ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV

Transkripcija

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO Irena Iršič ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV Diplomska naloga Maribor, december 2008

2 Stran 2 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO SI MARIBOR, Smetanova 17 Diplomsko delo visokošolskega strokovnega programa ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV Študent: Irena Iršič Študijski program: Visokošolski strokovni, Kemijska tehnologija Smer: Mentor: Somentor: Kemijska tehnologija izr. prof. dr. Črtomir Stropnik izr. prof. dr. Peter Krajnc prim. Vera Urlep Šalinović, dr. med.

3 Stran 3 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO SI MARIBOR, Smetanova 17 Diplomsko delo visokošolskega strokovnega programa ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV Študent: Študijski program: Smer: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Somentor: Irena Iršič Visokošolski strokovni, Kemijska tehnologija Kemijska tehnologija Dipl. inž. kem. tehnol. izr. prof. dr. Črtomir Stropnik izr. prof. dr. Peter Krajnc prim. Vera Urlep Šalinović, dr. med. IZJAVA Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledala sem literaturo iz področja diplomskega dela po naslednjih elementih: Vir: Gesla: Skupine gesel (unija itd.): Medical abstract testiranje krvi, encimsko-imunska metoda, krvodajalec, HBsAg, anti-hcv, anti-hiv, anti-tp EIA, ELISA, HBsAg, anti-hcv, anti-hiv, anti-tp Časovno obdobje: Število referenc: 34 Število prebranih izvlečkov: 31 Število prebranih člankov: 16 Število pregledanih knjig: 9 Maribor, december podpis študentke

4 Stran 4 ZAHVALA Iskrena hvala mentorju prof. dr. Črtomirju Stropniku in somentorju prof. dr. Petru Krajncu za koristne nasvete in napotke. Zahvaljujem se somentorici, prim. Veri Urlep Šalinović, dr.med. za strokovno pomoč pri oblikovanju diplomske naloge. Posebna zahvala moji družini za pomoč in vsestransko podporo.

5 Stran 5 POVZETEK Naslov: ENCIMSKO-IMUNSKE METODE ZA TESTIRANJE KRVI PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV UDK: :612.12(043.2) Ključne besede: testiranje krvi, encimsko-imunska metoda, krvodajalec, hepatitis B surface antigen, protitelesa proti virusu hepatitisa C, protitelesa proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti, protitelesa proti Treponemi pallidum. Namen Načelo, sprejeto v Evropi in tudi v svetu, da si mora vsak narod sam zagotoviti zadostne količine krvi, krvnih komponent in produktov, obvezuje transfuzijsko dejavnost, da načrtuje in izvaja nacionalni program samozadostnosti pri oskrbi s krvjo. Ker potrebe po krvi naraščajo, je velikega pomena pridobivanje novih krvodajalcev. Kri in krvni pripravki morajo biti varni za bolnike. Med mnogimi ukrepi zagotavljanja varne transfuzije je tudi presejalno testiranje. Pravilnik o obveznem testiranju krvi in komponent krvi določa obseg obveznega testiranja vsake odvzete enote krvi. Namen naloge je ugotoviti pojavnost okužbe z virusom človeške imunske pomanjkljivosti (HIV), z virusom hepatitisa B in C ter z bakterijo Treponema pallidum med novimi in rednimi krvodajalci. Metode V računalniškem programu Datec smo v Centru za transfuzijsko medicino Maribor pridobili podatke o številu novih krvodajalcev v obdobju od leta 2003 do Predstavili smo Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) za določanje površinskega antigena hepatitisa B (HBsAg), protiteles proti virusu hepatitisa C (anti-hcv), protiteles proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti (anti-hiv) in protiteles proti bakteriji Treponema

6 Stran 6 pallidum (anti-tp). Podatke o številu pozitivnih krvodajalcev na posamezne virusne označevalce smo za obdobje petih let poiskali v računalniškem programu Datec. Rezultati Število novih krvodajalcev, ki jih testiramo v Centru za transfuzijsko medicino Maribor, iz leta v leto upada. Največ novih krvodajalcev je bilo leta 2005 in sicer 5537, kar znaša 17% od vseh sprejetih krvodajalcev v tem letu. Razen leta 2003 je bilo število pozitivnih krvodajalcev na HBsAg med novimi krvodajalci večje kot med rednimi krvodajalci. Še posebej izstopa leto 2006, ko smo med novimi krvodajalci odkrili kar 6 okuženih z virusom hepatitisa B, med rednimi pa 1. V petletnem obdobju smo skupaj odkrili 8 krvodajalcev okuženih z virusom hepatitisa C, od tega 7 med novimi krvodajalci in enega med rednimi. Samo leta 2005 smo odkrili 2 krvodajalca okužena z virusom HIV, oba sta kri darovala že večkrat. Skupno število okuženih krvodajalcev z bakterijo Treponema pallidum v letih od je bilo 9, od tega 5 med rednimi in 4 med novimi krvodajalci. Največ smo jih odkrili leta 2007, kar 4. V tem petletnem obdobju smo skupno odkrili 19 krvodajalcev pozitivnih na HBsAg, 8 na anti-hcv, 2 na anti-hiv in 9 na anti-tp. Zaključki Kljub rahlemu upadanju števila novih krvodajalcev, še zadostimo zahtevam samozadostnosti v preskrbi s krvjo in krvnimi komponentami. V letih od smo odkrili, da je okuženost z virusom hepatitisa B in C večja med novimi krvodajalci, okuženih z virusom HIV in Treponemo pallidum pa je bilo več med rednimi krvodajalci.

7 Stran 7 ABSTRACTE Title: ENZYME-IMMUNO ASSAYS OF TESTING BLOOD OF VOLUNTARY BLOOD DONORS UDK: :612.12(043.2) Key words: blood testing, enzyme-immuno assay, blood donor, hepatitis B surface antigen, antibodies against hepatitis C virus, antibodies against human immunodeficiency virus, antibodies against Treponema pallidum. Purpose The principle, which was accepted in Europe and also in the world, that each nation should by itself assure the sufficient amount of blood, blood components and products, makes the transfusional activity responsible for planning and execution of the national program of self-sufficiency when blood supply is concerned. Because the needs for blood are on the increase, the acquisition of new blood donors is of great importance. Blood and blood preparations have to be safe for the patients. One of the many precautions which are taken in order to assure safe transfusion is also screening testing. Rules on obligatory testing of human blood and blood components determine the extent of the obligatory testing of each taken unit of blood. The purpose of the paper is to establish the appearance of infection with human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B and C viruses and the bacterium Treponema pallidum among new and regular blood donors. Methods The data about the number of new blood donors from the period of 2003 to 2007 was gained from the computer program Datec in the Center for Transfusional Medicine Maribor. We presented Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) for the

8 Stran 8 establishment of surface hepatitis B antigen (HBsAg), antibodies against hepatitis C virus (anti-hcv), antibodies against human immunodeficiency virus (anti-hiv) and antibodies against Treponema pallidum bacterium (anti-tp). The data about the number of blood donors who were tested positive on individual viral markers for the period of five years were found in the computer program Datec. Results The number of new blood donors, who are tested in the Center for Transfusional Medicine Maribor, decreases from year to year. In 2005 the highest number of new blood donors was marked, namely 5537 which is 17% of all blood donors who donated blood that year. With the exception of 2003, the number of blood donors positive on HBsAg among new blood donors was higher than those of the regular blood donors. Year 2006 stands out especially, because we discovered 6 new blood donors infected with hepatitis B virus, while there was only one among regular ones. In the five year period we together discovered 8 blood donors infected with hepatitis C virus, 7 of them were new blood donors and 1 regular blood donor. Only in 2005 we discovered 2 blood donors infected with HIV, both donated blood many times. From 2003 to blood donors were infected with Treponema pallidum bacterium, 5 were regular and 4 new blood donors. The highest number of them was discovered in 2007, 4. In the five year period we together discovered 19 blood donors positive on HBsAg, 8 on anti-hcv, 2 on anti-hiv and 9 on anti-tp. Conclusions Although the number of new blood donors is slightly decreasing, we can still meet the requirements of self-sufficiency in supply with blood and blood components. From 2003 to 2007 we discovered that the infection with hepatitis B and C viruses is bigger among new blood donors, while there was more of those infected with HIV and Treponema pallidum among regular blood donors.

