FUNKCIONALIZACIJA POVRŠINE SILIKONOV S HITOZANSKIMI NANODELCI KOT DOSTAVNIM SISTEMOM ZA ZDRAVILO

Transkripcija

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA STROJNIŠTVO Urška JERENEC FUNKCIONALIZACIJA POVRŠINE SILIKONOV S HITOZANSKIMI NANODELCI KOT DOSTAVNIM SISTEMOM ZA ZDRAVILO študijskega programa 2. stopnje Tehniško varstvo okolja Maribor, september 2018

2 FUNKCIONALIZACIJA POVRŠINE SILIKONOV S HITOZANSKIMI NANODELCI KOT DOSTAVNIM SISTEMOM ZA ZDRAVILO Študentka: Študijski program: Mentor: Somentor: Somentor: Urška JERENEC študijski program 2. stopnje Tehniško varstvo okolja red. prof. dr. Lidija FRAS ZEMLJIČ red. prof. dr. Ivan ANŽEL doc. dr. Janez REBOL Maribor, september 2018

3

4 I Z J A V A Podpisana Urška Jerenec, izjavljam, da: je magistrsko delo rezultat lastnega raziskovalnega dela, predloženo delo v celoti ali v delih ni bilo predloženo za pridobitev kakršnekoli izobrazbe po študijskem programu druge fakultete ali univerze, so rezultati korektno navedeni, nisem kršil-a avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih, soglašam z javno dostopnostjo magistrskega dela v Knjižnici tehniških fakultet ter Digitalni knjižnici Univerze v Mariboru, v skladu z Izjavo o istovetnosti tiskane in elektronske verzije zaključnega dela. Maribor, Podpis: - I -

5 FUNKCIONALIZACIJA POVRŠINE SILIKONOV S HITOZANSKIMI NANODELCI KOT DOSTAVNIM SISTEMOM ZA ZDRAVILO Ključne besede: silikon, timpanalne cevke, hitozan, amoksiklav, nanodelci, plazemska aktivacija, DLS, Zeta potencial, UV-VIS, SEM, FT-IR, XPS, protimikrobnost, Franz celica UDK: 620.3(043.2) POVZETEK Silikoni so široko uporabni materiali. Med številnimi aplikacijami jih najdemo tudi kot sestavni del timpanalnih cevk, kjer je cilj napredek razvoja funkcionalnih površin cevk na način, ki izboljša procese zdravljenja vnetja ušes ter druga stanja ušesnih bolezni, kjer se uporabljajo te cevke. V magistrski nalogi smo se osredotočili na pripravo silikonskih površin z različnimi protimikrobnimi premazi. V našem primeru smo naredili premaze iz nanodelcev polisaharida hitozana individualno ali z dodatkom komercialnega zdravila amoksiklav. Velikost delcev smo izmerili z metodo DLS, stabilnost disperzije smo preverili z meritvami zeta potenciala, fizikalno-kemijske lastnosti funkcionaliziranih silikonskih materialov pa smo preverili z metodami UV-VIS, SEM, FT-IR in Franz celico. Protimikrobnost smo testirali standardno na izbrane bakterije. Pridobljeni rezultati kažejo, da so preliminarni poskusi na timpanalnih silikonskih cevkah s takšnim premazom odlična preventiva pred nastankom biofilma, omogočeno pa bi bilo tudi boljše celjenje (manjša možnost porasta bakterij zaradi protimikrobnega premaza). Amoksiklav je zaradi svoje široke uporabe, učinkovitosti in dostopnosti primerna izboljšava površine cevk. - II -

6 FUNCTIONALIZATION OF SILICONE SURFACES WITH CHITOSAN NANOPARTICLES AS THE DRUG DELIVERY SYSTEM Key words: silicone, tympanostomy tubes, chitosan, amoxiclav, nanoparticles, plasma activation, DLS, Zeta potential, UV-VIS, SEM, FT-IR, XPS, antimicrobial, Franz cell UDK: 620.3(043.2) ABSTRACT Silicones are widely used materials which can also be used as part of tympanostomy tubes. There the goal is to further advance the functional surface of the tubes in a way that would enhance the healing processes of ear inflammations and other ear diseases where such tubes are used. The master s thesis focuses on the treatment of silicone surfaces with various antimicrobial coatings. The prepared coatings were made of nanoparticles of polysaccharide chitosan individually or with an added comercial drug amoxiclav. The size of the particles was measured using the DLS method (dynamic light scattering), stability of the dispersion was checked with the measurements of Zeta potential, physical chemical properties were checked using the UV-VIS method (ultraviolet-visible spectroscopy), SEM (scanning electron microscopy), FT-IR method (Fourier-transform infrared spectroscopy), and the Franz cell (in vitro release). Antimicrobial properties were tested using standards for selected bacteria. The results show that preliminary tests with tympanostomy tubes with the selected coatings are an excellent prevention against the occurrence of a biofilm, while also enabling better healing (reduced likelihood of bacterial growth due to the antimicrobial coating). Due to its wide spectre of use and high accessibility, amoxiclav is a suitable addition to the tubes. - III -

7 KAZALO VSEBINE UVOD TEORETIČNI DEL Predstavitev problema Stanje raziskav na področju funkcionalizacije timpanalnih cevk Hitozan Lastnosti hitozana Hitozanski nanodelci Silikon Kaj so silikoni Pridobivanje silikonov Lastnosti silikonov Polidimetilsiloksan (PDMS) Antibiotik»Amoksiklav« Teoretične osnove analiznih metod Dinamično sipanje svetlobe Elektrokinetični pojavi na mejnih površinah UV-VIS spektrometrija Obdelava materiala Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FT-IR) Spektroskopija fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki (XPS) Franz celica EKSPERIMENTALNI DEL Shema dela Seznam vzorcev Materiali IV -

8 Laboratorijska oprema in aparature Priprava raztopin Kisikova plazma za aktivacijo silikonskih ploščic Meritve velikosti nanodelcev Meritve zeta potenciala UV- VIS spektrometrija Nanos disperzij nanodelcev na silikonske plošče Analiza površine s premazi in brez njih s SEM mikroskopom Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FT-IR) Spektroskopija fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki (XPS) Mikrobiološko testiranje Franz celica: analiza sproščanja REZULTATI IN DISKUSIJA Disperzija nanodelcev Določitev velikosti nanodelcev vzorca CH-TPP z metodo DLS Določitev zeta (ζ) potenciala UV-VIS spektrometrija Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FT-IR) Analiza površine s spektroskopijo fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki (XPS) Neaktivirani vzorci Vzorci aktivirani s plazmo Protimikrobnost Zmanjšanje bakterijske rasti Zmanjšanje pritrjevanja bakterij na površino silikonskih vzorcev Franz celica: analiza sproščanja V -

9 SKLEP BIBLIOGRAFIJA Priloge rezultatov metode Franz celice Vzorec CH-TPP-AMOX PDMS Vzorec PLAZM 1 min PDMS CH-TPP-AMOX Vzorec PLAZM 2 min PDMS CH-TPP-AMOX Vzorec PLAZM 3 min PDMS CH-TPP-AMOX Vzorec PLAZM 5 min PDMS CH-TPP-AMOX VI -

10 KAZALO SLIK Slika 2.1: Strukturna formula hitozana [2] Slika 2.2: Priprava nanodelcev hitozana z metodo ionotropnega geliranja [5] Slika 2.3: Industrijsko pridobivanje silikona [7] Slika 2.4: Skeletna formula poli (dimetilsiloksana) [6] Slika 2.5: Skeletna formula amoksicilina [13] Slika 2.6: Shematski prikaz delovanja DLS [54] Slika 2.7: FT-IR spektrometer in njegovi sestavni deli Slika 2.8: Shematski prikaz XPS analize [72] Slika 4.1: SEM posnetek silikona Slika 4.2: SEM posnetek CH-TPP PDMS Slika 4.3: SEM posnetek CH-TPP PDMS Slika 4.4: SEM posnetek CH-TPP-AMOX PDMS Slika 4.5: SEM posnetek PLAZM 5 min PDMS CH-TPP-AMOX Slika 4.6: SEM posnetek PLAZM 3 min PDMS CH-TPP Slika 4.7: FT-IR spekter CH v prahu in CH-TPP-AMOX PDMS Slika 4.8: FT-IR spekter čistega CH, silikonskega nosilca in CH-TPP-AMOX PDMS Slika 4.9: FT-IR spekter silikonskega nosilca, CH in TPP Slika 4.10: FT-IR spekter silikonskega nosilca in PLAZM 1-5 min PDMS CH-TPP (različni časovni tretmaji) Slika 4.11: XPS vrhovi elementov pri meritvi silikonskega nosilca Slika 4.12: XPS vrhovi elementov pri meritvi vzorca CH-TPP PDMS Slika 4.13: XPS meritve vrhov elementov pri meritvi vzorca CH-TPP-AMOX PDMS Slika 4.14: XPS meritve vrhov elementov PLAZM 5 min PDMS Slika 4.15: Sprememba koncentracije učinkovine v odvisnosti od časa Slika 4.16: Sprememba kumulativne mase v odvisnosti od časa VII -

11 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 4.1: Razporeditev nanodelcev vzorca CH-TPP glede na njihovo velikost Preglednica 4.2: Razporeditev nanodelcev vzorca CH-TPP glede na njihovo velikost po ultrazvočni kopeli Preglednica 4.3: Meritev vzorca CH-TPP-AMOX glede na velikost delcev Preglednica 4.4: Vrednosti zeta potenciala delcev Preglednica 4.5: Sestava površine vzorcev v at. % Preglednica 4.6: Sestava površine vzorcev po uporabi plazme v at. % Preglednica 4.7: Mikrobiološki rezultati zmanjšane bakterijske rasti na različnih silikonskih vzorcih Preglednica 4.8: Mikrobiološki rezultati zmanjšanja pritrjevanja bakterij na površino različnih silikonskih vzorcev VIII -

12 UPORABLJENI SIMBOLI ε0 εr η θ λ ν v τ τd ζ Ŋ influenčna konstanta dielektrična konstanta viskoznost medija sipalni kot valovna dolžina laserske svetlobe frekvenca valovanja valovno število, časovni zamik korelatorja difuzijski čas zeta potencial viskoznost < > povprečje po času A amplituda statičnega dela A površina Abs absorbanca a polmer at.% atomski odstotki B amplituda dinamičnega dela c koncentracija vzorca v mol/l c avg c (B) c st. dev c c donor D dh E Ek Ev eφ e0 povprečna koncentracija koncentracija učinkovine nanodelcev amoksiklava, TPP-ja in hitozana koncentracija standardne deviacije hitrost fotona koncentracija donorja difuzijska konstanta hidrodinamski premer jakost električnega polja kinetična energija vezavna energija elektrona potrebno izstopno delo, da elektron zapusti vzorec elementarni naboj - IX -

13 hν I0 I K l le m norm. m st. dev. n P pka q r T T Tg U u V receptor v z energija fotona začetna intenziteta sevanja izhodna intenziteta sevanja Boltzmannova konstanta dolžina svetlobne poti skozi kiveto v cm razdalja med elektrodama kumulativna masa vzorca B standardna deviacija mase vzorca B lomni količnik vode, v kateri so dispergirani delci prepustnost merilo kislosti sipalni vektor polmer delcev transmisija temperatura raztopine oz. vzorca temperatura steklastega prehoda napetost gibljivost iona volumen receptorja hitrost naboj - X -

14 UPORABLJENE KRATICE AOM ASTM BPLB CHT DLS DNK EE FT-IR HPLC IVRT ISO mrnk me NH2 NP OH OME PBS PBP PDI PDMS PNP SEM SOM TPP VSSA XPS akutno vnetje srednjega ušesa Standard Terminology for Additive Manufacturing Technologies krvno-perilimfne pregrade hitozan dinamično sipanje svetlobe deoksiribonukleinska kislina učinkovitost ujetosti zdravila infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo tekočinska kromatografija visoke ločljivosti In vitro testiranje sproščanja International Organization for Standardization prenašalna ribonukleinska kislina metil amino skupina nanodelci hidroksilna skupina vnetje srednjega ušesa z izlivom fosfatna pufrska sol penicilin-vežoče beljakovine polidisperzni indeks poli (dimetilsiloksan) polimerni nanodelci vrstična elektronska mikroskopija serozni otitis media natrijev tripolifosfat specifična površina na enoto prostornine spektroskopija fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki - XI -

