IZOLACIJA IN BIOLOŠKI UČINKI POTENCIALNIH PROTEKTIVNIH OZIROMA PROBIOTIČNIH BAKTERIJ V KOZJEM MLEKU IN INTESTINALNEM TRAKTU

Transkripcija

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE Martin TRAPEČAR IZOLACIJA IN BIOLOŠKI UČINKI POTENCIALNIH PROTEKTIVNIH OZIROMA PROBIOTIČNIH BAKTERIJ V KOZJEM MLEKU IN INTESTINALNEM TRAKTU DIPLOMSKO DELO Maribor, 2009

2 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE KMETIJSTVO Martin TRAPEČAR IZOLACIJA IN BIOLOŠKI UČINKI POTENCIALNIH PROTEKTIVNIH OZIROMA PROBIOTIČNIH BAKTERIJ V KOZJEM MLEKU IN INTESTINALNEM TRAKTU DIPLOMSKO DELO Maribor, 2009

3 III Komisija za zagovor in oceno diplomskega dela: Predsednik: red. prof. dr. Dejan ŠKORJANC Mentor: izr. prof. dr. Avrelija CENCIČ Član: docent dr. Marjan JANŽEKOVIČ Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Lektorica: Katja Javornik, prof. slovenskega jezika in književnosti Datum zagovora: 13. OKTOBER 2009

4 IV Izolacija in biološki učinki potencialnih protektivnih oziroma probiotičnih bakterij v kozjem mleku in intestinalnem traktu UDK: :577.27:636.39(043.2)=863 Iz vzorcev kozjega mleka in fecesa smo uspešno izolirali 16 bakterijskih vzorcev in jih karakterizirali s pomočjo klasičnih in sodobnih mikrobioloških metod. Izmed izoliranih in karakteriziranih 16 bakterij jih 14 pripada rodu Lactobacillus ter 2 rodu Lactococcus. Dokazali smo pozitiven vpliv bakterij v in vitro celičnem modelu intestinalnega trakta. Rezultati so pokazali dobro stopnjo vezave na intestinalni epitelij, sorazmerno nizko citotoksičnost ter spodbujanje nespecifičnega imunskega odziva. S tem smo dokazali tudi zadostnost naših sevov za selekcijske kriterije. So funkcionalni, predvsem pa ne patogeni. Zanimivi za nadaljnje raziskave so predvsem vzorci M5K1 (Lactobacillus Brevis), F1K1K2 (Lactobacillus Plantarum) ter F1K1K1 (Lactococcus Rafinolactis), ki so najbolj izstopali po učinkovitosti. Navkljub dejstvu, da so vsi izolirani sevi pripadniki mlečnokislinskih bakterij je opazna vrstna specifičnost posameznih izoliranih sevov, ki se med seboj močno razlikujejo glede biološke aktivnosti. Prav tako prihaja do razhajanj znotraj posamezne vrste. Naše delo predstavlja v svetu edinstven eksperimentalni model za tovrstne analize. Ključne besede: koze / probiotiki / celični model / vezava / imunski odziv OP: X, 71 s., 8 pregl., 18 graf., 60 ref. Isolation and biological activity of potentially protective or probiotic bacteria in goat milk and intestinal tract We isolated and characterized successfully 16 bacterial samples from goat milk and feces with classical and modern practices. Among the isolated bacteria, 14 belong to the genus of Lactobacillus and 2 belong to the genus of Lactococcus. We proved the beneficial influence of bacteria in a in vitro intestinal cell model. The results showed a good degree of attachment to the intestinal epithelium, low citotoxicity and stimulation of non-specific immune responses. With this we also showed that these bacteria fulfill the criteria for probiotic selection. They are functional and non-pathogenic. The isolates M5K1 (Lactobacillus Brevis), F1K1K2 (Lactobacillus Plantarum) and F1K1K1 (Lactococcus Rafinolactis) are especially interesting for further research due to their efficiency. We observed strong specifities among different genus groups concerning their bio-activity. Our work presents a unique experimental approach for this kind of analysis. Key words: goats / probiotics / cell model / attachment / immune response NO: X, 71 P., 8 Tab., 18 Graph, 60 Ref.

5 V Kazalo vsebine 1 UVOD CILJI DIPLOMSKE NALOGE TER DELOVNE HIPOTEZE PREGLED OBJAV DEFINICIJA PROBIOTIKOV ZGODOVINA PROBIOTIKOV EKOSISTEM PREBAVIL STABILNOST ČLOVEŠKE MIKROFLORE MLEČNOKISLINSKE BAKTERIJE (LACTOBACILLALES) Klasifikacija mlečnokislinskih bakterij Splošne značilnosti mlečnokislinskih bakterij (MKB) NAMEN TER UPRAVIČENOST UPORABE PROBIOTIKOV Delovanje probiotikov Vloga gostiteljevega intestinalnega epitelija pri delovanju probiotikov Vezava probiotikov Interakcije med mikrobi Primeri uspešne uporabe probiotikov SELEKCIJSKI KRITERIJI ZA PROBIOTIKE IMUNSKI SISTEM Vloga prirojene imunosti pri delovanju probiotikov Vloga pridobljene imunosti pri delovanju probiotikov Produkcija dušikovega oksida (NO) Citokini UPORABA CELIČNIH KULTUR... 25

6 VI 3 MATERIALI IN METODE MATERIALI Bakterijski vzorci Celične kulture Gojišča Raztopine in reagenti Testni kiti Droben material Laboratorijska oprema METODE Potek dela Vzorci Celične kulture Karakterizacija bakterij Testiranje biološke aktivnosti bakterij Statistična obdelava podatkov ter prikaz rezultatov REZULTATI IZOLACIJA BAKTERIJ BARVANJE PO GRAMU KATALAZNI TEST API CH 50 TEST TESTIRANJE CITOTOKSIČNOSTI VEZAVA BAKTERIJ NA CELIČNE LINIJE Odstotek vezave na celično linijo PSI Odstotek vezave na celično linijo OSI Odstotek vezave na celično linijo GIE MERJENJE CELIČNEGA NO Določanje stopnje nastajanja dušikovega oksida celične linije CIEB MTT TEST MTT test na celični kulturi CIEB: IZLOČANJE PROINFLAMATORNIH CITOKINOV... 58

7 VII 5 RAZPRAVA IN SKLEPI... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED. 5.1 RAZPRAVA SKLEPI POVZETEK LITERATURA ZAHVALA... 71

8 VIII Kazalo preglednic Preglednica 1: Opazovani učinki probiotičnih organizmov. 14 Preglednica 2: Željene probiotične lastnosti Preglednica 3: Izolirani bakterijski sevi 26 Preglednica 4: Uporabljene celične kulture 27 Preglednica 5: Rezultati barvanja po Gramu. 46 Preglednica 6: Rezultati katalaznega testa 47 Preglednica 7: Rezultati API CH 50 testa Preglednica 8: Prikaz citotoksičnosti za celične linije CLAB, CIEB, PSI, OSI.. 50

9 IX Kazalo slik Slika 1: Poseljenost gastro intestinalnega trakta. 6 Slika 2: Gastrointestinalni epitelij. 10 Slika 3: Prehodi bakterij. 11 Slika 4: Imunski odziv. 19 Slika 5: Vloga NO pri rasti tumorskega tkiva.. 22 Slika 6: Vloga interlevkinov Slika 7: Celične linije CIEB, GIE, PSI, OSI, CLAB 28 Slika 8: Potek dela.. 34 Slika 9: Gram pozitivni Lactobacilli.. 40 Slika 10: API CH 50 test 41 Slika 11: Stopnja vezave na celično linijo PSI 51 Slika 12: Stopnja vezave na celično kulturo OSI Slika 13: Stopnja vezave na celično linijo GIE Slika 14: Izmerjena absorbanca za NO test Slika 15: Povečano izločanje NO v %...55 Slika 16: Vrednosti absorbance pri MTT testu Slika 17: Prikaz povečane mitohondrijalne aktivnosti v % Slika 18: Izločanje IL

10 X Kazalo enačb Enačba 1: Enačba za izračun abosrbance. 37 Enačba 2: Enačba za izračun povprečne vrednosti..44 Enačba 3: Enačba za izračun standardnega odklona.. 44

11 1 1 UVOD Skozi tisočletja smo se ljudje razvijali ob prisotnosti mikroorganizmov in se tako prilagodili njihovim aktivnostim znotraj in okoli nas. Razvili smo številne mehanizme ter načine medsebojnega življenja in delovanja. Navkljub dejstvu, da obstajajo različne skupine mikroorganizmov, ki s svojim delovanjem škodujejo človeku, obstaja mnogo mikrobov, ki so ključni za naše normalno delovanje. Tako je kolonizacija s komenzalnimi organizmi nujna za pravilen razvoj specifičnega ter nespecifičnega imunskega odziva (Neumann in sod. 1998). Področje prehrane in zdravja je eno od prioritetnih raziskovalnih področji v Evropski uniji. Ravno prehrana je tista, ki je v centru strategij za izboljšanje zdravja širše javnosti saj lahko z njo vplivamo na razvoj številnih bolezni od raka do gastrointestinalnih obolenj. Žal pa so ti mehanizmi preko katerih sta povezana prehrana in zdravje še zelo slabo raziskani. Vedno večje povpraševanje po zdravi prehrani stimulira razvoj novih tehnologij in novih produktov, kar daje prehrambni industriji ključno vlogo pri zagotavljanju zdrave prehrane. Zaradi njihovih že dokazanih za zdravje pozitivnih lastnosti, se čedalje veča zanimanje in povpraševanje po probiotičnih organizmih. Tako zadnjih 20 let najdemo čedalje več produktov katerim so bili dodani probiotiki, predvsem mleka ter jogurti. Z razvojem tehnologije in znanja o probiotikih pa se je povečala tudi njihova uporabnost saj jih dan danes lahko najdemo tudi v mesnih izdelkih, sladkarijah ter kremah. K popularnosti probiotikov je pripomoglo tudi dejstvo, da probiotične bakterije spodbujajo gostiteljeve obrambne mehanizme. Zraven učinkov, ki jih imajo probiotiki na nespecifično imunost črevesja, kar se kaže v stabilizaciji črevesne mikroflore (Salminen in sod. 1998), so ugotovili, da lahko povečajo tudi humoralni imunski odziv in tako spodbujajo intestinalno imunsko bariero (Kaila in sod. 1992). Še več, odkrili so tudi, da probiotične bakterije stimulirajo nespecifično gostiteljevo odpornost na mikrobne patogene (Perdigón in sod. 1998) in tako pomagajo pri vzdrževanju zdravja organizmov.