9 Stran 9 VSEBINA 1 UVOD ZGODOVINA TRANSFUZIOLOGIJE ORGANIZACIJA TRANSFUZIJSKE DEJAVNOSTI PROSOTOVOLJNO KRVODAJALSTVO VARNA TRANSFUZIJA Zdravstvena vzgoja krvodajalcev Izbira krvodajalca Presejalno testiranje krvi krvodajalcev NAMEN NALOGE 19 2 METODE IN MATERIALI ENCIMSKO IMUNSKA METODA REAGENTI ZA PRESEJALNO TESTIRANJE KRVI 24 PROSTOVOLJNIH KRVODAJALCEV 2.3 TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA HBsAg TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA anti-hcv TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA anti-hiv TESTIRANJE KRVI KRVODAJALCEV NA anti-tp INFORMACIJSKI SISTEM DATEC Analiza podatkov 38 3 REZULTATI DELEŽ NOVIH KRVODAJALCEV 39

10 Stran REZULTATI PRESEJALNEGA TESTIRANJA Rezultati testiranja na HBsAg Rezultati testiranja na anti-hcv Rezultati testiranja na anti-hiv Rezultati testiranja na anti-tp 43 4 RAZPRAVA 46 5 SKLEP 48 6 LITERATURA 49

11 Stran 11 SEZNAM TABEL Tabela 3-1: Število novih krvodajalcev Tabela 3-2: Število pozitivnih krvodajalcev na HBsAg v obdobju Tabela 3-3: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-hcv v obdobju Tabela 3-4: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-hiv v obdobju Tabela 3-5: Število pozitivnih krvodajalcev na anti-tp v obdobju Tabela 3-6: Število pozitivnih krvodajalcev na virusne označevalce v obdobju SEZNAM GRAFOV Graf 3-1: Pozitivni krvodajalci na HBsAg med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju Graf 3-2: Pozitivni krvodajalci na anti-hcv med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju Graf 3-3: Pozitivni krvodajalci na anti-hiv med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju Graf 3-4: Pozitivni krvodajalci na anti-tp med novimi in rednimi krvodajalci v obdobju Graf 3-5: Gibanje števila pozitivnih krvodajalcev na HBsAg, anti-hcv, anti-hiv in anti TP v letih od SEZNAM SLIK Slika 2-1: Indirektna ELISA Slika 2-2: Sendvič ELISA Slika 2-3: Kompetitivna ELISA Slika 2-4: Analizator BEP 2000 Slika 2-5: Analizator Axsym

12 Stran 12 UPORABLJENI SIMBOLI A absorbanca Ā povprečna absorbanca anti-hcv protitelesa proti hepatitis C virusu anti-hiv protitelesa proti human immuno deficiency virusu (protitelesa proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti) anti-tp protitelesa proti bakteriji Treponema pallidum anti-hbc protitelesa proti hepatitis B core antigenu (protitelesa proti antigenu jedra virusa hepatitisa B) CTM Center za transfuzijsko medicino Cut-off mejna vrednost EDTA Etilendiamintetraocetna kislina EIA Enzyme Immuno Assay (encimsko imunski postopek) ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HBsAg hepatitis B surface antigen (površinski antigen virusa hepatitisa B) HCV RNA ribonukleinska kislina virusa hepatitisa C MEIA Microparticles Enzyme Immuno Assay mmhg milimetri stolpca živega srebra NAT nucleic acid testing (detekcija nukleinskih kislin) Rh Rhesus faktor RIA RadioImmuno Assay RK Rdeči križ ZTM Zavod za transfuzijsko medicino g gram g/l gram na liter kg kilogram ml mililiter mmol/l milimol na liter nm nanometer

13 Stran 13 1 UVOD 1.1 Zgodovina transfuziologije Terapevtski učinek krvi je bil spoznan že pred stoletji, vendar je preteklo več kot tisoč let, da so spoznali pomembnost same transfuzije krvi. Razvoj transfuziologije bi lahko razdelili na: doba pred dajanjem transfuzije transfuzija krvi od živali-živali transfuzija krvi od živali -človeku dajanje krvi človeka-človeku(1). Prve sledove teh zamisli najdemo že v antičnih zapiskih Ovidovih Metamorfoz. Stari Grki so pili kri padlih junakov, prepričani, da bodo pridobili mladost oziroma hrabrost padlega. V Libaviusovih pismih leta 1615 najdemo že prvi opis tedanje transfuzije. Zdravnik je uporabljal za transfuzijo krvi dve prilegajoči se srebrni cevki. Krvodajalcu je odprl žilo in vanj vstavil eno cevko, drugo pa namestil v žilo bolnika. Menili so, da kri nastaja v srcu, od koder gre v ostale organe (2). Leta 1616 je William Harvey odkril krvotok. Zapisal je, da kri cirkulira skozi telo v zaprtem sistemu. Srce je črpalka, ki potiska kri skozi arterije, vrača pa se skozi vene (1). V 17. stoletju se je pojavilo več oseb, ki so pričeli z eksperimentalnimi transfuzijami. Te so potekale večinoma na živalih in leta 1666 je angleški zdravnik Richard Lower uspešno opravil transfuzijo na psu. Kmalu za tem se je utrnila zamisel, da bi živalsko kri prenesli na človeka. To je uspelo mlademu zdravniku Jean Denisu, ki je prenesel kri ovce na človeka (2). Mnogi zapleti, ki so se pojavljali, so preprečili da bi se ta metoda zdravljenja razširila. Medicinska fakulteta v Parizu je označila transfuzijo kot kriminalno dejanje. Leta 1678 je odredba francoskega parlamenta prepovedala transfuzije v Franciji, pridružila pa se ji je tudi Royal Society v Londonu (1). Do ponovnega napredka je prišlo v 19. stoletju. Zdravnik James Blunder je dal prvo transfuzijo krvi človeku. Trdil je, da se mora za humano transfuzijo uporabljati humana kri. Zato so bile te transfuzije krvi direktne iz žile dajalca v žilo prejemnika.