15 UVOD Silikonski materiali so široko uporabni v različnih panogah (letalstvo, medicina, elektronika, gospodinjstvo, kozmetika). Prisotnost organskih skupin, pritrjenih na anorgansko osnovo silikonov, jim daje edinstvene lastnosti in jih naredi uporabne na številnih tehnoloških področjih. Silikon se uporablja na električnem področju kot izolacijski material in v drugih aplikacijah, specifičnih za proizvodnjo polprevodnikov. Uporablja se v letalski in vesoljski industriji zaradi odlične zmogljivosti oz. vzdržljivosti pri nizkih in visokih temperaturah. Zaradi trajnosti je odličen material za tesnila, lepila in vodoodporne premaze v gradbeništvu. Zanimanje za silikone se je pričelo v medicini predvsem zaradi njihove priznane biokompatibilnosti in ugodnih fizikalno kemijskih kot tudi mehanskih lastnosti [1] [2] [3]. Sredi 40-ih let 20. stoletja so znanstveniki na Univerzi v Torontu ugotovili, da izpiranje igel, ki imajo prevlečene brizge z metilklorosilanom, in vial z destilirano vodo povzroči nastanek silikonske prevleke, ki se lahko uporablja za preprečevanje koagulacije krvi. Trenutno je večina igel in brizg še vedno prevlečena s silikonom, toda silikon je v preteklih letih prerasel v raznolik spekter medicinskih aplikacij. Njegova biokompatibilnost v kombinaciji s kemijsko stabilnostjo in elastičnostjo omogoča, da je idealen material za dolgoročno implantacijo. Implantati se razlikujejo ter so se razvili zaradi popravila žolčnega kanala, ki je bil prvič izveden s silikonom leta 1946, najbolj cenjen med njimi pa je ventrikulo-atrijski ventil, znan kot Spitz-Holter ventil, ki ga je leta 1956 oblikoval oče, katerega sin je umiral zaradi hidrocefalusa. Tovrstni ventil se še danes uporablja v skoraj nespremenjeni obliki. Po tem so se možnosti za uporabo silikona v medicinskih aplikacijah zdele neomejene in se je od tedaj uporabljal v ortopediji, pri razvoju raznih katetrov, odtočnih tubah, kontaktnih lečah, umetnih organih, kot sestavnih komponent pri dializi ledvic, srčnega obvoda, krvnim oksigenatorjem, in mnogimi drugimi [1] [4] [5]. Zanimivo področje uporabe silikonskih cevi so timpanalne cevke, kjer je še vedno velik izziv razvoj funkcionalnih površin cevk na način, ki izboljša procese zdravljenja vnetja ušes, kot tudi druga stanja ušesnih bolezni, kjer se uporabljajo te cevke. Tako bi lahko antimikrobna funkcionalizacija timpanalnih cevk s sočasnim sproščanjem zdravila povečala učinkovitost zdravljenja vnetja v ušesu ali zmanjšala čas zdravljenja kot tudi zmanjšala možnost vnetja kot stranskega učinka uporabe timpanalnih cevk, ki se uporabljajo za zmanjšanje tlaka notranjega - 1 -

16 ušesa v določenih bolezenskih stanjih, kot je recimo Menierova bolezen. Slednje področje je tudi zelo malo raziskano. Silikoni so prisotni tudi v številnih farmacevtskih aplikacijah kot procesne pomožne snovi [6] [7]. Kakorkoli, pri uporabi različnih medicinskih pripomočkov, vključno silikonskih, je velikega pomena zagotovitev aktivne/funkcionalne površine medicinskih pripomočkov v stiku z izbranim biološkim okoljem. Slednje lahko zagotovimo s primerno izbiro materialov, modifikacijo strukture in kemije površin materialov in primernimi tehnologijami (2D filmi ali 3D porozne matrike pripravljene z elektro-predenjem, 2D/3D tiskanjem, casting/vlivanjem in zamrzovanjem, nanešene s pršenjem ali fulardom). Največkrat se uporablja modifikacija površin s premazovanjem ob uporabi funkcionalnih agensov [8] [9]. Eden izmed zelo zanimivih tovrstnih funkcionalnih agensov je hitozan. Hitozan je naraven polimer, kationski polisaharid, ki ima dobre biološke in protimikrobne lastnosti ter spodbuja delovanje imunskega sistema. Zaradi svojih edinstvenih lastnosti, kot so biorazgradljivost, netoksičnost in visoka protimikrobna aktivnost, je zelo uporaben kot protimikrobno sredstvo, samostojno ali kot snov za dostavo zdravila [2] [10] [11]. Posebej učinkovit je v obliki nanodelcev (velikost le-teh je od 1 do 100 nm) ali nanokapsul, ki imajo nekaj prednosti pred makromolekularno raztopino hitozana. Izboljšano je učinkovito protimikrobno delovanje zaradi majhne velikosti in visoke aktivne površine, sposobnost nadzora nad sproščanjem aktivnih snovi in izboljšanje mukoadhezivnih lastnosti. Posebej dobro se hitozanski nanodelci odzivajo kot površinski premaz za različne osnovne materiale, ki delujejo kot medicinski pripomočki [11] [12]. V magistrski nalogi so bili kot premaza za silikonske cevke uporabljeni nanodelci hitozana, pripravljeni z ionsko gelacijo, ki je nezahtevna, preprosta in blaga reakcija brez kakršnih koli strupenih reagentov. Komercialno zdravilo Amoksiklav, ki vsebuje amoksicilin in klavulansko kislino, je bilo kapsulirano v nanodelce hitozana. Oba sistema sta bila uporabljena kot adsorbat za silikonski material. Funkcionaliziran silikon smo testirali glede elementarne sestave, morfologije in protimikrobne aktivnosti. Pokazalo se je, da sama prevleka ali dodatek zdravila deluje kot obetavni funkcionalni premaz za timpanalne cevke

17 Cilji magistrske naloge zagotoviti primerno zdravilo, ki bo ustrezalo kriterijem raziskave, sintetizirati nanodelce s kontroliranim sproščanjem zdravila, zagotoviti s funkcionalizacijo primerno aktivno površino silikonskih ploščic, ki bo protimikrobna in vlažilna ter po možnosti biofilm inhibitorna, zagotoviti primerne mehanske uporabne lastnosti silikonskega materiala

18 TEORETIČNI DEL Predstavitev problema Vnetje srednjega ušesa je najpogostejša bolezen, zaradi katere otroci v ZDA obiščejo zdravnika, prejmejo antibiotike ali pa so napoteni na operacijo. Antibiotiki so se izkazali za učinkovite pri otrocih z akutnim vnetjem srednjega ušesa, kjer se biofilm še ni oblikoval. Pri otrocih, ki imajo kronične bolezni, zdravila ne učinkujejo dovolj dobro. V tem primeru je bolj učinkovita miringotomija. To je kirurški postopek, pri katerem se v bobnič vstavijo majhne cevke, ki omogočajo konstantno odtekanje infekcijske tekočine. Prva plastična prezračevalna cevka za ušesa je bila uporabljena že leta 1954 v času razvoja antibiotikov [13] [14] [15]. Takšne cevke so še vedno v uporabi. Polimerna osnova je oblikovana tako, da cevka ostane znotraj v timpanalni membrani ter s tem preprečuje prehitro zaprtje reza maringotomije. Tovrstne cevke delujejo na mehanskem principu odtekanja tovrstne tekočine. Timpanalne cevke lahko vzdržujejo zračno odprtino za prostor srednjega ušesa približno 1-2 leti. Da se vnetni proces umiri, je največkrat potreben daljši čas. Cevke se velikokrat uporabljajo tudi pri lajšanju bolezenskih stanj notranjega ušesa, kot so Menierova bolezen, vnetje srednjega ušesa z izlivom (OME), serozni otitis media (SOM) in akutno vnetje srednjega ušesa (AOM) [14]. Pri takšni vstavitvi v uho se lahko kot stranski učinek pojavi gnojna infekcija ušesa, kjer je klasični pristop zdravljenja lokalno z uporabo antibiotičnih kapljic ali oralno užitje antibiotika. Pri vnetjih je bila dokazana prisotnost Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae in Moraxella catarrhalis [13] [16] [14] [17]. Notranje uho predstavlja eno izmed največjih izzivov med ciljnimi organi za dostavo zdravil. Konvencionalne poti, kot npr. peroralne ali parenteralne poti, so v veliki meri neučinkovite predvsem zaradi krvno-perilimfne pregrade (BPLB), ki preprečuje stik notranjega ušesa s krvjo. Zato so za takšne primere razvile lokalne in ne sistemske dostave zdravil [18]. Velik izziv tako predstavljajo raziskave na področju funkcionalizacije timpanalnih cevk, ki bi poleg mehanske funkcije odtekanja tekočin in prezračevanja ušesa služila tudi kot učinkovit dostavni sistem specifičnega zdravila. S protimikrobno funkcionalizacijo cevk bi zmanjšali vnetne procese kot tudi zmanjšali pojavnost nastanka biofilma na površini le teh [19] [20][21]

19 Stanje raziskav na področju funkcionalizacije timpanalnih cevk Pregled stanja raziskav na področju funkcionalizacije timpanalnih cevk sem analizirala za obdobje od leta 1991 do leta Članki najpogosteje opisujejo le del mojega raziskovalnega dela, saj v nobenem od člankov nisem zasledila izdelave premazov z nanodelci hitozana in njegovega nanosa na timpanalne cevke. Anne-Charlotte Hessén Söderman je s sodelavci v članku A randomized study of four different types of tympanostomy ventilation tubes - One-year follow-up povzela ugotovitve uporabe različnih timpanalnih cevk. Te so lahko iz različnih materialov in oblik. Cevke z dolgo gredjo (tankim, nerazširjenim delom) v primerjavi s cevkami s kratko gredjo ostanejo v bobniču dlje, silikonske cevke pa so pri enoletnem spremljanju pacientov pokazale učinkovitejše zdravljenje SOM v primerjavi s fluoroplastičnimi cevkami [17]. V članku Phosphorylcholine-coated antibiotic tympanostomy tubes: Are post-tube placement complications reduced? (avtorji Greg Licameli, Patrick Johnston, Jennifer Luz, James Daley, Margaret Kenna) je opisano testiranje timpanalnih cevk s premazom fosforilholina. Ta premaz je bil testiran s številnimi varnostnimi preizkusi, vključno s citotoksičnostjo, akutno sistemsko toksičnostjo in senzibilnostjo kože. Uporaba premaza je znana že v drugih medicinskih aplikacijah, vključno za urologijo in koronarno angioplastiko (odpravljanje zoženja in zapor arterij mišice srca). Med zdravljenjem vnetnega procesa pri timpanalnih cevkah s premazom in brez njega ni bilo opaziti značilnih razlik v obdobju 21 do 24 mesecev. Čeprav njihova študija ni našla nobene statistično značilne razlike med standardnimi cevkami in cevkami s premazom, opozarjajo, da njihova velikost vzorca (n = 70) morda ni bila dovolj velika, da bi omogočila učinkovito delovanje premaza in bi tako lahko ugotovili razliko [22]. Avtorji člankov New method for coating tympanostomy tubes to prevent tube occlusions in Albumin-Coated Tympanostomy Tubes: Prospective, Double-Blind Clinical Study opisujejo testiranje timpanalnih cevk, ki preprečujejo zamašitev z granulacijskim tkivom, krvnim strdkom ali gnojem. Pri raziskavi so uporabili humani serumski albumin (HSA) kot oblogo standardnih timpanalnih cevi različnih materialov. Kot možno snov za zamašitev timpanalnih - 5 -

20 cevi so uporabili fibronektin, tipični protein v serumu, ki je eden najbolj lepilnih glikoproteinov. Timpanalne cevke, ki so bile prevlečene s HSA, so inhibirale vezavo fibronektina od 59 do 85%, odvisno od uporabljene vrste cevke. Študija tako prikazuje potencialno vlogo premaza HSA pri preprečevanju sprijemanja gnoja in ostalih neželenih izločkov v timpanalnih cevkah [23] [24]

21 Hitozan Uvod (1,4)-2-amino-2-dezokcil-beta-D-glukan, ki je poimenovan tudi hitozan, je deacetiliran derivat hitina (deacetilacija je odstranitev acetilne skupine iz molekule). Je kemično definiran kot kopolimer á- (1,4) glukozamina (C6H11O4N)n, ki ima drugačno število N-acetilnih skupin. Po videzu je bel do svetlordeč trdni prašek, ki je netopen v vodi, vendar pa topen v organskih kislinah. Hitin in hitozan sta naravnega izvora in sta obnovljiva polimera, ki imata odlične lastnosti, kot so: biorazgradljivost, biokompatibilnost, nestrupenost in adsorpcija. Avtor Shigehiro Hirano v članku Chitin and chitosan as novel biotechnological Materials navaja dejstvo, da je rast Escherichie coli zmanjša že pri več kot % hitozana [25]. Podobno kot celulozo lahko tudi hitin in hitozan uporabimo v reakcijah, kot so eterifikacija, esterifikacija in zamreženje. Glavni parameter, ki vpliva na značilnosti hitozana, je njegova molekulska teža in stopnje deacetilacije, ki predstavlja delež deacetiliranih enot [2] [12] [25] [26]. Članka z naslovoma Applications of Chitin and Chitosan in Industry and Medical Science: A Review (avtorica Shanta Pokhrel in sodelavci) in Chitosan/TPP microparticles obtained by microemulsion method applied in controlled release of heparin (avtor Alessandro F. Martins in sodelavci) opisujeta lastnosti in uporabnost hitina in hitozana v industrijski in medicinski aplikaciji. Hitin se lahko ekstrahira iz eksoskeletov rakov, žuželk in mehkužcev ter celične stene mikroorganizmov in se pretvori v hitozan z deacetilacijskim procesom. Hitozan je precej uporaben zaradi svoje topnosti in reaktivnih prostih aminskih skupin (-NH2) in je že bil raziskan za številne medicinske aplikacije, kot so tkivno inženirstvo in sistemi sproščanja zdravil. Pri tem se pogosto uporabljajo tehnike nastanka nanodelcev z natrijevim tripolifosfatom (TPP), to je tehnika ionotropnega geliranja. Sam postopek ne potrebuje strupenih kemikalij, njegov potek pa je preprost in hiter ter ekonomičen [12][27]. Protonirane aminske skupine v hitozanu reagirajo z negativno nabitimi ioni na TPP-ju, pri čemer se s pomočjo ionskih interakcij ustvari ionsko-povezano omrežje (postopek zamreženja) na nano nivoju [28]. V knjigi Chitosan Nanoparticles for Biomedical Applications Paula Pereira s sodelavci povzame mogoče poteke nastanka nanodelcev ter možnost uporabe hitozanskih nanodelcev kot sistemov za dostavo zdravil. Takšne lastnosti polimera hitozana so zelo zaželene, saj sta v - 7 -

