliC-ΔD0) pripravili model ektodomene TLR5. Preko okrnjenega flagelina bakterije S. dublin v kristalni strukturi smo nalegali cel flagelin bakterije S. typhimurium (PDB koda 1UCU). Levo; kristalna struktura TLR5- N14 VLR /FliC-ΔD0 (PDB koda 3V47), desno; model TLR5 s celim flagelinom. 44

61 Domena D1 flagelina je vezana preko primarne vezavne površine na notranjo površino ektodomene TLR5. Spoke regija, ki povezuje domeni D0 in D1 je zelo fleksibilna in omogoča zasuk domene D0 glede na preostali del flagelina. Glede na postavitev flagelina v kompleksu sklepamo, da bi se lahko domena D0 vezala na zunanjo površino sosednjega monomera TLR5' v kompleksu (slika 25). Tako bi imela domena D0 vlogo v dodatni stabilizaciji tetramernega kompleksa, potrebnega za aktivacijo. TLR5 flagelin TLR5 TLR5 flagelin TLR5 D1 D1 spoke D0 spoke D0 Notranja površina Zunanja površina TLR5 flagelin Notranja površina TLR5 Zunanja površina D1 D0 Slika 25. Predviden model postavitve domene D0 flagelina v komplesu s TLR5 Flagelin na sliki je prikazan z rumeno barvo. Zavoljo večje jasnosti slike je prikazana samo ohranjena regije (D0- D1) enega flagelina v kompleksu. TLR5 je označen z modro in TLR5' z rdečo barvo. 45

62 Domena D0 ima vlogo pri stabilizaciji aktivnega kompleksa TLR5 Za potrditev hipoteze, da ima domena D0 vlogo v stabilizaciji tetramernega kompleksa, smo neaktivni flagelin brez hipervariabilne regije in brez domene D0 (SFΔD0) kovalentno povezali s peptidnim povezovalcem dolgim 27 aminokislin v dimerno obliko, dimsfδd0 (slika 26). S tem smo skušali nadomestiti predpostavljeno vlogo domene D0 v pritegnitvi dveh monomerov v zadostno bližino za signalizacijo. Razdalja med končnima deloma flagelina (domenama D1) v kristalni strukturi znaša 73 Å (slika 27) in tak kompleks je neaktiven. Da bi preverili relevantnost takšne postavitve, smo modificirali dolžino peptidnega povezovalca v dimernem flagelinu dimsfδd0. SFΔD0 smo povezali s fleksibilnimi peptidnimi povezovalci dolgimi 15, 27 ali 71 aminokislin (dim-l 15 -SFΔD0, dim-l 27 -SFΔD0 in dim-l 71 -SFΔD0). Glede na literature sklepamo, da bi ti trije peptidni povezovalci lahko zavzemali dolžino nekje okoli 30, 40 in 53 Å, vendar natančna ocena ni enostavna, saj peptidni povezovalci predvidoma tvorijo strukturo naključnega klobčiča, ki pa je lahko presenetljivo kompaktna 144. Čistost proteinov smo preverili z gelsko elektroforezo (slika 28B). D1 D2-3 D0 SFΔD0 flagelin dimsfδd0 Slika 26. Shematski prikaz povezave dveh neaktivnih flagelinov SFΔD0 v aktiven dimer Na sliki (levo) je označena regija flagelina, ki je sama po sebi neaktivna (SFΔD0) in je predstavljala osnovo za sestavo dimernih proteinov z različno dolgimi peptidnimi povezovalci. Na desni je prikazan dimerni konstrukt v katerem je z oranžno črto ponazorjen peptidni povezovalec. V dimernih konstruktih smo uporabili peptidne povezovalce treh različnih dolžin. 46

63 Celice HEK293 smo transficirali s humanim TLR5 (1 ng) in stimulirali z divjim tipom flagelina (SaTy) ali s proteini SFΔD0 (negativna kontrola), dim-l 15 -SFΔD0, dim-l 27 -SFΔD0 in dim-l 71 -SFΔD0 (slika 28). Medtem ko je bil monomer SFΔD0 neaktiven, so vsi dimerni proteini dobro aktivirali TLR5, pri čemer je protein z najkrajšim peptidnim povezovalcem (15 ak) receptor aktiviral najboljše. Iz teh rezultatov sklepamo, da je vloga domene D0 v pritegnitvi dveh receptorjev v zadostno bližino za signalizacijo, pri čemer je konformacija aktivnega signalnega kompleksa verjetno nekoliko drugačna, kot je prikazana v kristalu TLR5-N14 VLR /FliC-ΔD0. Receptorja morata bodisi spremeniti konformacijo, bodisi se pomakniti bližje drug k drugemu. 73 Å Slika 27. Razdalja med končnima deloma flagelina v kristalni strukturi Z rdečo črto je označena razdalja 73 Å med domenama D1 flagelina v kompleksu TLR5-N14 VLR /FliC-ΔD0 (PDB koda 3V47), izmerjena s programom UCSF Chimera. 47

64 akt. NFκB (RLE) SaTy SFΔD0 Dim-l 15 -SFΔD0 Dim-l 27 -SFΔD0 Dim-l 71 -SFΔD0 A B 5,0 4,5 5 ng/ul 50 ng/ul 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 55 kda 28 kda 75 kda 55 kda 0,0 SaTy SFΔD0 dim-l15-sfδd0 dim-l27-sfδd0 dim-l71-sfδd0 Slika 28. Aktivnost kovalentno povezanih dimerov flagelina (A) Aktivnost dimernih proteinov flagelina brez domene D0 (SFΔD0) povezanih s peptidnimi povezovalci različnih dolžin. Celice HEK293 smo transficirali z 1 ng htlr5 in stimulirali s 5 ali 50 ng/ml divjega tipa flagelina (SaTy pozitivna kontrola), flagelina brez domene D0 (SFΔD0 negativna kontrola) in s flagelini brez domene D0, povezanimi s peptidnimi povezovalci v dimer (dim-l 15 -SFΔD0, dim-l 27 -SFΔD0 in dim-l 71 -SFΔD0). Po 18h smo v celičnih lizatih pomerili luciferazno aktivnost. (B) Gelska elektroforeza izoliranih proteinov Domena D0 se predvidoma veže na zunanjo površino TLR5 Pri analizi mutant v C-končni regiji flagelina smo opazili, da medtem ko sta mutanti R467A in VLSLL_5A močno znižali aktivacijo humanega receptorja TLR5, sta imeli na aktivacijo mišjega receptorja nekoliko manjši učinek (slika 20). Ektodomena receptorja TLR5 je sestavljena iz 24ih z levcinom bogatih ponovitev. Na N-končnem delu se prične z LRRNT, nato sledijo LRR1-LRR22 in na C-končnem delu še LRRCT. Pripravili smo himere med humanim in mišjim TLR5, tako da smo receptorja spojili znotraj ohranjenih motivov LRR16, 17 ali 18. Himera H-LRR16-M je sestavljena iz humanega receptorja od LRRNT do LRR16 in iz mišjega receptorja od LRR16 naprej. Komplementarna himera, M-LRR16-H, je sestavljena iz mišjega receptorja od LRRNT do LRR16 in iz človeškega receptorja od LRR16 naprej. Shematski prikaz himernih receptorjev je prikazan na sliki 29. Če se vezavno mesto za domeno D0 nahaja na ektodomeni receptorja v predelu med LRRNT in LRR16, smo pričakovali, da bi imel himerni receptor, ki je v tem predelu sestavljen iz humanega dela receptorja (H-LRR16-M), ob stimulaciji z mutanto bolj podoben aktivacijski profil humanemu receptorju, medtem ko bi imela komplementarna himera (M-LRR16-H) bolj podoben aktivacijski profil mišjemu receptorju. 48

65 ECD TM LRRNT LRRCT LRR16 LRR17 LRR18 TIR htlr5 mtlr5 H-LRR16-M M-LRR16-H H-LRR17-M M-LRR17-H H-LRR18-M M-LRR18-H Slika 29. Shematski prikaz himernih receptorjev mišjega in človeškega TLR5 Pripravili smo konstrukte z zapisom za himerne proteine, ki so sestavljeni iz človeškega (htlr5 obarvan temno sivo) in mišjega receptorja (mtlr5 obarvan svetlo sivo). V konstruktih smo receptorje spojili znotraj ohranjenih regiji LRR16, 17 in 18. Vsak himerni receptor ima svoj komplementarni par. LRR z levcinom bogata ponovitev, ECD ektodomena, TM transmembranska domena, TIR - domena Toll-interlevkinskega receptorja ali citoplazemska domena. Celice HEK293 smo transficirali z mišjim TLR5 (mtlr5), humanim TLR5 (htlr5), ali s himernimi receptorji in z dvojnim luciferaznim testom spremljali aktivacijo ob stimulacijo z divjim tipom flagelina (SaTy) in mutantama R467A in VLSLL_5A. Himerni proteini so ob stimulaciji z divjim tipom flagelina (SaTy) različno aktvirali signalno pot NF-κB (slika 30A, C). Zavoljo preglednosti rezultatov smo, za vsak himerni receptor posebej, normalizirali vrednost aktivacije z mutantnim proteinom glede na aktivacijo z divjim tipom flagelina (slika 30B, D). Stimulacija himer z mutanto VLSLL_5A (slika 30A, B) kaže na vezavo končnega hidrofobnega motiva flagelina v predelu TLR5 med LRRNT in LRR16, saj ima himerni receptor H-LRR16-M podoben aktivacijski profil kot humani receptor TLR5, medtem ko ima himerni receptor M-LRR16-H aktivacijo bolj podobno mišjemu receptorju. Podobno se nakazuje tudi pri stimulaciji himer v predelu LRR17 in 18 z mutanto VLSLL_5A. Nasprotno pa se pri stimulaciji himer z mutanto flagelina R467A nakazuje na vezavo v predelu ektodomene TLR5 med LRR16 in LRRCT. Himere v predelu LRR17 in LRR18 v tem primeru niso informativne, saj jim ne moremo pripisati značilne aktivacije mišjegega ali človeškega receptorja in tudi komplementarne zamenjave znotraj LRR17 ali 18 se na stimulacijo z mutanto R467A odzivajo podobno (slika 31). 49

66 akt. NFκB (RLE) Akt. NFκB (RLE) akt. NFκB (RLE) Akt. NFκB (RLE) A C 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 SaTy VLSLL_5A 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 SaTy R467A B D 1,4 1,2 SaTy VLSLL_5A 1,4 1,2 SaTy R467A 1,0 1,0 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0,0 0,0 Slika 30. Aktivnost himer med mišjim in človeških receptorjem TLR5 ob stimulaciji z divjim tipom flagelina in mutiranima različicama VLSLL_5A in R467A. Celice HEK293 smo transficirali z 0,5 ng mtlr5, htlr5 ali posamezne himere. Celice smo stimulirali z 1 ng divjega tipa flagelina (SaTy) ali mutantnima proteinoma VLSLL_5A in R467A in po 18 h v celičnih lizatih pomerili luciferazno aktivnost. (A, C) Aktivacija htlr5, mtlr5 in himernih receptorjev z SaTy in mutantnima proteinoma. (B, D) Normalizirane vrednosti aktivacije posameznega receptorja z mutantnim proteinom glede na aktivacijo z divjim tipom. 50

67 Končni hidrofobni motiv flagelina VLSLL je od arginina na mestu 467 precej oddaljen; v helikalni konformaciji znaša ta razdalja 40 Å (slika 31). Dejansko razdaljo je nekoliko težje oceniti, saj je končni del flagelina v monomerni obliki najverjetneje nestrukturiran 93. Vsekakor pa je možno, da se ta dva predela flagelina vežeta na prostorsko ločene površine na TLR5. Na podlagi poskusov s himernimi receptorji smo sklepali, da se vezavno mesto za končni hidrofobni motiv flagelina (VLSLL) nahaja nekje na ektodomeni med LRRNT in LRR16 in vezavno mesto za osrednji del domene CD0, kjer se nahaja aminokislinski ostanek R467, med LRR16 in LRRCT. S pomočjo aminokislinske poravnave in strukturnega modela TLR5 smo identificirali hidrofobne aminokislinske ostanke na zunanji površini ektodomene med LRR7 in LRR10 (površina A; L198, M226, A249, A255 in F256) in negativno nabite aminokislinske ostanke na zunanji površini ektodomene med LRR19 in LRR20 (površina B; E471, E476, D496), ki bi lahko sodelovale v vezavi domene D0 flagelina (slika 32). Razdalja med aminokislinskim ostankom F256 znotraj hidrofobne površine A in E476 znotraj površine B v modelu ektodomene je ravno 40 Å. R Å V489 L492 L493 L490 Slika 31. Regije znotraj domene CD0 flagelina, ključne za aktivacijo TLR5, so med seboj prostorsko ločene. 51

68 A Površina A Površina B B Površina A M226 A249 A255 F256 E471 LRR16 L198 E476 D496 Površina B Slika 32. Poravnava zaporedij receptorja TLR5 različnih organizmov in model ektodomene TLR5 z izbranimi aminokislinskimi ostanki, ki se nahajajo v dveh potencialnih vezavnih površinah za domeno D0 flagelina (A) Poravnava aminokislinskega zaporedja TLR5 različnih organizmov s sledečimi oznakami iz baze podatkov UniProt: Homo sapiens; O60602, Gorilla gorilla; G3SHF1, Macaca mulatta; F7G9P6, Bos taurus; Q2LDA0, Mus musculus; Q9JLF7, Rattus norvegicus; G3V6F8, Gallus gallus; C4PCK0 in Danio rerio; B3DIN1. (B) Aminokislinski ostanki znotraj hidrofobne površine A in negativno nabite površine B izbrani za točkovno mutagenezo, prikazani na modelu ektodomene človeškega TLR5. 52

69 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 akt. NF-κB (RLE) Akt. NF-κB (RLE) Da bi preučili vpliv posameznih aminokislinskih ostankov na aktivacijo receptorja, smo hidrofobne aminokislinske ostanke spremenili v polarne in negativno nabite nadomestili bodisi z alanini, bodisi s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki. V primeru vezave flagelina na hidrofobno regijo smo pričakovali zmanjšanje aktivacije pri stimulaciji z divjim tipom flagelina na račun delno porušene hidrofobna interakcija. Znižanje aktivacije receptorja smo opazili pri dveh mutiranih različicah receptorja, L198T in M226T. Mutacije A249T, A255T in F256T na signalizacijo recepotorja niso vplivale (slika 33B). Nadalje smo pričakovali, da bi efekt mutacije lahko izničili s stimulaciji mutantnih receptorjev z dimerno obliko flagelina, dimsfδd0. Za dimerno obliko flagelina dimsfδd0 namreč predvidevamo, da smo s peptidnim povezovalcem nadomestili vlogo domene D0 v povezovanju dveh monomerov receptorja. Če je znižanje aktivacije mutatnih receptorjev posledica okvarjene vezave domene D0, bi lahko z dimernim flagelin dimsfδd0 ta efekt izničili (slika 33A). V tem primeru smo pričakovali, da bi bila aktivacija mutantnih receptorjev z dimsfδd0 višja od aktivacije z divjim tipom flagelina. Vendar pa pri nobenem od mutatnih receptorjev nismo opazili povišane stopnje aktivacije ob stimulaciji z dimsfδd0 (slika 33C). A B 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 1 ng SaTy 10 ng SaTy C ng/ml 10 ng/ml 50 ng/ml htlr5 L198T M226T Slika 33. Vpliv mutacije znotraj hidrofobne površine na ektodomeni TLR5 na aktivnost receptorja (A) shematski prikaz postavitve domene D0 v kompleksu s flagelinom in vloge peptidnega povezovalca v dimsfδd0. Levo aktivacija divjega tipa receptorja z divjim tipom flagelina (SaTy); sredina aktivacija mutantnega receptorja s SaTy; desno aktivacija mutatnega recepotrja z dimsfδd0. (B,C) Celice HEK293 smo transficirali s plazmidom z zapisom za htlr5 ali mutirano različico receptorja, jih stimulirali s SaTy (1, 5, 10 ali 50 ng/ml) ali z dimsfδd0 (5, 10 ali 50 ng/ml) in v celičnih lizatih pomerili luciferazno aktivnost. 53

70 Akt. NF-κB (RLE) V primeru nabite vezavne površine smo prav tako pričakovali znižanje aktivacije ob stimulaciji z divjim tipom flagelina. Celice HEK293 smo transficirali s plazmidi z zapisom za htlr5 in mutantne proteine in jih stimulirali z divjim tipom flagelina (SaTy). Opazili smo znižano aktivacijo pri vseh mutantnih receptorjih (slika 34) SaTy 5 ng/ml SaTy 50 ng/ml 0 Slika 34. Vpliv mutacij znotraj negativno nabite površine na ektodomeni TLR5 na aktivnost receptorja Celice HEK293 smo transficirali s plazmidom z zapisom za htlr5 ali mutirano različico receptorja, jih stimulirali s SaTy (5 ali 50 ng/ml) in v celičnih lizatih izmerili luciferazno aktivnost. Podobno kot pri mutacijah znotraj hidrofobne površine, smo tudi za mutacije znotraj negativne površine predvidevali, da bi lahko efekt mutacij izničili s stimulacijo z dimerno obliko flagelina dimsfδd0. V tem primeru bi pričakovali višjo stopnjo aktivacije ob stimulaciji z dimsfδd0, kot pa z divjim tipom flagelina SaTy. Vendar pa tudi pri mutacijah znotraj negativno nabite površine na ektodomeni TLR5 nismo opazili povrnjene aktivacije ob stimulaciji z dimsfδd0 (slika 35). 54