14 Stran 14 Komplikacije so bile pogoste in hude, največkrat smrtne, zato so transfuzijo krvi spet prepovedali (2). Raziskave so se nadaljevale. Ugotovili so, da kri posameznih dajalcev ustreza krvi bolnika. Nemški kirurg K. Oelecker je pred vsako transfuzijo uvedel»biološki poskus«in bistveno zmanjšal zaplete po transfuziji krvi (3). Temelji sodobnega transfuzijskega zdravljenja so bili postavljeni v začetku 20 stoletja. Leta 1901 so Karl Landsteiner in njegovi sodelavci v Ameriki odkrili krvne skupine AB0 sistema. Ugotovili so, da prisotnost ali odsotnost antigenov A in B na eritrocitih omogoča razdelitev človeške krvi v štiri skupine A, B, AB in 0. S tem odkritjem so omogočili pomemben razvoj transfuzijske medicine (3). Leta 1942 je Landsteiner odkril na eritrocitih opice (vrste Rhesus Macacus) novi antigen. Poimenoval ga je Rhesus faktor (Rh faktor). Raziskave so pokazale, da je Rh faktor v populaciji belcev prisoten v 85%. Odkritje Rh faktorja je dodatno znižalo število zapletov po transfuzijah krvi. Kasneje so ugotovili še druge eritrocitne, levkocitne in trombocitne antigene (3). V začetku so transfuzije krvi izvajali direktno iz žile krvodajalca v žilo prejemnika. Izvajali so jih tako, da so odprli arterijo krvodajalca in veno prejemnika ter ju neposredno zvezali s šivom ali pa med obe žili vstavili cevko (2,3). Prvo takšno transfuzijo krvi v Sloveniji je v Mariboru opravil dr. Adolf Ramšak jeseni leta 1926 (4). Mnogi znanstveniki so iskali sredstvo, ki bi preprečevalo strjevanje krvi. Med prvo svetovno vojno leta 1915 je bil odkrit natrijev citrat kot sredstvo, ki preprečuje strjevanje krvi. Tako so bile dane možnosti za konzerviranje krvi. V drugi svetovni vojni so se potrebe po krvi izjemno povečale (4). Njena uporaba je zmanjšala število mrtvih. Žalostna je ugotovitev, da so prav velike vojne najbolj značilno vplivale na razvoj transfuzijske medicine (3). Krvodajalska služba se je v večjem obsegu najprej razvila v Angliji. Že leta 1918 je Rdeči križ (RK) Anglije zbiral prostovoljne krvodajalce in jih po potrebi pošiljal v posamezne bolnišnice (3). Šele leta 1945 je bila v Sloveniji organizirana prva transfuzijska postaja v Ljubljani, v okviru Centralne vojne bolnice, kjer so 4. junija darovali kri prvi plačani krvodajalci. Ta dan praznujemo kot Dan krvodajalcev. Januarja leta 1946 se je transfuzijska postaja preimenovala v Zavod za transfuzijo krvi Medicinske fakultete v Ljubljani. Kmalu se je izkazalo, da zavod sam ne bo mogel kriti hitrega naraščanja potreb po krvi za vse bolnišnice v Sloveniji. Zato so organizirali transfuzijske oddelke po večjih bolnišnicah (Celje, Maribor, Jesenice, Izola ) (5).

15 Stran 15 V Mariboru je bila ustanovljena Postaja za transfuzijo krvi konec leta V njej so prvi plačani krvodajalci darovali kri 28. decembra istega leta. Postaja v začetku ni imela lastnih prostorov in je gostovala kar na treh oddelkih. Leta 1953 so prešli na prostovoljno krvodajalstvo, ki ga od vsega začetka organizira RK v tesnem sodelovanju s strokovno službo. V začetku so kri zbirali le v bolnišnici, leta 1954 so začeli z zbiranjem krvi tudi na terenskih akcijah. Leta 1965 se je Postaja za transfuzijo krvi preimenovala v Oddelek za transfuzijo krvi, leta 1973 pa v Oddelek za transfuziologijo in imunohematologijo. Število prostovoljnih krvodajalcev je iz leta v leto naraščalo, vse do začetka 90. let, ko sta se ekonomska kriza in odpuščanje delavcev močno odrazila tudi v krvodajalstvu. S selitvijo v kletne prostore kirurške stolpnice leta 1990 so se rešili prostorske stiske, ki jih je pestila vsa leta delovanja in tu deluje še danes. Ves čas delovanja so sledili hitremu razvoju transfuziologije, v skrbi za pripravo kvalitetnejše in varnejše transfuzije krvi. Vzporedno s krvodajalstvom se je razvijala tudi laboratorijska in ambulantna dejavnost. Izjemno pomembna je bila uvedba hemostaziološke dejavnosti, s katero so se tesno povezali s kliniki in postali prvi klinični transfuziologi v Sloveniji. V okviru laboratorijske dejavnosti imajo danes interno ločeno imunohematoserološko, virološko in hemostaziološko dejavnost (4). Leta 2007 je oddelek dobil naziv Center za transfuzijsko medicino. 1.2 Organizacija krvodajalstva pri nas Svet Evrope v priporočilih o odgovornosti zdravstvenih oblasti pri izvajanju transfuzijske dejavnosti določa, da mora biti transfuzijska dejavnost organizirana kot vladna javna nepridobitvena organizacija, ki z upravljanjem javnih storitev in proizvodnjo javnih dobrin deluje v javno korist. Njen ustanovitelj je država oziroma vlada, ki zagotavlja tudi finančna sredstva za njeno delovanje. Transfuzijska dejavnost je pomemben del javnega zdravstva, ki deluje in se razvija znotraj državnega sistema zdravstvenega varstva (3). Glavni organizator krvodajalstva v Sloveniji je RK, ki to nalogo opravlja s svojo mrežo 56 območnih združenj RK po vsej državi in je odgovoren za zagotavljanje zadostnega števila krvodajalcev. Za odvzem krvi, zbiranje, predelavo ter oskrbo z varno krvjo in krvnimi pripravki je pristojna transfuzijska služba. Delo transfuzijske službe in RK je na področju krvodajalstva tesno povezano (6). V Sloveniji sodeluje pri izvajanju nacionalnega programa:

16 Stran 16 Zavod za transfuzijsko medicino v Ljubljani (ZTM) Center za transfuzijsko medicino v Mariboru (CTM) 9 oddelkov za transfuzijo krvi, ki pripadajo regionalnim bolnišnicam RK Slovenije Država Slovenija je z Zakonom o RK tej humanitarni organizaciji dala javno pooblastilo pridobivanja krvodajalcev in organizacijo krvodajalskih akcij (3). Letno oceno potreb po krvi poda transfuzijska služba. To so podatki, ki so RK osnova za načrtovanje krvodajalskih akcij. Priprave za planiranje krvodajalskih akcij za prihodnje leto se pričnejo že v mesecu septembru. Strokovna služba RK pri planiranju krvodajalskih akcij vključuje območna združenja RK, ki s transfuzijsko službo razporedijo akcije čim enakomerneje preko celega leta (3). V letu 2007 je bilo v Sloveniji organiziranih 1500 krvodajalskih akcij, od tega 350 na terenu in opravljenih odvzemov krvi (7). Kri se zbira v rednih, izrednih in dodatnih akcijah in z individualnim telefonskim obveščanjemklicanje krvodajalcev v primeru dodatne potrebe po krvi. Načelo, sprejeto v Evropi in tudi v svetu, da si mora vsak narod sam zagotoviti zadostne količine krvi, krvnih komponent in produktov, obvezuje transfuzijsko dejavnost, da načrtuje in izvaja nacionalni program samozadostnosti pri oskrbi s krvjo. Evropski koncept samozadostnosti predvideva pomoč naprednejših držav tistim evropskim državam, ki jim samozadostnosti samim ne bo uspelo doseči (8). Po številu krvodajalcev med prebivalci in po količini zbranih enot krvi je Slovenija popolnoma primerljiva z državami Evropske unije. Najpomembneje pa je, da imamo na razpolago toliko krvi, kot je potrebujemo (6). Zakon o Zdravstveni dejavnosti Republike Slovenije določa, da preskrbe s krvjo in krvnimi pripravki ni mogoče opravljati v obliki zasebne zdravstvene dejavnosti. Zakon prav tako določa, da se sredstva za zbiranje krvi zagotavljajo iz sredstev republiškega proračuna (Ur.L.št. 9/92). 1.3 Prostovoljno krvodajalstvo Prve steklenice krvi so v Sloveniji konzervirali 4. junija Uprava Centralne vojne bolnice je dajala krvodajalcem kosilo in kot darilo moko, olje in sladkor. Ko so bile živilske nakaznice ukinjene, so dobivali krvodajalci le še denar. Tako se je prešlo na plačano

