UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO JULIJA BUCHMEISTER MAGISTRSKA NALOGA UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO JULIJA BUCHMEISTER MAGISTRSKA NALOGA UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA Ljubljana, 2021

2

3 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO JULIJA BUCHMEISTER ANALIZNI PRISTOP ZA VREDNOTENJE STABILNOSTI HIDROFILNIH VITAMINOV ANALYTICAL APPROACH FOR STABILITY EVALUATION OF HYDROPHILIC VITAMINS UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA Ljubljana, 2021

4

5 Magistrsko nalogo sem opravljala na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko na Fakulteti za farmacijo, Univerza v Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Roberta Roškarja, mag. farm. in somentorstvom dr. Žane Temove Rakuša, mag. farm. Mentorju prof. dr. Robertu Roškarju se iskreno zahvaljujem za vso strokovno znanje, nasvete, prijaznost, sproščenost in potrpežljivost. Velika zahvala gre tudi somentorici dr. Žane Temovi Rakuša za ves trud, čas, prijetnost in pomoč pri nastajanju magistrskega dela. Posebna zahvala gre tudi vsem najbližjim za podporo, potrpežljivost in spodbudo v času izdelave magistrske naloge. Izjava Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja prof. dr. Roberta Roškarja, mag. farm in somentorice dr. Žane Temove Rakuša, mag. farm. Julija Buchmeister

6

7 VSEBINA 1 UVOD VITAMINI VODOTOPNI VITAMINI B KOMPLEKS IN C VITAMIN Tiamin (B1) Riboflavin (B2) Niacin (B3) Pantotenska kislina (B5) Piridoksin (B6) Biotin (B7) Folati Cianokobalamin (B12) Askorbinska kislina (vitamin C) STABILNOST STABILNOST NA SPLOŠNO STABILNOST VITAMINOV Vpliv farmacevtske oblike, agregatnega stanja in ovojnine Vpliv zunanjih dejavnikov Stabilnost vitaminov v raztopinah Stabilnost vitaminov v trdnem stanju TESTIRANJE STABILNOSTI Dolgoročno testiranje (angl. long term testing) Pospešeno testiranje (angl. accelerated testing) Stresno testiranje (angl. stress testing) ANALITIKA VITAMINOV NAMEN DELA MATERIALI IN METODE MATERIALI REAGENTI IN TOPILA STANDARDI III

8 3.1.3 NAPRAVE IN PRIBOR INSTRUMENTALNE ANALIZNE METODE ANALIZNA METODA ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV IZOKRATSKE METODE ZA ANALIZO POSAMEZNIH VODOTOPNIH VITAMINOV PRIPRAVA VZORCEV PRIPRAVA MOBILNE FAZE (MF) IN TOPIL VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV RAZVOJ IN VALIDACIJA ANALIZNIH METOD ZA POSAMEZNE VITAMINE STRESNO TESTIRANJE STABILNOSTI VITAMINOV V TRDNEM STANJU Priprava vzorcev za preverjanje topnosti vit. B7 in stabilnosti THFK Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti posameznih vitaminov pri povišani T in RV Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti posameznih vitaminov v fotostabilnostni stresni študiji Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti vitaminov v zmesi vseh vitaminov pri povišani T in RV VALIDACIJA INSTRUMENTALNE METODE SPECIFIČNOST LINEARNOST TOČNOST NATANČNOST STABILNOST VZORCEV OBDELAVA PODATKOV REZULTATI IN RAZPRAVA RAZVOJ ANALIZNEGA PRISTOPA NADGRADNJA GRADIENTNE ANALIZNE METODE RAZVOJ IZOKRATSKIH ANALIZNIH METOD VREDNOTENJE UHPLC METODE VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV Specifičnost Linearnost IV

9 Točnost in ponovljivost Stabilnost vzorcev VALIDACIJA ANALIZNIH METOD ZA POSAMEZNE VITAMINE Specifičnost Linearnost Točnost, ponovljivost in stabilnost standardov PRIMERJAVA GRADIENTNE IN IZOKRATSKE ANALIZNE METODE VREDNOTENJE STABILNOSTI VITAMINOV V TRDNEM STANJU STRESNA ŠTUDIJA RAZVOJ IN OPTIMIZACIJA PRIPRAVE VZORCEV ZA VREDNOTENJE STABILNOSTI V TRDNEM VREDNOTENJE STABILNOSTI POSAMEZNIH VITAMINOV PRI POVIŠANI T IN RV VREDNOTENJE STABILNOSTI POSAMEZNIH VITAMINOV OB IZPOSTAVITVI SVETLOBI VREDNOTENJE STABILNOSTI ZMESI VITAMINOV PRI POVIŠANI T IN RV SKLEP LITERATURA PRILOGE PRILOGA PRILOGA PRILOGA PRILOGA V

10 KAZALO SLIK Slika 1: Kromatogram vseh devetih osnovnih vodotopnih vitaminov in treh vitamerov v standardni raztopini pri 210 nm. Vrstni red elucije: C (2,1 min), B1 (3,1 min), B3-k (3,6 min), B6 (4,4 min), B3 (6,9 min), B5 (9,4 min), THFK (12,1 min), B9 (14,2 min), B7 (17,6 min), B2-f (20,8 min), B12 (21,6 min) in B2 (24,7 min) Slika 2: Kromatogram vit. B2-f z retencijskim časom 20,8 min, posnet pri 445 nm Slika 3: Kromatograma izokratskih programov za analizo vit. B7 (7,7 min) in B12 (7,0 min) pri 20 % (3a) oz. vit. B7 (5,1 min) in B12 (3,4 min) pri 25 % MeOH (3b), posneta pri 210 nm Slika 4: Kromatogram uporabljenih topil (MQ, 1 mm EDTA, 1 mm NaOH, 1 mm EDTA z dodanim 1 mm NaOH) pri 210 nm Slika 5: Umeritvena premica za vit. B6 s podano enačbo linearne regresije in R Slika 6: Vidna barvna razlika pri vit. C v odprtem (levi vsebnik) in zaprtem vsebniku (srednji vsebnik) po prvem tednu izpostavljenosti 60 C in 75 % RV. Barvna sprememba vit. C v zaprtem vsebniku po treh mesecih v izrazitejšo rjavo in pojav majhnih»zažganih kep«(desni vsebnik) Slika 7: Na vseh treh slikah so prikazani vzorci po zaključku enotedenske stresne študije. Stresna vzorca zmesi vitaminov (RDA razmerje in enako razmerje vitaminov 1:1) pri 60 C in nekontrolirani nizki RV sta ohranila prvotne organoleptične lastnosti ves čas študije (a). Stresna vzorca zmesi vitaminov (RDA razmerje in enako razmerje vitaminov 1:1) pri 60 C in 75 % RV sta bila že po dveh dneh povsem ožgana, po tednu dni pa smoljnata z zlepljenimi delci (b). Stresni vzorec enakega razmerja zmesi vitaminov pri 40 C in 75 % RV je bil povsem ožgan že po treh dneh, stresni vzorec RDA razmerja zmesi vitaminov pri 40 C in 75 % RV pa rahlo ožgan po tednu dni izpostavljenosti stresnim pogojem (c) Slika 8: Spremljanje vsebnosti vit. B2-f v zmesi vitaminov, v stresnih vzorcih in obeh kontrolah z označenimi SD odstopanji. Vzorci: 1:1 60O (enakomerno razmerje, 60 C, odprt vsebnik), 1:1 60Z (enakomerno razmerje, 60 C, zaprt vsebnik), 1:1 80Z (enakomerno razmerje, 60 C, zaprt vsebnik), 1:1 kontrola (enakomerno razmerje, sobna T, zaprt vsebnik), RDA 60O (RDA razmerje, 60 C, odprt vsebnik), RDA 60Z (RDA razmerje, 60 C, zaprt vsebnik), RDA 80Z (RDA razmerje, 80 C, zaprt vsebnik), RDA kontrola (RDA razmerje, sobna T, zaprt vsebnik) Slika 9: Vsebnost in SD odstopanja posameznih vitaminov v zmesi vseh vitaminov po enem tednu študije. Rezultati so podani v % glede na vsebnost vitamina ob času 0. Vzorci: 1:1 60O (enakomerno razmerje, 60 C, odprt vsebnik), 1:1 60Z (enakomerno razmerje, 60 C, zaprt vsebnik), 1:1 80Z (enakomerno razmerje, 60 C, zaprt vsebnik), RDA 60O (RDA razmerje, 60 C, odprt vsebnik), RDA 60Z (RDA razmerje, 60 C, zaprt vsebnik), RDA 80Z (RDA razmerje, 80 C, zaprt vsebnik) Slika 10: Kromatogram izokratske metode za vit. C pri 290 nm in 1 % MeOH z retencijskim časom 2,1 min Slika 11: Kromatogram izokratske metode za vit. B1 pri 245 nm in 1 % MeOH z retencijskim časom 3,1 min Slika 12: Kromatogram izokratske metode za vit. B6 pri 290 nm in 1 % MeOH z retencijskim časom 4,4 min Slika 13: Kromatogram izokratske metode za vit. B3 pri 260 nm in 10 % MeOH z retencijskim časom 3,3 min Slika 14: Kromatogram izokratske metode za vit. B5 pri 210 nm in 10 % MeOH z retencijskim časom 5,1 min Slika 15: Kromatogram izokratske metode za THFK pri 287 nm in 20 % MeOH z retencijskim časom 3,7 min Slika 16: Kromatogram izokratske metode za vit. B9 pri 287 nm in 20 % MeOH z retencijskim časom 4,4 min Slika 17: Kromatogram izokratske metode za vit. B7 pri 210 nm in 25 % MeOH z retencijskim časom 5,3 min Slika 18: Kromatogram izokratske metode za vit. B12 pri 362 nm in 25 % MeOH z retencijskim časom 3,5 min Slika 19: Kromatogram izokratske metode za vit. B2 pri 445 nm in 30 % MeOH z retencijskim časom 4,6 min Slika 20: Kromatogram izokratske metode za vit. B9 (4,4 min) in THFK (3,7 min) pri 20 % MeOH, posnet pri 287 nm. 67 VI

11 SEZNAM PREGLEDNIC Preglednica I: Zbrani kvalitativni podatki (+ skoraj neobčutljiv/stabilen, ++ delno občutljiv, +++ zelo občutljiv/nestabilen) o stabilnosti vodotopnih vitaminov v raztopinah pod vplivom različnih dejavnikov (56,62), stresna študija posameznih vit. (posam.) in vit. v zmesi vseh vodotopnih vit., kjer zapisani % predstavljajo preostal % vit. po določenem času urah (h) (63) in dodatni podatki o stabilnosti vit. v raztopinah Preglednica II: Zbrani podatki o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju Preglednica III: Deleža mobilne faze A in B v določenem časovnem intervalu Preglednica IV: Izbrane valovne dolžine detekcije in retencijski časi (tr) posameznih vitaminov Preglednica V: Pregled izokratskih metod z uporabljenimi deleži MeOH v mobilni fazi, pripadajočimi retencijskimi časi posameznih vitaminov (tr), časom analize in valovno dolžino detekcije (λ) Preglednica VI: Priprava OR standardov vitaminov za vrednotenje analizne metode Preglednica VII: Postopek redčitev 400 % standardne raztopine za pripravo kalibracijskih (vzorci umeritvene premice (UP)) in kontrolnih vzorcev (QC) Preglednica VIII: Koncentracije standardov vodotopnih vitaminov za vrednotenje metode Preglednica IX: Priprava stresnih vzorcev Preglednica X: Pripravo kalibracijskih vzorcev posameznega vitamina (B1, B3, B5, B6, B7, B9, B12 in C) z navedenimi volumni [μl] Preglednica XI: Pripravo kalibracijskih vzorcev posameznega vitamina (THFK, B2 in B2-f) z navedenimi volumni [μl] Preglednica XII: Rezultati vrednotenja linearnosti za vodotopne vitamine s podanim linearnim koncentracijskim območjem, s pripadajočimi umeritvenimi premicami in izračunanimi R Preglednica XIII: Znotraj-dnevna točnost, ponovljivost in ponovljivost injiciranja (RSD, n = 3) analizne metode za vodotopne vitamine Preglednica XIV: Stabilnost vzorcev pri vseh treh koncentracijskih nivojih po 12 in 24 urah, izražena v odstotkih glede na začetno vrednost (n = 3) Preglednica XV: Vitamini, analizirani po kratkih izokratskih metodah, s pripadajočimi umeritvenimi premicami in korelacijskimi koeficienti (R 2 ) Preglednica XVI: Rezultati točnosti, ponovljivosti in stabilnosti vzorcev na enem koncentracijskem nivoju QCM po 24 urah, izraženi v odstotkih glede na začetno vrednost (n =3) za kratke izokratske metodo Preglednica XVII: Rezultati preverjanja homogenosti znotraj vzorcev posameznih vitaminov, podani s povprečno vrednostjo točnosti in RSD (n = 3) Preglednica XVIII: Rezultati študije posameznih vitaminov v trdnem stanju pri 60 C in 75 % RV. Prikazani so podatki o stabilnosti vitaminov v odprtih in zaprtih vsebnikih v testiranih časovnih intervalih glede na začetno časovno točko Preglednica XIX: Vpliv svetlobe na stabilnost posameznih vitaminov v trdnem stanju. Podatki o stabilnosti vitaminov v testiranih časovnih intervalih glede na začetno časovno točko so izraženi v % Preglednica XX: Podatki o priporočenem dnevnem vnosu posameznih vodotopnih vitaminov, v katerih živilih so najpogosteje prisotna ter bolezni, ki lahko nastanejo zaradi dolgotrajnega pomanjkanja posameznega vitamina (Poglavje 1.1) (7,10 12,102) Preglednica XXI: Rezultati testiranih stresnih vzorcev: podatki o vsebnosti posameznega vitamina v kontrolnem in stresnem vzorcu pri določenem pogoju VII

12 POVZETEK Vitamini so zelo aktualno raziskovalno področje zaradi številnih pozitivnih učinkov pri ohranjanju zdravja. V splošnem so vodotopni vitamini nestabilni, a je podatkov malo, še posebej o njihovi stabilnosti v trdnem stanju. Naš namen je bil pridobiti podatke o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, posamezno in v zmeseh. Glavni cilj magistrske naloge je bil razvoj enostavnega analiznega pristopa za spremljanje stabilnosti najpogostejših oblik vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. V ta namen smo predhodno razvito stabilnostno indikativno metodo UHPLC-DAD za sočasno vrednotenje glavnih vodotopnih vitaminov (tiaminijev klorid (B1), riboflavin (B2), riboflavin natrijev fosfat (B2-f), nikotinamid (B3), kalcijev D-pantotenat (B5), piridoksinijev klorid (B6), D- biotin (B7), folna kislina (B9), cianokobalamin (B12), L-askorbinska kislina (C)) razširili za vrednotenje dveh dodatnih vitamerov B3 in B9 (nikotinska kislina in 5-metil tetrahidrofolna kislina). Z namenom skrajšanja časa in poenostavitve analiznega postopka smo razvili in optimizirali kratke stabilnostno indikativne metode za analizo posameznih vodotopnih vitaminov. Vse metode smo ovrednotili v skladu s smernicami ICH in jih uporabili pri vrednotenju stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, posamezno in v zmeseh. Stabilnostne študije smo izvedli v klimatskih komorah pri različnih stresnih pogojih povišani temperaturi, relativni vlažnosti, svetlobi. Optimizirali smo pripravo vzorcev in prilagajali eksperimentalne pogoje. Na osnovi rezultatov trimesečne študije stabilnosti posameznih vitaminov pri 60 C in 75 % relativne vlažnosti smo potrdili ustrezno stabilnost (> 90 % začetne vsebnosti) za večino vitaminov in manjšo stabilnost (45 89 %) za vitamine B5, B12 in obe obliki B2. V enotedenski študiji izpostavitve posameznih vodotopnih vitaminov svetlobi smo ugotovili, da vsi vitamini razen vitaminov C in B12 ohranjajo svojo stabilnost (> 90 % začetne vsebnosti). Vrednotenje stabilnosti vodotopnih vitaminov v zmesi je bilo težavno zaradi nehomogenosti vzorcev. Smo pa ugotovili, da so vitamini v zmesi manj stabilni kot posamezno, kar so potrdile tudi organoleptične spremembe vzorcev (ožganost in smoljnatost). Na stabilnost vitaminov v zmesi je pomembno vplivala zlasti višja relativna vlažnost in njen sinergistično destabilizirajoči učinek s povišano temperaturo. Zaključimo lahko, da smo uspešno razvili analizni pristop za vrednotenje stabilnosti posameznih vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. Za ustrezno ovrednotenje stabilnosti vitaminov v zmeseh pa bo potrebna še nadaljnja optimizacija pred-analiznih aktivnosti. Ključne besede: vodotopni vitamini, UHPLC, stabilnostno indikativna metoda, stabilnost v trdnem, stresno testiranje VIII

13 ABSTRACT Vitamins are a very topical field of research due to their many positive effects in maintaining health. In general, water-soluble vitamins are unstable, but little data is available, especially about the stability of water-soluble vitamins in the solid state. Our purpose was to obtain data on their stability in the solid state, individually and in mixtures. The main goal of the master's thesis was to develop a simple analytical approach to monitor the stability of the most common forms of water-soluble vitamins in the solid state. For this purpose we expanded previously developed stability indicative UHPLC-DAD method for the simultaneous evaluation of the main water-soluble vitamins (thiamine chloride (B1), riboflavin (B2), riboflavin sodium phosphate (B2-f), nicotinamide (B3), calcium D- pantothenate (B5), pyridoxine hydrochloride (B6), D-biotin (B7), folic acid (B9), cyanocobalamin (B12), L-ascorbic acid (C)) for evaluation of two additional vitamers B3 and B9 (nicotinic acid and 5-methyl tetrahydrofolic acid). In order to shorten the time and simplify the analytical procedure, we have developed and optimized fast stability-indicative methods for the analysis of individual water-soluble vitamins. All methods were evaluated according to ICH guidelines and used for stability studies of water-soluble vitamins in the solid state, individually and in mixtures. Stability studies were performed in climatic chambers under various stress conditions - elevated temperature, relative humidity, light. We optimized sample preparation and adjusted the experimental conditions. Based on the results of a three-month stability study of individual vitamins at 60 C and 75 % relative humidity, we confirmed adequate stability (> 90% of initial content) for most vitamins and lower stability (45 89 %) for vitamins B5, B12 and both forms of B2. In a one-week study of the exposure of individual water-soluble vitamins to light, we found out that all vitamins except vitamins C and B12 maintain their stability (> 90% of the initial content). Evaluation of the stability of water-soluble vitamin mixtures was difficult due to the inhomogeneity of the samples. However, we found out that the vitamins in the mixture are less stable than individually, which was also confirmed by organoleptic changes of samples (burned and resinous). The stability of the vitamins in the mixture was significantly affected by the higher relative humidity and its synergistic destabilizing effect with elevated temperature. We have successfully developed an analytical approach to evaluate the stability of individual water-soluble vitamins in the solid state. Further optimization of pre-analytical activities will be required to properly evaluate the stability of vitamins in mixtures. Keywords: water-soluble vitamins, UHPLC, stability indicative method, stability in solid state, stress testing IX