71 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 Akt. NF-κB (RLE) Akt. NF-κB (RLE) SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 SaTy dimsfδd0 Akt. NF-κB (RLE) Akt. NF-κB (RLE) A B 25 C ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml D htlr5 E471A E471R 5 ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml E htlr5 E476A E476R 5 ng/ml 50 ng/ml 100 ng/ml htlr5 D496A htlr5 D496R Slika 35. Stimulacija mutant receptorja TLR5 z dimernim flagelinom dimsfδd0. (A) shematski prikaz postavitve domene D0 v kompleksu s flagelinom in vloge peptidnega povezovalca v dimsfδd0. Levo aktivacija divjega tipa receptorja z divjim tipom flagelina (SaTy); sredina aktivacija mutantnega receptorja s SaTy; desno aktivacija mutatnega recepotrja z dimsfδd0. (B - E) Celice HEK293 smo transficirali s plazmidom z zapisom za htlr5 ali mutirano različico receptorja in jih stimulirali s SaTy ali z dimsfδd0 (5, 50 ali 100 ng/ml). V celičnih lizatih smo izmerili luciferazno aktivnost. Mutacije v ektodomeni receptorja bi lahko vplivale na strukturo receptorja in s tem preprečila pravilno lokalizacijo na membrani. Takšen receptor ne bi bil sposoben vezave liganda in efekt mutacije bi si lahko napačno razlagali. Izvedli smo test inhibicije, v katerem smo v celice sočasno trasficirali plazmid z zapisom za divji tip receptorja in plazmid z zapisom za mutirano različico receptorja. Vsi mutantni receptorji, ki so vplivali na aktivnost, so tudi znižali aktivacijo divjega tipa receptorje TLR5 ob stimulaciji s flagelinom (slika 36). Iz tega sklepamo, da mutatni receptorji tvorijo dimere z divjim tipom in tekmujejo za vezavo liganda. 55

72 akt. NFκB (RLE) ng/ml SaTy htlr5 L198T M226T E476A E476H E471A E471R D496A D496R ng htlr5 5 ng htlr5 Slika 36. Aktivnost divjega tipa TLR5 ob sočasnem izražanju z mutantnimi receptorji. Celice HEK293 smo transficirali s plazmidom z zapisom za divji tip TLR5 (5 ng) ali sočasno s plazmidom z zapisom za divji tip TLR5 (5 ng) in z naraščajočimi količinami plazmidov z zapisom za mutantne receptorje (0, 5 in 10 ng). Za kontrolo smo enak postopek transfekcije izvedli tudi z naraščajočimi količinami plazmida z zapisom za sam divji tip TLR5 (na grafu levo). Celice smo stimulirali s flagelinom (SaTy, 1 ng/ml) in po 18 h v celičnih lizatih pomerili luciferazno aktivnost Bakterija Helicobacter pylori se izogne imunski prepoznavi preko modifikacij v C-končni regiji flagelina Kljub visoki stopnji ohranjenosti domen D0 in D1 obstajajo razlike med bakterijami, tako v strukturi protofilamentov, kot tudi v aktivacijski sposobnosti flagelina. Bakterija Helicobacter pylori spada v razred ε-proteobakterij, ki se izognejo prepoznavi preko receptorja TLR5 in tvorijo značilno strukturo protofilamenta, sestavljenega iz sedmih monomernih podenot flagelina 91,100. Raziskava Andersen-Nissen in sod. je identificirala aminokislinske ostanke znotraj domene D1 flagelina bakterij iz razreda ε-proteobakterij, ki so pripomogle k izognitvi prepoznave preko TLR5 in dodatne komepenzacijske mutacije, ki so hkrati omogočale ohranitev gibljivosti 65. Zanimalo nas je, ali so bile za izognitev imunske prepoznave poleg identificiranih modifikacij v domeni D1 potrebne modifikacije tudi drugje v ohranjemnem delu flagelina. V ta namen smo pripravili himerni protein, v katerem je domena CD0 flagelina bakterije S. typhiurium (SaTy), ki spada v razreda γ-proteobakterij, zamenjana z domeno CD0 flagelina bakterije H. pylori (HePy), iz razreda ε-proteobakterij. Himerni protein je poimenovan SaTy-CD0(HePy) (slika 37A). Celice HEK293, transficirane s humanim TLR5, smo stimulirali z različnimi koncentracijami SaTy in himernega proteina (slika 37B). Ugotovili smo, da zamenjava C-končnega dela domene D0 popolnoma izniči aktivacijo himernega proteina pri nižji koncentraciji, medtem ko se aktivnost nekoliko ohrani pri višji 56

73 Akt. NF-κB (RLE) Akt. NF-κB (A 630nm ) koncentraciji (50 in 100 ng/ml) (slika 37B). Dodatno smo aktivacijsko sposobnost himernega proteina SaTy-CD0(HePy) preizkusili tudi na celični liniji A549 (slika 37C). Rezultati na celični liniji A549 so primerljivi z rezultati na celicah HEK293, le da je himerni protein nekoliko slabše aktiven tudi pri višjih koncentracijah (50 in 100 ng/ml). Ti rezultati nakazujejo, da so bile za evolucijsko prilagoditev ε-proteobakterij potrebne spremembe, ki zajemajo celoten ohranjen del flagelina in ne samo domeno D1, kjer se nahaja regija primarnega vezavnega mesta. A Flagelin S. typhimurium (SaTy) SaTy z domeno CD0 od H. pylori (SaTy-CD0(HePy)) B C Slika 37. Domena D0 prispeva k izognitvi imunske prepoznave bakterije H. pylori (A) Shematski prikaz flagelina S. typhimurium in himernega proteina SaTy-CD0(HePy) (B) Celice HEK293 smo transficirali s htlr5 (1 ng), jih stimulirali z naraščajočimi koncentracijami SaTy ali SaTy-CD0(HePy) (0 100 ng/ml) in v celičnih lizatih po 18 h pomerili luciferazno aktivnost. (C) Celice A549 smo stimulirali z različnimi koncentracijami (0, 10, 50 in 100 ng/ml) divjega tipa flagelina (SaTy) ali SaTy-CD0(HePy) in po 10 h v supernatantih pomerili količino izločene alkalne fosfataze SEAP. Aminokislinska sekvenca je med domenama D0 SaTy in HePy dobro ohranjena. Podrobneje smo preučili poravnavo obeh zaporedij in določili aminokislinske ostanke, ki se med bakterijama bolj izrazito razlikujejo po naboju ali hidrofobnosti. Izbrali smo kombinacijo petih aminokislinskih ostankov in jih v konstruktu SaTy-CD0(HePy) spremenili nazaj v aminokislinske ostanke, ki se na tem mestu nahajajo v proteinu SaTy (slika 38A). Tak himerni protein, SaTy-CD0(HePy) mut, je kazal povrnjeno aktivacijo v primerjavi s SaTy-CD0(HePy) ob stimulaciji celic HEK293, transficiranih s htlr5 in celic A549 (slika 38C in D). S tem poskusom smo identificirali dodatne aminokisline, ki so omogočale, da je bakterija H. pylori zaobšla ta del imunske prepoznave. Z meritvami spektra cirkularnega dikroizma smo preverili ustreznost sekundarne strukture proteinov SaTy-CD0(HePy) in SaTy-CD0(HePy) mut (slika 38B). Čistost proteinov smo preverili z gelsko elektroforezo (slika 38E). 57

74 Akt. NF-κB (RLE) A Flagelin S. typhimurium (SaTy) SaTy z mutirano domeno D0 od H. pylori (SaTy-D0(HePy) mut ) B Cirkularni dikroizem (mdeg) D Valovna dolžina [nm] C E Slika 38. Aminokislinski ostanki znotraj domene D0, ki prispevajo k izognitvi imunske prepoznave bakterije H. pylori (A) Shematski prikaz strukture proteinov SaTy in SaTy-CD0(HePy) mut. Prikazana je aminokislinska poravnava domen CD0 flagelina bakterij S. typhimurium in H.pylori in izbor aminokislinskih ostankov za mutagenezo. (B) S cirkularnim dikroizmom smo preverili ustreznost sekundarne strukture himernih proteinov SaTy-CD0(HePy) in SaTy-CD0(HePy) mut v območju od 195 do 240 nm. Koncentracija himernih proteinov in divjega tipa flagelina (SaTy) je bila 0,5 mg/ml. (C) Celice HEK293 smo transficirali s htlr5 (1 ng) in stimulirali z različnimi koncentracijami divjega tipa (SaTy) ali himernih proteinov SaTy-CD0(HePy) in SaTy-CD0(HePy) mut. Po 18 h smo pomerili luciferazno aktivnost. (D) Celice A549 smo stimulirali z divjim tipom (SaTy) ali s himernimi proteini SaTy-CD0(HePy) in SaTy-CD0(HePy) mut in po 10 h v supernatantih pomerili količino izločene alkalne fosfataze SEAP. (E) Čistost himernih proteinov SaTy-CD0(HePy) in SaTy-CD0(HePy) mut (2 µg) smo preverili z gelsko elektroforezo. 58

75 4.2 Inhibitorni flagelin Signalizacija flagelina preko receptorja TLR5 ima pri infekciji z nekaterimi patogeni zaščitno vlogo, po drugi strani pa je aktivacija receptorja TLR5 povezana z nekaterimi boleznimi, med drugim s cistično fibrozo in Chronovo boleznijo, kjer je flagelin kot prevladujoči antigen povezan s kroničnim ali prekomernim imunskim odzivom v pljučnem oz. črevesnem epiteliju 81,145. Naš namen je bil priprava inhibitorne oblike flagelina, ki bi imela potencialno terapevtsko vrednost pri omenjenih boleznih. Flagelin tvori, poleg primarnih interakcij s TLR5 v heterodimeru, dodatne interakcije s sosednjim receptorjem (TLR5 ), ki naj bi stabilizirale aktivni tetramerni kompleks. To območje je imenovano sekundarna dimerizacijska površina. Vključuje pozitivno nabite in polarne aminokislinske ostanke v N-končni domeni D1 flagelina, ki tvorijo interakcije z ohranjenimi aminokislinskimi ostanki konveksne površine TLR5 med LRR12 in 13 (slika 39). S354 A378 K135 D356 Q130 G380 Q128 D381 D382 R124 Slika 39. Dimerizacijska površina med flagelinom in sosednjim receptorjem TLR5 v kompleksu Aminokisline, ki interagirajo v sekundarni dimerizacijski površini so obarvane zeleno (TLR5) in rumeno (flagelin). Oznake aminokislinskih ostankov flagelina so podčrtane. 59

76 Predvidevali smo, da bi uvedba negativnega naboja na tem mestu v flagelinu povzročila odboj znotraj sekundarne dimerizacijske površine in s tem preprečila tvorbo aktivne oblike kompleksa, medtem ko bi ostala primarna vezava intaktna. V preteklih raziskavah smo opazili, da imata dve varianti flagelina z mutacijo v primarnem vezavnem mestu, E89R in E93R, nekoliko izboljšan aktivacijski potencial glede na divji tip flagelina. Sklepali smo, da bi ti dve mutaciji lahko izboljšali vezavo v primarnem vezavnem mestu. V flagelin smo vnesli omenjeni modifikaciji v primarno vezavno mesto (E83R in E93R) in uvedli negativni naboj na štirih mestih v sekundarni dimerizacijski površini (R124D, Q128E, Q130E in K135E). Odstranili smo variabilni domeni D2 in D3, ki na aktivacijo TLR5 ne vplivata in domeno D0, za katero predvidevamo, da se veže na sosednji TLR5 v kompleksu. Protein smo poimenovali inhibitorni flagelin oz. inhflic in je prikazan na sliki 40. Slika 40. Predvidena struktura inhibitornega flagelina V strukturi flagelina (PDB koda 1UCU) je z modro označena regija, ki sestavlja inhibitorni flagelin (inhflic). V inhibitornem flagelinu smo uvedli modifikacije znotraj primarnega vezavnega mesta (obarvane zeleno) in modifikacije znotraj dimerizacijskega mesta (obarvane oranžno). 60

77 akt. NFκB (RLE) akt. NFκB (RLE) Celice HEK293 smo transficirali s humanim receptorjem TLR5 (htlr5) in jih nato sočasno stimulirali z divjim tipom flagelina (SaTy) in naraščajočimi količinami inhibitornega flagelina inhflic (slika 41). TLR5 zaznava flagelin v pikomolarnem območju. Inhibitor smo preizkusili v piko- in nanomolarnem območju. InhFliC v nasprotju s pričakovanji ni inhibiral signalizacije z divjim tipom flagelina. Možna razlaga je, da bi mutacije v sekundarnem dimerizacijskem mestu lahko vplivale na strukturno integriteto primarnega vezavnega mesta. Po drugi strani pa je možno, da v kristalni strukturi ni zaobjeto celotno sekundarno vezavno mesto, saj je kristaliziran le del ektodomene do začetka LRR14 in tudi nekatere regije flagelina, za katere je bilo s študijami mutageneze pokazano, da sodelujejo pri aktivaciji TLR5, v kristalni strukturi ne igrajo vidne vloge 40,106. Možno bi torej bilo, da so v stabilizaciji tetramernega kompleksa udeležene dodatne regije flagelina in uvedene mutacije v dimerizacijskem mestu pri preprečevanju tvorbe aktivnega kompleksa ne zadostujejo. 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 PBS 480 pm 7 pm 30 pm 60 pm 120 pm inhflic SaTy inhflic + 7 pm SaTy 240 pm 480 pm 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 PBS 7 pm 2 nm 4 nm 20 nm 40 nm SaTy inhflic + 7 pm SaTy Slika 41. Inhibitorna sposobnost inhflic Celice HEK293 smo transficirali s humanim receptorjem TLR5 (0,5 ng) in po 24 h stimulirali s kontrolo (PBS), inhibitornim flagelinom (inhflic), divjim tipom flagelina (SaTy) in z divjim tipom flagelina, ki smo mu dodajali inhibitorni flagelin v različnih koncentracijah (levo: 30 do 480 pm; desno: 2 do 40 nm) Iz kristalne strukture je razvidno, da ima največji prispevek k vezavi flagelina na lasten TLR5 primarno vezavno mesto B, ki vključije aminokislinske ostanke znotraj vijačnic αnd1a in αnd1b flagelina. Da bi se izognili vprašanjem v povezavi s sekundarnim vezavnim mestom, ki se je porajalo kot razlaga za nedelovanje inhflic, smo načrtovali novo obliko inhibitorja. Načrtovali smo kratke peptide, v katere smo vključili le predel flagelina, udeležen v primarnem vezavnem mestu B (slika 42). V literaturi smo zasledili podatek, da flagelin bakterije Listeria monocytogenes nekoliko boljše aktivira receptor TLR5 kot flagelin bakterije Salmonella typhimurium 108. Predvidevali smo, da bi bila lahko višja aktivacija posledica 61

78 močnejše vezave v primarnem vezavnem mestu. Klub temu, da je ta predel flagelina dobro ohranjen med bakterijama S. typhimurium in L. monocytogenes, je v aminokislinski sekvenci med njima nekaj razlik. Načrtovali smo tri različice inhibitornega peptida (IP) (slika 42). Prvi izvira iz flagelina S. typhimurium (IP SaTy). Drugi vsebuje zgoraj omenjeni mutaciji, E83R in E93R, za katere smo v preteklih raziskavah opazili izboljšano aktivacijo TLR5 (IP SaTy mut ) in tretji izvira iz flagelina bakterije L. monocytogenes (IP LisMo). Vsem trem peptidom smo dodali na N- in C-konec zaporedje štirih aminokislin (SPED), ki predvidoma pripomorejo k zvitju strukture v alfa vijačnico 146,147. IP SaTy Izhaja iz flagelina bakterija Salmonella typhimurium IP SaTy mut Izhaja iz flagelina bakterija S. typhimurium, vključuje mutaciji E89R in E93R IP LisMo Izhaja iz flagelina bakterije Listeria monocytogenes Slika 42. Model in opis inhibitornih peptidov Na levi je prikazana predvidena struktura inhibitornega peptida, vezanega v primarno vezano mesto na TLR5. Na desni so navedene različice pripravljenih inhibitornih peptidov. Zapis za peptide smo vnesli v ekspresijski vektor za izražanje v sesalskih celicah, ki omogoča izločanje proteinov v medij. Celice HEK293, transficirane s plazmidi z zapisom za posamezen peptid smo v različnih razmerjih gojili v kokulturi s celicami, ki so izražale receptor TLR5 in reporterske plazmide. Kokulturo smo stimulirali s flagelinom (SaTy) bodisi istočasno z združitvijo celic v kokulturi, bodisi z zamikom po združitvi. Z dvojnim luciferaznim testom smo preverili aktivacijo receptorja TLR5. Ugotovili smo, da signalizacijo flagelina preko TLR5 najbolje inhibira peptid, ki izvira iz flagelina bakterije L. monocytogenes, IP LisMo. Pri razmerju kokultiviranih reporterskih in produkcijskih celic 1:1 je peptid IP LisMo signalizacijo z divjim tipom flagelina znižal za cca. polovico. Peptid IP LisMo deluje inhibitorno tako pri hkratni stimulaciji s flagelinom, kot tudi v primeru, ko smo celice najprej združili v kokulturo in jih stimulirali s flagelinom kasneje. Po drugi strani peptida IP SaTy in IP SaTy mut, ki izvirata iz flagelina bakterije S. typhimurium, izkazujeta nekoliko slabše inhibitorne lastnosti. 62