17 Stran 17 krvodajalstvo. Kmalu so se pokazale negativne strani plačanega krvodajalstva. Med krvodajalci, ki so dajali kri iz nesebičnih, človekoljubnih nagibov, da bi reševali življenja, so prihajali ljudje, ki jim je šlo le za denar. Pri tem niso upoštevali niti nevarnosti zase, niti za bolnika. Podatki o prebolelih boleznih in njihovem zdravstvenem stanju so največkrat bili lažni. Leta 1953 se je ukinilo plačevanje krvodajalcem in se je prešlo na neplačano, prostovoljno in anonimno krvodajalstvo (9). Definicija prostovoljnega krvodajalstva Svetovne zdravstvene organizacije je naslednja: Oseba daruje kri, plazmo ali krvne celice prostovoljno in za to ne dobi plačila niti v obliki denarja, niti v obliki denarnega nadomestila, ki vključuje dela prost dan. Manjša pozornostna darila, osvežilni obroki in povračilo stroškov prevoza so združljivi s prostovoljnim neplačanim darovanjem krvi (10). Priporočila Sveta Evrope definicijo prostovoljnega krvodajalstva še nekoliko razširijo, in sicer tako, da dovoljujejo plačilo za odsotnost z dela, ki je potrebna za pot in samo darovanje krvi. Pri nas so zaposleni krvodajalci upravičeni do enega ali celo dveh prostih delovnih dni. V bodoče se bomo moral prilagoditi zahtevam Sveta Evrope (11).. Prostovoljni, neplačani in anonimni krvodajalci so lahko: Zdravi ljudje Starost krvodajalcev od let Telesna teža vsaj 50 kg Krvni pritisk: sistolični mm stolpca živega srebra (mmhg), diastolični mmhg Hemoglobin 125 g/l (7,8 mmol/l) za ženske in 135 g/l (8,4 mmol/l) za moške Ne smejo biti pod vplivom alkohola ali zdravil Po standardih, ki so enotni po mnogih deželah Evrope in Amerike, lahko ljudje darujejo 450 ml krvi, ne da bi s tem ogrožali svoje zdravje in dobro počutje. Moški lahko darujejo krvi s 3-mesečnimi razmaki, ženske pa z 4-mesečnimi razmaki med posameznimi odvzemi (12). 1.4 Varna transfuzija krvi Zdravstvena vzgoja krvodajalcev Globalni cilj zdravstvene vzgoje krvodajalcev je»zdrav krvodajalec«:

18 Stran 18 Ozaveščeni in vzgojeni krvodajalci znanje, pridobljeno s pomočjo zdravstveno vzgojnih dejavnosti, vnašajo v vsakdanje življenje. Sami prevzamejo pobudo in odgovornost za krepitev in povrnitev svojega zdravja in se izogibajo škodljivim vplivom. Krvodajalci se zavedajo, da se s krvjo lahko prenašajo povzročitelji različnih bolezni, zato sami odstopajo od darovanja krvi, če pri sebi prepoznajo vedenje s katerim tvegajo okužbo ali znake bolezni, ki se lahko prenašajo s krvjo. S tem pripomorejo k varni transfuziji (13). Mednarodno združenje Rdečega križa in Rdečega polmeseca priporoča izvajanje zdravstvene vzgoje krvodajalcev v štirih stopnjah. Temu glede na dane kadrovske, finančne in tehnične možnosti skuša slediti tudi Slovenija. 1.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev v skupnosti 2.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev pred odvzemom krvi 3.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev med odvzemom krvi 4.stopnja: Zdravstvena vzgoja krvodajalcev po končanem testiranju krvi (3) Izbira krvodajalca Krvodajalec sme biti le zdrava oseba. Ker moramo zagotoviti, da je dajanje krvi varno za krvodajalca in da je dana kri varna za bolnika, moramo pred odvzemom upoštevati določene strokovne omejitve, kot so starost, časovni presledek med odvzemi, laboratorijske preiskave, pregled krvodajalca. Ker v praksi ni mogoče opraviti popolnega zdravstvenega pregleda krvodajalca, ocenimo splošni videz krvodajalca, izvede se merjenje krvnega tlaka in srčnega utripa (12). Septembra leta 1994 smo uvedli prvi vprašalnik in spremenili način zdravniškega pregleda. Vprašanja so usmerjena na prebolele bolezni, ki se prenašajo s krvjo (hepatitis, aids, malarija, tuberkuloza ), na klinične simptome teh bolezni, kontakte z obolelimi osebami, jemanje drog in tvegani način življenja (11). Prednosti vprašalnika pred ustnim spraševanjem so predvsem v tem, da vsem krvodajalcem postavimo ista vprašanja, in sicer tista, ki so po dognanjih stroke potrebna za izbor primernih - varnih krvodajalcev. Krvodajalec podpiše izjavo na hrbtni strani krvodajalskega kartona, da je razumel podane informacije in dal pravilne podatke o svojem zdravju (12).

19 Stran Presejalno testiranje krvi krvodajalcev S testiranjem krvi lahko ugotavljamo prisotnost povzročiteljev okužb (viruse, bakterije, parazite) ali pa kazalce okužb seroloških označevalcev, ki kažejo na prisotnost okužbe ali pa že prebolelo infekcijo. Pri krvodajalcih opravljamo t. i. presejalno testiranje (screening), kjer med velikim številom vzorcev iščemo tiste z reaktivnim rezultatom. Tako kri nato izločimo kot neprimerno za transfuzijo. S presejalnim testiranjem ugotavljamo samo reaktivnost na izbran označevalec, šele s ponovitvami testiranja in potrditvenim testiranjem pridobi testiranje tudi diagnostično vrednost. Metoda, po kateri izvajamo presejalno testiranje, je encimsko imunska (14). Pravilnik o obveznem testiranju krvi in komponent krvi (Ur.l.RS, št.9/2007) določa obseg obveznega testiranja vsake odvzete enote krvi. V Sloveniji je vsa kri testirana na protitelesa proti bakteriji Treponema pallidum (anti-tp) od leta 1960, na hepatitis B površinski antigen (HBsAg) od leta 1970, na protitelesa proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti (anti-hiv) od leta 1986 in na hepatitis C protitelesa (anti- HCV) od leta 1993 (15).Čeprav je transfuzija danes varna oblika zdravljenja, še vedno obstaja možnost prenosa virusov hepatitisa B, C in HIV s krvjo, zaradi diagnostičnega okna. To je čas od okužbe do izdelave zadostne količine protiteles. V tem času so osebe že kužne, vendar so presejalni testi negativni (11). V ta namen je bilo 1. marca 2000 uvedeno dodatno rutinsko testiranje krvi krvodajalcev na prisotnost ribonukleinske kisline virusa hepatitisa C (HCV RNA) z namenom skrajšati diagnostično okno in tako z večjo gotovostjo preprečiti prenos okužbe z virusom hepatitisa C. Test se je izvajal na ZTM Ljubljana. Leta 2007 pa je bilo uvedeno kot dodatno testiranje detekcija nukleinskih kislin (NAT testiranje) na viruse hepatitisa B, hepatitisa C in HIV. Testiranje za celotno Slovenijo izvajajo na ZTM Ljubljana (16). 1.5 Namen naloge Naloga transfuzijske dejavnosti v svetu in pri nas je samozadostnost v preskrbi s kakovostno in varno krvjo in krvnimi pripravki. Zaradi potrebe po vedno večji količini krvi, je velikega pomena skrb za pridobivanje novih krvodajalcev. V nalogi želimo ugotoviti trend pridobivanja novih krvodajalcev in ugotoviti pojavnost okužbe z virusom hepatitisa B, C in HIV ter Treponeme pallidum med novimi in rednimi krvodajalci.

