Microsoft Word - Magistrsko delo 1 (Samodejno shranjeno)

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA POUČEVANJE - PREDMETNO POUČEVANJE, BIOLOGIJA KEMIJA MARINKA KRŽIČ LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE SVINCA PRI RANEM MOŠNJAKU (Noccaea praecox Wulf) MAGISTRSKO DELO LJUBLJANA, 2018

2 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA POUČEVANJE - PREDMETNO POUČEVANJE, BIOLOGIJA - KEMIJA MARINKA KRŽIČ LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE SVINCA PRI RANEM MOŠNJAKU (Noccaea praecox Wulf) MAGISTRSKO DELO LOCALIZATION AND LIGAND ENVIRONMENT OF LEAD IN PENNYCRESS (Noccaea praecox Wulf) MASTERS THESIS Mentorica: PROF. DR. KATARINA VOGEL-MIKUŠ Somentorica: PROF. DR. MATEJA GERM LJUBLJANA, 2018

3 Magistrsko delo je zaključek magistrskega študija na Pedagoški fakulteti, smer Poučevanje- Predmetno poučevanje, Biologija in kemija. Delo je bilo opravljeno v prostorih Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani, na Oddelku za biologijo na katedri za botaniko in fiziologijo rastlin. Študijska komisija je potrdila predlagano temo magistrske naloge z naslovom Lokalizacija in vezavne oblike svinca pri ranem mošnjaku (Noccaea praecox Wulf). Za mentorico je bila imenovana prof. dr. Katarina Vogel-Mikuš, za somentorico pa prof. dr. Mateja Germ. Komisija za oceno in zagovor: Predsednica: prof. dr. Alenka Gaberščik Članica: prof. dr. Marjana Regvar Mentorica: prof. dr. Katarina Vogel-Mikuš Somentorica: prof. dr. Mateja Germ Datuma zagovora: Magistrsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Podpisana dovoljujem objavo svoje magistrske naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Pedagoške fakultete. Izjavljam, da je oddano delo v elektronski obliki identično tiskanemu. Marinka Kržič i

4 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Mn DK UDK KG svinec, rani mošnjak, Noccaea praecox Wulf, lokalizacija svinca, vezavne oblike svinca AV KRŽIČ, Marinka, prof. bio. in kem. (UN) SA VOGEL-MIKUŠ Katarina (mentor), GERM Mateja (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta LI 2018 IN LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE SVINCA PRI RANEM MOŠNJAKU (Noccaea praecox Wulf) TD Magistrsko delo OP XI, 61 str., 2 pregl., 19 sl., 112 vir. IJ sl JI sl/en AI Svinec (Pb) se naravno pojavlja znotraj zemeljske skorje, v zadnjem času pa se je na industrijskih območjih njegova koncentracija v zgornjih plasteh tal povečala. V vodi je slabo topen, v tleh pa se veže na organske ali koloidne snovi. Je zelo strupen in v rastlinah nima poznane biološke vloge. Da bi se rastline ubranile škodljivih učinkov Pb, so razvile različne mehanizme razstrupljanja in tolerance. V magistrskem delu smo preučili vpliv različnih koncentracij Pb na biokemijske in fiziološke lastnosti ranega mošnjaka ter lokalizacijo in vezavne oblike Pb v tkivih. Rastline, ki so rasle na hidroponiki, smo izpostavili različnim koncentracijam Pb, uporabili smo tudi kontrolne rastline, ki niso bile izpostavljene Pb. Med poskusom smo merili fotokemično učinkovitost fotosistema II (FU FS II). Na koncu poskusa smo stehtali svežo in suho maso rastlin in pripravili različne vzorce, v katerih smo določali fotosintezna barvila, oksidativni stres, privzem, prenos in porazdelitev hranilnih snovi, lokalizacijo Pb z metodo LA-ICP-MS in mikro.pixe ter vezavne oblike Pb z metodo Pb-L3 XANES. Ugotovili smo, da visoke koncentracije Pb (100 mg/l) povzročajo motnje v rasti in zmanjšajo tvorbo suhe mase, zavirajo sintezo klorofila a in b ter karotenoidov in negativno vplivajo na privzem in porazdelitev nekaterih elementov. Ugotovili smo tudi, da fotosintezni sistem ni bil prizadet in da nizke koncentracije Pb pozitivno vplivajo na FU FS II, sintezo klorofilov in karotenoidov. Oksidativne poškodbe kontrolnih rastlin so bile podobne poškodbam pri visokih koncentracijah Pb. Svinec se je kopičil večinoma v povrhnjici, vezal pa se je na kisikove in fosfatne ligande. Delo bo pripomoglo k razumevanju različnih mehanizmov tolerance ranega mošnjaka na Pb in nadaljnjemu preučevanju njegove lokalizacije ter vezavnih oblik. ii

5 KEY WORDS DOCUMENTATION DN Mn DC UDK CX lead, pennycress, Noccaea praecox Wulf, localization of lead, ligand environment of lead AU KRŽIČ, Marinka AA VOGEL-MIKUŠ Katarina (supervisor), GERM Mateja (co-supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotechnical Faculty PY 2018 TI LOCALIZATION AND LIGAND ENVIRONMENT OF LEAD IN PENNYCRESS (Noccaea praecox Wulf) DT M. Sc. Thesis NO XI, 61 p., 2 tab., 19 fig., 112 ref. LA sl AL sl/en AB Lead (Pb) occurs naturally within the earth's crust, but recently, in industrial areas, its concentration in the upper soil layers increased. It is poorly soluble in water and it is bound to organic or colloidal material in the soil. It is very toxic and has unknown biological function in plants. In order to protect from harmful effects of Pb, plants developed various mechanisms of detoxification and tolerance. In the master's thesis, the influence of various concentrations of Pb on the biochemical and physiological properties of pennycress, and the localization and ligand environment of Pb in tissues, were studied. Plants grown on hydroponics were exposed to various concentrations of Pb, the control plants were not exposed to Pb. During the experiment, we measured photochemical effect of photosystem II (FU FS II). At the end of the experiment, we weighed the fresh and dry plants mass and prepared various samples for the determination of photosynthetic pigments, oxidative stress, absorption, mobility and distribution of nutrients, Pb localization using LA-ICP-MS and micro-pixe method, ligand environment was determined using Pb-L3 XANES method. We have established that high concentrations of Pb (100 mg/l) cause disturbances in growth and reduce the formation of dry mass, inhibit the synthesis of chlorophyll a, b and carotenoids and negatively effect on absorption and distribution of certain elements. The photosynthesis system was not affected and low concentrations of Pb had a positive effect on FU FS II, chlorophylls and carotenoids synthesis. The oxidative damage of the control plants was similar to damage at high concentrations of Pb. Lead accumulated mainly in the epidermis, bound to oxygen and phosphate ligands. This work will help to understand the various mechanisms of Pb tolerance in pennycress and further study of its localization and binding forms. iii

6 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... ii KEY WORDS DOCUMENTATION... iii KAZALO PREGLEDNIC... vii KAZALO SLIK... viii OKRAJŠAVE IN SIMBOLI... x 1. UVOD CILJI RAZISKAVE RAZISKOVALNA VPRAŠANJA IN HIPOTEZE PREGLED OBJAV AKUMULACIJSKE IN HIPERAKUMULACIJSKE RASTLINE TOLERANČNI MEHANIZMI RASTLIN MEHANIZMI TOLERANCE NA SVINEC RANI MOŠNJAK (Noccaea praecox Wulf) Hiperakumulacijske sposobnosti N. praecox Wulf SVINEC Fizikalne in kemijske lastnosti svinca Svinec v okolju Privzem in prenos svinca pri rastlinah Lokalizacija svinca v rastlinah Strupenost svinca PREUČEVANJE STRUPENOSTI SVINCA PRI RASTLINAH Metode za določanje skupnih koncentracij elementov v rastlinskih organih Metode za določanje porazdeljevanja elementov na tkivnem in celičnem nivoju Metode za določanje vezavnih oblik na tkivnem in celičnem nivoju MATERIALI IN METODE VZGOJA RASTLIN Vzgoja rastlin iz semena Namestitev v hidroponsko raztopino in rastni pogoji DOLOČANJE RASNIH PARAMETROV IN PRIPRAVA RASTLINSKEGA MATERIALA ZA NADALJNE ANALIZE iv

7 3.2.1 Priprava liofiliziranih rezin za lokalizacijo kovin v rastlinskih tkivih Priprava izbranih listov za določanje porazdelitve elementov Določanje vezavnih oblik svinca MERITVE Meritve fotokemične učinkovitosti fotosistema II Določanje koncentracije in vsebnosti klorofilov in karotenoidov Določanje oksidativnega stresa METODE ZA DOLOČANJE KONCENTRACIJE, PORAZDELITVE IN VEZAVNIH OBLIK ELEMENTOV NA ORGANSKEM, TKIVNEM IN CELIČNEM NIVOJU Metoda rentgenske fluorescenčne spektrometrije (XRF) Metoda protonsko inducirane emisije rentgenskih žarkov s fokusiranim žarkom (mikro-pixe) Metoda laserske ablacije z induktivno sklopljeno plazmo masna spektrometrija (LA-ICP-MS) Metoda rentgenske absorpcijske spektroskopije (XAS in XANES/Pb-L3 XANES) Metoda mikro rentgenske florescenčne spektrometrije (micro-xrf, µxrf) MORFOLOGIJA RASTLINSKIH TKIV Svetlobna mikroskopija STATISTIČNA OBDELAVA IN ANALIZA PODATKOV REZULTATI FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FOTOSISTEMA II SVEŽA IN SUHA MASA KORENIN IN POGANJKOV FOTOSINTEZNA BARVILA KONCENTRACIJA SVINCA, MAKRO IN MIKROELEMENTOV V POGANJKIH Koncentracija Pb Koncentracija makroelementov Koncentracija mikroelementov OKSIDATIVNI STRES (LIPIDNA PEROKSIDACIJA) LOKALIZACIJA SVINCA NA TKIVNEM NIVOJU Lokalizacija Pb in Ca na prečnih prerezih listov Lokalizacija Pb na prečnih prerezih listov in pecljev v

8 4.7 PORAZDELITEV ELEMENTOV NA ORGANSKEM NIVOJU VEZAVNE OBLIKE SVINCA V KORENINAH IN LISTIH Z METODO RENTGENSKE ABSORPCIJSKE SPEKTROMETRIJE RAZPRAVA FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FOTOSISTEMA II SVEŽA IN SUHA MASA KORENIN IN POGANJKOV FOTOSINTEZNA BARVILA PRIVZEM SVINCA, MAKRO IN MIKROELEMENTOV OKSIDATIVNI STRES (LIPIDNA PEROKSIDACIJA) LOKALIZACIJA SVINCA NA TKIVNEM NIVOJU Lokalizacija Pb in Ca na prečnih prerezih listov Lokalizacija Pb na prečnih prerezih listov in pecljev PORAZDELITEV ELEMENTOV NA ORGANSKEM NIVOJU VEZAVNE OBLIKE SVINCA V KORENINAH IN LISTIH Z METODO RENTGENSKE ABSORPCIJSKE SPEKTROMETRIJE SKLEPI LITERATURA vi

9 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Prirejena hidroponska raztopina (Krämer in sod., 1997), ph=6, Preglednica 2: Tip, število in razdalja med Pb in sosednjimi atomi v 1. in 2. lupini vii

10 KAZALO SLIK Slika 1: Rani mošnjak Noccaea praecox Wulf (Botanični vrt Univerze v Ljubljani, 2018) 5 Slika 2: Vzorci različnih koncentracij pripravljeni za nadaljnje merjenje absorpcije pri 647 nm, 664 nm in 470 nm (foto: Marinka Kržič) Slika 3: Vzorci z dodatkom TBA pripravljeni za merjene absorbance in določanje lipidne peroksidacije (foto: Marinka Kržič) Slika 4: Vzorci brez dodane TBA pripravljeni za merjene absorbance in določanje lipidne peroksidacije (foto: Marinka Kržič) Slika 5: Tabletke, stisnjene s hidravlično stiskalnico pripravljene za meritve prisotnosti elementov (foto: Marinka Kržič) Slika 6: Fotokemična učinkovitost FS II pri rastlinah pred poskusom (c*) in različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n= ). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 7: Sveža masa (g) poganjkov (SvMP) in korenin (SvMK) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=7-12). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 8: Suha masa (g) poganjkov (SMP) in korenin (SMK) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=7-12). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 9: Vsebnost vode (%) v poganjkih (VODAP) in koreninah (VODAK) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=7-12). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 10: Vsebnost klorofilov (mg/g) in koncentracija karotenoidov (µmol/l) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 11: Koncentracija (mg/kg SM) Pb v poganjkih pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=3-4). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 12: Koncentracija (mg/kg SM) makroelementov (P, S, Ca, K) v poganjkih pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=3-4). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) viii