12 2 Področje probiotikov ponuja ogromno prostora za nove raziskave saj je potreba po novih probiotičnih mikroorganizmih čedalje večja. Prav zaradi želje po odkritju novih potencialnih probiotičnih kultur smo se odločili za izolacijo teh iz kozjega mleka ter intestinalnega trakta. Kozje mleko ter njegovi mlečni izdelki že generacije veljajo kot za zdravje zelo koristni, ni pa povsem jasno čemu pripisati te ugodne učinke. Eden od vzrokov bi zagotovo lahko bili specifični mikroorganizmi prisotni v kozji mikroflori. 1.1 Cilji diplomske naloge ter delovne hipoteze Cilji te diplomske naloge so bili: Izolacija potencialnih novih probiotičnih bakterij iz kozjega mleka ter kozjega intestinalnega trakta Karakterizacija ter določitev izoliranih bakterij Ugotavljanje biološke aktivnosti bakterijskih izolatov Ugotavljanje interakcij med imunskim sistemom celičnih kultur in izoliranimi bakterijami Postavitev standardne metodologije za primarno testiranje probiotičnih protektivnih bakterijskih kultur

13 3 Delovne hipoteze: Zaradi vse večje popularnosti mlečnih izdelkov iz kozjega mleka in številnih pozitivnih lastnosti predvsem pa sorazmerno nizke stopnje selekcioniranosti koz, s čimer je zadoščeno naravni prvobitnosti, smo predpostavili, da bi lahko imele mlečnokislinske bakterije izolirane iz kozjega mleka ter intestinalnega trakta dobre potencialne probiotične lastnosti. Predpostavili smo, da bi lahko dobro izbrana metodologija za testiranje potencialnih protektivnih probiotičnih kultur služila kot standardni model primarnih testiranj novih izolatov na intestinalnih celičnih kulturah.

14 4 2 PREGLED OBJAV 2.1 Definicija probiotikov "Probiotiki so živi mikroorganizmi, ki ob pravilni koncentraciji kažejo pozitiven vpliv na gostiteljevo zdravje" Takšno definicijo sta sprejeli Organizacija Združenih narodov za prehrano in kmetijstvo ter Svetovna zdravstvena organizacija (FAO/WHO, 2001). Precizna deifinicija termina "probiotik" je bila predmet številnih razprav saj se strokovni svet težko zedini ali bi naj v ta termin bili vključeni tudi mrtvi oziroma deaktivirani mikroorganizmi in njihovi metabolni produkti. Prav tako pri definiranju tega pojma povzroča težave določitev ustrezne koncentracije mikroorganizmov, ki so potrebne za pozitiven učinek na gostiteljevo zdravje. Pri definiranju pojma "probiotik" je potrebno omeniti tudi to, da se ti uporabljajo tudi v prehrani živali in ne samo ljudi ob čimer se termin "gostitelj" nanaša tako na živali kot ljudi. 2.2 Zgodovina probiotikov Od kar so ljudje pričeli variti pivo, kisati zelje, iz vzhajanega testa peči kruh in pripravljati jogurt, so s tem istočasno za pripravo hrane pričeli uporabljati tudi mikroorganizme. Znatno pred letom 1900 so nekateri raziskovalci smatrali, da lahko imajo določene vrste bakterij ugoden vpliv tudi na zdravje ljudi in živali. Že Pasteur je ugotovil, da obstaja direktno ravnotežje med gostiteljem in njegovo črevesno floro, prve intelektualne osnove delovanja mlečnokislinskih bakterij pa izvirajo od ruskega biologa in nobelovca Ilje Mečnikova. Smatral je namreč, da je ravnotežje v črevesni flori ključnega pomena za zdravje gostitelja in to zaradi resorbcije toksičnih bakterijskih metabolitov (Mečnikov 1908).

15 5 Znana je njegova trditev, da je dolga življenjska doba kmečkega prebivalstva v Kavkazu, med drugim tudi posledica prehrane z veliko mlečnih izdelkov, ki so jih tradicionalno pripravljali s fermentacijo z mlečnokislinskimi bakterijami. Mečnikov je pojasnjeval, da zato, ker Lactobacillus bulgaricus in Streptococcus thermophilus iz jogurta izpodrineta črevesne mikrobe, ki proizvajajo toksine (avtointoksikacija). Skozi leta se je znanje in razvoj probiotikov močno povečal. Še posebej z razvojem tehnologije, ki omogoča raziskave na molekularnem, genetskem in kliničnem nivoju. Niso pa probiotiki zanimivi le iz znanstvenega stališča ampak tudi iz ekonomskega. Danes je na tržišču na tisoče različnih pripravkov, ki vsebujejo koristne mikroorganizme. Ocenjuje se da probiotiki letno ustvarijo na svetovnem trgu dobiček v višini nekaj milijard dolarjev (Stanton in sod. 2001). 2.3 Ekosistem prebavil Za lažje razumevanje učinkov in delovanja probiotikov je potrebno razjasniti nekaj značilnosti mikrobne flore v prebavilih. V primerjavi s približno dvema m 2 naše površine kože, predstavlja gastrointestinalni trakt veliko večjo površino, ki se stika z»okoljem«(van Dijk 1997). Površina naj bi bila preračunano okrog m 2 (Waldeck 1990), kar omogoča potreben prostor za interakcije med samim procesom razgrajevanja hranil ter za adhezijo na sluznične stene in sočasno kolonizacijo. Gastrointestinalni trakt človeka naj bi dajal»zavetje«približno živim bakterijam (Luckey in Floch 1972), kar je 10-krat več kot vseh evkariontskih celic v človeškem telesu. Pomembnost teh bakterij v gastrointestinalnem traktu je bila dolgo časa prezrta, saj so bile raziskave usmerjene predvsem na enterične patogene mikroorganizme in ostale dejavnike, ki so vodili do gastrointestinalnih težav. Število in sestava bakterijske združbe sta vzdolž prebavil zelo spremenljiva. Skupno število bakterij v želodcu je običajno izpod 10 3 CFU /g vsebine čigar vzrok je kisla vsebina želodca. V tankem črevesu je število bakterij med 10 4 CFU/ml vsebine v začetnem delu do okoli CFU/ml v ileocekalnem področju. Glavni omejevalni dejavniki močnejše populacije so hiter prehod hrane in izločki žolča in pankreasnih encimov (Waldeck 1990).

16 6 Debelo črevo je precej gosteje poseljen mikrobni ekosistem. Gram vsebine vsebuje do CFU/ml organizmov iz vsaj 50 vrst nabora doslej opazovanih 400 mikrobnih vrst. Predvsem so to striktni anaerobni mikroorganizmi. Količinsko sta pri živalih in človeku najpomembnejši skupini Bacteroides in Bifidobakterije, ki jih je 30 % enih in 25 % drugih (Ahrne in sod. 1998). Številčno prevladujejo po Gramu negativne Bacteroides vrste (npr. Bacteroides ovatus, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron) (Waldeck 1990). V rodu so tako proteolitične in saharolitične vrste. Velja še omeniti, da prebavila dojenih otrok prvenstveno naseljujejo Bifidobaketrije, ki jim pripisujejo tudi pomembno vlogo v zaščiti mladega organizma pred infekcijami in v dozorevanju kompetence imunskega sistema (Ahrne, in sod.,1998). V prebavilih najdemo: stalno ali avtohtono (imenujemo tudi indigeno) floro prehodno ali alohtono (imenujemo tudi pasantno) floro Pomembnejše učinke imajo predvsem stalni mikroorganizmi, prehodni mikroorganizmi pa le izjemoma, če so prisotni v velikem številu ali če izločajo bioaktivne snovi (toksine, inhibitorje, metabolite). Slika 1: Poseljenost gastro intestinalnega trakta (Trapečar 2009, prirejeno po Brock, Biology of Microorganisms, 1997, str. 794)

17 7 2.4 Stabilnost človeške mikroflore Mikrobiološka kolonizacija je razmnoževanje in vztrajnost mikroorganizmov v določenem ekološkem okolju. Določen bakterijski sev lahko kolonizira človeški gastrointestinalni trakt (GIT) nekaj dni ali nekaj let. Razisave so pokazale, da ob grobem opazovanju celih rodov bakterij ugotovimo, da je mikroflora posameznikov sorazmerno stabilna. Ob podrobnejšemu pogledu pa ugotovimo, da se posamezni sevi znotraj rodov močno spreminjajo (McCartney in sod. 1996). Kot primer lahko navedemo predstavnike rodu Bacteroides in Clostridium, ki lahko leta kolonizirajo gostiteljev GIT a hkrati poteka njihova konstantna obnova individualnih sevov. Prav tako obstajajo dokazi za neprestano obnavljanje genetskega materiala znotraj mikrobnih skupnosti (Adlerberth in sod. 1998). Med faktorji, ki vplivajo na stabilnost mikroflore so čas prehoda hrane skozi prebavila, način prehranjevanja in stabilnost posameznih področij prebavnega trakta. Usta predstavljajo najstabilnejše področje. Prav tako zelo stabilno je debelo črevo, veliko bolj kot ileum saj v njem poteka precej manjša tekmovalnost (Rachmilewitz in sod. 2002, 2004). Navkljub temu, da so populacije znotraj prebavil zelo dinamične in prilagodljive glede sprememb okrog posameznih področij, je težko inducirati dolgoročno spremembo uveljavljene mikrobiološke sestave. Poskusi so pokazali, da se umetno spremenjena mikroflora hitro spremeni a se dolgoročno vspostavi prvotna oblika poseljenosti (De la Cochetière in sod. 2005). Tako je mnogo lažje dolgoročno vplivati na mikrobiološko sestavo prebavil dojenčkov kot odraslih ljudi (Adlerberth in sod. 1998).

18 8 2.5 Mlečnokislinske bakterije (Lactobacillales) Sevi mlečnokislinksih bakterij so kot probiotiki najpogosteje uporabljeni mikroorganizmi. Med temi so najbolje preučeni rodovi Lactobacillus in Lactococcus (Tannock 2005). Zaradi tega in zaradi dejstva, da so prav mlečnokislinske bakterije tiste, ki spadajo med najuspešnejše probiotike, smo kot glavni predmet te diplomske naloge izbrali izolacijo prav teh Klasifikacija mlečnokislinskih bakterij Bakterije rodu Lactobacillales spadajo v razred Bacilli in vsebujejo 13 rodov: Abiotrophia, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus in Weissella (Ludwig in sod. 2008) Splošne značilnosti mlečnokislinskih bakterij (MKB) Mlečnokislinske bakterije so skupina bakterij, ki razgrajujejo ogljikove hidrate s procesom fermentacije v mlečno kislino. Večina MKB je Gram pozitivnih, ne tvorijo spor, so acidofilne in so fakultativni anaerobi. Za normalno delovanje potrebujejo okolje, ki jim nudi vsa potrebna hranila saj mnogo od teh ne proizvajajo sami. Sorazmerno specifične potrebe po hranilih omejuje MKB v izbiri življenskega okolja. Tako se pri sesalcih nahajajo predvsem v ustih ter gastro intestinalnem traktu (Ahrne in sod. 1998). Najbolj znani predstavniki in uporabljeni MKB so bakterije rodu Lactobacillus.