20 Stran 20 Eden izmed ukrepov za zagotavljanje varne transfuzije je presejalno testiranje vsake enote krvi. Metoda testiranja je encimsko imunska (EIA). S pomočjo informacijskega sistema Datec bomo pridobili podatke o številu novih krvodajalcev in rezultate presejalnega testiranja.

21 Stran 21 2 METODE IN MATERIALI 2.1 Encimsko imunska metoda Encimsko imunska metoda (EIA) je biokemična metoda, uporabljena največkrat v imunologiji za dokazovanje protiteles ali antigenov v vzorcu. Encimska metoda, pri kateri se v procesu ločevanja vezanih in nevezanih komponent uporablja trdna faza (polistirenska mikrotitrska plošča z vdolbinicami, polistirenske kroglice ), imenujemo enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) (17). Metodo odlikuje visoka občutljivost in specifičnost. V reakciji antigenov s protitelesi so protitelesa označena z encimom, ne da bi se spremenila aktivnost encima ali lastnosti sestavin imunskega kompleksa (18). Za označevanje se uporabljajo različni encimi, alkalna fosfataza, peroksidaza in p-nitrofenil fosfataza (19) Reakcijo izvedemo tako, da izbrani virusni antigen (lahko tudi rekombinantne virusne beljakovine) vežemo na trden nosilec. Nato dodamo serum. Na nastale komplekse antigena in protiteles vežemo sekundarna protitelesa, ki so označena z encimom. S spiranjem odstranimo nevezana sekundarna protitelesa. Dodamo ustrezni substrat, ki zaradi delovanja encima spremeni barvo. Končni barvni produkt reakcije fotometrično izmerimo (18). Razvili so številne variante ELISA, s katerimi lahko kvalitativno in kvantitativno določimo protitelesa ali antigene (20). Določevanje protiteles indirektna ELISA Protitelesa lahko odkrijemo in kvantitativno določimo z indirektnim ELISA. Na dnu vdolbinice mikrotitrske plošče imamo vezan antigen. Serum ali kak drugi vzorec, v katerem je primarno protitelo, odpipetiramo v mikrotitrsko vdolbinico in pustimo da reagira z vezanim antigenom. Speremo nevezana protitelesa. Na nastale komplekse protiteles in antigena vežemo druga z encimom označena protitelesa. Ta se vežejo s primarnim protitelesom. Prosta sekundarna protitelesa speremo in dodamo substrat za encim. Dobimo obarvan produkt reakcije. V spektrofotometru pri določeni valovni dolžini odčitamo optično gostoto in tako ugotovimo prisotnost protiteles (Slika 2-1) (20,21).

22 Stran 22 Slika 2-1: Indirektna ELISA Na trdni nosilec vezani antigeni. Protitelesa iz testnega vzorca. Z encimom označena protitelesa (konjugat). Vezava sekundarnih protiteles na specifična primarna protitelesa. Substrat ob prisotnosti encima spremeni barvo. Določevanje antigena sendvič ELISA Antigene, ki imajo več epitopov, lahko določimo kvantitativno s sendvič ELISA. Pri tej tehniki imobiliziramo v mikrotitrski vdolbinici protitelo. Dodamo vzorec, ki vsebuje antigen, in pustimo, da reagira z vezanimi protitelesi. Ko speremo vdolbinico, dodamo drugo z encimom vezano protitelo, specifično za drugi epitop na antigenu in pustimo, da reagira z vezanim antigenom. Ko s spiranjem odstranimo drugo protitelo, dodamo substrat in izmerimo obarvan produkt reakcije (slika 2-2) (20,21).

23 Stran 23 Slika2-2: Sendvič ELISA Na trdni nosilec vezana protitelesa. Antigeni iz testnega vzorca. Z encimom označena protitelesa, specifična za drugi epitop na antigenih. Vezava specifičnih protiteles označenih z encimom. Substrat ob prisotnosti encima spremeni barvo. Kompetitivna ELISA Vzorec, ki vsebuje neoznačena protitelesa, inkubiramo določen čas s protitelesi, označenimi z encimom. V času inkubacije poteka tekmovanje med označenimi in neoznačenimi protitelesi za vezavna mesta na antigenih. Večja je količina neoznačenih protiteles, manjša količina označenih protiteles se bo vezala na antigene in manjša bo izmerjena absorbanca. Razmerje med izmerjeno absorbanco in koncentracijo protiteles v vzorcu je obratno sorazmerno (Slika 2-3) (17,21).

24 Stran 24 Slika 2-3: Kompetativna ELISA Na trdni nosilec vezani antigeni. Protitelesa iz testnega vzorca in z encimom označena protitelesa. Med njimi poteka tekmovanje za vezavna mesta na antigenih. Vezava označenih in neoznačenih protiteles na antigene. Obarvanje substrata zaradi delovanja encima. 2.2 Regenti za presejalno testiranje krvi prostovoljnih krvodajalcev V Centru za transfuzijsko medicino Maribor (CTM) uporabljamo za testiranje krvi krvodajalcev na virusne označevalce hepatitis B površinskega antigena (HBsAg), protiteles proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti (anti-hiv) in protiteles proti bakteriji Treponema pallidum (anti-tp) reagente proizvajalca Dade Behring in za določanje protiteles proti virusu hepatitis C (anti-hcv) reagente proizvajalca Ortho. Testi poleg specifičnih protiteles zaznavajo tudi prisotnost antigenov. S tem se je skrajšalo diagnostično okno. Specifičnost in občutljivost testov se je močno povečala z uporabo monoklonskih protiteles. Specifičnost testa izrazimo z odstotkom zdravih, neokuženih oseb, pri katerih je rezultat testa negativen. Specifičnost diagnostičnega testa predstavlja sposobnost ločevanja določenega antigena ali protiteles od drugih antigenov ali protiteles. Občutljivost testa izrazimo z odstotkom oseb z določeno okužbo, pri katerih je rezultat testa pozitiven. Občutljivost testa predstavlja sposobnost dokazovanja najmanjše količine določenega antigena ali protiteles (18).

