Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za biologijo DELO Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI NA ODDELKU ZA BIOLOGIJO BIOTEHNIŠKE FAKULTETE UN

Transkripcija

1 Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za biologijo DELO Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI NA ODDELKU ZA BIOLOGIJO BIOTEHNIŠKE FAKULTETE UNIVERZE V LJUBLJANI Uredila: Marjanca Starčič Erjavec Ljubljana, 2017

2 Izdajatelj Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Delo z gensko spremenjenimi organizmi na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani Urednica prof. dr. Marjanca Starčič Erjavec, Katedra za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov Avtorji doc. dr. Gregor Belušič, Katedra za fiziologijo živali doc. dr. Matej Butala, Katedra za biokemijo doc. dr. Cene Gostinčar, Katedra za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov Bojan Papić, Katedra za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov doc. dr. Lejla Pašić, Katedra za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov dr. Ruth Rupreht, Ministrstvo za okolje in prostor, Direktorat za okolje prof. dr. Kristina Sepčić, Katedra za biokemijo dr. Matej Skočaj, Katedra za biokemijo prof. dr. Marjanca Starčič Erjavec, Katedra za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov doc. dr. Martina Turk, Katedra za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov Recenzenta prof. dr. Zlata Luthar, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo prof. dr. Jože Pungerčar, Institut Jožef Stefan, Odsek za molekularne in biomedicinske znanosti Izdaja publikacije je bila financirana iz sredstev raziskovalnih programov št. P1-0170, P1-0198, P1-0207, P in raziskovalnih projektov J3-3624, J4-2022, J4-2111, L4-5533, Z ki jih je financirala Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije iz državnega proračuna ter sredstev Infrastrukturnega centra IC Myocosmo Univerze v Ljubljani. CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana :604.6( ) DELO z gensko spremenjenimi organizmi na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani [Elektronski vir] / [avtorji Gregor Belušič... et al.] ; uredila Marjanca Starčič Erjavec. - El. knjiga. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2016 Način dostopa (URL): ISBN (pdf) 1. Belušič, Gregor 2. Starčič Erjavec, Marjanca

3 KAZALO Predgovor in zahvala...vii 1. Poglavje: Zgodovina in splošna predstavitev nastanka GSO Poglavje: Predstavitev zakonodaje s področja GSO Poglavje: GSO v metagenomiki Poglavje: Raziskovanje prilagoditev gliv za življenje v skrajnostnih okoljih s pomočjo GSO Poglavje: O vinu, pivu in biogorivu GS-kvasovke Poglavje: Uporaba GSO pri preučevanju interakcij proteinov z naravnimi in umetnimi lipidnimi membranami Poglavje: GSO, uporabljeni za študije parodontoze in biologije heteronemertina Poglavje: Gensko spremenjene vinske mušice Stvarno kazalo Priloge Slovarček Kratice in okrajšave Zadrževalni ukrepi za delo z GSO v laboratoriju Zaprti sistemi za delo z GSO na Oddelku za biologijo in njihova dokumentacija Zaprti sistem kateder za molekularno genetiko, biologijo mikroorganizmov in biokemijo Navodila za delo z GSO v laboratorijih Zaprtega sistema kateder za molekularno genetiko, biologijo mikroorganizmov in biokemijo Načrt zadrževalnih ukrepov za Zaprt sistem kateder za molekularno genetiko, biologijo mikroorganizmov in biokemijo Načrt ukrepov za primer nesreče pri delu z GSO v Zaprtem sistemu kateder za molekularno genetiko, biologijo mikroorganizmov in biokemijo Načrt ukrepov za primer izrednega dogodka pri delu z GSO v Zaprtem sistemu kateder za molekularno genetiko, biologijo mikroorganizmov in biokemijo Zaprti sistem katedre za fiziologijo živali Navodila za delo v Zaprtem sistemu katedre za fiziologijo živali Načrt zadrževalnih ukrepov za Zaprt sistem katedre za fiziologijo živali Načrt ukrepov za primer nesreče pri delu z GSO v Zaprtem sistemu katedre za fiziologijo živali Načrt ukrepov za primer izrednega dogodka pri delu z GSO v Zaprtem sistemu katedre za fiziologijo živali Zaprti sistem pralnica Navodila za delo v Zaprtem sistemu pralnica Načrt zadrževalnih ukrepov za Zaprt sistem pralnica Načrt ukrepov za primer nesreče pri delu z GSO v Zaprtem sistemu pralnica Načrt ukrepov za primer izrednega dogodka pri delu z GSO v Zaprtem sistemu pralnica iii

4 Seznam vseh skupin GSO na Oddelku za biologijo, ki smo jih pripravili v obdobju pred izdajo prve monografije o GSO na Oddelku za biologijo Seznam vseh skupin GSO na Oddelku za biologijo, ki smo jih na novo pripravili in uporabljali v obdobju po izdaji prve monografije o GSO na Oddelku za biologijo Ocene tveganja za skupine GSO na Oddelku za biologijo, ki smo jih na novo pripravili in uporabljali v obdobju po izdaji prve monografije o GSO na Oddelku za biologijo Ocena tveganja za delo z GSO knjižnica cdna glive Aureobasidium pullulans sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sev E. coli in laboratorijski sev S. cerevisiae z vključkom D12-desaturaze glive Aureobasidium pullulans sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sev E. coli in laboratorijski sev S. cerevisiae z vključkom glicerolnega transporterja STL1 glive Aureobasidium pullulans sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO vključki gena za 16S rrna pomnoženih iz okoljske DNA biofilmov jamskih bakterij fozmid Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz bakterije Chlamydia trachomatis Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za hipotetični protein CPn0176 in kloniran gen za protein MACPF iz bakterije Chlamydophila pneumoniae Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz bakterije Chryseobacterium gleum Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz bakterije Clostridium perfringens Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz vinske mušice Drosophila melanogaster Ocena tveganja za delo z GSO E. coli z vključki bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitans Ocena tveganja za delo z GSO vključki bakterije Clostridium bifermentas Ocena tveganja za delo z GSO vključki bakterije Clostridium difficile Ocena tveganja za delo Z GSO laboratorijski sevi E. coli z vključki filogenetskih označevalcev glive Hortaea werneckii Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za citolitični protein iz heteronemertina Parborlasia corrugatus Ocena tveganja za delo z GSO vključki bakterije Pseudomonas aeruginsa Ocena tveganja za delo z GSO vključki bakterije Vibrio cholerae Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sev E. coli in laboratorijski sev S. cerevisiae z vključkom D12-desaturaze glive Hortaea werneckii sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sev E. coli in laboratorijski sev S. cerevisiae z vključkom glicerolnega transporterja STL1 glive Hortaea werneckii sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sevi E. coli z vključki glivnih in bakterijskih združb iz mikrobnih preprog Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sevi E. coli z vključki gena za 16S rrna bakterijskih združb iz aktivnega blata čistilne naprave iv

5 Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sev S. cerevisiae z vključkom biotehnološko pomembnih genov iz Aureobasidium pullulans sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz protozojskega parazita Plasmodium falciparum Ocena tveganja za delo z GSO plazmidni vektorji YRC za ekspresijo proteinov v Saccharomyces cerevisiae Ocena tveganja za delo z GSO vključki gliv Pleurotus ostreatus in Pleurotus eryngii. 214 Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz bakterije Prevotella ruminicola Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz bakterije Ralstonia solanacearum Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sev E. coli in laboratorijski sev S. cerevisiae z vključkom fosfoglukomutaze RmPGM2 in fosfomanomutaze RmSEC53 glive Rhodotorula mucilaginosa SEV EXF Ocena tveganja za delo z GSO knjižnica cdna glive Rhodotorula mucilaginosa sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO kloniran gen za protein iz bakterije Sphingobacterium spiritivorum Ocena tveganja za delo z GSO laboratorijski sev E. coli in laboratorijski sev S. cerevisiae z vključkom glicerolfosfat-dehidrogenaze gliv Wallemia ichthyophaga sev EXF Ocena tveganja za delo z GSO knjižnica cdna glive Wallemia ichthyophaga sev EXF Seznam oseb in služb, ki se jih obvesti v primeru nesreče, ki privede do sproščanja v okolje izven stavbe biološkega središča v

6

7 PREDGOVOR IN ZAHVALA Na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani imamo z delom z GSO dolgoletno tradicijo, in smo že marsikateri GSO pripravili in ga v naših raziskavah uporabili. Že v letu 2009 smo izdali prvič monografijo o GSO na Oddelku za biologijo, kjer smo predstavili tri zaprte sisteme za delo z GSO, ki jih imamo na Oddelku za biologijo: Zaprti sistem kateder za molekularno genetiko, biologijo mikroorganizmov in biokemijo, Zaprti sistem katedre za fiziologijo živali in Zaprti sistem pralnica ter prikazali skupine GSO, s katerimi smo do tedaj delali. Ker je od takrat preteklo že kar nekaj časa in so bili v tem času pripravljeni tudi že mnogi novi GSO, smo se odločili, da v letu 2016 pripravimo novo monografijo, v kateri bomo povzeli naše delo z GSO v obdobju Prisrčno se zahvaljujemo recenzentoma, prof. dr. Zlati Luthar z Oddelka za agronomijo Biotehniške fakultete v Ljubljani in prof. dr. Jožetu Pungerčarju z Odseka za molekularne in biomedicinske znanosti Instituta Jožef Stefan, za skrbno opravljeno recenzijo. Zahvala gre tudi prof. dr. Urošu Petroviču za nasvete s področja nomenklature v genetiki kvasovk. Hvaležni smo tudi Barbari Černač za vso pomoč pri izdaji te monografije. Prof. dr. Marjanca Starčič Erjavec Pooblaščenka za biološko varnost in odgovorna oseba za prijavljanje GSO Oddelka za biologijo Ljubljana, februar 2017 vii

8

9 1. POGLAVJE Zgodovina in splošna predstavitev nastanka GSO Marjanca Starčič Erjavec POVZETEK O gensko spremenjenem organizmu (GSO) govorimo takrat, ko se pridobi nek organizem, z izjemo človeka, ali mikroorganizem, katerih genetski material je spremenjen s postopki, ki potekajo drugače kot v naravnih razmerah s križanjem ali naravno rekombinacijo. Najpogostejši tak postopek je molekulsko kloniranje. Molekulsko kloniranje, ki mu pogosto rečemo kar tehnologija rekombinantne DNA ali genetsko inženirstvo, vključuje izolacijo določenega dela DNA in pomnoževanje tega dela v velikem številu kopij v gostiteljskih celicah. Postopek zajema več korakov. Najprej pripravimo del DNA (vključek ali insert), ki ga bomo klonirali. Želeno DNA nato združimo z vektorjem in tako dobljeno rekombinantno DNA vnesemo s transformacijo, transfekcijo ali z elektroporacijo v gostiteljske celice. Znanstvena odkritja, ki so omogočila molekulsko kloniranje, so se dogajala v t. i. dobi molekularne genetike, ki se je začela leta 1953 s predstavitvijo modela zgradbe dvojne vijačnice molekule DNA, ki sta ga zasnovala J. D. Watson in F. H. Crick. Prve poskuse molekulskega kloniranja so P. Berg, H. W. Boyer in S. N. Cohen izvedli v začetku 70-ih let. Že v letu 1978 so H. W. Boyer, A. D. Riggs in K. Itakura združili gen (zapis) za humani inzulin z vektorskim bakterijskim plazmidom in takšno rekombinantno molekulo DNA vnesli v bakterijo Escherichia coli (E. coli), ki je nato uspešno proizvedla humani inzulin, t. i. humulin. Leta 1982 je ameriška FDA (angl. Food and Drug Administration) odobrila humulin za prodajo na trgu in tako smo dobili prvi biotehnološki proizvod iz gensko spremenjenega mikroorganizma. E. coli je poleg bakterije Bacillus subtilis in kvasovk tudi še danes najpogosteje uporabljen gostiteljski organizem. KLJUČNE BESEDE: molekulsko kloniranje, tehnologija rekombinantne DNA, genetsko inženirstvo, gostiteljski organizem, vključek, vektor. 1. UVOD GSO so organizmi, ki so nastali s pomočjo tehnologije rekombinantne DNA oz. molekulskega kloniranja, ki mu pravimo tudi genetsko inženirstvo. Ta tehnologija omogoča prenos genov med različnimi organizmi in s tem nastanek takšnih, ki v naravi zelo verjetno ne bi nastali. Genski prenosi v naravi so sicer zelo pestri in se dogajajo tako v vertikalni (s staršev na potomce) kot v horizontalni smeri (med posamezniki v isti generaciji), med predstavniki iste vrste kot tudi med predstavniki različnih vrst. Vendar se genski prenosi v naravi dogajajo popolnoma naključno, medtem ko je za tehnologijo rekombinante DNA značilno, da je gen, ki se bo prenesel, ciljno izbran in da njegov prenos poteka usmerjeno, kar seveda omogoča veliko prednosti v primerjavi z genskimi prenosi v naravi. 2. ZGODOVINSKI MEJNIKI POMEMBNI ZA GSO V zgodovinski časovnici pomembnih genetskih znanstvenih odkritij je kar nekaj prelomnih, ki so omogočili molekulsko kloniranje, kot ga dandanes izvajamo. Tukaj bodo predstavljeni samo najpomembnejši JOHANNES F. MIESCHER IN PRVA IZOLACIJA DNA LETA 1869 Prvi znanstvenik, ki mu je uspelo izolirati DNA, je bil švicarski zdravnik Johannes Friedrich Miescher, ki je delal na Fakulteti za naravoslovje Univerze v Tübingenu v Nemčiji. Spomladi leta 1868 je končal študij medicine v Baslu v Švici in se je, ker so ga nadvse zanimale raziskave temeljev življenja, odpravil v Tübingen, na Fakulteto za naravoslovje, kjer so raziskovali biokemijo tkiv in izolirali molekule iz celic. Miescherjeva naloga je bila izolirati in preučiti sestavo levkocitov belih krvnih celic. Ker je vedel, da je v 1

10 gnoju ogromno levkocitov, si je leta 1869 iz bližnje bolnišnice priskrbel povoje bolnikov z gnojnimi ranami. Povoje je za nekaj časa namočil v raztopino natrijevega sulfata, Na 2 SO 4, da so se celice sprale z njih. Zatem je povoje odstranil in raztopini s celicami dodal šibko bazično raztopino. Celice so lizirale in na dnu reakcijske posode se je pojavila usedlina, v kateri so bila jedra celic. Celičnim jedrom je nato dodal razredčeno raztopino natrijevega sulfata. Jedra so v tej raztopini nabreknila in postala prosojna. Iz celičnih jeder je nato izoliral rumeno obarvano raztopino snovi, iz katere je z dodatkom ocetne ali klorovodikove kisline oboril do takrat še nepoznano kemijsko snov, ki jo je poimenoval nuklein. Danes vemo, da je bila oborjena snov DNA. Nuklein je našel tudi v drugih celicah, ki jih je raziskoval (npr. lososova sperma) (Dahm, 2005; Dahm, 2008). Slika 1-1: Johannes Friedrich Miescher. Vir slike: File:Friedrich_Miescher.jpg JAMES D. WATSON IN FRANCIS H. CRICK IN ODKRITJE ZGRADBE DNA LETA 1953 Po tem, ko so leta 1944 Oswald T. Avery, Colin MacLeod in Maclyn McCarty s kemijsko metodo dokazali, da je DNA dedna snov, in ko sta leta 1952 to potrdila še Alfred Hershey in Martha Chase z biološko metodo, je postala želja po poznavanju zgradbe DNA neizmerna. To željo sta izpolnila že leta 1953 James D. Watson, ameriški molekulski biolog, in Francis H. Crick, britanski molekulski biolog, ko sta odkrila zgradbo dvojne vijačnice molekule DNA. Slika 1-2: James D. Watson in Francis H. Crick ter njun model dvojne vijačnice DNA. James Watson (levo) in Francis H. Crick (desno) ob svoje aluminijastem modelu dvojne vijačnice DNA. Zadaj na steni je vidna skica modela dvojne vijačnice DNA, ki je bila objavljena tudi v reviji Nature. Vir slike: 2