19 9 2.6 Namen ter upravičenost uporabe probiotikov Delovanje probiotikov Terapije s probiotiki so bile razvite za obolele kakor tudi zdrave osebe saj v teoriji, spreminjanje človeške mikroflore in s tem krepitev imunske obrambe ugodno vpliva na razvoj obolenj ter infekcij (Dugas 1999; Teitlebaum in sod. 2002). Prepoznavanje mikrobov s strani gostitelja temelji na prepoznavanju signaturnih molekul mikrobov, ki jih imenujemo molekulski motivi patogenih organizmov (MAMP). Pri tem procesu pomagajo receptorji za prepoznavanje patogenih motivov (PRR) (Eckmann 2004). Mikrobi, ki jih prepoznajo gostiteljevi PRR lahko vplivajo na imunski sistem, metabolizem in fiziologijo. ``Higienska hipoteza`` pojasnjuje pojav alergij in avtoimunskih obolenj s pomanjkanjem mikrobiološke stimulacije imunskega sistema med njegovim nastajanjem in razvojem (Willis 2001). V primeru, da ``higienska hipoteza`` drži in imunski sistem dejansko potrebuje stimulacijo mikroorganizmov za pravilen ter popolni razvoj, lahko sklepamo, da bi ljudje, ki živijo v razvitih državah in so manj izpostavljeni mikrobom zaradi večje higiene, morali dopolnjevati svojo prehrano z bakterijskimi dodatki in to že v mladih letih (Oliveira 2005; Souza in sod. 2004). Tako lahko probiotiki z moduliranjem gostiteljeve mikroflore in PPR ugodno vplivajo na sledeče procese: Protiinfekcijsko delovanje Imunomodulatorno delovanje Povečevanje pregradne funkcije Metabolna učinkovitost Alterniranje inestinalne mobilnosti in delovanja

20 Vloga gostiteljevega gastrointestinalnega epitelija pri delovanju probiotikov Prva točka kjer pride do stika med mikroorganizmi in gostiteljem je na epiteliju, tkivu, ki ločuje notranjo in zunanjo površino telesa. Celice epitelija prepoznavajo in komunicirajo z mikroorganizmi ter vodijo prirojen ter pridobljen imunski odziv. Rekrutirajo lahko dendritične celice v nekaj minutah po prvem stiku s patogenom, lahko pa tudi zatrejo aktivacijo T celic. Prav tako so tudi diskriminatorne v proizvodnji različnih citokinov pri odzivu na zajedalske mikroorganizme (Lan in sod. 2005). Epitelijske celice predajajo antigene poglavitnim histokompatibilnostnim proteinom (Telega 2000). Epitelij ne predstavlja popolne prepreke mikrobom saj ti pogosto za prehod uporabljajo mehanizem translokacije. Prehod bakterij v epitelijske celice je možno opazovati z elektronskim mikroskopom. Translokacija je pogostejša v epiteliju ust kot pa v epiteliju prebavil (Eckmann 2004). Slika 2: Gastrointestinalni epitelij (Nature Reviews, 2006)

21 11 Spodnji del tankega črevesja, ileum, je prepreden s Peyerjevimi zaplatami. To je limfoidno tkivo, ki pomaga pri mediaciji imunskega odziva na vsebino prebavnega trakta. Peyerjeve zaplate so prekrite z M celicami, ki absorbirajo in transportirajo proteine ter antigene v plasti pod njimi. Absorbcija antigenov močno variira od posameznika do posameznika in se spreminja s starostjo in stanjem v katerem je telo. Prav tako se razlikuje med posameznimi sesalci kar močno vpliva na uspešnost posameznih probiotikov pri različnih živalih in ljudeh. Omeniti je potrebno tudi proteine za tesen stik. Ti so odgovorni za natančno prileganje posameznih celic (Eckmann 2004) Vezava probiotikov Pripenjanje je med najpomembnejsimi lastnostmi bakterij za njihovo učinkovito naselitev na sluznicah, ki pa je še slabo pojasnjeno. Zanimivo je relativno novo spoznanje, da črevesna flora ureja možnost poselitve tako, da vpliva na ekspresijo epitelnih glikokonjugatov. Zlasti nekatere vrste kot Bacteroides thetaiotaomicron in segmentirane filamentozne bakterije izzovejo ekspresijo fukoziliranih glikokonjugatov. Pripenjanje patogenih mikrobov je omejeno prav zaradi učinkovitega dogovarjanja med indigeno floro in gostiteljskimi celicami sluznice. Pri tem seveda dodatno vlogo igra izločanje mukopolisaharidov na teh celicah (Matsumoto 2004). Slika 3: Prehodi bakterij (Nature Reviews, 2006)

22 Interakcije med mikrobi Bakterije med seboj vplivajo na številne načine, ki so za gostitelja lahko koristni ali škodljivi. Med seboj lahko komunicirajo po principu kvorumskega zaznavanja, kar pomeni, da lahko ena sama bakterija zazna gostoto populacije z detekcijo akumuliranih signalizacijskih molekul. Prav tako lahko mikroorganizmi tvorijo konglomerate in se tako povezujejo v biofilme (Eckburg in sod. 2005). Kot primer pozitivnega sodelovanja med bakterijami lahko služi proizvodnja ekstracelularne beta laktamaze. Z razbijanjem penicilina, beta laktamaze pomagajo na penicilin občutljivim bakterijam, da preživijo ob terapiji z antibiotiki (Hackman in sod. 1976). Nekatere bakterije so tudi prepletle medsebojne metabolne poti s čimer bi lahko vplivali na terapije s probiotiki (Schell in sod. 2002). Za primer lahko postavimo bakterije, ki razbijajo ogljikove hidrate in s tem ustvarjajo substrate bakterijam, ki tega ne zmorejo. Eden najpomembnejših načinov interakcij med bakterijami predstavlja tekmovanje za prosta vezivna mesta ter hranila. To je eden glavnih atributov probiotikov saj ta odvzemajo patogenom hranila in vezivna mesta. Mnogi mikroorganizmi proizvajajo tudi bakteriocine (Eckburg in sod. 2005) Primeri uspešne uporabe probiotikov Do sedaj se je večino probiotikov uporabljalo profilaktično ali kot dodatna pomoč pri zdravljenju določenih obolenj. Obstajajo pa tudi mnogi primeri uspešnih kurativnih lastnosti probiotikov. Med te spadajo: a) Diareja Najlepši primer učinkovitosti terapije s probiotiki predstavlja uporaba koristnih bakterij za zdravljenje diareje povzročene z rotavirusom. Številni probiotiki so dokazali učinkovitost pri skrajševanju trajanja akutne oblike takšne infekcije pri otrocih, ki so najbolj dovzetni za tovršna obolenja (Szajewska in sod. 2001; Van Niel in sod. 2002).

23 13 b) Sindrom iritabilnega črevesa Določene probiotične kombinacije so se izkazale kot učinkovite v boju proti sindromu iritabilnega črevesa z protivnetnim delovanjem in moduliranjem citokinske sestave (O`Mahony in sod. 2005). Dokazano je, da lahko en sam rod bakterij regulira delovanje citokinov. c) Rak na mehurju Nekatere raziskave so dokazale, da lahko probiotiki uspešno preprečijo ponovno nastajanje tumorjev v mehurju (Hoesl in sod. 2005). d) Urogenitalne infekcije Med možnimi uporabami probiotikov je tudi aplikacija v primeru urogenitalnih infekcij kjer so se določeni sevi Lactobacillus v kliničnih testih izkazali kot zelo učinkoviti naproti urogenitalnim infekcijam in bakterijskim vaginozam (Hoesel in sod. 2005). e) Infekcije s Clostridium difficile Zdravljenje pacientov, ki so inficirani z C. Difficile s pomočjo Sayccharomyces boulardii znatno skrajša trajanje infekcije (Castagluiuala in sod. 1999). f) Atopični ekcemi Oralna administracija Lactobacillus rhamnasus in Lactobacillus reuteri je zelo koristna pri bojevanju atopičnih ekcemov (Rosenfeld in sod. 2003).

24 14 Preglednica 1: Opazovani učinki probiotičnih organizmov (Szajevska in sod. 2001) Opazovani učinki Species Stimulacija imunskega sistema Urejanje intestinalne mikroflore Zmanjšanje fekalnih encimov Antitumorno delovanje Preprečitev potovalne diareje Preprečitev rotavirusne diareje Preprečitev C. defficile diareje Preprečitev ostalih diarej Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. delbrueckii L. acidophilus, L. casei, Bifidobacterium bifidum L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbrueckii L. acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. delbrueckii, L. plantarum, B. adolescentis, B. bifidum, B. longum Saccharomyces bulgaricus, L. acidophilus, B. bifidum, Streptococcus thermophilus, L. bulgaricus L. rahmnosus, B. Bifidum L. rahmnosus, S. Bulgaricus L. acidophilus, L. Rahmnosus, B. bifidum Mnogi probiotični sevi se uporabljajo tudi kot dodatek k živalski prehrani. Lactobacillus reuteri se uporablja kot dopolnilo pri reji perutnine kot preventiva proti vnetjem in za boljšo rast. Drugi sevi, med njimi Propionobacterium, Lactobacillus, Bacillus in Saccharomyces, so pogosto uporabljeni za zmanjšanje težav, ki nastajajo ob menjavi krme (Hoesel in sod. 2005).