25 Stran 25 HBsAg je prvi serološki označevalec hepatitisa B, ki ga lahko zaznamo 2-12 tednov po okužbi z virusom hepatitisa B. Je prvi pokazatelj akutne oblike bolezni. Če njegova koncentracija bistveno ne pade več kot 6 mesecev, govorimo o kroničnih prenašalcih HBsAg. Večina hepatitisa B se prenaša z okuženo krvjo ali s spolnimi odnosi z okuženo osebo (22). Najpogosteje uporabljena tehnika za dokazovanje HBsAg je sendvič ELISA (23). Vsaka enota krvi mora biti testirana z licenčnim visoko občutljivim testom. Za HBsAg občutljivost EIA testov mora doseči 0,5 ng HBsAg/mL seruma (24). Enzygnost HBsAg 5.0. proizvajalca Dade Behring je encimsko imunski test tretje generacije, ki ga uporabljamo za kvalitativno določitev HBsAg v serumu ali plazmi pri krvodajalcih. HBsAg zaznamo s temi reagenti 59 dni po okužbi. Diagnostična občutljivost testa znaša <0,2 ng/ml seruma, specifičnost testa pa je 99,83% (25). Protitelesa anti-hcv v krvi določamo za odkrivanje akutne, kronične ali prebolele infekcije s hepatitis C virusom ter odkrivanje okuženih krvodajalcev. Za določanje se uporabljajo različne imunokemijske metode s kloniranimi in sintetičnimi proteini virusa hepatitisa C kot antigeni. Najpogosteje uporabljena je EIA metoda. Določajo se skoraj izključno protitelesa razreda IgG. Prva generacija testov na anti-hcv je uporabljala samo en rekombinantni virusni protein c100-3 in se danes zaradi slabe občutljivosti in specifičnosti ne uporablja več. Klinična občutljivost testov druge generacije, ki so prišli na tržišče leta 1991, je bila izboljšana z uvedbo antigenov virusne kapside (c22-3) in NS3 antigenov (c33 ali c200) v teste. Leta 1995 so s tretjo generacijo testov še dodatno izboljšali občutljivost z uvedbo antigena NS5 regije (22). S testi tretje generacije se je diagnostično okno skrajšalo na 82 dni (15). V CTM Maribor uporabljamo test tretje generacije proizvajalca Ortho HCV 3.0 Elisa Test. S testom Enzygnost HIV Integral II proizvajalca Dade Behring zaznavamo HIV infekcijo. Test je 4. generacije, ki temelji na hkratnem ugotavljanju HIV p24 antigena in specifičnih IgG in IgM protiteles proti virusu HIV, tipa 1 in 2, kot protiteles proti HIV 1 (podtip 0). Občutljivost testa znaša med x g HIV antigena/ml seruma, specifičnost testa je 99,89% (29). S testi četrte generacije je diagnostično okno dni (16). Z encimsko imunskimi testi zaznamo prisotnost protiteles proti bakteriji Treponema pallidum 11 dni po okužbi. Trenutno so na tržišču testi prve generacije. Za dokazovanje protiteles proti bakteriji Treponema pallidum uporabljamo test Enzygnost Syphilis proizvajalca Dade Behring. Je enofazni encimsko imunski test za določitev protiteles. Test se izvaja na osnovi kompetativne ELISA tehnike.

26 Stran 26 Analizator BEP 2000 Testiranje izvajamo na analizatorju BEP 2000 (slika 2-4). Aparat je popolnoma avtomatski analizator, katerega uporabnost je v In vitro diagnostiki. Testiranje poteka na mikrotitrskih ploščah. Vsi koraki, začenši z redčenjem vzorcev, razdeljevanjem vzorcev, razdeljevanjem reagentov, inkubacijo, spiranjem, merjenjem plošč v fotometru in vrednotenjem testa in rezultatov potekajo v aparatu samodejno. V aparatu lahko hkrati testiramo 4 teste in 90 testnih vzorcev. V času delovanja aparata lahko dodatno testiramo še na eni mikrotitrski plošči. Aparat je primeren za izvajanje testov v laboratorijih bolnišnic in krvnih bank. Slika 2-4: Analizator BEP 2000 Priprava reagentov in testnih vzorcev Reagenti in testni vzorci morajo biti segreti na 15-25ºC. Za testiranje HBsAg, anti-hiv in anti TP pripravimo spiralno tekočino tako, da 20 ml spiralnega koncentrata POD (fosfatni pufer, ki vsebuje Tween ) zmešamo z 400 ml destilirane oz. deionizirane vode. Za pripravo kromogena zmešamo 1mL kromogen TMB (tetrametilbenzidin dihidroklorid) z

27 Stran ml Pufer/Substrat TMB (vodikov peroksid v acetatnem pufru); hranimo ga v zaprti steklenički zaščitenega pred svetlobo. Na sobni temperaturi je obstojen 8 ur, na temperaturi 2-8ºC pet dni, oziroma manj, če se obarva rahlo modro. Za test HIV Integral II raztopimo pozitivno kontrolo z 1mL destilirane vode in konjugat 1 s konjugat diluentom. Tako pripravljena pozitivna kontrola in konjugat 1 sta obstojna 4 tedne na temperaturi 2-8ºC. Ostale reagente uporabimo že tovarniško pripravljene. Za testiranje na anti-hcv pripravimo spiralno tekočino po naslednjem postopku: zmešamo 50 ml spiralnega pufer koncentrata (0,2M fosfatni pufer s 3,0M NaCl) in 950 ml destilirane ali deionizirane vode. Obstojnost spiralne tekočine je 30 dni na sobni temperaturi in 60 dni na temperaturi 2-8ºC. Za testiranje uporabljamo vzorce krvi krvodajalcev, odvzete v epruvete z antikoagulantnim sredstvom etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) - plazma ali v epruvete brez dodatka serum. Vzorci so lahko pred testiranjem hranjeni največ 3 dni na temperaturi 2-8ºC. Če vzorce ne testiramo znotraj tega časa, je potrebno serum ali plazmo zamrzniti. Pred testiranjem vzorce centrifugiramo 20 min na 4500 obratov. 2.3 Testiranje krvi krvodajalcev na HBsAg Potek testiranja v analizatorju BEP 2000: Predhodno pripravimo aparat, speremo ga s spiralno tekočino. V stojala vstavimo potrebne reagente: Konjugat 1 (Anti HBs/ Biotin); mišja monoklonska protitelesa, konjugirana z biotinom, reagent je modre barve. Konjugat 2 (Streptavidin/POD); streptavidin konjugiran s peroksidazo (POD), reagent je rumene barve. Kromogen; TMB (tetrametilbenzidin dihidroklorid) pomešan s Pufer/Substrat TMB.(vodikov peroksid v acetatnem pufru) Stop solucija POD; 0,25 M H 2 SO Pozitivna in negativna kontrola. Mikrotitrska plošča; vdolbinice plošče prevlečene z mišjimi protitelesi proti HBsAg Glede na število testnih vzorcev pripravimo ustrezno število stripov (št. vzorcev in 5 vdolbinic za kontrole). V aparatu BEP 2000 potekajo naslednje faze testiranja:

28 Stran 28 -Pipetiranje 100 µl negativne kontrole v prve tri vdolbinice (pozicija A1-C1), pozitivna kontrola v eno vdolbinico (D1), nato analizator napolni naslednje vdolbinice s 100 µl testnega vzorca in na koncu še 100 µl pozitivne kontrole. Pipetiranje mora biti končano znotraj 30 min. -Takoj po končanem pipetiranju vzorcev in kontrol se napolnijo vdolbinice s 25 µl konjugata 1. -Inkubacija mikrotitrske plošče poteka 60 ±2 min pri 37±1 ºC. Vdolbinice mikrotitrske plošče so prevlečene s protitelesi proti HBsAg. V testnem vzorcu HBsAg reagira v prvem koraku s poliklonskimi protitelesi vezanimi na dno vdolbinice mikrotitrske plošče in s konjugatom 1. -V spiralcu se posesajo vse vdolbinice. Plošča se spere s približno 0,3 ml spiralne tekočine v štirih ciklusih. Med vsakim ciklusom se plošča namaka približno 10 sek. S tem se odstranijo vsi nevezani reaktanti. -Vsaka vdolbinica se napolni z 100 µl konjugata 2. -Sledi inkubacija mikrotitrske plošče 30 ±2 min pri 37±1 ºC. Po spiranju nevezanih reaktantov se doda konjugat 2, ki reagira s konjugatom 1. Odločilna je aktivnost encima, vezanega na konjugatu 2. -Plošča se ponovno spere po prej opisanem postopku. -Po končanem spiranju se vsaka vdolbinica napolni s 75 µl kromogena. -Plošča se inkubira 30 ± 2 min pri ºC, zaščitena pred svetlobo. Kromogen se obarva rumeno, zaradi aktivnosti encima na konjugatu 2. -Reakcija se ustavi z dodajanjem 75 µl stop solucije POD. -Plošča se odčita v fotometru pri 450/650 nm valovne dolžine v času 1 ure. Intenzivnost barve je sorazmerna koncentraciji antigena v testnem vzorcu (25). Veljavnost testa: 1. Absorbanca negativne kontrole:-0,010 A(neg) 0,150, vrednost le ene negativne kontrole lahko odstopa. 2. Absorbanca pozitivne kontole: A(poz ) 0,700, vrednosti obeh pozitivnih kontrol morajo biti znotraj določenih mej. Vrednotenje rezultatov: Ā (neg. kontrole) + 0,050 = cut-off 1. A (vzorca) < cut-off =.NEGATIVEN 2. A (vzorca) Ā (neg. kontrole + 0,050) x 0,89 < cut-off = NEJASEN in mora biti ponovljen v dvojniku

29 Stran A (vzorca) cut-off = začetno REAKTIVEN in mora biti ponovljen v dvojniku. Če sta oba rezultata manjša od cut-off vrednosti, potem se smatra vzorec negativen na virusni označevalec HBsAg. Če je vsaj eden rezultat ponovljenega testiranja v dvojniku enak ali večji od cut-off vrednosti, se vzorec vrednoti kot ponovljeno reaktiven. Pri vseh začetno reaktivnih vzorcih ravnamo dalje po navodilih proizvajalca reagentov in po algoritmu testiranja za HBsAg. Kot reagent drugega proizvajalca uporabljamo HBsAg (V2) proizvajalca Abbott. Testiranje izvajamo na aparatu Axsym (slika. 2-5). Izvajamo še dodaten test protitelo proti antigenu jedra (core) virusa hepatitisa B (anti-hbc), imenovan CORE proizvajalca Abbott, na aparatu Axsym. Slika 2-5: Analizator Axsym

30 Stran 30 Test Abbott HBsAg (V2) je encimsko imunski test, ki uporablja mikrodelce (polistirenske kroglice), na katere so vezana monoklonska protitelesa proti površinskemu antigenu virusa hepatitisa B (anti-hbs). Test temelji na Microparticles Enzyme Immuno Assay (MEIA) tehniki. V reakcijsko posodico se odpipetira ustrezna količina vzorca in reagenta. Reakcijska posodica potuje v procesni center, kjer se zgodijo naslednje faze reakcije: Vzorec, mikrodelci prevlečene z anti-hbs in anti-hbs označena z biotinom se pomešajo v reakcijski posodici. Če so v vzorcu prisotni HBsAg, se vežejo z anti-hbs vezanimi na mikrodelcih in z anti-hbs označenimi z biotinom. Nastane kompleks protitelo-antigen-protitelo v reakcijski mešanici. Del reakcijske mešanice se prenese na matrix celico. Mikrodelci se vežejo ireverzibilno na steklena vlakna matrix celice. Doda se konjugat:, alkalna fosfataza, ki se veže na protitelo-antigen-protitelo kompleks. Matrix celica se spere in se tako odstranijo vsi nevezani delci. Doda se substrat:4-metilumbeliferil fosfat (MUP). Vezana alkalna fosfataza iz konjugata povzroči odcepljanje fosfatne skupine iz substrata, kar ima za posledico fluorescentno obarvanje reakcijskega produkta (4-Metilumbeliferon). Sledi merjenje fluorescentnega produkta v MEIA optičnem čitalcu (26). Vrednotenje rezultatov: Cut-off = vrednost indeks kalibratorja x 2 S/CO = vrednost vzorca (S) / Cut-off (CO) 1. S/CO vzorca < 1 = NEGATIVEN 2. S/CO vzorca 1 = začetno REAKTIVEN 2.4 Testiranje krvi krvodajalcev na anti-hcv Potek testiranja v analizatorju BEP 2000 Aparat speremo s spiralno tekočino. Pripravimo reagente in mikrotitrsko ploščo: Diluent vzorcev: fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom, stabilizator volovski proteini.

31 Stran 31 Konjugat; prititelesa proti človeškim protitelesom razreda IgG proti virusu hepatitisa C konjugirana s hrenovo peroksidazo in stabilizirana z volovskimi proteini. Substrat; tableta OPD (o-phenilenediamin 2HCl) raztopljena v substratnem pufru (citratnofosfatni pufer z 0,02% vodikovega peroksida). Stop solucija; 2M H 2 SO 4. Mikrotitrska plošča; dno vdolbinic prevlečeno z rekombinantnimi antigeni virusa hepatitisa C: c22-3, c200 in NS5. Pripravimo potrebno število stripov (št. vzorcev in 6 vdolbinic za kontrole). V aparatu potekajo naslednje faze testiranja: -Pipetiranje 200 µl diluenta v vse vdolbinice, tudi v A1. -Dodajanje po 20 µl negativne kontrole v tri zaporedne vdolbinice od pozicije B1 dalje in 20 µl pozitivne kontrole v dve naslednji vdolbinici. Sledi pipetiranje vzorcev krvi po 20 µl. -Inkubacija mikrotitrske plošče poteka 30 ±1 min pri 37±1 ºC. Če je v vzorcu prisotno protitelo proti kateremu od vezanih antigenov, se bo tvoril kompleks antigen-protitelo. -Vdolbinice se posesajo in nato do vrha napolnijo s spiralno tekočino. Spiranje poteka v štirih zaporednih ciklusih, med posameznimi ciklusi mora biti 20 sek premora. Spiranje se zaključi s sesanjem spiralne tekočine. V tem postopku se odstranijo vse nevezane komponente vzorca. -V vse vdolbinice se doda 200 µl konjugata. -Sledi inkubacija mikrotitrske plošče 30 ±1 min pri 37±1 ºC. Konjugat se veže na specifična mesta človeških protiteles tipa IgG na antigen-protitelo kompleksu. -Ponovi se postopek spiranja. Če se v prvi fazi ni tvoril kompleks antigen-protitelo, potem se celotni konjugat v tem koraku odstrani. -Še pred koncem druge inkubacije nas aparata z zvočnim signalom opozori, da moramo pripravit reagent. Raztopimo OPD tableto v substratnem pufru (za 24 vzorcev rabimo 1 tableto in 6 ml substratnega pufra). Ko je tableta dobro raztopljena reagent vlijemo v prej pripravljeno prazno stekleničko. Aparat odpipetira 200 µl substrata v vse vdolbinice. -Plošča se inkubira 30 ± 2 min pri ºC, zaščitena pred svetlobo. Če je vezan konjugat prisoten potem OPD oksidira in nastane rumeno obarvan končni reakcijski produkt. Barva se spremeni v oranžno z dodajanjem 50 µl 2M H 2 SO 4.. -Mikrotitrska plošča se odčita v roku 1 ure pri 492/620 nm (27). Test je veljaven kadar so zagotovljeni naslednji trije kriteriji: 1. Vrednost absorbance blank kontrole: -0,020 in 0,050