79 ns HEKTLR5 1:1 1:2 1:3 HEKTLR5 1:1 1:2 1:3 HEKTLR5 1:1 1:2 1:3 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 HEK TLR5 HEK TLR5 HEK TLR5 ns HEKTLR5 2:1 1:2 HEKTLR5 2:1 1:2 HEKTLR5 2:1 1:2 Akt. NF-κB (RLE) Akt. NF-κB (RLE) HEKTLR5 : HEKIP HEKTLR5 :: HEKIP HEKTLR5 : HEK : HEKIP IP SaTy IP SaTymut IP IP LisMo 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 HEK TLR5 HEK TLR5 HEK TLR5 HEK HEKTLR5 TLR5 : HEK HEKTLR5 TLR5 : HEK : HEKTLR5 TLR5 : HEK HEKIP IP HEK HEKIP IP HEK HEKIP IP IP IP SaTy IP IP SaTymut mut IP LisMo Slika 43. Inhibitorna sposobnost kratkih peptidov Celice HEK293 smo transficirali s plazmidom z zapisom za htlr5 in reporterskimi plazmidi, ali s plazmidom z zapisom za enega izmed inhibitornih peptidov (IP). Različno tranficirane celice smo 24 h po transfekciji združili v različnih razmerjih in količino izenačili s celicami, transficiranimi s kontrolnim plazmidom pcdna3. Celice smo stimulirali s flagelinom bodisi s 4 urnim zamikom po kokultivaciji (zgoraj), bodisi istočasno z združitvijo (spodaj). 63

80 Sistem priprave peptidov v sesalskih celicah je ustrezen za izbor inhibitornih peptidov, vendar ne omogoča natančnejšega ovrednotenja njihovih inhibitornih lastnosti, saj je koncentracija proizvedenega peptida v supernatantu neznana. Konstrukte z zapisom za peptide smo prenesli v plazmide za izražanje v bakterijah, peptide izrazili in jih izolirali z afinitento kromatografijo. Tako pri izolacji, kot tudi pri nadaljnem shranjevanju, so bili peptidi podvrženi razgradnji in tako neprimerni za nadaljne poskuse. V nadaljevanju bi bilo potrebno peptidno strukturo modificirati, na primer z uvedbo disulfidne vezi med alfa vijačnicama, ki bi strukturo stabilizirala in morda preprečila proteolitsko razgradnjo. 64

81 Diskusija Flagela oz. biček je organel številnih po Gramu pozitivnih in negativnih bakterij, ki jim omogoča gibanje in kemotakso in s tem kolonizacijo določenih bioloških niš. Strukturna integriteta flagelina, kot glavnega sestavnega elementa flagele, je tako za te bakterije ključnega pomena. Za receptorje prirojene imunosti je značilno, da prepoznavajo ohranjene vzorce mikroorganizmov, ki so velikokrat pomembni za njihovo preživetje. Od leta 2001, ko so raziskovalci odkrili človeški receptor, ki v gostitelju zaznava prisotnost flagelina 46, so se nizale številne raziskave o naravi te interakcije. Študije mutageneze in delecije so opredelile mesta na ligandu in receptorju, pomembne za aktivacijo 95,106,108,142,148,149. Leta 2012 objavljena kristalna struktura dela ektodomene TLR5 navadne cebrice in fragmenta flagelina ponuja pomembne informacije o načinu vezave flagelina na receptor 40. Izmed interakcijskih površin, opisanih v kristalni strukturi, je najpomembnejša in tudi najbolj ohranjena primarna vezavna površina med regijo flagelina v okolici aminokisline R90 in zanko LRR9 receptorja (slika 44). Ob vezavi flagelina je zanka LRR9 podvržena strukturnim spremembam in tvori žleb, kamor se veže arginin na mestu 90 in glutamat na mestu 114 (številčenje aminokislinskih ostankov se nanaša na flagelin bakterije S. dublin). Ta interakcija velja za t.i.»hot spot«vezave. Tudi med najrazličnejšimi flagelini se na mestu 90 v flagelinu konsistentno pojavljajo nabite ali polarne aminokisline in na mestu 114 negativno nabite aminokisline. Prav tako so dobro ohranjene aminokisline v okolici. Kasnejše strukturne študije in študije mutageneze nakazujejo, da je mehanizem skupen za prepoznavo flagelinov različnih bakterijskih vrst

82 Slika 44. Zanka LRR9 receptorja je ob vezavi flagelina podvržena strukturnim spremembam Povzeto po Yoon in sod. 40 Po drugi strani pa so na strani liganda evolucijske razdalje med vrstami večje. Človeški in cebričin receptor si delita le 37-odstotno enakost, medtem ko je ta odstotek med človeškim in mišjim receptorjem večji (72%). Kljub visokemu odstotku enakosti smo opazili razlike med mišjim in človeškim receptorjem v občutljivosti na spremembe flagelina znotraj primarne vezavne površine. Na podlagi homolognega modela mišjega in človeškega receptorja smo pokazali, da so, podobno kot pri cebričinem receptorju, v primarnem vezavnem mestu ključne interakcije med zanko receptorja LRR9 in med predelom okoli aminokisline R90 flagelina. Simulacije molekularne dinamike so pokazale, da zanka človeškega receptorja od flagelina disociira, če uvedemo spremembo na dveh ohranjenih pozicijah znotraj primarnega vezavnega mesta, R90N in E93R. Po drugi strani je vezava zanke LRR9 mišjega receptorja stabilnejša, saj je konformacija enaka pri vezavi divjega tipa flagelina in mutirane različice. Na ta način smo delno pojasnili razlike v odzivnosti mišjega receptorja, vsaj za regijo primarne vezave. Ti rezultati so zanimivi predvsem zato, ker je zanka LRR9 med mišjim in človeškim receptorjem dobro ohranjena. Razlikujeta se le v dveh aminokislinskih ostankih. Ena izmed razlik, alanin na mestu 267 v človeškem receptorju, ki ustreza prolinu na mestu 268 v mišjem receptorju, je bila v študiji Andersen-Nissen in sod. že povezana z različnim odzivom človeškega in mišjega receptorja na flagelin 108. Tudi sicer se je v omenjeni študiji mišji receptor izkazal za manj občutljivega na spremembe v flagelinu in za boljše odzivnega na stimulacijo s flagelini 66

83 različnih bakterijskih vrst. Prav tako smo v naši raziskavi opazili, da tudi spremembe drugje v flagelinu (v domeni D0) na mišji receptor, za razliko od človeškega, praktično nimajo vpliva. Razlike v zaznavi tako težko pripišemo eni sami regiji na receptorju, saj so mutacije v domeni D0 in v primarnem vezavnem mestu med seboj prostorsko precej oddaljene. Lahko da gre za kombinacijo manjših razlik na vseh vezavnih površinah za flagelin na mišjem TLR5, ki povzročajo celokupno robustnejšo vezavo liganda. Po drugi strani pa lahko da obstajajo razlike tudi drugje, na primer v signalizacijskih domenah receptorja, ki omogočajo različen odziv ob enaki afiniteti vezave liganda. Razlike v prepoznavi ligandov so opazili tudi pri drugih receptorjih TLR. Človeški receptor TLR4 na primer za razliko od mišjega razlikuje med penta in heksa acilirano obliko LPS-a 151. Tudi pri TLR2 so opazili razlike med mišjim in človeškim receptorjem pri prepoznavi različnih lipopeptidov 152. Prav tako se mišji in človeški TLR9 razlikuje pri prepoznavi razporeditve CpG motivov v oligonukleotidih 153. Kljub številnim podobnostim med mehanizmi imunske prepoznave človeka in miši je evolucijska razdalja med nami velika (med 65 in 75 milijoni let). Na račun razlik v morfologiji, fiziologiji, življenski dobi in razvoja v različnih ekoloških nišah, smo tekom evolucije prihajali v stik z različnimi patogeni in z različno velikim bremenom patogenov, proti katerim smo razvili ustrezne obrambne mehanizme 154. Mišji modeli v imunoloških študijah in širše predstavljajo nepogrešljivi člen pri prenosu znanja v klinične študije in v končni fazi v klinično prakso. Ligandi receptorjev TLR imajo velik potencial predvsem na področju razvoje adjuvansov za cepiva. Znanje o razlikah v prepoznavi ligandov med mišjimi in človeškimi receptorji je pomembno pri prenosu izsledkov iz živalskih modelov. Pomembna stopnja aktivacije receptorjev TLR je dimerizacija. Vezava liganda povzroči bodisi konformacijske spremembe receptorja, bodisi pritegne dva monomera receptorja v dimer. Ustrezna konformacija dimernega receptorja nato omogoča vezavo adapterskih molekul in sprožitev signalne kaskade. Nekateri receptorji TLR so predvidoma že v odsotnosti liganda v dimerni obliki. Vezava liganda nato povzroči konformacijsko spremembo, ki omogoči aktivacijo. Kristalna struktura receptorja TLR8 v kombinaciji z ligandom ali brez njega nazorno pokaže konformacijsko spremembo receptorja ob vezavi liganda 42. Za TLR9 so študije z uporabo fluorescentnih proteinov pokazale, da naj bi se receptor na membrani nahajal v obliki dimera in da vezava liganda povzroči spremembo konformacije, ki vodi v aktivacijo 155. Po drugi strani pa je TLR9 v kristalni strukturi brez liganda v obliki monomera 43. Razlike so lahko posledica različnih pogojev preučevanja; v celicah so receptorji vsidrani v 67

84 membrano, kar do neke mere omejuje njihovo gibanje v prostoru. Interakcije, ki so prisotne in vivo niso nujno vidne tudi v in vitro pogojih, kjer se preučuje le del molekule v raztopini. Za receptor TLR5 ni popolnoma jasno, v kakšni konformaciji se nahaja v neaktivnem stanju. Dve študiji nakazujeta obstoj preformiranih dimerov receptorja TLR5. V prvi študiji se cepljeni fluorescentni proteini, kovalentno povezani na TLR5, sestavijo že v odsotnosti liganda 60. Druga, študija humanega receptorja TLR5 z elektronsko mikroskopijo, nakazuje formacijo nesimetričnega dimera TLR5 v odsotnosti flagelina 156. V takem dimeru je izpostavljeno samo eno primarno vezavno mesto za flagelin, medtem ko je na drugi molekuli TLR5 v paru to mesto zakopano v vmesni površini med receptorjema. To pomeni, da bi morala biti vezava flagelina kooperativna. Vezava enega flagelina bi morala spremeniti strukturo dimera in šele nato bi se lahko na sosednjo molekulo TLR5 vezal drugi flagelin, da bi nastala simetrična struktura s stehiometrijo 2:2, kot jo vidimo v kristalu. flagelin flagelin TLR5 D1 D1 D0 D0 Plazemska membrana Slika 45. Model predvidenega načina vezave domene D0 flagelina v signalnem komplesku flagelin-tlr5 V kristalni strukturi TLR5 so razvidna mesta med LRR12 in 13, kjer pride do kontakta med dvema ektodomenama (TLR5 TLR5') in med flagelinom in sosednjo ektodomeno (FliC TLR5'). Te interakcije imajo predvideno vlogo v dimerizaciji receptorja TLR5. Vendar pa te interakcije očitno ne zadoščajo za tvorbo aktivne oblike kompleksa, saj flagelin v obliki kot je v kristalu, brez domene D0, ni sposoben aktivacije receptorja. Vezave flagelina na TLR5 v predelu med LRR11 in 17, kjer se nahaja predvideno dimerizacijsko mesto, v raztopini niso 68

85 zaznali, medtem ko so zaznali šibko vezavo flagelina na TLR5 v predelu med LRR17 in LRRCT 157. Rezultati nakazujejo, da so za stabilizacijo aktivnega kompleksa potrebne dodatno regije, ki niso vključene v kristalno strukturo. Da domena D0 ni vključena v kristalni strukturi flagelina in TLR5 ni presenetljivo. Domena D0 se je izkazala za problematično že pri kristalizaciji flagelina, saj je bil ta uspešno kristaliziran šele po odstranitvi domene D0 in dela domene D1. Tak fragment je imel molekulsko maso 41 kda in so ga poimenovali F41 (Samatey et al. 2001). Kristalna struktura celotnega flagelina je bila pridobljena na podlagi atomskega modela flagelarnega filamenta in fragmenta F41 (Yonekura et al. 2003). Domena D0 v kristalni strukturi flagelina tako zavzema konformacijo obvite vijačnice, kot jo ima v flageli, medtem ko je znano, da je ta domena v monomerni obliki flagelina nestrukturirana 93. Tudi ob vezavi flagelina na TLR5 ni mogoča strukturirana konformacija domene D0, vsaj ne v iztegnjeni obliki, saj bi povzročila sterične ovire z plazemsko membrano (slika 45). Predvidevali smo, da ima domena D0 flagelina, ki manjka v kristalni strukturi, vlogo v dodatni stabilizaciji tetramernega kompleksa. Glede na postavitev flagelina v strukturi smo predvidevali, da se domena D0 zasuka proti sosednjemu receptorju v kompleksu, TLR5', se nanj veže in s tem poveže dve monomerni enoti receptorja v aktivno obliko (slika 45). Sklepamo torej, da sta za aktivacijo receptorja nepogrešljivi dve regiji flagelina; regija, ki zagotavlja primarno vezavo (domeno D1) in regija, ki sodeluje pri dimerizaciji receptorskega kompleksa (domena D0). Za potrditev te hipoteze smo dve neaktivni obliki flagelini, brez domene D0, povezali s peptidnim povezovalcem v dimer. Tak dimerni flagelin je sestavljen iz domene D1, ki zagotavlja primarno vezavo flagelina na lastni receptor, predvidena vloga domene D0, dimerizacija, pa je nadomeščena s peptidnim povezovalcem (slika 46). Po naših pričakovanjih se je tak dimer (dimsfδd0) izkazal za aktivnega, v nasprotju z monomerno obliko (SFΔD0), ki receptorja ne aktivira. Sklepamo, da je aktivnost dimerne oblike kratkega flagelina posledica uspešne dimerizacije receptorskega kompleksa. Druga možna razlaga za povišano aktivacijsko sposobnost dimerne oblike kratkega flagelina je, da smo preko dimerizacije zgolj povečali avidnost in lokalno koncentracijo liganda. Po našem mnenju je ta razlaga manj verjetno, saj gre za povrnitev aktivacijske sposobnosti neaktivne oblike flagelina (SFΔD0). Nadalje smo preučili razdalje v kompleksu TLR5 in flagelina v kristalni strukturi. Z variacijo dolžine peptidnega povezovalca v dimernem konstruktu smo pokazali, da je postavitev receptorja v aktivni obliki verjetno nekoliko drugačna, kot je prikazana v kristalu. V kristalu je namreč razdalja med koncema flagelina 73 Å, medtem ko v naših raziskavah receptor uspešno stimulira že dimerni konstrukt s predvideno razdaljo med koncema flagelina 69