11 V reviji Nature sta takrat objavila svoj članek o molekulski strukturi deoksiribonukleinske kisline (Watson in Crick, 1953), ki je nastal na podlagi strnitve vseh do takrat znanih dejstev o DNA, ko so jih pred njima zbrali že drugi znanstveniki (Semenza, 2003). Phoebus Levene, v Litvi rojeni ameriški biokemik, je odkril, da je osnovni gradnik DNA sestavljen iz fosfatne skupine, vezane na sladkor deoksiribozo, na katero je vezana ena izmed štirih dušikovih baz: adenin (A), citozin (C), gvanin (G) ali timin (T). On je bil tudi, ki je dal ime osnovnemu gradniku DNA, in sicer nukleotid (Levene in Bass, 1931). Erwin Chargaff, avstrijski biokemik, je izoliral DNA iz različnih organizmov in ugotovil, da je v vsakem od preučevanih organizmov količina adenina zelo podobna količini timina in da je količina citozina zelo podobna količini gvanina, iz česar je sklepal, da morajo biti nukleotidi razporejeni tako, da se število A ujema s številom T in število C s številom G (Chargaff, 1950). Linus Pauling, ameriški kemik, je s pomočjo rentgenske kristalografije v mnogih proteinih odkril vijačno strukturo, ki jo je poimenoval alfa vijačnica, in je tako tudi že predlagal, skupaj s Robert B. Coreyem, nekakšno triverižno vijačno strukturo za DNA (Pauling in Corey, 1953). Rosalind Franklin, britanska biokemičarka, in Maurice Wilkins, v Novi Zelandiji rojeni britanski fizik, sta z rentgensko kristalografijo, uspela pridobiti kristalografske slike DNA, na podlagi katerih je Rosalind izračunala osnovne dimenzije molekule DNA (Watson in Crick, 1953). Vsa ta dotedanja spoznanja sta Watson in Crick pravilno povezala in združila v predstavljenem modelu zgradbe DNA kot dvojne vijačnice iz dve verig nukleotidov z nasprotno orientacijo, ki se ovijata okoli skupne osi. Na obodu dvojne vijačnice so med seboj povezani fosfatno sladkorni ostanki in v notranjosti komplementarne dušikove baze. Dušikove baze ene in druge verige se med seboj povezujejo z vodikovimi vezmi, pri čemer se A povezuje s T in C z G (Watson in Crick, 1953). Na podlagi teh parov sta Watson in Crick v svojem članku tudi izpostavila, da tvorjenje teh parov nakazuje na možen mehanizem podvojevanja molekule DNA. Njuno zamisel sta leta 1958 potrdila Matthew Meselson, ameriški genetik, in Franklin Stahl, ameriški molekulski biolog, ki sta izvedla poskus, s katerim sta dokazala, da se DNA podvaja tako, da ena veriga služi drugi kot matrica, da se torej podvaja na semikonzervativen način (Meselson in Stahl, 1958) MARSHALL W. NIRENBERG IN JOHANN H. MATTHAEI IN ODKRITJE GENETSKEGA KODA LETA 1961 Po odkritju zgradbe molekule DNA so znanstveniki pričeli z odkrivanjem genetskega koda načela, kako je lahko v zaporedju nukleotidov zapisana informacija za zaporedje aminokislin v proteinih. Prvi predlog genetskega koda je podal rusko-ameriški teoretični fizik George Gamow (Biro, 2008). Tako je že leta 1954 George Gamow predpostavil, da je edini način, kako z uporabo štirih različnih nukleotidov (A, C, G in T), ki so v DNA, lahko kodiramo 20 različnih aminokislin, ta, da zaporedje treh nukleotidov (= kodon) kodira eno aminokislino. Le kombinacija 3 nukleotidov v zaporedju molekule DNA namreč lahko da dovolj različnih kodonov, da je s tem kodiranih (zapisanih) 20 različnih aminokislin (Gamow, 1954). Tudi Francis H. Crick s sodelavci je poskušal predpostaviti genetski kod in zamisli o kodu brez vejice objavil leta 1957 (Crick in sod., 1957). To pa je bilo leto, ko je s svojim delom na ameriškem Nacionalnem inštitutu za zdravje (angl. National Institute of Health) pričel mladi podoktorski raziskovalec Marshall W. Nirenberg. Raziskoval je sintezo beljakovin v t. i. brezceličnih sistemih, ki so jih pridobivali iz ekstrakta bakterijskih celic. Predvsem ga ja zanimala povezava med DNA, RNA in beljakovinami. Leta 1960 je tako pričel z raziskavami, ki so pokazale, da je RNA potrebna za sintezo beljakovin. Na podlagi rezultatov teh poskusov je domneval, da bi umetne sintetične molekule RNA lahko uporabili za razkritje genetskega koda. V novembru istega leta se mu je pridružil nemški podoktorski raziskovalec Johann Heinrich Matthaei, ki je dobil dveletno NATO-vo štipendijo za raziskave na sistemih brezcelične beljakovinske sinteze. In maja 1961 je Matthaei bil tisti, ki je po zamisli Nirenberga izvedel poskus, ki je razkril pomen zapisa UUU. V brezcelični sistem za sintezo beljakovin je dodal poliu-rna in potem analiziral, katera aminokislina se je vgradila v beljakovino, ki je nastala na podlagi poliu-rna. Ugotovil je, da je bila to aminokislina fenilalanin. O tem odkritju sta 1961 objavila članek (Nirenberg in Matthaei, 1961). V 3

12 naslednjih letih so ne le Nirenberg s skupino svojih sodelavcev, ampak tudi raziskovalci na drugih ustanovah z veliko hitrostjo odkrivali pomene še vseh ostalih kodonov. Slika 1-3: Marshall W. Nirenberg in Johann H. Matthaei. Marshall Nirenberg (desno) in Johann Matthaei (levo) v laboratoriju na NIH. Vir slike: MARTIN GELLERT IN ODKRITJE DNA-LIGAZE LETA 1967 V 60-ih letih 20. stoletja so znanstveniki že vedeli, da v naravi poteka rekombinacija molekul DNA, saj so npr. odkrili, da se lahko molekula DNA, ki se prelomi zaradi vliva ultravijoličnega sevanja, na istem mestu spet ponovno združi (zlepi). In tako se je pričela tekma, kdo bo prvi odkril encim, ki lahko lepi konce DNA. To je odkril, v Češkoslovaški rojeni ameriški kemik, Martin Gellert leta 1967 (Kiermer, 2007). A. B. Slika 1-4: Martin Gellert in njegova slika krožne molekule bakteriofagne DNA. A. Martin Gellert. Vir slike je B. Elektronska slika ( kratna povečava) kovalentno povezane molekule bakteriofagne DNA, tj. genoma, virusa. Vir slike je 4

13 Martin Gellert je delal na ameriškem Nacionalnem inštitutu za zdravje, kjer je opazil, da se izolirana virusna DNA bakteriofaga, ki je zaokrožena zaradi vodikovih vezi med obema koncema molekule DNA, spremeni v kovalentno povezano krožno molekulo, če nanjo deluje z ekstraktom, pripravljenim iz celic bakterije Escherichia coli (E. coli). Nadalje je opazil, da v kolikor doda, namesto z vodikovimi vezmi povezanih krožnih molekul DNA bakteriofaga linearno DNA bakteriofaga ne nastane kovalentna povezava med obema koncema molekule DNA. Iz teh rezultatov je sklepal, da mora biti v ekstraktu iz E. coli prisoten nek encim, ki lahko naredi kovalentne povezave med dvema koncema molekule DNA, ki sta že bila predhodno povezana z vodikovimi vezmi, da torej obstaja nek encim, ki popravlja prekinitve (prelome) v molekuli DNA, tako da jih ponovno zlepi (Gellert, 1967). Po objavi Gellertovega članka so se nadaljevali poskusi izolacije encima, ki ima sposobnost zlepljanja koncev DNA, torej tvorbe fosfodiestrske vezi med dvema deloma dvoverižne molekule DNA. V šestih mesecih po objavi Gellertovega članka so tako Gellert kot še tri druge skupine, neodvisno drug od drugega, izolirale ustrezni encim, DNA-ligazo (Kiermer, 2007) HAMILTON O. SMITH IN ODKRITJE RESTRIKCIJSKE ENDONUKLEAZE S SPECIFIČNIM PREPOZNAVNIM MESTOM LETA 1970 Leta 1968 so neodvisno v dveh ustanovah odkrili encim, ki cepi (reže) molekulo DNA. Na švicarskem inštitutu za molekularno biologijo v Ženevi sta delala švicarski mikrobiolog in genetik Werner Arber in Stuart Linn, ameriški biokemik in molekulski biolog. Ta dva sta iz seva B bakterije E. coli (E. coli B) uspela izolirati pripravek, ki je imel restrikcijsko endonukleazno funkcijo in rezal bakteriofagno DNA virusa fd. V bioloških laboratorijih harvardske univerze v ZDA pa sta na sevu K (E. coli K) delala ameriški genetik in molekulski biolog Matthew Meselson in ameriški molekulski genetik Robert Yuan. Tudi njima je iz seva E. coli K uspelo izolirati encim, ki je rezal bakteriofagno DNA virusa. Skupno obema izoliranima encimoma je bilo, da za svojo aktivnost potrebujeta S-adenozilmetionin, ATP in Mg 2+ ione ter da režeta DNA neodvisno od določenega prepoznavnega mesta, da torej režeta DNA kot endonukleazi nespecifično. Kar je pomenilo, da ta dva encima nista bila prepoznana kot uporabna, saj ne bi mogli predvideti, kje v molekuli DNA bosta rezala. Restrikcijski encim, ki reže na določenem mestu, pa je našel ameriški mikrobiolog Hamilton O. Smith s svojima sodelavcema iz Oddelka za mikrobiologijo Univerze John Hopkins v ZDA (Kelly in Smith, 1970; Smith in Wilcox, 1970). Smith je s sodelavcema, svojima podiplomskima študentoma, izoliral restrikcijski encim iz seva Rd bakterije Haemophilus influenzae, ki za svojo encimsko aktivnost potrebuje le Mg 2+ ione in reže le na specifičnem prepoznavnem zaporedju. A. B. Slika 1-5: Hamilton O. Smith in prepoznavno zaporedje restrikcijskega encima, ki ga je odkril. A. Hamilton Smith. Vir slike je B. Prepoznavno zaporedje odkritega encima, kot je zapisano v članku Kelly in Smith,

14 Odkritje restrikcijskega encima, ki ima določeno prepoznavno zaporedje, pa je odprlo zelo velike možnosti za manipulacije z DNA, kar je privedlo do razvoja tehnologije rekombinantne DNA PAUL N. BERG IN PRIPRAVA PRVE REKOMBINANTNE MOLEKULE DNA LETA 1971 Prvi, ki mu je uspelo pripraviti rekombinantno molekulo DNA, sestavljeno iz delov molekul DNA dveh različnih virov ( organizmov ), je bil ameriški biokemik Paul N. Berg z Oddelka za biokemijo Univerze v Standfordu. Pri tem sta mu pomagala sodelavca David A. Jackson in Robert H. Symons (Jackson in sod., 1972). Slika 1-6: Paul N. Berg. Vir slike je Berg je v svojem poskusu uporabil molekuli DNA dveh virusov, opičjega virusa SV40 in bakterijskega virusa. Krožno molekulo DNA virusa SV40 je najprej z restrikcijskim encimom EcoRI prekinil (odprl) in nato vanjo vključil fragment (košček) molekule DNA bakteriofaga. Slika 1-7: Bergov poskus poenostavljen prikaz. Vir slike je Slika je poslovenjena. 6

15 Vključitev fragmenta molekule DNA bakteriofaga v odprto molekulo DNA virusa SV40 je bila dokaj zapletena, saj je za vključitev potreboval kar nekaj korakov, ki so sledili začetnemu koraku, rezanju z encimom EcoRI. V naslednjih korakih je tako uporabil še naslednje encime: -eksonukleazo, terminalno transferazo, DNA-polimerazo E. coli, DNA-ligazo E. coli in eksonukleazo III E. coli. Slika 1-8: Bergov poskus celotni postopek. Postopek priprave kovalentno zaprtih rekombinantnih molekul, kot je bil prikazan v članku Jackson in sod. (1972). S pripravo prve rekombinantne molekule DNA so se tako postavili temelji sodobnega načina priprave rekombinantnih molekul DNA v molekularni biologiji HERBERT W. BOYER IN STANLEY N. COHEN IN PRVI MOLEKULSKI KLON LETA 1972 Ameriški biokemik Herbert W. Boyer iz kalifornijske univerze in ameriški genetik Stanley N. Cohen iz standfordske univerze sta se leta 1972 srečala na konferenci o plazmidih na Havajih. Ob klepetu sta si izmenjala svoje izkušnje, kaj raziskujeta (Seedhouse, 2014). Slika 1-9: Herbert W. Boyer (levo) in Stanley N. Cohen (desno). Vir slike je 7

16 Cohen je delal na plazmidih, njihovi izolaciji in ponovnem vnosu v bakterije, Boyer pa je rezal DNA z restrikcijskim encimom EcoRI in konce ponovno združeval. Svoji ekspertizi sta združila v zamisel o pripravi molekulskega klona (Seedhouse, 2014). Slika 1-10: Boyerjev in Cohenov poskus poenostavljen prikaz. Vir slike je Slika je poslovenjena. Tako so se že kmalu po konferenci v njunih dveh laboratorijih lotili uresničevanja njune zamisli, pri čemer sta jima pomagala sodelavca Annie C. Y. Chang in Robert D. Helling. Leta 1973 so že uspeli objaviti članek, v katerem so prikazali udejanjeno izvedbo Cohenove in Boyerjeve zamisli, da se lahko posamezni geni vstavijo v bakterijske plazmide, ki se samostojno podvojujejo, in takšne rekombinantne molekule DNA vnesejo v gostiteljske bakterijske celice (Cohen in sod., 1973). Kmalu zatem sta Chang in Cohen (1974) objavila članek, v katerem sta pokazala, da lahko kloniramo tudi gene iz nesorodne bakterije, če jih vnesemo v E. coli in tam uspešno pridobimo funkcionalen protein nesorodne bakterije. Kmalu zatem sta H. W. Boyer in S. N. Cohen s sodelavci objavila članek, da lahko uspešno klonirajo tudi gene iz evkariontskih celic (Morrow in sod., 1974). Vsi ti trije objavljeni članki so med znanstveniki povzročili precejšnje vznemirjenje in dali zagon mnogim drugim znanstvenikom, da so se lotili raziskovanja skoraj neomejenih možnosti kloniranja oz. genetskega inženirstva (Cohen, 2013) HERBERT W. BOYER, ARTHUR D. RIGGS IN KEIICHI ITAKURA IN REKOMBINANTNI INZULIN (HUMULIN) LETA 1978 Po principu priprave molekulskih klonov, kot sta ga zastavila H. W. Boyer in S. H. Cohen, so v okviru podjetja Genentech raziskovalci Herbert W. Boyer, biokemik Arthur D. Riggs in biolog Keiichi Itakura leta 1978 v vektorsko molekulo DNA vstavili človeški gen (nukleotidni zapis) za inzulin, ki so ga umetno, tj. kemično, sintetizirali in rekombinantno molekulo DNA vstavili v bakterijo E. coli. V bakteriji se je nato sintetiziral človeški inzulin, ki so ga, da bi ga razlikovali od človeškega, poimenovali humulin. Pri tem so jim pomagali seveda še drugi sodelavci, med njimi David Goeddel in Roberto Crea (Goeddel in sod., 1979). 8

17 Slika 1-11: Keiichi Itakura, Arthur D. Riggs, David Goeddel in Roberto Crea ob prikazu priprave humulina. Vir slike je Raziskovalci na sliki so poimenovani od leve proti desni. Leta 1982 je ameriška FDA odobrila humulin za prodajo na trgu in tako smo dobili prvi biotehnološki proizvod iz gensko spremenjenega mikroorganizma. Za bolnike s sladkorno boleznijo, katerih zdravljenje je odvisno od inzulina, je to bilo veliko olajšanje, saj je bil na ta način proizveden inzulin lažje dostopen in tudi boljše kakovosti (Chance in Frank, 1993). Slika 1-12: Zdravilo humulin se lahko dobi v različnih oblikah. Na slovenskem trgu je zdravilo humulin dostopno kot suspenzija za injiciranje ali v obliki injekcijskega peresnika. Vir slike je 3. SODOBNEJŠA PRIPRAVA GENSKO SPREMENJENEGA ORGANIZMA Tudi v sodobnem času je princip molekulskega kloniranja, ki omogoča nastanek gensko spremenjenega organizma, bolj ali manj podoben. Fragment DNA, ki ima želen gen in ga vstavimo v vektor (plazmid), lahko še vedno pripravimo s pomočjo izolacije DNA in potem rezanja z restrikcijskim encimom, tako kot so to izvedli Berg, Cohen in Boyer. A po odkritju verižne reakcije pomnoževanja DNA s polimerazo (PCR) v letu 1985 želen gen pogosto kar pomnožimo s PCR, dobljeni produkt režemo z restrikcijskimi encimi in vstavimo v vektor. Obstaja pa še tretja možnost, pri kateri želen gen pripravimo kar z in vitro sintezo DNA. 9

18 Princip priprave GSO z različnimi možnostmi je prikazan na spodnji shemi. Slika 1-13: Priprava GSO danes. Plazmidni vektor, ki ga bomo uporabili za kloniranje, izoliramo po postopku plazmidne izolacije in ga lineariziramo z uporabo restrikcijskih encimov. Fragment DNA, ki ga želimo vstaviti v vektor, lahko pripravimo tako, da iz organizma, katerega kromosomsko DNA želimo klonirati, po postopku za izolacijo kromosomske DNA le-to izoliramo, jo nato režemo z restrikcijskimi encimi ali pa jo uporabimo za to, da s PCR pomnožimo želen odseka, ki ga nato za vstavitev v vektor režemo s primernimi restrikcijskimi encimi. Pri rezanju z restrikcijskimi encimi moramo paziti, da so si konci, ki nastanejo po rezanju kromosomske oz. v PCR pomnožene DNA in plazmidne DNA komplementarni. Želen fragment DNA lahko tudi pridobimo brez izolacije iz organizma, tako da ga kar sintetiziramo in vitro. Fragmente kromosomske DNA, ki so nastali po rezanju oz. s sintezo DNA in vitro, vključimo v lineariziran vektor (ligacija). Po uspešni vključitvi fragmenta kromosomske DNA v vektor vnesemo rekombinantno molekulo DNA v gostiteljeve celice (transformacija), kjer se namnoži in se izraža. 10