11 Slika 13: Koncentracija (mg/kg SM) mikroelementov (Mn, Fe in Zn) v poganjkih pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=3-4). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 14: MDA ekvivalent v koreninah in poganjkih rastlin izpostavljenim različnim koncentracijam Pb (povprečje ± standardna napaka, n=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05) Slika 15: a-d) Mapa lokalizacije Pb (red/rdeč) in Ca (blue/moder) (a-d) posnete z metodo LA-ICP-MS na prečnem prerezu listov ranega mošnjaka pri različni izpostavljenosti Pb (mg/l). Barvna lestvica je podana v µg/g Slika 16:a-i) Slike prečnih prerezov listnih pecljev posnete s svetlobnim mikroskopom (ac) in ionsko presevno mikroskopijo (STIM) (d-f) ter kvantitativne elementarne mape (g-i) izbranih koncentracij Pb (mg/l). Koncentracijska skala je logaritemska v µg/g Slika 17:a-s) Slike prečnih prerezov listov posnete s svetlobnim mikroskopom (a-f) in ionsko presevno mikroskopijo (STIM) (g-l) ter kvantitativne elementarne mape (m-s) Pb (mg/l). Koncentracijska skala je logaritemska v µg/g Slika 18: Elementarne mape posnete na listih kontrolnih rastlin in na listih rastlin izpostavljenim različnim koncentracijam Pb, opravljene z 2D XRF-om Slika 19: Fourierjeva transformacija Pb-L3 EXAFS spektrov ix

12 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ABA abscizinska kislina Abs absorbanca ADP adenozin difosfat AM arbuskularna mikoriza ATP adenozin trifosfat Ca, Ca 2+ kalcij, kalcijev (II) ion Ca(NO3)2 4H2O kalcijev nitrat tetrahidrat Cd kadmij Chl a klorofil a Chl b klorofil b Co kobalt Cu, Cu 2+ baker, bakrov (II) ion CuSO4 5H2O bakrov(ii) sulfat pentahidrat DNA deoksiribonukleinska kislina EDTA etilendiamintetraocetna kislina EXAFS razširjena rentgenska absorpcija finih struktur (angl. extended X- ray absorption fine structure) Fe2(C4H4O6)3 železov(iii) tartarat FU FS II fotokemična učinkovitost fotosistema II H3BO3 borova kislina Hg živo srebro K + kalijev (I) ion KNO3 kalijev nitrat LA-ICP-MS laserska ablacija z induktivno sklopljeno plazmo masna spektrometrija (angl. laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry) MDA malondialdehid Mg, Mg 2+ magnezij, magnezijev (II) ion MgSO4 7H2O magnezijev sulfat heptahidrat mikro-pixe mikro protonsko inducirana emisija rentgenskih žarkov z visokoenergijskim fokusiranim žarkom (angl. particle induced micro-x-ray fluorescence emission) mikro-xrf mikro rentgenska florescenčna spektrometrija (angl. micro-x-ray fluorescence spectrometry) Mn, Mn 2+ mangan, manganov (II) ion MnCl2 4H2O manganov(ii) klorid tetrahidrat Na2MoO4 2H2O natrijev molibdat dihidrat NH4 + amonijev ion NH4H2PO4 amonijev dihidrogen fosfat x

13 Ni Pb, Pb 2+ RF RKS RNA SM STIM SvM TBA Zn, Zn 2+ ZnSO4 7H2O XANES XAS XRF nikelj svinec, svinčev (II) ion rentgenska fluorescenca reaktivne kisikove spojine ribonukleinska kislina suha masa ionska presevna mikroskopija (angl. scanning transmission ion microscopy) sveža masa tiobarbiturna kislina cink, cinkov (II) ion cinkov sulfat heptahidrat bližnja struktura rentgenskih absorpcijskih robov (angl. X-ray absorption near-edge structure) rentgenska absorpcijska spektroskopija (angl. X-ray absorption spectroscopy) rentgenska fluorescenčna spektrometrija (angl. X-ray fluorescence spectrometry) xi

14 1. UVOD Tla predstavljajo površinski del litosfere in jih zaradi počasnega nastajanja ter obnavljanja uvrščamo med tako imenovane neobnovljive vire. Izpostavljena so številnim nevarnostim, ki so lahko naravnega ali antropogenega izvora (Zupan in sod., 2008). Nevarnost za tla predstavlja tudi onesnaženost s kovinami, ki je eden izmed najbolj perečih okoljskih težav, saj negativno vplivajo na rast rastlin in talno mikrofloro (Tangahu in sod., 2011). Kovine, ki najpogosteje onesnažujejo okolje so baker, kadmij, krom, svinec, cink in živo srebro (Lasat, 2000). Nekatere škodljive kovine kot so Co, Cd in Pb se lahko kopičijo v živih organizmih in povzročajo številne motnje in bolezni (Tangahu in sod., 2011). Rastline iz tal privzemajo tako esencialne elemente (Zn, Cu, Mn, Ni, Co), kot tiste z neznano biološko funkcijo (Cd, Pb, Hg) (Gaur in Adholeya, 2004). Nekatere rastlinske vrste so sposobne pospešeno privzemati kovine (tudi strupene) in jih nato kopičiti v svojih tkivih, zato so postale zanimive za uporabo v fitoremediaciji in za študije mehanizmov privzema, translokacije in akumulacije strupenih kovin. Svinec je potencialno strupena kovina, ki se akumulira v zgornjih plasteh prsti in je izredno nemobilen (Tangahu in sod., 2011). Čeprav je za rastline strupen, so nekatere rastlinske vrste sposobne kopičiti povečane količine Pb v svojih koreninah in poganjkih. Do sedaj poznamo dve rastlinski vrsti iz rodu Noccaea, ki sta sposobni privzemati Pb. V Sloveniji uspeva vrsta Noccaea praecox Wulf, ki v svojih poganjkih kopiči povečane koncentracije Pb (Vogel- Mikuš in sod., 2005), na Južnem Koroškem (Avstrija) pa uspeva Noccaea rotundifolium podvrsta cepaeiffolium, ki hiperakumulira Pb (Brooks, 1998). Znano je, da ima Pb različne učinke na morfološke, fiziološke in biokemične značilnosti rastline. Rastline, kot je N. praecox, so se sposobne z različnimi mehanizmi razstrupljanja in tolerance izogniti oziroma omejiti strupene učinke Pb. Pretekle raziskave izvedene na hiperakumulacijski vrsti N. praecox Wulf so bile usmerjene predvsem na raziskovanje mehanizmov akumulacije in tolerance na kovine na tkivnem nivoju, s poudarkom na Cd in Zn, raziskave pa so bile opravljene na rastlinah nabranih v naravnem okolju. Dandanes imamo na voljo mnogo različnih metod, ki nam omogočajo preučevanje vpliva strupenosti svinca na rastline. Poleg tega poznamo zelo občutljive metode, ki nam omogočajo določanje vsebnosti, porazdeljevanja in vezavnih oblik na tkivnem, celičnem in subceličnem nivoju. 1

15 1.1 CILJI RAZISKAVE Ker so lokalizacija Pb in njegove vezavne oblike v ranem mošnjaku (Noccaea praecox Wulf) le malo raziskane, je cilj magistrskega dela s pomočjo uporabe različnih eksperimentalnih metod določiti lokalizacijo Pb v listih ranega mošnjaka na tkivnem nivoju in ugotoviti glavne vezavne oblike Pb v listih in koreninah. S tem bomo spoznali različne mehanizme tolerance ranega mošnjaka na Pb in tako lažje razumeli oziroma razložili zakaj lahko rani mošnjak uspeva na tleh onesnaženih s povečanimi koncentracijami Pb. 1.2 RAZISKOVALNA VPRAŠANJA IN HIPOTEZE RAZISKOVALNA VPRAŠANJA: V katerih listnih tkivih se bo kopičil svinec? Na katere ligande se bo vezal svinec v tkivih ranega mošnjaka? HIPOTEZE: Predvidevamo, da se bo največ svinca kopičilo v povrhnjici (epidermisu) lista. Predvidevamo, da se bo svinec v tkivih ranega mošnjaka vezal predvsem na kisikove ligande (O-ligandi) prisotne v celični steni in vakuoli. 2

16 2. PREGLED OBJAV 2.1 AKUMULACIJSKE IN HIPERAKUMULACIJSKE RASTLINE Rastline, ki so sposobne pospešeno privzemati kovine iz tal v korenine in jih nato transportirati v nadzemne dele, kjer se kopičijo, imenujemo akumulacijske vrste (Baker, 1981). Neakumulacijske rastline imajo koncentracijsko razmerje kovin med poganjki in koreninami <1 (translokacijski faktor, Baker, 1981), akumulacijske rastline pa >1 (Baker, 1981). Nekateri novejši avtorji v splošnem trdijo, da so rastline, ki imajo translokacijski faktor >1 hiperakumulatorji (Salido in sod., 2003). Takšne rastline lahko privzemajo kovinske ione do več tisoč mg/kg (Tangahu, 2011). Akumulacijske vrste lahko koncentrirajo kovine kot so Pb, Cd, Zn, Mn, Ni, Co do 100 ali 1000-krat več kot neakumulacijske vrste (Erdei in sod., 2005). Akumulacijske in hiperakumulacijske rastline rastejo počasi in imajo nizko biomaso, medtem ko imajo nehiperakumulacijske rastline visoko biomaso, nimajo pa sposobnosti kopičenja povečanih koncentracij kovin (Gupta in sod., 2013). Mejna vrednost, ki določa hiperakumulacijo rastlin (suha teža poganjkov) je za Cd 100 mg/kg, za Zn mg/kg in za Pb 1000 mg/kg (Reeves in Baker, 2000). Do zdaj je bilo raziskanih že kar nekaj rastlinskih vrst, ki hiperakumulirajo kovine, med njimi so številne, ki pripadajo rodu Noccaea (včasih rod Thlaspi). Za Noccaea caerulescenc je znano, da hiperakumulira Zn/Cd (Baker in sod., 1994), Noccaea rotundifolium podvrsta cepaeiffolium hiperakumulira Pb (Brooks, 1998), N. goesingense hiperakumulira Cd (Lombi in sod., 2000; Vogel-Mikuš in sod., 2005) in N. praecox Wulf hiperakumulira Zn (Reeves in Brooks, 1983) ter Cd (Lombi in sod., 2000; Vogel-Mikuš in sod., 2005). Za N. praecox Wulf so Vogel-Mikuš in sod. (2005) ugotovili, da v naravnem okolju v poganjkih kopiči tudi povečane koncentracije Pb. Tangahu in sod. (2011) navajajo kar nekaj rastlinskih vrst iz rodu Brassica, ki v svojem tkivu kopičijo več kot 50 mg Pb/g suhe mase. Brassica juncea (rjava gorčica), lahko v določenih razmerah, v poganjkih kopiči 1,5% Pb (Kumar in sod., 1995). Rastline, ki so sposobne privzemati svinec in/ali druge kovine iz tal oziroma vode in jih nato kopičiti v svojih tkivih, so postale v sedanjih študijah ključne za poznavanje fitoremediacije. Pri fitoremediaciji ali bioremediaciji gre za reševanje okoljskih problemov z uporabo rastlin, ki v svojih tkivih kopičijo kovine in tako zmanjšujejo oziroma ublažijo negativne vplive strupenih kovin na okolje (Gupta in sod., 2013). 3

17 2.2 TOLERANČNI MEHANIZMI RASTLIN Baker (1981) je predlagal dve osnovni strategiji o privzemu in toleranci rastlin na kovine. Prva strategija opisuje izključevalske rastlinske vrste, druga strategija pa akumulacijske rastlinske vrste. Izključevalci so sposobni ob konstantnih nizkih koncentracijah kovin v tleh preprečiti prenos le teh v občutljive nadzemne dele, vse dokler ni dosežena kritična koncentracija kovin v tleh, ko mehanizmi izključevanja popustijo in je prenos kovin v rastlinska tkiva neomejen. Za akumulacijske vrste velja, da so sposobne pospešeno privzemati kovine prek celotnega razpona talne koncentracije in jih nato prenesti prek korenin ter ksilema v nadzemne dele, kjer se nalagajo. Tudi Berry (1986) je predlagal tri osnovne strategije odgovora rastlin na škodljive kovine: (1) izogibanje, (2) razstrupljanje in (3) biokemijska toleranca, od katerih vsaka na različne načine vpliva na koncentracijo kovin v tkivih. Različni odgovori celic na škodljive kovine zajemajo izključevanje, mehanizme razstrupljanja in nespecifične obrambne sisteme (Berry, 1986). 2.3 MEHANIZMI TOLERANCE NA SVINEC Svinec je za rastline neesencialen element (Arazi in sod., 1999), ki v rastlinah nima znane biološke vloge (Gaur in Adholeya, 2004) in je zelo strupen (Arazi in sod., 1999). Na strupene oziroma škodljive učinke Pb se rastline različno odzivajo, odziv rastlin na Pb pa je odvisen tudi od koncentracije kovine, rastlinske vrste in razmer, v katerih so rastline izpostavljene škodljivi kovini. Da bi se rastline ubranile škodljivim učinkom svinca, ga vežejo na površino korenin, na celično steno, selektivno privzemajo kovine in sprožijo delovanje antioksidantov (Pourrut in sod., 2011). Najpomembnejši rastlinski mehanizmi razstrupljanja Pb so: vezava talnega Pb na karboksilne skupine uronične kisline, kar omeji njegov privzem v korenine (Morel in sod., 1986), združevanje Pb s pektinskimi karboksilnimi skupinami v celični steni zmanjša transport Pb prek apoplasta (Meyers in sod., 2008), izločanje kovinskih ionov v zunajcelične prostore s transportnimi proteini (Meyers in sod., 2008), vezava raztopljenega Pb v citoplazmi s fitokelatini (peptidi), s čimer se zmanjša prenos Pb v vakuole in kloroplaste (Jiang in Liu, 2010), vezava Pb v vakuoli v obliki kompleksov (Wierzbica in Antosiewicz, 1993), zaustavitev Pb, vezanega na določene organske molekule, v veziklih endoplazmatskega retikuluma, diktiosomnih vezikli in plazmotubulih (Pourrut in sod., 2011), zaviranje oksidativnega stresa z atioksidantom glutationom (Liu in sod, 2009), 4