86 30 Å. Predvidevamo, da sta v aktivnem kompleksu receptorja bodisi pomaknjena bližje drug k drugemu, bodisi pride do strukturne spremembe v naklonu receptorja, ki omogoča aktivacijo. Da pride do dodatnih strukturnih sprememb ni presenetljivo, saj v kristalni strukturi niso vključeni vsi deli molekul, ki so za aktivacijo potrebni in tako kristalna struktura ne oriše celovitega mehanizma aktivacije. flagelin flagelin TLR5 D1 D1 D0 Plazemska membrana Peptidni povezovalec Slika 46. Model predvidene vloge peptidnega povezovalca v dimernem flagelinu dimsfδd0 Domene D0 posameznih monomerov flagelina tvorijo notranjo cev in domene D1 zunanjo cev flagelarnega filamenta. Flagelin se pri tvorbi flagelarnih filamentov nalaga v votlo helikalno strukturo. Skozi sredinski kanal se pri elongaciji filamenta do distalnega konca prenašajo monomeri flagelini. Domena D0 je sestavljena iz dveh verig, ki sestavljata N- in C-končni del proteina. Pokazali smo, da je v aktivacijo receptorja TLR5 vključena le veriga C-končnega dela, medtem ko N-končni del pri aktivaciji ne igra vloge. Kljub temu, da sta obe regiji flagelina med bakterijskimi vrstami dobro ohranjeni, je ohranjenost C-končnega dela (CD0) nekoliko večja. Domena CD0 tvori notranjo površino kanala flagelarnega filamenta in tako igra pomembno vlogo v strukturi filamenta in v njegovem nastanku. Izmed vseh domen v flagelinu, imata najvišjo stopnjo ohranjenosti med vrstami N- in C-končni spoke regiji. Spoke regija je krajša fleksibilna veriga, ki povezuje domeno D0 in D1. V filamentu ta del pomembno vpliva na integriteto notranjega in zunanjega kanala in tvori interakcije s sosednjimi monomeri. Dva aminoksilinska ostanka znotraj C-končne spoke regije, D457 in Y458, sta pomembno vplivala na aktivacijo TLR5. Nadalje smo identificirali kot ključna mesta pri aktivaciji arginin na mestu 467 in aminokislinske ostanke na koncu flagelina, 70

87 vključno z asparaginom na mestu 488 in hidrofobnim motivom valina in treh levcinov v regiji Pokazali smo torej, da je za aktivacijo receptorja TLR5 potrebna dodatna, do sedaj še neidentificirana regija na flagelinu. Receptor TLR5 tako prepoznava svoj ligand preko številnih površin, razporejenih preko celotne ohranjene regije flagelina. Mesta v domeni CD0 flagelina, odgovorna za aktivacijo TLR5 so prikazana na sliki 47. Flagelin, poleg receptorja TLR5, prepoznava tudi znotrajcelični receptorski kompleks NAIP5/NLRC4. NAIP5 je v citosolu prisoten v neaktivni obliki. Vezava flagelina povzroči spremembo konformacije molekule iz neaktivne v aktivno obliko. Aktiviran NAIP5 se nato veže na NLRC4, ki se prav tako aktivira in oligomerizira v kompleks imenovan inflamasom. Znano je, da za aktivacijo NAIP5 zadošča terminalnih 35 aminokislin flagelina in da so znotraj te regije ključni trije ohranjeni levcini 143. Do sedaj je bilo splošno sprejeto, da so za aktivacijo inflamasoma in TLR5 odgovorne različne regije flagelina. V naši raziskavi smo prvič pokazali, da kljub temu, da terminalna regija flagelina sama po sebi ne zadošča za aktivacijo TLR5, sprememba terminalnega hidrofobnega motiva, ki je ključen za sestavo inflamasoma, popolnoma izniči aktivacijo. Hidrofobni motiv je popolnoma ohranjen med zelo različnimi bakterijskimi vrstami. Lahko da gre za sistem dvojne zaščite gostitelja pred vdorom patogenov tako zunajceličnih, kot tudi znotrajceličnih. Skupina Yoon in sod. je pokazala, da medtem ko so mutacije v primarnem vezavnem mestu praktično izničile aktivacijo in vezavo, delecija domene D0 na vezavo flagelina na TLR5 praktično ni imela vpliva. V raztopini niso zaznali nastanek kompleksov višjega reda, ampak le vezavo flagelina na TLR5 v stehiometriji 1:1 40. Glavni prispevek k visoki afiniteti vezave flagelina na TLR5 ima torej primarno vezavno mesto. Pričakovali smo, da mutacije v domeni CD0, enako kot delecija te domene, na vezavo flagelina na TLR5 ne bodo vplivale. V poskusih merimo namreč vezavo flagelina na TLR5 v stehiometriji 1:1. Skladno z našimi pričakovanji so se vse mutante, ne glede na njihovo aktivacijsko sposobnost, na TLR5 vezale primerljivo z divjim tipom. 71

88 D2-3 D457 Y458 R467 D1 D0 N C L490 L493 N488 V489 L492 Slika 47. Aminokislinski ostanki znotraj C-končnega dela domene D0, ki sodelujejo pri aktivaciji receptorja TLR5 Pri interpretacijo efekta flagelinskih mutant na aktivacijo TLR5 se porajata vsaj dva možna scenarija. Naša hipoteza je, da se domena D0 flagelina veže na sosednji receptor v kompleksu. Pokazali smo, da posamezne aminokislinske spremembe v domeni CD0 flagelina vplivajo na aktivacijo, ne pa tudi na vezavo flagelina na receptor. Glede na postavitev flagelina v kompleksu menimo, da bi se ta težko vezal na 'lastni' receptor. Povezava dveh neaktivnih flagelinov brez domene D0 v dimer ligandu povrne aktivacijsko sposobnost. Predvidevamo, da smo s peptidnim povezovalcem v dimernem proteinu nadomestili vlogo domene D0 v povezovanju dveh receptorjev v aktivno obliko. Ti rezultati skupaj nakazujejo na pravilnost postavljene hipoteze. Vendar pa je, zaradi tehničnih omejitev, direktna potrditev hipoteze relativno zahtevna. Ektodomena receptorja v raztopini namreč ne tvori interakcij in je v obliki monomera. Tudi ob vezavi flagelina na ektodomeno so Yoon in sod. zaznali le formacijo kompleksa flagelin:tlr5 v razmerju 1:1 40. V in vitro sistemih, v katerih merimo vezavo receptorja in liganda, so pogoji drugačni kot v celicah, kjer je receptor vsidran v membrano. Prenos dognanj iz in vitro sistemov tako pogosto ni enostaven in se moramo posluževati manj direktnih metod, da dokažemo ali ovržemo postavljene hipoteze. 72

89 Druga možnost, ki jo v naših raziskavah nismo izključili, pa je, da je v vezavo flagelina na TLR5 vpletena tretja, še neznana koreceptorska molekula. Študij, ki bi kazale v to smer, sicer ni veliko. Znano je, da se flagelin bakterije Pseudomonas aeruginoza veže na gangliozide, membransko vezane oligosaharidne molekule 158. Raziskava Ogushi in sod. celo kaže na vlogo gangliozidov kot koreceptorjev pri signalizaciji flagelina preko TLR Vendar pa kasnejša študija to teorijo ovrže, saj pokažejo, da je efekt gangliozidov neodvisen od vezave flagelina na TLR5 160 in da je interakcija med flagelinom in gangliozidi povezana predvsem z invazijo nekaterih bakterij v gostiteljsko celico, ne pa s signalizacijo preko receptorjev TLR 161. Interakcije med monomeri v flageli v predelu domene D0 so večinoma hidrofobne narave 91,162. Tako ni presenetljivo, da sta izmed mutacij, ki so signifikantno vplivale na aktivacijo receptorja TLR5, prav spremembi hidrofobnih aminokislinskih ostankov, Y458A in VLSLL_5A, močno zmanjšali gibljivost bakterij. Ti aminokislinski ostanki so direktno vpleteni v interakcije med monomeri v flageli. Atomi glavnih in stranskih verig aminokislinskih ostankov domene CD0, vključno s Q484, N488, S491 in R494, sestavljajo hidrofilno površino notranjega kanala flagele. Monomerni flagelin potuje preko notranjega kanala v nestrukturirani obliki. Proteini v nestrukturirani obliki imajo, za razliko od strukturiranih, izpostavljene številne hidrofobne stranske verige. Polarna narava notranjega kanala prispeva k hitri difuziji monomerov do distalnega konca flagele 91,163. Medtem ko mutaciji na mestih S491 in R494 rahlo znižata gibljivost bakterij, pa mutaciji na mestih N488 in Q484 gibljivost celo nekoliko povišata. Slednji mutaciji, mutaciji asparagina in glutamina v alanin, bi lahko povečali velikost notranjega kanala, brez večjega vpliva na polarnost in s tem še nekoliko olajšali prehod flagelinskih monomerov do distalnega konca flagele. Kljub temu da, vsaj na aminokislinskem nivoju, ne moremo potegniti direktnih vzporednic med imunostimulatornimi in funkcionalnimi lastnostmi flagelina, velja, da so regije, odgovorne za aktivacijo TLR5, pomembne tudi za funkcionalnost flagelina in s tem za gibljivost bakterij. Regije, ki jih bakterije na račun strukturne in funkcijske integritete težko spreminjajo, predstavljajo idealne tarče za prepoznavo s strani receptorjev prirojene imunosti. Pokazali smo, da je mišji receptor TLR5 na vse mutacije v domeni CD0 flagelina veliko manj občutljiv kot človeški. Izbrali smo dve mutaciji flagelina, R467A in VLSLL_5A, ki sta aktivacijo človeškega receptorja popolnoma izničili, medtem ko sta imeli na mišji receptor 73

90 precej manjši vpliv. Ti dve mutaciji smo uporabili kot orodje za iskanje vezavnega mesta za domeno CD0 na ektodomeni receptorja. Pripravili smo himere med človeškim in mišjim receptorjem, tako da smo receptorja spojili znotraj treh različnih ohranjenih ponovitev LRR (16, 17 in 18). Na podlagi poskusov s himernimi receptorji sklepamo, da bi se lahko hidrofobni motiv VLSLL vezal na ektodomeno nekje med LRRNT in LRR16, arginin na mestu 467 pa v predelu ektodomene med LRR16 in LRRCT. Arginin na mestu 467 in regija , kjer se nahaja hidrofobni motiv, sta med seboj precej oddaljena. V helikalni konformaciji znaša ta razdalja 40 Å. Verjetno je ta razdalja v razviti obliki domene D0 še nekoliko daljša. Aminokislinski ostanki, ki se nahajajo v sredinskem predelu domene CD0, niso bistveno vplivali na aktivacijo receptorja. Zato je možno, da bi se lahko arginin na mestu 467 in hidrofobni motiv v C-končnem predelu flagelina vezala na prostorsko ločene predele ektodomene. Glede na postavitev flagelina v kompleksu smo sklepali, da se domena CD0 veže na zunanjo površino sosednje ektodomene. Na podlagi poravnave receptorjev TLR različnih organizmov in strukturnega modela ektodomene človeškega receptorja, smo izbrali aminokislinske ostanke, ki so izpostavljeni na zunanji površini med LRR19 in 20 in bi lahko predstavljali vezavne partnerje za R467. Pokazali smo vlogo negativno nabitih aminokislinskih ostankov E471, E476 in D496 v signalizaciji receptorja ob stimulaciji z divjim tipom flagelina. Izbrane aminokisline so negativno nabite in izpostavljene na zunanji površini ektodomene. Regija ne sodeluje v primarni vezavi flagelina na TLR5, vendar mutacije v tem predelu močno znižajo aktivacijo receptorja. Sklepali smo, da bi se v ta predel ektodomene lahko vezal arginin na mestu 467 v flagelinu. Nadalje smo izmed preučevanih aminokislin določili dve hidrofobni, L198T in M226T, ki se nahajata med LRR7 in LRR10 in bi lahko bili vpleteni v vezavo končnega hidrofobnega motiva flagelina, VLSLL. Obe mutirani različici sta bili na flagelin slabše odzivni kot divji tip receptorja. Sklepali smo, da v primeru, da je slabša aktivnost mutiranih različic receptorja TLR5 res posledica slabše vezave domene D0 flagelina, bi lahko ta ekfekt izničili, če bi mutirane različice TLR5 stimulirali z dimernim flagelinom dimsfδd0. Za dimerni flagelin namreč predvidevamo, da smo s peptidnim povezovalcem nadomestili vlogo domene D0 v povezovanju dveh monomerov receptorja v aktiven dimer. Vendar pa nobena od mutiranih različic ni bila boljše odzivna na dimerni flagelin, kot na divji tip flagelina. Z uporabo dimernega flagelina dimsfδd0 torej nismo mogli potrditi, da mutacije res vplivajo na dimerizacijo receptorja. 74

91 Aminokisline v predvidenih vezavnih mestih za domeno D0 na ektodomeni TLR5 se nahajajo na izpostavljeni zunanji površini ektodomene in glede na podatke iz kristalne strukture in našega strukturnega modela ne tvorijo interakcij z domeno D1 flagelina. Zato predvidevamo, da bi lahko sodelovale v vezavi domene D0 flagelina. Znižana odzivnost mutantnih receptorjev nakazuje možnost, da je postavljena hipoteza pravilna, vendar pa tega zaradi pomanjkanja bolj direktnih dokazov ne moremo z gotovostjo trditi. Flagelin je ključen za preživetje številnih bakterij in hkrati pomemben imunogen, ki ga prepoznavajo različni receptorji znotraj kraljestva živali in rastlin. Tekom evolucije so bakterije razvile različne mehanizme, s pomočjo katerih so se sposobne izogniti imunski prepoznavi. Nekatere fitopatogene bakterije na primer izločajo molekule, ki delujejo inhibitorno na signalizacijo preko rastlinskega receptorja za flagelin, FLS2 99. Bakterija Pseudomonas aeruginosa, oportunistični patogen živali in rastlin, izloča proteazo, ki razgrajuje monomerni flagelin, kar omogoča izognitev prepoznave tako preko rastlinskega receptorja FLS2, kot tudi preko receptorja TLR Številne bakterije svoje flageline glikozilirajo. Čeprav so flagelini večinoma glikozilirani v hipervariabilnih domenah in tako glikozilacija ne vpliva na prepoznavo preko TLR5 165, pa so v primeru bakterije Burkholderia cenocepacia pokazali, da glikoziliran flagelin slabše aktivira receptor TLR5 kot neglikoziliran 166. Nekatere patogene bakterije iz razreda ε-proteobakterij, kot so Campilobacter jejuni in H. pylori, pa so se prepoznavi preko receptorja TLR5 izognile preko modifikacij ohranjene regije flagelina. Razlika na proteinskem nivoju se v primeru ε-proteobakterij manifestira tudi v strukturah višjega reda, saj imajo omenjene bakterije drugačno pakiranje flagelarnih protofilamentov. Filamenti teh bakterij so sestavljeni iz sedmih, in ne enajstih protofilamentov, kot pri γ-proteobakterijah 100. Skupina Anderesen-Nissen in sod. je identificirala modifikacije znotraj domene D1 pri bakterijah iz razreda ε-proteobakterij, ki so omogočile izognitev prepoznave preko TLR5 in kompenzatorne modifikacije, ki so hkrati omogočile ohranitev gibljivosti 65. V naši raziskavi smo določili dodatno regijo flagelina, ki prispeva k izognitvi imunske prepoznave bakterije H. pylori. Zamenjava domene CD0 flagelina bakterije S. typhimurium z domeno CD0 flagelina bakterije H. pylori je namreč izničilo aktivacijsko sposobnost takšnega himernega flagelina (SaTy-CD0(HePy)). Zamenjava petih aminokislinskih ostankov znotraj domene CD0 himernega konstrukta SaTy-CD0(HePy) nazaj v aminokislinske ostanke, ki se na tem mestu nahajajo pri bakteriji S. typhimurium, pa je himernemu proteinu nekoliko povrnilo aktivacijsko sposobnost. S temi rezultati smo pokazali, 75

92 da obstajajo razlike na aminokislinskem nivoju med flagelini ε- in γ-proteobakterij, ki so razporejene po celotni ohranjeni regiji proteina in vplivajo na njihove imunogene lastnosti. Te razlike omogočajo ε-proteobakterijam izognitev prepoznave preko receptorja TLR5. V prvem delu rezultatov smo pokazali, da spremembe določenih aminokislinskih ostankov vplivajo na aktivacijo TLR5. Pri tem je zanimivo, da imajo med izbranimi aminokislinskimi ostanki največji efekt prav tiste, ki so ohranjene pri γ- in ε-proteobakterij, kljub temu, da slednje receptorja TLR5 ne aktivirajo. Vpliv posameznih domen in točkovnih sprememb znotraj le-teh tako ne moremo obravnavati ločeno, ampak le v kontekstu celotnega proteina. Kljub temu, da zamenjava domene D0 v himernem konstruktu SaTy-D0(HePy) onemogoči aktivacijo, je pri višjih koncentracijah vseeno nekoliko bolj aktivna kot flagelin brez domene D0 (SFΔD0). To kaže na neko morebitno, šibkejšo, vezavo domene D0 flagelina bakterije H. pylori na receptor TLR5. Kljub temu, da je primarna vloga receptorja TLR5 zaščita organizma pred patogeni, pa ima lahko signalizacija receptorja negativen vpliv na organizem v povezavi z določenimi bolezenskimi stanji. Revmatoidni artritis je sistemska in kronična avtoimunska bolezen, pri kateri so ugotovili pomembno vlogo receptorja TLR5, predvidoma preko vezave še neznanega endogenega liganda v sinovialnem tkivu. Aktivacija TLR5 poveča nastanek osteoklasti, celic ki razgrajujejo kostnino. Inhibicija signalizacije TLR5 je zmanjšala razgrajevanje kosti in stopnjo vnetja v sklepih 85. Cistična fibroza je avtosomalno recesivno obolenje, ki je posledica mutacije v genu za proteinski transportni kanal CFTR (ang. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Nefunkcionalen transportni kanal povzroči okvare v pretoku tekočin preko epitelija in posledično dehidracijo mukoze, kar vodi v pogoste infekcije pljuč 167. Pljučna obolenja in prekomerna inflamacija v pljučih sodijo med glavne razloge smrti pri bolnikih s cistično fibrozo. Zaznavanje flagelina bakterije Pseudomonas aeruginosa preko TLR5 igra osrednjo vlogo v povečanem vnetju pljuč in inhibicija TLR5 v veliki meri normalizira vnetni odziv pljučnih epitelijskih celic 81. Polimorfizem v genu za TLR5, ki kodira nefunkcionalen receptor, korelira z višjo stopnjo preživetja pri tropski bolezni melioidozi, ki jo povzroča bakterija Burkholderia pseudomallei in je endemična v jugovzhodni Aziji in Avstraliji 82. Crohnova bolezen je kronična vnetna črevesna bolezen, za katero je značilna sporadična pojavnost povišanega vnetja, ki je domnevno posledica imunskega odziva na komenzalne mikroorganizme v črevesju na račun povečane prepustnosti 76

