Microsoft Word - Novi trendi.doc

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO AVTOMATIZIRANA ANALIZA: NOVE TEHNIKE PRIPRAVE VZORCA V KLINIČNI IN FARMACEVTSKI ANALIZI Prof. dr. Boris Pihlar Napisala: Ana Trkovnik V Ljubljani, junij

2 KAZALO 1. UVOD 1 2. TEHNIKE PRIPRAVE VZORCA TRDNO FAZNA EKSTRAKCIJA (SPE) TRDNO FAZNA MIKROEKSTRAKCIJA (SPME) 3 3. in-tube TRDNO- FAZNA MIKROEKSTRAKCIJA AVTOMATIZIRAN on-line in-tube SPME SISTEM AVTOMATIZIRAN on-line in-tube SPME SISTEM EKSTRAKCIJSKI MEHANIZEM PRI in-tube SPME 5 4. PRIČAKOVANJA V PRIHODNOSTI 6 5. SLIKE 7 6. LITERATURA 9 2

3 1.UVOD Priprava vzorca je potrebna, da izoliramo željene komponente iz kompleksa matriksa, zato ker večina analitskih instrumentov ne more rokovat direktno z matriksom. Prikazala bom pregled novejših tehnik priprave vzorca v forenzični, klinični in farmacevtski analizi. Potreba po analizi zdravil v bioloških vzorcih in farmacevtskih produktih postaja vse bolj in bolj pogosta z razvojem bolj izbranih in bolj efektivnih zdravil in za potrebo po večjem razumevanju terapevtskih in toksičnih efektov. Poznavanje nivoja zdravila v telesnih tekočinah, kot so serum in urin omogoča, da je farmakoterapija optimizirana in zagotavlja osnovo za študij farmakokinetike, genetike, Kvantitativna in kvalitativna analiza zdravil in metabolitov ima razširjeno uporabo v farmakokinetičnih raziskavah. TDM terapevtski zdravilni monitoring se uporablja za izboljšanje napredka v zdravilni terapiji. Zlorabo zdravil, uporabo nedovoljenih zdravil in zastrupitve z zdravili in strupi analizirajo v klinični in sodno medicinski toksikologiji. Biološki materiali in farmacevtski produkti so kompleksni in pogosto vključujejo proteine, soli, kisline, baze in organske komponente podobne lastnostim analita. Poleg tega je analit v vzorcu pogosto v nizkih koncentracijah. Odvisno od izvora vzorca, uporabljajo različne instrumente v različnih okoliščinah kot so: klinična kontrola, dopping kontrola, forenzična analiza in toksikologija. Ker večina instrumentov ne deluje direktno na matriks je ponavadi potrebena predpriprava vzorca zato, da izoliramo in koncentriramo analit iz matriksa. Na splošno je analitski proces razdeljen na pet korakov: vzorčevanje, priprava vzorca, separacija, detekcija in analiza podatkov. Vzorčenje in priprava vzorca porabi več kot 80% analitskega časa. Priprava vzorca lahko vključuje postopek čiščenja vzorca. Problem lahko predstavlja izolacija in merjenje organske komponente v biološkem matriksu posebno v nizkih koncentracijah. Zelo pomembno pri pripravi vzorca je: - minimalna izguba vzorca - koeksistencialne komponente morajo biti učinkovito odstranjene - problemi ne smejo nastajat v kromatografskem sistemu - postopek mora biti ustrezen in hiter - nizka cena analize Prejšne tehnike priprave vzorca so vsebovele mnogo slabih strani kot so: neenostavnost, porabile so veliko časa, potrebne so bile velike količine vzorca in organskih raztopin imeli so težave pri avtomatizaciji (večstopenjska priprava vzorca lahko povzoči izgubo vzorca). Poleg tega uporaba večjih količin škodljivih kemikalij in topil obremeni okolje in poveča tveganje laboratorijskega osebja, kar privede do dragih postopkov zdravljenja. Idealno bi bilo, če bi bile tehnike priprave vzorca hitre, enostavne za uporabo in kompatibilne z vrsto analitskih instrumentov. Slika 1 prikazuje glavne tehnike za pripravo plinastih, tekočih in trdnih 3