14 SEZNAM OKRAJŠAV Simboli m M tr t T λ V masa [g] molska masa [g/mol] retencijski čas [min] čas [min] temperatura [ C] valovna dolžina [nm] volumen [L] Kratice AUC AK B1 B2 B2-f B3 B3-k B5 B6 B7 B9 B12 C DAD EDTA FO površina pod kromatografskim vrhom (angl.: Area Under the Curve) askorbinska kislina tiaminijev klorid riboflavin riboflavin natrijev fosfat nikotinamid nikotinska kislina kalcijev D-pantotenat piridoksinijev klorid D-biotin folna kislina cianokobalamin L-askorbinska kislina detektor z nizom diod (angl.: Diode-Array Detector) etilendiamintetraocetna kislina farmacevtska oblika X

15 HPLC MeOH MF MQ voda OR QC R 2 razt. RDA RSD RV SIM SR ST THFK tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl.: High Performance Liquid Chromatography) metanol mobilna faza milliq voda osnovna raztopina kontrolna raztopina korelacijski koeficient raztopina priporočen dnevni odmerek (angl.: Recommended Daily Allowance) relativni standardni odklon (angl.: Relative Standard Deviation) relativna vlažnost stabilnostno indikativna metoda raztopina standarda standard 5-metil tetrahidrofolna kislina UHPLC-DAD tekočinska kromatografija ultra visoke ločljivosti sklopljena z detektorjem z nizom diod (angl.: Ultra-High Performance Liquid Chromatography coupled with Dode-Array Detection) UP UZ vit. VZ ZU umeritvena premica ultrazvok vitamin vzorec zdravilna učinkovina XI

16

17 1 UVOD 1.1 VITAMINI Izraz vitamin (vit.) izvira iz dveh latinskih izrazov;»vita«pomeni življenje,»amin«pa se navezuje na dušik vsebujočo spojino. Prve vitamine so odkrili v začetku 20. stoletja, poimenovali pa so jih s črkami abecede po vrstnem redu odkritij. Kasneje so ugotovili, da vsi vitamini ne vsebujejo dušika, vendar se je ime ohranilo vse do danes (1 3). Vitamini so kemijsko heterogena skupina biološko aktivnih organskih spojin z nizko molekulsko maso, ki so nujno potrebna za normalno delovanje organizma. V telesu imajo pomembno vlogo pri uravnavanju fizioloških procesov, kot so dihanje, rast in razvoj, presnova, delovanje možganov in živčevja. Pri telesnih reakcijah sodelujejo kot hormoni, antioksidanti in kofaktorji (4). Poznamo 13 predstavnikov vitaminov: v maščobah so topni A, D, E in K, v vodi pa osem vitaminov skupine B in vit. C. Vodotopni vitamini imajo v svoji strukturi eno ali več polarnih ali ionizirajočih skupin (npr. hidroksilna, karboksilna, ketonska, amino ali fosfatna), medtem ko imajo maščobotopni vitamini hidrofobne strukture (dolge lipofilne verige, aromatski in nearomatski obroči). Razlika med obema skupinama je pomembna, saj lahko telo vitamine, topne v maščobah, skladišči dlje, medtem ko se lahko vodotopni vitamini (z izjemo B12) v telesu zadržijo le krajši čas in jih je zato treba pogosteje uživati. Vodotopni vitamini, ki so v presežku, se namreč ne skladiščijo v organizmu, ampak se skoraj v celoti izločijo iz telesa z urinom preko ledvic. Iz prebavil pa se absorbirajo hitro in neposredno, bodisi s pasivno difuzijo bodisi s specifičnimi transportnimi proteini (4 6). Telo vitaminov ni zmožno samo sintetizirati iz osnovnih gradnikov, razen izjem (D, K, B3), v manjših količinah (7). Zato jih moramo za varovanje zdravja vsakodnevno vnašati v telo s hrano, v ustreznih količinah, določenih s priporočenim dnevnim vnosom RDA (angl. Recommended Daily Allowance). Ta je prilagojen za nosečnice, doječe matere, otroke in mladostnike, starejše, vegetarijance in vegane ter telesno aktivnejše ljudi, ki imajo večinoma povečane potrebe po vitaminih (5,8 10). V sodobnem svetu masovne proizvodnje živil, industrijske obdelave in hitrega pridobivanja hrane je naša prehrana vedno bolj osiromašena in enolična (11). Na ta način je prejemanje dnevnega priporočenega vnosa hranil vprašljivo, kar lahko privede do (dolgotrajnega) pomanjkanja vitaminov, to pa lahko vodi v hipovitaminoze ali celo avitaminoze oz. z njimi 1

18 povezane bolezni, ki so zbrane v Preglednici XX v Prilogi 1 (8). V primeru nezadostnega vnosa je vitamine smiselno dodajati v vsakodnevno uravnoteženo prehrano v obliki prehranskimi dopolnil (7,12). Prekomeren vnos vitaminov, še posebej maščobotopnih, lahko vodi v drugo skrajnost, tako imenovane hipervitaminoze, pri katerih se posameznega vitamina v telesu nakopiči preveč. Maščobotopni vitamini se namreč ob prekomernem zaužitju ne izločijo z urinom kot vodotopni vitamini, ampak se kopičijo in ostajajo v telesu dlje časa (recimo A in D) (8) VODOTOPNI VITAMINI B KOMPLEKS IN C VITAMIN Med vodotopne vitamine prištevamo vitamine B kompleksa tiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), pantotenska kislina (B5), piridoksin (B6), biotin (B7), folna kislina (B9) in cianokobalamin (B12) ter vit. C (askorbinska kislina). Skupina zajema strukturno in funkcionalno zelo različne spojine. Vsem predstavnikom pa je skupno, da so bistveni za normalno celično delovanje, rast in razvoj, presnovo makrohranil (ogljikovih hidratov, maščob in beljakovin), obnovo dednega materiala, zdravo kožo, lase in nohte, normalno delovanje mišic, živčnega sistema ter možganov, tvorbo rdečih krvničk, celjenje ran in drugo (5). Pri odkritju so bili znanstveniki najprej prepričani, da gre za eno snov; poimenovali so jo vit. B, vendar izkazalo se je, da gre za skupino različnih vitaminov, ki so jih nato označili s številčnim indeksom: B1, B2 in tako dalje. Vsem je bilo skupno, da so jih izolirali iz kvasa in jeter (8). Za nekatere spojine so kasneje ugotovili, da ne izkazujejo vseh lastnosti vitaminov, zato nekateri vitamini B manjkajo (npr. B4) (13). Vitamine B kompleksa najdemo zlasti v mesu, ribah, mleku in mlečnih izdelkih, sveži zelenjavi, sadju, žitih, sladkorni melasi, tako da jih v večini lahko zaužijemo dovolj že z običajno uravnoteženo prehrano. V živilih vitamini niso prisotni posamezno, temveč se vedno pojavljajo v celotni skupini (7,11). V Prilogi 1 (Preglednici XX) so povzete informacije o priporočenem dnevnem vnosu posameznih vodotopnih vitaminov ter v katerih živilih so najpogosteje prisotni. Kljub uravnoteženi in splošno zdravi prehrani se lahko pojavi pomanjkanje kakšnega vitamina, ki ga spremljajo znaki, kot so npr. utrujenost, splošna slabost, zmanjšana zbranost, potrtost, slabša kakovost spanja, zgodnejše sivenje in izpadanje las, zaprtost, povečana vsebnost holesterola v krvi (11). Vpliv na zdravje posameznika je odvisen od trajanja in resnosti primajkljaja vitamina. Ima pa vsak posameznik različne potrebe po vitaminih, na katere vpliva zdravje (kronične in akutne bolezni), življenjski stil (npr. kajenje), določena (fiziološka) stanja in drugi dejavniki (14). Običajno se pojavi istočasno pomanjkanje večjega 2

19 števila B vitaminov, zato je ob znakih pomanjkanja kateregakoli B vitamina priporočljivo jemati celoten B-kompleks, saj se med seboj dopolnjujejo (13) Tiamin (B1) Tiamin označujemo z B1, saj so ga odkrili prvega (7). Poznamo ga v več oblikah, najpogostejši sta tiaminijev klorid in tiaminijev mononitrat (15). Sodeluje pri presnovi ogljikovih hidratov, zato so v primeru večje količine zaužitih enostavnih ogljikovih hidratov tudi potrebe telesa po tiaminu večje. Sicer je tiamin potreben za normalno delovanje živčevja, spominske sposobnosti, delovanje mišic in srca, izboljša razpoloženje in zmanjša celični oksidativni stres (7). Če ga primanjkuje, smo utrujeni in razdražljivi, pogosto nas spremlja tudi nespečnost. Največkrat pride do pomanjkanja pri starejših in alkoholikih zaradi zmanjšane absorpcije tiamina. Hudo pomanjkanje vit. B1 pa povzroča bolezen beriberi, ki se kaže z mišično šibkostjo, čustveno nestabilnostjo, glavoboli, utrujenostjo, motnjami zaznavanja, kar lahko vodi do težav z živčnim in krvno-žilnim sistemom (16) Riboflavin (B2) Ima značilno živo rumeno do oranžno barvo, najdemo pa ga v prosti ali fosfatni obliki, katera je v vodi tudi bistveno bolj topna (17 19). Sodeluje v elektronski transportni verigi pri celičnem dihanju, kot kofaktor v encimskih reakcijah presnove ogljikovih hidratov, lipidov in aminokislin, pri pretvorbi vit. B6 in B3, proizvodnji ščitničnega hormona, sintezi DNK, obnavljanju in popravljanju tkiv. Koristen je za zdravo kožo, nohte in lase, zmanjša pogostost napadov migrene in njihovo moč ter skupaj z vit. A vpliva na vid (7,11,20). Pomanjkanje vpliva na sposobnost absorpcije železa iz hrane, najpogosteje se pojavi pri bolnikih z vnetim črevesjem ali pri kroničnih alkoholikih. Priporočljivo je dodajati večje odmerke riboflavina nosečnicam, športnikom in ljudem, ki so pod hujšim stresom. Pri pomanjkanju prihaja do razpok na vogalih ust, vnetega rdečega jezika, vnetega grla, na svetlobo občutljivih oči, sprememb na koži, izpadanja las, glavobola, raztresenosti, nespečnosti in anemije (7,11) Niacin (B3) Poznamo dve obliki niacina nikotinamid in nikotinsko kislino (21). Njegova posebnost v skupini vodotopnih vitaminov je, da nastaja tudi endogeno, saj ga organizem lahko sintetizira iz esencialne aminokisline triptofan, ki se v telesu ne porabi za izgradnjo beljakovin (11). V telesu se niacin pretvarja iz ene oblike v drugo, ki sodelujeta pri celičnih 3

20 redoks reakcijah kot prekurzorja koencimov NAD + in NADP in tako opravljata pomembno vlogo pri celični presnovi in dihanju. Sodelujeta pri signalizaciji celic, popravljanju DNK, katabolizmu maščob, ogljikovih hidratov, beljakovin in alkohola, sintezi maščobnih kislin in holesterola. Niacin je potreben tudi za nastanek spolnih hormonov, za normalno delovanje živčnega sistema in možganov (11). V raziskavah so pokazali, da večji odmerki niacina znižujejo vsebnost holesterola in trigliceridov v krvi in lahko s tem pripomore k preprečevanju ateroskleroze in pri zdravljenju hiperholesterolemije (22,23). Naj bi tudi izboljšal cirkulacijo, lajšal simptome artritisa, lajšal depresijo, nespečnost in preprečeval razvoj sladkorne bolezni tipa I (11). Pomanjkanje niacina vodi do pelagre, bolezni, za katero je značilen sočasni pojav dermatitisa, diareje in demence. Prihaja do vnetja sluznice, luščenja kože, razpokane in pigmentirane kože, zmedenosti in nevroloških motenj (24) Pantotenska kislina (B5) Pantotenska kislina je kemijsko amid med pantojsko kislino in aminokislino beta-alanin. V naravi je večinoma vezana v koencimu A, v prosti obliki jo najdemo zelo redko, v farmacevtskih izdelkih pa je večinoma v obliki soli (npr. kalcijev pantotenat), ki imajo boljšo stabilnost (24). Ključna je pri sintezi živčnih prenašalcev, steroidnih hormonov, aminokislin, maščobnih kislin, fosfolipidov in hemoglobina. Pomembna je za rast, ohranja zdravje živčnega sistema, pravilno delovanje nadledvične žleze, regeneraciji tkiv, kože in las ter preprečuje vnetja. Sodeluje pri pretvorbi maščob in sladkorjev v energijo ter pri presnovi aminokislin in etanola. Lahko izboljša počutje pri sindromu kronične utrujenosti, pomaga pri migreni, artritisu, slabi prebavi in simptomih alergij (7). Izraz»pantotenska«izvira iz grške besedice»pantos«, kar pomeni od vsepovsod. Najdemo ga namreč v številnih živilih, zato do pomanjkanja vit. B5 običajno ne prihaja. V primeru pomanjkanja pa se pojavijo raztresenost, pomanjkanje zbranosti, težave pri pomnjenju, nespečnost, slabši imunski sistem, slabost (11). Ljudje, ki so pogosto pod stresom ali fizično zelo aktivni ter nosečnice morajo dnevno dobiti večje količine pantotenske kisline (24) Piridoksin (B6) Nahaja se v več oblikah kot piridoksin, piridoksal in piridoksamin, ki se ob vstopu v jetra ali telesno celico fosforilirajo (24). Piridoksin sodeluje pri presnovi makrohranil, maščobnih kislin in aminokislin (triptofan in cistein), sintezi hemoglobina, histamina in živčnih prenašalcev (prenašajo živčne dražljaje in s tem določajo razpoloženje, ravnanje in spanje), 4

21 tvorbi protiteles in rdečih krvničk, izražanju genov, uravnava delovanje hormonov, skrbi za izravnavo natrija in kalija v telesnih tekočinah ter pomaga pri absorpciji vit. B12. Skupaj s folno kislino in vit. B12 pomaga telesu razgrajevati homocistein, ki sicer poveča tveganje za srčno-žilna obolenja. Sodeluje kot kofaktor v več kot 140 biokemijskih reakcijah v celicah (7,11,25,26). Povečane potrebe po vnosu vit. B6 opazimo večkrat pri ženskah (pred menstruacijo, med jemanjem kontracepcijskih tablet, med nosečnostjo) in starostnikih, pri povišanem krvnem sladkorju in pri ljudeh, ki so veliko pod stresom. Pomanjkanje piridoksina se kaže v obliki dermatitisa, vnetja jezika in oči, izgube teka, anemije, živčnih motenj (nespečnost, nervoznost, depresija) (25,27,28) Biotin (B7) Ime biotin izvira iz besede»bios«, ki v grščini pomeni življenje. Izdelujejo ga črevesne bakterije, čeprav ga telo v takšni obliki težje uporabi. V naravi se nahaja samo v eni aktivni obliki, kot D-biotin (7). Nekateri ga imenujejo tudi vit. H (29). Sodeluje pri številnih metabolnih reakcijah, pri biosintezi maščobnih kislin, presnovi ogljikovih hidratov, glukoneogenezi in pri razgradnji nekaterih aminokislin. Ključen je za lepo, gladko kožo, bujne, zdrave in sijoče lase ter nohte. Pomanjkanje vodi do utrujenosti, slabosti, bolečine v mišicah, kognitivnih in nevroloških motenj, dermatitisa, izpadanja las in krhkih nohtov, pomanjkanje v nosečnosti je lahko zelo škodljivo za plod. Tudi pri sladkorni bolezni, epilepsiji in multipli sklerozi ga primanjkuje (24). Sicer pa do pomanjkanja vit. B7 običajno ne prihaja, saj ga najdemo v številnih živilih (7). Lahko pa se pojavi pri uživanju snovi (npr. avidin v surovem jajčnem beljaku), ki vežejo biotin in ga deaktivirajo, da se potem ne more absorbirati v krvni obtok (30) Folati Folno kislino skupaj z vsemi njenimi derivati s podobno aktivnostjo imenujemo folati, ki so kemijsko heterociklične strukture 4-[(pteridin-6-ilmetil)amino] benzojske kisline konjugirane z eno ali več L-glutaminskimi enotami. Gre za rumeno-oranžni kristalinični prašek brez vonja in okusa (31). Folna kislina je oksidirana sintezna oblika vit. B9, ki jo najdemo zgolj v obogatenih živilih, prehranskih dopolnilih in zdravilih (32). Nima koencimske aktivnosti in postane aktivna šele po pretvorbi v tetrahidrofolat. 5-metil tetrahidrofolna kislina (THFK) je torej reduciran presnovek folne kisline, ki nastane iz dihidrofolne kisline s pomočjo encima dihidrofolat reduktaze v jetrih in je biološko aktivna 5

22 oblika folatov v telesu, ki kot kofaktorji sodelujejo pri reakcijah sinteze nukleinskih kislin in aminokislin (33 35). Folati imajo pomembno vlogo pri sintezi, metilaciji in popravljanju DNK, delitvi celic, pri delovanju imunskega sistema, pri rasti in zorenju rdečih krvničk (vzdržuje normalno eritropoezo), spodbuja nastanek serotonina in noradrenalina (7,11,36). Pomanjkanje folatov je pogosto, saj jih z dnevno prehrano po navadi ne zaužijemo dovolj. Pomanjkanje se kaže kot megaloblastna anemija (napake v sintezi DNK v eritrocitih), splošna slabost in celo kot depresija. Nujno potreben je tudi hkraten vnos vit. B12 zaradi medsebojno povezanega delovanja. Dodajanje folatov je zlasti pomembno v nosečnosti, kjer lahko pomanjkanje vit. B9 vodi v okvare nevralne cevi zarodka in posledično do okvar v možganih in hrbtenici (7,35,37). Dodatek aktivne oblike folata (THFK) je zelo priporočljiv pri ljudeh z genetskim polimorfizmom v genu metilentetrahidrofolat reduktaze, kjer ima encim zaradi manjše aktivnosti oslabljeno sposobnost pretvorbe folatov v aktivno obliko. Ta polimorfizem povzroči manj biološko razpoložljivega THFK in s tem zmanjšan potencial metilacije, kar vodi do povišane ravni homocisteina in povečanega tveganja za nastanek okvar nevralnih cevi zarodka (38). Vnos THFK ima še dodatne prednosti pred vnosom folne kisline, saj omili hematološke simptome ob pomanjkanju vit. B12 ter izkazuje manjšo interakcijo z zdravili, ki zavirajo dihidrofolat reduktazo (32) Cianokobalamin (B12) Cianokobalamin, s kobaltovim atomom v središču razvejane molekule, je bil odkrit najkasneje in ima najkompleksnejšo sestavo med vsemi vitamini B kompleksa. Poznamo še metilkobalamin, hidroksikobalamin in adenozilkobalamin, vendar je vit. B12 v izdelkih najpogosteje prisoten v obliki cianokobalamina. Telo ga kopiči v večjih količinah, pretežno v jetrih (7,11,39,40). Kot kofaktor sodeluje pri presnovi makrohranil, pri eritropoezi ter pri sintezi proteinov, DNK in živčnih prenašalcev (41). Pomanjkanja so pogostejša pri vegetarijancih in veganih, saj ga najdemo večinoma zgolj v živilih živalskega izvora. Za pomanjkanjem trpijo tudi ljudje s kroničnim vnetjem želodčne sluznice, kjer pride do motene absorpcije vit. B12 (41 43). Posledice pomanjkanja se običajno kažejo v obliki perniciozne anemije, utrujenosti, potrtosti, izgube apetita, bledo rumeno obarvane kože, oteklega jezika, odrevenelih okončin, nevroloških težav (izguba spomina), dolgotrajno pomanjkanje vit. B12 (skupaj s pomanjkanjem vit. B9) pa vodi do megaloblastne anemije in okvare živčnega sistema (44). 6