19 4. ZAKLJUČEK Priprava GSO je dandanes res preprosta. Na voljo so različni kompleti, ki olajšajo izolacijo DNA, cenejši in hitrejši restrikcijski encimi. Vnose v gostiteljske celice pogosto izvajamo z elektroporacijo, ki omogoča učinkovitejše vključitve tudi večjih rekombinantnih molekul DNA. Enostavno in hitro določanje nukleotidnih zaporedij celotnih genomov, ki ga omogoča nova generacija tehnik za določanje nukleotidnega zaporedja, je prinesla nov zagon. Tudi uvedba novih gostiteljski organizmov, kot so bakterija Bacillus subtilis in evkariontski enocelični organizmi kvasovke, je omogočila dodatne možnosti priprave GSO in njihove uporabe za raziskovalne in komercialne namene. Kot gostiteljske celice uporabljamo tudi rastlinske in živalske celice. Delamo s celičnimi in tkivnimi kulturami. A vendarle bakterija E. coli še vedno ostaja najpogosteje uporabljen gostiteljski organizem. 5. LITERATURA Biro, J. C Discovery of proteomic code with mrna assisted protein folding. Int J Mol Sci 9: Crick, F. H. C., Griffith, J. S., Orgel, L. E Codes without commas. Proc Nat Acad Sci USA 43: Chargaff, E Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymatic degradation. Experientia 6: Chance, R. E., Frank, B. H Research, development, production, and safety of biosynthetic human insulin. Diabetes Care 16 (Suppl 3): Chang, A. C. Y., Cohen, S. N Genome construction between bacterial species in vitro: replication and expression of Staphylococcus plasmid genes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 71: Cohen, S. N DNA cloning: a personal view after 40 years. Proc Natl Acad Sci USA 110: Cohen, S. N., Chang, A. C., Boyer, H. W., Helling, R. B Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 70: Dahm, R Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Dev Biol 278: Dahm, R Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Hum Genet 122: Gamow, G Possible relation between deoxyribonucleic acid and protein structures. Nature 173: Gellert, M Formation of covalent circles of lambda DNA by E. coli extracts. Proc Natl Acad Sci USA 57: Goeddel, D. V., Kleid, D. G., Bolivar, F., Heyneker, H. L., Yansura, D. G., Crea, R., Hirose, T., Kraszewski, A., Itakura, K., Riggs, A. D Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc Natl Acad Sci USA 76: Jackson D. A., Symons R. H., Berg P Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 69: Kelly, T. J. Jr., Smith, H. O A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. II. Base sequence of the recognition site. J Mol Biol 51: Kiermer, V The dawn of recombinant DNA. Nature Milestones DNA Technologies. Levene, P. A., Bass, L. W Nucleic Acids, Chemical Catalogue Co, New York. Meselson, M., Stahl, F. W The replication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 44: Morrow, J. F., Cohen, S. N., Chang, A. C., Boyer, H. W., Goodman, H. M., Helling, R. B Replication and transcription of eukaryotic DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 71: Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Nat Acad Sci USA 47: Pauling, L., Corey, R. B Structure of the nucleic acids. Nature 171: 346. Seedhouse, E Beyond human. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, pp Semenza, G Fifty years ago: DNA: the double helix. FEBS Lett 544: 1 3. Smith, H. O., Wilcox, K. W A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J Mol Biol 51: Watson, J. D., Crick, F Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171:

20 2. POGLAVJE Predstavitev zakonodaje s področja GSO Ruth Rupreht POVZETEK Poglavitni cilj sistema biološke varnosti je učinkovit nadzor nad ravnanjem z GSO. Sistem biološke varnosti vzpostavlja potrebno infrastrukturo in postopke odločanja, ki zagotavljajo transparentnost odločanja o ravnanju z GSO z vključevanjem tako strokovne kot najširše zainteresirane javnosti. Zakonodajni in upravno-administrativni okvir biološke varnosti za področje GSO v Sloveniji je vzpostavljen s pravnim redom EU in v skladu z mednarodnima protokoloma o biološki varnosti ter odgovornosti in povračilih. Zakon o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi (ZRGSO) ureja ravnanje z GSO in določa ukrepe za preprečevanje in zmanjševanje možnih škodljivih vplivov na okolje, zlasti glede ohranjanja biotske raznovrstnosti, in zdravje ljudi, do katerih bi lahko prišlo pri delu z GSO v zaprtih sistemih, namernem sproščanju v okolje ali dajanju GSO ali izdelkov, ki vsebujejo GSO ali so sestavljeni iz njih ali njihovih kombinacij, na trg. Ključni temelj sistema biološke varnosti je ocena tveganja za vsak organizem posebej. Zaprte sisteme in dela z GSO je potrebno prijaviti Ministrstvu za okolje in prostor, ki odloča v soglasju z ostalimi pristojnimi resorji. KLJUČNE BESEDE: zakonodaja, ZRGSO, ocena tveganja, pravilniki, zaprti sistem. 1. UVOD Temeljni zakonodajni instrument s področja GSO je Zakon o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi uradno prečiščeno besedilo (ZRGSO 23/05-UPB1 in 21/10). Dopolnjujejo ga različni pravilniki in uredbe s področja GSO, ki so povzeti v Preglednici 2-1 in razporejeni glede na področje, ki ga urejajo. Preglednica 2-1: Zakonodaja s področja GSO in ostala zakonodaja Zakon, pravilniki in uredbe UL RS št. Krovni zakon Zakon o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi (uradno prečiščeno besedilo) (ZRGSO-UPB1) Kartagenski protokol Zakon o ratifikaciji Kartagenskega protokola o biološki varnosti h Konvenciji o biološki raznovrstnosti (MKPBV) Zakon o ratifikaciji Dopolnilnega protokola iz Nagoje in Kuala Lumpurja o odgovornosti in nadomestilih h Kartagenskemu protokolu o biološki varnosti (MDPKPBV) Odbori Uredba o načinu delovanja znanstvenih odborov na področju ravnanja z gensko spremenjenimi organizmi Komisija Pravilnik o postopku za določitev predstavnikov nevladnih organizacij v Komisiji za ravnanje z gensko spremenjenimi organizmi Zaprti sistemi Pravilnik o vsebini prijave zaprtega sistema in prijave dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu 23/ / /2002 4/ / / /

21 Uredba o merilih za uvrstitev dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu v 71/2011 varnostni razred in zadrževalnih ter drugih varnostnih ukrepih za posamezni varnostni razred Pravilnik o oceni tveganja za delo z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu 45/2004 Pravilnik o načrtu ukrepov za primer nesreče pri delu z gensko spremenjenimi organizmi v 69/2005 zaprtem sistemu Ostala zakonodaja Pravilnik o varovanju delavcev pred tveganji zaradi izpostavljenosti biološkim dejavnikom pri delu 4/2002, 39/05 in 43/11 ZVZD-1 Uredba o odpadkih 103/2011 Sproščanje v okolje Pravilnik o vsebini prijave namernega sproščanja gensko spremenjenih organizmov v okolje 42/2005 Pravilnik o oceni tveganja za namerno sproščanje gensko spremenjenih organizmov v okolje 4/2006 Pravilnik o obsegu in vsebini poročila o rezultatih namernega sproščanja GSO v okolje 80/2006 Dajanje na trg Pravilnik o oceni tveganja za dajanje izdelka, ki vsebuje gensko spremenjene organizme, na trg 13/2006 Uredba o poročilu o primernosti izdelka, ki vsebuje gensko spremenjene organizme, za dajanje 118/2005 na trg in njegove uporabe Pravilnik o vsebini prijave za dajanje izdelka, ki vsebuje gensko spremenjene organizme, na 87/2006 trg Pravilnik o programu monitoringa vplivov izdelka, ki vsebuje gensko spremenjene organizme, 63/2006 in njegove uporabe Čezmejno gibanje Uredba o izvajanju Uredbe (ES) o čezmejnem gibanju gensko spremenjenih organizmov 72/2005 Register GSO Pravilnik o registru gensko spremenjenih organizmov 79/2006 Stroški postopkov Uredba o načinu in merilih za določitev višine stroškov postopka izdaje upravnih aktov pri 22/2016 ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi Na Oddelku za biologijo so samo zaprti sistemi za delo z GSO v 1. varnostnem razredu, zato je pregled zakonodaje usmerjen predvsem v tiste člene zakona, pravilnikov in uredb, ki se nanašajo na zaprte sisteme in GSO iz 1. varnostnega razreda. 2. ZAKON O RAVNANJU Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI (ZRGSO23/2005- UPB1 in 21/2010) ZRGSO opredeljuje, kaj so GSO in kako z njimi ravnati ter določa ukrepe za preprečevanje in zmanjševanje možnih škodljivih vplivov na okolje, zlasti glede ohranjanja biotske raznovrstnosti, in na zdravje ljudi, do katerih bi lahko prišlo pri delu z GSO v zaprtih sistemih, namernem sproščanju GSO v okolje ali dajanju GSO ali izdelkov, ki vsebujejo GSO ali so sestavljeni iz njih ali njihovih kombinacij, na trg. V 2. členu ZRGSO so posebej izpostavljeni genski postopki spreminjanja dednega materiala, za katere ta zakon ne velja: i) mutageneza, ii) celična ali protoplastna fuzija celic prokariontskih vrst, če je mogoče pri tem nastale organizme pridobivati tudi z običajnimi tehnikami gojenja, iii) celična ali protoplastna fuzija celic evkariontskih vrst, vključno s pridobivanjem hibridov in 13

22 rastlinskimi celičnimi fuzijami in iv) samokloniranje, ki vključuje odvzem zaporedij nukleinskih kislin (NK) iz celice organizma, čemur lahko sledi ponovna vključitev celotne ali dela odvzete NK, ki je lahko predhodno encimsko ali mehansko obdelana, ali njenega sintetičnega ekvivalenta v celico iste ali filogenetsko sorodne vrste. Takšni mikroorganizmi lahko izmenjujejo genski material z naravnimi fiziološkimi procesi, vendar le, če nastali mikroorganizmi ne povzročajo bolezni pri človeku, živalih ali rastlinah. Samokloniranje lahko vključuje tudi uporabo rekombinantnih vektorjev s preverjeno varno uporabo v določenih mikroorganizmih, če ne vključujejo uporabe molekul rekombinantnih nukleinskih kislin ali drugih GSO razen tistih, ki nastanejo pri uporabi teh postopkov. Določbe zakona ne veljajo tudi za zdravilne učinkovine, hrano in krmo, ki jih urejajo posebni predpisi. V 3. členu so prikazana načela, na katerih zakon temelji: najpomembnejša so načelo previdnosti, bioetike, presoje posameznega primera, postopnosti in javnost. V skladu z načeli je delo z GSO dovoljeno le, če ob upoštevanju stanja znanosti in tehnike ter zagotavljanju varnostnih ukrepov ni pričakovati možnih neposrednih ali posrednih, takojšnjih ali poznejših ali dolgoročno kumulativnih škodljivih vplivov na okolje in zdravje ljudi ter živali. V 4. členu so definirani pojmi, ki jih zakon uporablja. GSO je organizem, z izjemo človeka, ali mikroorganizem, katerega genski material je spremenjen s postopki, ki spreminjajo genski material drugače, kot to poteka v naravnih razmerah s križanjem ali naravno rekombinacijo. Takšni postopki so: i) tehnike rekombinacije nukleinske kisline, ki vključujejo oblikovanje novih kombinacij genskega materiala z vnašanjem molekul nukleinske kisline, proizvedene na kakršenkoli način zunaj organizma, v katerikoli virus, bakterijski plazmid ali drug vektorski sistem in njihovo vgradnjo v gostiteljski organizem, v katerem se v naravi ne pojavljajo, vendar pa se lahko v njem naprej razmnožujejo, ii) tehnike, ki vključujejo neposreden vnos dednega materiala, pripravljenega zunaj organizma, v ta organizem, vključno z mikroinjiciranjem, makroinjiciranjem in mikrokapsulacijo in iii) tehnike celične fuzije, vključno s fuzijo protoplastov, ali hibridizacije, pri katerih se s fuzijo dveh ali več celic na načine, ki se ne pojavljajo v naravi, oblikujejo žive celice z novimi kombinacijami dednega genskega materiala. Za postopke, ki spreminjajo genski material drugače kot v naravnih razmerah, se ne štejejo: i) umetna oploditev, ii) nekateri naravni postopki, kot so konjugacija, transdukcija in transformacija, in iii) indukcija poliploidije, če ne vključuje molekul rekombinantnih nukleinskih kislin ali drugih GSO razen tistih, ki nastanejo pri uporabi enega ali več teh postopkov. Tveganje je verjetnost, da bo ravnanje z GSO posredno ali neposredno, takoj ali kasneje ali dolgoročno kumulativno škodljivo vplivalo na okolje ali zdravje ljudi, zlasti glede ohranjanja biotske raznovrstnosti, ohranjanja avtohtonih rastlinskih sort in živalskih pasem, rodovitnosti plodne zemlje, prehranjevalne verige ali zdravja človeka in živali. Ocena tveganja je ugotavljanje in ovrednotenje tveganja, ki bi lahko nastalo zaradi ravnanja z GSO. Ravnanje z GSO je delo z GSO v zaprtem sistemu, namerno sproščanje GSO v okolje in dajanje izdelka na trg. Zaprti sistem je laboratorij ali proizvodni oddelek ali drug zaprt prostor, kjer se dela z GSO. Delo z GSO v zaprtem sistemu je delo v zaprtem sistemu, pri katerem se gensko spreminja organizem ali goji, razmnožuje, shranjuje, prevaža, uničuje, odstranjuje ali na drug način uporablja GSO in pri katerem se izvajajo zadrževalni ukrepi. Zadrževalni ukrep je fizična zapora ali kombinacija fizične zapore s kemično ali biološko omejitvijo ali drugačen poseben ukrep ali kombinacija ukrepov, vključno z izvajanjem dobre laboratorijske in proizvodne prakse, ki se uporabljajo pri delu z GSO v zaprtem sistemu za omejitev stika GSO z okoljem in prebivalstvom in izključujejo ali zmanjšujejo sposobnost razmnoževanja GSO ali prenosa spremenjenega genskega materiala izven zaprtega sistema. Novost Nesreča je okoljska nesreča po predpisih o varstvu okolja. 14

23 Novost Izredni dogodek je vsak nenadzorovan dogodek ali vrsta dogodkov, pri katerih: - pri delu z GSO v zaprtem sistemu iz prvega ali drugega varnostnega razreda ni prišlo do sproščanja GSO v okolje ali ogrožanja življenja ali zdravja ljudi in lahko prijavitelj v skladu z opisom ukrepov za primer nesreče ali v skladu z načrtom iz 11. c člena tega zakona ustrezno ukrepa sam, - pri delu z GSO v zaprtem sistemu iz tretjega ali četrtega varnostnega razreda ni prišlo do sproščanja GSO v okolje ali ogrožanja življenja ali zdravja ljudi in lahko prijavitelj v skladu z načrtom iz 11. c člena tega zakona ustrezno ukrepa sam, - je pri delu z GSO v zaprtem sistemu iz prvega ali drugega varnostnega razreda prišlo do sproščanja GSO v okolje, vendar to nima za posledico ogrožanja življenja ali zdravja ljudi ali kakovosti okolja in lahko prijavitelj v skladu z opisom ukrepov za primer nesreče ali v skladu z načrtom iz 11. c člena tega zakona ustrezno ukrepa sam, ali - je pri namernem sproščanju GSO v okolje prišlo do nepričakovanega širjenja GSO v okolje, vendar to nima za posledico ogrožanja življenja ali zdravja ljudi ali kakovosti okolja in lahko prijavitelj v skladu z načrtom iz 11. c člena tega zakona ustrezno ukrepa sam. Monitoring je spremljanje in nadzorovanje GSO in sprejemnega okolja, procesov in postopkov pri namernem sproščanju GSO v okolje ali dajanju izdelkov na trg in možnih škodljivih vplivov skladno s predpisi. Zakon v nadaljnjih členih opredeli komisijo za ravnanje z GSO, določi sestavo komisije in njene naloge, opredeli znanstvena odbora (znanstveni odbor za zaprte sisteme in znanstveni odbor za sproščanje GSO), določi njuno sestavo in naloge. Novost 11. a c členi opredeljujejo ukrepanje v primeru nesreče, izrednega dogodka in izdelavo načrta ukrepanja za primere izrednega dogodka. 14. člen zakona definira varnostne razrede, v katere morajo biti uvrščeni GSO v zaprtem sistemu, in sicer: i) prvi varnostni razred (1. varnostni razred), če gre za delo, pri katerem je tveganje zanemarljivo, ii) drugi varnostni razred (2. varnostni razred), če gre za delo, pri katerem je tveganje majhno, iii) tretji varnostni razred (3. varnostni razred), če gre za delo, pri katerem je tveganje zmerno in iv) četrti varnostni razred (4. varnostni razred), če gre za delo, pri katerem je tveganje veliko. Pri delu z GSO v zaprtem sistemu je treba glede na njegovo uvrstitev v varnostni razred zagotoviti zadrževalne in druge varnostne ukrepe ter ravnati v skladu s predpisanimi zahtevami v Uredbi o merilih za uvrstitev dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu v varnostni razred in zadrževalnih ter drugih varnostnih ukrepih za posamezni varnostni razred. Zaprti sistem 15. člen obravnava prijavo zaprtega sistema za delo z GSO. Delo z GSO lahko opravljamo le v zaprtem sistemu, v katerem so izpolnjeni predpisani pogoji za varnostni razred, v katerega je nameravano delo uvrščeno. Prijavitelj mora zaprti sistem pred prvo uporabo za delo z GSO v zaprtem sistemu prijaviti ministrstvu in mu posredovati podatke o prijavitelju, zaprtem sistemu in varnostnem razredu nameravanih del z GSO v zaprtem sistemu. Vsebina prijave je opredeljena v Pravilniku o vsebini prijave zaprtega sistema in prijave dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu, ki v 4. členu določa, da morajo biti v primeru dela z GSO v 1. varnostnem razredu prijavi zaprtega sistema priloženi tudi podatki o nameravanih delih. 15