25 Selekcijski kriteriji za probiotike Izbira probiotika mora temeljiti na natančno določenih selekcijskih kriterijih, ki jih lahko združimo v štiri osnovne kategorije (Klaenhammer in Kullen 1999; Saarela in sod. 2000): primernost oziroma varnost tehnološka ustreznost tekmovalnost delovanje in funkcionalnost a) Primernost oziroma varnost Sev, ki ga uporabljamo kot probiotik, mora biti natančno taksonomsko identificiran, poznane morajo biti njegove karakteristike. Varnostni vidik vključuje naslednje specifikacije: - vrstna specifičnost - želeno je, da je za humano uporabo sev humanega izvora, - izoliran naj bo iz prebavnega trakta zdravega človeka, - biti mora nepatogen in netoksičen, - imeti mora status GRAS (angl. Generally Regarded As Safe). Posebno pozornost zahteva tudi problem prenosa genetskega materiala med mikrobno združbo (transdukcija, konjugacija, transformacija). Plazmidi z rezistenco na antibiotike in drugi prenosni genetski elementi so pri Laktobacilih in Bifidobakterijah redki, izjema pa so Enterokoki, pri katerih so pogosti. Zelo je torej pomembno, da se ugotovi, ali so determinante za rezistenco na klinično pomembne antibiotike prenosljive iz normalne mikroflore na patogene bakterije (O`Brien in sod. 1999). b) Tehnološka ustreznost Sev, ki ga želimo uporabiti na industrijskem nivoju, mora biti primeren za gojenje in shranjevanje v koncentrirani obliki (primerna rast, preživetje med koncentriranjem, sušenjem ali zamrzovanjem, obstojnost med skladiščenjem in distribucijo).

26 16 Zraven tega mora ohraniti želene karakteristike med pripravo kulture, tehnološkim postopkom in skladiščenjem živila ali preparata. Kadar ga vključujemo v hrano, mora prispevati k dobrim organoleptičnim lastnostim ali pa vsaj ne sme imeti negativnih učinkov. Pomembno je, da je genetsko stabilen (Rogelj 2001). c) Tekmovalnost Sev mora ostati metabolno aktiven v prebavnem traktu, na ciljnem mestu. Zato mora zadostiti številnim zahtevam: mora biti odporen proti želodčni kislini in žolčnim solem, sposoben vezanja na črevesno površino in s tem vsaj začasne kolonizacije, ter sposoben tekmovati z normalno črevesno mikrofloro (Rogelj 2001). Med najpomembnejšimi selekcijskimi kriteriji je sposobnost probiotične bakterije, da se veže na črevesno površino. To je pogoj, da bakterija vsaj začasno kolonizira črevo, s tem ima tudi boljše možnosti za funkcionalnost. Vezava je pomembna tudi pri stimulaciji imunskega sistema, saj omogoča probiotični bakteriji kontakt z limfatičnim tkivom črevesja, ki je posrednik tako lokalnih kot sistemskih imunskih odzivov. Splošno mišljenje je, da samo adhezivne bakterije učinkovito inducirajo imunski odziv. Adhezija zagotavlja tekmovalnost, kot tudi odstranjevanje in izločanje patogenih bakterij s črevesne površine (Ouwehand in sod. 1999). d) Delovanje in funkcionalnost Funkcionalne lastnosti se navadno proučujejo najprej in vitro, nato na živalih in končno morajo biti potrjene v kontroliranih kliničnih študijah. Proučevanje obsega: antagonistično delovanje proti patogenim bakterijam, proizvodnjo protimikrobnih snovi (bakteriocini, vodikov peroksid itd.), stimulacijo imunskega sistema, antimutagenost, antikarcinogenost, klinično dokumentiranje zdravstvenih učinkov (Rogelj 2001). Selekcijski kriteriji, ki temeljijo na tekmovalnosti in funkcionalnosti, ostajajo še vedno v veliki meri kontroverzni, saj mehanizmi s katerimi izkazujejo funkcionalnost in vivo, še vedno niso pojasnjeni na genetskem nivoju.

27 17 Veliko obeta funkcionalna genomika, ki naj bi na osnovi poznavanja strukturnih in odzivnih genskih sistemov uspela razložiti probiotsko funkcionalnost (Klaenhammer in Kullen 1999). Preglednica 2: Željene probiotične lastnosti (Teitelbaum in sod., 2002) Željene lastnosti Željen učinek Stabilnost na kislino ter žolč Adherenca na intestinalne celice Kolonizacija GIT Proizvajanje antimikrobnih snovi Varnost uporabe Pomembno za preživetje v GIT Vzdrževanje rahlo kislega okolja, antagonizem naproti patogenom, kompetitivnost za vezivna mesta Ohranitev kolonizacijskih sposobnosti, antagonizem naproti patogenom Antimikrobno delovanje ter anatagonizem naproti patogenom Preverjena varnost, natančna genetska določitev Za to, da je probiotik učinkovit mora imeti dobre kolonizacijske sposobnosti. Te ima pod pogojem, da je rezistenten na želodčno kislino ter žolč. Prav tako mora za uspešno moduliranje imunskega odziva posedovati sposobnost vezave. Da lahko probiotik učinkuje na mikrofloro debelega črevesa mora imeti anatgonistične lastnosti naproti patogenom. Te so lahko kompetitivnost ali pa proizvodnja bakteriocinov. Delovanje slednjih je vprašljivo (Teiltelbaum in sod. 2002).

28 Imunski sistem Živali in ljudje imamo dve obrambni liniji proti patogenom prirojeno in pridobljeno imunost. Prirojena imunost deluje tako, da preprečuje vdor mikroorganizmov v tkiva, v kolikor pa jim vdor uspe, sproži nespecifičen imunski odziv, ki prepozna in uniči potencialne patogene. Pridobljena imunost pa po drugi strani vključuje specifičen odziv na določene infekcije in specifično prikrojene komponente, kot so npr. protitelesa za uničenje patogenov. Izpostavljenost parazitnim organizmom je nujna za primeren razvoj prirojenega in pridobljenega imunskega sistema. Ko je ta vzpostavljen, probiotični organizmi delujejo nanj in vplivajo na imunski odziv naproti antigenom (Gill in sod. 2001) Vloga prirojene imunosti pri delovanju probiotikov Prirojen imunski sistem služi prepoznavanju in vplivanju na mikroorganizme. Njegov aparat vključuje topne faktorje kot so defenzini in lizosomi kot tudi makrofage, polimorfonuklearne neutrofile in dendritične celice. Kot del prirojene imunosti lahko štejemo tudi intestinalne epitelne celice, ki prav tako proizvajajo številne imunomodulatorne proteine in citokine. Eden od ciljev terapije s probiotiki je tako stimulacija ali zaviranje teh komponent (Gill in sod. 2001). Cilj telesa je vzdrževanje homeostaze imunskega sistema. Telo mora biti sposobno odziva na zajedalske mikroorganizme brez odvečnega vnetja. Probiotiki lahko inducirajo proizvodnjo topnih prirojeneih obrambnih faktorjev kot so IgA in citokini (Souza 2004). Prisotnost pozitivne mikroflore vpliva na bolj aktivno vračanje makrofagov (Neumannn in sod. 1998) in promovira generalno proinflamatorno stanje saj vspodbuja produkcijo proinflamatornih citokinov kot so TNF in MCP-1 (Souza 2004).

29 Vloga pridobljene imunosti pri delovanju probiotikov Prirojen imunski sistem inštruira pridobljen imunski sistem. Glede na to, da probiotiki vplivajo na prirojen imunski sistem lahko ti preko njega vplivajo na pridobljen imunski sistem. Makrofagi in dendritične celice delujejo proti mikroorganizmom in prezentirajo antigene T-celicam pomagalkam. T-celice pomagalke nato določijo imunski odziv na določen antigen. Glede na to s katerim mikroorganizmom pridejo v stik makrofagi in dendritične celice le te proizvajajo stimulatorne citokine (npr. IL-1 in IL-2) ali inhibitorne citokine (npr. IL-10). Na ta način lahko probiotiki vplivajo na delovanje antigen reprezentirajočih celic in s tem vplivajo na pridobljen imunski sistem (Matsumoto in sod. 2004). Pridobljen imunski sistem lahko delimo na: Humoralno imunost (HI) Celično imunost (CI) Slika 4: Imunski odziv (Nature Reviews, 2006)

30 Humoralna imunost (HI) Nosilke HI so plazmatske celice (zreli limfociti B), ki proizvajajo specifična protitelesa. Kot vse druge krvne celice, nastajajo tudi celice B iz hemopoetskih matičnih celic v kostnem mozgu. Receptor za antigen (Ag) na celicah B je na membrano vezano protitelo (Pt). Ko»naivne«celice B (ki še niso srečale Ag) prvič srečajo Ag, ki je specifičen za njihov receptor, se začnejo hitro razmnoževati. Njihovo potomstvo se diferencira v mirujoče spominske celice B, ki jih imenujemo plazmatke. Plazmatke izločajo v kri in mezgo velike količine Pt. Ta Pt so različnih razredov in imajo različne biološke funkcije. Npr. IgA protitelesa prevladujejo na površju sluznic in preprečujejo vezavo patogenih mikrobov na površino črevesja. Protitelesa IgG in IgM sodelujejo pri nevtralizaciji bakterijskih toksinov in spodbujajo fagocitozo monocitov in makrofagov z opsonizacijo (Gill 1998). Humoralna imunost je poglavitni obrambni mehanizem pred zunajceličnimi mikrobi. Pt ob pomoči komplementa lizirajo številne viruse in bakterije ter nevtralizirajo njihove toksine (Vozelj 2000) Celična imunost (CI) CI izvajajo limfociti T. Tudi limfociti T nastajajo v kostnem mozgu. V nasprotju s celicami B, ki dozorijo v kostnem mozgu, potujejo celice T v timus, kjer dozorijo do popolne imunske zmožnosti. Med zorenjem v timusu pridobijo na svoji membrani svojevrsten receptor za Ag, T celični receptor (TCR). Ta receptor lahko spozna Ag samo, če je vezan z membranskimi proteini, imenovanimi molekule poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (PHK). Ko»naivna celica T«sreča Ag, povezan z molekulo PHK na lastni celici, se celica T razmnožuje in diferencira v spominske celice T in različne efektorske celice (Vozelj 2000). Poznamo dve dobro opredeljeni podvrsti efektorskih celic T: celice T pomagalke (T H, od helper T cell) in citotoksične celice T (T C ). Med seboj se razlikujeta po membranskih glikoproteinih: CD4 in CD8. Celice T, ki izražajo CD4, delujejo navadno kot celice pomagalke (celice T H ), ki pomagajo celicam B, da izdelujejo Pt. Celice T, ki imajo na membrani CD8, so citotoksične celice T (celice T C ), ki uničujejo z virusi okužene celice.