23 Askorbinska kislina (vitamin C) Vit. C ali L-askorbinska kislina je dobila ime izpeljano iz lastnosti, da je»antiskorbut«(7). Deluje kot antioksidant in ščiti naše telo pred reaktivnimi kisikovimi spojinami (radikali, peroksidi), samostojno in v kombinaciji z vit. E. Zavira nekontrolirane oksidativne procese, ki oslabijo imunski sistem in povzročajo poškodbe celic, staranje organizma, rakasta obolenja, aterosklerozo, nevrodegenerativne bolezni ter bolezni srca in ožilja. Izboljša absorpcijo železa v prebavnem traktu, kot kofaktor sodeluje pri mnogih encimskih reakcijah in pomaga pri odstranjevanju strupov iz telesa. Pomemben je za sintezo kolagena, hemoglobina, hormonov, za vsa mehka tkiva (dlesni, ožilje, kožo in kosti) in pri dozorevanju eritrocitov. Potreben je tudi za normalno delovanje možganov in živčevja ter imunskega sistema (11,45,46). Najboljši vir vit. C je sveža, ustrezno skladiščena ter lokalno pridelana zelenjava in sadje (13). Zaradi neuravnotežene prehrane, zlasti pri otrocih, kadilcih, starejših in alkoholikih, prihaja do njegovega pomanjkanja, kar lahko privede do bolezni imenovane skorbut. Zanjo so značilne boleče, otečene in krvaveče dlesni, izguba apetita, bolečine v sklepih in mišicah, slabo celjenje ran in izčrpanost. Dolgotrajno pomanjkanje lahko vodi v slabše delovanja imunskega sistema, povečajo se tudi možnosti za razvoj srčnih bolezni in raka (47,48). Dnevne potrebe po vitaminu lahko povečajo intenzivna fizična aktivnost, okužbe in poškodbe ter višja temperatura (T) okolja. Presežke vit. C telo izloči z urinom. Pri prevelikem odmerjanju vit. C (npr. več kot 2000 mg) lahko pride do draženja želodca in črevesja, diareje, nastajanja ledvičnih kamnov in motnje stanja bakra v telesu (11). V študijah so ugotovili tudi, da lahko dajanje vit. C v visokih odmerkih izkazuje prooksidativno delovanje vitamina, ki bi se lahko izkoriščalo za zaviranje rasti rakavih celic (49,50). 1.2 STABILNOST STABILNOST NA SPLOŠNO Stabilnost je pomemben vidik različnih izdelkov zdravil, hrane, prehranskih dopolnil in drugih. Z zagotavljanjem stabilnosti farmacevtskega izdelka dosežemo, da izdelek ohranja svoje karakteristike znotraj predpisanih mej skozi čas roka uporabnosti, če ga shranjujemo v ustreznem vsebniku pri ustreznih pogojih (51). Ohranjanje stabilnosti zdravilne učinkovine (ZU) oz. farmacevtskega izdelka je ključno za zagotavljanje vseh treh osnovnih lastnosti farmacevtskega izdelka kakovosti, varnosti in učinkovitosti (52). 7

24 Zdravilo smatramo kot stabilno, če ohranja vsebnost ZU običajno nad 90 % začetne koncentracije, fizikalne lastnosti zdravila in mikrobiološka kakovost izdelka pa se pri tem bistveno ne spremenijo. Zaradi različnih vzrokov lahko pride do nestabilnosti farmacevtskega izdelka, ki se kaže kot znižanje koncentracije ZU, zvišanje koncentracije ZU, povečan nastanek razgradnih produktov, sprememba biološke uporabnosti ali profila raztapljanja, izguba homogenosti, zmanjšanje mikrobiološke kakovosti, nastanek toksičnih razgradnih produktov, sprememba barve in teksture (51,53). V okviru stabilnosti obravnavamo štiri vidike: kemijski, fizikalni, mikrobiološki in biofarmacevtski vidik. Kemijska stabilnost pomeni ohranjanje kemijske istovetnosti in jakosti ZU znotraj določenih mej. Pri kemijski nestabilnosti prihaja do razpada ZU (upad vsebnosti ZU v izdelku) in nastanka novih razgradnih spojin zaradi različnih reakcij oksidacij, dehidracij, fotoliz, solvoliz in drugih. Fizikalna nestabilnost se kaže v vidnih (sprememba izgleda, vonja, enakomernosti vsebine, raztapljanja) in nevidnih (prehajanje med kristalno in amorfno obliko) fizikalnih spremembah ZU ali zdravila. Mikrobiološka stabilnost pomeni odsotnost patogenih organizmov in odpornost na rast mikroorganizmov v okviru določenih zahtev in jo zagotavljamo z dobro proizvodno prakso GMP (angl. Good manufacturing practice), izbiro primernih vsebnikov in ovojnine, ustreznimi vhodnimi surovinami in dodatkom protimikrobnih sredstev. Stabilnost z biofarmacevtskega vidika je vezana na ohranjanje mehanizma in kinetike procesa prehoda ZU v organizmu (52,54). Zdravila se uporabljajo glede na njihovo učinkovitost in varnost, zato morajo biti stabilna in ohranjati kakovost do izteka navedenega roka uporabe. Kakovost zdravila je potrebno ohranjati pri vseh pogojih, ki jim je zdravilo izpostavljeno med proizvodnjo, prevozom in shranjevanjem v bolnišnicah, lekarnah ter med uporabo. Zato je ključno razumevanje dejavnikov, ki vplivajo na stabilnost ZU in končnih farmacevtskih izdelkov (52) STABILNOST VITAMINOV Vitamini so v splošnem (pogosto) nestabilni, na njihovo stabilnost vplivajo številni dejavniki kemijska struktura vitaminov in izpostavljenost zunanjim dejavnikom. Na njihovo stabilnost v izdelkih pa dodatno vplivajo še stabilnost pomožnih snovi, interakcije med ZU in pomožnimi sestavinami, farmacevtska oblika (FO), proizvodni postopek, vrsta vsebnika, okolje rokovanja, transportiranja in shranjevanja (51). 8

25 Vpliv farmacevtske oblike, agregatnega stanja in ovojnine Multivitaminske izdelke najdemo na tržišču v različnih oblikah: šumeče tablete, tablete, kapsule, praški, žvečljive tablete, pastile, podjezične tablete, sirupi, liposomski izdelki in drugi (7). Oblika multivitaminskega izdelka precej vpliva na stabilnost njegovih komponent. V tekoči obliki lahko molekule prosto reagirajo druga z drugo, medtem ko je v trdnem izdelku verjetnost kemijske interakcije manjša. Pomemben je tudi tip obloge (npr. trda kapsula, mehka želatinasta kapsula, obložena tableta), saj predstavlja zaščitno bariero za dejavnike (vlaga, svetloba, kisik), ki lahko vplivajo na stabilnost izdelka. Tudi velikost delcev sestavin je pomemben dejavnik, saj imajo manjši delci večjo specifično površino, večji delci pa manjšo specifično površino in so torej slednji bolj stabilni zaradi manjše izpostavljenosti dejavnikom okolja (55). Vitamini morajo biti ustrezno proizvedeni, transportirani in shranjeni pod predpisanimi pogoji. Največ vitaminov se shranjuje pri sobni T, lahko pa tudi pri nižji T v hladilniku. Za ohranjanje njihove stabilnosti je izrednega pomena izbira ustrezne ovojnine debelina, netransparentnost, stopnja prepustnosti plinov, uporaba sušilnih sredstev znotraj ovojnine, inertna atmosfera, prepihovanje z dušikom. Multivitaminski izdelki so najpogosteje shranjeni v plastenkah iz polietilena visoke gostote (HDPE) ali v pretisnih omotih, ki nudijo potrebno zaščito pred zunanjimi dejavniki (3,55) Vpliv zunanjih dejavnikov Vitamini so skupina kemijsko raznolikih spojin, ki se zelo razlikujejo po svoji stabilnosti oz. dovzetnosti za razgradnjo. Stopnja razgradnje posameznih vitaminov je odvisna od same strukture in stabilnosti vitaminov in od specifičnih zunanjih dejavnikov. Zelo pomembno je zagotavljanje in ohranjanje stabilnosti, ter s tem ohranjanje učinkovitosti vitaminov, ne le kot samostojnih komponent, temveč tudi kot del končnega farmacevtskega izdelka (55,56). Do reakcij nestabilnosti vitaminov pride že v vsakodnevni prehrani, kjer lahko z obdelavo živila povzročimo velik upad njihove vsebnosti. Na primer rezanje, lupljenje, mletje, fermentacija, termična in druga mehanska obdelava povzročajo izgube posameznih vitaminov. Na tovrstne metode obdelave so še posebej občutljivi vit. C, B1 in B9. Čas in T predelave ter shranjevanje pomembno vplivajo na vitaminski status živil (57). Zato je smiselno uživati več surove kot predelane zelenjave in sadja, ki sta lokalno pridelana in do uporabe ustrezno skladiščena (58). Stabilnost vitaminov se lahko zmanjša pod vplivom različnih dejavnikov, kot so: T, prisotnost vode, kislo ali bazično okolje, kisik, svetloba, kovinski ioni (Fe 2+, Cu + ), interakcije 9

26 z drugimi vitamini in pomožnimi snovmi, odsotnost stabilizatorjev (antioksidantov), proces izdelave končnega vitaminskega izdelka (npr. vročina in tlak pri peletiranju in iztiskanju) (56). Izpostavljenost večjemu številu stresnih dejavnikov hkrati še potencira negativni učinek na stabilnost vitamina (57). Temperatura vpliva na vse vrste nestabilnosti ZU. Pri povišanju T se v splošnem poveča hitrost reakcije razgradnje, npr. hitrost reakcije pri sobni T se podvoji v primeru porasta T že za zgolj 10 C (59). Vpliv atmosferske vlage je odvisen od T zraka in higroskopnosti vzorca. Prisotnost proste oz. nevezane vode je pomembna pri stabilnosti snovi v trdnem agregatnem stanju. Vlaga vpliva na kemijsko (zlasti hidrolize, oksidacije) in fizikalno (sprememba kristalne strukture, hitrost raztapljanja, razpadnost, organoleptične lastnosti) ter mikrobiološko stabilnost (razraščanje mikroorganizmov) (56). Odziv ZU na absorpcijo in ekscitacijo sončne, UV ali vidne svetlobe lahko vodi do fizikalnih ali kemijskih sprememb. Občutljivost ZU na določen spekter svetlobe je odvisna od kemijske strukture, fotoreaktivnosti in vrste FO. Razgradni fotoprodukti ZU so lahko nevarni in lahko pri uporabi zdravila povzročijo fototoksične, fotoalergične ali fotosenzitizirane reakcije (60). Kisik kot oksidant hitro reagira z ZU, ki vsebuje hidroksilno, karbonilno, aldehidno funkcionalno skupino v reakcijah oksidacije. Nastajajo potencialno toksični oksidacijski produkti in prihaja lahko do sprememb organoleptičnih lastnosti (61) Stabilnost vitaminov v raztopinah V strokovni literaturi najdemo podatke o stabilnosti vodotopnih vitaminov, vendar so le-ti pomanjkljivi, protislovni in pogosto samo kvalitativni ter v večini zajemajo vitamine v obliki raztopin (razt.). Ključne kvalitativne in določene kvantitativne podatke o občutljivosti vodotopnih vitaminov v raztopinah na različne dejavnike smo zbrali v Preglednici I. Preglednica I: Zbrani kvalitativni podatki (+ skoraj neobčutljiv/stabilen, ++ delno občutljiv, +++ zelo občutljiv/nestabilen) o stabilnosti vodotopnih vitaminov v raztopinah pod vplivom različnih dejavnikov (56,62), stresna študija posameznih vit. (posam.) in vit. v zmesi vseh vodotopnih vit., kjer zapisani % predstavljajo preostal % vit. po določenem času urah (h) (63) in dodatni podatki o stabilnosti vit. v raztopinah. Vitamin Povišana temperatura Oksidanti (kisik, H2O2) Kovinski ioni Vlaga Svetloba ph kisel / bazičen B / +++ Posam. 48 h 99 % 48 h 73 % / / 48 h 100 % 48 h 99 % / 59 % V zmesi 48 h 88 % 48 h 90 % / / 48 h 36 % 48 h 36 % / 48 % Dodatno Najbolj stabilen je pri ph 2, z višanjem ph, zlasti nad 6 pa stabilnost vit. B1 upada (3,15,64 66). B / +++ Posam. 48 h 16 % 48 h 79 % / / 24 h 0 % 48 h 94 % / 17 % 10

27 V zmesi 48 h 45 % 48 h 100 % / / 24 h 1 % 48 h 94 % / 44 % Dodatno V bazičnem okolju je rahlo nestabilen (66). V obliki razt. (posam. in v zmesi vseh vit.) ob prisotnosti svetlobe skoraj popolnoma razpade že v 24 h. V zmesi razt. vit. izrazito zmanjša fotostabilnost drugih vit. (67). B / ++ Posam. 48 h 100 % 48 h 96 % / / 48 h 100 % 48 h 98 % / 42 % V zmesi 48 h 97 % 48 h 100 % / / 48 h 93 % 48 h 95 % / 51 % Dodatno Je nestabilen pri visokih T in v bazičnem okolju pri prisotnosti kovinskih ionov. V kislem in bazičnem okolju je stabilen, prav tako na povišani T, v prisotnosti kisika in svetlobe (65). B / +++ Posam. 48 h 92 % 48 h 64 % / / 48 h 100 % 48 h 94 % / 24 h 3 % V zmesi 48 h 53 % 48 h 92 % / / 48 h 72 % 48 h 84 % / 24 h 9 % Dodatno Pantotenska kislina je nestabilna v kislem in bazičnem okolju. Kalcijev pantotenat je stabilen na svetlobi in zraku, nestabilen pri povišani T, kislem ter bazičnem okolju (66). B / ++ Posam. 48 h 99 % 48 h 98 % / / 48 h 100 % 48 h 100 % / 100 % V zmesi 48 h 92 % 48 h 95 % / / 48 h 7 % 48 h 82 % / 1 % Dodatno Stabilen je v prisotnosti kisika, nestabilen na UV svetlobi, povišani T in v prisotnosti baz. Stabilen je pri ph 1 in v kislih raztopinah, pri ph nad 6,8 je nestabilen (65,66). B / ++ Posam. 48 h 89 % 24 h 0 % / / 48 h 99 % 48 h 87 % / 100 % V zmesi 48 h 18 % 24 h 0 % / / 48 h 0 % 48 h 0 % / 89 % Dodatno Nestabilen pri oksidacijskih pogojih in v močno kislem ali bazičnem okolju (68). B / ++ Posam. 48 h 97 % 48 h 75 % / / 24 h 0 % 48 h 98 % / 95 % V zmesi 48 h 23 % 48 h 52 % / / 24 h 1 % 48 h 72 % / 84 % Dodatno Vit. B9 je zelo nestabilen na povišani T. Na zraku je stabilen, na svetlobi nestabilen. Zelo fotonestabilen je v obliki razt. (posam. ali v zmesi), kjer popolnoma razpade že v 24 h. Stabilen je pri ph pod 5. Do izrazitejšega razpada vit. B9 pod vplivom svetlobe prihaja pri ph 4,0-6,5. Pod 180 C in pri bazičnem ph je vit. B9 stabilen, pri izpostavitvi UVA in UVB razpade (3,65 69). Vodna razt. THFK je v bazičnem ph zelo občutljiva, pod vplivom kisika pa oksidira (70). B / +++ Posam. 48 h 92 % 48 h 97 % / / 48 h 97 % 48 h 89 % / 1 % V zmesi 48 h 7 % 48 h 50 % / / 24 h 0 % 48 h 70 % / 2 % Dodatno Nestabilen v bazičnih in močno kislih razt. Pod vplivom svetlobe in ph 3,5-6,5 se cianokobalamin pretvarja v hidroksikobalamin (3,65,66). C / +++ Posam. 48 h 1 % 24 h 0 % / / 48 h 3 % 48 h 41 % / 24 h 2% V zmesi 48 h 0 % 24 h 0 % / / 48 h 0 % 48 h 11 % / 24 h 9 % Dodatno Najbolj nestabilen izmed vseh vodotopnih vit. Hkrati prisotna kisik in povišana T, svetloba, bazično okolje ali kovinski ioni (železovi in bakrovi ioni) inducirajo pospešen razpad vit. (3,65,68). Svetloba nima velikega vpliva na vit. C. V zmeseh poveča fotostabilnost ostalih vit. in se uporablja kot stabilizator (65,67,72). / ni podatka 11