18 povečana sinteza nekaterih antioksidantnih encimov (superoksid dismutaza, katalaza, peroksidaza ), ki ščitijo rastlino pred oksidativnim stresom (Pourrut in sod., 2011). Nekateri avtorji omenjajo visoke koncentracije kalcija v mezofilu rastline, ki naj bi imel pomembno vlogo pri zaščiti fotosintezno aktivnih tkiv pred strupenimi kovinami, tako da preprečuje kopičenje velikih količin kovin v fotosintezno aktivnih celicah in kloroplastih (Antosiewicz, 2005) ter preprečuje kovinsko inhibicijo fotosistema II (Rashid in Popovic, 1990; Antosiewicz, 2005). 2.4 RANI MOŠNJAK (Noccaea praecox Wulf) Rani mošnjak Noccaea praecox Wulf (Slika 1) je predstavnik iz družine križnic (Brassicaceae). Je zeljnata trajnica, ki ima več pritličnih listov v obliki izrazite rozete. Ima več pokončnih, sinje zelenih stebel, ki so visoka od 10 do 20 cm. Večje število cvetočih stebel tvori venec bele barve, čaša pa je običajno rdečkasta (Martinčič in sod., 2007). N. praecox Wulf uspeva na kamnitih karbonatnih suhih travnikih, zato ga najdemo širom Slovenije od nižin do subalpinskega pasu. Večinoma cveti od marca do junija, po nekaterih krajih pa že konec februarja (Martinčič in sod., 2007). V Sloveniji je bilo največ raziskav narejenih na populacijah, ki rastejo v Žerjavu (severna Slovenija), saj je to območje močno onesnaženo s kovinami zaradi rudnika svinca in talilnice (Vogel-Mikuš in sod., 2005). Slika 1: Rani mošnjak Noccaea praecox Wulf (Botanični vrt Univerze v Ljubljani, 2018) 5

19 2.4.1 Hiperakumulacijske sposobnosti N. praecox Wulf Brooks (1998) je zapisal, da lahko N. praecox v svojem tkivu kopiči do 2.1% Zn, Vogel- Mikuš in sod. (2005) pa so v svojih raziskavah ugotovili, da je N. praecox iz okolice Žerjava v svojih poganjkih (suha masa = SM) kopičil 1,5% Zn, 0,6% Cd in 0,4% Pb. Visoke koncentracije Zn v poganjkih rani mošnjak tolerira tako, da ga največ kopiči v vakuolah epidermalnih celic in celičnih stenah listne povrhnjice. Kadmij kopiči predvsem v vakuolah mezofila, Pb pa se porazdeli med apoplastom in simplastom (Vogel-Mikuš in sod., 2008b). Pri vsem tem je potrebno poudariti, da je koncentracija kovin v rastlinah močno odvisna od koncentracije kovin v tleh (Baker in sod., 1994). Na razpoložljivost kovin v tleh poleg koncentracije vplivajo tudi druge značilnosti tal: kot so ph, vsebnost organskih snovi in kationska izmenjevalna kapaciteta, ki nadzira topnost kovin in s tem njihovo razpoložljivost za rastlinski privzem (Marschner, 1995). Tudi prisotnost mikroorganizmov v tleh vpliva na privzem kovin v koreninah in poganjkih, ker s svojo dejavnostjo spreminjajo talne pogoje in dostopnost kovin (Leyval in Joner, 2001). Za arbuskularne mikorizne glive je znano, da zavirajo ali povečajo privzem kovin v rastlinska tkiva (Joner in sod., 2000). Rani mošnjak sodi v družino križnic (Brassicaceae), ki v splošnem veljajo za ne mikorizne, in v naravnih razmerah tvori simbiozo z arbuskularnimi mikoriznimi (AM) glivami (Regvar in sod., 2003). Vogel-Mikuš in sod. (2005) navajajo, da N. praecox Wulf tvori simbiozo z AM glivami na tleh, ki niso onesnažena s kovinami oziroma niso premočno onesnažena s kovinami. Ta simbioza med rastlino in glivo predstavlja prilagoditev na neugodne talne razmere na onesnaženih območjih (Vogel-Mikuš in sod., 2005). Pongrac in sod. (2007) so opazili največjo kolonizacijo AM gliv v cvetoči fazi rastline, to pa je spremljala tudi povečana vsebnost svinca, cinka, kadmija in železa v koreninah. Dobljeni rezultati kažejo: (1) razvojno odvisnost formacije arbuskularnih mikoriznih gliv skupaj s selektivnimi spremembami v privzemu hranil pri N. praecox Wulf, ki so povezne s povečanimi rastlinskimi potrebami in (2) zaščitno vlogo kolonizacije AM gliv na območjih onesnaženih s kovinami, v reproduktivnem obdobju rastline (Pongrac in sod., 2007). 6

20 2.5 SVINEC Fizikalne in kemijske lastnosti svinca Svinec (Pb) je modrikasta ali srebrno-siva kovina z atomskim številom 82 in atomsko maso 207,19. Pri atmosferskem tlaku je njegovo tališče 327,5 C in vrelišče pri 1740 C. Naravno se pojavlja v štirih izotopih z atomsko maso 204, 206, 207 in 208. Čeprav ima na zunanji lupini 4 valenčne elektrone, je njegovo običajno oksidacijsko stanje +2 in ne +4, ker le dva elektrona enostavno ionizirata. Večina anorganskih soli Pb 2+ (razen klorata, klorida in nitrata) je v vodi slabo topnih (Tangahu in sod., 2011). Najbolj stabilne oblike svinca so svinčevi ioni (Pb 2+ ) in svinčevi hidroksi kompleksi. Pb 2+ je najbolj pogosta in najbolj reaktivna oblika svinca (Punamiya in sod., 2010) Svinec v okolju Svinec se naravno pojavlja znotraj zemeljske skorje (Gupta in sod., 2013; Arias in sod., 2010), njegova naravna koncentracija pa ostaja pod 50 mg/kg (Pais in Jones, 2000). Zaradi antropogenih dejavnosti se je koncentracija svinca povečala na številnih mestih po vsem svetu (Saifullah in sod., 2009). Je glavno onesnaževalo tako na kopnem, kot v vodnem ekosistemu (Eick in sod., 1999). Industrijske dejavnosti so primarni viri svinca v tleh. Povišane ravni svinca v tleh so rezultat uporabe barv, ki temeljijo na svincu, svinčenih nabojev za puške, svinčevega arzenata, ki se uporablja v pesticidih, kurjenja premoga, bencina, eksploziva in odloženega komunalnega blata iz čistilnih naprav oplemenitenega s svincem iz svinčenih baterij (Saifullah in sod., 2009). Največ svinca se v tla, podtalnico in površinske vode sprošča v obliki svinčevih ionov (Pb 2+ ), svinčevih oksidov in hidroksidov ter svinčeno kovinskih oksianionskih kompleksov (Punamiya in sod., 2010). Zaradi naraščajočih trendov urbanizacije se čedalje več odplak, ki vsebujejo Pb, razliva po vrtovih in poljih. Tudi večletni terenski poskusi so pokazali, da redna uporaba umetnih gnojil poveča raven mobilnih oblik svinca v tleh in njegov privzem v rastlinah. Trdni delci Pb s tal se odplavljajo s padavinami in tako onesnažujejo še druge vodotoke in prst. Voda, ki priteče iz rudnikov, vsebuje velike količine dobro zmletih sedimentov, ki vsebujejo Pb (Sharma in Dubey, 2005). V Sloveniji je največja onesnaženost s Pb v Jesenicah, Mežiški dolini (rudnik svinca in topilnica) in nekaterih mestih v Julijskih Alpah. Njegov izvor na teh lokacijah je posledica lokalnega fužinarstva in vpliva topilnice v Rajblu v Italiji (Zupan in sod., 2008). 7

21 2.5.3 Privzem in prenos svinca pri rastlinah Kot sem že prej omenila, je koreninski privzem Pb oziroma njegova dostopnost rastlinam odvisna od številnih dejavnikov, kot so: koncentracija Pb, talni pogoji (ph, vsebnost organskih snovi, kationska izmenjevalna kapaciteta) (Marschner, 1995; Moreno in sod.,1996), rastlinski dejavniki (površina korenin, koreninski izločki, mikoriza, hitrost transpiracije) (Davies, 1995), dodatek kelatnih sredstev, gnojil, rastlinske vrste in biodostopnosti Pb (Sharma in Dubey, 2005). Rastline, lahko privzemajo Pb prek korenin in/ali preko listov. Količina Pb, ki lahko v rastlino preide skozi liste, je odvisna od rastlinske absorpcije Pb iz zraka, ki je odvisna od specifične morfologije listov (Sharma in Dubey, 2005). Količino svinca, ki iz tal preide v rastlino, lahko izmerimo s tako imenovanim faktorjem prenosa (angl. transfer factor). Ta faktor je definiran kot razmerje med koncentracijo svinca v rastlini in koncentracijo svinca v tleh. Faktor je različen za različne rastlinske vrste in se bo spreminjal, kot se spreminjajo tudi fizikalne in kemijske lastnosti tal (Arshad in sod., 2008; Liu in sod., 2010). V večini obravnavanih primerov je faktor prenosa nizek, kar nakazuje, da se večina svinca nahaja v koreninah (Liu in sod., 2010). Kovine, prisotne v tleh, v rastline vstopajo preko koreninskega privzema (Sharma in Dubey, 2005).Večina Pb je akumuliranega v zgornjih plasteh tal in zato je težko izmeriti odstotek Pb v tleh, ki je takoj dostopen rastlinam (Sharma in Dubey, 2005). Poleg tega je Pb v tleh skoraj vedno močno vezan na organske ali koloidne snovi, ali pa se pojavlja v oborjeni obliki, kar zmanjša njegov privzem (Sharma in Dubey, 2005). Del svinca, prisotnega v talni raztopini, se adsorbira na korenine, nato pa se veže na karboksilne skupine uronične kisline, lahko pa se veže neposredno na polisaharide rizoderma (Seregin in Ivanov, 2001). Te vezi onemogočajo privzem Pb in so pomembna prepreka, ki varuje koreninski sistem (Morel in sod., 1986). Največ Pb se zadrži v koreninah s tem, ko se veže na ionska izmenjevalna mesta celične stene in zaradi izven celične sedimentacije v obliki svinčevih karbonatnih depozitov (Sharma in Dubey, 2005). Največje koncentracije svinca najdemo v koreninskem vršičku, kjer so mlade koreninske celice, ki imajo tanke celične stene (Seregin in sod., 2004), poleg tega pa ima območje vršička najnižji ph rizoderma, kar poveča topnost svinca v talni raztopin (Pourrut in sod., 2011). Biorazpoložljivost kovin v tleh upada pri ph-ju višjem od 5,5 do 6,0 (Tangahu in sod., 2011) oziroma absorpcija Pb v tleh narašča z naraščajočim ph-jem od 3,0 do 8,5 (Lee in sod., 1998). Za boljšo biorazpoložljivost Pb v tleh in njegov prenos iz korenin v poganjke se uporabljajo nekatera sintetična kelatna sredstva, kot je EDTA (etilendiamintetraocetna kislina), ki se je izkazal za najbolj učinkovitega pri topljenju Pb vezanega v tleh, v kombinaciji z nekaterimi rastlinskimi hormoni. Dodatek kelatov se tako odraža v povečani koncentraciji Pb v poganjkih (Saifullah in sod., 2009; Meers in sod., 2008). Svinec, lahko v korenino vstopi preko različnih poti, predvsem preko ionskih kanalov (Wang in sod., 2007). Absorpcijo svinca lahko zavira kalcij (Kim in sod., 2002), pri čemer gre za tekmovanje med 8