24 Ministrstvo preveri skladnost prijave s predpisanimi zahtevami in po pridobitvi predhodnega strokovnega mnenja znanstvenega odbora za zaprte sisteme vpiše zaprti sistem v register GSO, o vpisu pa prijavitelju v 60 dneh od pridobitve prijave izda potrdilo. Odbor mora pisno mnenje ministrstvu posredovati v 30 dneh od dne, ko mu je ta posredoval kopijo prijave. Novost Prijavitelj lahko po vpisu zaprtega sistema v register GSO poda prijavo za spremembo oz. dopolnitev zaprtega sistema, če se pri tem varnostni razred ne spremeni. Novost 15. a člen opredeljuje izbris zaprtega sistema iz registra na željo prijavitelja ali če zaprti sistem ne izpolnjuje več zahtev. Prijavitelj mora ministrstvo obvestiti o prenehanju dela z GSO ali zaprtju zaprtega sistema za delo z GSO. Novost 16. člen predpisuje, da je potrebno pred delom z GSO izdelati oceno tveganja nameravanega dela. V oceni tveganja je treba na podlagi analize značilnosti GSO in nameravanega dela z njim ter okolja, ki bi bilo lahko izpostavljeno tveganju, ugotoviti in ovrednotiti zlasti možne škodljive vplive, raven tveganja ter potrebne zadrževalne in druge varnostne ukrepe. Posebej je treba določiti ukrepe za ravnanje z odpadki in odvajanje odpadnih voda iz zaprtega sistema. Na podlagi ocene tveganja prijavitelj delo z GSO v zaprtem sistemu uvrsti v enega od varnostnih razredov. Če prijavitelj dvomi o tem, v kateri varnostni razred naj uvrsti delo z GSO v zaprtem sistemu, ga mora uvrstiti v varnostni razred s strožjimi zadrževalnimi ukrepi, v varnostni razred z manj strogimi pa le ob soglasju ministrstva. Prijavitelj mora oceno tveganja hraniti še vsaj pet let po zaključku dela z GSO. Oceno tveganja mora prijavitelj med izvajanjem dela najmanj enkrat letno ponovno pregledati in po potrebi dopolniti, zlasti z vidika primernosti zadrževalnih in drugih ukrepov glede na varnostni razred in novih znanstvenih spoznanj. O dopolnitvi je potrebno obvestiti ministrstvo, če gre za delo z GSO v 2. ali višjem varnostnem razredu. 17. člen določa izdelavo načrta ukrepov za primer nesreče. Načrt ukrepov mora vsebovati zlasti: i) oceno ogroženosti okolja in zdravja ljudi in možnih posledic v primeru nesreče, ii) navedbo ukrepov za odpravo ogroženosti ter takojšnjih in kasnejših posledic nesreče, iii) navedbo subjektov, ki jih je treba vključiti v izvajanje predvidenih ukrepov ter iv) način in obseg obveščanja in opozarjanja pristojnih organov, služb in prebivalstva v primeru nesreče. Prijavitelj je dolžan pred začetkom dela z GSO v zaprtem sistemu z načrtom ukrepov seznaniti okoljsko ministrstvo, ministrstvo, pristojno za zaščito in reševanje, in pristojno službo lokalne skupnosti, na katerem območju se delo z GSO v zaprtem sistemu izvaja, ki mora načrt ukrepov uporabiti pri izdelavi ocene ogroženosti ter načrta zaščite in reševanja skladno z zakonom o naravnih nesrečah. Prijavitelj mora najmanj enkrat na dve leti preverjati ustreznost načrta ukrepov in ga po potrebi dopolnjevati, o dopolnitvah načrta pa obvestiti organa in službo iz prejšnjega stavka. 18. in 19. člen opredeljujeta zaupnost podatkov in sodelovanje javnosti. Delo z GSO 20. člen opredeljuje delo z GSO v 1. varnostnem razredu, in sicer navaja, da se delo z GSO, uvrščeno v 1. varnostni razred, lahko začne izvajati brez prijave ministrstvu, če se izvaja v zaprtem sistemu, za katerega je bilo že izdano potrdilo. Prijavitelj je dolžan oceno tveganja za nameravano delo iz prejšnjega stavka med izvajanjem dela posredovati ministrstvu na njegovo zahtevo. 16

25 Za vsa dela z GSO v 2. ali višjem varnostnem razredu mora prijavitelj pridobiti dovoljenje po tem, ko je zaprti sistem vpisan v register GSO. 21. in 22. člen opredeljujeta postopek. 23. člen določa, da se dela za pridobivanje gensko spremenjenih vretenčarjev, s katerimi se namerava prekoračiti meje vrste, lahko izvajajo le v raziskovalne namene. Za takšna dela v zaprtem sistemu izda okoljsko ministrstvo potrdilo v soglasju z ministrstvom, pristojnim za veterino. Dela na vretenčarjih morajo potekati skladno s predpisi, ki urejajo zaščito živali pred mučenjem. V 54. členu je opredeljen register GSO in njegove značilnosti. Register GSO sestavljajo evidence o zaprtih sistemih, delih z GSO v zaprtih sistemih, namernem sproščanju GSO v okolje in dajanju izdelkov na trg. Evidence vsebujejo zlasti podatke o: i) firmi in sedežu ali naslovu prijavitelja, ii) naslovu in lastnostih zaprtega sistema, iii) delu z GSO v zaprtem sistemu in njegovi uvrstitvi v varnostni razred, iv) namernem sproščanju GSO v okolje, vključno z natančnim opisom kraja sproščanja, in v) izdelkih in njihovem dajanju na trg, vključno z opisom območja, kamor se izdelek daje na trg. Zaradi vodenja postopkov v skladu s tem zakonom ministrstvo vodi tudi podatke o osebnem imenu, izobrazbi in strokovni usposobljenosti fizičnih oseb, ki so skladno s predpisi pri prijavitelju odgovorne za ukrepe in ravnanja, povezane z zagotavljanjem varnosti pred tveganjem. Sestavni del registra so izdana potrdila in dovoljenja za zaprte sisteme, delo z GSO v zaprtem sistemu, njihovo namerno sproščanje v okolje in za dajanje izdelkov na trg. Register GSO vodi ministrstvo kot javno knjigo. Vsakdo ima pravico pregledovati podatke iz registra GSO in zahtevati ter pridobiti izpiske iz registra GSO proti plačilu stroškov, ki ne smejo presegati materialnih stroškov posredovanih podatkov. V evidence se ne smejo vpisovati podatki, ki se skladno s tem zakonom varujejo kot zaupni. Novost: V 54. a členu so opredeljeni stroški, ki nastanejo med upravnim postopkom po tem zakonu. Stroške krije prijavitelj, o čemer ministrstvo izda sklep. Merila za določitev višine stroškov so določena v uredbi. V 55. členu je opredeljen inšpekcijski nadzor nad ravnanjem z GSO. Izvaja ga Inšpektorat Republike Slovenije za okolje in prostor, ki je pristojen tudi za ravnanje z GSO v zaprtih sistemih. Kmetijski, fitosanitarni in gozdarski inšpektorji ter uradni veterinarji izvajajo nadzor vsak v skladu s svojimi pristojnostmi. V zaključku ZRGSO so navedene še kazenske določbe. Z globo se kaznujejo za prekršek pravna oseba, odgovorna oseba pravne osebe in tudi posameznik, ki stori prekršek. 3. PRAVILNIK O VSEBINI PRIJAVE ZAPRTEGA SISTEMA IN PRIJAVE DELA Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI V ZAPRTEM SISTEMU Pravilnik o vsebini prijave zaprtega sistema in prijave dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu natančno ureja podrobnejšo vsebino prijave zaprtega sistema za delo z GSO. V 2. členu so opredeljeni pojmi, ki jih pravilnik uporablja. Prejemni organizem je celica ali organizem, ki sprejema genski material iz izvornega organizma ali okolja, ga podvojuje in lahko izrazi informacijo ter jo lahko prenaša na potomce. Starševski organizem je prejemni organizem pred izvedeno gensko spremembo. Izvorni organizem je organizem, iz katerega se pridobi genski material za prenos v prejemni organizem. Vektor je prenašalec genskega materiala ali ustreznih celičnih sestavin iz izvornega organizma v prejemni organizem. Vključek je genski material, ki se vključi v vektor. Varen organizem je 17

26 organizem, ki je že dalj časa v uporabi in po znanih podatkih ne predstavlja biološke nevarnosti, nima škodljivih učinkov na zdravje ljudi ali okolje ter ne ogroža biotske raznovrstnosti in naravnega ravnovesja. V 3. členu so navedeni podatki, ki morajo biti vključeni v prijavo zaprtega sistema pred njegovo prvo uporabo za delo z GSO: i) ime firme, sedež in naslov prijavitelja, ii) identifikacijska številka prijavitelja v Poslovnem registru Slovenije, iii) odgovorna oseba prijavitelja, iv) pooblaščenec za biološko varnost, v) oseba, odgovorna za nadzor in varnost, vi) sestava, število članov in zadolžitve odbora za varnost pri delu z GSO, če je imenovan, vključno z njegovim mnenjem o predvidenih zadrževalnih ukrepih in opremi zaprtega sistema, vii) naslov, lokacija in vrsta zaprtega sistema, v katerem se bo izvajalo delo z GSO, viii) varnostni razred nameravanih del z GSO, ix) področje dela z GSO, ki se bo v zaprtem sistemu izvajalo, in x) utemeljitev določitve podatkov, ki naj se v postopku varujejo kot zaupni, če jih je prijavitelj v prijavi določil. Prijavitelj mora podatke iz prejšnjega odstavka predložiti na obrazcu (glej prilogo) in v elektronski obliki, ki je dostopna na spletni strani ministrstva, pristojnega za okolje. Prijavi iz prejšnjega odstavka morata biti priložena tudi: i) etažni načrt prostorov zaprtega sistema, iz katerega je razvidna lokacija prostorov v stavbi in njihova notranja razporeditev, in ii) dokazilo o registraciji dejavnosti prijavitelja pri pristojnem organu. 4. člen opredeljuje, da morajo biti prijavi, v primeru dela z GSO 1. varnostnega razreda, priloženi tudi podatki o nameravanem delu z GSO, in sicer: i) podatki o splošnih značilnostih organizmov, ki se uporabljajo pri posameznem delu z GSO in njihovi uvrstitvi med varne organizme, ii) podatki o vodji projekta po posameznih delih z GSO, iii) mnenje odbora za varnost pri delu z GSO, če je imenovan, o oceni tveganja za delo z GSO v 1. varnostnem razredu, iv) opis zadrževalnih ukrepov in opreme za njihovo zagotavljanje, v) opis ravnanja z odpadki, vključno s podatki o nastanku odpadkov, njihovi obdelavi in končnem odstranjevanju ter ravnanju z njimi pred obdelavo ali odstranitvijo, vi) opis ukrepov za primer nesreče in vii) utemeljitev določitve podatkov o delu z GSO, ki naj se v postopku varujejo kot zaupni, če jih je prijavitelj določil. Prijavitelj mora podatke predložiti na obrazcu (glej prilogo) in v elektronski obliki, ki je dostopna na spletni strani ministrstva, pristojnega za okolje in prostor. Novost Ne glede na določila v pravilniku pa mora prijavitelj v skladu z 11. c členom ZRGSO prijavi priložiti tudi načrt ukrepov v primeru izrednega dogodka. 4. UREDBA O MERILIH ZA UVRSTITEV DELA Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI V ZAPRTEM SISTEMU V VARNOSTNI RAZRED IN ZADRŽEVALNIH TER DRUGIH VARNOSTNIH UKREPIH ZA POSAMEZNI VARNOSTNI RAZRED Novost Prenovljena Uredba je začela veljati , s tem dnem je prenehala veljati Uredba o merilih za uvrstitev dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu v varnostni razred in zadrževalnih ter drugih varnostnih ukrepih za posamezni varnostni razred (Uradni list RS, št. 33/04). S prenovo so bile v slovenski pravni red prenesene zahteve Direktive 2009/41/ES o uporabi gensko spremenjenih mikroorganizmov v zaprtih sistemih (prenovitev). Obenem uredba zajema tudi določila Zakona o spremembah in dopolnitvah zakona o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi (Uradni list RS, št. 21/10). Uredba določa merila za uvrstitev dela z GSO v zaprtem sistemu v ustrezen varnostni razred, zadrževalne in druge varnostne ukrepe, pravila ravnanja ter druge pogoje za delo z GSO v posameznem varnostnem 18

27 razredu. Izrazi, ki jih uporablja, so enaki kot v Pravilniku o vsebini prijave zaprtega sistema in prijave dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu ter v ZRGSO. Merila za uvrščanje del z GSO v zaprtem sistemu v enega od štirih varnostnih razredov izhajajo iz ravni tveganja, ki ga GSO in delo z njimi predstavljajo za zdravje ljudi in okolje. Raven tveganja se ugotovi in ovrednoti v oceni tveganja, izdelani za nameravano delo z GSO. V primeru, če je GSO kombinacija organizmov, se delo z GSO uvrsti v ustrezni razred glede na tveganje, ki ga predstavljajo ti organizmi. V 4. členu je opredeljeno, da se delo z GSO lahko uvrsti v 1. varnostni razred, če so izpolnjena vsa naslednja merila: i) prejemni organizem, starševski organizem, izvorni organizem, vektor, vključek in novo nastali GSO ne povzročajo bolezni ali sprememb pri zdravih ljudeh, živalih ali rastlinah, vključno z alergijskimi in toksičnimi učinki, ii) prejemni organizem, starševski organizem, izvorni organizem, vektor, vključek in novo nastali GSO ne povzročajo škodljivih učinkov v okolju in ne ogrožajo biotske raznovrstnosti ali naravnega ravnovesja, iii) vektor in vključek pri novo nastalem GSO ne omogočita pojava takega fenotipa, ki bi povzročil bolezni pri ljudeh, živalih ali rastlinah ali škodljive učinke v okolju ali ogrožal biotsko raznovrstnost ali naravno ravnovesje, iv) novo nastali GSO se ne razmnožuje in ne križa z drugimi v naravi prisotnimi vrstami, če pride do njegovega nenamernega sproščanja v okolje, v) škodljivi učinki zaradi naravnega prenosa vnesenega genskega materiala v druge organizme se ne pojavijo, vi) vektor spada med varne vektorje, ki so že dolgo v uporabi in po znanih podatkih ne predstavljajo biološke nevarnosti, in vii) prejemni organizmi niso evkariontske celice, ki bi se lahko spontano regenerirale v višje organizme. 5., 6. in 7. člen opredeljujejo uvrstitev GSO v 2., 3. in 4. varnostni razred. 8. člen določa, da mora prijavitelj pri vsakem delu z GSO zagotoviti vse potrebne zadrževalne in druge varnostne ukrepe, da se prepreči stik GSO z ljudmi in okoljem zunaj zaprtega sistema ter prenos genskega materiala iz zaprtega sistema v okolje. Zadrževalni ukrepi so zlasti: i) biološki ukrepi, ki preprečujejo prenos genske spremembe v organizmu na druge organizme po biološki poti, ii) fizični ukrepi, ki preprečujejo stik GSO z ljudmi zunaj zaprtega sistema in okoljem s fizičnimi zaporami, iii) kemični ukrepi, ki inaktivirajo ali uničijo GSO s kemičnimi procesi in iv) organizacijski ukrepi, ki obsegajo sistem dela v zaprtem sistemu in aktivnosti, povezane z zagotavljanjem varnega dela. Zadrževalni ukrepi se razlikujejo glede na varnostni razred, v katerega je bilo delo z GSO uvrščeno (glej prilogo uredbe). Prijavitelj mora zagotoviti, da zadrževalne ukrepe dopolnjuje uporaba načel dobre delovne in laboratorijske prakse. Prijavitelj mora zagotoviti, da je osebje, ki dela z GSO, za to usposobljeno (redno izobraževanje). Usposobljenost osebja mora biti ustrezna glede na varnostni razred, v katerega je delo z GSO uvrščeno. Novost 12. člen Prijavitelj mora zagotoviti, da zadrževalne ukrepe dopolnjuje uporaba dobre delovne, laboratorijske ali proizvodne prakse in jih v načrtu zadrževalnih ukrepov tudi opisati. Novost 13. člen Pri delu z GSO, uvrščenih v drugi, tretji ali četrti varnostni razred, je treba uporabljati znak za biološko nevarnost, določen s predpisi, ki urejajo varovanje delavcev pred tveganjem zaradi izpostavljenosti biološkim dejavnikom pri delu. Znak za biološko nevarnost je treba namestiti na vhodna vrata zaprtega sistema za delo z GSO iz drugega, tretjega ali četrtega varnostnega razreda. 19