22 medicinski aplikaciji potrebni čim večja kemijska in fizikalna stabilnost, potrebna pa je tudi zaščita zdravila pred degradacijo v biološkem okolju. Hitozanski NP izboljšajo transmukozalno prepustnost in imajo dobre mukoadhezivne lastnosti. NP-ji, ki temeljijo na hitozanu in se uporabljajo kot dostavni sistemi zdravil z nizko molekularno težo droge, so zaradi obetavnih rezultatov uporabljeni tudi pri zdravljenjih rakavih obolenj in pri organsko specifičnih terapijah [5]. Lastnosti hitozana Hitozan je linearni poliamin, ki ima reaktivno amino skupino (-NH2), razpoložljive reaktivne hidroksilne skupine (-OH) ter kelacijske sposobnosti za mnoge prehodne kovinske ione. Je hidrofilen polimer s pka (merilo kislosti)= 6 6,5. Poleg različnih kemijskih lastnosti ima hitozan tudi raznolike biološke lastnosti. Hitozan je: biokompatibilen (je naravni polimer, ki je varen in netoksičen ter biorazgradljiv do običajnih kemijskih sestavin telesa), se agresivno veže na celice sesalcev in mikrobov, ima regenerativni učinek na vezivno gumijasto tkivo, pospešuje nastanek osteoblasta, ki je odgovoren za nastanek kosti, je hemostatik (ustavi krvavitve), fungicid (zavira rast gliv), spermicid (za nadzor rojstev), zavira rasti tumorjev, znižuje raven holesterola in je vključen pri nadgrajevanju imunskih odzivov [12] [29] [30]. Slika 2.1: Strukturna formula hitozana [2] Molekulska masa komercialnega hitozana je med in g/mol, medtem ko je molekulska masa naravnega hitina nad enim milijonom

23 Molekule hitozana so pozitivno nabite, kar jim omogoča, da začnejo prepuščati proteinske molekule in celične organele mikrobov, ki imajo negativno nabite celične membrane. Vezava hitozana z DNK omogoča zaviranje sinteze mrnk in posledično proteinov, poteče pa ob dostavi hitozanskih nanodelcev v jedra mikroorganizmov [11] [29]. Hitozanski nanodelci Hitozanski nanodelci se uvrščajo med polimerne nanodelce, ki imajo običajno organsko osnovo. V literaturi je za to skupino nanodelcev uporabljen termin polimerni nanodelci (PNP). Najpogosteje so v nanosferni ali nanokapsularni obliki. Matrični delci so najpogosteje v trdnem agregatnem stanju, medtem ko se ostale molekule adsorbirajo na zunanji meji sferične površine. Trdna masa je lahko popolnoma zaprta znotraj delca, PNP-ji pa se brez težav funkcionalizirajo [31] [32]. Nanodelci hitozana so lahko pripravljeni z različnimi metodami: emulzijska navzkrižna povezava, koacervacija (precipitacija), ionsko geliranje, sušenje s pršenjem, mikroemulzije, polielektrolitski kompleks, itd. [3][18]. Najpogosteje uporabljeni metodi sta ionotropno geliranje in tako imenovana metoda samo-sestavljenih (self-assemble) polielektrolitov [11]. Ti dve metodi sta preprosti ter ne potrebujeta organskih topil ali visoke strižne sile za formiranje nanodelcev. V splošnem so faktorji, ki vplivajo na tvorbo nanodelcev in posledično na velikost delcev in površinski naboj, molekulska masa in stopnja deacetilacije hitozana. Učinkovitost ujetosti zdravila v nanodelce pa je odvisna od pka in topnosti ujetega zdravila. Zdravilo je najpogosteje povezano s hitozanom z elektrostatsko interakcijo, vodikovo vezjo ali hidrofobno interakcijo [11] [32] [33]. Slika 2.2: Priprava nanodelcev hitozana z metodo ionotropnega geliranja [5] - 9 -

24 Dosedanje raziskave so dokazale, da je hitozan idealen dodatek pri zdravljenju očesnih, nosnih, ustnih, vaginalnih in črevesnih poti [34]. Sproščanje zdravila, ki temelji na hitozanski osnovi, iz sistemov delcev, je odvisno od obsega navzkrižne povezave, morfologije, velikosti in gostote sistema za delce in fizikalno-kemijskih lastnosti zdravila. In vitro sproščanje je odvisno od ph, polarnosti in prisotnosti encimov, ki so v raztopljenem mediju. Sprostitev zdravila iz CS sistemov poteka z enim od treh različnih mehanizmov: s sproščanjem s površine delcev, z difuzijo skozi polimerno matrico in s sproščanjem zaradi erozije polimerov [34] [35]. V predhodnih raziskavah so bili raziskani tudi hidrogeli za dostavo zdravila za notranje uho samostojno, ne pa kot premazi za polimerne materiale. Saber A. je s sodelavci primerjal učinkovitost treh strukturno različnih hitozanov kot bioadhezivov. Vse te bioadhezivne gelne formulacije so učinkovito omogočale sproščanje zdravila, imenovanega neomicin, v kohleo v časovnem obdobju 7 dni. Pripravljeni hidrogeli niso vplivali toksično na kohlearno tkivo. Hidrogel, imenovan glikoziliran hitozan, omogoča dostavo zdravila deksametazona. Med raziskanimi raztopinami je bil zaradi svoje varnosti in učinkovitosti kljub začasnemu otekanju lokalnega tkiva, obetaven biomaterial za zdravljenje notranjega ušesa. Drugi hidrogel, imenovan hitozan glicerofosfat, prav tako omogoča dostavo zdravila deksametazona. Pri terapiji je zdravilo ostalo v perilimfi 5 dni. Pri zdravljenju je mogoča začasna izguba sluha, ki se preneha približno v desetih dnevih po vstavitvi zdravila [36] [37]. Hitozanski nanodelci so uporabni kot formulacije za dobavo DNA in Si RNA ter za plazmidno DNA za nazalno imunizacijo proti hepatitisu B. Ti nanodelci so lahko tudi hidrogeli za lokalizirano dostavo zdravil in ciljno dostavo nizko molekularnih zdravil. Hidrogeli so materiali z visoko vsebnostjo vode, pripravljeni iz navzkrižno povezanih polimerov, ki lahko zagotavljajo trajno lokalno dostavo različnih terapevtskih sredstev. Raziskave naravnega polimera hitozana so omogočile razvoj novih sistemov zdravil, ki sprostijo svoje koristne sestavine ob prisotnosti različnih okoljskih dražljajev [10] [38] [39] [40] [41] [42]. Prav tako je bil hitozan dokazan kot idealen sistem za vaginalno dostavo protiretrovirusov pri preprečevanju okužbe z virusom HIV, za mikrobicidne biofarmacevtske izdelke in cepiva ter

25 za genitalne okužbe s HSV-2. Hitozan je bil preučevan tudi kot dostavni zdravilni sistem, pri katerem je mogoča vključitev joda v obliki disperzij [43] [44] [45] [46] [47]

26 Silikon Kaj so silikoni Silikoni so skupina visoko zmogljivih materialov, ki vključuje siloksane in silane, ki se uporabljajo v tisočih izdelkov in zagotavljajo bistvene koristi ključnim segmentom našega gospodarstva. Uporabni so v aplikacijah, kot so zdravstvena oskrba, prevoz (npr. letalska in avtomobilska industrija), tekstil, elektronika in gradbeništvo. Zaradi svoje molekularne strukture se silikoni lahko proizvajajo v mnogih oblikah, vključno s trdnimi snovmi, tekočinami, polviskoznimi pastami, masti, olji in gumo [48] [49]. Silicij, sestavni gradnik silikonov, je štirinajsti element periodnega sistema. Čisti silikon je temnosiva trdna snov z isto kristalinično strukturo kot diamant. Njegove kemijske in fizikalne lastnosti so podobne temu materialu. Silicij ima tališče pri 1410 C, vrelišče pri 2355 C in gostoto 2,33 g/cm3. Ko se silikon segreje, reagira s halogeni (fluor, klor, brom in jod), da tvori halide [32]. Silikoni imajo izjemno širino kemičnih in fizikalnih lastnosti. So prožni in se upirajo vlagi, kemikalijam, toploti, hladu in ultravijoličnemu sevanju. Izdelki so zaradi naštetih lastnosti estetsko prijetnejši, lažji za uporabo, uporabnejši in zelo dolgoročno stabilni [9] [48]. Pridobivanje silikonov Silikoni se proizvajajo s tristopenjsko sintezo: Sinteza klorosilana: uporabljena je silicijeva kovina, pridobljena z redukcijo peska pri visoki temperaturi): SiO2 + 2C Si + 2CO [3] [50] in metilklorida, pridobljenega s kondenzacijo metanola s klorovodikovo kislino: katalizator CH3 + HCl CH3Cl + H2O [50]. Reakcija, s katero pridobimo klorosilane, poteka v fluidiziranem sloju silicijevega kovinskega prahu, v katerem poteka tok metilklorida, običajno pri temperaturah od 250 C do 350 C in pri tlakih od 1 bar do 5 bar. Dobimo zmes različnih silanov, ki vsebujejo predvsem dimetildiklorosilan, Me2SiCl2. Reakcija je eksotermna, uporablja pa se katalizator iz bakra

27 Različne silane ločimo z destilacijo. Ker so vrelišča podobna, so v silikonskih tovarnah potrebne dolge destilacijske kolone [50]. Hidroliza klorosilana: polidimetilsiloksane dobimo s hidrolizo dimetidiklorosilana v prisotnosti vode. S to heterogeno in eksotermno reakcijo nastane disilanol Me2Si(OH)2, ki zlahka kondenzira s katalizatorjem (HCl), pri čemer dobimo mešanico linearnih ali cikličnih oligomerov z inter- ali intramolekularno kondenzacijo. Ta zmes se loči od faze vodne kisline, razmerje med obema oligomeroma pa je odvisno od pogojev hidrolize (koncentracije, ph, topila). Ti oligomeri so očiščeni z vodo, nevtralizirani in sušeni. HCl se reciklira in reagira z metanolom, da nastane metilklorid, uporabljen v neposrednem postopku, opisanem zgoraj [7] [50]. Polimerizacija in polikondenzacija: Linearni in ciklični oligomeri, dobljeni s hidrolizo dimetildiklorosilana, imajo za večino aplikacij v svoji kemijski strukturi prekratke verige. Ciklične reakcije so katalizirane s številnimi kislimi ali baznimi spojinami. Delež ciklov je odvisen od substituentov vzdolž verige, temperature in prisotnosti topila. Dolžina polimerne verige je odvisna od prisotnosti snovi, ki lahko dajejo verige. Silikone dobimo s strukturnim modificiranjem silicija z dodajanjem molekul ogljika. Na ta način so silikoni polimeri, ki združujejo lastnosti kovine z raznolikostjo plastike [7] [48]. Slika 2.3: Industrijsko pridobivanje silikona [7]

28 Lastnosti silikonov Silikoni se razlikujejo od večine industrijskih polimerov, saj verige povezanih atomov, ki tvorijo osnovo njihovih molekul, ne vsebujejo ogljika, značilnega elementa organskih spojin. Splošna formula za silikone je (R2SiO)X, kjer je R lahko katera koli od različnih organskih skupin. Verige in prečke določajo mehanske lastnosti iz tekočega olja preko gelske strukture do gumijastega elastomera. Stranske verige se lahko spremenijo, vendar se najpogosteje spremenijo v metilne skupine, kot recimo v polidimetilsiloksanu (PDMS). Silikoni so hidrofobni in biostabilni elastomeri brez potrebe po dodanih plastifikatorjih. Nekatere študije predpostavljajo povezavo med oljnimi silikonskimi ostanki in hematološkimi rakavimi obolenji in boleznimi vezivnega tkiva, zaradi česar bodo v prihodnosti potrebna še nadaljnja raziskovanja o uporabi silikonskih materialov v medicinske namene [6]. Zaradi viskoelastičnega obnašanja so silikoni, ki so ojačani s smolo ali delno zamreženi elastomeri (npr. geli), občutljivi na mehanske obremenitve. Na drugi strani pa je njihovo mehko, gumijasto obnašanje zelo primerno pri uporabi materialov, ki so namenjeni za stik z biološkimi tkivi (npr. nizka sila odstranjevanja od kože, nežna odstranitev, brez oprijemanja na rano). To omogoča tudi njihovo uporabo pri prenašanju transdermalne dostave zdravil in aplikacije na rane, z namenom zaščite obližev ali premazov na kožo z minimalnim učinkom na rano [9]. Visoka prepustnost silikonov dovoljujejo difuzijo številnih snovi, kot so plini (kisik, ogljikov dioksid, vodna para) in različne aktivne snovi (rastlinski ekstrakti, zdravila ali celo beljakovine). To pojasnjuje njihovo uporabo v osebni negi, v aplikacijah za kožo ali rane, kot lepila ali elastomeri v nadzorovanih sistemih za dostavo zdravil [9]. Polidimetilsiloksan (PDMS) Polidimetilsiloksan je organski polimer, sestavljen iz silicijeve osnove. Je netoksičen, negorljiv, nereaktiven ter hidrofoben. Zato so PDMS med najbolj ugodnimi polimeri glede biokompatibilnosti [9]