28 Stabilnost vitaminov v trdnem stanju V okviru magistrske naloge smo se osredotočili na stabilnost vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. V literaturi najdemo manj podatkov o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, le-te pa smo zbrali v Preglednici II. Preglednica II: Zbrani podatki o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. Vitamin Podatki o stabilnosti vitamina v trdnem B1 Zelo občutljiv na povišano T, pri procesu ekstruzije (80 C, vlaga, tlak) razpade 50 % vitamina (68). V amorfni obliki manj stabilen kot v kristalni obliki. Pri dodanih polimerih, ki tvorijo več intermolekularnih vezi (pektin bolj stabilizira vitamin kot polivinil pirolidon) je bolj stabilen. Tiamin klorid je bolj stabilen kot tiamin mononitrat, saj slednji povzroči dvig ph v primeru nastanka raztopine, pri katerem je tiamin manj stabilen (15). B2 Najmanj občutljiv na povišano T izmed vseh vodotopnih vitaminov, skoraj neobčutljiv na proces ekstruzije (80 C, vlaga, tlak), kjer razpade do 20 % vitamina (68). B3 Na proces ekstruzije je delno občutljiv, kjer razpade % vitamina (68). B5 Na proces ekstruzije je skoraj neobčutljiva, saj razpade % vitamina (68). B6 Delno občutljiv na proces ekstruzije, kjer razpade 5-25 % vitamina (68). B7 Na proces ekstruzije je skoraj neobčutljiv, razpade % vitamina (68). B9 Zelo občutljiva na proces ekstruzije, razpade okrog 50 % vitamina (68). Ekstrapolirani rezultati 18-mesečne študije pri 55, 70 in 85 C in 30, 50 in 70 % relativne vlažnosti (RV) v trdnem so nakazali 1 % razpad vitamina na leto (31). B12 Ni podatkov. C Zelo občutljiv na proces ekstruzije, med procesom razpade do 90 % vitamina (68). Rezultati 8-tedenske stresne študije: Pri 25 C in 98 % RV ostane 90 % askorbinske kisline (AK) (rahlo rumeni kristali z vidno vlago), pri 40 C in 98 % RV pa le 10 % (sprememba belih kristalov v temno rjavo tekočino) (73). V študiji o vplivu polimera na stabilnost AK so ugotovili, da pri 44 % RV, 25 C in 0,025 % AK v 1 mesecu ostane 60 % AK pri laktoznem polimeru in > 95 % pri trehaloznem polimeru (74). V študiji vpliva T in RV na stabilnost vit. C so ugotovili, da nizka prisotnost vlage (0,5 mol vode/mol vit. C) povzroči spremembo v barvi iz bele v rumeno (po enem tednu) in v rjavo (po več tednih). Rjavo obarvanje se pojavi hitreje kot kemijski razpad. Po 8 tednih pri 22 C in 0 % RV preostane 83 % vit. C., pri 22 C in 50 % RV pa 58 %. Po 8 tednih preostane 78 % vit. C pri 40 C in 0 % RV, pri 40 C in 25 % RV 39 % vit. C., pri 40 C in 50 % RV pa vit. C popolnoma razpade (75). Za ohranjanje stabilnosti je pomembna ustrezna zaščita izdelka pred kritičnimi zunanjimi dejavniki skrbno izbran proizvodni proces, izbira ustreznih kompatibilnih pomožnih snovi, ustrezna ovojnina in shranjevanje ter uporaba izdelka pod ustreznimi pogoji. Da pa le-te lahko določimo, je nujna izvedba testov stabilnosti (55). 12

29 1.2.3 TESTIRANJE STABILNOSTI Testiranje stabilnosti farmacevtskih izdelkov je kompleksen sklop postopkov, ki so strokovno zahtevni in stroškovno ter časovno potratni. So predpogoj za sprejem in odobritev farmacevtskih izdelkov. Stroge regulativne zahteve za načrtovanje in izvedbo študij stabilnosti ZU in končnih zdravil temeljijo na vrsti regulativnih zahtev in svetovalnih smernic ZDA, Evrope in Japonske, ki so usklajene s smernicami ICH (angl. International Council for Harmonisation). Za vrednotenje stabilnosti ZU in končnih farmacevtskih izdelkov sta potrebni zasnova in izvajanje študij stabilnosti z opredelitvijo predpisanih mej za testiranje nečistot s pristopom upravljanja tveganj, ki temelji na GMP (54,76). Testiranje stabilnosti je pomembno orodje določanja kakovosti ZU (identiteta, koncentracija in čistost) in kakovosti končnih farmacevtskih izdelkov (77). Osnovni namen stabilnostnih testov je ugotoviti, kako se spreminja ZU ali končni produkt s časom pod vplivom raznih zunanjih dejavnikov, kot so T, vlaga in svetloba. Študije stabilnosti zdravil so zasnovane v skladu s klimatskimi conami (I-IV) glede na T in RV. Njihov glavni cilj je določitev roka uporabnosti, roka uporabnosti zdravila po odprtju večodmernega vsebnika, roka ponovnega preskušanja ZU, določitev pogojev shranjevanja in ustrezne ovojnine. Rok uporabnosti je časovno obdobje, v okviru katerega se pričakuje, da zdravilo ostaja znotraj potrjenih specifikacijskih mej, če je shranjevano pri pogojih, navedenih na izbrani ovojnini (54,76,77). Poznamo tri vrste stabilnostnega testiranja: dolgoročno, pospešeno in stresno Dolgoročno testiranje (angl. long term testing) Je del formalnega testiranja. Izvajamo ga pri predvidenih pogojih shranjevanja (ustrezna T in vlaga) z namenom opredelitve roka uporabnosti zdravila oz. roka ponovnega preskušanja ZU (54,77). Izvedba študije poteka po predpisanih protokolih in smernicah. Nove ZU in FO testiramo v klimatski coni I in II (Evropa, Amerika in Japonska) pri 25 C ± 2 C/60 % RV ± 5 % RV ali pri 30 C ± 2 C/65 % RV ± 5 % RV (tudi za III in IVa cono). Frekvenca vzorčenja je v prvem letu na vsake tri mesece, v drugem letu na vsakih šest mesecev in nato letno do konca roka uporabnosti oz. skupno maksimalno pet let (78) Pospešeno testiranje (angl. accelerated testing) Je del formalnega testiranja. Njegov namen je dokazovanje odpornosti ZU ali končnega farmacevtskega izdelka na pogoje, ki odstopajo od predvidenih pogojev shranjevanja. S pospešenimi testi pospešimo razpad ZU pri višji T in nato predvidimo rok uporabe pri predvidenih pogojih shranjevanja s pomočjo ekstrapolacije rezultatov iz povišane T. Rok 13

30 uporabnosti, pridobljen na osnovi pospešenih testov stabilnosti, se mora vedno potrditi z dolgoročnimi testi stabilnosti. Izvedba študije poteka po predpisanih protokolih in smernicah pri 40 C ± 2 C/75 % RV ± 5 % RV. Pri pospešenem testiranju potrebujemo najmanj tri točke vzorčenja (npr. začetna točka, trije in šest mesecev za šestmesečno študijo) (54,77,78) Stresno testiranje (angl. stress testing) Stresno testiranje ZU pomaga razjasniti in identificirati verjetne razgradne produkte, verjetno pot razgradnje ZU in intrinzično stabilnost molekule ter je nujno pri razvoju in validaciji stabilnostno-indikativne metode. Oblika stresnega testiranja je odvisna od preiskovane snovi in vrste zdravila. Podrobnosti načrtovanja in strategije stresnega testiranja niso predpisane v smernicah regulativnih organov. Testiranje se večinoma izvaja na eni seriji ZU, pri pogojih, ki izzovejo hidrolitično, termolitično, oksidativno in fotolitično razgradnjo ZU. Stresno testiranje mora inducirati optimalen razpad (5-15 %) ZU, kar ponazarja potencialen razpad ZU ob koncu roka uporabnosti oz. potencialen razpad zaradi neustrezne proizvodnje, pakiranja in rokovanja z zdravilom. Če zaznamo razgradnjo, ki je manjša od 5 %, je potrebno stresne pogoje in trajanje izpostavitve poostriti, da se določijo in predvidijo razgradni produkti (52,78,79). Stresno testiranje vključuje pogoje, ki so ostrejši od pogojev pospešenega testiranja; vpliv T (npr. 50, 60 ali 80 C), vlage (npr. 75 % RV ali več), kjer je predvideno, pa tudi oksidacija in fotoliza ZU. Za ZU v obliki raztopine ali suspenzije, se mora oceniti tudi dovzetnost ZU za hidrolizo v širokem razponu vrednosti ph. Testiranje fotostabilnosti, katerega standardni pogoji za preskušanje so opisani v ICH Q1B, je prav tako nujen sestavni del stresnega testiranja (78). Običajno stresno testiranje traja 28 dni. Rezultati stresnih študij so nujen sestavni del informacij, posredovanih regulativnim organom (52,78,79). V stabilnostni študiji se najprej preveri vpliv zunanjih dejavnikov na stabilnost ZU. Ko poznamo te informacije, vemo na katere kritične točke mora biti pozoren tehnolog pri nadaljnjem razvoju oblikovanja zdravila; torej katere pomožne snovi in v kakšnih razmerjih z ZU so kompatibilne ter kateri proizvodni postopek bo primeren. Do registracijske faze, ko se končna FO testira v ovojnini, predvideni za trženje, je še dolga pot vmesnih testiranj stabilnosti. Vse pa se začne s stresnimi testi vpliva okoljskih dejavnikov na ZU (79) ANALITIKA VITAMINOV Za vrednotenje stabilnosti vitaminov potrebujemo ustrezno stabilnostno indikativno analizno metodo (SIM), ki omogoča točno in natančno določanje njihove vsebnosti v 14

31 prisotnosti pomožnih snovi, razgradnih produktov in nečistot (63). Na razpolago je nekaj SIM za vrednotenje posameznih vitaminov (39,80,81). Največkrat pa v izdelkih najdemo več različnih vitaminov skupaj, za kar potrebujemo SIM za njihovo sočasno analizo. Za ločitev večjega števila vitaminov potrebujemo ustrezno separacijsko metodo, kot je tekočinska kromatografija. Ta je največkrat sklopljena z UV detektorjem ali z detektorjem z nizom diod (DAD), pa tudi z masnim spektrometrom, ki ima določene prednosti (občutljivost, selektivnost), vendar je zahtevnejša in manj primerna za rutinsko analizo ali študije stabilnosti (82 84). Analizna metoda mora namreč biti čim bolj preprosta, natančna, selektivna, občutljiva, zanesljiva in predvsem hitra (14,63,85). Pri eksperimentalnem delu in pregledu analiznih metod za sočasno ločbo in analizo večjega števila vodotopnih vitaminov smo se osredotočili na metode na osnovi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC). Sočasno vrednotenje vodotopnih vitaminov je zapleteno, saj se pojavljajo v različnih oblikah (vitameri) in odmerkih. Dodatno predstavljajo izziv njihove kemijske strukture, ki se precej razlikujejo po polarnosti. Vit. C, B1, B3 in B6 so zelo polarni, medtem ko so vit. B2, B7, B9 in B12 v vodi slabše topni. Razlikujejo se tudi v stabilnosti, o čemer bomo raziskovali v magistrski nalogi. Večina vitaminov zelo dobro absorbira svetlobo v UV-VIS območju ( nm), težavnejša pa sta vit. B5 in B7, ki v svoji strukturi nimata prisotnih močnih kromoforjev in absorbirata svetlobo zgolj pri nizkih valovnih dolžinah (210 nm, kjer so vidni vsi vitamini). Razlika, ki prav tako otežuje izvedbo analize multivitaminskih izdelkov, so različni priporočeni dnevni vnosi za posamezne vitamine. RDA za vit. C znaša kar 80 mg, RDA za B12 pa zgolj 2,5 μg. Analiza multivitaminskih izdelkov je dodatno še zahtevnejša, saj so kompleksni in običajno vsebujejo še maščobotopne vitamine, minerale in pomožne snovi ter potencialne razgradne produkte, kar dodatno oteži analizo (63,66,86,87). Zaradi vseh omenjenih izzivov se pojavijo težave z ločbo vseh vodotopnih vitaminov pri uporabi standardnih kolon in z zgolj enim injiciranjem. Objavljenih je zgolj nekaj SIM HPLC za sočasno vrednotenje vodotopnih vitaminov (88 91), ki omogočajo analizo do največ 7 vitaminov, večinoma brez zahtevnejših B7, B9 in B12 ter v času analize ene ure ali več. Samo ena, najnovejša, kromatografska metoda pa omogoča sočasno vrednotenje vseh glavnih oblik vodotopnih vitaminov reverznofazna tekočinska kromatografija visoke ločljivosti sklopljene z DAD detektorjem (UHPLC-DAD) avtorjev Temove Rakuša, Grobina in Roškarja, ki smo jo tudi uporabili pri našem eksperimentalnem delu (63). 15

32 2 NAMEN DELA Vitamini so trenutno zelo aktualno raziskovalno področje zaradi številnih pozitivnih učinkov pri ohranjanju zdravja. V splošnem so vodotopni vitamini (vit. B kompleksa in vit. C) nestabilni, a je podatkov o njihovi stabilnosti malo in pri tem prevladujejo raziskave stabilnosti v raztopinah. Študij o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju je precej manj in podatki so pomanjkljivi, zastareli, protislovni in nesistematični. Naš namen je pridobiti podatke o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, kot osnovo za formuliranje vitaminov v trdne FO in jih sistematično ovrednotiti, tudi s ciljem medsebojne primerjave, posamezno in v zmeseh. Glavni cilj magistrske naloge bo razvoj pristopa za spremljanje stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju. V ta namen bomo uporabili predhodno razvito stabilnostno indikativno metodo UHPLC-DAD za sočasno vrednotenje glavnih vodotopnih vitaminov, ki jo bomo nadgradili za vrednotenje dveh dodatnih vitamerov. Z namenom skrajšanja časa in poenostavitve analiznega postopka bomo razvili in optimizirali kratke izokratske metode za analizo posameznih vodotopnih vitaminov. Vse uporabljene metode bomo ovrednotili v skladu s smernicami ICH in s tem dokazali, da služijo svojemu namenu. Analizne metode bomo nato uporabili za vrednotenje stabilnosti posameznih vitaminov (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C in THFK) v trdnem stanju. Stabilnost vitaminov bomo ovrednotili tudi v prisotnosti drugih vodotopnih vitaminov, v zmeseh, z enakimi deleži posameznih vitaminov in zmeseh, kjer bomo količine posameznih vitaminov prilagodili glede na njihove priporočene dnevne odmerke. Stabilnostne študije bomo izvedli pri različnih stresnih pogojih (povišana T, RV, svetloba). Eksperimentalne pogoje bomo sproti prilagajali z namenom doseganja ustreznih rezultatov stabilnosti vitaminov. Po pregledu podatkov iz literature in znanstvenih člankov smo si zadali naslednje cilje: - Razširitev predhodno razvite analizne metode za vrednotenje dveh dodatnih vitamerov in validacija metode. - Razvoj in optimizacija kratkih analiznih metod za vrednotenje posameznih vitaminov, njihova validacija in primerjava z že postavljeno analizno metodo. - Razvoj in optimizacija priprave vzorcev za vrednotenje stabilnosti vitaminov v trdnem. - Ugotavljanje stabilnosti posameznih vitaminov v trdnem stanju pod vplivom različnih okoljskih dejavnikov (T, vlaga, svetloba). - Ugotavljanje stabilnosti posameznih vitaminov ob prisotnosti ostalih vodotopnih vitaminov v enakomernih in RDA razmerjih v zmesi vitaminov. 16

33 3 MATERIALI IN METODE 3.1 MATERIALI REAGENTI IN TOPILA - demineralizirana voda, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani; - dinatrijeva sol etilendiamintetraocetne kisline (Na2EDTA), C10H14N2Na2O8 2H2O, M = 372,24 g/mol, 99,9 % (Merck, Nemčija); - klorovodikova kislina, HCl, M = 36,46 g/mol, Titrisol za pripravo 1 M raztopine (Merck, Nemčija); - metanol (MeOH), CH3OH, M = 32,04 g/mol, HPLC čistosti 99,9 % (Honeywell, Riedel-de Haën, Nemčija); - milliq voda (MQ voda), Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani; - natrijev dihidrogenfosfat monohidrat, NaH2PO4 H2O, M = 137,99 g/mol, 99,0 % (Merck, Nemčija); - natrijev hidroksid, NaOH, M = 40,00 g/mol, Titrisol za pripravo 1 M raztopine (Merck, Nemčija); - pufrne raztopine: ph = 2, ph = 4 in ph = 7 (Merck, Nemčija); - vodikov peroksid, H2O2, M = 34,01 g/mol, 29,0 % (Sigma, Nemčija) STANDARDI - L-askorbinska kislina (C), C6H8O6, M = 176,12 g/mol, 99,0 % (Sigma-Aldrich, Nemčija in Carbosynth, VB); - tiaminijev klorid (B1), C12H18Cl2N4OS, M = 337,27 g/mol, 99,0 % (Sigma-Aldrich, Nemčija); - riboflavin (B2), C17H20N4O6, M = 376,36 g/mol, 98 % (Sigma-Aldrich, Nemčija); - riboflavin natrijev fosfat (B2-f), C17H20N4NaO9P, M = 478,33 g/mol, 75,1 % na suho maso (Spruyt Hillen, Nizozemska); - nikotinamid (B3), C6H6N2O, M = 122,12 g/mol, 99,0 % (Sigma-Aldrich, Nemčija); - nikotinska kislina (B3-k), C6H5NO2, M = 123,11 g/mol, 99,0 % (Carbosynth, VB); - kalcijev D-pantotenat (B5), C18H32CaN2O10, M = 476,53 g/mol, 98,0 % (Sigma- Aldrich, Nemčija); - piridoksinijev klorid (B6), C8H11NO3 HCl, M = 205,64 g/mol, 99,0 % (Sigma- Aldrich, Nemčija); 17

34 - D-biotin (B7), C10H16N2O3S, M = 244,31 g/mol, 99,0 % (Carbosynth, VB); - folna kislina (B9), C19H19N7O6, M = 441,40 g/mol, 97,0 % (Carbosynth, VB); - 5-metil tetrahidrofolna kislina (THFK), C20H25N7O6, M = 459,46 g/mol, 98,0 % (Carbosynth, VB); - cianokobalamin (B12), C63H88CoN14O14P, M = 1355,37 g/mol, 99,0 % (Sigma- Aldrich, Nemčija) NAPRAVE IN PRIBOR - analitski sistem UHPLC, 1290 Infinity (Agilent Technologies, ZDA): binarna črpalka G4220A, avtomatski vzorčevalnik G4266A, termostat G1316C, DAD detektor G4212A, programska oprema OpenLab CDS EZChrom A kolona: X-Select CSH C ,6 mm, 3,5 μm (Waters, ZDA) - predkolona: Luna C18 4 3,0 mm (Phenomenex, ZDA); - analizna tehtnica Excellence Plus (Mettler Toledo, Švica); - avtomatske pipete: μl, μl in 1-5 ml (Eppendorf, Nemčija); - filtri za pripravo mobilne faze (MF): z velikostjo por 0,20 μm (Sartorius, Nemčija) - hladilnik (Gorenje, Slovenija); - klimatska komora ICH 260L s svetlobnim modulom (Memmert, Nemčija); - klimatska komora VC 4034 (Votsch, Nemčija); - magnetno mešalo (Hanna instruments, VB); - ph meter SevenCompact TM ph/ion (Mettler Toledo, Švica); - sistema za pripravo MilliQ vode A10 Advantage in demineralizirane vode Millipore Elix 35 (Millipore Corporation, ZDA); - spatule, zamaški za viale, magneti za magnetna mešala, nastavki za pipete, plastične kapalke, stojala za epruvete, rokavice, Parafilm M; - steklovina: čaše, čolnički za tehtanje, erlenmajerice, merilne bučke in valji, merilne in polnilne pipete, viale, zamaški za merilne bučke; - ultrazvočni kadički: Sonis 4 (Iskra, Slovenija) in Bandelin Sonorex (Bandelin electronic, Nemčija). 18