28 Novost 14. člen Poleg rednega izobraževanja mora po novem prijavitelj zagotoviti tudi začetno izobraževanje in o vseh izobraževanjih voditi evidence. 15. člen prijavitelju nalaga, da zagotovi varnost osebja pri delu z GSO in potrebne ukrepe za preprečitev tveganj za njihovo zdravje tudi skladno s predpisi, ki urejajo varovanje delavcev pred tveganji zaradi izpostavljenosti biološkim dejavnikom pri delu, če zagotavljajo višjo raven varnosti in zdravja pri delu kot zadrževalni ukrepi, določeni s to uredbo. Črtano: Prijavitelj mora zagotoviti izvajanje rednega zdravstvenega nadzora oseb, ki delajo z GSO. Novost V 16. členu je opredeljeno, da mora imeti prijavitelj za delo z GSO izdelan načrt zadrževalnih ukrepov, ki jih je treba v zaprtem sistemu izvajati, in določiti osebo, ki je odgovorna za njegovo hranjenje, dopolnjevanje in nadzor nad njegovim izvajanjem. Kopija načrta mora biti lahko dostopna vsem osebam, ki delajo z GSO. Načrt ukrepov je potrebno v pisni in elektronski obliki hraniti ves čas dela z GSO in še 10 let po njegovem zaključku. Novost 17. člen predpisuje, da mora imeti prijavitelj pisna navodila za delo z GSO in zagotoviti, da so z njimi seznanjene vse osebe, ki delajo v zaprtem sistemu. Navodila obsegajo predvsem opis ukrepov za preprečitev tveganj za zdravje osebja, opis postopkov in aktivnosti, povezanih z ravnanjem z odpadki, odvajanjem odpadnih voda, čiščenjem in razkuževanjem prostorov ter drugih postopkov, ki jih je treba izvajati skladno z načrtom zadrževalnih ukrepov, in opis ukrepov v primeru napak pri delu ali v primeru izrednega dogodka ali nesreče. Novost V 18. členu je zapisano, da mora prijavitelj zagotoviti vsaj enkrat letno nadzor nad izvajanjem zadrževalnih ukrepov, njihove skladnosti z načrtom in njihove učinkovitosti in o tem voditi evidenco. Novost 19. člen predpisuje, da mora prijavitelj zagotoviti, da se o delu z GSO vodi obratovalni dnevnik, in določiti osebo, ki je odgovorna za njegovo vodenje in hranjenje. V obratovalni dnevnik se poleg osnovnih podatkov o GSO in postopkih pri delu z njim vpisujejo zlasti podatki o ravnanju z odpadki in odpadnimi vodami, o izvajanju in rezultatih monitoringa ter o morebitnih napakah in izrednih dogodkih pri delu. Obratovalni dnevnik se vodi v obliki knjige z oštevilčenimi stranmi in se hrani ves čas dela z GSO v zaprtem sistemu ter še deset let po njegovem zaključku. Novost 20. člen prijavitelja obvezuje, da mora za preteklo koledarsko leto izdelati poročilo o delu z GSO in ga do 31. marca tekočega leta posredovati ministrstvu, pristojnemu za varstvo okolja. Poročilo mora vsebovati osnovne podatke o delu z GSO in GSO iz prvega varnostnega razreda, s katerimi je prijavitelj začel delati po oddaji prijave, osnovne podatke o delu z organizmi, ki niso GSO, podatke o izrednih dogodkih in nesrečah, o ravnanju z odpadki in odpadnimi vodami ter o rezultatih monitoringa. Novost 21. člen uvaja eno ali več oseb, ki so odgovorne za nadzor in varnost v prostorih, kjer poteka delo z GSO. Te osebe morajo imeti strokovni izpit iz varnosti in zdravja pri delu skladno s predpisi, ki urejajo varnost in zdravje pri delu, ter ustrezno znanje o delu z GSO, da je zagotovljeno zanesljivo izvajanje nalog. Naloge so 20

29 zlasti: i) sodelovanje pri uvajanju splošnih varnostnih ukrepov in nadzor nad njihovim izvajanjem, ii) sodelovanje pri uvajanju načel dobre delovne ali laboratorijske prakse in nadzor nad njihovo uporabo, iii) sodelovanje pri pripravi načrta ukrepov ob izrednem dogodku in načrta ukrepov za primer nesreče in redno preverjanje njune ustreznosti, iv) seznanjanje osebja s splošnimi varnostnimi ukrepi, z načrtom ukrepov ob izrednem dogodku in z načrtom ukrepov za primer nesreče, v) zagotavljanje ukrepov za varnost osebja pri delu z GSO in preprečitev tveganj za njegovo zdravje, vi) obveščanje prijavitelja in pristojnih organov o izrednem dogodku in v nesreči in vii) druge naloge v zvezi z nadzorom in varnostjo v skladu s pooblastili upravljavca. Novost 22. člen uvaja osebo, ki je odgovorna za biološko varnost v organizaciji (pooblaščenec za biološko varnost). Ta oseba mora imeti v delovnem ali pogodbenem razmerju pri prijavitelju in mora imeti univerzitetno izobrazbo naravoslovno-tehnične smeri in ustrezne izkušnje z delom z GSO, da je zagotovljeno zanesljivo izvajanje nalog. Naloge so zlasti: i) spremljanje razvoja na področju dela z GSO in seznanjanje upravljavca in osebja z njim, ii) seznanjanje in svetovanje upravljavcu v zvezi z novimi spoznanji in informacijami, ki lahko vplivajo na raven tveganja ali uvrstitev dela z GSO v varnostni razred, iii) svetovanje in sodelovanje pri pripravi ocen tveganja za nameravano delo z GSO, iv) dajanje mnenj in predlogov v zvezi z zadrževalnimi ukrepi ter sodelovanje pri pripravi načrta zadrževalnih ukrepov, v) redno preverjanje izvajanja zadrževalnih ukrepov in opreme ter poročanje upravljavcu o ugotovljenih težavah ali napakah, vi) priprava navodil za delo z GSO, vii) zagotavljanje rednega izobraževanja in usposabljanja za osebje, ki dela v zaprtem sistemu, viii) priprava letnih poročil o delu z GSO, ix) obveščanje javnosti o delu z GSO, x) sodelovanje z osebo, odgovorno za nadzor in varnost, in xi) druge naloge v zvezi z zagotavljanjem biološke varnosti v skladu s pooblastili upravljavca. Prijavitelj mora pooblaščencu za biološko varnost omogočiti strokovno neodvisno opravljanje nalog iz prejšnjega odstavka in zagotoviti dostop do vseh potrebnih podatkov. O imenovanju pooblaščenca za biološko varnost ali o njegovi razrešitvi mora prijavitelj obvestiti ministrstvo, pristojno za varstvo okolja. 24. člen uvaja za vsak projekt, ki vključuje delo z GSO, vodjo projekta, ki načrtuje, vodi in nadzira delo z GSO ves čas izvajanja projekta, in njegovega namestnika. Vodja projekta je zadolžen zlasti za: i) pripravo in vodenje predpisane dokumentacije za posamezno delo z GSO, ii) vodenje in nadziranje aktivnosti, povezanih z delom z GSO, iii) vodenje seznama osebja, ki dela z GSO, iv) sodelovanje pri pripravi navodil za delo z GSO in seznanjanje osebja z njimi in v) sodelovanje pri pripravi letnih poročil o delu z GSO. Vodja projekta je dolžan pooblaščenca za biološko varnost obvestiti o vsaki spremembi glede dela z GSO, katerega vodi, in o kakršnih koli novih informacijah ali podatkih, ki lahko vplivajo na raven tveganja. Vodja projekta ali njegov namestnik mora biti v času izvajanja dela z GSO ves čas prisoten. Vodja projekta in njegov namestnik morata imeti ustrezno strokovno izobrazbo in ustrezne izkušnje z delom z GSO ter znanje o ukrepih za zagotavljanje varnosti pred tveganjem za zdravje ljudi in okolje. 25. člen opozarja, da mora prijavitelj o vsaki spremembi firme ali imena ali sedeža ali naslova prijavitelja pisno obvestiti ministrstvo, prav tako pa tudi o prenehanju delovanja zaprtega sistema. 5. PRAVILNIK O OCENI TVEGANJA ZA DELO Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI V ZAPRTEM SISTEMU Pravilnik o oceni tveganja za delo z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu določa elemente in obseg ocene tveganja za delo z GSO v zaprtem sistemu in metodologijo za njeno izdelavo. Izrazi, ki jih uporablja, so enaki kot v Pravilniku o vsebini prijave zaprtega sistema in prijave dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu ter v ZRGSO. 21

30 3. člen določa predmet ocene tveganja za delo z GSO v zaprtem sistemu. Gre za analizo in ovrednotenje vseh tistih elementov dela z GSO, ki vplivajo na raven tveganja za zdravje ljudi in okolje, da se določijo potrebni zadrževalni in drugi varnostni ukrepi in uvrsti delo z GSO v enega od varnostnih razredov skladno s predpisanimi merili. Elementi dela z GSO, ki jih je treba analizirati in ovrednotiti, so zlasti: i) lastnosti GSO, ki lahko povzročijo kakršne koli možne škodljive učinke na zdravje ljudi ali okolje, ii) značilnosti aktivnosti in postopkov, ki jih vključuje delo z GSO ali so z njim povezani in lahko vplivajo na raven tveganja, iii) značilnosti okolja, ki je zunaj zaprtega sistema lahko izpostavljeno vplivom GSO v primeru nenamernega sproščanja, iv) resnost možnih škodljivih učinkov in raven tveganja za zdravje ljudi in okolje ter v) verjetnost, da se možni škodljivi učinki GSO pojavijo. V 4. členu so našteti možni škodljivi učinki GSO: i) bolezen človeka, vključno z alergenimi ali toksičnimi učinki, ii) bolezen živali ali rastlin, iii) škodljivi učinki, ker bolezni ni mogoče zdraviti ali zagotoviti učinkovite zaščite, iv) škodljivi učinki, ki so posledica naselitve ali širjenja GSO v okolju, in v) škodljivi učinki zaradi naravnega prenosa vnesenega genskega materiala v druge organizme. 5. člen opredeljuje, da mora vsebovati ocena tveganja: i) opis lastnosti GSO in določitev potencialno škodljivih lastnosti GSO, ii) opis narave nameravanega dela z GSO in oceno aktivnosti in postopkov, ki vplivajo na večjo ali manjšo izpostavljenost GSO, še zlasti ravnanja z odpadki in odpadnimi vodami, iii) opis značilnosti okolja, ki je lahko izpostavljeno GSO v primeru nenadzorovanega sproščanja iz zaprtega sistema, iv) oceno možnih škodljivih učinkov na zdravje ljudi in okolje, v) oceno verjetnosti, da se škodljivi učinki za zdravje ljudi ali okolje pojavijo ter določitev stopnje tveganja, ki ga pomeni nameravano delo z GSO za zdravje ljudi ali okolje, vi) določitev potrebnih zadrževalnih in drugih varnostnih ukrepov pri nameravanem delu z GSO in oceno njihove učinkovitosti ter vii) uvrstitev dela z GSO v ustrezni varnostni razred. 6. člen navaja, da mora biti ocena tveganja izdelana v dveh delih. V prvem delu se določijo potencialno škodljive lastnosti GSO in oceni nevarnost škodljivih učinkov na zdravje ljudi, živali in rastlin ter okolje, pri čemer se upoštevajo tudi druge biološke lastnosti GSO, ki lahko stopnjo nevarnosti škodljivih učinkov zvečajo ali zmanjšajo. V drugem delu pa se glede na naravo nameravanega dela z GSO in značilnosti okolja oceni verjetnost pojava škodljivih učinkov na zdravje ljudi in okolje kot posledice izpostavljenosti GSO, pri čemer se upoštevajo tudi trajanje takšne izpostavljenosti in ukrepi za njeno preprečevanje. 9. člen izpostavlja, da se novo nastali GSO, pred dokončno uvrstitvijo v varnostni razred, na podlagi ugotovljenih potencialno škodljivih lastnosti GSO in izdelane ocene nevarnosti škodljivih učinkov na zdravje ljudi in okolje začasno uvrsti v enega od varnostnih razredov in ugotovi predvidoma potrebne zadrževane ukrepe. Sledi ocenitev verjetnosti pojava škodljivih vplivov in njihovih posledic na zdravje ljudi in okolje. 11. člen podaja splošna in posebna merila za jasno identifikacijo GSO, ki je varen za zdravje ljudi in okolje. 12. člen določa, da se na podlagi ocene nevarnosti, ki jo predstavljajo potencialni škodljivi učinki na zdravje ljudi in okolje, in ocene verjetnosti pojava teh škodljivih učinkov določijo raven tveganja in potrebni zadrževalni in drugi varnostni ukrepi, delo z GSO pa dokončno uvrsti v ustrezni varnostni razred skladno s predpisi o merilih za uvrstitev dela z GSO v zaprtem sistemu v varnostni razred in zadrževalnih ter drugih varnostnih ukrepih za posamezni varnostni razred. V sklepnem delu se navedejo tudi dodatni predlogi ali zahteve za povečanje stopnje varnosti pri delu z GSO in predlogi za spremljanje tveganja med izvajanjem nameravanega dela. 22

31 13. člen še navaja, da se v sklepnem delu ocene tveganja opiše postopek njene izdelave in navedejo viri podatkov in informacij, ki so bili uporabljeni za pripravo ocene tveganja, in oceni njihova razpoložljivost, kakovost, časovna ažurnost in popolnost. Opozoriti je treba na možne pomanjkljivosti ocene tveganja, če ugotovitve in vrednotenje potencialnih škodljivih učinkov ter verjetnosti, da se pojavijo, zaradi kakršnih koli težav pri pripravi ocene tveganja niso celoviti ali zanesljivi. V 15. členu je še zapisano, da mora ocena tveganja vsebovati podatke o izdelovalcu ocene tveganja in osebah, ki so sodelovale pri njeni pripravi. Oceno tveganja in njene sestavine mora s svojim podpisom potrditi oseba, ki je pri izdelovalcu ocene tveganja odgovorna za njeno pripravo. 16. člen še opredeljuje, da mora biti del ocene tveganja tudi njen povzetek, ki mora vsebovati vse bistvene ugotovitve o potencialno škodljivih učinkih GSO na zdravje ljudi in okolje ter o verjetnosti pojava teh škodljivih učinkov, oceno ravni tveganja, ki ga pomeni nameravano delo z GSO, in podatke o potrebnih zadrževalnih in drugih varnostnih ukrepih. 6. PRAVILNIK O NAČRTU UKREPOV ZA PRIMER NESREČE PRI DELU Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI V ZAPRTEM SISTEMU Pravilnik o načrtu ukrepov za primer nesreče pri delu z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu ureja podrobnejšo vsebino in obseg načrta ukrepov za primer nesreče pri delu z GSO v zaprtih sistemih, metodologijo za njegovo pripravo, preverjanje in dopolnjevanje ter način in obseg obveščanja in opozarjanja v primeru nesreče, pa tudi sodelovanje z drugimi državami članicami ter pristojnim organom Evropske unije v zvezi z nesrečo pri delu z GSO v zaprtem sistemu. 2. člen opredeljuje, da je načrt ukrepov za primer nesreče pri delu z GSO v zaprtih sistemih razčlenjena zamisel za obvladovanje nesreče in omejitev ali preprečitev njenih posledic za okolje in zdravje ljudi. V načrtu ukrepov mora biti jasno razviden potek aktivnosti in ukrepanja ob nesreči ter določene naloge osebja zaprtega sistema, opredeljeni pa morajo biti tudi ukrepi, ki jih v primeru nesreče za zavarovanje okolja in zdravja ljudi zagotovijo drugi pristojni organi, službe in organizacije, ki jih je treba vključiti v načrtovano ukrepanje. Pri izdelavi načrta je treba upoštevati izkušnje pa tudi zadnje stanje varnostne tehnike in načela dobre laboratorijske prakse. 3. člen navaja, da mora načrt ukrepov temeljiti na oceni tveganja, pri čemer je treba upoštevati zlasti elemente ocene, povezane z: i) varnostnim razredom dela z GSO v zaprtem sistemu in lastnostmi GSO, ki lahko povzročijo možne škodljive učinke na okolje in zdravje ljudi, ii) značilnostmi zaprtega sistema in dela z GSO, ki lahko vplivajo na raven tveganja, iii) značilnostmi okolja izven zaprtega sistema, ki bi lahko bilo izpostavljeno vplivom nenamernega sproščanja GSO, iv) možnimi takojšnjimi ali kasnejšimi škodljivimi učinki na okolje in zdravje ljudi ter v) verjetnostjo, da se škodljivi učinki za okolje in zdravje ljudi pojavijo. Podrobno so v 5. členu navedeni vsi podatki, ki jih mora povzemati načrt ukrepov (značilnosti zaprtega sistema, dejavnosti in postopkov, ki so pomembni v primeru nesreče, vključno s podatki o shranjevanju GSO, seznam GSO, ki bi se v primeru nesreče lahko sprostili iz zaprtega sistema, in njihove škodljive lastnosti ter varnostni razred dela z GSO v zaprtem sistemu, zadrževalni ukrepi, ki so najpomembnejši za preprečevanje nesreče, možni dogodki v zaprtem sistemu in drugi vzroki, ki lahko povzročijo nesrečo, možne vrste in obseg nesreče, značilnosti okolice zaprtega sistema, ki lahko vplivajo na vrsto in obseg posledic nesreče, in glavne značilnosti okolja v okolici zaprtega sistema, možni načini in poti nepredvidenega sproščanja GSO iz zaprtega sistema in njihovega širjenja v okolju ter možni škodljivi 23