32 Stran Vrednost absorbance posamezne negativne kontrole: -0,005 in 0,120. Test je veljaven, kadar le ena absorbanca negativne kontrole odstopa. 3. Vrednost absorbance pozitivne kontrole:> cut-off. Da je test veljaven, morata obe pozitivni kontroli zadostiti temu kriteriju. Vrednotenje rezultatov: Cut-off = Ā (neg kontrole) Vzorec z A < -0,025 mora biti ponovljen v dvojniku. Kot nereaktiven se smatra, če so vrednosti ponovljenega testiranja manj od vrednosti cut-off. Hkrati se smatra vzorec kot nereaktiven, če so vrednosti absorbance ponovno < -0, Vzorec z A < cut-off in > -0,025 = NEREAKTIVEN 3. Vzorec z A Ā (neg kontrole ) x 0,84 < cut off = NEJASEN in mora biti ponovljen v dvojniku. 4. Vzorec z absorbanco cut-off = začetno REAKTIVEN in mora biti ponovljen v dvojniku pred končnim vrednotenjem rezultata. Vzorec je ponovljivo reaktiven, kadar je vsaj ena vrednost testiranja v dvojniku cut-off vrednosti, drugače se vrednoti kot nereaktiven. Po navodilih proizvajalca in po algoritmu testiranja za anti-hcv vse začetno reaktivne vzorce ponovimo v dvojniku z istim reagentom in v enojniku z reagentom HCV version 3.0 proizvajalca Abbott. HCV version 3.0 je MEIA test za kvalitativno detekcijo protiteles proti virusu hepatitisa C. Test je namenjen dokazovanju protiteles proti določenim proteinom HCV genoma. Test se izvaja na analizatorju Axsym v večih fazah: Vzorec se odpipetira v vdolbinico reakcijske posodice in se redči z ustreznim diluentom. V tako razredčen vzorec se odpipetirajo mikrodelci prevlečeni z antigenom. Reakcijska posodica se prenese v procesni center. Tam se reakcijska mešanica inkubira. Protitelesa iz vzorca se vežejo z antigeni na mikrodelcih. Del reakcijskega kompleksa se prenese na matrix celico, kjer se vežejo na steklena vlakna matrix celice. Površina matrix celice se spere. Doda se konjugat, monoklonska protitelesa koze konjugirana z alkalno fosfatazo, ki se v času inkubacije vežejo na protitelo-antigen kompleks. Spere se matrix celica in se tako odstranijo vsi nevezani reaktanti.

33 Stran 33 Doda se substrat: 4- metilumbeliferil fosfat (MUP). Vezana alkalna fosfataza iz konjugata povzroči odcepljanje fosfatne skupine iz substrata, kar ima za posledico fluorescentno obarvanje reakcijskega produkta (4-metilumbeliferon). Reakcijski produkt izmerimo v fotometru (28). Vrednotenje rezultatov: Cut-off = vrednost indeks kalibratorja x 0,12 S/CO = vrednost vzorca (S) / Cut-off (CO) 1. S/CO vzorca < 1 = NEREAKTIVEN 2. S/CO vzorca 1 = začetno REAKTIVEN 2.5 Testiranje krvi krvodajalcev na anti-hiv Potek testiranja v analizatorju BEP 2000 Aparat speremo s spiralno tekočino za test anti-hiv proizvajalca Dade Behring. V stojala naložimo potrebne reagente in pripravimo mikrotitrsko ploščo: Dilunet vzorcev; fosfatni pufer s kazeinom in Triton X-100, modre barve. Konjugat 1, rekombinantni HIV proteini (Escherichia Colli)/ sintetični peptidi HIV 1, HIV 2 in HIV 1(podtip 0) ter mišja monoklonska protitelesa proti antigenu HIV p24. razredčena s konjugat dilunetom (Tris pufer s Sapogenatom in kazeinom). Reagent je zelene barve. Konjugat 2; Tris pufer s Sapogenatom in streptavidinom, konjugiran s peroksidazo (POD), rdeče barve. Kromogen; TMB (tetrametilbenzidin dihidroklorid) pomešan s Pufer/Substrat TMB (vodikov peroksid v acetatnem pufru). Stop solucija POD; 0,25 M H 2 SO 4. Pozitivna in negativna kontrola. Mikrotitrska plošča; vdolbinice plošče prevlečene z mešanico rekombinantnih proteinov (Escherichia Colli) in sintetičnih peptidov HIV 1 gp24, HIV 1 (podtip 0) gp41, HIV 2 gp36 ter mišja monoklonska protitelesa proti HIV p24 antigenu. Pripravimo in vstavimo v aparat ustrezno število stripov (št. vzorcev in 4 vdolbinice za kontrole). V analizatorju BEP 2000 potekajo naslednje faze testiranja:

34 Stran 34 -Pipetiranje 25 µl diluenta za vzorce v vse vdolbinice. -Dodajanje 100 µl negativne kontrole v vdolbinico A1 in B1, v vdolbinico C1 doda 100 µl pozitivne kontrole, sledi pipetiranje vzorcev po 100 µl. Na koncu vseh vzorcev aparat doda še 100 µl pozitivne kontrole. -Inkubacija mikrotitrske plošče poteka 30 ±2 min pri 37±1 ºC. HIV specifični imunoglobulini v testnem vzorcu reagirajo z rekombinantnimi proteini in sintetičnimi peptidi HIV 1 gp24, HIV 1 (podtip 0) gp41 in HIV 2 gp36, ki so vezani na dno vdolbinic mikrotitrske plošče. Istočasno se v vzorcu obstoječi HIV p24 antigeni vežejo z monoklonskimi mišjimi protitelesi. -V spiralcu se posesajo vse vdolbinice. Plošča se spere s približno 0,3 ml spiralne tekočine v treh ciklusih. Odstranijo se vse nevezane komponente testnega vzorca. -V vsako vdolbinico aparat odpipetira 100 µl konjugata 1. -Sledi inkubacija mikrotitrske plošče 30 ±2 min pri 37±1 ºC. Vezana specifična protitelesa se v tem koraku vežejo z biotin konjugiranimi rekombinantnimi proteini oz. sintetičnimi peptidi HIV 1, HIV 2 in HIV 1(podtip 0). Hkrati se vsi vezani HIV antigeni vežejo z biotin konjugiranimi monoklonskimi protitelesi HIV p24. -Nevezan biotin konjugat se spere. -Vsaka vdolbinica plošče se napolni s 100 µl konjugata 2. -Ponovno sledi inkubacija plošče 30 ±2 min pri 37±1 ºC. Konjugat 2 (Streptavidin/POD) reagira s prej vezanim konjugatom 1. Aktivnost encima vezanega na konjugatu 2 povzroči obarvanje reakcije modro. -Višek konjugata se spere. -Doda se75 µl kromogena v vse vdolbinice. -Plošča se inkubira 30 ± 2 min pri ºC, zaščitena pred svetlobo. Poteka encimska zamenjava na kromogenu. -Po končani inkubaciji se doda 75 µl stop solucije POD. Reakcijski produkt se obarva rumeno. Plošča se izmeri v fotometru pri 450/650nm (29). Veljavnost testa: 1. -0,010 A (negativna kontrola) 0, ,500 A (pozitivna kontrola) 2, A (negativna kontrola) < cut-off Obe vrednosti negativne in pozitivne kontrole morajo biti znotraj zahtevanih mej. Vrednotenje rezultatov: Cut-off = Ā (pozitivne kontrole) x 0,23