Virotrap: A Synthetic Biology Approach Against HIV

Transkripcija

1 Sintezna biologija za bionanotehnologijo Roman Jerala Kemijski inštitut FKKT UL 6. Nanotehnološki dan 17. september 2010

2 Nanomateriali imajo številne tehnološke ugodne lastnosti. Bio-Nanomateriali Večinoma so pripravljeni iz anorganskih ali organskih materialov enega tipa relativno enostavne strukture. Biološki sistemi so nanosistemi, ki dejansko delujejo! Prednosti! Ali znamo sestaviti umetne nanostroje in nanostrukture?

3 Bio-nanostrukture v naravi

4 Prednosti Bio-Nanomaterialov -Samosestavljivost -Tvorba kompleksnih 3D struktur in njihovo povezovanje -Raznolike lastnosti mehanske, električne, optične, kemijske... -Cenena izdelava z industrijskimi mikroorganizmi -Biokompatibilnost za medicinske aplikacije

5 Kaj je sintezna biologija Načrtovanje in ustvarjanje novih bioloških funkcij in sistemov Inženiring bioloških sistemov Celična tovarna

6 odularna osnova sintezne biologije Dva temeljna pristopa sintezne biologije Spreminjanje obstoječih bioloških sistemov Rekonstrukcija novih bioloških sistemov: Tvorba celotnega genoma Sestavljanje najmanjših sistemov, ki se lahko podvajajo

7 odularna osnova sintezne biologije DNK moduli kot navodilo za izvajanje celičnega programa BioBricks (BioKocke) kot modularni gradniki: - regulatorna zaporedja - zapisi za proteine

8 Kemijska sinteza genov Avtomatska sinteza določenega nukleotidnega zaporedja 1985 prvi sintetični gen v tedanji Jugoslaviji pr. 300 nukleotidov danes ga za 250 dobimo v dveh tednih Danes s pomočjo robotov lahko sestavimo DNK velikosti več 10,000 nt kemijska sinteza oligonukleotidov parjenje povezovanje vnos v celico vstavitev v plazmid

9 Področja uporabe sintezne biologije diagnostika in zdravljenje bolezni obnovljivi viri energije novi materiali & bionanomateriali procesiranje informacij biosenzorji in bioremediacija okolja...

10 Sintezna biologija za pripravo zdravil Sinteza zdravila proti malariji 250 milijonov okuženih 1 milijon žrtev letno Izolacija iz enoletnega pelina visoka cena artemisinin

11 Sintezna biologija za pripravo zdravil Prenos biosintezne poti v bakterije pomočjo sintezne biologije

12 Sintezna biologija za obnovljive vire energije Obnovljivi viri energije iz biomase encimi biomasa iz rastlin celuloza sladkorji CO 2 pretvorba z mikroorganizmi gorivo

13 Priprava goriva iz rastlinske biomase v bakterijah Steen in sod. Nature 2010

14 Uporaba celic za procesiranje informacij DNK vsebuje gostoto informacije ~1 bit/nm 3, kar je bistveno več kot obstoječi elektronski mediji DNK omogoči izvajanje logičnih operacij

15 Sinhrona bakterijska ura Danino, Nature 2010

16 Bakterijski števec Friedland, Science 2009

17 Dosežki sintezne biologije na Kemijskem inštitutu Sintezna imunologija: Spreminjanje celične signalizacije detekcija virusa, spreminjanje celičnega odziva Priprava cepiv nove generacije Bionanotehnologija: Priprava nanomaterialov na osnovi DNK in peptidov

18 igem mednarodno tekmovanje gensko spremenjenih strojev 2004: srečanje petih ameriških ekip (MIT, BU, Caltech, UT Austin, Princeton) 2005: prvo mednarodno srečanje: 13 ekip, 2 evropski (ETH in Cambridge), ni formalnih nagrad in sodnikov 2006: 37 ekip iz vsega sveta 2007: 54 ekip 2008: 84 ekip 2009: 121 ekip 2010: 128 ekip

19 Celični odziv Projekt 2006 zmanjšanje pretiranega imunskega odziva Sepso sproži pretiran vnetni odziv, ki ga sprožijo sestavine patigenih bakterij 200,000 žrtev letno v EU, ni učinkovitega zdravila Osnovni koncept: zmanjšanje pretiranega celičnega odziva Okužba zmanjšanje odziva

20 Model z dodano negativno povratno zanko signalna veriga zaviralec zaustavi pretiran odziv vnetni posredniki

21 Slovenska ekipa je v prvem nastopu osvojila Grand Prize.

22 Slovenski igem projekt 2007 detekcija virusne okužbe, ki je neobčutljiva za mutacije

23 Virusni senzor na osnovi dimerizacije CCR5 CD4 HIV-I virus cepitev membranskega sidra (TEV substrate fuzija receptorja z deli TEV proteaze aktivirana TEV proteaza T7 RNAP NLS signal premik v jedro prepisovanje protivirusnih obrambnih genov (e.g. interferon, ApoBec...)