4 vzorcev: trdno-fazna ekstrakcija (SPE), trdno-fazna mikro ekstrakcija (SPME), superkritična fluidna ekstrakcija (SFE) in ekstrakcija na osnovi membrane (MBE). SPE Plinasti vzorci MBE SFE Tekoči vzorci SPME Tekoča Ekstrak. Trdni vzorci LPME Slika 1: Glavne ekstrakcijske tehnike za plinaste, tekoče in trdne vzorce Tradicionalna ekstrakcija tekoče tekoče (LLE) se sooča z mnogimi omejitvami npr. topilo, ki se ne meša z vzorcem težko ekstrahira polarne in ionske komponente iz vode, potreben je velik volumen organskih topil, kar vpliva tudi na razredčenost. Da preprečimo te slabe strani združimo dve glavne tehnike SPE (trdno-fazna ekstrakcija) in SPME (trdno-fazna mikro ekstrakcija), ki tvorita čiste ekstrakte za analizo. Pri SPE tehniki se vzorec prefiltrira skozi trdno fazo, ki zadrži raztopljene snovi, ki niso zaželjene, kasneje jih eluiramo z majhnim volumnom. Prednosti te tehnike so visoke koncentracije končnega ekstrakta, selektivnost in velika izbira trdnih faz, kar omogoča ekstrakcijo praktično vseh komponent vodnih ali organskih. Poleg tega ima tak sistem možnost avtomatizacije in sklopitve s kromatografijo. Slabost te tehnike je, da je včasih končna raztopina nezdružljiva z analitskim sistemom, tako da raztopino izparimo, preostanek pa raztopimo v ustreznem topilu. Ta problem rešimo z uporabo SPME, ki je tehnika brez topila. Kot prikazuje Slika 1 je SPME uporabna za ekstrakcijo plinastih, tekočih in trdnih vzorcev, ekstrahiran analit pa je lahko direktno predstavljen GC. Tekočinska-fazna mikroekstrakcija LPME vsebuje prozorna, polipropenska, votla vlakna. To metodo uporabljajo v analizi zdravil. 4

5 Imuno afinitetna ekstrakcija (IAE) in molekulska IMPRINTED POLAMER BASED ekstrakcija (MIP) bazirata na absorpciji ali ločevanju vzorca. Končni cilj priprave vzorca je izolacija in čistost analita in predstavitev analita GC, HPLC in kapilarni elektroforezi (CE). Avtomatiziran sistem priprave vzorca uporablja kombinacijo ene ali več tehnik. 3. TEHNIKE PRIPRAVE VZORCA LLE metoda za pripravo bioloških vzorcev je postala popolnoma avtomatizirana, uporablja 96 WELL PLATE in 96 robotskih programov. Vsak WELL ima filter sestavljen iz inertnih diatomnih delcev, ki omogoča nepretrgano in učinkovito ekstrakcijo analita med vodno in organsko fazo. Ekstrakcijski čas je relativno kratek. SFE se uporablja za ekstrahiranje in selekcioniranje anti vnetnih zdravil v plazmi. Nove različice membranskih tehnik so mikrodialize, ki so široko uporabne za in-vivo vzorčenje in elektrodialize. LPME trdno-fazna mikro ekstrakcija je nova tehnika za pripravo vzorca, ki je hitra, poceni in minimalno izpostavljena toksičnim organskim topilom. Je kompatibilna z kapilarno GC, CE in HPLC. Uporabna je za pripravo bioloških vzorcev za analizo različnih zdravil, kot so antidepresivi in osnovna zdravila. Bolj podrobno bom obravnavala SPE in SPME, ki sta široko uporabni v forenzični, klinični in farmacevtski industriji TRDNO FAZNA EKSTRAKCIJA (SPE) SPE je široko uporabna za pripravo vzorcev v farmacevtski analizi in pri zlorabi zdravil. SPE ima naslednje prednosti pred običajno tekočo-tekočo ekstrakcijo: - velika ponovljivost - bolj efektivne koncentracije - manjša poraba organskih topil - krajši čas priprave vzorca - ni težav s penjenjem - enostavno delovanje - enostavna priključitev na avtomatski proces Osnova SPE je delitev komponent med tekočo fazo (vzorec) in trdno fazo. Retenzija lahko vključuje nepolarne, polarne in ionske interakcije. Na voljo je široka vrsta SPE sorbentov. Primarna odločitev analitika je izbira sorbenta. SPE sorbenti, ki se največkrat uporabljajo so: diatomska zemlja Extelut, Chem Elut, Bond Elut, 5