93 epitelija. Flagelin spada med glavne antigene, ki so povezani s pridobljenim in prirojenim imunskim odzivom pri Crohnovi bolezni. Dominantno negativen polimorfizem gena z zapisom za TLR5 negativno korelira s pojavnostjo Crohnove bolezni pri preučevani Judovski populaciji, medtem ko druga študija prikazuje rahlo dovzetnost za Crohnovo bolezen pri preučevani populaciji otrok in mladostnikov iz Kanade 83,84. Zaradi vpletenosti receptorja TLR5 v številnih boleznskih stanjih, smo želeli pripraviti inhibitor receptorja TLR5, ki bi bil potencialno uporaben pri zdravljenje simptomov navedenih bolezni. Iz kristalne strukture so razvidna mesta na flagelinu, ki pridejo v kontakt s sosednjim receptorjem v kompleksu in naj bi stabilizirala tvorbo aktivnega kompleksa. Predvidevali smo, da bi lahko preko modifikacij teh mest v flagelinu uvedli odboj med receptorjem in ligandom znotraj dimerizacijske površine in na ta način pripravili varianto flagelina, ki bi se vezala v primarno vezavno mesto na lastnem receptorju, a hkrati preprečeval interakcije s sosednjim receptorjem in s tem aktivacijo signalne poti. Predvidevali smo, da bi tako modificiran flagelin lahko tekmoval za vezavo z divjim tipom flagelina in deloval inhibitorno. Vendar se je izkazalo, da na ta način modificiran flagelin ne izkazuje nikakršnih inhibitornih lastnosti. Lahko da v kristalni strukturi ni zaobjeta celotna dimerizacijska površina in da modifikacije, ki smo jih uvedli, ne zadostujejo za preprečitev dimerizacije. Po drugi strani je možno, da smo z modifikacijami v dimerizacijskem mestu vplivali na integriteto primarnega vezavnega mesta. Inhibitorni flagelin, ki se slabše veže v primarno vezavno mesto, tako ne bi bil sposoben uspešnega izpodrivanja divjega tipa flagelina, oziroma tekmovanja za vezavo z divjim tipom flagelina. Načrtovanja inhibitornega flagelina smo se zato lotili na drug način. Znano je, da t.i. hot spot vezave v okolici aminokisline flagelina R90 predstavlja največji doprinos k vezavni afiniteti flagelina na TLR5. Načrtovali smo kratek peptid sestavljen iz dveh krajših alfa vijačnic flagelina, ki tvorita t.i. hot spot vezave na strani liganda. Predvidevali smo, da bi tak peptid lahko deloval inhibitorno na signalizacijo receptorja TLR5. V naših raziskavah smo uporabljali flagelin bakterije S. typhimurium, ki tudi sicer velja za modelni flagelin v strukturnih in imunoloških študijah. V literaturi pa smo zasledili podatek, da izmed različnih preizkušenih flagelinov, receptor TLR5 najbolje aktivira flagelin bakterije L. monocytogenes 108. Zato smo pripravili različne inhibitorne peptide, ki izvirajo iz flagelina bakterije S. typhimurium (IP SaTy) ali iz flagelina bakterije L. monocytogenes (IP LisMo). Peptid IP LisMo se je izkazal kot relativno dober inhibitor receptorja TLR5 ob stimulaciji z divjim tipom flagelina. Komercialno so za ihnibicijo TLR5 77

94 na voljo nekatera monoklonska protitelesa. Vendar pa je prednost kratkega inhibitornega peptida v pripravi in ceni, saj je peptide takšne dolžine možno sintetično pripraviti po relativno nizki ceni. Po drugi strani vemo, da pripravo bioloških zdravil spremljajo relativno visoke cene, povezane s pridobivanjem in predvsem s čiščenjem takšnih produktov. Menimo, da ima kratek peptidni inhibitor IP LisMo potencialno terapevtsko vrednost pri zdravljenju simptomov nekaterih bolezni, kot so revmatiodni artritis, Crohnova boelzen in cistična fibroza. 78

95 5 Sklepi V doktorskem delu smo raziskovali mehanizem aktivacije receptorja TLR5 s flagelinom. Način vezave flagelina na TLR5 je bil v veliki meri pojasnjen z objavo kristalne strukture kompleksa. Vednar pa kristalna struktura ne oriše celovitega mehanizma aktivacije receptorja, saj v strukturi manjka ključna regija flagelina, potrebna za aktivacijo receptorja TLR5, domena D0. Kristalna struktura vsebuje fragment receptorja TLR5 iz navadne cebrice. Potrdili smo, da je molekularni mehanizem vezave flagelina na TLR5 pri miši in človeku podoben kot pri navadni cebrici. Na podlagi simulacij molekularne dinamike smo pojasnili nekatere razlike v prepoznavi flagelina preko mišjega in človeškega receptorja. V doktorskem delu smo si zastavili dve hipotezi. Prva hipoteza obravnava vlogo domene D0 pri aktivaciji receptorja TLR5. Na podlagi pridobljenih rezultatov domnevamo, da se domena D0 flagelina veže na sosednji receptor v kompleksu in s tem inducira nastanek aktivne dimerne oblike receptorja. Predvidevamo, da je postavitev aktivnega kompleksa nekoliko drugačna, kot je prikazana v kristalu. Identificirali smo do sedaj še neznane predele na ligandu in receptorju, ki so udeleženi v procesu aktivacije. Pokazali smo, da so za aktivacijo odgovorni ohranjeni aminokislinski ostanki znotraj C-končne regije domene D0, medtem ko N-končna regija pri aktivaciji receptorja ne sodeluje. Identificirali smo regijo na ektodomeni receptorja TLR5, ki bi lahko bila vpletena v vezavo domene D0. Pokazali smo, da je mišji receptor veliko manj občutljiv na točkovne mutacije v flagelinu, kot človeški. Dognanja v zvezi z molekularnim mehanizmom prepoznave flagelina preko receptorja TLR5 pomembno dopolnjujejo dosedanje znanje o načinu aktivacije receptorja in predstavljajo doprinos k bazičnemu znanju na področju receptorjev TLR. Podrobno znanje o interakciji med ligandom in receptorjem bo omogočalo bolj usmerjen razvoj terapevtikov, kot so adjuvansi za cepiva. Preučevane razlike v prepoznavi liganda preko človeškega in mišjega receptorja so pomembna pri prenosu znanj iz živalskih modelov v klinične študije. V drugi hipotezi smo predpostavili, da lahko na podlagi znane strukture receptorja in liganda načrtujemo obliko inhibitornega flagelina, ki bi se na receptor TLR5 vezala in hkrati preprečili aktivacijo. Pripravili smo kratek peptidni inhibitor, ki je uspešno inhibiral signalizacijo 79

96 receptorja TLR5 ob stimulaciji s flagelinom. Signalizacija receptorja TLR5 je povezana z nekaterimi boleznimi, kot so cistična fibroza, Crohnova bolezen in revmatoidni artritis. Verjamemo, da ima peptidni inhibitor receptorja TLR5 potencialno terapevtstko vrednost pri omenjenih boleznih. 80

97 6 Literatura 1. Iwasaki, A. & Medzhitov, R. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science (80-. ). 327, (2010). 2. Cooper, M. D. & Herrin, B. R. How did our complex immune system evolve? Nat. Rev. Immunol. 10, 2 3 (2010). 3. Abbas, A. K., Lichtman, A. H. & Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology. (Elsevier Inc., 2007). 4. Mackay, I. R., Rosen, F. S., Medzhitov, R. & Janeway, C. Innate Immunity. N. Engl. J. Med. 343, (2000). 5. Germain, R. N. & Jenkins, M. K. In vivo antigen presentation. Curr. Opin. Immunol. 16, (2004). 6. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell 124, (2006). 7. Spörri, R. & Reis e Sousa, C. Inflammatory mediators are insufficient for full dendritic cell activation and promote expansion of CD4+ T cell populations lacking helper function. Nat. Immunol. 6, (2005). 8. Akira, S., Takeda, K. & Kaisho, T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat. Immunol. 2, (2001). 9. West, M. A. et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science 305, (2004). 10. Palm, N. W. & Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol. Rev. 227, (2009). 11. Pasare, C. & Medzhitov, R. Control of B-cell responses by Toll-like receptors. Nature 438, (2005). 12. Hua, Z. & Hou, B. TLR signaling in B-cell development and activation. Cell. Mol. Immunol. 10, (2013). 13. Miguel, B., Celeste, M. & Teresa, M. in Protein Kinases (InTech, 2012). doi: / Chu, H. & Mazmanian, S. K. Innate immune recognition of the microbiota promotes host-microbial symbiosis. Nat. Immunol. 14, (2013). 15. Mackey, D. & McFall, A. J. MAMPs and MIMPs: proposed classifications for inducers of innate immunity. Mol. Microbiol. 61, (2006). 16. Takeda, K. & Akira, S. Toll-like receptors in innate immunity. Int. Immunol. 17, 1 14 (2005). 17. Mogensen, T. H. Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses. Clin. Microbiol. Rev. 22, , Table of Contents (2009). 18. Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 140, (2010). 19. Round, J. L. et al. The Toll-like receptor 2 pathway establishes colonization by a commensal of the human microbiota. Science 332, (2011). 20. Clarke, T. B. et al. Recognition of peptidoglycan from the microbiota by Nod1 enhances systemic innate immunity. Nat. Med. 16, (2010). 21. Ichinohe, T. et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, (2011). 22. Bryant, C. E. et al. Advances in Toll-like receptor biology: Modes of activation by 81

98 diverse stimuli. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 50, (2015). 23. Rubartelli, A. & Lotze, M. T. Inside, outside, upside down: damage-associated molecular-pattern molecules (DAMPs) and redox. Trends Immunol. 28, (2007). 24. Abdullah, Z. et al. Scaling of immune responses against intracellular bacterial infection. EMBO J. 33, (2014). 25. Kato, H., Takahasi, K. & Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for nonself RNA. Immunol. Rev. 243, (2011). 26. Bauernfeind, F. & Hornung, V. Of inflammasomes and pathogens--sensing of microbes by the inflammasome. EMBO Mol. Med. 5, (2013). 27. Willment, J. A. & Brown, G. D. C-type lectin receptors in antifungal immunity. Trends Microbiol. 16, (2008). 28. Hashimoto, C., Hudson, K. L. & Anderson, K. V. The Toll gene of Drosophila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein. Cell 52, (1988). 29. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M. & Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spätzle/toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell 86, (1996). 30. Di Gioia, M. & Zanoni, I. Toll-like receptor co-receptors as master regulators of the immune response. Mol. Immunol. 63, (2015). 31. Jiménez-Dalmaroni, M. J., Gerswhin, M. E. & Adamopoulos, I. E. The critical role of toll-like receptors--from microbial recognition to autoimmunity: A comprehensive review. Autoimmun. Rev. 15, 1 8 (2016). 32. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M. & Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat. Rev. Immunol. 14, (2014). 33. Botos, I., Segal, D. M. & Davies, D. R. The structural biology of Toll-like receptors. Structure 19, (2011). 34. Bell, J. K. et al. The molecular structure of the Toll-like receptor 3 ligand-binding domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, (2005). 35. Choe, J., Kelker, M. S. & Wilson, I. A. Crystal structure of human toll-like receptor 3 (TLR3) ectodomain. Science 309, (2005). 36. Jin, M. S. et al. Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated lipopeptide. Cell 130, (2007). 37. Kang, J. Y. et al. Recognition of lipopeptide patterns by Toll-like receptor 2-Toll-like receptor 6 heterodimer. Immunity 31, (2009). 38. Liu, L. et al. Structural basis of toll-like receptor 3 signaling with double-stranded RNA. Science 320, (2008). 39. Park, B. S. et al. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4- MD-2 complex. Nature 458, (2009). 40. Yoon, S. et al. Structural basis of TLR5-flagellin recognition and signaling. Science 335, (2012). 41. Zhang, Z. et al. Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7 Is a Dual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA. Immunity 45, (2016). 42. Tanji, H., Ohto, U., Shibata, T., Miyake, K. & Shimizu, T. Structural reorganization of the Toll-like receptor 8 dimer induced by agonistic ligands. Science 339, (2013). 43. Ohto, U. et al. Structural basis of CpG and inhibitory DNA recognition by Toll-like receptor 9. Nature (2015). doi: /nature Wang, J., Chai, J. & Wang, H. Structure of the mouse Toll-like receptor 13 ectodomain in complex with a conserved sequence from bacterial 23S ribosomal RNA. FEBS J. 82

99 283, (2016). 45. Gay, N. J., Gangloff, M. & O Neill, L. A. J. What the Myddosome structure tells us about the initiation of innate immunity. Trends Immunol. 32, (2011). 46. Hayashi, F. et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Tolllike receptor 5. Nature 410, (2001). 47. Shibata, T. et al. PRAT4A-dependent expression of cell surface TLR5 on neutrophils, classical monocytes and dendritic cells. Int. Immunol. 24, (2012). 48. Descamps, D. et al. Toll-like receptor 5 (TLR5), IL-1β secretion, and asparagine endopeptidase are critical factors for alveolar macrophage phagocytosis and bacterial killing. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (2012). 49. Uematsu, S. & Akira, S. Immune responses of TLR5(+) lamina propria dendritic cells in enterobacterial infection. J. Gastroenterol. 44, (2009). 50. Honko, A. N. & Mizel, S. B. Effects of Flagellin on Innate and Adaptive Immunity. Immunol. Res. 33, (2005). 51. Steiner, T. S. How flagellin and toll-like receptor 5 contribute to enteric infection. Infect. Immun. 75, (2007). 52. Maaser, C. et al. Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells Express Toll-Like Receptor 5: A Binding Partner for Bacterial Flagellin. J. Immunol. 172, (2004). 53. Blohmke, C. J. et al. Innate immunity mediated by TLR5 as a novel antiinflammatory target for cystic fibrosis lung disease. J. Immunol. 180, (2008). 54. Rhee, S. H., Keates, A. C., Moyer, M. P. & Pothoulakis, C. MEK Is a Key Modulator for TLR5-induced Interleukin-8 and MIP3 Gene Expression in Non-transformed Human Colonic Epithelial Cells. J. Biol. Chem. 279, (2004). 55. Foust-Wright, C. E. et al. Hormone Modulation of Toll-Like Receptor 5 in Cultured Human Bladder Epithelial Cells. Reprod. Sci. (2016). doi: / Gewirtz, a T., Navas, T. a, Lyons, S., Godowski, P. J. & Madara, J. L. Cutting edge: bacterial flagellin activates basolaterally expressed TLR5 to induce epithelial proinflammatory gene expression. J. Immunol. 167, (2001). 57. Vijay-Kumar, M. & Gewirtz, A. T. Flagellin: key target of mucosal innate immunity. Mucosal Immunol. 2, (2009). 58. Sanders, C. J., Moore, D. A., Williams, I. R. & Gewirtz, A. T. Both radioresistant and hemopoietic cells promote innate and adaptive immune responses to flagellin. J. Immunol. 180, (2008). 59. Takahashi, K. et al. A protein associated with Toll-like receptor (TLR) 4 (PRAT4A) is required for TLR-dependent immune responses. J. Exp. Med. 204, (2007). 60. Huh, J.-W. et al. UNC93B1 is essential for the plasma membrane localization and signaling of Toll-like receptor 5. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2 7 (2014). doi: /pnas Kim, Y.-M., Brinkmann, M. M., Paquet, M.-E. & Ploegh, H. L. UNC93B1 delivers nucleotide-sensing toll-like receptors to endolysosomes. Nature 452, (2008). 62. Lee, B. L. et al. UNC93B1 mediates differential trafficking of endosomal TLRs. Elife 2, e00291 (2013). 63. Horng, T., Barton, G. M., Flavell, R. A. & Medzhitov, R. The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like receptors. Nature 420, (2002). 64. Choi, Y. J., Im, E., Chung, H. K., Pothoulakis, C. & Rhee, S. H. TRIF mediates Tolllike receptor 5-induced signaling in intestinal epithelial cells. J. Biol. Chem. 285, (2010). 65. Andersen-Nissen, E. et al. Evasion of Toll-like receptor 5 by flagellated bacteria. Proc. 83