31 21 Ko se celica T CD4 aktivira z Ag, izloča številne hormonom podobne molekule, imenovane citokini. Citokini so izredno pomembni za aktivacijo celic B, celic T C, makrofagov in različnih drugih celic, ki sodelujejo pri imunskem odzivu. Celice T C so poglavitne celice celično posredovane imunosti, ki je obramba pred virusi in pred bakterijami, ki se razmnožujejo znotraj gostiteljske celice in so nedostopne za Pt. Celično posredovana imunost spodbudi znotrajcelično razgradnjo mikrobov in uničenje okuženih celic (Vozelj 2000). Veliko študij na živalih in ljudeh je prikazalo imunsko spodbujajoče učinke mlečnokislinskih bakterij na številnih področjih humoralnega in celičnega imunskega odziva (Gill 1998) Produkcija dušikovega oksida (NO) Nedavno so spoznali, da je dušikov oksid (NO) pomemben fiziološki mediator. V zvezi z obrambo pred patogenimi mikrobi je pomembno, da nastaja z delovanjem inducibilne sintaze NO (i NOS) v večini celic, predvsem pa v makrofagih in človeških nevtrofilcih. Dušikov oksid in njegovi derivati so močan mikrobicidni učinkovalec. Medtem ko je oksidaza NADPH namenjena za uničenje zunajceličnih mikroorganizmov, zajetih s fagocitozo v fagocitni vakuoli, deluje mehanizem NO proti mikrobom, ki vdrejo v citosol. Zato nas ne preseneča, da ima večina nefagocitnih celic, ki se lahko okužijo z virusi, inducibilno sintazo NO (i NOS). Mehanizem delovanja poteka preko razgradnje prostetičnih skupin Fe-S nekaterih encimov za prenos elektronov, odstranitve Fe in izdelovanja peroksidov ONOO-. Količina i NOS se v makrofagih močno poveča s spodbujevanjem z vnetnimi citokini IL-1, dejavnikom tumorske nekroze-α (TNF-α) in posebno z IFN- γ (Vozelj 2000).

32 22 Slika 5: Vloga NO pri rasti tumorskega tkiva (Nature Reviews, 2006) Citokini Citokini so skupina regulacijskih proteinov z majhno molekulsko maso, ki jih izločajo skoraj vse celice, predvsem pa limfociti in makrofagi. Citokini se vežejo s specifičnimi receptorji na membrani tarčnih celic in sprožijo signal, ki se prenese v notranjost celice in spremeni izražanje genov v njej. Na splošno se citokini vežejo na receptorje z močno afiniteto. Zaradi te velike afinitete lahko citokini posredujejo biološke učinke v pikomolarnih koncentracijah. Nekateri citokini se lahko vežejo z receptorji na membrani iste celice, ki jih izloča in delujejo avtokrino. Citokini se navadno vežejo na receptorje tarčnih celic, ki so v neposredni bližini celice, ki jih izloča in delujejo parakrino. V redkih primerih se vežejo na celico v oddaljenem kraju telesa in delujejo endokrino. Vezanje določenega citokina na odzivno celico povzroči, da odzivna celica izrazi na svoji površini citokinske receptorje in sprošča številne druge citokine, ki nato delujejo na različne tarčne celice.

33 23 Tako lahko citokini, ki jih izloča posamezni limfocit po aktivaciji z antigenom, vplivajo na aktivnost različnih celic, ki sodelujejo pri imunskem odzivu. Npr. citokini, ki jih izločajo aktivirane celice TH, vplivajo na aktivnost celic B, celic T C, naravnih celic ubijalk, makrofagov, granulocitov in hemopoetskih matičnih celic in tako aktivirajo celotno omrežje sodelujočih celic (Vozelj 2000). Najpomembnejša lastnost citokinov je pleiotropnost, tj. v različnih celicah tarčah sproščajo različne biološke učinke. Delujejo lahko sinergistično tj. če je skupen učinek dveh citokinov večji od aditivnega učinka posameznih citokinov, ali pa delujejo antagonistično. Citokini obsegajo družine molekul, kot so (Vozelj 2000): rastni faktorji ter kemokini interferoni, interlevkini - izdelujejo jih limfociti T, makrofagi in tudi nekatere tkivne celice in imajo številne funkcije. Večina usmerja druge celice k delitvi in razmnoževanju. Vsak interlevkin deluje na specifično skupino celic, ki izražajo ustrezen receptor za ta interlevkin. Slika 6: Vloga interlevkinov (Nature Reviews, 2006)

34 24 Ker imajo citokini številne lastnosti, ki so prav take, kot jih imajo hormoni in rastni faktorji, je razločevanje med temi tremi razredi mediatorjev pogosto nejasno. Vsi razredi mediatorjev so topne molekule, ki izzovejo biološke učinke v pikomolarnih koncentracijah z vezanjem na receptorje tarčnih celic. Rastni faktorji nastajajo konstitucijsko, medtem ko je izdelovanje citokinov skrbno uravnavano. Citokini se navadno izločajo po aktivaciji določene celice in njihovo izločanje je kratkotrajno, le nekaj ur ali dni. V nasprotju s hormoni, ki delujejo na velike razdalje na endokrini način, deluje večina citokinov na kratke razdalje avtokrino ali parakrino. Citokini navadno delujejo kot medcelične sporočilne molekule, ki po vezanju na receptorje odzivnih celic tarč spodbudijo v njih določeno biološko aktivnost. Čeprav izločajo citokine različne celice, so najpomembnejši izdelovalci citokinov celice T H in makrofagi. Citokini, ki jih sproščata ta dva celična tipa, aktivirajo celotno mrežje sodelujočih celic. Med številnimi fiziološkimi odzivi, za katere je potrebna udeležba citokinov, je razvoj humoralnega in celično posredovanega imunskega odziva, sprožitev vnetja, uravnavanje hemopoeze, uravnavanje celičnega razmnoževanja in diferenciacije ter zdravljenje ran (Vozelj 2000) Interlevkini Izdelujejo jih limfociti T, makrofagi in tudi nekatere tkivne celice in imajo številne funkcije. Večina usmerja druge celice k delitvi in razmnoževanju. Vsak interlevkin deluje na specifično skupino celic, ki izražajo ustrezen receptor za ta interlevkin (Vozelj 2000). Interlevkin-6 (IL-6) izdelujejo različni celični tipi. Je izrazit pleiotropni citokin. Na celice B deluje s pospeševanjem razmnoževanja in zorenja ter s tem okrepi izločanje imunoglobulinov. Raven IL-6 je zvečana pri različnih boleznih. Odkrijemo ga v obtoku pri okužbah z Gram negativnimi bakterijami. IL-6 je poglavitni mediator reakcije akutne faze vnetja in deluje neposredno na hepatocite, da sintetizirajo C-reaktivni protein (CRP), komponente komplementa in druge proteine akutne faze vnetja (Vozelj 2000).

35 Uporaba celičnih kultur Uporaba celičnih kultur za raziskovanje vplivov mikroorganizmov je standardna in vitro metoda. Z uporabo celičnih kultur se do določene mere lahko izognemo poskusom na živalih saj te služijo kot model za dejansko dogajanje v naravi (Hu in sod. 2006). Funkcionalni celični modeli normalnih, ne kancerogenih tkiv so bili uspešno uporabljeni v študijah transepitelijskih prehodov in biološke aktivnosti biomolekul (Cencič in sod. 2002). Opazovanje interakcij med probiotičnimi kulturami in celičnimi kulturami intestinalnega epitelija je zelo pomemben del ocenjevanja mikroorganizmov kot potencialnih probiotikov. Ta opazovanja nam nudijo vpogled na dogajanje v prebavnem traktu. Tako lahko izmerimo citotoksičnost preučevanih mikroorganizmov, stopnjo vezave bakterij na celice epitelija, imunski odziv ter mnoge druge parametre, ki so ključni za ugotavljanje pozitivnih lastnosti mikroorganizmov.

36 26 3 MATERIALI IN METODE 3.1 Materiali Bakterijski vzorci Izolirali smo 16 različnih bakterijskih kolonij iz vzorcev, ki smo jih pridobili na petih kmetijah v Savinjski regiji. Njihovo poimenovanje je prikazano v preglednici 3. Preglednica 3: Izolirani bakterijski sevi Izolati iz fecesa F1K1K1 F1K1K2 F1K2K1 F1K2K2 F1K2K3 F2K1 F2K2 F3K1 Izolati iz mleka M2K1 M2K2K1 M2K2K2 M3K1 M4K1 M5K1 M5K2K1 M5K2K2

37 Celične kulture Pri poskusih smo uporabili celične kulture navedene v preglednici 4. Preglednica 4: Uporabljene celične kulture Celična kultura Tip CLAB Prašičje intestinalne celice CIEB Telečje intestinalne epitelijske celice OSI Ovčje intestinalne epitelijske celice PSI Prašičje intestinalne epitelijske celice GIE Kozje intestinalne epitelijske celice H4 Človeške intestinalne epitelijske celice *Vse celične kulture so bile vzpostavljene v laboratoriju Katedre za mikrobiologijo in biokemijo Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede Univerze v Mariboru.

38 28 Celična linija CIEB Celična linija GIE Celična linija PSI Celična linija OSI Celična linija CLAB Slika 7: Celične linije CIEB, GIE, PSI, OSI, CLAB (Trapečar 2008)

39 Gojišča Bakterijska gojišča a) Trdno gojišče MRS agar (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Sestava: 61 g osnovnega medija MRS agar 1 liter destilirane vode Sestava osnovnega medija MRS agar: Agar Magnezijev sulfat, Manganov sulfat, Mesni ekstrakt, Natrijev acetat, Univerzalen pepton, Ekstrakt kvasovk, Di-Kalijev hidrogen fosfat, Di-Amonijev hidrogen citrat, D(+)-glukoza, 12 g/l 0.1 g/l 0.05 g/l 5 g/l 5 g/l 10 g/l 5 g/l 2 g/l 2 g/l 20 g/l b) Tekoče gojišče MRS broth (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Sestava: 51 g osnovnega medija MRS broth 1 liter destilirane vode

40 30 Sestava osnovnega medija MRS broth: Pepton, Mesni ekstrakt, Ekstrakt kvasovk, Glukoza, Di-Kalijev hidrogen fosfat, Natrijev acetat tri-hidrat, Tri-Amonijev citrat, Magnezijev sulfat hepta-hidrat, Manganov sulfat tetra-hidrat 10 g/l 8 g/l 4 g/l 20 g/l 2 g/l 5 g/l 2 g/l 0,2 g/l 0,05 g/l Gojišča za sesalske celične kulture V raziskavi smo uporabljali naslednja gojišča za celice: DMEM Advance (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) brezbarvni DMEM Advance (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Raztopine in reagenti Fiziološka raztopina (PBS) 8,5 g NaCl smo raztopili v 100 ml destilirane vode in nevtralizirali z vodno raztopino NaOH do vrednosti ph 7,2. Nevtralizirano raztopino smo kvantitativno prenesli v 1000ml merilno bučko,dopolnili z destilirano vodo do oznake,ter sterilizirali v avtoklavu 15 minut pri 121 C. Do uporabe smo raztopino hranili v hladilniku pri temperaturi 4 C. FBS,serum govejega zarodka (LONZA, Basel, Švica) Glicerol - C 3 H 8 O 3 (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) 0,25 % raztopina tripsina EDTA Raztopina gentamicina (pripravili smo ustrezno koncentracijo 100ug/ml iz komercialnega Garmycina (KRKA, Novomesto, Slovenija)) L-glutamin