29 PDMS polimeri ne potrebujejo stabilizatorjev zaradi svoje notranje stabilnosti ter mehčalcev zaradi nizke Tg (temperatura steklastega prehoda). Ta skupina materialov ima nizko tekočo površinsko napetost (okoli 20,4 mn/m) in nekoliko višjo kritično površinsko napetost vlaženja (24 mn/m), zaradi česar PDMS polimeri enostavno tvorijo filme čez podlage, kot je npr. koža, lahko pa so razporejeni tudi po lastni absorbirani foliji [9]. Ta skupina polimerov ima svojo zaščito pred mikroorganizmi, zaradi česar je zmanjšano pritrjevanje proteinov in bakterij na površino PDMS izdelkov. Najpogosteje se pri premazih PDMS polimernih izdelkov uporabljajo polietilen glikol, hialuronska kislina, glikol in hitozan [51]. Slika 2.4: Skeletna formula poli (dimetilsiloksana) [6]

30 Antibiotik»Amoksiklav«"Amoksiklav«(komercialno ime) je antibiotik, ki deluje tako, da ubija bakterije, ki povzročajo okužbe. Vsebuje dve različni učinkovini, ki se imenujeta amoksicilin in klavulanska kislina. Amoksicilin spada v skupino zdravil, imenovanih "penicilini", katerih delovanje je lahko včasih onemogočeno (inaktivirano). Druga zdravilna učinkovina (klavulanska kislina) prepreči, da bi se to zgodilo. Amoksicilin je polsintetski penicilin (betalaktamski antibiotik), ki zavira enega ali več encimov (beljakovine, ki vežejo penicilin) v biosintezni poti bakterijskega peptidoglikana, ki je integralna sestavina zgradbe bakterijske celične stene. Zavrtje sinteze peptidoglikana oslabi celično steno bakterije, temu po navadi sledi liza celice in smrt. Amoksicilin je občutljiv za razgradnjo z betalaktamazami, ki jih proizvaja rezistentna bakterija, in zato spekter delovanja samega amoksicilina ne zajema organizmov, ki izdelujejo te encime. Klavulanska kislina je betalaktam, ki je po zgradbi podoben penicilinu. Inaktivira nekatere betalaktamaze in tako prepreči inaktivacijo amoksicilina. Klavulanska kislina sama nima klinično uporabnega protibakterijskega učinka. Slika 2.5: Skeletna formula amoksicilina [13] Zdravilo Amoksiklav je indicirano (se uporablja) za zdravljenje naslednjih bakterijskih okužb pri odraslih in otrocih: hude okužbe ušes, nosu in grla, okužbe dihalnih poti, okužbe sečil,

31 okužbe kože in mehkih tkiv, vključno z okužbami obzobnega tkiva, okužbe kosti in sklepov, okužbe v trebušni votlini, okužbe ženskih spolnih organov. Amoksiklav se uporablja tudi za preprečevanje okužb, povezanih z večjimi kirurškimi posegi pri odraslih in otrocih [10]. Teoretične osnove analiznih metod Dinamično sipanje svetlobe Dinamično sipanje oz. razprševanje svetlobe (DLS), ki se imenuje tudi kvazi-elastično razprševanje svetlobe (QELS), je neinvazivna, dobro uveljavljena tehnika za merjenje velikosti ter porazdelitve molekul in delcev, značilnih v podmikronskem območju. Najpogosteje se uporablja pri karakterizaciji delcev, emulzij ali molekul velikosti med 3 in 3000 nm, ki so razpršene ali raztopljene v tekočini. Ostale tehnike pri tem velikostnem območju niso primerne, saj so nanodelci premajhni za optično mikroskopijo, preveliki za elektronsko mikroskopijo in preveč redki za pridobitev natančnih rezultatov [52][53]. Brownovo gibanje delcev ali molekul v suspenziji povzroči razpršenost laserske svetlobe z različnimi intenzitetami. Analiza teh fluktuacij intenzitete povzroči hitrost Brownovega naključnega gibanja delcev in s tem velikost delcev z uporabo Stokes-Einsteinove zveze. Ta analizna metoda omogoča tudi merjenje hitrosti, npr. gibanje mikroorganizmov in analiza tokov v tekočinah [53]

32 Slika 2.6: Shematski prikaz delovanja DLS [54] Dinamično sipanje svetlobe omogoča sipanje laserske svetlobe, kar imenujemo Frauenhof sipanje, kjer je kot razpršitve svetlobe odvisen od velikosti delcev (večji kot sipanja je pri manjših delcih ter isti kot pri delcih enakega velikostnega razreda. Termične fluktuacije lomnega količnika nenehno spreminjajo električno polje sipane svetlobe. Kadar je vir svetlobe laser in je svetloba monokromatska, lahko z avtokorelacijsko funkcijo določimo ponavljajoče se vzorce in s tem sledimo gibanju delcev, kar nas pripelje do difuzijskega koeficienta, iz česar lahko ob poznavanju lastnosti disperzije sklepamo o velikosti delcev. Meritve omogoča laserski žarek, ki sveti na kiveto preko leče (Slika 2.6). V kiveti je vzorec, ki je raztopina dispergiranih delcev v topilu. Svetloba se na vzorcu sipa, kar detektiramo s fotopomnoževalko, signal pa prenesemo na računalnik. Oblika delcev ne vpliva na intenziteto razpršitve svetlobe ter sipanje. Računalnik, ki ga uporabljamo, ima vgrajen korelator [52][53][54][55]. Enačba avtokorelacijske funkcije intenzitete sipane svetlobe je: G(2)(τ) = < I(t)I(t + τ) >, kjer je: (2.1)

33 τ = časovni zamik korelatorja, < > = povprečje po času. Za delce, za katere je značilno Brownovo gibanje, avtokorelacijska funkcija kot funkcija časovnega zamika eksponentno pada: G(τ) = A + B exp ( 2τ ), kjer je: (2.2) τd A in B = amplituda statičnega oz. dinamičnega dela, τ d = difuzijski čas. τd velja ob translacijskem Brownovem gibanju delcev v obliki enačbe: (1/ τd ) = D q 2, (2.3) pri čemer je sipalni vektor q: q = 4πn sin(θ 2 ), kjer je: (2.4) λ n = lomni količnik vode, v kateri so dispergirani delci, θ = sipalni kot, λ = valovna dolžina laserske svetlobe. Pri analizi vzorca opazujemo sipanje pri različnih sipalnih kotih θ ter ustvarimo funkcijo med obratno vrednostjo difuzijskega časa τd in kvadratom valovnega vektorja q 2. Zaradi linearnosti zveze lahko preko le-te dobimo difuzijsko konstanto D. Difuzijska konstanta za translacijsko gibanje sferičnih sipalcev je podana z zvezo: D = kt 6πrη, kjer je: (2.5) k = Boltzmannova konstanta, T = temperatura raztopine oz. vzorca, r = polmer delcev, η = viskoznost medija

34 Pri znanima η in T, lahko iz meritev difuzijske konstante s pomočjo izračuna dobimo polmer delcev v raztopini [55]. Elektrokinetični pojavi na mejnih površinah Elektrokinetične meritve nam omogočajo oceno velikosti Sternovega potenciala (Ψd). V Sternovi plasti se nahajajo ioni, koloidni delci in določena količina topila. Elektrokinetični del sestavljajo nabiti delci, specifično adsorbirani ioni in topilo. Zaradi električnega polja se nabiti delci v raztopini elektrolita gibljejo, posledica gibanja pa je nastanek strižne ploskve med medijem in delci. Potencial na strižni ploskvi je imenovan elektrokinetični oz. zeta (ξ) potencial, njegovo vrednost pa dobimo z eksperimentalnimi meritvami. Položaj strižne ploskve se razlikuje od položaja Sternove ravnine, saj leži bolj stran od površine delca proti raztopini. Zato je zeta potencial navadno manjši od Sternovega potenciala. Velikost razlike med potencialoma je odvisna od koncentracije elektrolitov v mediju (od ionske jakosti) in od potenciala na površini delca. Sternov in zeta potencial sta enaka, ko ima raztopina zelo nizko koncentracijo elektrolita (ali pa je brez dodanega elektrolita), pri čemer je debelina električnega dvosloja zelo velika [60]. Zeta potencial je torej funkcija površinskega naboja delcev, vsake adsorbirane plasti na vmesnem območju, narave in sestave okoliškega suspenzijskega medija, ki se lahko eksperimentalno določi. Ker odraža učinkovito napetost na delcih in je zato povezan z elektrostatičnim odbojem med njimi, se je zeta potencial izkazal kot izredno pomemben parameter pri nadzoru koloidne stabilnosti in flokulacijskih procesov. Kadar imajo delci v suspenziji velik negativen ali pozitiven zeta potencial, nimajo tendence po združevanju drug z drugim. V primeru nižjih zeta potencialnih vrednosti ni prisotne sile za preprečitev združevanja delcev, zaradi česar pride do flokulacije. Raztopine z delci z zeta potencialom, ki je bolj pozitiven kot +30 mv ali bolj negativen od -30 mv, se štejejo za stabilne. Če se ta potencial premika okoli 0 mv, možnost agregacije delcev narašča [61] [62]

35 Slika 2.7: Zeta potencial in površine, ki sodelujejo pri tem pojavu [61] Za določitev stabilnosti disperzij izkoriščamo elektrokinetični pojav elektroforeze. Pri tem opazujemo hitrost gibanja nabitih koloidnih delcev v električnem polju, pri čemer predpostavimo, da električno polje ne deformira električnega dvosloja delcev. Formula za izračun jakosti električnega polja: E = U l e, kjer je: (2.6) U = napetost, l e = razdalja med elektrodama, ki jo uporabimo pri izračunu hitrosti. Za okrogle delce velja, da je njihova hitrost sorazmerna električni poljski jakosti E: v = ue, kjer je: (2.7)

36 E = jakost električnega polja, u = elektroforetska gibljivost ionov, ki je odvisna od naboja delca. Z merjenjem hitrosti gibanja delcev v električnem polju z jakostjo E lahko izmerimo njihovo gibljivost. Elektroforetska gibljivost, u, je odvisna od naboja delca, zato lahko iz nje izračunamo tudi potencial ξ. Za ukrivljene površine uvedemo brezdimenzijski parameter κa, ki je razmerje med debelino električnega dvosloja (λd = κ -1 ) in radijem ukrivljenosti delca (a), torej: a/λd. Če je κa majhen, lahko imamo delec za točkasti naboj, kadar pa je velik, predpostavimo, da je dvoplast ravna (a gre v neskončnost). Hückelova enačba (majhni κa) in enačba Smoluchowskega (veliki κa) Na ione v električnem polju deluje električna sila (F el = ze0e), ki jih pospešuje, in sila viskoznega upora medija (Fŋ = ƒv), ki jih zavira. Ko sta električna in viskozna sila nasprotno enaki (Fel = Fŋ), se ioni gibljejo enakomerno. Za sferične delce z radijem a velja Stokesova zveza: ƒ = 6πŋa. Če uporabimo še definicijo gibljivosti iona u, dobimo sledeči zvezi: v = ze 0E 6πŋa u = ze 0 6πŋa ali (2.8) (2.9) v = hitrost, u = gibljivost iona, z = naboj, e 0 = elementarni naboj ( 1, C), E = jakost električnega polja, Ŋ = viskoznost, a = polmer. Enačbi veljata za enostavne ione. Pri koloidnih delcih pa je naboj takšnih delcev odvisen od okolice, pri čemer je potrebno upoštevati tudi električni dvosloj. Zvezo med zeta potencialom in elektrokinetično gibljivostjo izraža Hückelova enačba, ki velja za koloidne raztopine, kjer je

37 κa 0,1. Ta pogoj je dosežen le pri zelo nizkih koncentracijah elektrolita v vodi ali pa v nevodnih medijih z majhno prevodnostjo. Enačbo zapišemo kot: u = 2εξ, kjer je: (2.10) 3ŋ ε = ε 0ε r, ε 0 = influenčna konstanta = 8,85419 x A s V -1 m -1, ε r = dielektrična konstanta. Smoluchowski pa je izpeljal enačbo, ki velja za gibanje tekočine ob velikem neprevodnem delcu (približek, da je κa majhen, ne velja) v električnem polju z jakostjo E. Ko sta električna in viskozna sila na delec nasprotno enaki, je hitrost vsake plasti tekočine konstantno. Električna dvoplast ima v tem primeru zanemarljivo majhno debelino v primerjavi s krivinskim radijem delca. V tem primeru velja zveza: u = εξ ŋ (2.11) Enačba 2.11 nam pove, da je elektroforetska gibljivost velikih neprevodnih delcev, za katere je κa velik (območje veljavnosti te enačbe za sferične delce κa 100), neodvisna od njihove velikosti in oblike, če je potencial ξ konstanten [56]