24 Povezava dveh korakov: aktivacija celic na osnovi TEV-T7 kontrola + gp120 + HIV psevdovirus

25

26 Sintetično cepivo proti bakteriji Helicobacter pylori igem2008

27 Izogibanje imunskega sistema E. coli H. pylori Flagelin Aktivacija celice: kemokini citokini interferon... TLR5 NFκB P50/52 Flagelin TLR5 ne prepozna flagelina H. pylori

28 Sestava sintetičnega cepiva prirojen imunski odziv pridobljen imunski odziv (proti antigenom H.pylori) Variabilna domena flagelina H. pylori Aktivacija prirojene imunosti (TLR5) proteinski antigeni (aktivacija adaptivne imunosti) H. pylori antigen (npr. UreB)

29 DNK cepivo Celični in humoralni imunski odziv himerni flagelin- H. pylori antigen DNK cepivo NFκB P50/52 activation TLR5 Prezentacija antigena, aktivacija citokinov,... DC, makrofagi Tkivo

30

31

32 [primerjava DNK in polipeptidov kot gradnikov nanostruktur] DNK vsebuje 4 nukleotide s podobnimi lastnostmi - se lahko zvije v določene 3D strukture +/- v naravi shranjuje informacije lahko se programira (W-C bazni pari) - + polipeptidi vsebujejo 20 AK z različnimi kemijskimi lastnostmi + se lahko zvijejo v določene 3D strukture + v naravi gradijo strukture in funkcionalne naprave + informacija kodira strukturo na kompleksen način - intro

33 [kontrola sestavljanja struktur iz DNK] S pomočjo parjenja baz lahko kontrolirano povezujemo verige DNK

34 [sestavljanje DNK origami]

35 [geometrijski liki iz DNK] Rothemund, Nature 2006 He et al., Nature 2008, ChemComun 2006

36 [bolj kompleksne sestavljene strukture]

37 [Nano zemljevid Slovenije iz DNK] Sestavljen iz 7249 nt dolgega DNK genoma bakteriofaga M13 ter 227 sintetičnih oligonukleotidov 100 nm Miha Jerala, Gimnazija Vič Iva Hafner Bratkovič, KI

38 Uporaba DNK za pripravo nanometerskih tranzistorjev Winfree in sod. Nat Nanotech 2009

39 [obvite polipeptidne vijačnice kot gradniki] obvite vijačnice s paralelno ali antiparalelno orientacijo stabilnost in specifičnost parjenja izbrani AK ostanki na določenih mestih ponovitev heptad = dva zavoja vijačnice 1 nm/heptado

40 [kaj lahko sestavimo z obvitimi vijačnicami? ] Z uporabo peptidov, sestavljenih iz dveh vrst komplementarnih vijačnic, lahko sestavimo le linearne strukture: tvorba fibril.

41 [uporaba treh segmentov namesto dveh ] Za tvorbo 2D ali 3D struktur potrebujemo vsaj 3 različne, med seboj komplementarne vijačne segmente.

42 [kombinacija oligomerizacijske domene in obvite vijačnice] oligomerizacijska domena ( 3) + segment, ki tvori antiparalelno obvito vijačnico gradnik: mreža s porami, definiranimi z dolžino in lastnostmi segmenta, ki tvori obvito vijačnico p53 tetramerizacijska domena segment, ki tvori antiparalelno obvito vijačnico F 0.22um PVDF Filter with protein membrane F filter PVDF filter 0.22 with 0.22 pores um pores Protein membrane

43 [sestavljanje proteinske mreže] F 0.22um PVDF Filter with protein membrane F filter PVDF filter 0.22 with 0.22 pores um pores Protein membrane

44 [sestavljanje proteinske mreže] F Pore: velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico kemijske lastnosti pore določajo AK ostanki na povšini obvite vijačnice 0.22um PVDF Filter with protein membrane F filter PVDF filter 0.22 with 0.22 pores um pores Protein membrane

45 [sestavljanje proteinske mreže] F Pore: velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico kemijske lastnosti pore določajo ak ostanki na povšini obvite vijačnice 0.22um PVDF Filter with protein membrane F filter PVDF filter 0.22 with 0.22 pores um pores Protein membrane