22 svinčevimi in kalcijevimi ioni za kalcijeve kanale (Pourrut in sod., 2011), saj po kalcijevih kanalih največ svinca vstopi v korenine (Wang in sod., 2007; Pourrut in sod., 2008). Svinec, ki se je adsorbiral na površje koreninskega rizoderma, lahko pasivno vstopi v korenine in sledi toku vode, dokler ne doseže endodermisa (Seregin in sod., 2004). Endoderm s Kasparijevimi trakovi predstavlja fizično bariero in ima pomembno vlogo pri omejenem prenosu svinca iz korenin v nadzemne dele rastline (Pourrut in sod., 2011). Svinec mora tako zaradi Kasparijevih trakov slediti simplastnemu prenosu. V celicah endodermisa se velik del svinca zaseže ali pa se izloči s sistemi za razstrupljanje rastlin. Visoke koncentracije svinca uničijo fizično pregrado, ki jo tvori Kasparijev trak (Pourrut in sod., 2011). Kovine se iz korenin v poganjke prenesejo skozi ksilem, ta prenos pa poganja transpiracija (Pourrut in sod., 2011). Svinec, ki prodre v središče poganjka, se lahko ponovno prenaša po apoplastni poti in se nato prenese v liste preko vaskularnega toka (Sharma in Dubey, 2005). Medtem, ko svinec potuje preko ksilema, lahko tvori komplekse z aminokislinami ali organskimi kislinami (Pourrut in sod., 2011) Lokalizacija svinca v rastlinah V primeru, ko med seboj primerjamo rastlinske organe opazimo, da se večina Pb akumulira v koreninah (Seregin in Ivanov, 2001; Vogel-Mikuš in sod., 2005), sledijo listi, kjer je več Pb v starih, kot v mladih listih (Godzik, 1993), listom sledi steblo, socvetje in semena (Antosiewicz, 1992). To zaporedje se lahko razlikuje za različne rastlinske vrste (Antosiewicz, 1992). Ultrastrukturne študije so pokazale, da so spremenljive količine Pb depozitov prisotne predvsem v medceličnem prostoru, celični steni in vakuolah. Manjši depoziti Pb so vidni v endoplazmatskem retiklu, diktiosomih in diktiosomnih veziklih. Največ Pb se absorbira v celični steni in vakuoli, kar 96% (Wierzbicka in Antosiewicz, 1993). Majhna količina Pb doseže tudi celično jedro, kloroplaste in mitohondrij (Sharma in Dubey, 2005). Seregin in Ivanov (2001) poročata, da se v listu največ Pb 2+ ionov nahaja v žilah in na mestih, kjer poteka transpiracija (npr. epidermis). Tudi Vogel-Mikuš in sod. (2008a,b) poročajo, da se kovine običajno kopičijo v epidermisu (povrhnjici) in trihomih, v manjših količinah pa v fotosintezno aktivnih tkivih. 9

23 Lokalizacija svinca v ranem mošnjaku N. praecox Wulf V novejših študijah so Vogel-Mikuš in sod. (2008b) z uporabo metode mikro-pixe določili porazdelitev elementov v prečnem prerezu lista ranega mošnjaka in ugotovili, da se je največ svinca nakopičilo v spodnjem in zgornjem epidermisu, visoka koncentracija pa je bila opažena tudi v mezofilu in vaskularnem tkivu. Z izračunom relativne porazdelitve elementov so ugotovili, da se je največ svinca porazdelilo znotraj mezofila. Podroben pregled mezofila je razkril, da se je največ svinca kopičilo in razstrupljalo v apoplastu in simplastu mezofila. Pri pregledu glavnega žilnega snopa je bila največja koncentracija svinca v celicah kolenhima, prav tako pa je bila večja koncentracija svinca v floemu kot v ksilemu (Vogel- Mikuš in sod., 2008b). Nizka koncentracija svinca v ksilemu sovpada s trditvijo, da večina svinca v ranem mošnjaku ostane v koreninah (Vogel-Mikuš in sod., 2005, 2006; Pongrac in sod., 2007). Največja koncentracija svinca (2264 µg/g) je bila zabeležena v kolenhimskih celicah, kar nakazuje da te metabolno manj aktivne celice predstavljajo skladiščno mesto za kovine v listih ranega mošnjaka, ki hiperakumulira kovine (Vogel-Mikuš in sod., 2008b) Strupenost svinca Že kar nekaj časa poteka zanimanje oziroma skrb za morebitne škodljive učinke svinca na človekovo zdravje, tako pri neposrednem zaužitju kontaminiranih tal, kot tudi pri vnosu svinca v samo prehranjevalno verigo preko rastlin, vse to pa predstavlja veliko tveganje za zdravje ljudi (Hassan in sod., 2008). Že kratka izpostavljenost visokim koncentracijam svinca lahko pri ljudeh povzroči poškodbo možganov in ledvic ter težave s prebavili, medtem ko lahko dolgotrajna izpostavljenost vpliva na centralni živčni sistem, jetra, kri in razmnoževalni sistem (Han in sod., 2008). Strupene kovine, kot je svinec, pri ljudeh povzročajo možganske poškodbe in zaostalost (Cho-Ruk in sod., 2006). Svinec ni strupen samo za ljudi, ampak tudi za rastline, živali in mikroorganizme (Tangahu in sod., 2011). Svinec je eden izmed zelo fitotoksičnih elementov. Svinec lahko pri rastlinah povzroči spremembe v ultrastrukturi kloroplasta, zavira rast listov in korenin, zavira fotosintezo ter povzroča poškodbe celičnih membran (Liu in sod., 2008a). Svinec v rastlinskih celicah, že v majhnih koncentracijah povzroča širok spekter škodljivih učinkov na fiziološke procese. Posledica fitotoksičnosti svinca je inhibicija encimske aktivnosti, moteno vodno ravnovesje in mineralna prehrana, spremembe v hormonskem stanju in prepustnosti membrane. Visoke koncentracije Pb, lahko sčasoma povzročijo tudi celično smrt (Seregin in Ivanov, 2001). Svinec vpliva tudi na kalitev semen in rast sadik, saj zmanjšuje indeks in odstotek kaljivosti, zmanjšuje dolžino korenin, poganjkov, suho maso korenin in poganjkov ter tolerančni indeks (Sharma in Dubey, 2005). Rastlinske korenine se na absorbiran Pb hitro odzovejo (zmanjšana rast, nepravilna razvejanost), že pri koncentracijah nad 10 mg Pb/kg prsti (Breckle, 1991). Znotraj rastlinske celice Pb znižuje vsebnost beljakovin v tkivih, povzroča 10

24 spremembe v sestavi lipidov, zmanjšuje stopnjo nasičenih maščobnih kislin in poveča stopnjo nenasičenih maščobnih kislin, poškoduje mikrotubule, povzroča nepravilno oblikovana jedra ter jedra z razpadajočim jedrnim materialom. Sinteza DNA, RNA in proteinov v endospermu se zelo zmanjša z naraščajočo koncentracijo Pb (Sharma in Dubey, 2005) Vpliv svinca na kalitev in rast Negativne oziroma škodljive učinke na kalitev in rast rastlin ima lahko svinec že pri nekaj mikromolih (Kopittke in sod., 2007). Že zelo nizka koncentracija Pb 2+ močno zavira kalitev rastlin (Islam in sod., 2007). Zaviranje kalitve je lahko rezultat interference svinca z amilaznimi encimi in proteazo (Sengar in sod., 2008). Izpostavljenost svincu močno omejuje tudi poganjanje in razvoj sadik oziroma sejancev (Dey in sod., 2007). V nizkih koncentracijah zavira rast korenin in nadzemnih delov rastlin (Islam in sod., 2007; Kopittke in sod., 2007). Zavirana rast je izrazitejša pri koreninah, kar je posledica večje koncentracije Pb v koreninah kot v poganjkih (Liu in sod., 2008b). Strupenost svinca lahko povzroči tudi ukrivljene, otekle, kratke in debele korenine, ki kažejo na povečano število sekundarnih korenin na dolžino korenine (Kopittke in sod., 2007). Rastline, ki so bile izpostavljene močnemu stresu (izpostavljenost svincu), so pokazale očitne simptome zavrte rasti z redkejšimi, manjšimi in bolj krhkimi listi s temno vijolično (abaksialno) spodnjo površino (Islam in sod., 2007; Gupta in sod., 2009). Zavirano rast zaradi izpostavljenosti svincu lahko pripišemo motnjam v presnovi hranil (Kopittke in sod., 2007) in moteni fotosintezi (Islam in sod., 2007). V večini primerov je vpliv svinca na rast rastlin odvisen od trajanja izpostavitve in količine Pb (Dey in sod., 2007; Gupta in sod., 2009). Učinek strupenost svinca se spreminja glede na rastlinsko vrsto, med tako imenovanimi hiperakumulatorji, ki naravno prenesejo večje količine svinca kot občutljive rastline (neakumulatorji) (Arshad in sod., 2008) Vpliv svinca na mineralno prehrano Na rastlinski privzem hranil močno vpliva prisotnost svinca in povzroča neravnovesje v mineralni prehrani rastočih rastlin (Sharma in Dubey, 2005). Zaradi izpostavljenosti svincu se zmanjša koncentracija dvovalentnih kationov v listih nekaterih preiskovanih rastlin (Pourrut in sod., 2011). To zmanjšanje je lahko posledica blokade koreninske absorpcije, zmanjšanega prenosa iz korenin v nadzemne dele rastlin, ali spremembe v porazdelitvi teh elementov v rastlini. Vpliv svinca na kopičenje mineralov v nadzemnih delih rastlin, v večini primerov, sledi običajnim trendom. V koreninah pa se ta trend spreminja glede na jakost povzročenega stresa ali rastlinsko vrsto (Kopittke in sod., 2007). Predlagana sta bila dva mehanizma za zmanjšan privzem mikro in makronutrientov pod vplivom Pb. Prvi mehanizem je fizični in se opira na velikost radijev kovinskih ionov, drugi pa je kemični in 11

25 se opira na motnje povzročene v celičnem metabolizmu, kar vodi do sprememb v membranski encimski aktivnosti ter membranski strukturi (Sharma in Dubey 2005) Vpliv svinca na vodni status V številnih študijah so poročali o motnjah vodnega stanja pri rastlinah, ki so bile izpostavljene svincu (Brunet in sod., 2009). Rezultati takšne izpostavljenosti kažejo zmanjšanje transpiracije in vsebnosti vlage (Patra in sod., 2004). Zmanjšana transpiracija je lahko rezultat zmanjšane listne površine za transpiracijo, kar pa je rezultat zmanjšane rasti listov (Weryszko-Chmielewska in Chwil, 2005). Svinec zmanjša plastičnost rastlinskih celic in s tem vpliva na turgorski tlak celic. Svinec na turgorski tlak vpliva tudi tako, da se zmanjša koncentracija molekul, ki nadzirajo celični turgor (sladkorji, aminokisline) (Barceló in Poschenrieder, 1990). Sprememba v turgorskem pritisku vpliva na stomatalno odpiranje in zapiranje. Za vzdrževanje tlaka celičnega turgorja, kadar so pod stresom zaradi svinca, rastline proizvajajo visoke koncentracije ozmolitov (proline) (Qureshi in sod., 2007). Abscizinska kislina (ABA) je rastlinski hormon, ki nadzira stomatalno odpiranje in zapiranje. Prisotnost Pb 2+ ionov povzroči povečano kopičenje abscizinske kisline v koreninah in nadzemnih delih rastlin, kar vodi v stomatalno zapiranje. Zaprtje stomatale (pore) močno omeji izmenjavo plinov z atmosfero in izgubo vode s transpiracijo (Pourrut in sod., 2011). Weryszko-Chmielewska in Chwil (2005) poročata, da svinec zmanjša dihanje rastlin skozi listno površino. Vodni status rastlin je lahko moten tudi zaradi neravnovesja med kisikom in ogljikovim dioksidom, ki je posledica oksidativne fosforilacije in motnje dihanja Vpliv svinca na respiracijo (dihanje) Fotosintezne rastline škodljive učinke svinca občutijo tudi pri dihanju in vsebnosti adenozin trifosfata (ATP) (Seregin in Ivanov, 2001). Študije dihanja rastlin izpostavljenih svincu obravnavajo predvsem rastlinske liste, učinki svinca oziroma Pb 2+ ionov na dihanje korenin pa je še precej neznano. Za svinec je znano, da vpliva na aktivnost ribuloze bifosfat karboksilazo v C3 rastlinah, ki nadzira asimilacijo ogljikovega dioksida, ne da bi vplivali na oksigenazno aktivnost (Assche in Clijsters, 1990). Zato je možno, da se fotosinteza zelo zmanjša, ne da bi to vplivalo na fotorespiracijo, s tem pa se poveča razmerje fotorespiracije do fotosinteze (Pourrut in sod., 2011). Pri nekaterih rastlinah, ki so bile izpostavljene svinčevemu nitratu, so v listih opazili povečano koncentracijo ogljikovega dioksida. Do tega je najverjetneje prišlo zaradi zmanjšane fotosinteze in povečane dihalne aktivnosti (Pourrut in sod., 2011). Povečana respiracija zaradi Pb 2+ je bila opažena pri mitohondrijskem dihanju (Romanowska in sod., 2002), kot rezultat po povečanih energijskih zahtevah rastline (povečana proizvodnja ATP) za boj proti svincu in njegovim učinkom (Pourrut in sod., 2011). Svinec povzroči povečanje vsebnosti ATP in razmerja ATP/ADP v listih, ki je v glavnem posledica proizvodnje mitohondrijske ATP (Romanowska in sod., 2005). Svinec 12