41 31 Raztopina streptomicina (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) Raztopina penicilina (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) barvilo kristal vijolično barvilo tripansko modrilo etanol vodikov peroksid - H 2 O 2 (Belinka, Ljubljana, Slovenija) 40% raztopina natrijevega hidroksida NaOH 10% raztopina ocetne kisline CH 3 COOH 30% raztopina MTT - (proizvajalec Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) 10 % Triton X-100 v kislem propanolu (Merck, New Jersey, ZDA) raztopina citokrom C-ja (Merck, New Jersey, ZDA) v razmerju 80 µm /L PBS-a Testni kiti API CH 50 (proizvajalec BioMerieux, Marcy l'etoile, Francija) E.L.I.S.A. Cytokine test kit (proizvajalec MabTech, Štokholem, Švedska) Droben material Petrijevke (proizvajalec Thermo Scientific, Langesbold, Nemčija) Plastenke za gojenje celic (proizvajalec CORNING, New York, ZDA) Večnamenske ploščice P96 (proizvajalec TPP, Trasadingen, Švica) Tipsi, različnih velikosti (proizvajalec Thermo Scientific, Langesbold, Nemčija) Ependorf tubice (proizvajalec TPP, Trasadingen, Švica) Epruvete, različnih velikosti (proizvajalec TPP, Trasadingen, Švica)

42 Laboratorijska oprema CO 2 inkubator (proizvajalec Binder, Tuttlingen, Nemčija) Omogoča kontrolirano atmosfero z visoko vlažnostjo in določenim razmerjem kisika in ogljikovega dioksida (5% CO 2 in 95% O 2 ). Omogoča natančno vzdrževanje konstantne temperature (običajno 37 C). Mešanica zraka se vpihuje v inkubator skozi filter, tok zraka teče ob navlaženi površini in s seboj nosi vodne hlape. Vgrajen ima prostor za jemanje vzorcev iz inkubatorja in analiziranje koncentracije CO 2, omogoča doziranje čistega CO 2 do želene koncentracije. Komora z laminarnim tokom zraka v vertikalni smeri (proizvajalec Iskra, Šempeter pri gorici, Slovenija) Omogoča najenostavnejši način za doseganje aseptičnih pogojev. Uporabljamo jo pri presajanju celic ter pri pripravi medijev in reagentov. Spektrofotometer Uporabljali smo spektrofotometer Labsystems 391 Multiskan MS. Hematocitometer Omogoča štetje celic. Avtoklav (proizvajalec Kambič, Semič, Slovenija) Omogoča mokro sterilizacijo pri določeni temperatura (20 minut pri 121 C). Pri raziskavi smo uporabljali avtoklav proizvajalca Kambič laboratorijska oprema. Hladilniki in zamrzovalniki (proizvajalec Gorenje, Velenje, Slovenija) Dovolj efektni so hladilniki in zamrzovalniki iz gospodinjstev. Večina reagentov za tkivne kulture se shranjuje pri -20 C. Za shranjevanje bakterijskih vzorcev pa smo uporabili zamrzovalnik, ki omogoča shranjevanje pri -70 C. Invertni mikroskop (proizvajalec Nikon, Ljubljana, Slovenija) Opazovanje kultur je zelo pomembno,saj zaznamo odmiranje celic in možno mikrobiološko kontaminacijo.

43 33 Če želimo fotografirati žive kulture je pomembno,da imamo mikroskop s kvalitetno optiko, kondenzatorjem za fazni kontrast in objektivom za nameščanje fotoaparata. Uporabljali smo mikroskop in fotoaparat Coolpix 995. Centrifuga (proizvajalec Tehtnica, Železniki, Slovenija) Se uporablja za povečanje koncentracije celic in za izpiranje reagenta. Uporabljali smo centrifugo 3000R. Tehtnica (proizvajalec Sartorius, Gothingen, Slovenija) Omogoča pripravo gojišč,reagentov in medijev. Korito in pralni stroj za pomivanje steklovine V korito odlagamo uporabljene pipete,steklenice,čaše, in druge pripomočke,ki jih je potrebno namočiti v dezinfekcijskem sredstvu in detergentu. Uporabljali smo tudi pralni stroj proizvajalca Steelko. Čiščenje vode Za pranje steklovine se uporablja destilirana voda,za mešanje medijev in reagentov je potrebna deionizirana voda ali voda pridobljena z reverzno osmozo, imenuje se ultra čista voda in je še dodatno filtrirana skozi filter z mikroporami.

44 Metode Potek dela Odvzem vzorcev kozjega mleka ter fecesa Izolacija mlečnokislinskih bakterij Separacija posameznih bakterijskih kolonij Karakterizacija bakterij Določanje probiotičnih učinkov Slika 8: Potek dela Vzorci Zbiranje vzorcev Za pridobitev vzorcev smo se dogovoril s 5 kmetijami, ki se intenzivno ukvarjajo s prirejo koz na območju Savinjske regije. Odvzeto je bilo 5 vzorcev mleka ter 3 vzorci fecesa. Vzorci fecesa ter mleka so bili odvzeti aseptično ter shranjeni v fosfatnem pufru s soljo (PBS). Do prihoda v laboratorij so vzorci bili shranjeni v hladilni torbi.

45 Priprava razredčitvenih vrst Pred nanašanjem vzorcev na hranilne medije smo opravili več razredčin vzorcev zaradi lažjega ter preglednejšega štetja bakterijskih kolonij. Tako smo opravili razredčitvene vrste za mleko in feces. Od vsakega vzorca smo vzeli po 1 ml ter ga pomešali med 9 ml PBS-a tako, da smo dobili razredčino reda Iz te razredčine smo ponovno odvzeli 1 ml ter jih pomešali z nadaljnjimi 9 ml PBS-a in tako naprej do razredčine reda Priprava hranilnih medijev Kot hranilni medij za nanos vzorcev smo izbrali MRS agar (proizvajalec Scharlau). To je agar, ki favorizira rast mlečnokislinskih bakterij saj so le-te glavni objekt raziskave. MRS agar smo pripravil tako, da smo raztopili 66 g MRS agarja v prahu v 1 litru destilirane vode ter le-to segrevali dokler se prah ni povsem raztopil. Pripravljeno raztopino smo dali avtoklavirati na temperaturo 121 ºC za 15 minut. Avtoklaviran agar smo razlili na petrijeve ploščice v sterilnem okolju Nanašanje vzorcev Na vsako petrijevo ploščico smo nanesli po 1 ml vsake pripravljene razredčine vsakega vzorca ter razmazali po celotni površini ploščice Inkubiranje vzorcev Petrijeve ploščice z nanesenimi vzorci smo inkubiral pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37 ºC za 48 ur.

46 Izolacija bakterij Po 48 urah inkubacije je sledil pregled petrijevih ploščic. Pri razredčinah 10-3 so pri vseh vzorcih bile lepo vidne posamezne kolonije bakterij, ki smo jih ločili in vsako reprezentativno kolonijo prenesli v epruvete z 9 ml tekočega MRS. Prenesene kolonije smo inkubirali nadalnjih 24 ur pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37 ºC Kontrola čistosti kultur Po nadaljnjih 24 urah inkubacije smo iz vsake epruvete odvzeli po 1 ml bakterijske suspenzije in jih nanesli na ločene petrijeve ploščice z trdim MRS agarjem ter jih ponovno inkubirali 24 ur pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37 ºC. Tako smo se po 24 urah lahko prepričali, da so bakterijske kulture bile res čiste Shranjevanje bakterijskih vzorcev Za tem ko smo preverili čistost kultur so bakterije bile pripravljene za shranjevanje. Shranili smo jih tako, da smo po 850 µl bakterijske suspenzije pomešali z 450 µl glicerola, pretresli s stresalnikom in ependorf tubice shranil na -70 ºC. Tako shranjene bakterijske kulture smo uporabljal za nadaljnje poskuse Revitalizacija in kultivacija bakterijskih vzorcev Zamrznjene bakterije smo nacepili v 5 ml MRS tekočega gojišča ter jih kultivirali pod anaerobnimi pogoji 24 ur pri temperaturi 37 ºC

47 Določanje števila bakterij v vzorcu Za določitev števila bakterij smo uporabili metodo merjenja optične gostote bakterij s pomočjo Multiscan mikrotiter čitalca ploščic. Čeznočno kulturo bakterij smo dobro resuspendirali ter odpipetirali po 100 µl v luknjice ploščice P 96. Kot kontrolo smo vzeli čisto MRS gojišče brez bakterij. Sledilo je merjenje absorbance pri valovni dolžini 620 nm. Ko smo opravili meritve, lahko izračunamo natančno število bakterij v našem vzorcu po formuli: A= (A 620 nm (kultura) A 620 nm (kontrola) ) x 3 x 10 8 A= absorbanca Enačba 1: Enačba za izračun abosrbance Iz tega izračunamo potem še število bakterij na ml bakterijske suspenzije. Število bakterij za nanos na ploščice P 96 s celicami je različno: 1x10 8, 1x10 7, 1x Priprava ustrezne koncentracije bakterij za nanos na celice Ko smo določili število bakterij za vsako probiotično bakterijo posebej, smo odpipetirali ustrezen volumen vsake čeznočne kulture in razredčili z ustreznim volumnom brezbarvnega DMEM gojišča brez fenol rdečega, brez seruma in brez antibiotikov. Tako pripravljene suspenzije smo centrifugirali pri 2400 obratih/min 10 minut. Po končanem centrifugiranju smo odlili supernatante in jih nadomestili s čistim brezbarvnim DMEM medijem (enak volumen kot pred centrifugiranjem). Bakterije smo dobro resuspendirali. Dobljene suspenzije bakterij so pripravljene za nanos na ploščice z celicami.