6 Slika 2 prikazuje shemo dvojnega- kolonskega preklopnega sistema. RAM kolone so narejene, da zaščitijo ali omejijo velike molekule, da prestopijo notranjo absorpcijsko stran vezne faze. Tak tip kolon ima notranjo površino prekrito z vezno- reverzno faznim materialom, zunanja površina pa je prekrita z neabsorpcijskim vendar hidrofilnim materialom. Ta dvojno fazna kolona omogoča efektivno separacijo analita od makromolekul v matriksu vzorca; zdravila in druge majhne molekule vstopijo v pore hidrifilne reverzne faze in se ločijo in zadržijo, medtem ko so proteini in večje komponente matriksa zunaj. Pri HPLC metodi za določevanje in selekcioniranje nesteroidnih antivnetnih zdravil uporabljajo RAM kolone. Pri teh kolonah je nekaj pomanjkljivosti kot so: retenzijski čas je lahko dolg (>10min), kolona mora biti oprana med injiciranjem in mobilna faza ni vedno kompatibilna z nekaterimi tehnikami kot so LC/MS/MS. 2.3.TRDNO FAZNA MIKROEKSTRAKCIJA (SPME) SPME je odkril Pawliszyn leta Je nova tehnika priprave vzorca, ki uporablja silikonska vlakna, ki so na zunaj prekrita s primerno stacionarno fazo. Analit iz vzorca direktno izvleče v vlakno. Ta razporeditev združi vse korake priprave vzorca v en korak. Ta metoda prihrani čas priprave, topilo in denar in lahko izboljša mejo detekcije. Rutinsko se uporablja v kombinaciji z GC in GC/MS in je široko uporabna za različne plinske, tekoče, in trdne vzorce, še posebno za ekstrakcijo hlapnih organskih komponent v bioloških in živilskih vzorcih. SPME je lahko direktno sklopljena z HPLC in LC/MS za analizo slabo hlapnih in termično nestabilnih komponent katerim ni dostopna GC ali GC/MS. Glavne prednosti SPME tehnike so: - enostavnost - hitrost - eliminacija topila - visoka občutljivost - majhen volumen vzorca - relativno nizka cena - enostavna avzomatizacija Od leta 1995 so razvili veliko število SPME metod za ekstrakcijo iz različnih bioloških vzorcev kot so urin, serum, plazma, kri, slina in lasje. Mehanizem ene od SPME sestavlja skupino vlaken. Primerno debelino vlakna se izbere glede na snov, ki jo preiskujemo. Večina SPME metod se uporablja v forenzični in toksikološki analizi. 3. in-tube TRDNO- FAZNA MIKROEKSTRAKCIJA Nova tehnika priprave vzorca je tudi in-tube SPME, ki uporablja odprto cevasto kapilaro. Lahko je sklopljena z HPLC ali LC/MS. In tube SPME je lahko avtomatizirana, za ekstrakcijo, desorpcijo in injiciranje lahko uporabljamo standardni avtosempler. Avtomatizacija vzorca skrajša čas analize in je tudi bolj točna in natančna od ročne tehnike. Organske komponente in vodni vzorec se direktno ekstrahirajo v notranjo stacionarno fazo kapilare nato se desorbira v toku mobilne faze ali desorpcijskega topila, če je analit močnejše adsorbiran na kapilari. Desorbirane komponente nato injiciramo v kolono za anlizo. 6