26 zavira tudi Hill-ovo reakcijo v kloroplastih, poleg tega ima večji učinek na ciklično fotofosforilacijo kot na neciklično (Romanowska in sod., 2008). Akumulacija Pb 2+ v fotosistemu II povzroči poškodbe v sekundarni strukturi in povzroči zmanjšanje absorbance vidne svetlobe ter zavira prenos energije med aminokislinami (Qufei in Fashui, 2009) Vpliv svinca na fotosintezo Eden izmed dobro poznanih znakov strupenosti svinca je tudi zaviranje fotosinteze pri rastlinah (Liu in sod., 2008b). Svinec na zaviranje fotosinteze vpliva posredno in neposredno. Posredni učinki svinca na fotosintezo so: popačena ultrastruktura kloroplasta, zavirana sinteza klorofila, zaviranje plastokinona in sinteze karotenoidov, oviranje transportnega sistema elektronov, nezadostna koncentracija ogljikovega dioksida po zaprtju stomatalnih odprtin, zamenjava dvovalentnih kationov s svincem, poslabšan privzem nujno potrebnih elementov za rast rastlin, kot sta železo in mangan, zaviranje encimske katalize Kalvinovega cikla ter povečana aktivnost encima klorofilaza (Pourrut in sod., 2011). Ti različni efekti svinca so odvisni tudi od rastlinske vrste. V splošnem je znano, da je klorofil a manj občutljiv kot klorofil b (Xiong in sod., 2006). Kljub temu, pa je upad fotosintezne aktivnosti pogosto bolj občutljivo merilo kot je vsebnost barvil (Pourrut in sod., 2011) Vpliv svinca na celično delitev Najbolj znan strupen učinek svinca na rastline je antimitotični učinek (Patra in sod., 2004; Shahid in sod., 2011). Že dolgo nazaj je znanstvenikom uspelo prikazati, da svinec povzroča, glede na velikost odmerka, zmanjšano mitotsko aktivnost v koreninskih celicah (Pourrut in sod., 2011). Vpliv svinca v koreninskih celicah opazimo tudi kot skrajšanje mitotične stopnje in podaljšanje interfaze, s tem pa se podaljša sam celični cikel (Patra in sod., 2004). Strupen učinek svinca na rastline se prične z vezavo Pb 2+ ionov na celično steno in celične membrane, kar privede do njihove togosti ter zmanjšuje celično delitev. Temu sledi prekinitev mikrotubulov, ki so nujni za samo mitozo. Zaradi celične izpostavitve svincu pride do motenj v G2 in M stopnji celične delitve, kar vodi v nastanek nenormalnih celic. Do tega pojava pride, če so proteini, kot so ciklini, ki sodelujejo v celičnem ciklu posredno ali neposredno izpostavljeni svincu. Motnje, ki jih povzroči svinec v delitvenem vretenu celice, so lahko v nekaterih primerih prehodne in se mitoza vrne na začetno raven. Genotoksičnost, ki jo pri rastlinah povzroča svinec, je v primerjavi z antimitotičnim mehanizmom bolj kompleksna in zato slabše poznana. Pri nizki koncentraciji svinec nima pomembnega učinka na mitozo, povzroči pa nastanek kromosomskih mostov med anafazo, izgubo acentričnih fragmentov med mejozo, nastajanje mikronukleusov in fragmentacijo kromosomov (Patra in sod., 2004; Shahid in sod., 2011). Zaradi svinca povzročena kromosomska odstopanja lahko pojasnimo s prekinitvami mikrotubularne mreže. Študije izvedene v nadzorovanem okolju so pokazale, da svinec povzroči prelome v dvojnih in enojnih vijačnicah DNA ter tako vpliva na horizontalne povezave med dvema DNA ali med 13

27 DNA in beljakovinami (Shahid in sod., 2011). Svinec, lahko vstopi v celično jedro in se veže neposredno na DNA, ali posredno na proteine. Svinec, vezan na DNA, moti njeno popravljane in podvojevanje. Z vezavo na golo DNA svinec povzroča neposredne genotoksične učinke (Pourrut in sod., 2011) Vpliv svinca na oksidativni stres in lipidno peroksidacijo V kloroplastu se med normalno celično presnovo proizvajajo reaktivne kisikove spojine. Te spojine, med katere sodijo tudi hidroksilni radikali, superoksidni radikali in vodikov peroksid, nastanejo tudi zaradi izpostavitve določenim okoljskim dejavnikom. Nastajanje reaktivnih kisikovih spojin v celicah aerobnih organizmov, ki so opredeljene kot oksidativni stres, je ena izmed dobro poznanih značilnosti strupenosti kovin (Liu in sod., 2008b; Singh in sod., 2010). Po tem, ko reaktivne kisikove spojine izčrpajo rezerve antioksidantov v celici, lahko napadejo in oksidirajo vse vrste biomolekul, kot so beljakovine, lipidi in nukleinske kisline (Wang in sod., 2007). Takšni napadi vodijo v nepopravljive motnje v metabolizmu in na koncu v celično smrt (Pourrut in sod., 2011). Svinec povzroči izrazite spremembe v lipidni sestavi različnih celičnih membran (Liu in sod., 2008b; Singh in sod., 2010). Na reaktivne kisikove spojine (RKS) so zelo občutljive tudi polinenasičene maščobne kisline in njihovi estri prisotni v lipidih (Dey in sod., 2007; Gupta in sod., 2009). RKS iz nenasičenih maščobnih kislin odstranijo vodik in tvorijo lipidne radikale ter reaktivne aldehide, ki vodijo v popačenje lipidnega dvosloja (Mishra in sod., 2006). Svinčevi ioni povzročijo lipidno peroksidacijo, zmanjšajo količino nasičenih maščobnih kislin in povečajo vsebnost nenasičenih maščobnih kislin v membranah številnih rastlinskih vrst (Singh in sod., 2010). Spremembe v membranskih lipidih povzročijo nastanek nenormalnih celičnih struktur, kot so spremembe v celični membrani (Dey in sod., 2007; Islam in sod., 2008; Gupta in sod., 2009), kloroplastih (Weryszko-Chmielewska in Chwil, 2005), organelih in peroksisomih (Liu in sod., 2008b) Vpliv svinca na proteine Svinec vpliva oziroma reagira z citoplazemskimi proteini. Vpliv svinca na skupno koncentracijo proteinov pa ni povsem jasen (Mishra in sod., 2006). Količinsko zmanjšanje skupne vsebnosti proteinov je rezultat številnih vplivov svinca, kot je oksidativni stres reaktivnih kisikovih spojin (Gupta in sod., 2009), spremembe v izražanju genov, povečana ribonukleazna aktivnost (Pourrut in sod., 2011), rastlinsko izkoriščanje proteinov za razstrupljanje svinca in zmanjšanje vsebnosti prostih aminokislin (Gupta in sod., 2009), kar je povezano z motnjami v metabolizmu dušika. Pod stresom, ki ga povzroča svinec, se količina nekaterih aminokislin (prolin) poveča in ravno tej proteini imajo pomembno vlogo pri toleranci rastlin na svinec (Pourrut in sod., 2011). Nasprotno lahko nizke koncentracije svinca povečajo skupno vsebnost proteinov (Mishra in sod., 2006). Takšno kopičenje proteinov morda lahko ubrani rastlino pred stresom, ki ga povzroča svinec (Gupta in sod., 14

28 2010). Svinec ne vpliva samo na količino proteinov, ampak tudi na kvantitativno sestavo celičnih proteinov (Pourrut in sod., 2011). 2.6 PREUČEVANJE STRUPENOSTI SVINCA PRI RASTLINAH Pretekle raziskave, ki so bile opravljene na rastlinski vrsti Noccaea praecox Wulf, so bile usmerjene predvsem na raziskovanje mehanizmov akumulacije, tolerance in lokalizacije nekaterih kovin (predvsem kadmija in cinka) na tkivnem nivoju rastline, same rastline pa so bile nabrane v svojem naravnem okolju. Pri tem se uporabljajo moderne fizikalne metode, ki nam omogočajo kvantifikacijo privzema kovin na organskem nivoju in kvantifikacijo ter sočasno lokalizacijo kovin. Ena izmed takšnih metod je metoda micro-pixe oziroma metoda mikro protonsko inducirane emisije rentgenskih žarkov z visokoenergijskim fokusiranim žarkom (Vogel-Mikuš in sod., 2008a, b). Te raziskave bomo poskusili dopolniti s preučevanjem lokalizacije svinca v listnem tkivu N. praecox Wulf in z vezavo svinca na nekatere ligande Metode za določanje skupnih koncentracij elementov v rastlinskih organih Rentgenska fluorescenčna spektrometrija (XRF) Rentgenski žarki (X-žarki) so elektromagnetni valovi z valovno dolžino od približno 80 nm do približno 0,001 nm. Rentgenska fluorescenca (RF) nastane z vzbujanjem oz. ionizacijo atomov v tesno vezanih notranjih K in L atomskih lupinah z energijo, ki mora presegati vezavno energijo K in L elektronov, v procesu imenovanem fotoelektrični učinek. Atome lahko vzbudimo tudi z rentgenskimi fotoni, tako da jih obsevamo z izvorom X-žarkov (Markowicz, 1993). Karakteristični rentgenski fotoni, ki se izsevajo pri procesu nastanka rentgenske fluorescence, so značilni za točno določen element, kar predstavlja osnovo za razlikovanje med posameznimi elementi (Markowicz, 1993) Metode za določanje porazdeljevanja elementov na tkivnem in celičnem nivoju Metoda protonsko inducirane emisije rentgenskih žarkov s fokusiranim žarkom (mikro-pixe) Na Institutu Jožef Stefan so razvili metodo za opravljanje biomedicinskih meritev imenovano mikro-pixe (Nečemer in sod., 2008). Metoda mikro-pixe oz. metoda protonsko inducirane emisije rentgenskih žarkov s fokusiranim žarkom (angl. micro proton-induced X- ray emission) se uporablja za lokalizacijo in kvantifikacijo številnih elementov v bioloških vzorcih na celičnem in tkivnem nivoju (Vogel-Mikuš, in sod., 2008b). Prostorska lokalizacija kovin temelji na emisiji značilnih rentgenskih žarkov, vzbujenih z nabitimi delci 15

29 (protoni, elektroni, težji delci) ali fotoni (mikro-xrf) (Vogel-Mikuš in sod., 2008a). Med analizo mikro-pixe se tvori protonski žarek z energijo 3MeV in s premerom od 1 do 3 µm pri ionskih tokovih v območju od 40 do 500 pa, odvisno od zahtevane lateralne ločljivosti (Nečemer in sod., 2008). Hitri protoni vzbujajo atome in izbijejo elektrone iz notranjih lupin atoma (Small, 1993; Maenhaut in Malmqvist, 1993). V kombinaciji z metodo ionske presevne mikroskopije (angl. Scanning Transmission Ion Microscopy, STIM), omogoča elementarno kartiranje in kvantifikacijo elementarnih koncentracij v tkivnih odsekih (Vogel- Mikuš in sod., 2008b). Kvantitativne mape porazdelitve elementov posameznega vzorca dobimo z meritvijo energijskih spektrov izsevanih karakterističnih rentgenskih žarkov. Sliko porazdelitve debeline vzorca dobimo kot rezultat meritve energije protonov, ki so preleteli vzorec z metodo ionske presevne mikroskopije (STIM) (Vogel-Mikuš in sod., 2009). Mikro rentgenska florescenčna spektrometrija (micro-xrf, µxrf) Mikro-XRF tehnika se uporablja za elementarno analizo različnih materialov (Tsuji, 2010). Z µxrf dobimo, v primerjavi z običajnim XRF, bolj podrobne informacije o prostorski porazdelitvi elementov (Tsuji in sod., 2006). Rentgenski optični instrumenti se uporabljajo za pridobivanje rentgenskih mikrožarkov. Sestavljeni so iz vira rentgenskih žarkov, rantgenske optike, gibljivega nosilca vzorca, detektorja rentgenskih žarkov in analizatorja energije, ki ga nadzoruje računalnik. Mikro rentgenski žarki osvetljujejo vzorec, rentgenski detektor pa meri izsevane rentgenske žarke iz vzorca (Tsuji, 2010). Mikro-XRF lahko uporabljamo za dvodimensionalno in za tridimensionalno slikovno obdelavo, vendar dobimo s 3D mapami, v primerjavi z 2D mapami, bolj podrobne informacije o prostorski porazdelitvi (Tsuji, 2010). Laserska ablacija z induktivno sklopljeno plazmo masna spektrometrija (LA-ICP- MS) LA-ICP-MS je tehnika, ki se uporablja za analizo številnih elementov na najrazličnejših trdnih delcih (Resano in sod., 2010), v zadnjem času pa se uveljavlja za merjenje porazdelitve kovin v rastlinskih tkivih (Becker in sod., 2008). Z neposredno analizo trdnih delcev se izognemo razgradnji vzorcev, njihovi kontaminaciji in izgubi preiskovanega elementa ter prostorske informacije (Fernández in sod., 2010). Glavne prednosti so široka razpoložljivost instrumentov, velik pretok vzorcev, odlična meja zaznavanja in dobra lateralna ločljivost (Becker in sod., 2014). Analiza trdnih vzorcev se začne s kratkim pulzom visokoenergijskega laserskega žarka, ki s površine vzorca odnaša material v obliki zelo majhnih delcev (postopek znan kot laserska ablacija). Ti delci se nato prenesejo v sekundarni vzbujevalni vir instrumenta kjer poteka razgradnja in ionizacija vzorčne mase. Vzbujene atome se uvede v detektor za masno spektrometrijo, kjer poteka elementarna in izotopska analiza (Durrant, 1999; Fernández in 16