32 učinki in takojšnje ali kasnejše posledice nesreče za okolje in zdravje ljudi). Pri opredelitvi ogroženosti in vplivov na okolje v primeru nesreče je treba upoštevati vse dele okolja in biotsko raznovrstnost. 6. člen posebej opozarja, da se v okviru ocene ogroženosti iz prejšnjega člena opredeli tudi območje, na katerem bi v primeru nesreče lahko prišlo do vplivov nepredvidenega sproščanja GSO iz zaprtega sistema in za katerega je treba načrtovati ukrepe za preprečitev, omejitev ali odpravo posledic nesreče. 7. člen predpisuje, da se v načrtu ukrepov določijo organizacijski in tehnični ukrepi, ki jih mora v primeru nesreče zagotoviti prijavitelj: i) prepoznavanje dogodkov v zaprtem sistemu in drugih situacij, ki lahko povzročijo nesrečo in njihovo čimprejšnjo odpravo, da se omeji obseg nesreče, ii) spremljanje poteka nesreče in odkrivanje prisotnosti GSO izven zaprtega sistema, iii) ugotavljanje in spremljanje vplivov nesreče izven zaprtega sistema in njenih posledic, iv) način aktiviranja načrta ukrepov v primeru nesreče ter vodenje in usklajevanje ukrepov, ki jih zagotavlja prijavitelj, v) obveščanje odgovornih oseb in zaposlenih v zaprtem sistemu o nesreči ter zmanjšanje tveganja za zaposlene in druge osebe, ki sodelujejo pri odpravi ogroženosti in posledic nesreče, in vi) potrebna sredstva in oprema za izvedbo ukrepov, vključno s podatki o lokaciji razpoložljivih sredstev in opreme. 8. člen navaja, da se v načrtu ukrepov opredelijo tudi vsi potrebni organizacijski in tehnični ukrepi, ki jih glede na možne škodljive vplive v primeru nesreče zagotovijo drugi pristojni organi, službe in organizacije, zlasti v zvezi z: i) ugotavljanjem in spremljanjem vplivov nesreče zunaj zaprtega sistema in njenih posledic in ii) ukrepi za varovanje zdravja ljudi in živali, zagotavljanje zdrave hrane, varstvo okolja, ohranjanje narave in drugimi ukrepi, potrebnimi za preprečevanje in zmanjšanje takojšnjih in kasnejših posledic nesreče. 9. člen opredeljuje, da je treba v načrtu ukrepov določiti osebe, ki so pri prijavitelju pooblaščene in zadolžene za: i) aktiviranje načrta ukrepov v primeru nesreče, ii) vodenje in usklajevanje ukrepov v zaprtem sistemu v primeru nesreče, iii) opozarjanje in dajanje navodil v zvezi z zmanjšanjem tveganja znotraj zaprtega sistema, iv) obveščanje in sodelovanje s pristojnimi organi, službami in organizacijami, ki v skladu z načrtom ukrepov sodelujejo pri odpravi ogroženosti in posledic nesreče, in v) izvedbo posameznih tehničnih in drugih organizacijskih ukrepov, ki jih zagotavlja prijavitelj. V načrtu se opredelijo tudi službe in organizacije, ki jih mora prijavitelj v primeru nesreče vključiti v izvajanje svojih ukrepov, če je to potrebno. 10. člen določa, da se v zvezi z obveščanjem pristojnih organov, služb in organizacij v načrtu ukrepov določijo: i) organi, službe in organizacije, ki jih je treba v primeru nesreče obvestiti, ii) oseba pri prijavitelju, ki je pristojna za pripravo obvestila in njegovo posredovanje organom, službam in organizacijam, iii) vsebina obvestila o nesreči, ki se posreduje posameznim organom, službam in organizacijam, in iv) način izmenjave informacij s pristojnimi organi, službami in organizacijami v času trajanja ogroženosti in izvajanja ukrepov. 12. člen podaja sezam potrebnih prilog k načrtu ukrepov: i) seznam oseb, služb in organizacij, vključenih v izvajanje organizacijskih in tehničnih ukrepov prijavitelja, z vsemi potrebnimi podatki za njihovo hitro obveščanje in informiranje, ii) zbirka javnih podatkov, potrebnih za izvajanje načrta ukrepov in podatkov o službah in organizacijah, ki v primeru nesreče lahko nudijo dodatne potrebne informacije, iii) program usposabljanja, urjenja in vaj osebja za primer nesreče ter preverjanja usposobljenosti, iv) navodila za ravnanje zaposlenih v primeru nesreče v zvezi z zmanjšanjem tveganja za njihovo zdravje in vzajemno pomoč ob nesreči, v) načrt prostorov zaprtega sistema z označenimi evakuacijskimi potmi in lokacijo 24

33 razpoložljivih naprav, opreme in sredstev za ukrepanje v primeru nesreče ter vzorec obvestila in obrazec za posredovanje podatkov. 15. člen predpisuje, da mora odgovorna oseba prijavitelja potrditi načrt ukrepov, preden z njim seznani ministrstvo. 16. člen uvaja, da mora prijavitelj v načrtu ukrepov določiti skrbnika načrta, ki je dolžan skrbeti za preverjanje ustreznosti načrta v času trajanja dela z GSO v zaprtem sistemu in njegovo dopolnjevanje, kadar je to potrebno oziroma najmanj enkrat na dve leti, v skladu z zakonom, ki ureja ravnanje z GSO. 17. člen podaja, da mora prijavitelj nemudoma oziroma najkasneje šest ur po tem, ko je ugotovil, da je prišlo do nesreče, obvestiti ministrstvo, župana lokalne skupnosti in regijski center za obveščanje. Obveščanje drugih pristojnih organov, služb in organizacij o nesreči poteka v skladu s predpisi, ki urejajo varstvo pred naravnimi in drugimi nesrečami. 18. člen določa, da mora prijavitelj župane lokalnih skupnosti na območju nesreče obveščati o trenutnih razmerah in poteku aktivnosti ves čas izvajanja ukrepov za odpravo ogroženosti in zmanjšanje posledic. Redna poročila o trenutnih razmerah in izvajanju ukrepov v času trajanja potrebnih aktivnosti prijavitelj posreduje tudi ministrstvu. 7. UREDBA O NAČINU IN MERILIH ZA DOLOČITEV VIŠINE STROŠKOV POSTOPKA IZDAJE UPRAVNIH AKTOV PRI RAVNANJU Z GENSKO SPREMENJENIMI ORGANIZMI Uredba je bila sprejeta leta 2016 in določa merila za izračun stroškov izdaje upravnih aktov v skladu z ZRGSO. Za prijavitelje zaprtih sistemov to pomeni, da bo potrebno pokriti stroške priprave osnutkov strokovnega mnenja (okvirno 380 ) in morebitne potne stroške v primeru ogleda zaprtega sistema. V primeru prijav iz 3. ali 4. varnostnega razreda pa tudi stroške naznanila v sredstvih javnega obveščanja in javne obravnave (najem prostora). Za prijavitelje namernega sproščanja v okolje ali dajanja na trg pa je izdelava osnutka strokovnega mnenja veliko zahtevnejša, lahko vključuje več strokovnjakov in je zato strošek bistveno večji. 8. LITERATURA Zakon o ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi (uradno prečiščeno besedilo) (ZRGSO-UPB1). UL RS št. 23/2005 in UL RS št. 21/2010. Pravilnik o vsebini prijave zaprtega sistema in prijave dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu. UL RS št. 65/2004. Uredba o merilih za uvrstitev dela z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu v varnostni razred in zadrževalnih ter drugih varnostnih ukrepih za posamezni varnostni razred. UL RS št. 71/2011. Pravilnik o oceni tveganja za delo z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu. UL RS št.45/2004. Pravilnik o načrtu ukrepov za primer nesreče pri delu z gensko spremenjenimi organizmi v zaprtem sistemu. UL RS št. 69/2005. Uredba o načinu in merilih za določitev višine stroškov postopka izdaje upravnih aktov pri ravnanju z gensko spremenjenimi organizmi. UL RS št. 22/

34 3. POGLAVJE GSO v metagenomiki Bojan Papić in Lejla Pašić POVZETEK Z izrazom metagenomika označujemo pristope, ki neposredno analizirajo mikrobna zaporedja nukleinskih kislin v izbranem okolju brez potrebe po njihovem gojenju. Metagenomika je v zadnjih dveh desetletjih močno spremenila naše razumevanje raznolikosti, dinamike in metabolnega potenciala mikrobnih združb. Gre za interdisciplinarno področje, ki sega od bazičnih do aplikativnih znanosti. Iz biotehnološkega vidika je še posebej privlačno preučevanje mikrobov in mikrobnih združb v skrajnih (skrajnostnih) in slabo raziskanih okoljih, kot so kraške jame. Dosedanje raziskave jamskih mikrobnih združb so pokazale, da so jamski mikroorganizmi potencialni producenti biotehnološko zanimivih encimov in bioaktivnih snovi. Kot primer uporabe GSO v metagenomiki bo predstavljen primer preučevanja mikrobnih združb t. i. jamskega srebra s pomočjo izdelave klonskih knjižnic z majhnimi vključki (knjižnice 16S rdna) in metagenomskih knjižnic z velikimi vključki (fozmidne knjižnice), ki smo jih izdelali na Katedri za molekularno genetiko in mikrobiologijo. Analiza klonskih knjižnic 16S rdna iz rožnatih mikrobnih prevlek je pokazala, da v teh prevlekah prevladujejo filotipi, ki se uvrščajo v bakterijska debla Proteobacteria, Actinobacteria in Acidobacteria. Najpogostejši filotip (22 % zaporedij) je imel 94-odstotno podobnost z zaporedjem gena 16S rdna iz aktinobakterijske vrste Streptoalloteichus tenebrarius in je morda predstavnik novega rodu znotraj podreda Pseudonocardinae. Iz sivih in rožnatih mikrobnih prevlek v Pajsarjevi jami smo skupno izdelali dve metagenomski fozmidni knjižnici, ki sta posamično vsebovali 500 in primarnih klonov. S funkcijskimi presejalnimi testi na trdnih indikatorskih gojiščih smo skupno pregledali klonov pomnoženih fozmidnih knjižnic in identificirali en klon s potencialno lipolitično aktivnostjo, ki je hidroliziral tributirin. KLJUČNE BESEDE: metagenomika, mikrobne združbe, mikrobiologija jam, fozmidne knjižnice, klonske knjižnice 16S rdna, biotehnologija. 1. UVOD Izraz metagenomika so leta 1998 prvič uporabili Hendelsman in sod. in metagenomiko definirali kot nabor molekularnih metod, ki vključuje kloniranje in funkcijsko analizo vseh genomov v izbranem okolju. Danes metagenomiko pojmujemo nekoliko širše, in sicer gre za pristope, ki omogočajo neposredno analizo zaporedij nukleinskih kislin (DNA ali RNA) v izbranem okoljskem vzorcu (Thomas in sod., 2012; Oulas in sod., 2015). Metagenomika nam omogoča vpogled v celotno raznolikost in funkcijski potencial vseh mikrobov v izbranem okolju brez potrebe po njihovem gojenju. Gojitvene tehnike veljajo za precej omejene; znano je, da z običajnimi mikrobiološkimi tehnikami gojenja v čisti kulturi uspemo osamiti le majhen odstotek (< 1 %) vseh mikroorganizmov (Staley in Konopka, 1985). Danes v metagenomiki opažamo dva glavna pristopa, ki temeljita na nukleotidnih zaporedjih: naključno sekvenciranje (angl. shotgun sequencing) in sekvenciranje označevalskih genov (angl. marker gene sequencing). Pri prvem pristopu z novejšimi tehnologijami sekvenciranja, kot sta tehnologiji Illumina (San Diego, CA, ZDA) in Ion Torrent (Life Technologies; Carlsbad, CA, ZDA), določimo nukleotidna zaporedja obsežnega deleža celokupne okoljske DNA ali RNA. Sekvenciranje naslednje generacije producira veliko število kratkih nukleotidnih zaporedij, ki jih imenujemo tudi odčitki (angl. reads). Sledi sestavljanje (angl. assembly) odčitkov v daljša zaporedja, imenovana soseske (angl. contigs) in ogrodja (angl. scaffolds), ter pripis njihove biološke funkcije (anotacija). Nadaljnja bioinformacijska analiza zaporedij nam omogoča vpogled v funkcijski potencial združbe in zastopanost posameznih skupin genov. Pri drugem pristopu gre za ciljano sekvenciranje izbranega filogenetskega označevalskega gena ali nabora 26

35 genov, ki mu sledi filogenetski opis vrstne sestave mikrobnih združb in njihove zastopanosti v preučevani mikrobni združbi. Najpogosteje uporabljeni filogenetski označevalski geni so 16S rdna (prokarionti), 18S rdna (evkarionti) in nekateri hišni geni (Oulas in sod., 2015). Kot alternativni pristop se v metagenomiki uporablja tudi funkcijsko-metagenomski pristop, ki temelji na ugotavljanju funkcije oz. aktivnosti preiskovanega produkta genov (navadno encima ali protimikrobne snovi). Funkcijska metagenomika vključuje izdelavo metagenomskih knjižnic, ki običajno vsebujejo daljše fragmente okoljske DNA. Tovrstne fragmente ligiramo v vektorje z velikimi vključki (> 25 kb), kot so fozmidni vektorji, in rekombinantne vektorje vnesemo v izbranega heterolognega gostitelja najenostavneje v bakterijo Escherichia coli. Tako pripravljene metagenomske knjižnice lahko pregledujemo s presejalnimi testi, ki temeljijo na nukleotidnih zaporedjih (npr. hibridizacija ali verižna reakcija s polimerazo) ali na funkciji oz. aktivnosti produkta preiskovanega zaporedja (npr. indikatorska gojišča). V nadaljevanju lahko določimo in analiziramo le nukleotidna zaporedja klonov, ki nas zanimajo (npr. izražajo preiskovano aktivnost) (Lam in sod., 2015). V zadnjih letih na področju medicine močno narašča število okužb z večkratno odpornimi bakterijami (Gadakh in van Aerschot, 2015). Po drugi strani se na področju biotehnologije soočamo s prehodom s kemično na biokemično (encimsko) katalizirane industrijske procese in uporabo obnovljivih virov energije (Adrio in Demain, 2014). Tako se na trgu kaže vse večja potreba po odkrivanju novih antibiotikov in industrijskih encimov. Številne nove, še neopisane mikrobne vrste s svojo veliko funkcijsko in genetsko raznolikostjo se zdijo še posebej privlačen vir novih genov in njihovih produktov z biotehnološkim pomenom. Metagenomika se je izkazala za učinkovit pristop pri odkrivanju novih genov, kot so geni z zapisom za nove protimikrobne učinkovine, encime, odpornost proti antibiotikom in virulentne dejavnike (Culligan in sod., 2014). 2. MIKROBIOLOGIJA JAM Jame veljajo za enega od najslabše raziskanih ekosistemov (Lee in sod., 2012). V Sloveniji pa je registriranih že več kot jam in kraška območja pokrivajo več kot 45 odstotkov površine Slovenije (Komac in Urbanc, 2013; Merela in sod., 2013). Jame veljajo za skrajna okolja, saj sta v njih pogosto prisotna pomanjkanje hranil (oligotrofija) in odsotnost svetlobe. V odvisnosti od kamninske podlage so v jami lahko prisotni tudi skrajni gradienti v redoks potencialu in ph-vrednostih (Lee in sod., 2012). Slovenske kraške jame lahko smatramo tudi za psihrofilna okolja, saj je njihova povprečna temperatura običajno nižja od 15 C. Skrajna okolja so z biotehnološkega vidika še posebej zanimiva, saj jih naseljujejo mikroorganizmi, ki so potencialen vir biotehnološko zanimivih novih encimov, stabilnih in aktivnih v skrajnih razmerah (ekstremocimov), in zaščitnih organskih spojin (ekstremolitov) (Raddadi in sod., 2015). Stene nekaterih apnenčastih kraških jam naseljujejo specifične tanke mikrobne prevleke debeline manj kot 1 mm in različnih barv bele, rožnate, rumene ali sive barve. Te so lahko prisotne tako v osvetljenih predelih jame (npr. ob vhodu) kot tudi v popolnoma temnih delih jame. V različnih jamah so tovrstne prevleke različno razširjene; v Pajsarjevi jami (Slovenija) preraščajo površine več kvadratnih metrov, medtem ko v jami Altamiri (Španija) prevleke rastejo kot posamezne kolonije premera 2 5 mm (Cuezva in sod., 2012; Porca in sod., 2012). Med jamarji so tovrstne mikrobne prevleke znane kot jamsko srebro ali jamsko zlato, saj zaradi kondenziranih kapljic vode na svoji površini na značilen način odsevajo svetlobo (odsev je zlate ali srebrne barve) (Pašić in sod., 2010). Dosedanje raziskave jamskega srebra v različnih jamah Dinarskega krasa so pokazale, da v vzorcih različno obarvanih prevlek prevladujejo bakterije iz debel Proteobacteria in Actinobacteria, številni filotipi pa so bili le malo sorodni že opisanim mikrobnim vrstam (Cuezva in sod., 2012; Pašić in sod., 2010). Analiza vrstne raznolikosti jamskih mikrobnih izolatov iz mikrobnih prevlek na stenah Pajsarjeve jame je prav tako pokazala prevlado aktinobakterij (Herzog 27