35 3.2 INSTRUMENTALNE ANALIZNE METODE ANALIZNA METODA ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV Za sočasno vrednotenje vodotopnih vitaminov smo uporabili reverznofazno analizno UHPLC metodo, sklopljeno z DAD detektorjem, povzeto po avtorjih Temova Rakuša, Grobinu in Roškarju (63). Izbrani kromatografski pogoji: Kolona: X-Select CSH C ,6 mm, 3,5 μm Predkolona: Luna C18 4 3,0 mm T kolone: 40 C Pretok MF: 1 ml/min T avtomatskega vzorčevalnika: 8 C Volumen injiciranja: 5 μl (od 1 μl do 20 μl) (odvisno od koncentracije vzorca) Gradientni program MF: MF A 25 mm NaH2PO4 H2O (ph = 4,0), MF B MeOH (Preglednica III) Preglednica III: Deleža mobilne faze A in B v določenem časovnem intervalu. Čas [min] MF A [%] MF B [%] ,5 1 16, ,5 16, , , , , Valovna dolžina detekcije (λ) in retencijski časi (tr) analitov so prikazani v Preglednici IV. Preglednica IV: Izbrane valovne dolžine detekcije in retencijski časi (t r ) posameznih vitaminov. Vitamin Valovna dolžina detekcije [nm] Retencijski čas [min] C 290 2,1 B ,1 B3-k 260 3,6 B ,4 B ,9 B ,4 THFK ,1 B ,2 19

36 B ,4 B2-f ,8 B ,6 B ,7 Posamezna analiza vzorca poteka pri večih valovnih dolžinah sočasno in traja 30 minut (63) IZOKRATSKE METODE ZA ANALIZO POSAMEZNIH VODOTOPNIH VITAMINOV Za vrednotenje posameznih vitaminov smo razvili in uporabili izokratske UHPLC-DAD analizne metode. V Preglednici V so navedeni deleži uporabljenega MeOH, retencijski časi vitaminov, čas analize in valovne dolžine detekcije posameznih izokratskih analiznih metod. Ostale karakteristike analizne metode so enake kot pri gradientni UHPLC-DAD metodi (Poglavje 3.2.1). Preglednica V: Pregled izokratskih metod z uporabljenimi deleži MeOH v mobilni fazi, pripadajočimi retencijskimi časi posameznih vitaminov (t R ), časom analize in valovno dolžino detekcije (λ). Izokratska metoda MeOH [%] tr [min] Čas analize [min] λ [nm] C 1 2,1 3,2 290 B1 1 3,1 4,5 245 B6 1 4,4 5,3 290 B3 10 3,3 6,0 260 B5 10 5,1 6,0 210 THFK 20 3,7 5,3 287 B9 20 4,3 5,3 287 B7 25 5,2 6,0 210 B ,5 6,0 362 B2 30 4,6 5, PRIPRAVA VZORCEV PRIPRAVA MOBILNE FAZE (MF) IN TOPIL MF A za UHPLC - 25 mm puferna raztopina NaH 2 PO 4 Natehtali smo 3,45 g NaH2PO4 H2O, ki smo ga na magnetnem mešalu raztopili v približno 900 ml MQ vode. S pomočjo ph metra, ki smo ga vsakodnevno umerjali, smo pripravljeni raztopini med mešanjem uravnavali ph na 4,0 z 0,1 M HCl (iz vnaprej pripravljene 1 M HCl). Le-to smo kvantitativno prenesli v 1 L merilno bučko, jo dopolnili do oznake z MQ vodo in ponovno pomerili ph, ki se ni spremenil. Dobljeno raztopino smo filtrirali skozi 20

37 filter z velikostjo por 0,2 μm, da smo odstranili morebitne prisotne neraztopljene delce in jo pred uporabo razplinili na ultrazvočni kadički (UZ) (približno 15 minut). MF B za UHPLC - MeOH, namenjen analizi s HPLC 1 mm EDTA Natehtali smo točno približno 372 mg EDTA (M = 372,24 g/mol), jo kvantitativno prenesli v 1 L bučko in dopolnili do oznake z MQ vodo ter premešali, da se je v celoti raztopila. 1 mm NaOH V 250 ml merilno bučko smo odpipetirali 250 μl vnaprej pripravljene 1 M NaOH in dopolnili do oznake z MQ vodo ter premešali. 1 mm EDTA z 1 mm NaOH Natehtali smo točno približno 372 mg EDTA, jo kvantitativno prenesli v 1 L bučko in raztopili v približno 1 L MQ vode. Odpipetirali smo 1 ml vnaprej pripravljene 1 M NaOH in jo dodali k raztopini v bučko ter dopolnili z MQ vodo do oznake in premešali. Topilo za stabilizacijo THFK V 250 ml merilno bučko smo natehtali 60 mg standarda vit. C in do oznake dopolnili z 1 mm EDTA ter premešali. Bučko smo pustili približno 15 minut na UZ VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV Pripravili smo osnovne standardne raztopine posameznih vitaminov (OR) tako, da smo na tehtalni čolniček natehtali ustrezno maso vsakega standarda vitamina (Preglednica VI), ki smo ga kvantitativno prenesli v bučko določenega volumna in do oznake raztopili v ustreznem topilu (B1, B6 in B12 v 1 mm EDTA; B2 v 1 mm NaOH; B7, B9 ter THFK pa v 1 mm EDTA z dodanim 1 mm NaOH). Da se je standard vitamina popolnoma raztopil, smo vsako bučko OR postavili na UZ za minut. Izjema so bili vit. B3, B5 in C, ki smo jih natehtali neposredno v bučko za pripravo standardne raztopine (SR). 21

38 Preglednica VI: Priprava OR standardov vitaminov za vrednotenje analizne metode. Analit mst [mg] VOR [ml] Topilo Koncentracija [mg/l] B mm EDTA 2000 B mm NaOH 160 B3 8 25* 1 mm EDTA 320 B5 9 25* 1 mm EDTA 360 B mm EDTA 2000 B mm EDTA z 1 mm NaOH 200 B mm EDTA z 1 mm NaOH 200 THFK 5, mm EDTA z 1 mm NaOH 220 C 19 25* 1 mm EDTA 760 B mm EDTA 500 Masa standarda (m ST ), volumen bučke OR (V OR ), * izjeme natehtano neposredno v bučko standardne raztopine (SR) SR vodotopnih vitaminov (400 % RDA) smo pripravili v 25 ml bučki. Iz OR posameznih vitaminov smo odpipetirali določene volumne (275 μl B1 + 5,00 ml B μl B6 + 5,00 ml B μl B μl THFK μl B12), 8,00 mg B3, 9 mg B5 in 19 mg vit. C pa smo neposredno dodali v bučko SR, ki smo jo dopolnili do oznake z 1 mm EDTA. Tako pripravljeno SR smo dobro premešali. SR smo nato ustrezno redčili (Preglednica VII), da smo dobili koncentracije za standarde vitaminov v območju od 5 % do 400 % RDA, s katerimi smo izdelali umeritveno premico (UP). Redčitve SR smo prenesli v viale, jih zaprli z zamaški ter čimprej analizirali. Kontrolne vzorce (QC) smo pripravili na enak način kot kalibracijske vzorce, in sicer pri nizki (QCL), srednji (QCM) in visoki (QCH) koncentraciji znotraj območja linearnosti metode (Preglednica VII). Natančne koncentracije vitaminov v kalibracijskih in kontrolnih vzorcih so predstavljene v Preglednici VIII. Preglednica VII: Postopek redčitev 400 % standardne raztopine za pripravo kalibracijskih (vzorci umeritvene premice (UP)) in kontrolnih vzorcev (QC). Vzorci UP Redčitev oz. RDA [%] VSR [μl] Vtopila [μl] (1mM EDTA) 5 * * * do

39 QCL 30 * QCM QCH * Izhajali smo iz 50 % kalibracijske raztopine, ki smo jo pripravili v 5 ml bučki. SR za vit. B2-f smo pripravili posebej. Na tehtalni čolniček smo natehtali 4 mg standarda vit. B2-f, ki smo ga kvantitativno prenesli v 25 ml bučko in do oznake raztopili v 1 mm NaOH. Bučko OR smo postavili na UZ, da se je standard popolnoma raztopil, nato pa odpipetirali 5 ml pripravljene OR vitamina in dodali 1 mm EDTA v 25 ml bučki. Postopek redčitev smo izvedli enako kot za SR ostalih vitaminov (Preglednica VII). Postopek priprave SR in redčitve smo ponovili še dvakrat 3 zaporedne dni. Preglednica VIII: Koncentracije standardov vodotopnih vitaminov za vrednotenje metode. Vzorci Koncentracija standardov [mg/l] UP RDA B1 B2 B3 B5 B6 B7 B9 B12 THFK C 5 % 0,27 0,45 4,20 1,52 0,35 0,32 0,05 0,07 0,05 20,15 10 % 0,53 0,90 8,39 3,03 0,70 0,64 0,10 0,14 0,11 40,30 25 % 1,33 2,24 20,98 7,58 1,75 1,60 0,25 0,35 0,27 100,75 50 % 2,66 4,48 41,95 15,15 3,50 3,20 0,51 0,70 0,54 201, % 5,31 8,96 83,90 30,30 6,99 6,40 1,02 1,40 1,09 403, % 10,63 17,92 167,80 60,60 13,99 12,80 2,03 2,80 2,18 806, % 21,25 35,84 335,60 121,20 27,97 25,60 4,06 5,60 4, ,0 QCL 30 % 1,59 2,69 25,17 9,09 2,10 1,92 0,30 0,42 0,33 120,9 QCM 90 % 4,78 8,06 75,51 27,27 6,29 5,76 0,91 1,26 0,98 362,70 QCH 300 % 15,94 26,88 251,70 90,90 20,98 19,20 3,05 4,20 3,27 604, RAZVOJ IN VALIDACIJA ANALIZNIH METOD ZA POSAMEZNE VITAMINE Priprava vzorcev za razvoj izokratskih metod Uporabili smo predhodno pripravljene OR standardov vitaminov (postopek priprave opisan v Poglavju 3.3.2), ki smo jih shranjevali v hladilniku. V začetni fazi smo pripravili 400 % RDA SR posameznih vitaminov in jih analizirali po različnih izokratskih metodah. Nato smo združili vitamine po parih in pripravili 400 % SR dveh vitaminov tako, da smo odpipetirali ustrezne volumne (Poglavje 3.3.2) posameznih OR vitaminov. Skupaj smo pripravili vit. B1 in B6 (pri 1 % MeOH v MF), C in B1 (pri 1 % MeOH v MF), B3 in B5 (pri 10 % in 15 % MeOH v MF), THFK in B9 (pri 15 in 20 % MeOH v MF), B7 in B12 (pri 20 % in 25 % 23

40 MeOH v MF) ter posebej vit. C pri 1 % MeOH v MF in B2 (pri 25 % in 30 % MeOH v MF). Npr. za dvojico vit. B1 in B6: z avtomatsko pipeto smo v 25 ml bučko odmerili 275 μl B1 in 350 μl B6 ter do oznake dopolnili z 1 mm EDTA in premešali (Poglavje ) ter vzorec analizirali. Priprava stresnih vzorcev raztopin izbranih vitaminov za vrednotenje specifičnosti metod Za preverjanje specifičnosti metod za posamezne vitamine smo pripravili stresne vzorce raztopin posameznih izbranih nestabilnih vitaminov (63). Te vzorce raztopin vitaminov smo za en dan izpostavili stresnim pogojem: svetlobi, 0,1 M NaOH (bazično okolje) in 3 % H2O2 (oksidativno okolje). Za vsak vitamin smo pripravili 2 paralelki ter kontrolo. V Preglednici IX so zapisani postopki priprave posameznih vzorcev. Svetlobi smo izpostavili vit. B2 in B9, oksidativnim pogojem vit. B7, bazičnemu okolju pa vit. B1, B2, B5 in B12. Izhajali smo iz OR standardov vitaminov, pripravljenih po postopku opisanem v Poglavju 3.3.2, ki smo jih ustrezno redčili do koncentracije 400 % RDA s topili navedenimi v Preglednici IX. Podrobnejši postopek priprave vzorcev je v Prilogi 2. Preglednica IX: Priprava stresnih vzorcev. Pogoj Priprava 10-kratne redčitve OR Shranjevanje vzorca Obdelava pred analizo Kontrolni Ustrezen V OR vitamina* + MQ do 1000 μl Pri 25 C, v temi / Bazični Ustrezen V OR vitamina* μl 1 M Pri 25 C, v temi Dodatek 100 μl NaOH + MQ do 1000 μl 1 M HCl Oksidativni Ustrezen V OR vitamina* μl 30 % Pri 25 C, v temi / H 2 O 2 + MQ do 1000 μl Svetlobni Ustrezen V OR vitamina* + MQ do 1000 μl Pri 25 C, na svetlobi / * izračun ustreznega volumna OR vitamina je naveden v Prilogi 2. Pripravljene vzorce smo analizirali ob času 0 in po 24 urah. Stabilnost vitaminov smo izračunali kot razmerje površine pod kromatografskim vrhom oz. odziva AUC (angl. area under the curve) stresnega vzorca po 24 urah glede na AUC kontrole ob času 0: stabilnost [%] = AUC2 / AUC1 100 %. Pri tem smo upoštevali spremembe volumna ob dodatku HCl. Kontrola nam je služila kot izhodišče (100 % vsebnost). Priprava raztopin za vrednotenje linearnosti metod Raztopine posameznih vitaminov za vrednotenje linearnosti s koncentracijo 200 mg/l smo pripravili tako, da smo natehtali 5 mg standarda vitamina v 25 ml bučko. Kot topilo smo za 24

41 vsak posamezen vitamin uporabili ustrezno topilo, kot je navedeno v Preglednici VI. Po pripravi raztopine v bučki, smo le-to dali na UZ za 15 minut. 200 mg/l raztopino smo ustrezno redčili z 1 mm EDTA v viale, da smo dobili koncentracije 150, 100, 50 in 25 mg/l (Preglednica X) kalibracijske vzorce za izdelavo UP. Izjema so bile raztopine s THFK, B2 in B2-f, kjer smo za izdelavo UP raztopili 2,5 mg vzorca v 25 ml ustreznega topila (100 mg/l) in nato izvedli ustrezne redčitve po shemi v Preglednici XI. Preglednica X: Pripravo kalibracijskih vzorcev posameznega vitamina (B1, B3, B5, B6, B7, B9, B12 in C) z navedenimi volumni [μl]. 200 mg/l 150 mg/l 100 mg/l 50 mg/l 25 mg/l V(OR) V(1 mm EDTA) Preglednica XI: Pripravo kalibracijskih vzorcev posameznega vitamina (THFK, B2 in B2-f) z navedenimi volumni [μl]. 100 mg/l 75 mg/l 50 mg/l 25 mg/l 12,5 mg/l V(OR) V(1 mm EDTA) Priprava raztopin za vrednotenje točnosti, ponovljivosti in stabilnosti vzorcev Za preverjanje točnosti, ponovljivosti in stabilnosti vzorcev smo pripravili QC vzorce s koncentracijo 100 mg/l za vit. B1, B3, B5, B6, B7, B9, B12 in C in QC s koncentracijo 50 mg/l za vit. B2, B2-f in THFK. Natehtali smo tri paralelke po 2,5 mg posameznega standarda vitamina in ga z ustreznim topilom (Preglednica VI) raztopili v 25 ml bučki (100 mg/l) oz. 2,5 mg posameznega standarda vitamina raztopili z ustreznim topilom (Preglednica VI) v 50 ml bučki (50 mg/l). Vsako bučko smo dobro pretresli in dali na UZ za 15 minut. Postopek priprave raztopin smo ponovili še dvakrat 3 zaporedne dni STRESNO TESTIRANJE STABILNOSTI VITAMINOV V TRDNEM STANJU Priprava vzorcev za preverjanje topnosti vit. B7 in stabilnosti THFK Preverili smo topnost vit. B7 in stabilnost THFK v izbranih topilih. Natehtali smo štirikrat po 1,5 mg standarda vit. B7 in ga raztopili v 5 ml bučki z 1mM EDTA ter v 5, 25 in 50 ml bučki z 1 mm EDTA v 1 mm NaOH. Natehtali smo sedemkrat po 1 mg standarda vit. THFK in ga raztopili v 5, 10 in 20 ml bučki z 1 mm EDTA, v 5 in 10 ml bučki s topilom za stabilizacijo THFK (Poglavje 3.3.1) in v dve 10 ml bučki s kombinacijo dveh topil 1 ml 1 mm EDTA z 1 mm NaOH in 9 ml topila za stabilizacijo THFK. Izvedli smo dve različici, 25

42 topili smo dodali hkrati ali najprej dodali 1 mm EDTA z 1 mm NaOH, dobro premešali in šele nato dodali topilo za stabilizacijo THFK. Vse pripravljene raztopine vit. B7 in THFK smo dobro pretresli in dali na UZ najprej za 15 min, opazovali bistrost raztopine in po potrebi vrnili na UZ še za dodatnih 15 min in ponovno opazovali spremembe bistrosti raztopine. Na podlagi opazovane bistrosti raztopine vit. B7 smo izbrali optimalno topilo za testiran vitamin. Vzorcem bistrih raztopin THFK pa smo dodatno preverili vsebnost z UHPLC metodo in na ta način izbrali optimalno topilo za stabilizacijo vitamina Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti posameznih vitaminov pri povišani T in RV Vsak standard vitamina (11 vitaminov B1, B2, B2-f, B3, B5, B6, B7, B9, THFK, B12, C) smo natehtali v dva vsebnika, po 40 mg v vsakega. En vsebnik smo zaprli s plastičnim pokrovčkom in zatesnili s parafilmom, drugega pa smo pustili odprtega. Vsebnike smo shranjevali v klimatski komori pri pogojih: 60 C in 75 % RV. Meritve z metodo UHPLC (dolga in kratke metode) smo izvajali ob času 0, po dveh dnevih, po enem tednu in po treh mesecih. V vsaki časovni točki smo za vsak vitamin iz obeh vsebnikov natehtali 3 paralelke po 5 mg v 25 ml bučke, razen izjem (THFK in obe obliki B2), kjer smo natehtali 3 paralelke po 2,5 mg v 50 ml bučke. Za pripravo vzorcev smo uporabili ustrezno topilo (Preglednica VI), bučko pretresli in dali na UZ za 15 min. Ob času 0 smo dodatno preverili homogenost znotraj vzorca tako, da smo iz prve raztopine vzorca le-tega prenesli v tri viale za analizo. Takoj po tehtanju smo vsebnik vrnili v klimatsko komoro, na stresne pogoje (60 C in 75 % RV), pripravljene viale z vzorci pa analizirali z metodo UHPLC po dolgi in po kratkih metodah. Na ta način smo spremljali stabilnost vitaminov po enačbi: stabilnost [%] = AUCt / AUC0 100 %. Zaradi različnih zateht vzorcev smo upoštevali normirane odzive. Rezultate smo zbirali v Excel. Za preverjanje homogenosti znotraj vzorca smo poračunali povprečje in relativni standardni odklon RSD (angl. Relative Standard Deviation) s postavljenim kriterijem RSD < 2 % Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti posameznih vitaminov v fotostabilnostni stresni študiji 5 mg vsakega standarda vitamina (8 vitaminov B1, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C) smo v tankem sloju natehtali v devet transparentnih 50 ml bučk. THFK in obe obliki vit. B2 smo 26