7 3.1. AVTOMATIZIRAN on-line in-tube SPME SISTEM Slika 3 prikazuje shemo avtomatiziranega in-tube SPME/LC-MS sistema. Avtosempler iz te opreme je primeren tako za on-line kot za in-tube SPME/LC-MS sistem. Saito je konstruiral in-tube SPME sistem, ki uporablja dve črpalki in mikroinjekcijo. Slika 3A prikazuje kako pod nadzorom računalnika injekcijska igla hitro povleče in injicira vzorec v vialo. Desorbiran analit se transportira v HPLC kolono in se separira, nato ga detektira UV ali masni detektor. Injekcijska zanka prepreči kontaminacijo črpalke z vzorcem. Vlek in injiciranje vzorčne raztopine, preklop ventila, kontrola opreme kot je HPLC in MSD in analiziranje podatkov je računalniško kontrolirano. Rezultat je prihranek in visoka natančnost. Razen tega, in-tube SPME tehnika kombinirana z LC-MS lahko rokuje z zelo različnimi komponentami, od nizke do visoke molekulske teže in od nizke do visoke hlapnosti. Za veliko število vzorcev je možna uporaba avtosemplerja s podaljšano roko, zato ker se injekcijska igla in kapilarna kolona pred vzorcem opereta v metanolu in mobilni fazi. 7

8 Fiber SPME Zunanja igla Notranja igla Stacionarna faza Silikonsko vlakno Grelec z mešalom Analit In-tube SPME Kapilarna kolona Stacionarna faza Injekcijska igla Analit Slika 4: Ekstrakcija analita z fiber SPME in in-tube SPME 8

9 Slika 4 prikazuje prenos analita v ekstrakcijskem procesu SPME. Teoriji fiber SPME in in-tube SPME sta podobni. Pomembna razlika med tema dvema metodama je, da se pri fiber SPME analit adsorbira na notranjo površino vlakna, pri in-tube SPME pa se analit adsorbira na notranjo površino kapilarne kolone s pretočno vzorčno raztopino. Pri in-tube SPME je potrebno preprečiti zamašitev kapilare in pretočne linije s filtriranjem raztopine vzorca pred ekstrakcijo. V primeru fiber SPME ni potrebno odstraniti delcev pred ekstrakcijo, zato ker vlakno preden ga vstavimo v desorpcijsko celico operemo. Z vlakni je treba delati previdno, ker so krhka in se hitro zlomijo, plašč vlakna se lahko poškoduje med vstavljanjem in tresenjem. Komponente z visoko molekulsko težo, kot so proteini, se lahko adsorbirajo ireverzibilno na vlakno to spremeni lastnosti stacionarne faze in ekstrakcija je neuporabna. Odprta cevna GC kapilarna kolonaje zelo trdna in uporabna v SPME napravi za in-tube SPME sklopljeno z HPLC ali LC-MS AVTOMATIZIRAN on-line in-tube SPME SISTEM In-tube SPME je ekstrakcijska metoda prenosa analita, ki je odvisna od razporeditvenega koeficienta analita prav tako tudi pri fiber SPME. Pomembno je povišanje razporeditvenega faktorja na stacionarni fazi, da dosežemo hitro in učinkovito ekstrakcijo. Pri in-tube SPME je količina ekstrahiranega analita v stacionarni fazi kapilarne kolone odvisna od faktorjev, kot so polariteta kapilare, število in volumen ciklov (vlek/injiciranje) in ph vzorca. Pri in-tube SPME je v uporabi veliko komercialnih kapilarnih kolon. Kolone imajo različne lastnosti kot so selektivnost stacionarne faze, notranji premer, dolžina in debelina filma. Za primer: nizko polarna kolona z metil-silikonsko tekočo fazo zadrži hidrofobne komponente, visoko-polarna kolona z polietilen-glikolno tekočo fazo zadrži hidrofilne komponente. Ovrednotili so ekstrakcijsko učinkovitost nekaj kapilarnih kolon. Kot prikazuje slika 5A, Omegawax z polietilen-glikol tekočo fazo je primeren za ekstrakcijo relativno visoko polarnih komponent. Če se dimenzije povečajo, se širina vrha razširi in zniža. Če je debelina filma stacionarne faze velika, se lahko ekstrahirajo velike količine komponent, kvantitativna desorpcija komponent na kapilarni koloni je lahko različna (iz izkušenj je primerna dolžina kolone cm, ki minimalno niža vrh). Možnost za povečanje ekstrakcijske učinkovitosti analita v stacionarni fazi pri SPME je spreminjanje ph in nivoja soli vzorčne raztopine. Kisle in bazične komponente so učinkoviteje ekstrahirajo iz kislih in alkalnih raztopin vzorcev. Slika 5B prikazuje, da je ekstrakcijska učinkovitost nekaterih bazičnih zdravil optimalna pri ph 8,5 (Tris-HCl pufer), optimalna koncentracija pufra je mM. Hidrofilna topila, kot je naprimer metanol zniža učinkovitost ekstrakcije ker poveča topnost komponent v vzorcu. Količina ekstrahiranih komponent na stacionarni fazi je odvisna od koncentracije komponent v vzorcu. 9