46 [ultrafiltracija čez polipeptidno membrano] Odstranjevanje virusov: Only 0.22um PVDF Filter 0.22um PVDF Filter with protein membrane PVDF filter with 0.22 um pores PVDF filter with 0.22 um pores Protein membrane F 0.22um PVDF Filter with protein membrane Možnosti uporabe: naprave za filtracijo in ločevanje, kataliza. F filter PVDF filter 0.22 with 0.22 pores um pores Protein membrane

47 [kako sestaviti kocko iz ene vrste polipeptidov?] a b a

48 [samosestavljanje v heksagonalno mrežo gradniki so enaki kot pri kocki] a b a

49 [druge kombinacije: segmenti iz treh ali več obvitih vijačnic] Primer: trije homodimeri se lahko zvijejo v tetraeder, kocko ali planarno mrežo A B C C antiparalelni homodimeri iz obvitih vijačnic: segment C-C B antiparalelni homodimeri iz obvitih vijačnic: segment B-B A antiparalelni homodimeri iz obvitih vijačnic: segment A-A

50 Ellipticity (mdeg) Ellipticity (mdeg) [eksperimentalni rezultati] Le pari heterodimernih vijačnih segmentov lahko tvorijo obvite vijačnice. 140 K2: P1 P2 P1+P2 P1 GCN P Wavelength (nm) 0-5 P1 P2-10 P1-P2 heterodimer Wavelength (nm)

51 [samosestavljiva polipeptidna mreža] napoved rezultat!!! Posnetek TEM: samosestavljen K2

52 [nanokocka sestavljena iz peptidov] Posnetek TEM: samosestavljena struktura iz peptida K2 pri nizki koncentraciji To je prvi primer mrež ali 3D struktur, zgrajenih na osnovi obvitih vijačnic!

53 [možne aplikacije bio-nanomaterialov] ultrafiltracija, kemijska kataliza itd [samosestavljive polipeptidne membrane] dostava zdravil [nanokletke, regulirano sestavljanje/razstavljanje] biomedicinska uporaba rast in diferenciacija celic, regeneracija tkiv, celjenje ran... [funkcionalni biomateriali] ogrodje za gradnjo drugih nanostruktur elektronska vezja, biomineralizacija... materiali s posebnimi lastnostmi prožnost, absorpcija energije, samočistilne tkanine...

54 Trenutna ozka grla SB Orodja Bolj zmogljiva kemijska sinteza (razvoj 2.generacije DNK sintetizatorjev) Modularnost, standardizacija Avtomatizacija sestavljanja genomov (laboratorij na čipu) Razumevanje osnov delovanja bioloških sistemov Razumevanje celice kot kompleksnega sistema (sistemska biologija) Razumevanje zvitja proteinov in njihovih interakcij

55 Prihodnost sintezne biologije Aplikacije v bližnji prihodnosti obnovljivi viri energije napredni (nano)biomateriali medicinske aplikacije industrijska biosinteza Raziskave bioloških sistemov s sintezno biologijo Sinteza celotnih genomov bakterij in njihova aktivacija Identifikacija minimalnega genoma de novo programiranje genoma

56 [think outside the box!] Škatla je šele začetek... Meje potencialov uporabe sintezne biologije v nanotehnologiji postavljajo samo naše razumevanje naravnih principov in ustvarjalnost. Σ

57 Ekipe Monika Ciglič, BF Ota Fekonja, BF Jernej Kovač, FKKT Alja Oblak, BF Jelka Pohar, BF Matej Skočaj, BF Rok Tkavc, BF 2007 Marko Bitenc, BF Peter Cimermančič, FKKT Rok Gaber, BF Saša Jereb, FKKT Katja Kolar, FKKT Anja Korenčič, FKKT Andrej Ondračka, FKKT 2008 Eva Čeh, BF Vid Kočar, FKKT Katja Kolar, FKKT Ana Lasič, MF Jan Lonzarić, FKKT Jerneja Mori, BF Anže Smole, BF 2008 Sabina Božič, FKKT Nika Debeljak, BF Tibor Doles, BF Urška Jelerčič;FMF Anja Lukan, FKKT Špela Miklavič, BF Marko Verce, BF Mentorji Mojca Benčina (KI), Monika Ciglič (KI), Karolina Ivičak (KI), Nina Pirher (KI), Gabriela Panter (KI), Mateja Manček Keber (KI), Marko Dolinar(FKKT), Simon Horvat (BF), Roman Jerala (KI, FKKT)