100 Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, (2005). 66. Vijay-Kumar, M. et al. Toll-like receptor 5-deficient mice have dysregulated intestinal gene expression and nonspecific resistance to Salmonella-induced typhoid-like disease. Infect. Immun. 76, (2008). 67. Hawn, T. R. et al. Altered inflammatory responses in TLR5-deficient mice infected with Legionella pneumophila. J. Immunol. 179, (2007). 68. Andersen-Nissen, E. et al. Cutting edge: Tlr5-/- mice are more susceptible to Escherichia coli urinary tract infection. J. Immunol. 178, (2007). 69. Morris, A. E., Liggitt, H. D., Hawn, T. R. & Skerrett, S. J. Role of Toll-like receptor 5 in the innate immune response to acute P. aeruginosa pneumonia. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 297, L (2009). 70. Hawn, T. R. et al. A common dominant TLR5 stop codon polymorphism abolishes flagellin signaling and is associated with susceptibility to legionnaires disease. J. Exp. Med. 198, (2003). 71. Singh, V., Yeoh, B. S., Carvalho, F., Gewirtz, A. T. & Vijay-Kumar, M. Proneness of TLR5 deficient mice to develop colitis is microbiota dependent. Gut Microbes 6, (2015). 72. Chassaing, B., Ley, R. E. & Gewirtz, A. T. Intestinal epithelial cell toll-like receptor 5 regulates the intestinal microbiota to prevent low-grade inflammation and metabolic syndrome in mice. Gastroenterology 147, e17 (2014). 73. Atarashi, K. et al. Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota. Nature 500, (2013). 74. Atarashi, K. et al. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species. Science 331, (2011). 75. Abt, M. C. et al. Commensal bacteria calibrate the activation threshold of innate antiviral immunity. Immunity 37, (2012). 76. Mazmanian, S. K. et al. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell 122, (2005). 77. Rakoff-Nahoum, S. et al. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 118, (2004). 78. Vijay-Kumar, M. et al. Metabolic syndrome and altered gut microbiota in mice lacking Toll-like receptor 5. Science 328, (2010). 79. Oh, J. Z. et al. TLR5-Mediated Sensing of Gut Microbiota Is Necessary for Antibody Responses to Seasonal Influenza Vaccination. Immunity 41, (2014). 80. Zhang, B. et al. Prevention and cure of rotavirus infection via TLR5/NLRC4-mediated production of IL-22 and IL-18. Science (80-. ). 346, (2014). 81. Blohmke, C. J. et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J. Immunol. 185, (2010). 82. Chantratita, N. et al. Screen of whole blood responses to flagellin identifies TLR5 variation associated with outcome in melioidosis. Genes Immun. (2013). doi: /gene Vijay-Kumar, M. & Gewirtz, A. T. Role of flagellin in Crohnʼs disease: Emblematic of the progress and enigmas in understanding inflammatory bowel disease. Inflamm. Bowel Dis. 15, (2009). 84. Sheridan, J. et al. A Non-Synonymous Coding Variant (L616F) in the TLR5 Gene Is Potentially Associated with Crohn s Disease and Influences Responses to Bacterial Flagellin. PLoS One 8, e61326 (2013). 85. Kim, S.-J. et al. Ligation of TLR5 Promotes Myeloid Cell Infiltration and Differentiation into Mature Osteoclasts in Rheumatoid Arthritis and Experimental 84

101 Arthritis. J. Immunol. (2014). doi: /jimmunol Pfirschke, C. et al. Common TLR5 mutations control cancer progression. Cancer Cell 27, 1 3 (2015). 87. Rutkowski, M. R. et al. Microbially driven TLR5-dependent signaling governs distal malignant progression through tumor-promoting inflammation. Cancer Cell 27, (2015). 88. Hoste, E. et al. Innate sensing of microbial products promotes wound-induced skin cancer. Nat. Commun. 6, 5932 (2015). 89. Wilson, R. H. et al. The Toll-like receptor 5 ligand flagellin promotes asthma by priming allergic responses to indoor allergens. Nat. Med. 18, (2012). 90. Kim, J. et al. Flagellin-induced NADPH oxidase 4 activation is involved in atherosclerosis. Sci. Rep. 6, (2016). 91. Yonekura, K., Maki-Yonekura, S. & Namba, K. Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy. Nature 424, (2003). 92. Vonderviszt, F., Sonoyama, M., Tasumi, M. & Namba, K. Conformational adaptability of the terminal regions of flagellin. Biophys. J. 63, (1992). 93. Vonderviszt, F., Kanto, S., Aizawa, S. & Namba, K. Terminal regions of flagellin are disordered in solution. J. Mol. Biol. 209, (1989). 94. Yonekura, K., Maki-Yonekura, S. & Namba, K. Building the atomic model for the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy and image analysis. Structure 13, (2005). 95. Smith, K. D. et al. Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility. Nat. Immunol. 4, (2003). 96. Beatson, S. A., Minamino, T. & Pallen, M. J. Variation in bacterial flagellins: from sequence to structure. Trends Microbiol. 14, (2006). 97. Nempont, C. et al. Deletion of flagellin s hypervariable region abrogates antibodymediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, (2008). 98. Lu, Y. & Swartz, J. R. Functional properties of flagellin as a stimulator of innate immunity. Sci. Rep. 6, (2016). 99. Rossez, Y., Wolfson, E. B., Holmes, A., Gally, D. L. & Holden, N. J. Bacterial flagella: twist and stick, or dodge across the kingdoms. PLoS Pathog. 11, e (2015) Galkin, V. E. et al. Divergence of quaternary structures among bacterial flagellar filaments. Science 320, (2008) Haiko, J. & Westerlund-Wikström, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2, (2013) Kamiya, R., Asakura, S., Wakabayashi, K. & Namba, K. Transition of bacterial flagella from helical to straight forms with different subunit arrangements. J. Mol. Biol. 131, (1979) Calladine, C. R. New twists for bacterial flagella. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, (2010) Maki-Yonekura, S., Yonekura, K. & Namba, K. Conformational change of flagellin for polymorphic supercoiling of the flagellar filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, (2010) Eaves-Pyles, T. & Wong, H. Salmonella flagellin-dependent proinflammatory responses are localized to the conserved amino and carboxyl regions of the protein. J. Immunol. Balt. Md , (2001) de Zoete, M. R., Keestra, a M., Wagenaar, J. a & van Putten, J. P. M. Reconstitution of a functional Toll-like receptor 5 binding site in Campylobacter jejuni flagellin. J. Biol. 85

102 Chem. 285, (2010) Mizel, S. B., West, a P. & Hantgan, R. R. Identification of a sequence in human tolllike receptor 5 required for the binding of Gram-negative flagellin. J. Biol. Chem. 278, (2003) Andersen-Nissen, E., Smith, K. D., Bonneau, R., Strong, R. K. & Aderem, A. A conserved surface on Toll-like receptor 5 recognizes bacterial flagellin. J. Exp. Med. 204, (2007) Ivičak-Kocjan, K., Panter, G., Benčina, M. & Jerala, R. Determination of the physiological 2:2 TLR5:flagellin activation stoichiometry revealed by the activity of a fusion receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 435, 40 5 (2013) Subramanian, N. & Qadri, A. Lysophospholipid sensing triggers secretion of flagellin from pathogenic salmonella. Nat. Immunol. 7, (2006) Gewirtz, A. T. et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107, (2001) Macnab, R. M. How Bacteria Assemble Flagella. Annu. Rev. Microbiol. 57, (2003) Gómez-Gómez, L. & Boller, T. Flagellin perception: a paradigm for innate immunity. Trends Plant Sci. 7, (2002) Lightfield, K. L. et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nat. Immunol. 9, (2008) Kortmann, J., Brubaker, S. W. & Monack, D. M. Cutting Edge: Inflammasome Activation in Primary Human Macrophages Is Dependent on Flagellin. J. Immunol. 195, (2015) Feuillet, V. et al. Involvement of Toll-like receptor 5 in the recognition of flagellated bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, (2006) Vijay-Kumar, M. et al. Flagellin treatment protects against chemicals, bacteria, viruses, and radiation. J. Immunol. 180, (2008) Burdelya, L. G. et al. An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models. Science 320, (2008) Zhang, B. et al. Prevention and cure of rotavirus infection via TLR5/NLRC4 mediated production of IL-22 and IL-18. Science (80-. ). 346, (2014) Greene, C. M. et al. TLR-induced inflammation in cystic fibrosis and non-cystic fibrosis airway epithelial cells. J. Immunol. 174, (2005) Gewirtz, A. T. TLRs in the Gut. III. Immune responses to flagellin in Crohn s disease: good, bad, or irrelevant? Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G (2007) Gewirtz, A. T. Flag in the crossroads: flagellin modulates innate and adaptive immunity. Curr. Opin. Gastroenterol. 22, 8 12 (2006) Forstnerič, V., Ivičak-Kocjan, K., Ljubetič, A., Jerala, R. & Benčina, M. Distinctive Recognition of Flagellin by Human and Mouse Toll-Like Receptor 5. PLoS One 11, e (2016) Ivičak-Kocjan, K. Mehanizem aktivacije Tollu-podobnega receptorja 5 s flagelinom. (Univerza v Ljubljani, Medicinska Fakulteta, 2013) Gibson, D. D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods 6, (2009) Pettersen, E. F. et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J. Comput. Chem. 25, (2004) Eswar, N. et al. in Current Protocols in Protein Science Chapter 2, (John Wiley & Sons, Inc., 2007). 86

103 128. Zhang, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics 9, 40 (2008) Choe, J. Crystal Structure of Human Toll-Like Receptor 3 (TLR3) Ectodomain. Science (80-. ). 309, (2005) Ohto, U., Miyake, K. & Shimizu, T. Crystal structures of mouse and human RP105/MD-1 complexes reveal unique dimer organization of the toll-like receptor family. J. Mol. Biol. 413, (2011) Yoon, S., Hong, M. & Wilson, I. A. An unusual dimeric structure and assembly for TLR4 regulator RP105-MD-1. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, (2011) Ohto, U., Fukase, K., Miyake, K. & Shimizu, T. Structural basis of species-specific endotoxin sensing by innate immune receptor TLR4/MD-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (2012) Samatey, F. A. et al. Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling. Nature 410, (2001) Krivov, G. G., Shapovalov, M. V & Dunbrack, R. L. Improved prediction of protein side-chain conformations with SCWRL4. Proteins 77, (2009) Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: visual molecular dynamics. J. Mol. Graph. 14, 33 8, 27 8 (1996) Phillips, J. C. et al. Scalable molecular dynamics with NAMD. J. Comput. Chem. 26, (2005) Buck, M., Bouguet-Bonnet, S., Pastor, R. W. & MacKerell, A. D. Importance of the CMAP Correction to the CHARMM22 Protein Force Field: Dynamics of Hen Lysozyme. Biophys. J. 90, L36 L38 (2006) Vergara-Jaque, A., Comer, J., Monsalve, L., González-Nilo, F. D. & Sandoval, C. Computationally efficient methodology for atomic-level characterization of dendrimerdrug complexes: a comparison of amine- and acetyl-terminated PAMAM. J. Phys. Chem. B 117, (2013) McGibbon, R. T. et al. MDTraj: A Modern Open Library for the Analysis of Molecular Dynamics Trajectories. Biophys. J. 109, (2015) Colovos, C. & Yeates, T. O. Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic interactions. Protein Sci. 2, (1993) Shen, M.-Y. & Sali, A. Statistical potential for assessment and prediction of protein structures. Protein Sci. 15, (2006) Eaves-Pyles, T. D., Wong, H. R., Odoms, K. & Pyles, R. B. Salmonella flagellindependent proinflammatory responses are localized to the conserved amino and carboxyl regions of the protein. J. Immunol. 167, (2001) Lightfield, K. L. et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nat. Immunol. 9, (2008) Toon H. Evers, Elisabeth M. W. M. van Dongen, Alex C. Faesen, E. W. Meijer, and & Merkx*, M. Quantitative Understanding of the Energy Transfer between Fluorescent Proteins Connected via Flexible Peptide Linkers. (2006). doi: /bi061288t 145. Lodes, M. J. et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. J. Clin. Invest. 113, (2004) Kumar, S. & Bansal, M. Dissecting alpha-helices: position-specific analysis of alphahelices in globular proteins. Proteins 31, (1998) Gradišar, H. & Jerala, R. De novo design of orthogonal peptide pairs forming parallel coiled-coil heterodimers. J. Pept. Sci. 17, (2011) Mizel, S. B., West, A. P. & Hantgan, R. R. Identification of a sequence in human tolllike receptor 5 required for the binding of Gram-negative flagellin. J. Biol. Chem. 278, 87

104 (2003) Andersen-Nissen, E. et al. Evasion of Toll-like receptor 5 by flagellated bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, (2005) Song, W. S. et al. A conserved TLR5 binding and activation hot spot on flagellin. Sci. Rep. 7, (2017) Hajjar, A. M., Ernst, R. K., Tsai, J. H., Wilson, C. B. & Miller, S. I. Human Toll-like receptor 4 recognizes host-specific LPS modifications. Nat. Immunol. 3, (2002) Grabiec, A. et al. Human but not murine toll-like receptor 2 discriminates between tripalmitoylated and tri-lauroylated peptides. J. Biol. Chem. 279, (2004) Pohar, J., Kužnik Krajnik, A., Jerala, R. & Benčina, M. Minimal Sequence Requirements for Oligodeoxyribonucleotides Activating Human TLR9. J. Immunol. in press, (2015) Mestas, J. & Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J. Immunol. 172, (2004) Latz, E. et al. Ligand-induced conformational changes allosterically activate Toll-like receptor 9. Nat. Immunol. 8, (2007) Zhou, K., Kanai, R., Lee, P., Wang, H.-W. & Modis, Y. Toll-like receptor 5 forms asymmetric dimers in the absence of flagellin. J. Struct. Biol. 177, (2012) Hong, M., Yoon, S.-I. & Wilson, I. a. Recombinant expression of TLR5 proteins by ligand supplementation and a leucine-rich repeat hybrid technique. Biochem. Biophys. Res. Commun. 427, (2012) Feldman, M. et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infect. Immun. 66, (1998) Ogushi, K. et al. Gangliosides act as co-receptors for Salmonella enteritidis FliC and promote FliC induction of human beta-defensin-2 expression in Caco-2 cells. J. Biol. Chem. 279, (2004) West, a P., Dancho, B. a & Mizel, S. B. Gangliosides inhibit flagellin signaling in the absence of an effect on flagellin binding to toll-like receptor 5. J. Biol. Chem. 280, (2005) Rogers, T. J., Thorpe, C. M., Paton, A. W. & Paton, J. C. Role of lipid rafts and flagellin in invasion of colonic epithelial cells by Shiga-toxigenic Escherichia coli O113:H21. Infect. Immun. 80, (2012) Samatey, F., Imada, K. & Nagashima, S. Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling. Nature 410, (2001) Tanner, D. E., Ma, W., Chen, Z. & Schulten, K. Theoretical and computational investigation of flagellin translocation and bacterial flagellum growth. Biophys. J. 100, (2011) Bardoel, B. W. et al. Pseudomonas Evades Immune Recognition of Flagellin in Both Mammals and Plants. PLoS Pathog. 7, e (2011) Hayakawa, J. & Ishizuk, M. in Glycosylation 48352, (InTech, 2012) Hanuszkiewicz, A. et al. Identification of the Flagellin Glycosylation System in Burkholderia cenocepacia and the Contribution of Glycosylated Flagellin to Evasion of Human Innate Immune Responses. J. Biol. Chem. 289, (2014) Gadsby, D. C., Vergani, P. & Csanády, L. The ABC protein turned chloride channel whose failure causes cystic fibrosis. Nature 440, (2006). 88