10 3.3. EKSTRAKCIJSKI MEHANIZEM PRI in-tube SPME Komercialne odprto cevne kapilarne kolone so se v glavnem uporabljale pri in-tube SPME. Odkrili so različne mehanizme SPME, da bi izboljšali učinkovitost in selektivnost. Bolj primerna je ekstrakcija relativno polarnih komponent iz vodnih vzorcev, ki zvišajo občutljivost metode. Na začetku odkritja kapilarnih kolon so bile notranje stene kapilare prekrite z polipirolnim polimerom (PPY), tako prekrita kapilara je bila uspešno uporabljena za analizo β-blokerjev v urinu, serumu in laseh. Pred kratkim je Mullet sintetiziral adsorbent MIP za in-tube SPME. Naravna selektivnost in kemijska in fizikalna moč MIP materiala je bila prikazana kot efektivni stacionarni material za in-tube SPME. Prekoncentracija vzorca z MIP adsorbentom poveča občutljivost. Mullet je prav tako odkril avtomatizirano bio-kompatibilno in-tube SPME metodo z uporabo RAM. Uporaba RAM kapilare omogoča direktno ekstrakcijo različnih benzodiazepinov iz vzorcev seruma. Musshoff je odkril avtomatizirano trdno-fazno dinamično ekstrakcijo SPDE, ta tehnika je podobna in-tube. Uporablja votlo iglo v notranjosti prevlečeno z PDMS namesto kapilarne kolone. Ta tehnika je primerna za ekstrakcijo sklopljeno z GC-MS in je uporabna za določevanje amfetaminov in sintetičnih drog v vzorcih las. 4. PRIČAKOVANJA V PRIHODNOSTI Kot je bilo opisano v tem članku, so bile tehnike priprave vzorca za LLE, IAE, LPME, MBE, SPE in SPME odkrite pred kratkim. Od teh je SPE je najbolj razširjena in najbolj pomembna v vseh laboratorijih po svetu. Razvoj SPE se je pokazal v zadnjem desetletju z mnogimi izboljšavami, oblikami, avtomatizacijo in uvajanjem novih faz. Multi-well plates so prav tako pričakovani v prihodnosti avtomatiziranega analitskega sistema z uporabo robota. SPME je prišla kot zanimiva alternativa SPE in LLE. SPME je koncentracijsko ekstrakcijska tehnika brez topila. Uporabna je v analizi zdravil in metabolitov v bioloških tekočinah. In tube SPME tehnika je zelo učinkovita tehnika priprave vzorca za kvalitativno in kvantitativno analizo. Glavne prednosti in-tube SPME so enostavnost, hitrost, eliminacija topila, velika občutljivost, majhen volumen vzorca, nizka cena in enostavna avtomatizacija. In-tube SPME se uspešno uporablja za polarne in nepolarne komponente v tekočih vzorcih in se enostavno sklaplja z različnimi analitskimi metodami kot so HPLC, LC.MS in CE. Možnost za izboljšanje ekstrakcijske učinkovitosti je v nedaljnjem odkrivanju novih kapilarnih polnil z novimi materiali in s kombinacijo različnih analitskih instrumentov. Trendi, ki prihajajo so: - poenostavitev priprave vzorca - povečanje zanesljivosti in natančnosti priprave vzorca - odstranitev postopka čiščenja z uporabo selektivnih ekstrakcijskih postopkov V prihodnosti se kaže zanimanje za avtomatizacijo postopka priprave vzorca, ker se s tem izboljša natančnost, je hitrejša in cenejša. 10

11 6. LITERATURA 1. H. Kataoka: New trends in sample preparation for clinical and pharmaceutical analysis, Trends in Analitical Chemistry, Vol. 22, No. 4, 2003 (v celoti) 11