30 sod., 2010). Z uporabo LA-ICP-MS dobimo kvalitativno sliko porazdelitve elementov v tankih odsekih rastlinskih tkiv (Becker in sod., 2008) Metode za določanje vezavnih oblik na tkivnem in celičnem nivoju Rentgenska absorpcijska spektroskopija (XAS) Rentgenska absorpcijska spektroskopija (XAS) lahko zagotovi informacije o koordinacijskem okolju kovin v rastlinah, saj se uporablja za nepoškodovana zamrznjena hidratirana in liofilizirana rastlinska tkiva (Vogel-Mikuš in sod., 2010). Rentgenska absorpcijska spektroskopija (XAS) je sestavljena iz dveh komplementarnih tehnik: iz absorpcijske spektroskopije rentgenskih žarkov struktur blizu roba (XANES), ki zagotavlja informacije o stopnji kemijske oksidacije in koordinacijski geometriji elementov v kompleksih in iz razširjene oziroma podaljšane rentgenske absorpcije finih struktur (EXAFS), ki zagotavljajo informacije o okolici preiskovanih atomov v vzorcu (število in vrsta sosednjih atomov, njihova oddaljenost od izbranega atoma ter termične in strukturne motnje njihovih položajev) (Vogel-Mikuš in sod., 2010). Struktura XANES nam da informacije o tipu ligandov, valenčnem stanju atoma in simetriji koordinacijske okolice atoma. Oblika absorpcijskega spektra v okolici absorpcijskega roba se lahko uporablja kot»fingerprint«metoda oziroma metoda prstnega odtisa, s katero prepoznamo značilne vezavne oblike (Wong in sod., 1984). 17

31 3. MATERIALI IN METODE 3.1 VZGOJA RASTLIN Vzgoja rastlin iz semena Semena smo nabrali iz poljskih rastlin N. praecox Wulf v Žerjavu v SV Sloveniji, to območje pa je onesnaženo s kovinami zaradi rudnika Pb in talilnice (Vogel-Mikuš in sod., 2005). Semena smo posejali v vermikulit in jih zalivali s prilagojeno hranilno raztopino po Krämer in sod. (1997), ph = 6, Namestitev v hidroponsko raztopino in rastni pogoji Ko so bile rastline dovolj velike (približno 2-3 cm), smo po 3-4 rastline namestili na pokrovčke iz polistirena in jih dali v osemnajst 1000 ml čaš, ki so bile napolnjene s hranilno raztopino prirejeno po Krämer in sod. (1997). Vse spodaj prikazane založne raztopine smo najprej avtoklavirali in nato pripravili hranilno raztopino, za katero smo vzeli po 100 ml 100 konc. raztopine A (založne raztopine 1, 2, 3) in 1 ml 100 konc. raztopine B (založna raztopina 4) na ml bidestilirane vode, ph vrednost pa smo uravnali na 6,5. Preglednica 1: Prirejena hidroponska raztopina (Krämer in sod., 1997), ph=6,5. makroelementi c (mm) M (g/mol) m (g) za 1000 ml 100 x konc. založna raztopina 1 - raztopina A K + - (KNO3) 0,6 101,00 6,060 Ca 2+ - (Ca(NO3)2 4H2O) 0,28 236,1 6,610 NH4 + - ( NH4H2PO4) 0,1 114,98 1,149 založna raztopina 2 - raztopina A Mg 2+ - (MgSO4 7H2O) 0,5 246,38 12,32 založna raztopina 3 - raztopina A Fe tartarat - (Fe2(C4H4O6)3 4,75µM 555,9 0,264 mikroelementi c (µm) M (g/mol) m (g) 100 ml x konc. založna raztopina 4 - raztopina B H3BO3 4,6 61,81 0,2843 Mn 2+ - (MnCl2 4H2O) 0,5 197,84 0,0989 Zn 2+ - (ZnSO4 7H2O) 10,0 287,62 2,876 Cu 2+ - (CuSO4 5H2O) 0,03 249,62 0,0074 Na2MoO4 2H2O 0,01 241,95 0,

32 Rastline, nameščene na polistirenske plošče, so plavale na hranilni raztopini in bile postavljene v rastno komoro, kjer so rastle tri tedne (21 dni) na hidroponskem sistemu s stalnim prepihovanjem zraka. Hranilno raztopino smo zamenjali s svežo vsakih 7 dni. Po 21 dneh prilagajanja novim življenjskim razmeram, smo rastlinam izmerili dejansko in potencialno fotokemično učinkovitost fotosistema II, nato pa smo rastline izpostavili različnim koncentracijami svinca v obliki PbCl2, ki smo ga dodali v hranilno raztopino. Pripravili smo tri enake serije naslednjih koncentracij svinca: 0, 1, 5, 10, 50 in 100 mg/l. Hranilno raztopino z dodanim svincem smo menjali s svežo vsakih 7 dni in merili dejansko ter potencialno fotokemično učinkovitost fotosistema II. 3.2 DOLOČANJE RASNIH PARAMETROV IN PRIPRAVA RASTLINSKEGA MATERIALA ZA NADALJNE ANALIZE Poskus smo zaključili po 28 dneh tretiranja rastlin z različnimi koncentracijami svinca. Rastline smo ločili na korenine in na nadzemne dele (v nadaljevanju poganjek), ki smo jih najprej dobro sprali pod tekočo vodo, nato pa še z bidestilirano vodo. Korenine in poganjke smo osušili s papirnatimi brisačkami, jih ločeno stehtali (sveža masa = SvM), zavili v aluminijasto folijo in hitro zamrznili v tekočem dušiku. Tako zamrznjene vzorce smo nato liofilizirali oziroma posušili v pečici pri 60 C in ponovno stehtali (suha masa = SM). Posušene oziroma liofilizirane korenine in poganjke smo s pomočjo tekočega dušika strli v terilnici in tako dobili fini prah, ki smo ga do uporabe shranili v označenih plastičnih posodicah. Posodice so bile neprodušno zaprte in shranjene pri sobnih pogojih Priprava liofiliziranih rezin za lokalizacijo kovin v rastlinskih tkivih S hitrim zamrzovanjem rastlinskih vzorcev lahko dosežemo, da ostane porazdelitev elementov v rastlinskih tkivih takšna, kot je bila v živih rastlinah (lat. in vivo), kar je bistveno pri preučevanju lokalizacije kovin v rastlinskih tkivih (Vogel-Mikuš in sod., 2009). Ob zaključku poskusa smo iz vsake serije enakih koncentracij svinca vzeli po 9 popolnoma razvitih listov. Iz 6 listov smo s pomočjo skalpela izrezali glavno žilo, pri 3 listih pa smo izrezali samo zgornji del peclja, ki se dotika listne ploskve. Tako izrezane koščke, velike približno 2 5 mm 2, smo takoj vstavili v 2 mm iglo iz nerjavečega jekla, jih najprej potopili v zamrzovalni kriofiksant (Tissue Freezing Medium, Leica) nato pa še v tekoči propan hlajen s tekočim dušikom. V kriomikrotomu smo pri temperaturi med -20 in -35 C narezali vzorce na rezine debeline med 10 in 60 µm, jih nato do suhega liofilizirali in shranili v eksikatorju do nadaljnje uporabe. Metoda je povzeta po Schneider in sod. (2002), s priredbo po Vogel- Mikuš in sod. (2008a,b, 2009). Za analizo mikro-pixe smo nato posušene rezine namestili na aluminijaste nosilce in jih prekrili s tanko folijo pioloforma, za analizo LA-ICP-MS pa neposredno na objektna stekelca (Vogel-Mikuš in sod., 2009). 19

33 3.2.2 Priprava izbranih listov za določanje porazdelitve elementov Za ugotavljanje količinske razporeditve elementov po celotnih listih smo ob zaključku poskusa vzeli po 5 popolnoma razvitih listov za posamezno koncentracijo svinca. Liste smo takoj zavili v aluminijasto folijo, jih pomočili v tekoči propan in zamrznili v tekočem dušiku ter dali liofilizirat Določanje vezavnih oblik svinca Za določanje vezavnih oblik svinca smo ob koncu poskusa vzeli dve rastlini N. praecox Wulf, ki sta bili tretirani s 100 mg Pb/L. Sveže poganjke smo zavili v aluminijasto folijo, jih pomočili v tekoči propan in zamrznili v tekočem dušiku ter dali liofilizirat. Vezavne oblike smo določili z uporabo rentgenske absorpcijske spektroskopije (XAS), natančneje s Pb-L3 XANES. 3.3 MERITVE Meritve fotokemične učinkovitosti fotosistema II Fotokemično učinkovitost rastlin smo določili prek fluorescence klorofila a v fotosistemu II (Trošt Sedej, 2005). Fotokemično učinkovitost rastlin smo pomerili na vseh rastlinah (na vsaki rastlini pomerjena 2 lista, 3-4 rastline na tretma, tri zaporedne serije) z uporabo modulacijskega fluorometra (OS-500, Opti-Science) s katerim smo osvetlili liste s saturacijskim pulzom bele svetlobe. Dejansko fotokemično učinkovitost fotosistema II (v nadaljevanju FU FS II) smo izmerili pri danih svetlobnih pogojih, tako da smo na liste pritrdili ščipalko in list osvetlili s saturacijskim pulzom bele svetlobe (= 9000 µmol m -2 s -1, 0,8 s) ter takoj odčitali dejansko FU FS II. Potencialno FU FS II smo izmerili tako, da smo na liste pritrdili ščipalke za temotno adaptacijo. Po 15 min adaptacije smo liste osvetlili s saturacijskim pulzom bele svetlobe (= 8000 µmol m -2 s -1, 0,8 s) in odčitali vrednost potencialne FU FS II (Trošt Sedej, 2005). Dejansko in potencialno FU FS II smo izrazili v relativnih enotah Določanje koncentracije in vsebnosti klorofilov in karotenoidov Koncentracije klorofila a (Chl a) in b (Chl b) ter karotenoidov smo določili spektrofotometrično z metodo povzeto po Monni in sod. (2001). V čiste centrifugirke smo zatehtali po 30 mg uprašenih in liofiliziranih poganjkov in vanje nalili 5 ml 80% acetona. Centrifugirke smo označili, pokrili z gumijastimi pokrovčki, dobro zvrtinčili in označili višino acetona (Slika 2). Centrifugirke smo za 24 h postavili v hladilnik, 20

34 dolili aceton do oznake in ponovno zvrtinčili ter odcentrifugirali 2 min na 2500 obratov/min. Pred začetkom meritev smo spektrofotometer umerili z 80% acetonom, nato pa pomerili absorpcijo vzorcev pri 647 nm, 664 nm in 470 nm. Koncentracijo in vsebnost pigmentov smo izračunali po Lichtenthaler in Buschmann (2001). Rezultate smo nato predstavili kot vsebnost Chl a, Chl b (v mg/g SM) in koncentracijo karotenoidov (v µmol/l). Slika 2: Vzorci različnih koncentracij pripravljeni za nadaljnje merjenje absorpcije pri 647 nm, 664 nm in 470 nm (foto: Marinka Kržič) Določanje oksidativnega stresa Lipidno peroksidacijo oziroma poškodbe na celičnih membranah korenin in poganjkov ranega mošnjaka smo določili spektrofotometrično po protokolu Hodges in sod. (1999) preko vsebnosti malondialdehida (MDA), ki s tiobarbiturno kislino (TBA) tvori rožnato rdeče produkte z največjo absorbanco pri 532 nm. MDA se tvori pri avtomatski oksidaciji in encimski razgradnji polinenasičenih maščobnih kislin v celicah (Hodges in sod., 1999). Pripravili smo po 10 vzorcev svežih korenin in poganjkov na koncentracijo. Polovici vzorcev smo v epice dodali TBA (Slika 3), drugi polovici pa ne (Slika 4) ter izmerili absorbanco pri valovnih dolžinah 440 nm, 532 nm in 600 nm na spektrofotometu. Iz izmerjenih absorbanc smo izračunali vsebnost MDA po naslednjih enačbah. A = (Abs 532+TBA Abs 600+TBA) (Abs 532-TBA Abs 600-TBA) B = (Abs 440+TBA Abs 600+TBA) 0,0571 MDA ekvivalent (nmol/ml) = (A B/157000) 10 6 MDA ekvivalent (nmol/g) = (MDA ekvi.(nmol/ml) V vzorca (ml)) / m (g) (1) (2) (3) (4) 21

35 Slika 3: Vzorci z dodatkom TBA pripravljeni za merjene absorbance in določanje lipidne peroksidacije (foto: Marinka Kržič). Slika 4: Vzorci brez dodane TBA pripravljeni za merjene absorbance in določanje lipidne peroksidacije (foto: Marinka Kržič). 3.4 METODE ZA DOLOČANJE KONCENTRACIJE, PORAZDELITVE IN VEZAVNIH OBLIK ELEMENTOV NA ORGANSKEM, TKIVNEM IN CELIČNEM NIVOJU Metoda rentgenske fluorescenčne spektrometrije (XRF) Koncentracijo elementov v poganjkih smo določali na predhodno uprašenih in liofiliziranih vzorcih, iz katerih smo s pomočjo hidravlične stiskalnice stisnili tabletke tako, da so imele vse približno enako maso (Slika 5). Tabletke smo ločeno stehtali in jim določili površinsko gostoto. Prisotnost elementov v vzorcih smo pomerili z rentgenskim fluorescenčnim spektrometrom na Biotehniški fakulteti, oddelek za fiziologijo rastlin Univerze v Ljubljani. Analizo kompleksnih rentgenskih spektrov smo izvedli s programom za spektralne analize AXIL (Nečemer in sod., 2008), kvantitativno analizo elementov pa smo izvedli s QAES (Quantitative Analysis of Environmental Samples) programsko opremo (Kump in sod., 1996). Rezultate meritev smo predstavili v mg kg -1 SM. 22