48 Nanos bakterij na celice Pred nanosom bakterij na ploščice s celicami v luknjicah v P 96 ploščici smo najprej odstranili staro gojišče in enosloje sprali s 100 µl čistega brezbarvnega DMEM gojišča. V vsako luknjico s celicami smo nanesli po 100 µl suspenzije bakterij ter jih inkubirali po določenem protokolu. En del luknjic smo pustili praznih brez bakterij za kontrolo Celične kulture Gojenje celic Celice smo gojili v DMEM Advance gojišču z dodatkom 5 % telečjega seruma, antibiotikov penicilin ter streptomicin (9ml/l) in L-glutamina. Gojili smo jih v plastičnih stekleničkah za gojenje evkariotskih celic pri temperaturi 37 ºC in atmosferi z 5% CO 2. Gojišče smo menjavali, ko se je to obarvalo v rjavo rumeno barvo zaradi padca ph ob prekomernem kopičenju presnovnih produktov Presajanje celic Celice smo gojili tako dolgo, dokler niso tvorile lepega enosloja po celotni spodnji površini stekleničke. Ko so celice prerastle površino in tvorile lep enosloj, smo gojišče odlili in celice sprali z 1 ml 0,25% tripsina z dodanim 0,5 mm EDTA-jem. Nato smo v stekleničke odpipetirali po 1 ml tripsina in inkubirali 5-10 minut dokler se celice v celoti niso odlepile od površine pri 37 ºC. Po tem smo dodali 9 ml DMEM brez seruma tako, da so končni volumni v stekleničkah bili 10 ml. Suspenzijo celic v gojišču smo nato v celoti odpipetirali iz stekleničk v označene centrifugirke in jih centrifugirali pri 800 obratih 5 minut. Po centrifugiranju smo supernatante odlili in dodali enak volumen DMEM gojišča brez seruma. Celice smo dobro resuspendirali in v stekleničke vrnili po 2 ml suspenzije celic za gojenje ter dopolnili z DMEM gojiščem in 5 % serumom.

49 Štetje celic s pomočjo hematocitometra Iz prej pripravljene suspenzije celic smo sterilno odpipetirali 100 µl suspenzije in resuspendirali v pripravljeno epico z 900 µl 0,1 % tripanskega modrila. Nato smo 100 µl mešanice prenesli v hematocitometer ter prešteli celice v 25 kvadratkih pod mikroskopom. Število celic v ml suspenzije smo izračunali tako, da smo število preštetih celic pomnožili z 10 6 in delili z 25. Končno število celic za nanos na mikrotitrsko ploščico mora znašati natanko 1 x Nanos celic na ploščico P 96 Po izračunanem številu celic odpipetiramo ustrezen volumen suspenzije celic v novo centrifugirko in dodamo sveže gojišče DMEM s 5 % serumom tako, da je končni volumen 11 ml. V vsako luknjico ploščice nato nanesemo po 100 µl pripravljene mešanice in ploščico inkubiramo 24 ur v inkubatorju s 5 % CO 2-95 % 0 2 pri 37 ºC. Naslednji dan pred nanašanjem bakterij na celice za izvedbo poskusa, pregledamo z mikroskopom ter se prepričamo, da so celice pritrjene na dno vsake luknjice ter da so ustvarile lep enosloj.

50 Karakterizacija bakterij Barvanje po Gramu Bakterije smo nanesli na mikroskopsko stekelce, jih fiksirali s plamenom in prekrili z filtrirnim papirjem. Preparat smo prelili z kristal vijoličnim barvilom, pustili stati 3 minute, odstranili filtrirni papir, odlili odvečno barvo ter za dve minuti preparat prelili z NaOH. Preparat smo sprali z 96% etanolom do razbarvanja in nato sprali etanol z tekočo vodo. Tako obarvane bakterije smo opazovali pod svetlobnim mikroskopom. V primeru, da so bakterije obarvane vijolično so Gram pozitivne, v kolikor pa so obarvane roza pa Gram negativne. Slika 9: Gram pozitivni Lactobacilli (Trapečar, 2007) Katalazni test Pri katalaznem testu smo prenesli bakterijske kolonije z leseno paličico (kovine lahko spremenijo rezultat) na stekelce. Tam smo jim dodali 3% vodikov peroksid in opazovali ali nastajajo kakšni zračni mehurčki. V primeru, da ti nastajajo zaradi posledice izločanja kisika so bakterije katalazno pozitivne. V primeru, da kisik ne izstopa so bakterije katalazno negativne.

51 API CH 50 Test API test se uporablja za identifikacijo bakterij glede na ogljikove hidrate, ki jih fermentirajo. API test je zasnovan tako, da so na trakcih majhne komore, ki vsebujejo različne ogljikove hidrate ter indikacijska barvila. V te komore smo dodali po 100 µl bakterijske suspenzije ter vodo in inkubirali za 24 ur pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37 ºC. Po 24 urah smo po barvnem ključu ovrednotili barvne spremembe posameznih komor za posamezne bakterijske kulture s pomočjo pripadajočega računalniškega programa. Slika 10: API CH 50 test (Trapečar, 2009)

52 Testiranje biološke aktivnosti bakterij Določanje citotoksičnosti bakterij Iz ploščice s celicami in bakterijami smo najprej odstranili gojišče ter nato nanesli 0,1 % kristal vijoličnega barvila. Pustili smo ga delovati 5 minut pri sobni temperaturi. Barvilo smo nato odlili in ploščico previdno sprali pod tekočo vodo. Spiranje smo prekinili, ko barva več ni odtekala. Nato smo pustili ploščico 24 ur na sobni temperaturi, da se dobro posuši. Naslednji dan smo ploščico razbarvali tako, da smo v vsako luknjico nanesli po 100 µl 10 % ocetne kisline in jo pustili delovati 1 uro na stresalniku. Po preteku 1 ure smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 595 nm Test vezivnosti Vezivnost bakterij na celične kulture smo določali tako, da smo predhodno inkubirane celice z bakterijami najprej 3 x sprali s PBS, da smo zagotovili prisotnost le tistih bakterij, ki so se res vezale na površino. Nato smo v vsako luknjico dodali po 20 µl tripsina za 10 minut, da so se celice odlepile od površine. Po inkubaciji je sledi nanos 80 µl gojišča z 20 % serumom, s čimer smo zagotovili nevtralizacijo tripsina. Sledilo je izsesavanje 100 µl suspenzije v ependorf tubice in redčenje njene vsebine v 900 µl gojišča. Redčine smo nanesli na petrijeve ploščice z MRS agarjem in pustili rasti 3 dni pod anaerobnimi pogoji pri 37 ºC. Po koncu inkubacije smo prešteli zrasle kolonije bakterij MTT test Po predhodni inkubaciji celičnih linij na P 96 ploščici z bakterijskimi kulturami, smo odstranili gojišče ter v vsako luknjico nanesli najprej po 200 µl čistega brezbarvnega DMEM gojišča ter nato dodali po 20 µl raztopine MTT (15mg/ml). Ploščico smo inkubirali za 75 minut pri 37 ºC. Nastale formazanske kristale smo raztopili tako, da smo najprej izsesali 200 µl supernatanta in dodali 100 µl 10 % Triton X-100 v kislem propanolu. V nadaljevanju smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 650 nm.

53 NO test Iz predhodno inkubiranih celic z bakterijami smo prenesli 50 µl supernatanta na novo P 96 ploščico. Dodali smo še 50 µl Griess reagenta in pustili stresati na stresalniku pri 400 obratih 15 minut. Nato smo s pomočjo mikrotiter čitalca izmerili absorbanco pri valovni dolžini 540 nm E.L.I.S.A. test za merjenje citokinov E.L.I.S.A. test je test za merjenje citokinov. Za tale poskus smo nabavili E.L.I.S.A. test kit, kjer je vse potrebno vključeno. E.L.I.S.A. je visoko specifičen in občutljiv test za kvantitativno določitev citokinov. Vzeli smo ploščico z vezanimi monoklonalnimi protitelesi, jih sprali in dodali vzorce ter standard. Za tem smo dodali biotinilirana detekcijska monoklonalna protitelesa, sprali in dodali encim streptavidin. Ploščico smo ponovno sprali ter dodali kromogeni substrat za razvoj barve, ki smo jo nato izmerili na valovni dolžini 450 nm Merjenje ekstracelularnega kisika Iz predhodno inkubiranih celic z bakterijami smo prenesli 50 µl supernatanta na novo P 96 ploščico. K supernatantu smo dodali 50 µl mešanice citokrom C-ja v razmerju 80 µm na liter PBS-a. Za tem smo ploščico inkubirali za 30 minut na 37 ºC in izmerili absorbanco na valovni dolžini 550 nm Statistična obdelava podatkov ter prikaz rezultatov Eksperimente smo zasnovali tako, da smo vsak poskus izvedli v treh ponovitvah, kjer smo posamezno meritev opravili v treh paralelnih meritvah. Rezultati ponazarjajo povprečne vrednosti vseh meritev ter standardni odklon.

54 44 a) Povprečno vrednost smo izračunali po naslednji formulaciji: _ x = povprečna vrednost x i = posamezna meritev n = število meritev Enačba 2: Enačba za izračun povprečne vrednosti b) Standardni odklon smo izračunali po naslednji formulaciji: _ x = povprečna vrednost x i = posamezna meritev N = število meritev σ = standardni odklon Enačba 3: Enačba za izračun standardnega odklona

55 45 4 REZULTATI 4.1 Izolacija bakterij Po prihodu v laboratorij smo iz pridobljenih vzorcev najprej naredili razredčitveno vrsto v PBS do koncentracije 10-6 bakterij/ml. Pripravljene razredčine posameznih vzorcev smo prenesli na MRS agar in inkubirali pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37 ºC za 48 ur. Po inkubacijski dobi smo za pregled posameznih petrijevih ploščic za vsak vzorec izbrali ploščice z razredčino 10-3 saj so na njih bile najlepše vidne posamezne kolonije bakterij. Te smo prenesli na nove ploščice z MRS agarjem in jih inkubirali nadaljnjih 24 ur pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 37 ºC. Po 24 urah smo se lahko prepričali o čistosti posameznih kolonij.tako smo pridobili 16 bakterijskih kolonij (Preglednica 3). 4.2 Barvanje po Gramu Barvanje po Gramu je empirična metoda, ki diferencira bakterije na dve skupine. Gram pozitivne bakterije ter Gram negativne bakterije katere se ločijo po kemičnih in fizioloških lastnostih celičnih sten. Večina probiotičnih kultur je po diferencijaciji Gram pozitivnih za to je to pomemben karakterizacijski test za prvostopenjsko določanje probiotikov. Gram pozitivne bakterije imajo debelejšo celično plast sestavljeno večinoma iz peptidoglikana in se obarvajo vijolično med tem, ko Gram negativne bakterije posedujejo tanjšo steno, ki se obarva roza. Po postopku barvanja smo pod mikroskopom določili barvo in morfologijo posameznih vzorcev in ugotovili, da so bile vse testirane bakterije razen dveh Gram pozitivnih kokov, Gram pozitivni bacili (Preglednica 5).