38 UV-VIS spektrometrija Ultravijolično vidna spektroskopija ali ultravijolično vidna spektrofotometrija (UV-VIS ali UV / VIS) je absorpcijska spektroskopija v ultravijoličnem vidnem spektralnem območju. To pomeni, da uporablja svetlobo v vidnem in sosednjih (bližnje UV in bližnje infrardeče (NIR) območje) območjih, pri čemer snov, ki prepušča svetlobo, selektivno sprejme točno določene frekvence elektromagnetnega sevanja. Ultravijolično (UV) območje je običajno od 200 do 400 nm, vidni del pa je od 400 do 800 nm. Absorpcija v vidnem območju neposredno vpliva na zaznano barvo vključenih kemikalij. UV / VIS spektroskopija se uporablja pri kvantitativnem določanju raztopin ionskih ionov prehodnih kovin z visoko konjugiranimi organskimi spojinami in bioloških makromolekul. Absorbanca raztopine narašča, če se zmanjšuje intenziteta elektromagnetnega valovanja po prehodu skozi raztopino [57] [58]. Pri absorpciji fotonov določenih valovnih dolžin atom, ion ali molekula pridobi njihovo energijo in preide iz osnovnega (stabilno, nižje energetsko stanje) v vzbujeno stanje (nestabilno, višje energetsko stanje). Absorpcijske lastnosti analiziranih snovi so izražene v obliki absorpcijskega spektra. UV/VIS absorpcijski spekter je v obliki ozkih pikov (krivulj, ki imajo ožjo obliko) pri preprostih molekulah v plinskem stanju, medtem ko so širši piki pri ionih in molekulah v raztopinah. Širši piki nastanejo zaradi vibracijskih in energijskih sprememb. Vibracijske spremembe so posledica vibracijskih stanj, ki so povezana z vezmi, ki povezujejo dele molekule. Rotacijske spremembe pa nastanejo zaradi rotacijskega premikanja molekule okrog njene gravitacijske osi [57]. Delovanje instrumenta je razmeroma enostavno. Svetlobni žarek iz vidnega in / ali UVsvetlobnega vira (rdeče barve) je ločen v njene komponentne valovne dolžine s prizmo ali difrakcijsko mrežico. Vsaki monokromatski (enojna valovna dolžina) žarki so razdeljeni na dva enakovredna žarka s polzrcalno napravo. En žarek je vzorčni žarek, ki prehaja skozi majhno prozorno posodo (kiveto). Ta vsebuje raztopino spojine, ki jo preučujemo v prozornem topilu. Drugi žarek je referenčni in prehaja skozi identično kiveto, ki pa vsebuje le topilo. Intenzivnost teh svetlobnih žarkov se izmeri z elektronskimi detektorji, nato pa sledi primerjava. Intenzivnost referenčnega žarka, ki dopusti malo ali nič absorpcije svetlobe, je definirana kot I0. Intenzivnost vzorčnega žarka je definirana kot I. V kratkem času spektrometer samodejno pregleda vse valovne dolžine sestavnih delov na opisani način [58]

39 Če vzorčna spojina ne absorbira svetlobe dane valovne dolžine, je I = I0. Če pa vzorčna spojina absorbira svetlobo, potem je I manjša od I0, to razliko pa lahko opišemo na grafu glede na valovno dolžino. Absorbanca se nanaša na količine molekul, ki absorbirajo elektromagnetno valovanje, ki preide skozi vzorec. Torej, odvisna je od koncentracije vzorca ter od dolžine poti svetlobe pri prehodu skozi vzorec. Razmerje med absorbanco, koncentracijo in dolžino poti sevanja nam kaže Beer-Lambertov zakon (enačbi 2.7. in 2.8.). Večina spektrometrov prikazuje absorpcijo na navpični osi, običajno pa je obseg od 0 (100% prepustnost) do 2 (1% prepustnost). Valovna dolžina največje absorbance je značilna vrednost, označena kot λmax [58]. Različne spojine imajo lahko zelo različne absorpcijske maksimalne vrednosti in absorbance. Intenzivno absorbirajoče spojine je treba analizirati v razredčeni raztopini, tako da detektor dobi pomembno svetlobno energijo, kar zahteva uporabo popolnoma prozornih (ne absorbirajočih) topil. Najpogosteje uporabljena topila so voda, etanol, heksan in cikloheksan. Ker je absorbanca vzorca sorazmerna z molarno koncentracijo v kiveti vzorca, se pri primerjavi spektrov različnih spojin uporabi popravljena absorpcijska vrednost, znana kot molska absorpcijska sposobnost [58] [59]. To je opredeljeno kot molska absorpcijska sposobnost: ε = Abs, kjer je: (2.12) C l Abs = absorbanca, c = koncentracija vzorca v mol/l, l = dolžina svetlobne poti skozi kiveto v cm. Absorpcija je lahko definirana kot absorbanca (Abs) in je definirana je z enačbo: A = log 10 T = log I 0, kjer je: (2.13) I T = transmisija, I 0 = začetna intenziteta sevanja, I = izhodna intenziteta sevanja

40 Absorpcija je lahko definirana tudi kot prepustnost: T = I 0 I I 0 (2.14) Če do absorpcije ni prišlo, je T = 1,0 in A = 0 [58] [59]. Obdelava materiala Plazma aktivacija: Kisikova plazma Plazma se uporablja v obliki neravnovesnih plinov, ki so bogati z ustreznimi radikali. Ti s površino polimernih materialov omogočijo funkcionalizacijo z izbranimi funkcionalnimi skupinami. S spremembo površine materiala se izboljša vezava, tiskanje, lakiranje, premazovanje ali omočljivost. Hidrofilne lastnosti površine nastanejo s funkcionalizacijo s polarnimi skupinami, ki vsebujejo kisik, kot je -CO, -C = O in -COO-. Zaradi zmanjšane stabilnosti polarnih skupin je potrebno čim hitreje na površino ustvariti še premaz. Po opravljenem premazovanju pa stabilnost ni več problematična. Običajno se plazma aktivacija uporablja pri izdelavi elektronskih naprav, medicinskih pripomočkov, tekstila, plastike in gume. Skoraj vsak suh material lahko tretiramo v plazemski komori. Organskih površinskih onesnaževalcev ne vidimo s prostim očesom, vendar pa močno vplivajo na sposobnost objekta za interakcijo z drugimi materiali. Ko s plazmo obdelamo površino materiala, lahko odstranimo te kontaminante [60][61]. Plazma je plin, sestavljen iz nabitih delcev; prostih elektronov in ionov. Bolj natančna definicija pa zahteva, da veljajo naslednji kriteriji: - vsak izmed nabitih delcev mora biti dovolj blizu drugim delcem, da vpliva na čim večje število bližnjih nabitih delcev. Približek je dober, če plazma zasenči vsako področje z dodatnim prostorskim nabojem na karakteristični razdalji Debyevi dolžini [62], - Debyeva dolžina mora biti majhna v primerjavi s fizično velikostjo plazme, da lahko zanemarimo robne efekte [62], - plazemska frekvenca mora biti majhna v primerjavi s frekvenco trkanja elektronov ob nevtralne delce. Ko je ta pogoj izpolnjen, plazma senči naboj; pojavijo se kvazinevtralna območja, kar je tudi lastnost plazme

41 Izraz gostota plazme pomeni gostoto elektronov v plazmi, ki je definirana kot število elektronov na enoto volumna. Stopnja ionizacije je odvisna predvsem od temperature in je višja, če je temperatura višja, saj je posledično več ioniziranih delcev. Stopnja ionizacije je razmerje med številom atomov, ki so izgubili (zajeli) elektron, in vsoto števil nevtralnih atomov in ionov [62] [63]. Kisikova plazma se nanaša na kakršno koli plazemsko uporabo, ki se izvaja ob uvajanju kisika v plazemsko komoro. Kisik se pogosto uporablja za čiščenje površin pred vezavo, lahko pa se kombinira tudi z drugimi plini za jedkanje različnih materialov, kot so plastika in guma. Kisikova plazma se uporablja tudi za doprinos novih polarnih skupin na površini materiala. Tako kot druge oblike plazme, kisik očisti organske snovi in omogoči površinske spremembe. Plazma O2 očisti površino plastičnega vzorca in poveča njegovo omočljivost. Kisikova plazma se lahko uporablja tudi za čiščenje kovinskih površin, če je pomešana z argonom. Argon prepreči kisiku stik s kovino, s čimer se prepreči oksidacija [53]. V plazemsko komoro najprej vstavimo izdelek, nato pa ustvarimo plazmo. Te pline nato napaja RF (radijska frekvenca) moč, ki je nastala med množico elektrod. Zračni prostor v komori ali ohišju se izčrpa pred vstopom plina (nastane vakuum). Plin se nato v nizkem tlaku pretaka v napravo brez energije (električna energija). Aktivirani ioni v plinih se pospešijo in začnejo vibrirati. Te vibracije nato "brizgajo" na površine v komori. Obdelava v plazmi je lahko izvedena pri nizki temperaturi, zaradi česar se zlahka obdelujejo tudi materiali, ki so občutljivi na toploto. Postopke plazemske obdelave lahko izvedemo z uvedbo različnih plinov v komoro. Običajno se uporabljajo plini O2, N2, Ar, H2 in CF4. Lahko jih uporabljamo posamezno ali pa v kombinaciji. Obdelava materialov s plazmo na splošno traja približno pet do osem minut [61] [63]

42 Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) Vrstična elektronska mikroskopija (angl. Scanning Electron Microscopy) se uporablja pri analizah površine materialov. Elektroni, ki omogočajo nastanek slike, nastajajo v elektronski puški. Pri analiziranju se uporablja z magnetnimi lečami osredotočen žarek vzorca visokoenergetskih elektronov, ki vrstično potuje po površini ter pri tem generira različne signale na površini trdnih vzorcev. V komori za vzorec na spodnjem koncu mikroskopskega stolpca se nahaja vzorec in detektorji za različne signale, ki jih generira interakcija vzorec-elektroni. Med primarnim snopom elektronov in preiskovano površino pride do emitiranja sekundarnih elektronov, odbitih elektronov, rentgenskih žarkov in vidne svetlobe. Signali, ki izhajajo iz interakcij med elektroni in vzorci, razkrivajo informacije o vzorcu, vključno z zunanjo morfologijo (teksturo), kemijskim sestavo in kristalinično strukturo. V večini aplikacij se podatki zbirajo na izbranem območju površine vzorca in generira se 2-dimenzionalna slika na fluorescentnem zaslonu, ki prikazuje prostorske razlike v teh lastnostih. Pridobljene podatke lahko tudi fotografiramo [64] [65]. Stolpec za mikroskop in preizkusna komora uporabljata kombinacijo pred-vakuuma in visokih vakuumskih črpalk (običajno oljne difuzijske črpalke), saj elektronska pot zaradi njihove nizke mase ni dolga. Elektronsko konzolo sestavljajo: električni napajalniki za pospeševalno napetost, kondenzatorske in objektivne leče, skenerski generator in elektronski ojačevalniki za različne pridobljene signale [46] [64]. Največje povečave dosežejo elektronski mikroskopi, ki so do 1000-krat boljši od optičnih mikroskopov, saj je valovna dolžina elektronov krat krajša od vidne svetlobe (ločljivost mikroskopa je tem boljša, čim manjša je valovna dolžina uporabljenega izvora). S tem mikroskopi lahko dosežejo povečavo do 106-krat in povprečno ločljivost 1 nm [65] [66]. Primerjava SEM IN TEM (Presevna ali transmisijska elektronska mikroskopija) Princip transmisijske elektronske mikroskopije (TEM), kot že ime pove, je uporaba elektronov, ki prehajajo skozi vzorec, preden se zberejo. Kot rezultat, TEM omogoča informacije o notranji strukturi vzorca, kot so kristalna struktura, morfologija in stanje napetosti, medtem ko SEM zagotavlja informacije o površini vzorca in njegovi sestavi