43 natehtali po 2,5 mg v 50 ml bučke. Vsako bučko smo dobro zatesnili z zamaški. 3 bučke (paralelke) vsakega vitamina smo analizirali takoj. Ostale smo shranili v klimatsko komoro s svetlobnim modulom (nastavljen na 100 % dnevno svetlobo, 100 % UV sevanje) pri 25 C in 60 % RV, v skladu s smernico Q1B. Po dveh in po štirih dneh smo iz klimatske komore vzeli 3 bučke z vsakim vitaminom in pripravili vzorce za analizo. Pred analizo smo vzorec pripravili z raztapljanjem v ustreznem topilu (Preglednica VI) do oznake na bučki, sonicirali vsaj 15 minut in analizirali. Meritve z metodo UHPLC smo izvajali ob času 0, po dveh in po štirih dnevih po kratkih izokratskih metodah, z izjemo B2-f, ki smo ga analizirali po dolgi gradientni metodi. Stabilnost smo vrednotili po istem postopku kot pri vrednotenju stabilnosti posameznih vitaminov pri povišani T in višji RV (Poglavje ) Priprava vzorcev za spremljanje stabilnosti vitaminov v zmesi vseh vitaminov pri povišani T in RV Zmesi vitaminov smo pripravili v dveh različicah; enaki deleži vseh izbranih vodotopnih vitaminov (enaka razmerja med posameznimi vitamini) in deleži posameznih vitaminov, prilagojeni glede na njihove RDA vrednosti. Postopek priprave zmesi, pogoji njihovega shranjevanja in postopek priprave vzorcev za analizo je enak, razlikujejo se le mase vitaminov. Pri enakem razmerju vitaminov smo natehtali 100 mg vsakega vitamina (B1, B2-f, B3-k, B5, B6, B7, B9, B12, THFK, C) v steklen vsebnik, kar je predstavljalo 1 g skupne mase. Pri RDA razmerju vitaminov smo v steklen vsebnik natehtali različne mase posameznih vitaminov: 22 mg B1, 28 mg B2-f, 320 mg B3-k, 120 mg B5, 28 mg B6, 1 mg B7, 4 mg B9, 1 mg B12, 4 mg THFK in 1600 mg vit. C v steklen vsebnik, kar je predstavljalo 2128 mg skupne mase. Nato smo oba vsebnika zaprli s pokrovčkom in s sunkovitim stresanjem premešali zmes do (navidezne) homogenosti. Maso smo nato enakomerno razdelili na 4 dele; iz obeh prvotnih vsebnikov smo vsebino prenesli v 3 nove, katere smo nato za teden dni izpostavili različnim pogojem: sobni T kontrola (zaprt vsebnik), 60 C in 60 % RV (odprt in zaprt vsebnik) prva klimatska komora, 80 C in nekontrolirana nizka RV (zaprt vsebnik) druga klimatska komora. Vzorce smo analizirali ob času 0, po treh dneh in po enem tednu. Za pripravo vzorcev smo vsebnike vzeli iz klimatske komore in natehtali 5 mg zmesi praškov vsebnika v 50 ml bučko. Pred odvzemom vzorca smo vsebnik temeljito pretresli. Pripravili smo tri paralelke z 1 mm EDTA in tri paralelke z 1 mm EDTA z 1 mm NaOH. Vsebino bučk smo raztopili do oznake z ustreznim topilom ter premešali in dali na UZ do nastanka 27

44 bistre raztopine. Tako pripravljene vzorce smo prenesli v viale in analizirali po dolgi gradientni metodi UHPLC z 10 µl volumnom injiciranja za zmes enakih deležev vitaminov in z 5 µl volumnom injiciranja za RDA zmes vitaminov. Vsebnike smo po tehtanju čimprej vrnili v klimatsko komoro. Preverili smo tudi homogenost vzorcev pri zmesi enakih deležev praškov tako, da smo iz ene bučke prenesli vzorec v tri viale. Upad vsebnosti vitaminov smo spremljali kot razmerje odzivov ob času analize v primerjavi s kontrolo ob času 0: stabilnost [%] = AUCt / AUC0 100 %. Zaradi različnih zateht vzorcev smo upoštevali normirane odzive. Rezultate smo zbirali v Excel in izračunali povprečje treh paralelk in njihovo ponovljivost izrazili kot RSD. Dodatno smo po enakem postopku (enake mase standardov vitaminov, stresanje vsebnika) pripravili zmes RDA in zmes enakih deležev vitaminov. Vsebino smo razdelili v več steklenih vsebnikov, ki smo jih izpostavili različnim stresnim pogojem: 40 C in 75 % RV, 60 C in 75 % RV (odprt vsebnik, prva klimatska komora), 60 C in nekontrolirana nizka RV (zaprt vsebnik, druga klimatska komora) za teden dni. Dnevno smo opazovali in beležili organoleptične spremembe vzorcev. 3.4 VALIDACIJA INSTRUMENTALNE METODE Namen validacije je dokazati, da je metoda ustrezna in daje zanesljive rezultate, ki ustrezajo postavljenim merilom kakovosti. V okviru validacije instrumentalne metode smo v skladu s smernico za validacijo analiznih metod ICH Q2(R1) preverili naslednje parametre: specifičnost, linearnost, točnost, natančnost ter stabilnost vzorcev (92) SPECIFIČNOST Specifičnost metode se nanaša na sposobnost metode, da analizira točno določen analit ob prisotnosti ostalih sestavin v vzorcu. Za določanje specifičnosti gradientne in vseh izokratskih analiznih metod smo injicirali topila, ki smo jih uporabljali med pripravo vzorcev: 1 mm EDTA, 1 mm NaOH, MQ, 1 mm EDTA z dodanim 1 mm NaOH in topilo za stabilizacijo THFK (njihova priprava je opisana v Poglavju 3.3.1), razt. standardov vseh vitaminov (Poglavje 3.3.2) in v stresnih vzorcih nestabilne vitamine (Poglavje 3.3.3). Preverjali smo, ali so kromatografski vrhovi jasno ločeni, se ne prekrivajo in med komponentami ne prihaja do interferenc; morebitne prisotnosti kromatografskih vrhov pri istih retencijskih časih kot se eluirajo posamezni vitamini. 28

45 3.4.2 LINEARNOST Linearnost analizne metode pomeni sposobnost, da znotraj določenega območja metoda zagotavlja rezultate, ki so neposredno sorazmerni s koncentracijo. Linearnost razmerja med koncentracijo in odzivom vitamina preverimo s pomočjo regresijske premice na osnovi metode najmanjših kvadratov. Rezultat regresijske premice je UP z enačbo: y = bx + a, kjer y predstavlja odziv (AUC), x koncentracijo analita, a odsek na ordinati in b naklon premice. Linearnost smo vrednotili posamezno za vsak vitamin v zmesi vseh vitaminov za gradientno metodo (Poglavje 3.3.2) in v raztopinah posameznih vitaminov za izokratske metode (Poglavje 3.3.3). Za vsak posamezen vitamin smo izdelali UP pri izbrani valovni dolžini detekcije (Preglednica IV). Rezultate smo obdelali, izračunali enačbe UP in linearnost regresijskih premic potrdili s korelacijskim koeficientom (R 2 ), ki podaja korelacijo med odzivom in koncentracijo. Postavljen kriterij sprejemljivosti za potrditev linearnosti je bil R 2 > 0, TOČNOST Točnost analizne metode definira stopnjo ujemanja izmerjene vrednosti z dejansko vrednostjo. Za vrednotenje točnosti gradientne analizne metode smo pripravili QC treh različnih koncentracij (pri nizki QCL, srednji QCM in visoki QCH), v treh ponovitvah, znotraj območja linearnosti metode, po postopku navedenem v Poglavju Točnost izokratskih metod pa smo vrednotili na enem koncentracijskem nivoju 100 % kontrolnih vzorcih, v treh ponovitvah, pripravljenih po postopku navedenem v Poglavju S pomočjo enačbe UP smo izračunali koncentracijo (cugotovljena) za vitamine in jo primerjali z dejansko (cnominalna) koncentracijo v kontrolnih vzorcih (Enačba 1). Za mejo sprejemljivosti smo definirali interval 90% 110%. Točnost [%] = cugotovljena/cnominalna 100 % (Enačba 1) cugotovljena ugotovljena koncentracija vitaminov iz enačbe UP [mg/l] cnominalna dejanska koncentracija vitaminov v vzorcu, izračunana iz postopka priprave [mg/l] NATANČNOST Natančnost analizne metode pomeni stopnjo ponovljivosti oz. razpršenosti med serijami analiz istega homogenega vzorca pod predpisanimi eksperimentalnimi pogoji. Zanimala nas je ponovljivost znotraj enega dneva (znotraj-dnevna ponovljivost) pri normalnih delovnih 29

46 pogojih (znotraj laboratorija z istim analitom, isto opremo in istimi reagenti), zato smo natančnost ovrednotili na nivoju ponovljivosti, ki se izraža kot RSD. Znotraj-dnevno ponovljivost gradientne analizne metode smo preverili tako, da smo uporabljali enake QC (QCL, QCM in QCH) kot pri preverjanju točnosti, izdelane po postopku opisanem v Poglavju Ponovljivost izokratskih metod pa smo preverjali na enem koncentracijskem nivoju (100 %). Vsak QC smo vrednotili v treh paralelkah in vrednotili stopnjo ujemanja rezultatov med njimi. Za mejo sprejemljivosti smo definirali vrednost RSD < 5%. Pri gradientni metodi smo preverjali tudi ponovljivost injiciranja, pri čemer smo isti QC vzorec (eno paralelko za vsak QC) injicirali šestkrat zapored in primerjali stopnjo ujemanja odzivov vseh zaporednih injiciranj. S tem smo preverili ponovljivost injiciranja, katere kriterij sprejemljivosti je bil RSD < 2 % STABILNOST VZORCEV S preverjanjem stabilnosti standardov smo želeli potrditi, da vzorci ohranijo ustrezne lastnosti še dalj časa po pripravi oz., da je vitamin primeren za analizo v daljšem časovnem intervalu. QC standardov (QCL, QCM in QCH za gradientno metodo, izdelani po postopku opisanem v Poglavju in QC100 % za izokratske metode po postopku v Poglavju 3.3.3) smo shranjevali v avtomatskem vzorčevalniku pri 8 C in pomerili vsebnost vitaminov ob času 0, po 12 h in 24 h. Rezultate smo podali kot razmerje odzivov v določeni časovni točki glede na odziv ob času 0. Določili smo, da upad ali porast ne sme biti večji od 10 % glede na začetno vrednost odziva. Stabilnost posameznega vitamina, izraženo v %, smo izračunali kot: stabilnost [%] = AUCt / AUC0 100 %. 3.5 OBDELAVA PODATKOV Rezultate analiz opravljenih eksperimentov smo obdelali s programsko opremo EZChrom. Pridobljene podatke smo prenesli v programsko opremo Microsoft Excel 2013, kjer smo jih statistično obdelali. Izračunali smo pomembne parametre (povprečna vrednost, standardni odklon, RSD in R 2 ) za potrebe potrditve validacije metode in vrednotenje stabilnosti vzorcev stresnih študij. Izrisali smo grafe oz. UP za vsak posamezen vitamin in sicer, odziv v odvisnosti od koncentracije. Za lažjo in preglednejšo predstavitev rezultatov smo podatke prikazali v preglednicah in grafih. 30

47 4 REZULTATI IN RAZPRAVA 4.1 RAZVOJ ANALIZNEGA PRISTOPA NADGRADNJA GRADIENTNE ANALIZNE METODE Glavni namen naloge je bil razvoj enostavnega analiznega pristopa za vrednotenje stabilnosti posameznih vodotopnih vitaminov in njihovih zmesi v trdnem stanju. Analizni pristop je zajemal ustrezno pripravo vzorcev in instrumentalno analizno metodo. Za analizo smo uporabili sistem UHPLC. Osnova pri sočasnem vrednotenju je bila predhodno razvita gradientna analizna UHPLC-DAD metoda (63), ki smo jo razširili še za analizo dveh vitamerov, THFK in B3-k. Kromatogram z ločbo vseh devetih osnovnih vodotopnih vitaminov in treh vitamerov v standardni raztopini pri 210 nm je prikazan na Sliki 1. Na ta način smo z zgolj enim injiciranjem vzorca ločili vse vodotopne vitamine. Vsi vrhovi so lepo ločeni na bazni liniji. Slika 1: Kromatogram vseh devetih osnovnih vodotopnih vitaminov in treh vitamerov v standardni raztopini pri 210 nm. Vrstni red elucije: C (2,1 min), B1 (3,1 min), B3-k (3,6 min), B6 (4,4 min), B3 (6,9 min), B5 (9,4 min), THFK (12,1 min), B9 (14,2 min), B7 (17,6 min), B2-f (20,8 min), B12 (21,6 min) in B2 (24,7 min). Uporabljena analizna metoda je torej primerna za vrednotenje osnovnih oblik vitaminov in dodatno treh vitamerov, ki se pogosto uporabljajo B3 v obliki kisline (B3-k), ki je poleg nikotinamida dovoljena oblika v živilih in prehranskih dopolnilih, THFK, ki je aktivna 31

48 oblika folatov in je prav tako dovoljen v živilih in prehranskih dopolnilih ter B2 v obliki fosfata (B2-f), ki se uporablja v prehrambenih izdelkih zaradi boljše topnosti (21,93,94). Vsi so ločeni na bazni liniji (Slika 1). Analitsko najzahtevnejši je B2-f, ki vsebuje še številne druge sestavine ki prispevajo k več kot 10 kromatografskih vrhov v kromatogramu standarda B2-f (Slika 2). Slika 2: Kromatogram vit. B2-f z retencijskim časom 20,8 min, posnet pri 445 nm RAZVOJ IZOKRATSKIH ANALIZNIH METOD Čas analize traja pri gradientni metodi 30 minut, kar je časovno potratno pri meritvah večjega števila vzorcev z zgolj enim ali dvema vitaminoma. Zato smo razvili metode za analizo posameznih vitaminov. V začetni fazi smo za analizo posameznih vitaminov preizkusili različne izokratske programe (različne kombinacije pufra s ph = 4 in MeOH). V kasnejši fazi smo v pare združili vitamine, ki se eluirajo v ožjem intervalu retencijskih časov imajo podobno polarnost in zanje preizkusili različice izokratskih programov. Izbrali smo sestavo MF, pri kateri je prišlo do lepše ločbe vrhov na bazni liniji kromatograma. Bili smo pozorni tudi na obliko vrhov (ozki, ostri in simetrični) in njihovo ustrezno ločbo od vrha topila. Potek razvoja analiznih metod je predstavljen na Sliki 3, na primeru vit. B7 in B12, ki smo ju preizkusili pri dveh izokratskih programih; pri 20 % (Slika 3a) in 25 % (Slika 3b) MeOH. Kot boljšo različico 32

49 smo izbrali program pri 25 % MeOH (Slika 3b), saj pride do elucije obeh analitov hitreje (pri 3,4 in 5,1 min), kar pomeni krajši čas analize. Vrhova sta ožja in višja ter lepše ločena na bazni liniji, prav tako pa se ustrezno zadržita na koloni, da ne pride do interferenc z vrhom topila. Pri uporabi 20 % MeOH (Slika 3a) se analita eluirata kasneje (po 7. minuti), vrhova nista lepe oblike in sta relativno blizu skupaj. Slika 3: Kromatograma izokratskih programov za analizo vit. B7 (7,7 min) in B12 (7,0 min) pri 20 % (3a) oz. vit. B7 (5,1 min) in B12 (3,4 min) pri 25 % MeOH (3b), posneta pri 210 nm. 33

50 Kromatogrami razvitih izokratskih metod za posamezne vitamine so zbrani v Prilogi 3, končni kromatografski pogoji pa navedeni v Poglavju Pri pregledu rezultatov smo opazili zanimiv pojav, in sicer zamenjavo vrstnega reda elucije za vit. B7 in B12 (v primerjavi z dolgo gradientno metodo). Pri dolgi gradientni metodi se najprej eluira vit. B7 pri 17,4 min in nato B12 pri 21,5 min. V obeh preizkušenih izokratskih metodah, pri 20 % in 25 % MeOH, pa se najprej eluira B12 pri 3,4 min in kasneje B7 pri 5,1 min (pri 25 % MeOH). Tudi v najdenih člankih se pojavljajo razlike v vrstnem redu elucije omenjenih vitaminov, kar pa je precej odvisno ne le od vrste stacionarne faze, ampak tudi od vrste, polarnosti in deleža organskega topila MF (95 97). 4.2 VREDNOTENJE UHPLC METODE VALIDACIJA ANALIZNE METODE ZA SOČASNO VREDNOTENJE VODOTOPNIH VITAMINOV Predhodno razvito analizno metodo za sočasno vrednotenje vodotopnih vitaminov (63) smo razširili za vrednotenje dveh vitamerov (THFK in B3-k) in jo celostno validirali ter s tem ovrednotili njene karakteristike (specifičnost, linearnost, točnost, natančnost in stabilnost vzorcev) ter potrdili, da le-ta daje pravilne rezultate in ustreza svojemu namenu Specifičnost Pri vrednotenju specifičnosti smo najprej preverili vsa uporabljena topila (priprava v Poglavju 3.3.1). S primerjavo kromatogramov topil (Slika 4) s kromatogrami standardov vodotopnih vitaminov (Slika 1) smo potrdili, da uporabljena topila ne motijo analize vrednotenih vitaminov, prav tako pa so vitamini lepo ločeni med seboj na bazni liniji. Specifičnost metode smo prav tako potrdili v zmesi standardov vseh vitaminov, vključno z B2-f, ki vsebuje številne interference (Slika 2). 34

51 Slika 4: Kromatogram uporabljenih topil (MQ, 1 mm EDTA, 1 mm NaOH, 1 mm EDTA z dodanim 1 mm NaOH) pri 210 nm Linearnost OR in SR za vrednotenje linearnosti smo pripravili po postopkih opisanih v Poglavju Za območje linearnosti metode smo uporabili že predhodno določene intervale (5 400 % RDA) (67,98), kjer so bile koncentracije posameznih vitaminov izbrane glede na njihov priporočen dnevni vnos (Preglednica VIII) (10,38). 100 % RDA ustreza vrednosti RDA posameznega vitamina, raztopljenega v 200 ml medija, ki predstavlja običajen volumen zaužitja tablete (63). Razen v primeru vit. B7, B12 in THFK, kjer smo zaradi nizkih RDA vrednosti uporabili 25-krat večje koncentracije. Rezultati vrednotenja linearnosti za vodotopne vitamine so zbrani v Preglednici XII. R 2 je bil za vse vitamine večji od 0,999, zato lahko zaključimo, da je metoda linearna za vse analite (B1, B2, B2-f, B3, B5, B6, B7, B9, B12, THFK in C) v testiranem koncentracijskem območju. Izjeme so bili vit. C, B7 in THFK, kjer smo območje linearnosti prilagodili. Pri vit. C smo kot zgornjo mejo linearnosti vzeli 200 % RDA, saj sta že avtorja Grobin in Horvat (67,98) ugotovila, da je pri koncentraciji 1600 mg/l (400 % RDA) presežena zgornja mejna koncentracija za linearnost vit. C. Zato smo območje vrednotenja linearnosti prilagodili tako, da smo spremenili zgornjo mejo linearnosti oz. smo za maksimalno koncentracijo območja linearnosti metode določili koncentracijo 800 mg/l (200 % RDA vrednost za vit. C) (67,98). V koncentracijskem območju 20,15 806,00 mg/l smo tako tudi za vit. C potrdili linearnost (R 2 > 0,999). Pri vit. B7 in THFK nismo zaznali najnižjih koncentracij (5 % RDA za B7 oz. 35