36 Slika 5: Tabletke, stisnjene s hidravlično stiskalnico, pripravljene za meritve prisotnosti elementov (foto: Marinka Kržič) Metoda protonsko inducirane emisije rentgenskih žarkov s fokusiranim žarkom (mikro-pixe) Liofilizirane rezine prečnih prerezov listnih pecljev in listnih žil (v nadaljevanju listi) smo namestili na aluminijaste nosilce (Vogel-Mikuš in sod., 2009). Za detekcijo rentgenskih žarkov, ki imajo energijo od 1 kev do 25 kev, smo uporabili dva polprevodniška detektorja. Za zbiranje rentgenskih žarkov z energijami med 4 in 25 kev smo uporabili rentgenski detektor iz čistega germanija (angl. High Purity Germanium, HPGe), za merjenje rentgenskih žarkov z energijami med 0,8 in 5 kev pa silicijev detektor s prečnim zbiranjem naboja (angl. Silicon Drift Detector, SDD) (Pongrac in sod., 2010). Kot rezultat meritev z mikro-pixe in analize izsevanih karakterističnih rentgenskih žarkov smo dobili mape porazdelitve posameznih elementov v vzorcu. Sliko površinske debeline vzorca (STIM) pa smo dobili kot rezultat meritev porazdelitve transmitiranih ionov (Vogel- Mikuš in sod., 2009) Metoda laserske ablacije z induktivno sklopljeno plazmo masna spektrometrija (LA-ICP-MS) Za 2D mapiranje elementov smo uporabili 213 nm Nd : YAG sistem laserske ablacije v trdnem stanju iz (angl.) New Wave Research (Fremont, CA) in ICP-MS instrument Agilent 7500ce (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Sistem za lasersko ablacijo je bil opremljen s komercialno lasersko ablacijsko celico in učinkovitim izpiralnim volumnom (10 ml). Nameščen je bil tako, da se je lahko položaj laserskega žarka nastavil na vseh treh oseh. Ablacijski material se je iz ablacijske celice prenesel v ICP s pomočjo helija, ki je bil uporabljen kot nosilni plin, argon je bil dodan kot strukturni pokazatelj pod ICP svetilko. Optimalno kvantitativno mapiranje z LA-ICP-MS je potekalo v več korakih, kot končen rezultat pa smo dobili izdelane 2D mape z barvno skalo v µg g

37 3.4.4 Metoda rentgenske absorpcijske spektroskopije (XAS in XANES/Pb-L3 XANES) Vezavne oblike Pb smo določali na zamrznjenih in liofiliziranih poganjkih ranega mošnjaka, ki so bili izpostavljeni 100 mg Pb/L. Meritve so bile opravljene pri sobni temperaturi na žarkovni liniji BM29 Evropskega sinhotronskega sevalnega objekta (ESRF) (Vogel-Mikuš in sod., 2010). BM29 je bil opremljen z dvokristalnim monokromatorjem Si 311 in ločljivostjo 1 ev za robno regijo Pb L3 (Arčon in sod., 2009). Višji harmoniki so bili odstranjeni s ploskim ogledalom prevlečenim s silicijem, ki je bil nameščen za monokromatorjem. Intenziteta monokromatiziranega žarka je bila nadzorovana s tremi ionizacijskimi detektorji napolnjenimi z argonom pri tlaku 110 mbar, 710 mbar in 900 mbar. V vseh primerih je bil dodan tudi helij do skupnega tlaka 2 bara (Arčon in sod., 2009). Vzorci so bili nameščeni med prvi par detektorjev, referenčne kovinske folije pa med zadnji par detektorjev, da smo preverili stabilnost energijske skale (Vogel-Mikuš in sod., 2010; Arčon in sod., 2009). Absorpcijski spektri so bili pomerjeni znotraj intervala [250 ev do 1000 ev], glede na preiskovan Pb L3 rob (Arčon in sod., 2009). XANES in EXAFS regijo smo raziskali na način, ki je podrobneje opisan v Vogel-Mikuš in sod. (2010) in Arčon in sod. (2009) Metoda mikro rentgenske florescenčne spektrometrije (micro-xrf, µxrf) Mikro-XRF meritve so bile opravljene v Berlinu na 2D XRF-u. Za meritve smo uporabili komercialni spektrometer s 30 W rentgensko cevjo iz molibdena, dvema polikapilarnima lečama in Si(Li) detektorji. V kanalu vzbujanja smo uporabili polikapilarno mini lečo s točko velikosti 65 µm pri energiji 16 do 19 kev. Za zaznavne leče smo uporabili polikapilarne polleče s točko velikosti okoli 30 µm pri energiji 5 do 10 kev. Izsevano fluorescenco iz vzorcev je zbral Si(Li) detektor (Mantouvalou, 2009). 3.5 MORFOLOGIJA RASTLINSKIH TKIV Svetlobna mikroskopija Liofilizirane rezine prečnih prerezov listov in listnih pecljev nameščene na aluminijaste nosilce smo opazovali s svetlobnim mikroskopom (Axioskop 2 MOT) pri 25 in 100-kratni povečavi. Za opazovanje rezin pod mikroskopom smo uporabili program AxioVision Rel STATISTIČNA OBDELAVA IN ANALIZA PODATKOV Pridobljene podatke smo obdelali in analizirali s pomočjo programov Microsoft Office Excel 2016 in Statistica 7.0 (StatSoft). Statistično značilne razlike smo izračunali s pomočjo enosmerne ANOVE, Duncanov Post-hoc test (p < 0,05). 24

38 4. REZULTATI 4.1 FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FOTOSISTEMA II Dejansko in potencialno fotokemično učinkovitost FS II smo najprej izmerili na rastlinah, ki so se že prilagodile na rast na hranilni raztopini in še niso bile izpostavljene Pb (rastline pred poskusom = c*). Dejansko in potencialno FU FS II smo nato izmerili še na kontrolnih rastlinah (0 mg Pb/L) in rastlinah, ki so bile izpostavljene 1, 5, 10, 50 in 100 mg Pb/L. Med rastlinami pred poskusom in kontrolnimi rastlinami ob koncu poskusa ni statistično značilnih razlik pri potencialni in dejanski FU FS II (Slika 6). Dejanska FU FS II je bila pri kontrolnih rastlinah in rastlinah izpostavljenim 1, 5 in 10 mg Pb/L statistično značilno večja, v primerjavi z rastlinami izpostavljenim 50 in 100 mg Pb/L (Slika 6). Potencialna FU FS II je bila pri vseh vzorcih večja kot dejanska FU FS II (Slika 6). Potencialna FU FS II je bila pri kontrolnih rastlinah statistično značilno manjša, v primerjavi z rastlinami, izpostavljenim 1 in 5 mg Pb/L (Slika 6). Rastline, izpostavljene 1 in 5 mg Pb/L, so imele statistično značilno večjo potencialno FU FS II, v primerjavi s kontrolnimi rastlinami in rastlinami, izpostavljenimi 50 in 100 mg Pb/L (Slika 6). Fotokemična učinkovitost FS II 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Dejanska FU Potencialna FU no m m mn no o mno a a a a b b a c* Koncentracija Pb (mg/l) Slika 6: Fotokemična učinkovitost FS II pri rastlinah pred poskusom (c*) in različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n= ). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). 25

39 4.2 SVEŽA IN SUHA MASA KORENIN IN POGANJKOV Vpliv različnih koncentracij Pb na rast in razvoj ranega mošnjaka smo ugotavljali tudi z določanjem sveže mase (SvM) (Slika 7) in suhe mase (SM) (Slika 8) korenin in poganjkov ter izračunali vsebnost vode (Slika 9). Sveža masa poganjkov (SvMP) kontrolnih rastlin je statistično značilno večja le od SvMP rastlin, ki so bile izpostavljene 100 mg Pb/L (Slika 7). SvMP rastlin izpostavljenih 10 mg Pb/L je statistično značilno večja od SvMP rastlin, ki so bile izpostavljene 1, 50 in 100 mg Pb/L (Slika 7). Sveža masa korenin (SvMK) kontrolnih rastlin in rastlin izpostavljenih 10 mg Pb/L je statistično značilno večja od rastlin izpostavljenih 5, 50 in 100 mg Pb/L (Slika 7). Rastline izpostavljene 100 mg Pb/L imajo statistično značilno manjšo SvMK od preostalih rastlin (Slika 7). V splošnem lahko trdimo, da imajo rastline izpostavljene 100 mg Pb/L najmanjšo svežo maso poganjkov in korenin (Slika 7). Sveža masa (g) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 ab m b mn ab n a m b n SvMP SvMK c 1,0 0,5 o 0, Koncentracija Pb (mg/l) Slika 7: Sveža masa (g) poganjkov (SvMP) in korenin (SvMK) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=7-12). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). 26

40 Suha masa poganjkov (SMP) kontrolnih rastlin in rastlin izpostavljenih 10 mg Pb/L je statistično značilno večja od rastlin izpostavljenim 5 in 100 mg Pb/L (Slika 8). Rastline izpostavljene 100 mg Pb/L imajo statistično značilno manjšo SMP od preostalih rastlin (Slika 8). Suha masa korenin (SMK) kontrolnih rastlin je statistično značilno večja le od SMK rastlin, ki so bile izpostavljene 100 mg Pb/L (Slika 8). Suha masa korenin rastlin izpostavljenih 10 mg Pb/L je statistično značilno večja od rastlin izpostavljenih 1, 5, 50 in 100 mg Pb/L (Slika 8). Rastline, izpostavljene 100 mg Pb/L, imajo statistično značilno manjšo SMK od preostalih rastlin (Slika 8). V splošnem lahko trdimo, da imajo rastline izpostavljene 100 mg Pb/L najmanjšo suho maso poganjkov in korenin (Slika 8). 0,9 0,8 0,7 a a ab SMP SMK Suha masa (g) 0,6 0,5 0,4 0,3 nm ab n b n m n c 0,2 0,1 0, Koncentracija Pb (mg/l) o Slika 8: Suha masa (g) poganjkov (SMP) in korenin (SMK) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=7-12). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). 27

41 Vsebnost vode v poganjkih kontrolnih rastlin je statistično značilno večja le od rastlin izpostavljenih 100 mg Pb /L (Slika 9). Vsebnost vode v poganjkih rastlin, izpostavljenih 100 mg Pb/L, je statistično značilno manjša od preostalih rastlin (Slika 9). Vsebnost vode v koreninah kontrolnih rastlin je statistično značilno večja od vsebnosti vode v rastlinah izpostavljenih 50 in 100 mg Pb/L (Slika 9). Vsebnost vode v koreninah rastlin, izpostavljenih 100 mg Pb/L, je statistično značilno manjša od preostalih rastlin (Slika 9). V splošnem lahko trdimo, da je vsebnost vode v poganjkih in koreninah najnižja pri rastlinah izpostavljenih 100 mg Pb/L (Slika 9). Vsebnost vode (%) 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 VODAP VODAK m m mn mn n a o a a a a b Koncentracija Pb (mg/l) Slika 9: Vsebnost vode (%) v poganjkih (VODAP) in koreninah (VODAK) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=7-12). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). 28

42 4.3 FOTOSINTEZNA BARVILA Iz suhih in uprašenih poganjkov ranega mošnjaka, ki so bili izpostavljeni različnim koncentracijam Pb, smo izmerili absorpcijo pri različnih valovnih dolžinah in nato izračunali vsebnost klorofila a in b ter koncentracijo karotenoidov. Vsebnost klorofila a in b ter koncentracija karotenoidov kontrolnih rastlin je statistično značilno manjša od vsebnosti klorofila a in b ter koncentracije karotenoidov pri rastlinah izpostavljenih 1, 5 in 10 mg Pb/L (Slika 10). Vsebnost klorofila a in b ter koncentracija karotenoidov je pri rastlinah, izpostavljenih 1 in 10 mg Pb/L, statistično značilno večja od kontrolnih rastlin in rastlin izpostavljenih 50 in 100 mg Pb/L (Slika 10). Vsebnost klorofila a in b ter koncentracija karotenoidov, rastlin izpostavljenih 5 mg Pb/L, je statistično značilno večja od preostalih rastlin (Slika 10). Rastline, izpostavljene 100 mg Pb/L, imajo statistično značilno manjšo vsebnost klorofila a in b ter koncentracijo karotenoidov od preostalih rastlin (Slika 10). V splošnem lahko trdimo, da vsebnost klorofila a in b ter koncentracija karotenoidov narašča vzporedno z naraščanjem koncentracije Pb do vključno 5 mg Pb/L, kjer doseže najvišjo vrednost in prične ponovno upadati ter doseže najnižjo vrednost pri koncentraciji 100 mg Pb/L (Slika 10). Vsebnost klorofilov (mg/g) in koncentracija karotenoidov (µmol/l) 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 c g o b f n a e m Koncentracija Pb (mg/l) b Slika 10: Vsebnost klorofilov (mg/g) in koncentracija karotenoidov (µmol/l) pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). f n c g Chl a (mg/g) Chl b (mg/g) Karotenoidi (μmol/l) o d h p 29