43 Poleg tega je ena izmed najbolj izrazitih razlik med obema metodama optimalna prostorska ločljivost, ki jo lahko dosežejo; SEM resolucija je omejena na ~ 0,5 nm, medtem ko je z nedavnim razvojem TEM-naprav, popravljenih pri aberaciji, zabeležene slike s prostorsko ločljivostjo, ki je še manj kot 50 pm [67] [68]. Sistema mikroskopiranja se razlikujeta po načinu delovanja. Pri SEM se običajno uporabljajo pospeševalne napetosti do 30 kv, pri TEM pa je možnost nastavitve v razponu od 60 do 300 kv [68]. Povečave, ki jih omogočajo transmisijski elektronski mikroskopi, so veliko večje kot pri vrstičnih elektronskih mikroskopih: pri TEM je mogoča povečava za več kot krat, medtem ko je za SEM omejitev na krat [65] [67] [68]. Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FT-IR) FTIR spektrometrija (angl. Fourier Transform Infrared Spektrometer) se pogosto uporablja v organski sintezi, polimernih znanostih, petrokemijskem inženirstvu, farmacevtski industriji in analizi hrane. S spektrometri FTIR lahko preučujemo mehanizem kemičnih reakcij in odkrivanje nestabilnih snovi [19]. Infrardeče območje sega med cm -1 in se lahko razdeli na bližnje infrardeče območje ( cm -1 ), srednje infrardeče območja ( cm -1 ) in daljno infrardeče območje ( cm -1 ) [19]. Infrardeča absorpcijska spektroskopija je metoda, ki se uporablja za določanje strukture molekul (kemijske vezi) z značilno absorpcijo infrardečega sevanja molekul. Infrardeči spekter je molekularni vibracijski spekter. Pri izpostavljenosti infrardečemu sevanju vzorčne molekule selektivno absorbirajo sevanje specifičnih valovnih dolžin, kar povzroči spremembo dipolnega momenta vzorčnih molekul. Posledično se vibracijski nivoji molekul vzorcev prenesejo iz osnovnega nivoja v vzbujeno stanje. Frekvenca absorpcijskega vrha je določena z vibracijsko energijsko vrzeljo. Število absorpcijskih vrhov je povezano s številom vibracijske ohlapnosti molekule. Intenzivnost absorpcijskih vrhov je povezana s spremembo dipolnega momenta in možnostjo prehoda ravni energije. Zato lahko z analizo infrardečega spektra dobimo obsežne strukturne in elementarne informacije molekule. Možna nihanja naraščajo z velikostjo

44 molekule, zaradi česar so lahko IR spektri velikih molekul kompleksni in je težavno določevanje, kateremu nihanju ustreza določen absorpcijski trak [19] [64]. Večina molekul je infrardeče aktivna (razen nekaj dvoatomskih molekul elementov, kot so O2, N2 in Cl2 zaradi spremembe ničelnega dipola v vibriranju in vrtenju teh molekul). Metoda je uporabna za plinske, tekoče in trdne vzorce. Skupno uporabljeno območje za infrardečo absorpcijsko spektroskopijo je cm -1, saj je v tem območju absorpcijsko sevanje večine organskih spojin in anorganskih ionov. Pri visokih valovnih številih bo absorpcija potekala pri skupinah z lahkimi atomi, ki so povezani z močnimi vezmi. Najlažji atom - vodik je v organskih spojinah vezan na ogljik, kisik ali dušik, izjemoma tudi na žveplo. S temi atomi vodik tvori močne vezi, ki imajo absorpcijske trakove pri visokih valovnih številih. Vezi C - C, C - O, C - N, C - halogen in druge imajo nižje frekvence, malo višje pa dvojne in trojne vezi (C = O, C C, C N) [19] [69]. FT-IR spektrometer je sestavljen iz vira, interferometra, vzorčnega dela, detektorja, ojačevalnika, pretvornika A in računalnika. Vir ustvarja sevanje, ki prehaja vzorec skozi interferometer in doseže detektor. Nato signal ojačamo in pretvorimo v digitalni signal s pomočjo ojačevalnika in analogno-digitalnega pretvornika. Signal se nato prenese na računalnik, v katerem se izvede Fourierjeva transformacija. Imenovana je po francoskem matematiku in fiziku Jean Baptiste Joseph Fourierju ter je matematična metoda za preoblikovanje funkcije v novo funkcijo, kjer so spektri predstavljeni kot oris intenzitete glede na valovno številko (v cm- 1 ). Intenzivnost se lahko opiše kot odstotek svetlobne prepustnosti ali absorbance pri vsakem valovnem številu [19][70]

45 Slika 2.7: FT-IR spektrometer in njegovi sestavni deli V IR spektrih se uporablja namesto valovne dolžine valovno število (ν), ki je obratna vrednost valovne dolžine, izražena v cm -1. v = 1 = ν, kjer je: (2.15) λ c v = valovno število, ν = frekvenca valovanja, λ = valovna dolžina, c = hitrost fotona [69] [71]. Spektroskopija fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki (XPS) Spektroskopija fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki (angl. X-ray Photoelectron Spectroscopy) je najbolj razširjena tehnika površinske analize, saj jo je mogoče uporabiti za širok spekter materialov. Z njo pridobimo količinske in kemične podatke o stanju s površine preučevanega materiala, prvenstveno pa je namenjena za ugotavljanje kemijskega stanja vseh kemijskih elementov razen vodika in helija (majhna verjetnost oddaje elektronov). XPS omogoča zaznavo elementov od litija naprej (od vrstnega števila 3 naprej) [72] [73]

46 Analiza temelji na pojavu fotoefekta. Rentgenska svetloba energije najprej obseva atome, sledi pa meritev energije elektronom (Ev), ki so bili izbiti iz notranjih energijskih nivojev. Trdno površino zapustijo samo Augerjevi elektroni vrhnjih plasti. Ti elektroni imajo višjo kinetično energijo (Ek) od izstopne površine, kar nam omogoča, da dobimo fotoelektronski spekter. Zvezo med delom elektrona, ki je potrebna, da zapusti vzorec (eφ), kinetično energijo elektrona (Ek), energijo fotona (hν) in vezavno energijo elektrona (Ev) nam poda naslednja enačba [74]: E ν = hν E k e Φ [75] (2.16) Spekter nam loči število elektronov glede na kinetično energijo. Zaradi presežka pozitivnega naboja na površini, ki vpliva na obliko vrhov v spektru in energijsko lego, ima XPS spektrometer elektronsko puško. Ta se uporablja za obstreljevanje površine neprevodnih vzorcev z nizkoenergijskimi elektroni, ki nevtralizirajo pozitivni površinski naboj. S to metodo ni mogoča analiza vodika in helija[51] [72] [75] [76]. Slika 2.8: Shematski prikaz XPS analize [72]

47 Franz celica V preteklih letih so in vitro analize Franzove difuzije postale ene izmed najbolj pomembnih metod za raziskovanje transdermalne uporabe zdravil. Najpogostejša metoda IVRT (in vitro testiranje sproščanja) se lahko uporablja s sintetično membrano, tkivom ali biološkim vzorcem, kot je koža kadavra. Membrana ločuje prostor z vzorcem in del z receptorjem, napolnjen z zbiralnim medijem. Pogosto se za zbiralni medij uporablja fosfatna pufrska sol (PBS). Analiza difuzije zdravila iz poltrdnega produkta skozi membrano se opravlja s testom zaporedno zbranih vzorcev receptorskega medija. Na vnaprej določenih časovnih točkah se vzorec medija odstrani iz receptorskega oddelka za analizo vsebnosti zdravila, običajno z analizo HPLC (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti). Po vsakem vzorčenju se receptorski predel prelije s svežim medijem [77] [78]. Prednosti transdermalnih zdravil so: izogibanje metabolizmu prvega prehoda, zmanjšana toksičnost, manj stranskih učinkov in večje sprejemanje s strani bolnikov [77]. Metoda je nastala za potrebe ocene prepustnosti kože, saj je ključna pri vpogledu v interakcije med kožo, zdravilom in formulacijo. Testiranje je zelo koristno za načrtovanje in razvoj novih formulacij, kot tudi za nadzor toksičnosti in nadzor kakovosti. Ključno je, da so pri teh študijah difuzije tipa Franz pogosto uporabljene sintetične membrane kot model prave kože. Čeprav umetne membrane ne bodo modelirale učinkov perturbacije lipidov v bioloških vzorcih, pa je mogoče sklepanje o razdelitvi in difuzijski pojavi [77]. Sintetične membrane so lahko primernejše kot kožno tkivo, saj njihova dobava ni zahtevna, so cenejše in strukturno enostavnejše. Te membrane so boljši pokazatelj podatkov, saj so odstranjene in vivo spremenljivke, kot so starost kože, rasa, spol in anatomsko mesto. Študije pogosto pri testiranjih navajajo PDMS kot material, ki je predstavljal kožo [77]

48 Vzorčenje ima vsaj pet časovnih točk v primernem časovnem obdobju, kar omogoča nastanek ustreznega profila sproščanja (tj. pri 30 min, 1, 2, 4 in 6 urah). Glede na učinek razpadanja zdravila in čas sproščanja, da dosežejo plato (ravnotežje), je morda treba prilagoditi čas vzorčenja. Rezultati so podatki sproščanja (μg/cm 2 hr) v določenem času. Poleg podatkov o sproščanju se uporabljajo tudi druge vrednosti, kot je pretok sproščene zdravilne učinkovine (μg/cm 2 hr), akumulacija v 24 urah (μg / cm 2 ) in prepustnost (cm/h) [78]. Prepustnost (P), je opredeljena kot hitrost toka tekočine ali plina skozi porozni material in se izračuna po naslednji enačbi: P = ( C receptor t A ) V receptor, kjer je: (2.17) C donor P = prepustnost Δ c receptor = sprememba koncentracije receptorja Δ t = sprememba časa A = površina V receptor = volumen receptorja c donor = koncentracija donorja

49 EKSPERIMENTALNI DEL Eksperimentalni del je bil sestavljen iz naslednjih delov: 1. Priprava raztopin tripolifosfata (TPP), hitozana in amoksiklava 2. Priprava nanodelcev iz TPP, hitozana in amoksiklava za nanos premaza na silikonske površine 3. Izdelava PDMS ploščic ter obdelava določenih ploščic s kisikovo plazmo 4. Meritve velikosti nanodelcev 5. Meritve zeta potenciala disperzije nanodelcev 6. Meritve z UV-VIS spektrometrijo in določitev enkapsulacije (ujetosti) zdravila v nanodelce 7. Obdelava materiala (plazma aktivacija: kisikova plazma) 8. Nanos disperzij na silikonske ploščice 9. Analiza silikonskih površin (z in brez premazov) s SEM mikroskopom 10. Analiza silikonskih površin (z in brez premazov) z metodo infrardeče spektroskopije s Fourierjevo transformacijo (FT-IR) 11. Analiza silikonskih površin (z in brez premazov) z metodo spektroskopije fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki (XPS) 12. Mikrobiološko testiranje površin silikonskih površin z in brez premazov 13. Testiranje sproščanja zdravilnih učinkovin iz površine z metodo Franz celice (študija desorpcije) Analizne metode so služile predvsem dokazovanju učinkovitosti in obstojnosti premaza. Pri delu smo vse analize opravili tudi na referenčnih silikonskih vzorcih brez premazov in brez aktivacije s kisikovo plazmo. Tako smo imeli referenčne rezultate, s katerimi smo lahko opazovali/ izračunali/izmerili razlike. Zaradi kompleksnosti dela smo opravili številne različne analizne metode, ki so nam na koncu pokazale smiselnost oz. efektivnost uporabljenih premazov na površini silikona. Rezultate analiznih meritev silikonskih ploščic, ki so bile pred nanosom premaza aktivirane s kisikovo plazmo, smo primerjali z referenco. To je bil vzorec silikonske ploščice, ki je bil aktiviran s kisikovo plazmo za 5 minut ter ni imel premaza. Zaradi omejitev števila vzorcev pri

50 analizah smo izbrali le eno referenco. Za ta vzorec smo namreč domnevali, da bi lahko imel najbolj ugodne rezultate zaradi najdaljšega časovnega obdobja obdelave s kisikovo plazmo

51 Shema dela EKSPERIMENTALNI DEL PLAZEMSKA AKTIVACIJA PDMS PLOŠČIC PRIPRAVA VZORCEV NANOS PREMAZOV NA PDMS PLOŠČICE PDMS TPP HITOZAN NANODELCI VRSTIČNO MIKROSKOPIRANJE IR S FOURIERJEVO TRANSFORMACIJO XPS MIKROBIOLOGIJA MERITVE VELIKOSTI NANODELCEV MERITVE ZETA POTENCIALA UV-VIS SPEKTROMETRIJA FRANZ CELICA

52 Seznam vzorcev Vzorec CH-TPP CH-TPP PDMS CH-TPP-AMOX CH-TPP-AMOX PDMS PLAZM 1 min PDMS CH-TPP PLAZM 1 min PDMS CH-TPP-AMOX PLAZM 2 min PDMS CH-TPP-AMOX PLAZM 3 min PDMS CH-TPP PLAZM 3 min PDMS CH-TPP-AMOX PLAZM 5 min PDMS PLAZM 5 min PDMS CH-TPP-AMOX Opis vzorca Disperzija nanodelcev tripolifosfata (TPP) in hitozana (CH) Premaz nanodelcev tripolifosfata (TPP) in hitozana (CH), ki je nanešen na silikonski nosilec Disperzija nanodelcev hitozana, tripolifosfata (TPP) in amoksiklava Premaz nanodelcev hitozana, tripolifosfata (TPP) in amoksiklava, ki je nanešen na silikonski nosilec Premaz nanodelcev hitozana in tripolifosfata (TPP), ki je nanešen na silikonski nosilec, ki je bil aktiviran s kisikovo plazmo za 1 min Premaz nanodelcev hitozana, tripolifosfata (TPP) in amoksiklava, ki je nanešen na silikonski nosilec, ki je bil aktiviran s kisikovo plazmo za 1 min Premaz nanodelcev hitozana, tripolifosfata (TPP) in amoksiklava, ki je nanešen na silikonski nosilec, ki je bil aktiviran s kisikovo plazmo za 2 min Premaz nanodelcev hitozana in tripolifosfata (TPP), ki je nanešen na silikonski nosilec, ki je bil aktiviran s kisikovo plazmo za 3 min Premaz nanodelcev hitozana, tripolifosfata (TPP) in amoksiklava, ki je nanešen na silikonski nosilec, ki je bil aktiviran s kisikovo plazmo za 3 min Silikonski nosilec, aktiviran s kisikovo plazmo za 5 min Premaz nanodelcev hitozana, tripolifosfata (TPP) in amoksiklava, ki je nanešen na silikonski nosilec, ki je bil aktiviran s kisikovo plazmo za 5 min