52 5 in 10 % RDA za THFK), saj so bile pod spodnjo mejo zaznave. Območje vrednotenja linearnosti smo prilagodili na koncentracijski območji 0,64 25,60 mg/l za B7 in 0,27 4,36 mg/l za THFK, kjer smo tako tudi za omenjena vitamina potrdili linearnost (R 2 > 0,9998 oz. R 2 > 0,9997). Preglednica XII: Rezultati vrednotenja linearnosti za vodotopne vitamine s podanim linearnim koncentracijskim območjem, s pripadajočimi umeritvenimi premicami in izračunanimi R 2. Vitamin Koncentracijsko območje [mg/l] Naklon Odsek R 2 B1 0,27 21, ,9998 B2 0,45 35, ,9999 B2-f 0,45 35, ,0000 B3 4,20 335, ,9999 B5 1,52 121, ,9997 B6 0,35 27, ,0000 B7 0,64 25, ,9998 B9 0,05 4, ,9997 B12 0,07 5, ,9996 THFK 0,27 4, ,9997 C 20,15 806, ,9995 Primer izrisa UP za vit. B6 je prikazan na Sliki 5. Odziv (AUC) [mau] Milijoni (10 6 ) B6 y = x R² = Koncentracija [mg/l] Slika 5: Umeritvena premica za vit. B6 s podano enačbo linearne regresije in R 2. 36

53 Točnost in ponovljivost Znotraj-dnevno točnost in ponovljivost (RSD) analizne metode smo vrednotili na QC pri treh različnih koncentracijah (QCL, QCM in QCH) znotraj območja linearnosti metode, ki smo jih pripravili po postopku, opisanem v Poglavju Rezultati vrednotenja točnosti, ponovljivosti in ponovljivosti injiciranja za vodotopne vitamine so navedeni v Preglednici XIII. Vsi vitamini, z izjemo THFK pri QCL, so bili znotraj predpisane meje za točnost ( %), ponovljivost (RSD < 5 %) in ponovljivost injiciranja (RSD < 2 %). Opazili smo trend največjega odstopanja točnosti in ponovljivosti pri QCL, kjer je zaradi nižjih koncentracij posledično večja merilna negotovost. Manjša odstopanja točnosti in ponovljivosti so bila pri QCM in QCH zaradi višjih koncentracij in s tem manjših napak pri integraciji kromatografskih vrhov. Najboljša ponovljivost injiciranja je bila pri QCM. Preglednica XIII: Znotraj-dnevna točnost, ponovljivost in ponovljivost injiciranja (RSD, n = 3) analizne metode za vodotopne vitamine. Vitamin Točnost [%] Ponovljivost [%] Ponovljivost injiciranja [%] QCL QCM QCH QCL QCM QCH QCL QCM QCH B1 96,0 97,8 99,9 4,2 1,0 1,9 1,6 0,2 1,3 B2 96,4 101,7 100,0 0,2 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 B2-f 99,7 100,0 100,2 0,2 0,1 0,3 0,7 0,2 0,1 B3 97,3 104,0 100,4 2,5 1,5 0,2 1,1 0,1 0,8 B5 96,7 104,5 100,4 0,4 0,2 0,3 0,5 0,1 0,4 B6 97,1 102,0 99,9 0,5 0,1 0,1 0,2 0,1 0,4 B7 95,8 103,6 100,1 1,9 1,9 2,6 1,6 1,9 1,8 B9 91,2 103,3 100,0 1,4 2,1 0,6 1,8 1,1 1,7 B12 94,3 102,5 100,2 3,3 1,0 0,3 1,9 1,1 1,8 THFK 116,4 107,2 103,6 0,6 4,5 1,6 1,5 1,9 1,4 C 92,4 104,2 101,9 0,3 0,2 0,2 0,3 0,5 1,3 Zaključimo lahko, da metoda daje točne in ponovljive rezultate za vse obravnavane vitamine Stabilnost vzorcev Pred samo analizo vzorca je potrebno vzorec pripraviti (npr. tehtanje standarda, raztapljanje, UZ, redčenje), kar zahteva svoj čas. Medtem lahko v raztopini vitaminov pride do nestabilnosti. Zato smo preverjali stabilnost vitaminov v skladu s postopkom na treh različnih koncentracijskih nivojih kontrolnih vzorcev (Poglavje 3.3.2) znotraj 24 ur. Vzorce 37

54 smo shranjevali v vialah v avtomatskem vzorčevalniku pri 8 C in njihovo stabilnost preverjali z analizo po 12 in 24 urah. Meja sprejemljivosti je bila vsaj 90 % glede na začetno koncentracijo vitaminov. Rezultati so predstavljeni v Preglednici XIV. Preglednica XIV: Stabilnost vzorcev pri vseh treh koncentracijskih nivojih po 12 in 24 urah, izražena v odstotkih glede na začetno vrednost (n = 3). Vitamin 12 ur [%] 24 ur [%] QC L QC M QC H QC L QC M QC H B1 92,9 101,0 100,0 98,0 101,6 98,6 B2 99,5 99,7 99,9 99,5 99,6 99,9 B2-f / / / 99,2 99,4 98,9 B3 99,8 99,9 100,6 101,2 99,3 99,3 B5 94,1 96,5 97,6 97,1 101,3 101,4 B6 99,5 99,6 100,0 98,9 99,4 99,7 B7 91,1 98,2 106,9 104,9 90,6 101,7 B9 98,7 96,3 99,2 98,0 101,9 99,8 B12 101,4 98,2 100,0 97,7 98,1 101,0 THFK 35,6 52,2 74,9 0 31,8 55,7 96,4* 97,6* 101,3* / / / C 97,3 97,0 97,4 96,2 97,8 98,5 / vitamin ni bil analiziran; * vitamin je dodatno stabiliziran s topilom za stabilizacijo THFK Vsi vitamini so bili stabilni vseh 24 ur, z izjemo THFK, pri katerem je prišlo do izrazite nestabilnosti v vzorcih, pripravljenih po postopku (uporabljeno topilo 1 mm EDTA z 1 mm NaOH). Zaradi ugotovljene nestabilnosti smo postopek priprave vzorcev prilagodili z uporabo topila za stabilizacijo THFK (postopek priprave topila opisan v Poglavju 3.3.1) in validacijo za THFK ponovili. Za validacijske parametre linearnost, točnost in ponovljivost smo dobili primerljive rezultate, bistvena razlika pa je bila pri stabilnosti. Le-to smo potrdili do 12 ur, kjer je vsebnost vitamina glede na začetno vrednost na treh koncentracijskih nivojih znesla 96,4 % pri QCL, 97,6 % pri QCM in 101,3 % pri QCH. Iz rezultatov lahko sklepamo, da za večino vitaminov velja trend, da so pri nižjih koncentracijah (QCL) manj, pri višjih koncentracijah (QCH) pa bolj stabilni. V nekaterih vzorcih se je stabilnost vitaminov iz 12 na 24 ur celo izboljšala, kar obravnavamo kot eksperimentalno napako. Zaključimo lahko, da so vsi analizirani vitamini stabilni vsaj 24 ur po pripravi, le THFK je ob ustrezni stabilizaciji stabilen vsaj 12 ur. 38

55 4.2.2 VALIDACIJA ANALIZNIH METOD ZA POSAMEZNE VITAMINE Analizne metode za vrednotenje posameznih vodotopnih vitaminov smo razvili in delno validirali ter s tem ovrednotili njihove karakteristike (specifičnost, linearnost, točnost, natančnost in stabilnost vzorcev) ter potrdili, da le-te dajejo pravilne rezultate in ustrezajo svojemu namenu Specifičnost Pri vrednotenju specifičnosti smo najprej preverili vsa uporabljena topila (priprava v Poglavju 3.3.1) in razt. standardov vseh vitaminov (Poglavje 3.3.2) ter ugotovili, da ne motijo analize posameznih vrednotenih vitaminov. Dodatno smo specifičnost potrdili s stresnimi vzorci raztopin posameznih vitaminov (rezultati zbrani v Prilogi 4), kjer tudi po znatnem razpadu izbranega vitamina ne nastanejo produkti razgradnje, ki bi motili analizo. Na ta način smo potrdili specifičnost novih (kratkih) metod Linearnost Za vsak standard vitamina posebej (pripravljeni po postopku v Poglavju 3.3.3) smo na podlagi petih kalibracijskih točk in z uporabo regresije najmanjših kvadratov izrisali UP in izračunali R 2 (Preglednica XV). Korelacijski koeficienti vseh testiranih vitaminov so bili vsaj 0,999, s čimer lahko potrdimo linearnost vseh razvitih kratkih metod. Preglednica XV: Vitamini, analizirani po kratkih izokratskih metodah, s pripadajočimi umeritvenimi premicami in korelacijskimi koeficienti (R 2 ). Vitamin Naklon Odsek R 2 B ,9998 B ,9995 B2-f ,9998 B ,0000 B ,9997 B ,0000 B ,9993 B ,9997 B ,9999 THFK ,9992 C ,

56 Točnost, ponovljivost in stabilnost standardov Izračunali smo točnost, ponovljivost in stabilnost standardov po postopkih, navedenih v Poglavjih 3.4.3, in Vzorce smo pripravili po postopkih navedenih v Poglavju Vsi rezultati so zbrani v Preglednici XVI. Preglednica XVI: Rezultati točnosti, ponovljivosti in stabilnosti vzorcev na enem koncentracijskem nivoju QC M po 24 urah, izraženi v odstotkih glede na začetno vrednost (n =3) za kratke izokratske metodo. Vitamin Točnost [%] Ponovljivost, RSD [%] Stabilnost [%] B1 102,4 2,2 99,8 B2 90,1 1,4 99,0 B2-f 90,3 0,3 97,4 B3 101,6 2,3 99,4 B5 101,9 0,1 98,8 B6 98,9 3,0 98,8 B7 102,4 2,4 100,0 B9 101,3 3,3 99,4 B12 101,8 1,2 100,2 THFK 99,0 2,7 103,7 C 101,4 0,5 100,3 Iz rezultatov je razvidno, da je točnost za vse vitamine ustrezna. Ponovljivost treh paralelk, izražena v RSD, je pri vseh vitaminih pod 5 %, torej v okviru dovoljene napake. Izokratske metode za posamezne vitamine torej preverjeno dajejo točne in ponovljive rezultate. Prav tako so vitamini v vzorcih stabilni vsaj 24 ur, saj vsi ohranjajo vrednosti okrog 100 % v okviru dovoljenega odstopanja ± 10 %, tudi THFK, za pripravo katerega smo uporabili topilo za stabilizacijo THFK PRIMERJAVA GRADIENTNE IN IZOKRATSKE ANALIZNE METODE Z validacijo obeh analiznih metod (Poglavje 4.2) smo potrdili, da sta dolga gradienta in kratka izokratska metoda za vsak posamezen vitamin zamenljivi oz. alternativi v primeru analize posameznega vitamina. Prav tako smo pokazali, da z obema metodama pridobimo primerljive rezultate stabilnosti posameznih vitaminov v okviru stabilnostne študije. Največja bistvena razlika med uporabo obeh metod je v času analize; 30 minut pri dolgi gradientni in 3,2 6 minut pri kratki izokratski metodi (zgolj 3,2 min za analizo vit. C in maksimalno 6 min npr. za analizo vit. B7). Na ta način smo pri analizi posameznega vitamina povprečno prihranili 25 minut. Pri izvedenemu večjemu številu analiz, kar je značilno za 40

57 stabilnostne študije, ima ta prihranek časa še toliko večji pomen. Razlika med dolgo gradientno in kratko izokratsko metodo je tudi v enostavnejšem pregledu vrhov in prilegajočih podatkov v kromatogramu. Pri dolgi metodi poteka meritev vzorca pri večjem številu valovnih dolžinah naenkrat, pri kratkih metodah pa zgolj pri 210 nm (pri tej λ absorbirajo vsi vitamini) in tisti λ, kjer ima vitamin maksimum absorpcije (Preglednica IV). Tako je tudi z vidika analize podatkov precej hitrejša, izognemo se morebitni napaki (izris vrha vitamina pri napačni valovni dolžini) ali morda izris napačnega vrha (drug vitamin) v kromatogramu. Pri kratkih izokratskih metodah se porabi tudi precej manj MF (ena meritev porabi približno 30 ml MF) in obraba sistema UHPLC je zaradi krajšega obratovanja manjša. Pri analizi večjega števila vodotopnih vitaminov pa je uporaba dolge gradientne UHPLC metode najprimernejša in hkrati edina analizna metoda, ki nam omogoča sočasno analizo vseh vodotopnih vitaminov v tako kratkem času (30 min) (63). Zaključimo lahko, da smo dolgo gradientno analizno metodo uspešno razširili, saj smo potrdili, da z njo lahko specifično vrednotimo tudi vitamera B3-k in THFK. Dodatno smo razvili ter potrdili kratke izokratske metode. Z ustvarjeno kombinacijo analiznih metod imamo vso potrebno analitsko podporo za nadaljnjo kvantitativno vrednotenje stabilnosti vitaminov, posameznih in v zmeseh, v čim krajšem času. 4.3 VREDNOTENJE STABILNOSTI VITAMINOV V TRDNEM STANJU STRESNA ŠTUDIJA RAZVOJ IN OPTIMIZACIJA PRIPRAVE VZORCEV ZA VREDNOTENJE STABILNOSTI V TRDNEM Osnova za vrednotenje stabilnosti vitaminov v trdnem stanju je ustrezna analizna metoda, ki smo jo razvili in potrdili, da ustreza svojemu namenu. Predpogoj za uspešno izvedbo stabilnostne študije je tudi ustrezna priprava vzorca. Običajno gre za premišljeno izbiro vrste in volumna topila ter obdelave vzorca (npr. stresanje, soniciranje), ki mu sledi analiza. Večina vitaminov je dobro topna v vodi, zato nismo imeli posebnih težav pri pripravi vzorcev, njihovo stabilnost pa smo zagotovili z uporabo EDTA, ki kot stabilizator (kelator kovinskih ionov) poveča obstojnost vitaminov in s tem zagotovi, da se s pripravo raztopine (vzorec mora biti za meritev s sistemom UHPLC v obliki raztopine) ne prične tudi razpad vitamina. Izjemi sta bila vit. B7 in THFK, ki sta med testiranimi vitamini najmanj topna v vodi, zato smo zanju prilagodili postopek priprave vzorcev z izbiro ustreznejšega topila in 41

58 načina obdelave (Poglavje ). Pri testiranju topnosti vit. B7 v različnih vrstah in volumnih topila (1 mm EDTA in 1 mm EDTA z 1mM NaOH) smo ugotovili, da se 1,5 mg standarda vit. B7 raztopi v 50 ml 1 mm EDTA z 1 mm NaOH. Pri drugem topilu so bili vidni delci, kar pomeni da ni bila dosežena zadostna topnost. 1 mg standarda THFK v 5, 10 oz. 20 ml 1 mm EDTA se tudi po 30 minutah na UZ ni popolnoma raztopil. Pri raztapljanju 1 mg THFK v 10 ml 1 mm EDTA z 1 mm NaOH smo dobili bistro raztopino, torej je bila topnost THFK ustrezna. Pri postopku priprave vzorca pa je poleg topnosti bistvenega pomena tudi stabilnost preučevanega analita. Pri THFK smo namreč med validacijo dolge gradientne metode ugotovili, da je v 1 mm EDTA z 1 mm NaOH dobro topna, a ne dovolj stabilizirana. Zato smo pri izbiri topila med preiskovanimi topili vključili tudi 1 mm EDTA z dodano AK, ki stabilizira THFK. Po pregledu podatkov (Preglednica I) smo namreč ugotovili, da gre večinoma za oksidativen mehanizem razgradnje THFK, zato smo dodali AK kot antioksidant. Odločili smo se za 10 ml kombinacijo dveh topil v razmerju 9:1; večji delež topila za stabilizacijo THFK in manjši delež 1 mm EDTA z 1 mm NaOH, s katero smo dosegli ustrezno topnost in stabilizacijo THFK. Preverili smo dve različici dodatka kombinacije topil; topili smo dodali hkrati ali najprej dodali 1 mm EDTA z 1 mm NaOH, dobro pretresli in nato dodali še topilo za stabilizacijo THFK. Obe raztopini sta bili povsem bistri. Nato smo z metodo UHPLC preverili, katera različica bolje stabilizira THFK. Obe topili sta zagotavljali ustrezno stabilnost po 24 urah (v obeh primerih 105 %), zato smo se odločili za enostavnejšo izbiro hkratni dodatek obeh topil, saj je manj zamudna. Vrednotili smo tudi postopek priprave vzorcev posameznih vitaminov s preverjanjem homogenosti znotraj vzorca po postopku opisanem v Poglavju Izračunali smo točnost in RSD za vse tri paralelke vial iz prve raztopine vzorca glede na UP za posamezne vitamine (Preglednica XV). Rezultate smo zbrali v Preglednici XVII. Homogenosti znotraj vzorca, izražene kot RSD, so bile za skoraj vse vitamine pod 1 %, torej pripravljeni vzorci ustrezajo postavljenemu kriteriju (RSD < 2 %). Preglednica XVII: Rezultati preverjanja homogenosti znotraj vzorcev posameznih vitaminov, podani s povprečno vrednostjo točnosti in RSD (n = 3). Vitamin Povprečna vrednost točnosti [%] RSD [%] B1 101,9 0,6 B2 90,1 0,3 B2-f 90,1 1,1 42