43 4.4 KONCENTRACIJA SVINCA, MAKRO IN MIKROELEMENTOV V POGANJKIH Koncentracijo mikro in makroelementov smo pomerili s pomočjo rentgenskega fluorescenčnega spektrometra na predhodno pripravljenih tabletkah iz posušenih in uprašenih poganjkov Koncentracija Pb Koncentracija Pb je pri rastlinah, izpostavljenih 5, 10, 50 in 100 mg Pb/L, statistično značilno večja od koncentracije Pb v kontrolnih rastlinah (Slika 11). Koncentracija Pb pri rastlinah, izpostavljenih 1 mg Pb/L, je statistično značilno manjša v primerjavi z rastlinami izpostavljenim 10, 50 in 100 mg Pb/L (Slika 11). Pri rastlinah izpostavljenih 5 mg Pb/L, prihaja do statistično značilnega zmanjšanja koncentracije Pb v primerjavi z rastlinami, izpostavljenimi 50 in 100 mg Pb/L (Slika 10). Koncentracija Pb pri rastlinah, izpostavljenih 10 mg Pb/L, je statistično značilno manjša v primerjavi z rastlinami, izpostavljenimi 100 mg Pb/L (Slika 11). Koncentracija Pb pri rastlinah, izpostavljenih 50 mg Pb/L, je statistično značilno manjša od koncentracije Pb pri rastlinah, izpostavljenih 100 mg Pb/L (Slika 11). V splošnem lahko trdimo, da koncentracija Pb v poganjkih narašča z naraščajočo koncentracijo Pb dodano v hranilno raztopino a Koncentracija (mg/kg SM) e de cd bc b Pb Koncentracija Pb (mg/l) Slika 11: Koncentracija (mg/kg SM) Pb v poganjkih pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=3-4). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). 30

44 4.4.2 Koncentracija makroelementov Koncentracija P v poganjkih kontrolnih rastlin in rastlin izpostavljenih 5 mg Pb/L je statistično značilno večja od koncentracije P pri rastlinah izpostavljenih 1, 10, 50 in 100 mg Pb/L (Slika 12). Rastline, izpostavljene 50 in 100 mg Pb/L, imajo statistično značilno manjšo koncentracijo P od preostalih rastlin (Slika 12). Do statistično značilnega zmanjšanja koncentracije S, v primerjavi s kontrolnimi rastlinami, prihaja le pri rastlinah izpostavljenih 100 mg Pb/L (Slika 12). Koncentracija Ca se med kontrolnimi rastlinami in preostalimi rastlinami ne razlikuje statistično značilno (Slika 12). Rastline, izpostavljene 1 in 10 mg Pb/L, imajo statistično značilno večjo koncentracijo Ca v primerjavi z rastlinami, ki so bile izpostavljene 100 mg Pb/L (Slika 12). Pri rastlinah, izpostavljenih 5 mg Pb/L, smo zabeležili najvišjo koncentracijo Ca, ki je statistično značilno večja od koncentracije Ca pri rastlinah izpostavljenih 50 in 100 mg Pb/L (Slika 12). Koncentracija K se v primerjavi s kontrolnimi rastlinami statistično značilno zmanjša le pri rastlinah izpostavljenih 100 mg Pb/L (Slika 12). Rastline, izpostavljene 5 mg Pb/L, imajo statistično značilno večjo koncentracijo K kot rastline izpostavljene 50 in 100 mg Pb/L (Slika 12). Rastline, izpostavljene 100 Pb/L, imajo statistično značilno manjšo koncentracijo K od preostalih rastlin (Slika12). Koncentracija (mg/kg SM) a kl fgh d kl fg de b k f a de b kl fg de c l gh de Koncentracija Pb (mg/l) Slika 12: Koncentracija (mg/kg SM) makroelementov (P, S, Ca, K) v poganjkih pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=3-4). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). c m e h Konentracija (mg/kg SM) P S Ca K 31

45 4.4.3 Koncentracija mikroelementov Koncentracije Mn v poganjkih se pri različnih koncentracija Pb ne razlikujejo statistično značilno (Slika 13). Koncentracija Fe, se v primerjavi s kontrolnimi rastlinami, statistično značilno zmanjša pri rastlinah izpostavljenih 50 in 100 mg Pb/L (Slika 13). Koncentracija Zn, se v primerjavi s kontrolnimi rastlinami, statistično značilno zmanjša le pri rastlinah izpostavljenih 100 mg Pb/L (Slika13). Rastline izpostavljene 1 in 5 mg Pb/L imajo statistično značilno večjo koncentracijo Zn, kot rastline izpostavljene 50 in 100 mg Pb/L (Slika 13). Rastline izpostavljene 100 mg Pb/L imajo statistično značilno manjšo koncentracijo Pb kot kontrolne rastline in rastline izpostavljene 1, 5 in 10 mg Pb/L (Slika 13). Koncentracija (mg/kg SM) de a d a d a b bc bc bc c c de Koncentracija Pb (mg/l) a ef Slika 13: Koncentracija (mg/kg SM) mikroelementov (Mn, Fe in Zn) v poganjkih pri različni izpostavljenosti Pb (povprečje ± standardna napaka, n=3-4). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). a a f Koncentracija (mg/kg SM) Mn Fe Zn 32

46 4.5 OKSIDATIVNI STRES (LIPIDNA PEROKSIDACIJA) Lipidno peroksidacijo oziroma poškodbe na celičnih membranah ranega mošnjaka, ki so nastale zaradi izpostavljenosti Pb, smo določili preko vsebnosti malondialdehida (MDA) v predhodno pripravljenih vzorcih. Vsebnost MDA v koreninah kontrolnih rastlin je statistično značilno večja od vsebnosti MDA pri rastlinah izpostavljenim 1, 10 in 100 mg Pb/L (Slika 14). Vsebnost MDA v poganjkih kontrolnih rastlin in rastlin, izpostavljenih 100 mg Pb/L, je statistično značilno večja od vsebnosti MDA v rastlinah izpostavljenih 1, 5, 10 in 50 mg Pb/L (Slika 14). Vsebnost MDA v poganjkih rastlin je v vseh vzorcih večja od vsebnosti MDA v koreninah (Slika 14). MDA ekvivalent (nmol/g) 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 a m n n n n b ab b ab b m Korenine Poganjki 0, Koncentracija Pb (mg/l) Slika 14: MDA ekvivalent v koreninah in poganjkih rastlin izpostavljenim različnim koncentracijam Pb (povprečje ± standardna napaka, n=5). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (p < 0,05). 4.6 LOKALIZACIJA SVINCA NA TKIVNEM NIVOJU Lokalizacija Pb in Ca na prečnih prerezih listov Z metodo LA-ICP-MS smo na prečnem prerezu listov raziskali lokalizacijo Pb in Ca v posameznih listnih tkivih. Slike, narejene z LA-ICP-MS kažejo, da se skoraj ves Pb lokalizira v spodnji in zgornji povrhnjici, ne glede na koncentracijo, ne moremo pa točno določiti ali v simplastu ali apoplastu (Slika 15a-d). Tudi kontrolne rastline kažejo manjšo prisotnost Pb v povrhnjici 33

47 (Slika 15a). Jakost signala za Pb narašča z naraščajočo koncentracijo Pb v hranilni raztopini (Slika 15a-d). Na slikah je razvidno, da se Ca večinoma lokalizira v mezofilu neglede na koncentracijo Pb, ne moremo pa določiti ali prevladuje v stebričastem ali gobastem mezofilu. Jakost signala za Ca je najbolj intenziven pri kontroli, najmanj intenziven pa pri rastlinah, izpostavljenih 1 mg Pb/L (Slika 15a-b). Signal za Ca je pri rastlinah, izpostavljenih 10 mg Pb/L, primerljiv signalu pri rastlinah, izpostavljenih 100mg Pb/L, oba pa sta nekoliko šibkejša v primerjavi s kontrolo (Slika 15a, c, d). a b c d Slika 15: a-d) Mapa lokalizacije Pb (red/rdeč) in Ca (blue/moder) (a-d) posnete z metodo LA-ICP-MS na prečnem prerezu listov ranega mošnjaka pri različni izpostavljenosti Pb (mg/l). Barvna lestvica je podana v µg/g. 34

48 4.6.2 Lokalizacija Pb na prečnih prerezih listov in pecljev Z metodo protonsko inducirane emisije rentgenskih žarkov (mikro-pixe) smo na izbranih prečnih prerezih listov in listnih pecljev raziskali količinsko razporeditev in koncentracijo Pb po celotnih vzorcih in posameznih presekih. Raziskani prečni prerezi listnih pecljev so pokazali, da se največ Pb nalaga v zgornji in spodnji povrhnjici (epidermisu), v manjših koncentracijah pa je prisoten tudi v mezofilu in vaskularnem tkivu (Slika 16g-i). Največje koncentriranje Pb v povrhnjici, opazimo pri rastlinah, izpostavljenih 100 mg Pb/L (Slika 16i). Kvantitativne mape za peclje kontrolnih rastlin in rastlin izpostavljenih 1 ter 5 mg Pb/L niso prikazane, ker so bile koncentracije Pb prenizke za ustvarjanje zanesljivih slik. a d ( µm) b e ( µm) f ( µm) c g 10 Pb h 50 Pb i 100 Pb Slika 16:a-i) Slike prečnih prerezov listnih pecljev posnete s svetlobnim mikroskopom (a-c) in ionsko presevno mikroskopijo (STIM) (d-f) ter kvantitativne elementarne mape (g-i) izbranih koncentracij Pb (mg/l). Koncentracijska skala je logaritemska v µg/g. 35

49 Raziskani prečni prerezi listov so podobno kot prečni prerezi pecljev pokazali, da se največ Pb nalaga v zgornji in spodnji povrhnjici. Manj intenzivno nalaganje Pb smo opazili znotraj mezofila in vaskularnega tkiva (Slika 17m-s). Ugotovili smo, da se je nekaj Pb nakopičilo tudi v tkivih kontrolnih listov (Slika 17m). Do največjega koncentriranja Pb je prišlo v povrhnjici listov rastlin, ki so bile izpostavljene visokim koncentracijam Pb (Slika 17r in s). m Kontrola a g ( µm) b h ( µm) n 1Pb i ( µm) o 5Pb c se nadaljuje 36

50 nadaljevanje Slike 17 d e f j ( µm) p 10Pb k ( µm) r 50Pb l ( µm) s 100Pb Slika 17:a-s) Slike prečnih prerezov listov posnete s svetlobnim mikroskopom (a-f) in ionsko presevno mikroskopijo (STIM) (g-l) ter kvantitativne elementarne mape (m-s) Pb (mg/l). Koncentracijska skala je logaritemska v µg/g. 37

51 4.7 PORAZDELITEV ELEMENTOV NA ORGANSKEM NIVOJU Elementarne mape izbranih elementov so bile opravljene na listih kontrolnih rastlin in na listih rastlin, ki so bile izpostavljene različnim koncentracijam Pb. Meritve so bile opravljene v Berlinu na 2D XRF-u. Iz posnetih elementarni map smo ugotovili, da je signal za kalij (K) pri kontrolnem listu in listih izpostavljenih različnim koncentracijam Pb enako intenziven, podobno pa opazimo tudi za kalcij (Ca) (Slika 18). Pri fosforju (P) smo v primerjavi s kontrolnim listom opazili močnejši signal le pri listu, izpostavljenemu 5 mg Pb/L (Slika 18). Signal za svinec (Pb) je v primerjavi s kontrolnim listom in ostalimi listi intenziven le pri listu, ki je bil izpostavljen 100 mg Pb/L (Slika 18). Šibek signal pri kontrolnem listu in listih izpostavljenih različnim koncentracijam Pb smo zaznali tudi za žveplo (S) in (Zn) (Slika 18). Močnejši signal za klor (Cl) smo v primerjavi s kontrolnim listom zaznali pri listih, izpostavljenih 10 in 100 mg Pb/L, med listi izpostavljenim 1, 5 in 50 mg Pb/L nismo zaznali razlik v moči signala (Slika 18). V primerjavi s kontrolnim listom smo šibkejši signal za železo (Fe) zaznali le pri listu izpostavljenem 100 mg Pb/L. Med kontrolnim listom in listi izpostavljenim 1, 5, 10 in 50 mg Pb/L ni večjih razlik v intenzivnosti signala za Fe (Slika 18). Na spodnjih slikah si koncentracije Pb (mg/l) v listih sledijo na način, kot je prikazano na spodnji fotografiji fotografija K P Pb S Zn se nadaljuje 38

52 nadaljevanje Slike 18 Ca Cl Fe Slika 18:Elementarne mape posnete na listih kontrolnih rastlin in na listih rastlin izpostavljenim različnim koncentracijam Pb, opravljene z 2D XRF-om. 4.8 VEZAVNE OBLIKE SVINCA V KORENINAH IN LISTIH Z METODO RENTGENSKE ABSORPCIJSKE SPEKTROMETRIJE Vezavne oblike Pb smo določili z metodo rentgenske absorpcijske spektrometrije finih struktur na Pb-L3 robu (angl. EXAFS, extended X-ray absorption fine structure), kjer smo določili število in razdaljo do sosednjih atomov v prvi in drugi lupini. Spektri so prikazani na Sliki 19. Rezultati kažejo, da je Pb v rastlinah, ki so rasle na hidroponiki tako v koreninah kot v poganjkih, vezan na kisikove atome (-OH in -COOH skupine celične stene; Pb-O-C koordinacija), kot ligand pa se pojavlja tudi fosfat (Pb-O-P koordinacija). Za primerjavo smo določili tudi vezavne oblike pri rastlinah iz narave, kjer se kaže rahlo drugačna okolica Pb. Tako v listih kot koreninah še vedno prevladujejo kisikovi ligandi, vendar se v listih namesto fosfata pojavlja žveplo (Pb-S-C, koordinacija Pb na tiolne skupine). 39