53 Materiali amoksiklav- učinkovini amoksicilin in klavulanska kislina (1000 mg/200 mg, prašek za raztopino za injiciranje/infundiranje) (Lek, Slovenija) destilirana voda fosfatni pufer PBS (Sigma-Aldrich, Nemčija) hitozan (Sigma Aldrich, low molecular weight) natrijev tripolifosfat (TPP) (Sigma-Aldrich, Nemčija) silikonski elastomer (Dow Corning, USA) zamreževalec silikona (Dow Corning, USA) Laboratorijska oprema in aparature merilne bučke; 250 ml, 500 ml, 1000 ml steklena čaša; 50 ml, 100 ml, 250 ml, 1000 ml, plastični lončki; 200 ml centrifugirke; 50 ml pipete; 1 ml, 10 ml, 20 ml, Eppendorf, Rainin plastični model za silikonske plošče precizna tehtnica AE 240, Mettler, ZDA pištola za razpršitev vzorca na podlago Airbrush, magnetno mešalo Rotamix 550 MMH, Tehtnica, Slovenija ph meter SevenGo, Mettler Toledo, ZDA ultrazvočna kopel centrifuga Rotina 380R, Hettich, Nemčija vakuumski sušilnik zetasizer Nano ZS, Malvern, Velika Britanija elektronski mikroskop, FEI Quanta 200 3D, ZDA kisikova plazma z radio frekvenčnim generatorjem (Induktio d.o.o.) FT-IR, Spectrum GX (Perkin Elmer) Infrared XPS, TFA-XPS (Physical Electronics) UV-VIS, Cary 60 UV-Vis (Agilent)

54 Franz celica, Logan System (Somerset, ZDA). Priprava raztopin Priprava raztopine hitozana Ustrezno količino hitozana (v prahu) smo zatehtali in ga suspendirali v deionizirani vodi. Za boljše raztapljanje hitozana smo z dodatkom koncentrirane ocetne kisline umerili ph vrednost raztopine na 3,8. Pripravljeno raztopino smo mešali na magnetnem mešalu 24 ur pri sobni temperaturi ter nato naslednji dan uravnali ph s koncentrirano ocetno kislino na 3,5. Priprava raztopine natrijevega tripolifosfata, γ = 0,7 mg/ml Pripravili smo raztopino natrijevega tripolifosfata (TPP) s koncentracijo 2 g/l, tako da smo ustrezno količino TPP (v prahu) raztopili v deionizirani vodi. Priprava raztopine amoksiklava V vialo smo s pomočjo injekcije injicirali 20 ml fiziološke raztopine ter stresali 10 minut. Raztopino, ki smo jo uporabljali v nadaljevanju, smo odvzemali s pomočjo injekcije. Priprava nanodelcev iz TPP in hitozana V čašo z volumnom 50 ml smo odmerili 10 ml raztopine hitozana, nato pa smo čašo postavili na mešalnik. Ob konstantnem mešanju smo dodali še 10 ml TPP, pri čemer so se spontano tvorili nanodelci. Sledilo je še mešanje nanodelcev (1 uro). Priprava nanodelcev iz TPP, hitozana in amoksiklava V 50 ml čaše smo dodali 10 ml raztopine hitozana, nato pa smo čašo postavili na mešalnik. Ob konstantnem mešanju smo hkrati dodali 10 ml TPP in 10 ml amoksiklava, raztopljenega v fiziološki raztopini, pri čemer so se spontano tvorili nanodelci s ujetim zdravilom. Sledilo je še mešanje nanodelcev za 10 minut. Priprava silikonskih plošč V 200 ml plastični lonček smo zatehtali 90 g silikonskega elastomera, ki smo mu dodali 10 g zamreževalca silikona. Sledilo je mešanje, nato pa smo raztopino prelili v plastične kalupe

55 Potrebna je bila enakomerna porazdelitev polimerne raztopine, da so vzorci silikonskih plošč čim bolj primerljivi. Sledilo je 24-urno sušenje v vakuumskem sušilniku. Temperatura pladnjev, ki so nameščeni v sušilniku je bila 80 C. Dane silikonske ploščice so simulirale material timpanalnih cevk (enaka sestava).. Meritve velikosti nanodelcev Vzorce smo pred merjenjem za 5 min postavili v ultrazvočno kopel, nato pa smo jih injicirali v kiveto (DTS10012). Kiveta je morala biti popolnoma čista, v vzorcu ni smelo biti zračnih mehurčkov. Pogoji, pri katerih smo izvajali meritve: T = 25 C Čas merjenja = 120 s Število ponovitev = 3 Metoda se je uporabila za meritve velikosti nanodelcev v raztopini. Analiza se je izvajala na aparaturi Zetasizer Nano ZS, Malvern, Velika Britanija, v laboratorijih Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Mariboru. Meritve zeta potenciala Vzorce smo pred merjenjem za 5 min postavili v ultrazvočno kopel, nato pa smo jih injicirali v kapilarno kiveto (DTS1060). Kiveta je morala biti popolnoma čista, v vzorcu ni smelo biti zračnih mehurčkov. Pogoji pri katerih smo izvajali meritve: T = 25 C Število ponovitev = 3 Metoda se je uporabila za meritve Zeta potenciala, ki nam pove o stabilnosti disperzije. Analiza se je izvajala na aparaturi Zetasizer Nano ZS, Malvern, Velika Britanija, v laboratorijih Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Mariboru

56 UV- VIS spektrometrija Najvišje vrednosti absorbance smo želeli določiti z namenom uporabnosti rezultatov pri nadaljnjih analizah (učinkovitost ujetosti zdravila, Franz celica). Pred prvimi meritvami smo naredili kalibracijo z Mili-Q vodo. Vzorec smo odpipetirali v merilno kiveto, vanjo dali UV- VIS merilnik ter preprečili svetlobi dostop do vzorca. Meritev absorbance smo izvedli s pomočjo 10µL vzorca nanodelcev z zdravilom na 1 ml raztopine (100x redčenje). Primerno valovno dolžino (λ) smo določili s pomočjo raziskovalnih člankov. Absorbanco smo izmerili še pri različnih koncentracijah, rezultati pa so nam služili za izris umeritvene krivulje. λ amoksiklava = 275 nm λ nanodelcev = 202 nm Metoda UV-VIS spektrometrije se je uporabila za pridobitev podatkov o učinkovitosti nastanka nanodelcev z zdravilom v notranjosti. Analiza se je izvajala na spektrometru Cary 60 UV-Vis (Agilent) v laboratorijih Fakultete za strojništvo, Univerze v Mariboru. Kisikova plazma za aktivacijo silikonskih ploščic Vzorce silikonskih ploščic smo z namenom izboljšanja vezave premaza obdelali še s kisikovo plazmo. Posamezne vzorce smo namestili na nosilec v komori. Sledila je vzpostavitev vakuuma, po njegovi vzpostavitvi pa se je pričel vnos kisika iz bombe, ki je priključena na plazmo. Vzorce smo z namenom primerjave učinkovitosti plazme obdelali z različnimi časovnimi dolžinami. Induktivno sklopljena kisikova plazma je bila ustvarjena v plazemskem sistemu, napajanim z MHZ radio frekvenčnim generatorjem (Induktio d.o.o.). Tlak = 30 Pa Moč = 2 kw Električni tok = 0,3 A Čas = 1 min, 2 min, 3 min in 5 min Metoda aktivacije površine s kisikovo plazmo se je uporabila z namenom izboljšanja vezave premaza na površino silikona. Delo se je izvajalo s kisikovo plazmo v laboratorijih odseka Tehnologija površin in optoelektronika na Inštitutu Jožefa Stefana, Ljubljana

57 Nanos disperzij nanodelcev na silikonske plošče Raztopine vzorcev smo s pomočjo Airbrush pršilca nanesli na vrhnjo stran silikonskih ploščic. Nanos raztopine je potekal na plazemsko aktiviranih vzorcih kot tudi na silikonskih ploščicah, ki niso bile aktivirane. Primeren tlak v cevkah Airbrush-a za nanos vzorca je omogočala povezava s dušikovo bombo. Zaradi občutljivosti zdravila na visoke temperature smo nato funkcionalne vzorce silikona shranili v hladilniku pri temperaturi 5 C. Analiza površine s premazi in brez njih s SEM mikroskopom Površino silikonskih vzorcev, ki so bili premazani z raztopino nanodelcev, smo opazovali z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Analizo smo opravili tudi na silikonskih ploščicah brez premazov. Metoda se je uporabila za dokazovanje premaza na površini silikona. Prav tako smo želeli analizirati morfološke razlike površin silikona funkcionaliziranega z nanodelci hitozana v primerjavi z nanodelci hitozana z ujetim zdravilom. Pri tem smo naredili tudi fotografije vzorcev, ki služijo za vizualno preverjanje nastanka nanodelcev in kvalitete premaza. Izvir elektronov je bila volframova (W) elektroda, izvor curka ionov pa tekoči kovinski galij. Ločljivost ionske puške je bila 10 nm pri 30 kv. Analiza se je izvajala na elektronskem vrstičnem mikroskopu FEI Quanta 200 3D, ZDA, v laboratoriju Inštituta za tehnologijo materialov Fakultete za strojništvo, Univerze v Mariboru. Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo (FT-IR) Vzorce silikonskih plošč smo po kalibraciji vstavili v meritveno komoro aparaturo Perkin Elmer ATR FT-IR. Meritve so potekale pri 25 C. Sledile so posamezne meritve ter računalniška obdelava pridobljenih grafičnih rezultatov. Te smo nato primerjali z različnimi podatki raziskovalnih člankov ter podali domnevo o prisotnosti vezi oz. funkcionalne skupine. Zaradi občutljivosti metode so rezultati pripomogli le k domnevam, ki pa jih je potrebno potrditi še z ostalimi analiznimi metodami

58 Metoda FT-IR se je uporabila za dokazovanje premaza in kemijskih vezi na površini silikona. Analiza se je izvajala na Perkin Elmer ATR FT-IR spektrometru v laboratorijih Fakultete za strojništvo Univerze v Mariboru. Spektroskopija fotoelektronov, vzbujenih z rentgenskimi žarki (XPS) Posamezni vzorci so nameščeni na nosilce za vzorce, vse skupaj pa se vstavi v vakuumsko komoro. Uporabili smo model TFA-XPS, proizvajalca Physical Electronics. Obsevali smo jih z monokromatsko rentgensko svetlobo Al K. Fotoni rentgenske svetlobe so na površini vzorca povzročili izbitje elektronov (fotoefekt), energijo izbitih fotoelektronov pa smo analizirali s polkrožnim analizatorjem. Zaradi neprevodnosti vzorcev smo uporabili tudi dodatno elektronsko puško, zato da smo preprečili nabijanje vzorca med analizo zaradi izgube elektronov. Posneli smo pregledni spekter površine preko širokega energijskega območja 0 ev ev. V izmerjenem spektru, ki predstavlja porazdelitev fotoelektronov po njihovi vezavni energiji, so prisotni vrhovi, značilni za elemente, ki so na površini vzorca do globine nekaj nanometrov. To nam je omogočilo, da smo lahko identificirali prisotne elemente in izračunali njihove koncentracije, pri čemer smo si pomagali s programom Multipax istega proizvajalca. Vsak vzorec smo analizirali na dveh različnih mestih in kasneje izračunali povprečno sestavo. Tlak vakuumske komore = 10-8 Pa Energija AlK = 1486 ev Kot polkrožnega analizatorja glede na vzorec = 45 Premer površine analiznega mesta = 0,4 mm Metoda XPS se je uporabila za pridobitev podatkov o elementarni sestavi na površini silikona. Analiza se je izvajala na spektrometru XPS v laboratorijih odseka Tehnologija površin in optoelektronika na Inštitutu Jožefa Stefana, Ljubljana