36 Velikonja in sod., 2014). Jame so tudi habitat, iz katerega so uspeli osamiti številne do tedaj neopisane aktinobakterijske vrste (npr. Cheng in sod., 2013; Lee, 2013; Maciejewska in sod., 2015). Zaključimo lahko, da so aktinobakterije v jamah in v jamskem srebru splošno razširjene ter imajo v njih tudi pomembno biogeokemično vlogo, saj aktivno sodelujejo pri nastanku jam (speleogenezi) (Cuezva in sod., 2012). 3. METAGENOMSKE KLONSKE KNJIŽNICE Izdelava metagenomskih klonskih knjižnic sestoji iz dveh glavnih korakov: kloniranja fragmentov okoljske DNA v izbran vektor in vnosa rekombinantnega vektorja v heterolognega gostitelja. Vektorje, ki jih uporabljamo v molekularni biologiji, delimo na vektorje z majhnimi vključki ( 25 kb) in vektorje z velikimi vključki (> 25 kb). V nadaljevanju je na primeru vzorcev jamskega srebra predstavljena izdelava obeh tipov metagenomskih knjižnic KLONSKE KNJIŽNICE 16S/18S rdna Plazmidi so najbolj razširjen tip vektorjev z majhnimi vključki. V metagenomiki pri izdelavi klonskih knjižnic najpogosteje uporabljamo filogenetsko informativne gene, kot sta gena 16S rdna in 18S rdna ter nekateri hišni geni. Analiza zaporedij 16S/18S rrna velja za zlati standard v molekularni analizi mikrobnih združb. Omogoča nam vpogled v mikrobno raznolikost, relativno zastopanost posameznih taksonov in dinamiko mikrobnih združb. Nekatere pomanjkljivosti 16S/18S rdna kot filogenetskih označevalcev so: (i) variacija v številu kopij, (ii) različna hitrost evolucije vzdolž gena 16S/18S rdna, med različnimi geni 16S/18S rdna ter med geni 16S/18S rdna in drugimi geni v genomu, (iii) omejena ločljivost med ozko sorodnimi vrstami in (iv) možnost horizontalnih genskih prenosov. Metodološke napake, kot so pristranskost verižne reakcije s polimerazo in napake v sekvenciranju, dodatno otežujejo analizo zaporedij. Poleg tega v knjižnicah le stežka identificiramo redko zastopane taksone (Poretsky in sod., 2014; Wooley in sod., 2010). Izdelava klonskih knjižnic 16S/18S rdna vključuje namnožitev izbranih okoljskih genov z verižno reakcijo s polimerazo, ligacijo fragmentov okoljske DNA v izbran plazmidni vektor, vnos rekombinantnega klona v gostiteljsko celico (najpogosteje E. coli) in selekcijo bakterijskih celic z rekombinantnim plazmidom. Rekombinantne plazmide nato iz gostiteljskih celic izoliramo in jim določimo zaporedje vključkov s sekvenciranjem po Sangerju, s katerim lahko sekvenciramo fragmente DNA dolžine ~ 1 kb. Sledi filogenetska rekonstrukcija zaporedij z bioinformacijskimi orodji. Z razvojem sekvenciranja novejše generacije, ki je visoko zmogljivo in poceni, se priprava in vivo klonskih knjižnic 16S/18S rdna v heterolognem gostitelju opušča in v ospredje stopa sekvenciranje odsekov označevalskih genov (npr. izbranih hipervariabilnih regij v 16S/18S rdna) s sekvenciranjem naslednje generacije. Pri slednjem izbrane odseke označevalskih genov predhodno namnožimo z verižno reakcijo s polimerazo, na njihove konce ligiramo kratka adapterska zaporedja DNA, jih namnožimo z verižno reakcijo s polimerazo in njihovo nukleotidno zaporedje določimo s sekvenciranjem naslednje generacije. Omenjeni pristop torej ne zahteva izdelave metagenomskih knjižnic (Oulas in sod., 2015). Vendarle izdelava klonskih knjižnic 16S/18S rdna in sekvenciranje po Sangerju zaradi relativno enostavne in poceni priprave ter ustaljenih protokolov še vedno ostajata priljubljena metoda za manjše mikrobnoekološke raziskave. Poleg tega sekvenciranje po Sangerju velja za precej natančno (stopnja napake < 0,01 %) in omogoča daljše odčitke (~ 1 kb) od večine danes uporabljenih tehnologij sekvenciranja naslednje generacije, kar vodi v lažji in zanesljivejši filogenetski pripis zaporedij 16S/18S rdna (Shendure in Ji, 2008). 28

37 IZDELAVA KLONSKIH KNJIŽNIC 16S rdna IZ JAMSKIH MIKROBNIH PREVLEK Na Katedri za molekularno genetiko in mikrobiologijo smo izdelali skupno dve klonski knjižnici 16S rdna iz rožnatih prevlek iz Pajsarjeve jame (bližina Vrhnike) in jame Vjetrenica (Bosna in Hercegovina) (Papić, 2015). Celokupno okoljsko DNA iz mikrobnih prevlek jamskega srebra smo izolirali po modificirani metodi, ki so jo opisali Pang in sod. (2008). Gene 16S rdna smo pomnožili s Taq DNApolimerazo ter začetnima oligonukleotidoma 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') in 27F (5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), kot je opisano v Porca in sod. (2012). Klonski knjižnici 16S rdna smo pripravili s komercialnim kompletom pgem T-Easy Vector System (Promega; Madison, WI, ZDA) po navodilih proizvajalca. Pomnožene okoljske gene 16S rdna smo naključno klonirali v plazmidni vektor pgem T-Easy in jih vnesli v gostiteljske celice E. coli JM109. Rekombinantne klone z vključki smo selekcionirali z α-komplementacijo diferencialno-selektivna trdna gojišča LB z dodatkom ampicilina (100 µg/ml), IPTG (0,5 mm) in X-gal (20 mg/ml). Iz vsake knjižnice smo naključno izbrali 96 za vključek pozitivnih klonov, ki so jim nukleotidno zaporedje določili v podjetju Macrogen (Seul, Južna Koreja). Himerna zaporedja smo odstranili z orodjem Bellerophon (Huber in sod., 2004). Preostala zaporedja smo z orodjem Mothur v (Schloss in sod., 2009) združili v operacijske taksonomske enote z uporabo triodstotne razlike v evolucijskih razdaljah. Analiziranim zaporedjem smo poiskali najbolj podobna zaporedja znotraj (i) podatkovne zbirke NCBI NR nucleotide database z algoritmom BLASTn in (ii) znotraj skrbno vzdrževane podatkovne zbirke EzTaxon s prosto dostopnim spletnim orodjem EzBioCloud (Chun, 2012). Končna nukleotidna zaporedja smo poravnali s programom ClustalOmega (Sievers in sod., 2011) in končni filogenetski drevesi izrisali s programom MEGA6 (Tamura in sod., 2013) z metodo največjega verjetja. Vrednosti podpore bootstrap smo opredelili z neparametričnim testom samovzorčenja s 1000 ponovitvami. Glavne ugotovitve bioinformacijske analize so bile, da v rožnatih mikrobnih prevlekah jamskega srebra prevladujejo filotipi, ki jih uvrščamo v debla Proteobacteria, Actinobacteria in Acidobacteria. Sestava preučevanih rožnatih mikrobnih prevlek je bila na nivoju prevladujočih bakterijskih debel precej podobna sestavi drugih mikrobnih prevlek jamskega srebra iz različnih kraških jam (Pašić in sod., 2010; Porca in sod., 2012). Najpogostejši filotip (22 % zaporedij) je imel 94-odstotno enakost (tj. 94 % enakih nukleotidov) z zaporedjem 16S rdna iz aktinobakterije Streptoalloteichus tenebrarius in morda predstavlja nov rod znotraj podreda Pseudonocardinae (slika 3-1). Ostali najbolj zastopani filotipi so bili najbolj sorodni gamaproteobakteriji Thiohalomonas denitrificans (11 % zaporedij), gamaproteobakteriji Povalibacter uvarum (8 % zaporedij) in nitrospiri Nitrospira moscoviensis (7 % zaporedij). Filotip EB2_E07_27F (10 zaporedij), ki je bil najbolj soroden nitrospiri Nitrospira moscoviensis, je bil prisoten tudi v rumenih mikrobnih prevlekah (Porca in sod., 2012). Prav tako je bil v rumenih mikrobnih prevlekah prisoten filotip BS1_F12_27F (15 zaporedij), ki je bil najbolj podoben gamaproteobakteriji Thiohalomonas denitrificans. Preostala dva prevladujoča filotipa sta se filogenetsko grupirala z drugimi že opisanimi bakterijskimi vrstami kot filotipi iz drugih mikrobnih prevlek jamskega srebra (Pašić in sod., 2010; Porca in sod., 2012). Sestava mikrobne združbe rožnatih in rumenih mikrobnih prevlek jamskega srebra se tako zdi podobna tako na nivoju prevladujočih bakterijskih debel kot tudi na nivoju nekaterih prevladujočih taksonov (vrst). Sestavo zgoraj opisanih klonskih knjižnic s preostalimi knjižnicami, ki so bile prav tako izdelane iz mikrobnih prevlek jamskega srebra (Pašić in sod., 2010; Porca in sod., 2012), smo primerjali tudi s statističnima analizama -LIBSHUFF in HOMOVA (orodje mothur; Schloss in sod., 2009). Primerjalna analiza klonskih knjižnic je prav tako pokazala, da gre za mikrobne prevleke s podobno vrstno sestavo (neobjavljeni rezultati). 29

38 Slika 3-1. Izsek filogenetskega drevesa genov 16S rdna iz rožnatih mikrobnih prevlek iz Pajsarjeve jame in jame Vjetrenica (rdeča barva), ki prikazuje filogenetsko uvrstitev prevladujočega aktinobakterijskega filotipa EB2_B09_27F. Filogenetsko drevo smo izrisali z metodo največjega verjetja in uporabo modela nukleotidnih zamenjav TN93+G+I s programom MEGA6 (Tamura in sod., 2013). Na vejiščih so predstavljene vrednosti podpore bootstrap, ki smo jih določili z neparametričnim testom samovzorčenja s 1000 ponovitvami. Kot zunanjo skupino smo uporabili evriarhejo Methanospirillum hungatei (M60880). BS, rožnate mikrobne prevleke iz Pajsarjeve jame (Slovenija); EB, rožnate mikrobne prevleke iz jame Vjetrenica (Bosna in Hercegovina) (Papić, 2015) METAGENOMSKE KNJIŽNICE Z VELIKIMI VKLJUČKI Primeri pogosto uporabljenih vektorjev z velikimi vključki so fozmidi (velikost vključka kb), kozmidi (35 45 kb) in umetni kromosomi bakterij ( kb). Ti so v celici navadno prisotni v majhnem številu kopij, število kopij vektorja v celici pa je lahko inducibilno. Glavne prednosti vektorjev z velikimi vključki so večja stabilnost vključka, možnost analize okolice preiskovanega gena, zanesljivejši filogenetski in taksonomski pripis zaporedij ter večja verjetnost odkritja celotnih biosinteznih poti v primerjavi s knjižnicami z majhnimi vključki (Culligan in sod., 2014; Danhorn in sod., 2012). Vektorji z velikimi vključki imajo širok spekter uporabnosti. Poleg odkrivanja novih genov, gruč genov in biosinteznih poti se uporabljajo npr. za analizo haplotipov in sekvenciranje celotnih genomov. Knjižnice, pripravljene s tovrstnimi vektorji, so pogosto potrebne za zanesljivo sestavljanje celotnih genomov (orientacija ogrodij in zapolnitev vrzeli med ogrodji pri zaključevanju celotnih genomov) (Culligan in sod., 2014; Quail in sod., 2011) IZDELAVA METAGENOMSKIH FOZMIDNIH KNJIŽNIC IZ JAMSKIH MIKROBNIH PREVLEK Na Katedri za molekularno genetiko in mikrobiologijo smo izdelali skupno dve fozmidni knjižnici iz sivih in rožnatih mikrobnih prevlek jamskega srebra iz Pajsarjeve jame v bližini Vrhnike (Papić, 2015). Celokupno okoljsko DNA iz mikrobnih prevlek jamskega srebra smo izolirali po modificirani metodi, ki so jo opisali Pang in sod. (2008). Za izdelavo fozmidnih knjižnic smo uporabili komercialni komplet CopyControl Fosmid Library Production Kit (Epicentre; Illumina, Madison, WI, ZDA), ki vključuje 30

39 fozmidni vektor pcc1fos in gostiteljski sev E. coli EPI300-T1 R. Fozmidni vektor pcc1fos je pogosto uporabljen kot komercialni vektor za pripravo fozmidnih knjižnic, saj se v celici običajno nahaja v eni kopiji, kar poveča stabilnost vključka. Njegovo pomnoževanje lahko induciramo s komercialno avtoindukcijsko raztopino, kar olajša nadaljnjo molekularnobiološko manipulacijo. Pokazali smo, da je avtoindukcijska raztopina 0,01-odstotna (w/v) raztopina L-arabinoze. Čistost in koncentracijo DNA smo opredelili mikrospektrofotometrično (NanoDrop 1000; NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, ZDA). Kakovost okoljske DNA smo opredelili z elektroforezno ločitvijo v 0,6-odstotnem agaroznem gelu (v jamico smo nanesli 1 µl okoljske DNA). Fragmentom okoljske DNA smo encimsko priredili konce (tvorba 5'-fosforiliranih koncev DNA). Okoljsko DNA smo nato ločili z elektroforezo v pulzirajočem električnem polju (CHEF-DR III Variable Angle System; Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) in iz agaroznega gela iz nizkotališčne agaroze izrezali fragmente okoljske DNA želene velikosti (~ 40 kb). DNA smo iz agaroznih kock ekstrahirali z encimom agaraza. Okoljsko DNA smo ligirali v fozmidni vektor pcc1fos, rekombinantne fozmide pakirali v glave fagnih delcev λ in z rekombinantnimi fagi λ okužili gostiteljske celice E. coli EPI300-T1 R. Tako pripravljeno fozmidno knjižnico smo nacepili na selektivna trdna gojišča LB z dodatkom kloramfenikola (12,5 µg/ml). Fozmidna knjižnica, pripravljena iz rožnatih mikrobnih prevlek, je vsebovala primarnih klonov. Zaradi velikega števila klonov smo klone postrgali s plošč in jih shranili pri 80 C kot pomnoženo fozmidno knjižnico v petih 2-ml kriovialah. Siva fozmidna knjižnica je vsebovala 500 primarnih klonov; to smo namnožili v mikrotitrskih ploščah s 96 jamicami (volumen gojišča v jamicah 300 µl) in jo po dvodnevni inkubaciji pri 37 C shranili kot posamezne kolonije pri 80 C PREGLEDOVANJE KLONOV FOZMIDNIH KNJIŽNIC ZA ENCIMSKO IN PROTIMIKROBNO AKTIVNOST Glavni encimi industrijskega pomena so hidrolaze, med katerimi prevladujejo glikozil-hidrolaze (celulaze, hemicelulaze, hitinaze, amilaze), proteaze in lipolitični encimi (lipaze, esteraze). Industrijski encimi so uporabni praktično v vseh biotehnoloških panogah, med drugim v živilski, tekstilni, papirni, kozmetični in usnjarski industriji, industriji detergentov, proizvodnji biogoriv, živinoreji, kmetijstvu, okoljevarstveni biotehnologiji in v tudi raziskovanju. Na področju industrijske biotehnologije se kaže potreba po novih in izboljšanih encimih, še posebej encimih, ki so stabilni in aktivni v skrajnih razmerah (Adrio in Demain, 2014). Da bi ugotovili smotrnost iskanja omenjenih encimov v izdelanih fozmidnih knjižnicah, nas je zanimalo, ali so omenjeni encimi prisotni v anotiranem jamskem metagenomu Echo Passage (Ortiz in sod., 2014). Gre za trenutno edini prosto dostopni, naključno sekvenciran jamski metagenom, ki predstavlja metagenom treh kapnikov v jami Kartchner caverns (AZ, ZDA). Omenjeni metagenom smo privzeli kot najboljši približek našim preučevanim jamskim ekosistemom. Ugotovili smo, da so bili vsi encimi z izjemo proteaz prisotni v metagenomu Echo Passage. Subpopulacijo klonov fozmidnih knjižnic smo tako v nadaljevanju pregledali za izbrane hidrolitične aktivnosti s pomočjo trdnih indikatorskih gojišč za detekcijo encimske aktivnosti (trdna gojišča LB z dodatkom induktorja in substrata za preiskovan substrat). Preiskovane encimske aktivnosti so bile amilazna, beta-glukozidazna, endoglukanazna, esterazna, hitinazna, ksilanazna, lipazna in proteazna aktivnost. Encimsko aktivnost smo spremljali kot spremembo v obarvanju gojišča ali cono zbistritve okoli pozitivne kolonije. V primeru, ko je način detekcije zahteval destrukcijo celic (amilazna, endoglukanazna aktivnost), smo replike kolonij zagotovili z odtisom kolonij na žamet in nato na trdna gojišča. Skupno smo pregledali klonov ter identificirali in uspešno potrdili en klon, imenovan K10 lip+, s potencialno lipolitično aktivnostjo (hidrolizo tributirina), ki je izviral iz fozmidne knjižnice iz rožnatih mikrobnih prevlek (slika 3-2). Klon K10 lip+ na trdnih indikatorskih 31