105 PRILOGA 1: IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK 89

106 RESEARCH ARTICLE Distinctive Recognition of Flagellin by Human and Mouse Toll-Like Receptor 5 Vida Forstnerič 1, Karolina Ivičak-Kocjan 1, Ajasja Ljubetič 1, Roman Jerala 1,2 *, Mojca Benčina 1,2 * 1 Department of Synthetic Biology and Immunology, National Institute of Chemistry, Ljubljana, Slovenia, 2 Centre of Excellence EN-FIST, Ljubljana, Slovenia These authors are co-first authors on this work. * roman.jerala@ki.si (RJ); mojca.bencina@ki.si (MB) a11111 OPEN ACCESS Citation: Forstnerič V, Ivičak-Kocjan K, Ljubetič A, Jerala R, Benčina M (2016) Distinctive Recognition of Flagellin by Human and Mouse Toll-Like Receptor 5. PLoS ONE 11(7): e doi: /journal. pone Editor: Dipshikha Chakravortty, Indian Institute of Science, INDIA Received: November 25, 2015 Abstract Toll-like receptor 5 (TLR5) is a receptor of the innate immune system that recognizes flagellin from certain bacterial species and triggers an inflammatory response. The Salmonella dublin flagellin in complex with zebrafish TLR5 has been crystallized previously. In the present study, we extrapolate the structure of this complex using structure-guided mutagenesis to determine the recognition modes of human and mouse TLR5 receptors and demonstrate species-specific differences in flagellin recognition. In general, the recognition mode of the mouse receptor can be said to be more robust in comparison to that of the human receptor. All-atom molecular dynamics simulation showed differences between the two receptors within the primary binding region. Using a functional motility assay, we show that although the highly conserved area of the flagellin analyzed in this study encompasses key structural requirements for flagella formation, a direct correlation between immune recognition and structure on the level of amino acid residues is not observed. Accepted: June 22, 2016 Published: July 8, 2016 Copyright: 2016 Forstnerič et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Data Availability Statement: All relevant data are within the paper and its Supporting Information files. Funding: The authors acknowledge the financial support from the state budget by the Slovenian Research Agency (VF, KIK,AL, MB, RJ), EN-FIST Centre of Excellence (RJ, MB). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. Introduction Toll-like receptors (TLRs) are germline-encoded pathogen sensors of the innate immune system that recognize conserved microbial patterns and facilitate host protection against invading pathogens. TLR receptors are highly conserved in evolutionary distant species, and a common mode of recognition and activation is conserved within each TLR type. Nevertheless, differences in species-specific recognition have been observed at the level of the host (receptor) and the pathogen (ligand). In many cases, mice show more robust recognition of microbial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) in comparison to humans, such as in the case of TLR9, where the oligodeoxynucleotides (ODNs) comprising a single CpG activate mouse TLR9 but not human TLR9 [1 3], and in the case of TLR4, where tetra-acetylated lipid IVa activates mouse TLR4 but not human TLR4 [4]. Moreover, human TLR2 but not mouse TLR2 can discriminate between tripalmitoylated and trilauroylated peptides [5]. In the context of TLR5, species-specificity was demonstrated for bacterial flagellins [6] and for TLR5 because the mice and chicken receptor yield more potent responses to most flagellins, and mouse TLR5 (mtlr5) has been shown to be less sensitive to flagellin point mutations [7,8]. PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

107 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 TLR5 plays a versatile role in vertebrates innate immunity. It is expressed in antigen-presenting cells [9 12] and fibroblasts [13]. In intestinal epithelial cells, the receptor is restricted to the basolateral side [14], and it plays an important role in inflammatory bowel disease, where the barrier against bacterial invasion is disrupted [15]. In lung epithelial cells, TLR5 is expressed on the apical side [16], and it plays a role in damaging lung inflammation in cystic fibrosis [17]. Moreover, flagellin acts as a strong adjuvant, and a number of flagellin-based vaccines for infectious diseases employing flagellin and TLR5 signalling have already entered into clinical trials [18 20]. Flagellins across numerous bacterial species share a common domain structure, in which the conserved D0 and D1 domains comprise the core of the protein that is packed via intersubunit interactions into the flagellar filament, while the D2 and D3 domains, which are highly variable in sequence and length, protrude outwards from the flagellar filament [21,22]. Binding of flagellin to the TLR5 ectodomain (ECD) induces receptor dimerization [23]. Activation of TLR5 with flagellin from β- and γ-proteobacteria such as Salmonella typhimurium or Serratia marcescens triggers the MyD88-dependent signalling pathway and, subsequently, activates the transcription factor NF-κB, leading to the synthesis of pro-inflammatory cytokines. Three separate regions of flagellin involved in TLR5 activation have been identified. The crystal structure of the N-terminal fragment of zebrafish TLR5-N14 VLR in complex with S. dublin flagellin lacking the D0 domain [24] revealed that the primary binding interface for the α-helices of the D1 domain lies on the lateral side of TLR5, stretching from LRRNT to LRR10 [24] and targeting a conserved segment of the flagellin, which is important for flagellar assembly [22,25]. The heterodimer TLR5:flagellin dimerizes to form a 2:2 complex [23]. The convex side of the second TLR5 (TLR5 LRR12/13) and the C-terminal αnd1b of the primary flagellin form a secondary dimerization interface-α, which is thought to stabilize the tetrameric complex despite its small interface surface. A third region of flagellin identified to have a role in TLR5 activation is the D0 domain, which is required for receptor activation. However, its deletion only slightly impedes the binding of such a truncated flagellin variant to TLR5 [24,26,27]. In the present study, we focus on species-specificity in regard to the host species. We constructed molecular models of human TLR5 (htlr5) and mtlr5 in complex with the D1 domain of S. typhimurium flagellin based on the crystal structure of zebrafish TLR5-N14 VLR (drtlr5) in complex with S. dublin flagellin [24]. We compared the activities of flagellin and several flagellin point mutants upon stimulation of htlr5 or mtlr5 experimentally by measuring cell activation and by performing all-atom molecular simulations. Our results indicate species-specific recognition of flagellin with respect to the receptor species and demonstrate that mtlr5 is generally less susceptible to point mutations within flagellin, thus achieving more robust recognition. Despite a few differences in the structures of the binding interfaces between zebrafish and mtlr5 or htlr5, flagellin recognition appears to target the same conserved region within the D1 domain, as suggested previously [24,25]. Materials and Methods Cell Cultures and Plasmids The human embryonic kidney cell line HEK293 was cultured in complete media (DMEM, 1 g/l glucose, 2 mm L-glutamin, 10% heat-inactivated FBS (Gibco)) in 5% CO 2 at 37 C. Human THP-1 monocytes were cultured in RPMI media with 10% FBS. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from TLR4-defective C3H/HeJ mice were cultured in DMEM, 4.5 g/l glucose media with 10% FBS, streptomycin (100 μg/ml), and penicillin (100 U/ml). All experimental procedures were carried out in accordance to the law of the Republic Slovenia for Food Safety, Veterinary and Plant Protection. The law body granted the permit to the University of PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

108 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Ljubjana, Biotechnical Faculty, Department of Animal Science (Permit Number: U / 2013/3) and approved this study. The animals from which MEFs were collected were cared for in accordance with the dictates of the National Animal Welfare Law of Slovenia and experiments were supervised by expert for animal welfare. Plasmids puno-htlr5 and puno-mtlr5-ha (InvivoGen) coding for htlr5 and mtlr5, respectively, and pcdna3 (Invitrogen) were used. Wild-type S. typhimurium flagellin (SaTy) and its mutants were cloned into the pet19b expression vector (Novagen) and into the prp4 plasmid (courtesy of E. Miao, Institute for Systems Biology, Seattle) for motility assays. For site-directed mutagenesis, pet19b-saty-encoding flagellin of S. typhimurium was used [28]. The primers used in this study are described in detail in S1 Table. Production and Isolation of Bacterial Flagellins Escherichia coli BL21 cells transformed with the pet19b plasmid expressing wild-type or mutant flagellin were cultivated at 37 C in a Luria-Bertani (LB) medium containing 50 μg/ml ampicillin. Overnight cultures where transferred to fresh media, grown to an optical density of ~0.8 at 600 nm, and supplemented with 1mM Isopropyl β-d-thiogalactoside (IPTG). Cells where grown at 25 C for 8 h, harvested and lysed in a buffer solution (10 mm TRIS ph 7.5, 1 mm EDTA, 0.1% DOC) containing a protease inhibitor cocktail (Sigma P8849), followed by sonication (pulse 1s on, 2s off, min) and centrifugation (12000 rpm for 30 min). 6xHistagged recombinant proteins were purified on Ni-NTA affinity agarose (Qiagen) and dialyzed against demi-water. Protein concentration was determined using the BCA assay (Pierce), and purity was confirmed with SDS-PAGE and immunoblotting using murine anti-his antibodies (Qiagen). Bacterial Motility Assays The impact of flagellin mutations on bacterial motility was tested using an immobile bacterial strain S. typhimurium FliC FljB ATCC 14028s (courtesy of E. Miao, Institute for Systems Biology, Seattle) transformed with a prp4 plasmid expressing wild-type or mutant flagellin. The bacterial cells were transformed using electroporation at 2.5 kv, 200 Ω, and 25 μf in 10% glycerol. A single colony of transformed bacteria grown on LB agar plates containing 50 μg/ml ampicillin was selected and transferred to the motility test plates (LB media containing 0.3% agar, 1 mm IPTG, and 50 μg/ml ampicillin). The cultures were incubated overnight in the upright position at room temperature, and they were photographed subsequently. Each plate was inoculated with a single colony of S. typhimurium expressing mutated flagellin and bacteria expressing wild-type SaTy (or those transformed with an empty vector) as the control. Motility of the strains expressing the mutated flagellin was compared to the motility of the control strain transformed with wild-type SaTy. Luciferase Reporter Assay For dual luciferase assays, HEK293 cells were seeded in 96-well plates (Corning) at a density of cells per well (0.1 ml). On the next day, the cells were transiently transfected with plasmids expressing TLR5, pelam-1 expressing NF-κB-dependent firefly luciferase as a reporter (50 ng per well) (C. Kirschning, Institute for Medical Microbiology, University of Duisburg-Essen, Essen, Germany), and phrl-tk (5 ng) constitutively expressing Renilla luciferase (Promega) for normalizing the transfection efficiency using the JetPEI transfection reagent (Polyplus Transfection). The total amount of DNA in each transfection was kept constant by adding appropriate amounts of pcdna3 plasmids. After 24 h, the cells were either lysed or the medium was changed and the cells stimulated with purified recombinant flagellin PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

109 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 (5 ng/ml) for a further 18 h before lysis. The cells were lysed in a passive lysis buffer (Promega) and analyzed for reporter genes activities using a dual-luciferase reporter assay measuring NFκB-dependent firefly luciferase and the constitutively expressed Renilla luciferase activity. Each experiment was repeated at least twice in at least three biological replicates. Average relative luciferase activity with standard deviation is given. The unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis of the activation efficiency of different flagellins on htlr5 and mtlr5 comparing the relative luciferase activities (relative light units, RLU). Cytokine Detection in human monocytes and mouse embryonic fibroblasts Human THP-1 monocytes were seeded in 24-well plates at a cell density of cells/ml and stimulated with 100 ng/ml of flagellin or mutated variants. Six hours later, the cell supernatants were collected, and the concentration of htnfα (Affymetrix) was determined. The experiment was repeated at least twice in at least three parallels. MEFs were seeded at 10 5 per well in a 24-well-plate format and stimulated with 10 ng/ml of flagellin or mutated variants on the next day. Eighteen hours after stimulation, the cell supernatants were collected and analyzed for mil-6 concentrations using ELISA (Affymetrix). The experiment was repeated at least twice in at least three biological replicates. Average cytokine level with standard deviation is given. The unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical comparison of cytokine expression levels between treatments with different flagellins. Immunoprecipitation assay Soluble ectodomain htlr5-fc (InvivoGen, #fc-htlr5) or mtlr5-fc (R&D Systems, 7915-TR) (8 μg) was incubated with (50 μl) Protein D DynaBeads (Novex) for 90 min at 25 C with shaking at 1000 rpm. Beads were washed 3 times with wash buffer (1xPBS, 0.02% Tween) and incubated with 10 μgor20μg of wild-type flagellin or mutants (R90N-E93R, N438D) for 120 min at 25 C with shaking at 1000 rpm. After incubation, beads were washed 3 times with wash buffer and eluted by boiling for 10 min in mixture of 10 μl elution buffer (1% SDS, 1x PBS) and 30 μl 4x SDS-PAGE loading buffer. After centrifugation at rpm for 5 min, proteins in equal volumes were separated by SDS-PAGE and probed by Western blot analysis. The h or mtlr5-fc were detected using Natural Protein A (HRP) (abcam, ab7456) and His-tagged flagellins were detected using mouse Tetra-HIS Antibody (Qiagen) and goat anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz, sc-2005). Unspecific binding was determined by incubating flagellins with beads without TLR5 and an input control represents flagellins loaded to beads. TLR5 and flagellin sequence alignment Flagellin amino acid sequences were aligned using the ClustalW software program ( embnet.vital-it.ch/software/clustalw.html). Sequence alignment included γ-flagellins from S. typhimurium (SaTy, P06179), S. marcescens (SeMa, UniProt id. P13713), S. dublin (SaDu, Uni- Prot id. Q06971), as well as ε-flagellins from Helicobacter pylori (HePy, UniProt id. Q59HI7) and Campylobacter jejuni (CaJe, UniProt id. P22252) that both evade TLR5 activation. A multiple sequence alignment of the 20 most diverse flagellins by Beatson et al. [22] was also used for analysis of amino acid residue conservation. Molecular modelling of TLR5 with flagellin Structural models of the htlr5 ECD (aa ) and the mtlr5 ECD (aa ) were generated using MODELLER v9.15 [29]. drtlr5 (PDB code 3V47 [24], chain A) was used as the PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

110 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 homology template. The TLR5 homology models and the structure of S. typhimurium flagellin (PDB code 1IO1 [30]) were aligned with drtlr5 (3V47, chain A) and flagelin (3V47, chain C) of the crystallographically determined complex. This procedure was used instead of docking to ensure the correct orientation of m/htlr5 and flagellin. The ND1 (aa , flagellin F1) or CD1 domain (aa , flagellin F2) of flagellin was used for further simulations and upon alignment the various mutants of S. typhimurium were created. After homology modeling, side chains were repacked using SCWRL 4.0 [31].Theinputfilesformoleculardynamics(MD)simulationwere prepared using VMD [32], and the simulations were executed in the NAMD 2.10 environment [33] using the CHARMM 22 all-atom force field with CMAP correction [34]. The TLR5-flagellin complex was first minimized in vacuum over 1880 steps, solvated with explicit water (box size: Å 3 ), and equilibrated over 12,000 steps. The production trajectory was run for 30 million steps (60 ns); an integrator step size of 2 fs, Langevin thermostat temperature of 300 K, and Langevin barostat pressure of 1 bar were used. Snapshots were saved every 50 picoseconds. The free energy of binding was estimated using MM-GBSA in NAMD [35]. Briefly, the energies for trajectories of only flagellin, only TLR, and the TLR flagellin complex were calculated from the simulations performed using explicit water. The free energy (G) of each component was estimated using GBSA (solvent dielectric: 78.5, ion concentration: 0.3 mm, surface tension: kcal/mol/å). The free energy of binding was obtained as follows: DG ¼ 1 N frames XNframes i¼1 ðgðcomplexþ GðflagÞ GðTLRÞÞ Only the differences between the mutant and the wild-type with the same TLR are directly comparable, and they were calculated using the following formula: DDG ¼ DGðmutantÞ DGðwild typeþ In total 14 simulations of ~60 ns length were performed (mtlr5-flag, htlr5-flag, mtlr5-flagr90a, htlr5-flagr90a, mtlr5-flagr90n, htlr5-flagr90n, mtlr5-flage93r, htlr5-flage93r, htlr5-flage93r-r1, mtlr5-flagr90n_e93r, htlr5-flagr90n_e93r, htlr5-flagr90n_e93r-r1, mtlr5-flagn438d, htlr5-flagn438d). The R1 suffix designates an alternative starting roamer of E93R. SCWRL choose different starting rotamers for the htlr and mtlr complex for the flagellin mutant E93R. To exclude that differences in the binding energy are based only on a different starting rotamer conformation, simulations of htlr5-flage93r-r1 and htlr5-flagr90n_e93r-r1 were performed in which 93R was in the same starting conformation as in the mouse complex. The obtained energies were averaged over a 1 ns window to obtain 60 ΔΔG points that were presented as violin plots. MDtraj [36] was used for root mean square deviation (RMSD) calculations (S1 and S2 Figs) and for computing dictionary of protein secondary structure (DSSP) plots (S3 Fig). ERRAT [37] was used to estimate the validity/quality of the models (S4 and S5 Figs). The values were calculated using the on-line webserver at The DOPE Z-score [38], which measures the likeness of the model to native-like proteins, was calculated every 1 ns of the molecular dynamics simulation (S6 Fig). Software and statistics UCSF Chimera software was used to generate structural figures and determine the distances between atoms ( Pettersen et al. [39]). Graphs were prepared using Origin 8.1 ( and matplotlib ( [40]. GraphPad Prism 5 ( was used for statistical analysis. PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