59 Mikrobiološko testiranje Za izvedbo mikrobiološkega testiranja je bil uporabljen test vpliva na bakterijsko rast v supernatantu po izpostavitvi vzorcu. Protimikrobno delovanje so testirali po protokolu, v katerem se testira število CFU (enot, ki tvorijo kolonije) v supernatantu po izpostavitvi na funkcionaliziranem materialu. Uporabljen je bil testni sev S. aureus (DSM 1386). Različno funkcionalizirani silikonski materiali v velikosti 1x1 cm so bili izpostavljen sveži kulturi S. aureus, ki je bila umerjena na gostoto McF 0,5. Po 4-urni inkubaciji na temperaturi 37 C in ob rahlem stresanju je bil odvzet vzorec kulture, v kateri je bil inkubiran silikonski material, v katerem določimo število bakterij, tako da suspenzijo ustrezno redčimo in cepimo na trdno gojišče TSA ter preštejemo kolonije. Vpliv funkcionaliziranega silikonskega materiala se je določal kot redukcija rasti v primerjavi s številom bakterij, določenih po izpostavitvi nefunkcionaliziranemu silikonskemu materialu. Testiranje protimikrobnosti je bilo uporabljeno za pridobitev podatkov o učinkovitosti premaza na silikonskem materialu. Testiranje smo izvedli v Centru za medicinsko mikrobiologijo Nacionalnega laboratorija za zdravje, okolje in hrano (NLZOH) v Mariboru. Franz celica: analiza sproščanja Sproščanje zdravilne učinkovine smo želeli dokazati s pomočjo sistema transdermalnih difuzijskih celic z avtomatskim vzorčenjem Logan System (Somerset, ZDA). Vzorce smo namestili v Franz-ove difuzijske celice, kjer je bila stran silikonskega nosilca s premazom obrnjena navzgor. Topilo je bila raztopina fosfatnega pufra (angl. phosphate buffered saline), ki je vsebovalo 0,01 M fosfatnega pufra, 0,0027 M KCl in 0,137 M NaCl. ph vrednost pufra je bila 7,4 pri 25 C. V času sproščanja zdravilne učinkovine smo s pomočjo termostatirane vodne kopeli segrevali in ohranjali temperaturo pri 37 C. Med meritvami se je topilo mešalo z magnetnim mešalom, ki je bilo nameščeno pod Franz-ovo celico s hitrostjo 50 obr min -1. Vzorce raztopine smo odvzemali v času 24 ur v različnih časovnih intervalih: 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min, 360 min in 1440 min

60 Koncentracijo sproščenega vzorca smo določili s Cary UV-Vis spektrofotometrom (Agilent, Nemčija) pri valovni dolžini 275 nm (absorbcijski vrh za amoksiklav). Po posameznem vzorčenju smo odvzeto količino nadomestili s svežo raztopino PBS s temperaturo 37 C. Zaradi dodajanja pufra je prišlo do redčenja, kar je bilo potrebno upoštevati pri izračunu koncentracije po Beer-Lambertovem zakonu. Analize sproščanja zdravilne učinkovine smo izvedli v treh ponovitvah. Analiza s Franz celico se je uporabila za pridobitev podatkov o sproščanju zdravila. Analiza se je izvajala v laboratorijih na Inštitutu za biomedicinske vede, Fakultete za medicino Univerze v Mariboru

61 REZULTATI IN DISKUSIJA Disperzija nanodelcev Določitev velikosti nanodelcev vzorca CH-TPP z metodo DLS S programsko opremo analizne aparature Zetasizer Nano SZ, Malvern, smo pridobili izračunano povprečje izmerjenih hidrodinamskih premerov (dh) nanodelcev vzorca CH-TPP ter polidisperzni indeks (PDI). Meritve so podane v nm (nanometri). Preglednica 4.1: Razporeditev nanodelcev vzorca CH-TPP glede na njihovo velikost Velikost delcev Delež delcev z izmerjenim dh vzorca CH-TPP, dh (%) (nm) 1.meritev 778, ,21 27,3 2,124 7,4 2.meritev ,1 63,3 11,9 3.meritev ,7 130,3 21,3 PDI 0,547 0,55 0,451 Prve meritve nanodelcev so potekale brez vnosa zdravila (le uporaba hitozana in TPP). Pridobljeni podatki kažejo na raznolikost velikosti delcev v raztopini ter na precej velike delce. Največji izmerjeni delci so imeli dh = 1994 nm. Meritve smo ponovili še po uporabi ultrazvočne kopeli, z namenom odstranitve zračnih mehurčkov

62 Preglednica 4.2: Razporeditev nanodelcev vzorca CH-TPP glede na njihovo velikost po ultrazvočni kopeli Velikost delcev Delež delcev z izmerjenim dh vzorca CH-TPP, dh (%) (nm) 1.meritev 337, , meritev 404, ,04 12,7 3,509 5,3 3.meritev 397,4 82,4 29,32 11,9 3,648 5,6 PDI Pri meritvah nanodelcev po ultrazvočni kopeli (preglednica 4.2) smo opazili zmanjšanje velikosti delcev, kar je tudi bil naš cilj. Manjši delci se počasneje posedajo, kar je ugodno za suspenzije. PDI se je po ultrazvočni kopeli povečal, kar kaže na še vedno precej različno velike delce. Povprečna velikost treh meritev, kjer je bil delež določene velikosti največji, je 379,7 nm. Preglednica 4.3: Meritev vzorca CH-TPP-AMOX glede na velikost delcev Velikost delcev Delež delcev z izmerjenim dh vzorca CH-TPP- (%) AMOX, dh (nm) PDI 654,3 86,6 0,479 88,06 8,1 0, ,3 0,

63 V nanodelce hitozana (po ultrazvočni obdelavi) smo ujeli še zdravilo AMOX ter jim izmerili velikost (preglednica 4.3). Glede na meritve velikosti nanodelcev po obdelavi v ultrazvočni kopeli lahko opazimo, da so se delci povečali, kar nakazuje ujetost zdravila v delcih. Kar 86,6 % delcev je imelo hidrodinamski premer 654, 3 nm, kar kaze na približno 172,3 % povečanje hidrodinamskega radija glede na nanodelce brez ujetega zdravila. Glede na meritve lahko sklepamo, da so se delci z vnosom zdravila povečali, PDI pa se je zmanjšal, kar kaže na manjšo heterogenost delcev glede na velikost po ujetju zdravila. Določitev zeta (ζ) potenciala Zanimalo nas je, kako se ζ-potencial spreminja glede na sestavo delcev in uporabo UZ kopeli ter centrifuge. Rezultati so prikazani v preglednici 5. Z meritvijo zeta potenciala disperzij smo pridobili podatke o stabilnosti delcev. O stabilnosti delcev v disperziji govorimo takrat, ko je absolutna vrednost zeta potenciala večja od (20) 30 mv. Najmanj stabilni delci so bili delci z zdravilom, delci brez zdravila pa so zmerno stabilni. Stabilnost disperzije nanodelcev hitozana je pričakovana zaradi protoniranih aminskih skupin (kisel ph) in posledično zadostnih odbojnih sil. Visok zeta potencial po ujetju zdravila je posledica povečanja velikosti delcev, zaradi česar se delci hitreje posedajo v disperziji ali raztopini. Po ujetju zdravila očitno ni več zadostnega pozitivnega odboja v disperziji. Domnevamo lahko, da se je zdravilo deloma vezalo na površino nanodelcev in tako zmanjšalo dostopnost aminskih skupin ali pa se je zdravilo pri enkapsulaciji vezalo kemijsko z aminskimi skupinami hitozana. V disperziji nanodelcev hitozana tako ni pričakovati aglomeracije delcev, medtem ko pa nanodelci z ujetim zdravilom kažejo težnjo k aglomeraciji

64 Preglednica 4.4: Vrednosti zeta potenciala delcev Zeta potencial delcev vzorca CH- TPP (mv) Zeta potencial delcev po UZ kopeli (mv) Zeta potencial delcev vzorca CH-TPP-AMOX (mv) 1. meritev 33, 5 33, 9 4, meritev 35 31, 9 6, meritev 35, 9 31, 5 4, 86 Povprečna vrednost 34, 8 32, 4 5, 4 UV-VIS spektrometrija Stopnjo enkapsulacije zdravila smo določili spektrofotometrično s pomočjo Beer- Lambertovega zakona, kjer lahko ustrezne koncentracije izračunamo s pomočjo izmerjenih absorbanc in ustrezne umeritvene krivulje substrata zdravila (k parameter). Koncentracijo supernatanta raztopine nanodelcev z ujetim zdravilom smo izračunali glede na izmerjene podatke ter predhodno znane podatke. Naredili smo umeritveno krivuljo zdravila, pri kateri smo imeli znane raztopine zdravila. Pri teh koncentracijah smo nato izmerili absorbance ter s pomočjo računalniškega programa Excel pridobili enačbo premice, ki nam poda k. Ta je bil uporabljen v enačbi za izračun koncentracije supernatanta disperzije nanodelcev s enkapsuliranim zdravilom. Iz razlike začetne koncentracije zdravila in koncentracije zdravila v supernatantu (nanodelce odcentrifugiramo in analiziramo supernatant) lahko izračunamo stopnjo ujetosti zdravila v nanodelce hitozana. Sledil je izračun koncentracije ujetosti zdravila v nanodelcih (koncentrat po centrifugiranju), ki jo dobimo z razliko celotne koncentracije zdravila in koncentracije zdravila v supernatantu: c koncentrat = c zdravila c supernatanta = 50 g l 4,19 g l = 45, 81 g l

65 Učinkovitost ujetosti zdravila (EE) dobimo z naslednjim izračunom: EE = c koncetrat 45, 81 = c zdravila 50 g l g l = 0, 9162 EE (%) = 100% 0,9162 = 91, 62% Ugotovili smo, da se je v nanodelce ujelo 91,62 % zdravila. Takšen rezultat je zelo ugoden, saj je visok procent ujetosti zdravila nujen tudi v ekonomskem smislu v primeru procesa izdelave nanodelcev v večjih količinah. S tem smo dokazali, da je metoda primerna za ujetje tovrstnega zdravila v nanodelce in da se lahko tako sprosti dokaj velika koncentracija zdravila iz rezervoarja nanodelcev hitozana. Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) Pri fotografijah, posnetih pri mikroskopiranju z vrstičnim mikroskopom, smo želeli določiti morfološke lastnosti premazov. Analizirali smo vzorce CH-TPP PDMS, CH-TPP-AMOX PDMS, PLAZM 5 min PDMS CH-TPP-AMOX in PLAZM 3 min PDMS CH-TPP. Rezultati nam povedo, kako enakomerno in v kakšnih skupkih oz. oblikah je nanešen premaz na silikonski nosilec. V vseh primerih je mogoče opaziti nehomogene premaze, a hkrati dokaj uspešno adsorpcijo na površino. Na sliki 4.1 je prikazana silikonska ploščica brez premaza, kar služi kot referenca pri preostalih vzorcih

66 Slika 4.1: SEM posnetek silikona Sliki 4.2 in 4.3 prikazujeta premaz nanodelcev hitozana (CH) in tripolifosfata (TPP) kjer lahko opazimo, da se je premaz ustvaril neenakomerno in v presledkih, kar je lahko posledica hidrofobnosti silikona ter način nanašanja premaza, ki je potekalo z Airbrush pršilcem. Opazimo lahko slabo adhezijo nanosa na substrat, kar se vidi kot nehomogen nanos. Glede na velikostno skalo opazimo, da so največji delci veliki okoli 500 nm. V obeh primerih opazimo tudi, da se notranjost skupkov razlikuje od zunanjosti (različna gostota in zrnatost posameznih delcev). Pri sliki 4.3 opazimo, da se je kapljica sušila iz sredine navzven, prisotni pa so tudi delci, ki so precej polidisperzni (različna velikost delcev). Slika 4.2: SEM posnetek CH-TPP PDMS

67 Slika 4.3: SEM posnetek CH-TPP PDMS V tem primeru (slika 4.4) smo naredili posnetek delcev, ki so vsebovali zdravilo. Takšni delci so bili pri analizi DLS praviloma večji v primerjavi z delci, kjer zdravilo ni bilo dodano Na sliki 4.4 je opazen delec, velik okoli 40 nm. Posnetek je bil narejen pri preveliki pospeševalni napetosti. Beli rob je posledica nabijanje elektronov zaradi neprevodnosti materiala. Povečava je 1x večja kot pri sliki Sklepamo, da je prikazan delec, okoli delca pa je premaz odvečnega hitozana. Prelom pa nakazuje na sam material PDMS.. Nehomogenost delca je posledica tripolifosfata, hitozana in amoksiklava. Slika 4.4: SEM posnetek CH-TPP-AMOX PDMS

68 Na slikah 4.5 in 4.6 so posnetki materiala, ki je bil predhodno obdelan s kisikovo plazmo in nato premazan s nanodelci hitozana s ujetim zdravilom. Obdelava s plazmo je trajala 3 in 5 minut. Na sliki 4.5 vidimo dobro razvejanost in nehomogenost premaza, adhezija pa je boljša v primerjavi s predhodnimi slikami. Opazimo lahko prisotnost mikronskih delcev različnih velikosti. Na sliki 4.6 pa tudi vidimo okrogel skupek, velik okoli 15 nm. Majhna velikost delcev je še posebej ugodna in željena, saj so takšni delci bolj stabilni. Po obdelavi s plazmo je manjša prisotnost aglomeratov, adhezija pa je boljša. Slika 4.5: SEM posnetek PLAZM 5 min PDMS CH-TPP-AMOX

69 Slika 4.6: SEM posnetek PLAZM 3 min PDMS CH-TPP