59 B3 103,1 0,1 B5 101,9 0,9 B6 99,8 0,2 B7 104,6 0,1 B9 103,8 0,2 B12 101,9 0,4 THFK 100,3 0,1 C 100,9 0, VREDNOTENJE STABILNOSTI POSAMEZNIH VITAMINOV PRI POVIŠANI T IN RV Osnovni namen naloge je bil postaviti analizni postopek in ovrednotiti stabilnost vodotopnih vitaminov v trdnem stanju, kar bi služilo kot osnova za njihovo formuliranje v tablete (trdne FO). V literaturi je teh podatkov izredno malo, zato smo se sistematično lotili preučevanja stabilnosti, začenši z najbolj enostavnim sistemom posameznimi vitamini. Ker so vitamini pri sobni T v trdnem stanju bolj ali manj stabilni, smo se odločili, da bomo uporabili stresne pogoje povišano T in RV z namenom pospešitve razgradnih procesov. Študijo smo izvajali pri 60 C in 75 % RV z izpostavitvijo vzorcev v odprtih in zaprtih vsebnikih. Vzorce v vsebnikov smo pripravili po postopku, opisanem v Poglavju in jih analizirali po dveh dneh, enem tednu in treh mesecih shranjevanja v klimatski komori. Ob vsaki časovni točki smo vzorce najprej organoleptično ovrednotili, nato pa kvantitativno določili vsebnost po kratkih izokratskih metodah za posamezne vitamine (Poglavje 3.2.2), z izjemo B2-f, ki smo ga analizirali po dolgi gradientni metodi (Poglavje 3.2.1). Rezultate smo podali v % glede na pomerjeno vsebnost ob času 0 in so zbrani v Preglednici XVIII. Po dveh dneh študije so se vsebniki, ki so bili zaprti z zamaški brez navoja, zaradi ostrejših pogojev v klimatski komori odprli. Pokrovčke smo zamenjali z zamaški z navojem, ki so ustrezno tesnili do konca študije. Prve organoleptične spremembe smo opazili že po dveh dneh pri vzorcih z vit. B5, ki se je povsem zasušil na dno vsebnika. Za pripravo vzorcev za analizo smo le-tega izpraskali iz dna vsebnika in zaradi omenjene težave število paralelk omejili na dve. Po enem tednu smo opazili spremembo barve pri vit. C v zaprtem vsebniku; prvoten belkast prah se je spremenil v rahlo rumenorjavo barvo (Slika 6, srednji vsebnik). Barvna sprememba je bila tudi značilna pri vit. B9, ki se je obarval v bolj izrazito rumenooranžno barvo v obeh vsebnikih. Že predhodna zasušenost vit. B5 v obeh vsebnikih je postala po enem tednu še izrazitejša. Po treh mesecih je bila opazna barvna sprememba tudi 43

60 pri vit. B6 v zaprtem vsebniku, iz bele v nežno rjavo barvo. Zasušenost vit. B5 se je še okrepila, pri odprtem vsebniku je bila bolj izrazita, kar verjetno nakazuje na večjo občutljivost tega vitamina na prisotnost vlage. Vit. C v zaprtem vsebniku je postal še izraziteje rjavkast, pojavile so se»zažgane kepe«, ki so nam otežile tehtanje vzorca (Slika 6, desni vsebnik). Do spremembe v bež barvo je v treh mesecih prišlo tudi pri THFK v obeh vsebnikih (pri zaprtem izrazitejši temnejši odtenek). Slika 6: Vidna barvna razlika pri vit. C v odprtem (levi vsebnik) in zaprtem vsebniku (srednji vsebnik) po prvem tednu izpostavljenosti 60 C in 75 % RV. Barvna sprememba vit. C v zaprtem vsebniku po treh mesecih v izrazitejšo rjavo in pojav majhnih»zažganih kep«(desni vsebnik). Preglednica XVIII: Rezultati študije posameznih vitaminov v trdnem stanju pri 60 C in 75 % RV. Prikazani so podatki o stabilnosti vitaminov v odprtih in zaprtih vsebnikih v testiranih časovnih intervalih glede na začetno časovno točko. Vitamin Odprt vsebnik [%] Zaprt vsebnik [%] 0 2 dni 1 teden 3 meseci 0 2 dni 1 teden 3 meseci B ,8 100,6 100, ,9 99,4 100,3 B2 100 / 91,5 88,5 100 / 91,2 86,9 B2-f 100 / 96,4 70,5 100 / 85,8 60,2 B ,3 99,5 104, ,0 101,4 98,0 B ,9 105,2 45, ,4 104,7 49,7 B ,9 100,4 100, ,3 100,3 100,2 B ,7 100,7 95, ,6 101,6 97,4 B ,7 105,8 99, ,5 103,2 100,1 B ,8 101,5 91, ,0 96,5 88,8 THFK ,7 106,6 102, ,1 104,5 100,9 C ,9 / 102, ,4 / 93,7 / manjka podatek 44

61 Pri analizi stresne študije posameznih vitaminov v trdnem stanju pri povišani T in RV (Preglednica XVIII) smo ugotovili, da so nekateri vitamini zelo stabilni, saj so npr. vit. B1, B3, B6, B9 in THFK po treh mesecih ohranili nad 97 % začetne vsebnosti. Manjši upad smo zaznali (do 7 %) pri vit. B7 in C. Pri slednjem smo sicer glede na literaturne podatke pričakovali večjo nestabilnost. Do nekoliko večjih sprememb v stabilnosti je prišlo pri vit. B12 (10 %) in B2 (12 %), do izrazitih pa pri B2-f (30-40 %) in pri B5 (> 50 %). Podatki o stabilnosti vodotopnih vitaminov v trdnem stanju v literaturi so drugačni kot najbolj občutljive vitamine uvrščajo vit. B1, B9 in C. Za vit. B2 in B5 navajajo, da sta skoraj neobčutljiva na preučevana stresna dejavnika (68), za vit. B12 pa nismo zasledili podatkov o stabilnosti v trdnem stanju. Sicer pa lahko zaključimo, da so posamezni vodotopni vitamini v trdnem stanju na splošno precej neobčutljivi (z določenimi izjemami) na povišano T in RV. Če primerjamo zaprte in odprte vsebnike, ki so bili poleg povišane T izpostavljeni tudi višji RV, ugotovimo, da ni značilnega trenda v stabilnosti. Pri večini vitaminov so bile razlike v stabilnosti med shranjevanjem v obeh vsebnikih praviloma majhne (nekaj %). Do večje razlike (> 5 %) pa je prišlo pri vit. B2-f, B3 in C. V vseh treh primerih je prišlo do večjega upada stabilnosti v zaprtih vsebnikih, kar ni povsem logično, saj je bil vpliv vlage načeloma izključen. Možno je, da je kljub zatesnjenem vsebniku vlaga prehajala navznoter in reagirala z vsebino. Npr. pri vit. C v zaprtem vsebniku je prišlo ne le do intenzivnejšega razpada, temveč tudi do izrazitejše barvne spremembe v primerjavi z odprtim vsebnikom. Iz tega lahko predvidevamo, da na stabilnost nima izrazitega vpliva sočasna izpostavitev povišani T in RV. V literaturi sicer zasledimo, da je večina vitaminov manj stabilna, če so izpostavljeni hkratnemu učinku obeh zunanjih dejavnikov (73). Predvidevali smo, da bo večji upad vsebnosti vitaminov pri kombinaciji obeh zunanjih dejavnikov (odprti vsebniki), vendar te hipoteze nismo potrdili VREDNOTENJE STABILNOSTI POSAMEZNIH VITAMINOV OB IZPOSTAVITVI SVETLOBI Pomemben zunanji stresni dejavnik je tudi svetloba, ki lahko vpliva na stabilnost vitaminov pri njihovem shranjevanju. Za nekatere vitamine v raztopinah (npr. folate) je karakteristična nestabilnost ob prisotnosti svetlobe (Preglednica I). Vit. B2 pa poleg lastne nestabilnosti deluje tudi kot fotosenzitizator in pospešuje nestabilnost ostalih vitaminov v zmesi B1, B6, B7 in B12 (67). Podatkov o vplivu svetlobe na stabilnost vodotopnih vitaminov v trdnem 45

62 stanju v literaturi nismo zasledili, zato nas je zanimalo, v kolikšni meri svetloba vpliva na njihovo stabilnost v trdnem. Vzorce smo izpostavili vidni in UV svetlobi v klimatski komori s svetlobnim modulom in jih po dveh in štirih dneh organoleptično in kvantitativno ovrednotili. Vzorce smo pripravili po postopku v Poglavju in jih analizirali po kratkih izokratskih metodah (Poglavje 3.2.2), z izjemo B2-f, ki smo ga analizirali po dolgi gradientni metodi (Poglavje 3.2.1). Rezultate smo zbrali v Preglednici XIX in ugotovili, da v času študije svetloba ni imela večjega vpliva na stabilnost večine vitaminov. Ohranitev stabilnosti potrjuje tudi odsotnost organoleptičnih sprememb. Največji upad vsebnosti (med 5 in 13 %) smo zaznali pri vit. B9, B12 in C. Zanimivo je opažanje, da sta obe obliki vit. B2 ostali stabilni ves čas študije, čeprav v mnogih virih zasledimo, da je vit. B2 poleg vit. B9 najbolj občutljiv na prisotnost svetlobe (Preglednica I, Priloga 4 Preglednica XXI) (63,99,100). Preglednica XIX: Vpliv svetlobe na stabilnost posameznih vitaminov v trdnem stanju. Podatki o stabilnosti vitaminov v testiranih časovnih intervalih glede na začetno časovno točko so izraženi v %.. Vitamin 0. dan [%] 2. dan [%] 4. dan [%] B ,4 100,8 B ,0 105,1 B2-f ,6 102,0 B ,3 99,7 B ,4 102,6 B ,9 99,8 B ,5 98,2 B ,4 94,8 B ,2 89,6 THFK ,6 97,1 C ,8 87,4 Če primerjamo rezultate naše študije s podatki fotostabilnostne študije raztopin vodotopnih vitaminov, lahko zaključimo, da so posamezni vodotopni vitamini v trdnem stanju precej neobčutljivi na UV in vidno sevanje, tudi pod zelo stresnimi pogoji študije. Vsebnost vit. C, B2 in B9 v 200 mg/l razt. posameznih vitaminov je namreč že po prvem dnevu študije fotostabilnosti padla pod 2 % začetne vsebnosti vitamina (67). V naši študiji pa smo po štirih dneh zaznali največji razpad - približno 12 % pri vit. C. V prihodnje bi bilo zanimivo študijo podaljšati in preveriti občutljivost vitaminov v trdnem stanju po daljši izpostavitvi svetlobi. 46

63 Fotostabilnostne študije z obravnavo fotokemijskega obnašanja ZU so ključne za izdajo priporočil o rokovanju, pakiranju in označevanju farmacevtskih izdelkov. Kljub rezultatom, ki pričajo o dobri stabilnosti vitaminov v trdnem stanju pod svetlobnimi pogoji, je vseeno priporočljivo shranjevanje vitaminov v temnih vsebnikih iz ustreznih materialov za zaščito vitaminov pred kvarnimi učinki svetlobe (60) VREDNOTENJE STABILNOSTI ZMESI VITAMINOV PRI POVIŠANI T IN RV Vitamini v zmeseh lahko interagirajo, rezultat tega pa je lahko spremenjena stabilnost (boljša ali slabša) v primerjavi s stabilnostjo posameznih vitaminov. Sistematičnega vrednotenja stabilnosti posameznih vitaminov v prisotnosti ostalih vodotopnih vitaminov v trdnem stanju v literaturi nismo zasledili. Tovrstna študija ima pa praktičen pomen, saj so vitamini v izdelkih večinoma prisotni v kombinacijah. Zato smo v naslednjem koraku našega eksperimentalnega dela izvedli vrednotenje stabilnosti vitaminov v zmeseh. Pripravili smo dve različici zmesi vitaminov po postopkih opisanih v Poglavju V prvi so bili vitamini prisotni v enakih razmerjih, v drugi pa so bili deleži posameznih vitaminov prilagojeni glede na njihove RDA vrednosti. Za osnovo smo vzeli 1 mg vit. B7 in glede na njegovo maso prilagodili vse ostale mase vitaminov z upoštevanjem RDA razmerja (le za B12 smo upoštevali 20-krat višjo maso). S to različico smo se približali realni situaciji v izdelkih, kjer so običajno vsebnosti vitaminov prilagojene na RDA vrednosti. Poleg vpliva različnih deležev vitaminov v zmesi (RDA in enakomerni deleži) na stabilnost posameznih vitaminov smo ugotavljali tudi vpliv povišane T in RV na stabilnost posameznih vitaminov v zmesi. Dodatno smo s primerjavo rezultatov študije v zmeseh in študije posameznih vitaminov pri enakih pogojih želeli ovrednotiti, kako prisotnost ostalih vitaminov vpliva na stabilnost posameznega vitamina. Pripravljene zmesi smo za en teden izpostavili sobni T kontrola (zaprt vsebnik), 60 C in 60 % RV (odprt in zaprt vsebnik) in 80 C (zaprt vsebnik). Ob času 0, po treh dneh in po enem tednu smo vzorce organoleptično ovrednotili, jih pripravili po postopku v Poglavju in jih kvantitativno ovrednotili po dolgi gradientni metodi (Poglavje 3.2.1). Pri preverjanju organoleptičnih sprememb smo že po dveh dneh študije zaznali, da je nastala velika vidna sprememba pri vzorcih z enakim razmerjem vitaminov v zmesi izpostavljeni 60 C in 60 % RV (odprt in zaprt vsebnik), kjer je bila vsebina vzorca zažgana (temno rjave barve) in lepljiva (smolnata tekstura), podobno kot je razvidno iz Slike 7b. Po treh dneh študije je prišlo do podobnih opažanj pri vzorcih z RDA razmerjem vitaminov v zmesi na 47

64 60 C in 60 % RV (odprt in zaprt vsebnik). Medtem ko sta obe zmesi na 80 C ostali praškasti in brez izrazite barvne spremembe, morda le za odtenek temnejše barve v primerjavi s kontrolo na sobni T. Iz tega sklepamo, da je glavni vzrok za nestabilnost oz. vidne spremembe vzorcev prisotnost vlage, saj v klimatski komori pri shranjevanju na 80 C in nizki nekontrolirani RV v zaprtem vsebniku dodatna vlaga ni bila na razpolago in tudi ni bilo vidnih sprememb v vzorcih. Za zaprta vsebnika na 60 C pa predvidevamo, da del prisotne 60 % RV v klimatski komori kljub tesnitvi vsebnikov prodira skozi in prihaja v stik z vzorcem. To bi lahko pojasnilo razliko v zaprtih vsebnikih vzorcev na 60 C v klimatski komori s prisotno vlago v primerjavi z zaprtimi vsebniki na 80 C v klimatski komori z nizko RV. S tem poskusom smo pokazali, kako pomembna je ustrezna izbira ovojnine pri zaščiti izdelka pred zunanjimi dejavniki. Z namenom potrditve opaženih organoleptičnih sprememb smo ponovno pripravili zmesi vitaminov (enakomerno razmerje in RDA razmerje) v steklenih vsebnikih, ki smo jih teden dni shranili pri nižji T in višji RV v primerjavi s prejšnjo študijo. Izpostavili smo jih trem različnim stresnim pogojem: 40 C in 75 % RV (odprt vsebnik), 60 C in 75 % RV (odprt vsebnik), 60 C in nekontrolirana nizka RV (zaprt vsebnik) in dnevno spremljali organoleptične spremembe v izpostavljenih vzorcih. Oba vzorca zmesi v zaprtih vsebnikih pri stresnih pogojih 60 C in nekontrolirani nizki RV sta ostala vizualno nespremenjena (Slika 7a) v primerjavi s kontrolnima vzorcema zmesi, ki sta bila shranjevana v zaprtih vsebnikih pri sobni T. Ta organoleptična opažanja so popolnoma drugačna od opazovanih vidnih sprememb vzorcev, izpostavljenih enaki T in 60 % RV iz prejšnjega poskusa. To dokazuje, da ima vlaga velik vpliv na stabilnost vitaminov (tudi v zaprtem vsebniku). Stresna vzorca obeh zmesi vitaminov, izpostavljena 60 C in 75 % RV, sta bila že po dveh dneh povsem ožgana oz. zasmojena (črne barve), vendar s še vidnimi rahlo zlepljenimi delci praškov (Slika 7b). Po sedmih dneh pa sta vzorca postala povsem smoljnata, delci pa med seboj zlepljeni. Intenziteta ožganosti zmesi vitaminov v enakem razmerju je bila izrazitejša v primerjavi z RDA zmesjo vitaminov. Do podobne barvne spremembe je prišlo pri stresnih vzorcih izpostavljenih 40 C in 75 % RV (Slika 7c), vendar nekoliko kasneje, saj so bili pogoji manj ostri (nižja T). RDA zmes vitaminov je prešla v oranžno-rjavkasto barvo po sedmih dnevih študije, zmes vitaminov z enakimi deleži pa je bila povsem ožgana že po treh dneh. Za ožgane, smoljnate vzorce sklepamo, da je največ k spremembi barve in teksture prispeval vit. C, za katerega je znano, da se pri povišani T in vlagi pretvarja v rjavkasto barvo (72 75). 48

65 a) b) c) Slika 7: Na vseh treh slikah so prikazani vzorci po zaključku enotedenske stresne študije. Stresna vzorca zmesi vitaminov (RDA razmerje in enako razmerje vitaminov 1:1) pri 60 C in nekontrolirani nizki RV sta ohranila prvotne organoleptične lastnosti ves čas študije (a). Stresna vzorca zmesi vitaminov (RDA razmerje in enako razmerje vitaminov 1:1) pri 60 C in 75 % RV sta bila že po dveh dneh povsem ožgana, po tednu dni pa smoljnata z zlepljenimi delci (b). Stresni vzorec enakega razmerja zmesi vitaminov pri 40 C in 75 % RV je bil povsem ožgan že po treh dneh, stresni vzorec RDA razmerja zmesi vitaminov pri 40 C in 75 % RV pa rahlo ožgan po tednu dni izpostavljenosti stresnim pogojem (c). Zbrani rezultati organoleptičnega vrednotenja nakazujejo na izrazit vpliv vlage na stabilnost zmesi vitaminov. V klimatski komori z nekontrolirano vlago (nizka RV) so vzorci ostali nespremenjeni in sklepamo, da se je tudi stabilnost vitaminov ohranila. Medtem ko je v klimatski komori s 75 % RV prišlo do zelo hitrih vizualnih sprememb stresnih vzorcev. Tudi T ima vpliv na stabilnost vzorcev, ampak izrazito manjši kot povišana RV. Pri 40 C so namreč vizualne spremembe nastopile nekoliko kasneje kot pri 60 C. Očitne so tudi razlike med obema različicama zmesi vitaminov. Spremembe pri stresnih vzorcih na osnovi RDA razmerja so se pojavile kasneje, torej je ta zmes vitaminov nekoliko bolj odporna na testirane stresne pogoje. Vzrok za to je morda večji delež vit. C, ki je znan kot dober stabilizator za ostale vitamine (65,67). Stabilnost vodotopnih vitaminov smo tudi kvantitativno vrednotili v trdnem stanju pri sobni T kontrola (zaprt vsebnik), 60 C in 60 % RV (odprt in zaprt vsebnik) in 80 C in nekontrolirani nizki RV (zaprt vsebnik). V začetni točki smo za obe zmesi (RDA in enako razmerje vitaminov) vsak vzorec pripravili v šestih paralelkah. Po pridobljenih prvih rezultatih smo ugotovili, da z informativnega in časovnega vidika ni smiselno pripravljati vzporednih paralelk z dvema različnima vrstama topil. Ob času 0 smo namreč izvedli analizo vzorcev v treh paralelkah z 1 mm EDTA in v treh paralelkah z 1 mm EDTA z 1 mm NaOH. Topilo z dodanim NaOH smo uporabili predvsem zaradi vit. B7, za katerega smo predvidevali, da se v EDTA ne bo povsem raztopil. Pri pregledu rezultatov smo ugotovili, da topilo 1 mm EDTA z 1 mm NaOH ne doprinese dodatnih podatkov oz. informacij, saj je bila ugotovljena vsebnost vit. B7 pri uporabi obeh različic topil podobna, brez značilnih 49