111 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Results Mouse TLR5 is less sensitive to mutations in flagellin than human TLR5 Differential recognition of flagellins from different bacterial strains has already been demonstrated for the mtlr5 and the htlr5 receptors [7]. To determine which amino acids within the primary binding interface of flagellin contribute to this species-specific recognition, we selected amino acid residues for point mutations based on their contributions to the binding interface according to the crystal structure. The primary binding site of S. dublin flagellin (SaDu) to drtlr5 is restricted to the flagellin subdomains αnd1 and αcd1, and the ascending lateral interface of drtlr5 LRRNT to LRR10 with approximately 1320 Å 2 of buried accessible surface area [24]. This region of flagellin is highly conserved because it is packed through intersubunit connections within the flagellar filament. Therefore, an additional consideration for point mutation targets was the conservation of amino acid residues and their contribution to intersubunit connections within the filament. Residues E83, N430, N438, and T442, which are conserved among flagellins, and additional residues R90, E93, R431, and N433, all of which face neighboring flagellin molecules in the flagellar filament, were selected (Fig 1A). The charges of the amino acid residues were reversed, and polar amino acid residues were replaced with charged amino acid residues. Mutations R90N, E93R, N433, as well as a double mutant R90N-E93R, were changed to the counterpart residues of SeMa, which has been reported to differentially activate h- and mtlr5 [7]. The substitution of N433 to D was expected to have a minor impact on TLR5 activation and bacterial motility since it is a naturally occurring mutation of SaTy associated with the curly morphology of filament [21]. Residue N430 is also encompassed in the primary binding interface and is positioned just above N433 facing in the same direction in S. typhimurium flagellin. To intensify the effect of mutations in this region, double mutants N430D-N433D and N430E-N433E where generated. All flagellin variants were purified and analyzed. HEK293 cells transfected transiently with htlr5 or mtlr5 were stimulated with the mutated flagellin variants, and the NF-κB activation level was measured. The activation of h- and mtlr5 by each flagellin point mutation is shown as a dose response curve relative to stimulation with wild-type S. typhimurium flagellin (SaTy). The response to each mutant (solid lines) is superimposed on the response to wt flagellin (dashed lines) (Fig 1B). The results of the point mutations could be grouped into three classes: those with no effect, those that abrogated TLR5 recognition, and those that reduced only htlr5 activation but not mtlr5 activation. Mutations E83R, R90N, E93R, T422R, and T422E had no effect on the flagellin s efficiency to activate TLR5. The charge-reversed variant R90D was the only mutation that significantly reduced the ability of flagellin to stimulate both mtlr5 and htlr5 (Fig 1B and Table 1). Point mutants R90A, R431D, and N438D, of which the corresponding amino acid residues of S. dublin form the primary binding interface with drtlr5 [24], exerted an effect on activation of htlr5 but had a minimum or no effect on the activation of mtlr5 (Fig 1B). Interestingly, the E93R or R90N mutants alone had no effect on the ability of flagellin to activate h- or mtlr5, whereas a combination of both mutations impaired the activation potential of htlr5 but had no influence on mtlr5 activation. Double mutants N430-N433 to negative E or D had a minor impact on activation efficiency, but they were still able to activate mtlr5 to a higher degree than htlr5, even increasing the activity of mtlr5 with respect to wt flagellin. These results confirm the roles that several amino acid residues within the primary binding site of flagellin play in the species-specific differences between htlr5 and mtlr5 recognition. The mouse receptor was less sensitive to mutations in all cases in which a difference was observed. This indicates either altogether more robust recognition of flagellin by mtlr5, possibly the stronger homotypic inter-receptor interactions, or a slightly different mode of recognition with respect to the region of flagellin recognized by the mouse receptor. PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

112 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Fig 1. Mapping flagellin residues with presumed effect on receptor species-specific recognition. (A) Amino acid sequence alignment of the N- and C- D1 domain of S. typhimurium SaTy, S. marcescens SeMa, and S. dublin SaDu γ-flagellins and N- and C- D1 domain of ε-flagellins of H. pylori (HePy) and C. jejuni (CaJe), which both evades activation of TLR5 (ClustalW). Residues selected for point mutations are shown above the alignment. Hydrophobic aa are represented in light grey and charged aa in dark grey. Amino acids corresponding to S. dublin residues that form the primary binding interfaces A and B are highlighted in magenta and cyan, respectively, and aa of the secondary dimerization interface are highlighted in yellow [24]. (B) Responses to mutated flagellin differ between htlr5 and mtlr5. For dose-response curves, htlr5 HA - or mtlr5 HA -transfected HEK293 cells were stimulated with up to 1 μg/ml of purified recombinant SaTy or mutants, and luciferase activities were measured. (Data are representative of two independent experiments. Points represent mean of 4 biological replicates ± s.d.) Shown here is the percent fold induction of NF-κB activity relative to stimulation with the maximal concentration of wild-type SaTy (1μg/ml), with the exception of R90D, in which case saturation was not achieved. The response to the mutants (solid lines) is superimposed on the response to wt flagellin (dashed lines). doi: /journal.pone g001 Flagellin mutants differentially activate human or mouse cells To further confirm the relevance of the species-specific recognition of flagellin point mutations between human and mouse receptors, human THP-1 monocytes or MEFs, both expressing endogenous levels of their respective receptors, were tested for cytokine production in response to stimulation with flagellin or mutated variants that elicited the most profound differences in activation. mtlr5 was responsive to flagellin mutants R90A, N438D, and the double mutant R90N-E93R, whereas htlr5 signalling was abrogated by these point mutations in HEK293 PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

113 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Table 1. Comparison of flagellin functionality and its ability to activate htlr5 or mtlr5 in SaTy and mutant variants. Activity was determined for mtlr5 HA - or htlr5 HA -transfected HEK293 cells stimulated with 5 ng/ml wild-type flagellin and mutants. Mutants Motility Activity [%] htlr5 [%] mtlr5 [%] SaTy E83R R90A R90D R90N E93R R431D N438D T442R T442E R90N-E93R N430D-N433D N430E-N433E doi: /journal.pone t001 cells (Fig 2A). Human THP-1 monocytes or MEFs were, therefore, stimulated using SaTy or the mutated variants, respectively, and synthesis of human TNFα and mouse IL-6 were measured, respectively. The human monocytes were not activated with flagellin mutants R90A, N438D, and the double mutant R90N-E93R (Fig 2B), as determined for htlr5-positive HEK293 cells (Fig 2A). In contrast, MEFs were activated upon stimulation with all mutated variants, although some differences in responsiveness can be noticed between the overexpression system in HEK293 cells and primary cells. Specifically, double mutant R90N-E93R and mutant N438D seem to have a greater effect on MEF responsiveness (Fig 2C). Taken together, these results confirm the lower sensitivity of mtlr5 to amino acid residue variations in the primary binding site than that of htlr5. Mutations within ND1 and CD1 domains of flagellin affect bacterial motility Monomers of flagellin self-assemble through intermolecular contacts between the conserved D1 and D0 domains into flagellar filaments that enable bacterial motility [21,30]. The conserved amino acid residues within these regions represent an appropriate conserved target for the innate immune receptor TLR5 because structural requirements restrict extensive modifications, which would allow immune evasion, in this area of flagellin. To assess the impact of the changes in the amino acid residues tested for receptor activation on the functionality of bacterial flagella, mutant flagellins were transformed into a flagellin-deficient strain of S. typhimurium and tested for their effects on bacterial motility. The positions of specific amino acid residues with regard to their positioning in the flagellar filament between two adjacent monomers are shown in Fig 3A. All tested mutants influenced bacterial motility. Mutation R90D and mutations within the C-terminal D1 domain including R431D, N430D-N433D, and N430E-N433E rendered the bacteria completely immobile. Mutations R90N, E93R, and T422R reduced motility by over 50% (Fig 3B; Table 1). A strong correlation between activation potential and influence on motility was observed only for the mutant R90D, which rendered the bacteria completely immobile and was unable to stimulate the human or mouse receptor. Double mutants N430D-N433D and N430E-N433E, too, rendered bacteria immobile, but they retained TLR5 activation potential. Within this study, all flagellin variants that were functional PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

114 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Fig 2. Flagellins with mutations in ND1 and CD1 domains differentially activate human or mouse cells. (A) HEK293 cells transfected with a plasmid expressing htlr5 HA or mtlr5 HA were stimulated with 5 ng/ml of purified recombinant SaTy or mutant variants and luciferase activities were measured and relative luciferase activities (RLU) were calculated using the Renilla luciferase as transfection control. (Data are representative of 3 independent experiments. Bars represent mean of 4 biological replicates ± s.d.; ***p > 0.005, two-tailed unpaired Student s t-test). Relative NF-κB activities compared to wild-type flagellin are shown. (B) Human monocytes THP-1 and (C) MEFs were stimulated with 100 or 10 ng/ml of purified recombinant SaTy or mutants, respectively, and cytokine production was measured (Data are representative of 2 independent experiments. Bars represent mean of 3 biological replicates ± s.d.; ***p > 0.005, *p > 0.1, ns: p > 0.1, two-tailed unpaired Student s t-test). doi: /journal.pone g002 for bacterial motility were also detected by TLR5, at least in the case of the mouse orthologue (Table 1). This suggests that all conserved amino acid residues tested in this study are under structural restraint as modifications strongly influence flagellar filament formation and result in non-motile or reduced-motility bacteria. Comparison of primary binding sites of htlr5 and mtlr5 Differences were observed upon activation of the htlr5 or mtlr5 receptor with flagellin containing point mutations in the primary binding site. To evaluate these differences, molecular models of the critical region of the mtlr5 and the htlr5 complexes SaTy were constructed based on the crystal structure of drtlr5 with S. dublin flagellin (SaDu) [24]. Due to the high similarity between the sequences of htlr5 and mtlr5, the homology models of htlr5 and mtlr5 were highly similar. Because the homology models by themselves cannot explain the observed differences in the activation of htlr5 and mtlr5, we performed an all-atom molecular dynamics simulation to probe potential differences in binding and to verify our models. Wild-type SaTy flagellin and a double mutant of flagellin (R90N-E93R) were simulated with htlr5 and mtlr5 in explicit water (Fig 4 and Fig 5). After 60 ns, the interface between htlr5 and wild-type flagellin (Figs 4A and 5A) and that between mtlr5 and wild-type flagellin (Figs 4B and 5B) remained stable and similar to the initial homology structure. The interface between mtlr5 and the mutant flagellin, too, remained stable (Figs 4D, 5E and 5F). In contrast, the interface between htlr5 and the mutant flagellin underwent some structural changes (Fig 4C, Fig 5C and 5D), specifically, in the LRR9 loop (shown as a thick blue band) within the primary binding site of htlr5 dissociated from flagellin. The flagellin D1 fragment in this complex assumed a different binding position across the primary and secondary interfaces. The results of the simulation agree very well with experimental results, in which this specific flagellin double mutant fails to activate htlr5 but activates mtlr5 (Fig 1C). The binding energies of flagellin and mutant flagellin to h- and mtlr5 were estimated from the simulation and were found to correlate well with the experimentally determined receptor activation (Fig 6). For mutants R90A, R90N and N438D, the estimated ΔΔG for htlr5 was comparable to that of mtlr5 (Fig 6). The differences of estimated ΔΔG s for the E93R mutants binding to h- and mtlr5 were similar to PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

115 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Fig 3. Mutations in D1 domain of SaTy flagellin affect motility of flagellin-deficient bacterial strain S. typhimurium FliC FljB. (A) Amino acid residues subjected to mutagenesis are shown on two adjacent flagellin monomers positioned as in the flagellar filament. Yellow and red colors represent the residues selected for point mutation. (B) Motilities of flagellin-deficient bacteria transformed with plasmids encoding mutant or wild-type flagellin were tested on low-density agar plates. Each mutant was inoculated with a wild-type control on the same agar plate (right side). The percentage of mutant versus wild-type diameters is shown. (Data are representative of 3 independent experiments.) doi: /journal.pone g003 the double R90N-E93R mutant suggesting that the main contribution to observed changes in the ΔΔG for the double R90N-E93R mutant originates from the E93R mutation, while experimental results show that this mutation does not decrease receptor activation (Fig 1B). Immunoprecipitation studies show that binding of the R90N-E93R and N438D mutants to h- and mtlr5 was as efficient as binding of wild-type SaTy flagellin (Fig 7). This might seem surprising yet was not altogether unexpected since a previous study has also shown only slightly weaker binding of the completely inactive mutant R90A to htlr5 compared to wild type flagellin [7]. Furthermore, a total of three amino acid residues (Q89A/R90A/Q97A) had to be altered in the S. dublin flagellin to decrease binding to drtlr5 [24]. Therefore, single amino acid changes which attribute to a decreased activation level do not necessarily also affect binding, since extensive ligand surfaces are involved in the multiple interaction interfaces. The effects of the single point mutations might rather be due to insufficient receptor conformational changes decreasing efficient dimer formation. PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

116 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Fig 4. Models of htlr5 and mtlr5 in complex with wild-type and mutant flagellin. Flagellin is shown in orange, TLR5 in white. The LLR9 loop of TLR5 is shown as a thick blue band. Positions 90 and 93 in flagellin are represented using Van der Waals surfaces. (A) Top and side views of htlr5 with wild-type SaTy flagellin. (B) Top and side views of mtlr5 with wild-type SaTy flagellin. (C) Top view of htlr5 with flagellin mutant R90N E93R. (D) Top view of mtlr5 with flagellin mutant R90N E93R. doi: /journal.pone g004 Discussion Species-specific ligand recognition has been reported for a number of receptors in the TLR family, including TLR4 [4,41], TLR9 [2,3], TLR2 [5], and TLR5 [6 8]. In this study, we focused on the species-specific differences in recognition of flagellin between htlr5 and mtlr5. The primary binding site between flagellin and TLR5 has been described in the crystal structure of the complex of a fragment of drtlr5 with truncated flagellin of S. dublin (containing the D1 and D2 domains) [24]. The crystal structure of the drtlr5 fragment provides the basis for interpreting the results of the mutational analysis performed on human and mouse receptors. To apply the structural information of drtlr5 to the mode of recognition of flagellin by htlr5 and mtlr5, and to explain differences in recognition between the two species, we constructed homology models of htlr5 and mtlr5 in complex with S. typhimurium flagellin based on the crystal structure of the drtlr5 S. dublin complex. Data pertaining to the crystal structure indicates that the amino acid arginine at position R90 in flagellin and several other surrounding amino acids form a so-called hot spot of the primary binding interface between flagellin and TLR5 [24]. All amino acid residues selected in this study are located within the highly conserved block of 140 residues of flagellin that corresponds to the ND0, ND1a and ND1b sub-domains and the β-turn. A study by Beatson et al. aligning 20 of the most diverse flagellin sequences shows that residues at positions 83, 90 and 93 are consistently of a charged or polar nature, residues at position 430 and 431 are consistently polar even among unrelated PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

117 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Fig 5. Structural details of binding between wild-type and mutant flagellin. Flagellin is shown in orange, TLR5 in white. The LLR9 loop of TLR5 is shown as a thick blue band. Positions 90 and 93 in flagellin are represented using Van der Waals surfaces. (A-F) Zoomed in view of the interaction surface of TLR5 with wt or mutant flagellin (side and top views). The right panels (D and F) show an overlay of the TLR5 interaction with wt flagellin (white) and mutant flagellin (orange). doi: /journal.pone g005 species and residues at positions 438 and 442 are more variable among species (numbering is relative to Salmonella typhimurium flagellin) (Fig 1A) [22]. The R90D mutation completely abrogates htlr5 and significantly decreases mtlr5 activation (Fig 1B). Mutational studies agree with the data from our model, which shows a similar orientation of mouse and human amino acid side chains corresponding to the zebrafish counterparts that interact with flagellin residue R90 in the crystal structure. Conservation of this amino acid position among distinct bacterial species is quite high, and the mutation R90D renders bacteria completely immobile, while mutating arginine 90 to alanine or asparagine has a somewhat milder effect on motility and on the activation of the murine receptor, as reported in previous studies [7]. In contrast, htlr5 exhibits high sensitivity to mutations at this flagellin position. Several flagellin point mutations of amino acid residues, which come into contact with drtlr5 in the crystal, resulted in abrogated activation of htlr5 but not of mtlr5. Residue R431 corresponds to R441 in S. dublin, and it interacts with L56 and Q90 in drtlr5. Although PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18

118 Recognition of Flagellin Mutants by TLR5 Fig 6. Differences in calculated binding free energies between wild-type and mutant flagellin. The free energy of binding was estimated using MM-GBSA. The energy differences between wild-type and mutant (ΔΔG) flagellins were averaged over 1 ns intervals to obtain 60 points and shown as violin plots. A higher value corresponds to lower stability. The results agree well with our experimental data. The R1 suffix designates an alternative starting rotamer of E93R as described in the methods section. (***p > 0.005, two-tailed unpaired Student s t-test). doi: /journal.pone g006 Fig 7. Mutants bind to TLR5 as efficiently as wild type flagellin. (A,B) The ectodomain mtlr5-fc (mtlr5 Fc )(A) or htlr5-fc (htlr5 Fc )(B) was immobilized on Protein D beads and mixed with equal amounts of purified wild-type flagellin or mutants. Bound flagellins and TLR5 were eluted and detected by Western blot using Protein-A conjugated with HRP for TLR5 (top panel) and anti-his antibodies for flagellins (bottom panel). (Data are representative of 2 independent experiments.) (C) Quality of input material. (D) Unspecific binding of flagellins to Protein-D beads. doi: /journal.pone g007 PLOS ONE DOI: /journal.pone July 8, / 18