56 46 Preglednica 5: Rezultati barvanja po Gramu Vzorci Gram F1K1K1 + F1K1K2 + F1K2K1 + F1K2K2 + F2K1 + F2K2 + F3K1 + M2K1 + M2K2K1 + M2K2K2 + M3K1 + M4K1 + M5K1 + M5K2K1 + M5K2K2 +

57 Katalazni test Katalazni test je zraven barvanja po Gramu eden od glavnih diferenciacijskih testov za osnovno določanje potencialnih probiotičnih bakterij. Prav tako kot barvanje po Gramu tudi katalazni test diferencira bakterije v dve skupni. To sta katalazno pozitivne ter katalazno negativne bakterije. Loči jih posedovanje encima katalaze, ki povzroči nastajanje zračnih mehurčkov ob prisotnosti vodikovega peroksida. Za probiotične bakterije je značilno, da so katalazno negativne. Ugotovili smo, da so vse analizirane bakterije katalaza negativne (Preglednica 6). Preglednica 6: Rezultati katalaznega testa Vzorci Prisotnost encima katalaze F1K1K1 - F1K1K2 - F1K2K1 - F1K2K2 - F2K1 - F2K2 - F3K1 - M2K1 - M2K2K1 - M2K2K2 - M3K1 - M4K1 - M5K1 - M5K2K1 - M5K2K2 -

58 API CH 50 Test API CH 50 test je ustvarjen za natančnejšo karakterizacijo mlečnokislinskih bakterijskih vrst na podlagi fermentacije ogljikovih hidratov. Vsaka testna ploščica je opremljena z majhnimi žepki, ki vsebujejo specifičen ogljikov hidrat ter barvni indikator, ki ob fermentaciji spremeni barvo. Tako smo naše vzorce nanesli v vse žepke in s pomočjo računalniškega programa ki dobljene rezultate primerja z rezultati znanih in že identificiranih bakterijskih sevov identificirali posamezne vrste izoliranih sevov (Preglednica 7). Test zagotavlja 90% točnost rezultatov. Preglednica 7: Rezultati API CH 50 testa Vzorci Identifikacija po API CH 50 F1K1K1 F1K1K2 F1K2K1 F1K2K2 F2K1 F2K2 F3K1 M2K1 M2K2K1 M2K2K2 M3K1 M4K1 M5K1 M5K2K1 M5K2K2 Lactococcus Rafinolactis Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Crispatus Lactobacillus Crispatus Lactobacillus Paracasei Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Brevis Lactobacillus Plantarum Lactococcus Lactis

59 49 Ugotovili smo, da 13 vzorcev spada v rod Lactobacillus spp. ter 2 v rod Lactococcus spp.. Od 13 vzorcev, ki pripadajo rodu Lactobacillus spp. jih devet pripada vrsti Lactobacillus Plantarum, 2 pripadata vrsti Lactobacillus Crispatus, 1 vrsti Lactobacillus Brevis ter 1 vrsti Lactobacillus Paracasei. Od dobljenih 2 rodov Lactococcus spp., eden pripada vrsti Lactococcus Lactis ter eden k vrsti Lactococcus Rafinolactis. 4.5 Testiranje citotoksičnosti Za varno aplikativno uporabo v probiotične ali zdravstvene namene, je potrebno ugotoviti morebitne dejavnike tveganja apliciranja bakterijskih sevov na žival ali človeka. Zato smo ugotavljali učinke izoliranih in identificiranih sevov na intestinalni epitelij prašiča (CLAB, PSI), goveda (CIEB) in ovac (OSI) (Preglednica 8). Vsaka snov ali bakterijski sev, ki je dodan na celične kulture v dovolj visoki koncentraciji je citotoksičen. Za to smo pred testiranjem probiotičnih bakterij na celičnih kulturah določili koncentracijo ob kateri se opazi citotoksičen učinek. V poskusu smo določili najvišjo koncentracijo bakterij, ki še ne kaže citotoksičnosti. Dobljene rezultate smo upoštevali za nadaljnje poskuse.

60 50 Preglednica 8: Prikaz citotoksičnosti za celične linije CLAB, CIEB, PSI, OSI Bakterije CLAB CIEB PSI OSI F1K1K F1K1K F1K2K F1K2K F2K F2K F3K M2K M2K2K M2K2K M3K M4K M5K M5K2K M5K2K Iz tabele je razvidno, da so posamezne bakterijske kulture sorazmerno neizenačene glede citotoksičnega učinka na celične linije CLAB saj segajo vrednosti najvišje koncentracije bakterij brez citotoksičnega učinka od 10 4 do 10 6 bakterij/ml. Prav tako je razvidno, da so posamezne bakterijske kulture sorazmerno neizenačene glede citotoksičnega učinka na celične linije CIEB saj segajo vrednosti najvišje koncentracije bakterij brez citotoksičnega učinka prav tako od 10 4 do bakterij/ml. V nasprotju s tem so sorazmerno izenačene bakterijske kulture glede citotoksičnega učinka na celične linije OSI ter PSI saj segajo vrednosti najvišje koncentracije bakterij brez citotoksičnega učinka pri vseh bakterijah do 10 6 bakterij/ml. Celična linija CLAB se je izkazala kot najobčutljivejša za naše vzorce, OSI pa kot najmanj. Izpostavimo lahko vzorec F1K2K2 ki kaže od vseh vzorcev najvišjo citotoksičnost, le-ta pripada vrsti Lactobacillus Plantarum.

61 51 Najmanjšo citotoksičnost kažejo vzorci F1K1K1 (Lactococcus Rafinolactis), F2K1 (Lactobacillus Plantarum) ter M3K1 (Lactobacilllus Plantarum), saj na vseh celičnih linijah segajo vrednosti najvišje koncentracije bakterij brez citotoksičnega učinka do bakterij/ml. 4.6 Vezava bakterij na celične linije Eden od najpomembnejših atributov za uspešnost probiotičnega organizma je sposobnost vezave na intestinalni epitelij. To sposobnost smo izmerili z dodajanjem probiotičnih kultur na celične linije, jih skupaj inkubirali 90 minut ter celice naknadno sprali s PBS, da smo zagotovili izključno prisotnost vezanih bakterij. Bakterije smo skupaj z celicami prenesli na MRS agar ter naslednji dan prešteli nastale kolonije. V rezultatih je prikazan odstotek vezanih bakterij glede na aplicirano začetno količino bakterij Odstotek vezave na celično linijo PSI Slika 11: Stopnja vezave na celično linijo PSI

62 52 Iz Slike 11 je razvidno, da so se najuspešneje vezale na celično linijo PSI bakterije F1K1K2 (Lactobacillus Plantarum) in to z 28 % ter F1K1K1 (Lactococcus Rafinolactis) in M2K1 (Lactobacillus Paracasei) z 20%. Najslabšo adhezivnost so pokazale bakterije F3K1(Lactobacillus Crispatus), M2K2K1 (Lactobacillus Plantarum), M2K2K2 (Lactobacillus Plantarum) z 2 % odstotkom vezave Odstotek vezave na celično linijo OSI Slika 12: Stopnja vezave na celično kulturo OSI Iz Slike 12 je razvidno, da so se najuspešneje vezale na celično linijo OSI bakterije F1K2K1 (Lactobacillus Plantarum) in to z 33 % ter vzorec F1K2K2 (Lactobacillus Plantarum) z 31 %. Najslabšo adhezivnost so pokazale bakterije F2K1 (Lactobacillus Plantarum) z 2 % odstotkom vezave.

63 Odstotek vezave na celično linijo GIE Slika 13: Stopnja vezave na celično linijo GIE Iz slike 13 je razvidno, da so se najuspešneje vezale na celično linijo GIE bakterije F1K1K1 (Lactococcus Rafinolactis) ter F2K2 (Lactobacillus Crispatus) in to z 80 %, najslabšo adhezivnost pa so pokazale bakterije F2K1 (Lactobacillus Plantarum) z 0,7% odstotkom vezave ter M5K1 (Lactobacillus Brevis) z 0,2 % vezavo.

64 Merjenje celičnega NO Izločanje dušikovega oksida (NO) je eden od mehanizmov prirojenega imunskega sistema za uničevanje patogenov. NO je toksičen za večino patogenov. Probiotiki so zmožni indukcije proizvodnje NO in s tem pripomorejo k antagonističnemu delovanju naproti patogenom. Rezultati so prikazani kot povprečje izmerjenih svetlobnih absorbanc (A) pri 540 nm. Te smo vnesli v program Excel in izračunali povprečje in standardne odklone, ter jih izrazili v odstotkih (Slike 14, 15) Določanje stopnje nastajanja dušikovega oksida ob dodatku vzorcev celičnim linijam CIEB Sliki 14 in 15 ponazarjata povečano oz. zmanjšano izločanje NO kot posledice koinkubacije celične linije CIEB z našimi vzorci. Vsi vzorci so pokazali sposobnost induciranja večjega izločanja NO. Kot najuspešnejša sta se izkazala bakterijska seva F1K1K1 (Lactococcus Rafinolactis) ter F2K1(Lactobacillus Plantarum), ki povečata izločanje NO v primerjavi z kontrolo za 52 % ter 41%. Najslabše se je odrezal bakterijski sev M2K2K2 (Lactobacillus Plantarum), ki je povečal izločanje NO za 8 %. Povišane vrednosti NO lepo kažejo na to, da probiotične bakterije aktivirajo respiratorne poti intestinalnih celičnih kultur, ki začno izdelovati NO, kar pripomore k potencialnemu uničenju patogenov, vendar je delovanje specifično za posamezne seve.

65 55 Slika 14: Izmerjena absorbanca za NO test Slika 15: Povečano izločanje NO v %

66 MTT test Z MTT testom smo želeli preveriti sposobnost izoliranih bakterijskih sevov za povečanje ali zmanjšanje mitohondrialne aktivnosti intestinalnih celičnih kultur. Rezultati so prikazani kot povprečje izmerjenih absorbcijskih vrednosti pri 650 nm, ki smo jih vnesli v program Excel in izračunali povprečje ter standardne odklone (Sliki 16, 17) MTT test na celični kulturi CIEB: Sliki 16 ter 17 prikazujeta stopnjo povišane oz. znižane metabolne aktivnosti celične linije CIEB, ki je posledica koinkubacije z različnimi probiotičnimi bakterijami. Iz slik je razvidno, da žive bakterije sprožijo povečano metabolno aktivnost celic v primerjavi s celicami inkubiranimi z kontrolo. Kot najuspešnejši se je izkazal vzorec M5K2K1 (Lactobacillus Plantarum), ki je povečal metabolno aktivnost kar za 88%. Kot najslabši pa se je izkazal vzorec F2K2 (Lactobacillus Crispatus), ki je metabolno aktivnost celo znižal in to za 21%. Slika 16: Vrednosti absorbance pri MTT testu