40 gojiščih ni hidroliziral olivnega olja ali detergentov Tween 20/80. Izolacija domnevne lipaze in njen biokemijski opis sta predmet prihodnjih raziskav. Slika 3-2. Potrjen klon K10 lip+ iz fozmidne knjižnice iz rožnatih mikrobnih prevlek z lipolitično aktivnostjo na trdnem gojišču z 1-odstotnim tributirinom. Zgoraj: gostiteljska seva E. coli EPI300-T1 R in DH5α (negativni kontroli). Spodaj: pozitivna klona K10 lip+ EPI300-T1 R in DH5α. Pri obeh gostiteljskih sevih E. coli je opazna cona zbistritve okoli klona K10 lip+, ki je posledica hidrolize tributirina (Papić, 2015). Na področju medicine se soočamo s porastom večkratno odpornih sevov in s pomanjkanjem novih spojin s protimikrobnim delovanjem. Aktinobakterije iz rodu Streptomyces so glavni producenti antibiotikov, ki so danes v klinični rabi (Baltz, 2007). Medtem ko izolacija streptomicetnih sevov s protimikrobno aktivnostjo pogosto vodi v identifikacijo že znanih spojin s protimikrobno aktivnostjo, redke druge (ne-streptomicetne) vrste veljajo za potencialni vir novih antibiotikov (Jose in Jebakumar, 2013). Zaradi visoke prevalence aktinobakterij v jamskem srebru in ugotovitve, da v rožnatih mikrobnih prevlekah prevladuje filotip, ki predstavlja kandidatno novo aktinobakterijsko vrsto s potencialno novimi biosinteznimi potmi (slika 3-1), smo fozmidne knjižnice vzporedno s pregledovanjem encimske aktivnosti pregledovali tudi za protibakterijsko in protiglivno aktivnost. Uporabili smo metodo prelivanja z mehkim agarjem, v katerega smo vmešali enega od indikatorskih sevov (E. coli DH5α, Bacillus subtilis oz. Saccharomyces cerevisiae). Protimikrobna aktivnost se je kazala kot cona inhibicije okoli pozitivnih pregledovanih klonov. Skupno smo pregledali klonov. Protimikrobne aktivnosti nismo uspeli zaznati pri nobenem od pregledanih klonov. 4. DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA USPEŠNOST UGOTAVLJANJA NOVIH GENOV Naši rezultati potrjujejo opažanja drugih raziskovalcev, da je uspešnost identifikacije novih encimov in protimikrobnih snovi z običajnim ( naivnim ) funkcijsko-metagenomskim pristopom v splošnem precej nizka (Ferrer in sod., 2016). V literaturi zasledimo tako zelo visoke uspešnosti (0,26 % pozitivnih klonov; Nyyssönen in sod., 2013) kot tudi zelo nizke uspešnosti (1, % pozitivnih klonov; Chung in sod., 2008) identifikacije pozitivnih klonov. Zdi se, da je poleg same mikrobne združbe pomemben dejavnik, ki določa uspešnost identifikacije, tudi izbor preiskovane aktivnosti (Ferrer in sod., 2016). 32

41 Dejavniki, ki vplivajo na uspešnost identifikacije novih genov s presejalnimi testi, ki temeljijo na indikatorskih gojiščih, so številni. Število klonov, ki jih moramo pregledati, da identificiramo pozitivni klon z intaktnim preiskovanim zaporedjem, je odvisno od: (i) razmerja med velikostjo preiskovanega zaporedja in velikostjo vključka, (ii) velikosti genoma, iz katerega zaporedje izhaja, in (iii) števila kopij preiskovanega zaporedja na genom (Kim in sod., 2008). Medtem ko v primeru hidrolaznih genov (povprečna velikost ~ 1,7 kb) velikost nima velikega vpliva na število klonov, ki jih moramo pregledati, ima lahko velikost biosinteznih gruč genov pomemben vpliv na uspešnost identifikacije pozitivnih klonov. Gruče genov z zapisom za sintaze poliketidov ali sintaze neribosomskih peptidov namreč pogosto presegajo 40 kb, ki je največja velikost vključka v fozmidnih knjižnicah (Yamanaka in sod., 2014). Pomemben dejavnik je tudi pristranskost kloniranja; znano je, da fragmente z visoko ali nizko vsebnostjo baznih parov gvanin citozin težje vstavimo v običajne vektorje in imajo manjšo stabilnost (Godiska in sod., 2005). Na zastopanost preiskovanih genov v okolju lahko vplivamo z neposrednim posegom v okolje, npr. z dodatkom označenega ali neoznačenega substrata (Ekkers in sod., 2012). Naslednji pomemben dejavnik je pristranskost izbranega gostiteljskega seva. V heterolognem gostitelju se tuj gen lahko ne izraža zaradi različnih razlogov, kot so razlike v transkripcijsko-translacijskem aparatu, spremenjeni okoljski dejavniki ali odsotnost kofaktorjev, modifikacijskih encimov oz. molekularnih spremljevalcev. Nadalje lahko produkt v celici tvori inkluzijska telesca, se pospešeno razgradi, koagregira z drugimi proteini gostitelja, deluje toksično na gostitelja ali se iz celice ne izloča zaradi nekompatibilnega sistema izločanja (Ekkers in sod., 2012; Culligan in sod., 2014). V zadnjih letih so bile razvite številne izboljšave za večjo uspešnost izražanja okoljske DNA v heterolognem gostitelju. Nekatere od možnosti so (i) genetsko inženirstvo transkripcijsko-translacijskega aparata pri E. coli (Gaida in sod., 2015; Terrón- González in sod., 2013), (ii) uporaba gensko spremenjenega gostitelja, ki omogoča komplementacijo (Simon in sod., 2009; Charlop-Powers in sod., 2013), (iii) izdelava vektorjev za alternativne gostitelje in vnos rekombinantnih vektorjev v več (alternativnih) gostiteljev, ki so filogenetsko čim bolj oddaljeni (Craig in sod., 2010), in (iv) izdelava gostiteljskega seva E. coli popolnoma brez preiskovane aktivnosti (angl. background activity; Nyyssönen in sod., 2013). Medtem ko je znano, da ima sam gostiteljski sev E. coli EPI300-T1 R gene, udeležene v metabolizmu amilaze in fosfata (Nyyssönen in sod., 2013), smo v naši raziskavi pri pregledovanju klonov opazili tudi šibko lipolitično aktivnost samega gostiteljskega seva ter pojav beta-glukozidazno pozitivnih mutant E. coli EPI300-T1 R in E. coli DH5α, kar je zmanjševalo uspešnost detekcije pravih pozitivnih klonov. Uspešnost identifikacije pozitivnih klonov je lahko odvisna tudi od uporabljenega substrata, tipa gojišča, faze rasti gostiteljskega ali indikatorskega seva ipd. Maruthamuthu in sod. (2016) so uspešnost identifikacije pozitivnih klonov povečali z uporabo večjega števila substratov za preiskovano skupino encimov. Nadalje je pomemben dejavnik pristranskost metode detekcije, s katero sledimo preiskovani aktivnosti. Trdna indikatorska gojišča, ki smo jih uporabljali v naši raziskavi, imajo nižjo občutljivost in specifičnost kot tekoča gojišča s fluorogeno ali kromogeno označenimi substrati, imajo omejeno možnost avtomatizacije ter so bolj časovno in finančno potratna (Nyyssönen in sod., 2013). V literaturi je zaslediti številne primere navidezno pozitivnih klonov zaradi nizke pozitivne napovedne vrednosti trdnih indikatorskih gojišč (Litthauer in sod., 2010; Jones in sod., 2007). Zaradi tega razvijajo avtomatizirane in miniaturizirane presejalne teste visokih zmogljivosti, ki omogočajo enostavno pregledovanje velikega števila klonov, pocenijo presejalne teste in vodijo v večjo uspešnost identifikacije pozitivnih klonov (Nyyssönen in sod., 2013; Colin in sod., 2015). 5. ZAKLJUČEK Metagenomika je korenito spremenila naše razumevanje mikrobne genetske in funkcijske raznolikosti. Neizmerna mikrobna raznolikost predstavlja velik in še neizkoriščen vir novih spojin biotehnološkega 33

42 pomena, kot so novi encimi in antibiotiki. Znani so primeri novih encimov biotehnološkega pomena iz mikrobnih združb, ki naseljujejo različna skrajna okolja, kot so vampni sok (Privé in sod., 2015), ledeniki (Ferrés in sod., 2015) in globokomorski sedimenti (Jeon in sod., 2011). Po drugi strani kraške jame iz metagenomskega vidika ostajajo še precej neraziskano skrajno okolje. Naša raziskava predstavlja prvi primer izdelave fozmidnih metagenomskih knjižnic iz jamskih mikrobnih združb in njihovega pregledovanja s funkcijsko-metagenomskim pristopom. Ob pregledovanju klonov za različne encimske in protimikrobne aktivnosti smo uspešno identificirali in potrdili en klon s potencialno lipolitično aktivnostjo. Čeprav se običajni ( naivni ) funkcijsko-metagenomski pristop za iskanje novih spojin, ki smo ga uporabili tudi v naši raziskavi, zdi premalo učinkovit, se v zadnjih letih razvijajo visoko zmogljivi in avtomatizirani presejalni testi ter številne izboljšave na področju uporabljenih vektorjev in gostiteljev. V kombinaciji z visoko zmogljivim naključnim sekvenciranjem funkcijska metagenomika ostaja močno orodje za ugotavljanje novih spojin biotehnološkega pomena. 6. LITERATURA Adrio, J. L., Demain, A. L Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules 4: Baltz, R. H Antimicrobials from Actinomycetes: back to the future. Microbe 2: Charlop-Powers, Z., Banik, J. J., Owen, J. G., Craig, J. W., Brady, S. F Selective enrichment of environmental DNA libraries for genes encoding nonribosomal peptides and polyketides by phosphopantetheine transferase-dependent complementation of siderophore biosynthesis. ACS Chem Biol 8: Cheng, J., Chen, W., Huo-Zhang, B., Nimaichand, S., Zhou, E. M., Lu, X. H., Klenk, H. P., Li, W. J Microlunatus cavernae sp. nov., a novel actinobacterium isolated from Alu ancient cave, Yunnan, South-West China. Antonie Van Leeuwenhoek 104: Chun, J Introducing EzTaxon: a prokaryotic 16S rrna gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int J Syst Evol Microbiol 62: Chung, E. J., Lim, H. K., Kim, J. C., Choi, G. J., Park, E. J., Lee, M. H., Chung, Y. R., Lee, S. W Forest soil metagenome gene cluster involved in antifungal activity expression in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 74: Colin, P. Y., Kintses, B., Gielen, F., Miton, C. M., Fischer, G., Mohamed, M. F., Hyvönen, M., Morgavi, D. P., Janssen, D. B., Hollfelder, F Ultrahigh-throughput discovery of promiscuous enzymes by picodroplet functional metagenomics. Nat Commun 6: Craig, J. W., Chang, F. Y., Kim, J. H., Obiajulu, S. C., Brady, S. F Expanding small-molecule functional metagenomics through parallel screening of broad-host-range cosmid environmental DNA libraries in diverse proteobacteria. Appl Environ Microbiol 76: Cuezva, S., Fernandez-Cortes, A., Porca, E., Pašić, L., Jurado, V., Hernandez-Marine, M., Serrano-Ortiz, P., Hermosin, B., Cañaveras, J. C., Sanchez-Moral, S., Saiz-Jimenez, C The biogeochemical role of Actinobacteria in Altamira Cave, Spain. FEMS Microbiol Ecol 81: Culligan, E. P., Sleator, R. D., Marchesi, J. R., Hill, C Metagenomics and novel gene discovery. Virulence 5: Danhorn, T., Young, C. R., DeLong, E. F Comparison of large-insert, small-insert and pyrosequencing libraries for metagenomic analysis. ISME J 6: Ekkers, D. M., Cretoiu, M. S., Kielak, A. M., van Elsas, J. D The great screen anomaly a new frontier in product discovery through functional metagenomics. Appl Microbiol Biotechnol 93: Ferrer, M., Martínez-Martínez, M., Bargiela, R., Streit, W. R., Golyshina, O. V., Golyshin, P. N Estimating the success of enzyme bioprospecting through metagenomics: current status and future trends. Microb Biotechnol 9: Ferrés, I., Amarelle, V., Noya, F., Fabiano, E Construction and screening of a functional metagenomic library to identify novel enzymes produced by Antarctic bacteria. Advances in Polar Science 26: Gadakh, B., van Aerschot, A Renaissance in antibiotic discovery: some novel approaches for finding drugs to treat bad bugs. Curr Med Chem 22: Gaida, S. M., Sandoval, N. R., Nicolaou, S. A., Chen, Y., Venkataramanan, K. P., Papoutsakis, E. T Expression of heterologous sigma factors enables functional screening of metagenomic and heterologous genomic libraries. Nat Commun 6:

43 Godiska, R., Patterson, M., Schoenfeld, T., Mead, D. A Beyond puc: vectors for cloning unstable DNA. V: Kieleczawa, J. (Ed.), DNA sequencing: optimizing the process and analysis. Jones and Barlett Publishers, London, pp Herzog-Velikonja, B., Tkavc, R., Pašić, L Diversity of cultivable bacteria involved in the formation of macroscopic microbial colonies (cave silver) on the walls of a cave in Slovenia. Int J Speleol 43: Huber, T., Faulkner, G., Hugenholtz, P Bellerophon: a program to detect chimeric sequences in multiple sequence alignments. Bioinformatics 20: Jeon, J. H., Kim, J. T., Lee, H. S., Kim, S. J., Kang, S. G., Choi, S. H., Lee, J. H Novel lipolytic enzymes identified from metagenomic library of deep-sea sediment. Evid Based Complement Alternat Med 2011: Jones, B. V., Sun, F., Marchesi, J. R Using skimmed milk agar to functionally screen a gut metagenomic library for proteases may lead to false positives. Lett Appl Microbiol 45: Jose, P. A., Jebakumar, S. R. D Non-streptomycete actinomycetes nourish the current microbial antibiotic drug discovery. Front Microbiol 4: 240. Kim, E. J., Angell, S., Janes, J., Watanabe, C. M Estimating P-coverage of biosynthetic pathways in DNA libraries and screening by genetic selection: biotin biosynthesis in the marine microorganism Chromohalobacter. Mol Biosyst 4: Komac, M., Urbanc, J Model stopnje zakraselosti za območje Slovenije. Ujma 27: Lam, K. N., Cheng, J., Engel, K., Neufeld, J. D., Charles, T. C Current and future resources for functional metagenomics. Front Microbiol 6: Lee, N. M., Meisinger, D. B., Aubrecht, R., Kovacik, L., Saiz-Jimenez, C., Baskar, S., Baskar, R., Liebl, W., Porter, M. L., Summers Engel A Caves and karst environments. V: Bell, E.M. (Ed.), Life at extremes: environments, organisms and strategies for survival. Cambridge, CABI, pp Lee, S. D Spelaeicoccus albus gen. nov., sp. nov., an actinobacterium isolated from a natural cave. Int J Syst Evol Microbiol 63: Litthauer, D., Abbai, N. S., Piater, L. A., van Heerden, E Pitfalls using tributyrin agar screening to detect lipolytic activity in metagenomic studies. Afr J Biotechnol 9: Maciejewska, M., Stelmach Pessi, I., Arguelles-Arias, A., Noirfalise, P., Luis, G., Ongena, M., Barton, H., Carnol, M., Rigali, S Streptomyces lunaelactis sp. nov., a novel ferroverdin A-producing Streptomyces species isolated from a moonmilk speleothem. Antonie Van Leeuwenhoek 107: Maruthamuthu, M., Jiménez, D. J., Stevens, P., van Elsas, D. J A multi-substrate approach for functional metagenomics-based screening for (hemi)cellulases in two wheat straw-degrading microbial consortia unveils novel thermoalkaliphilic enzymes. BMC Genom 17: 86. Merela, M., Kregar, V., Čekada, M., Bračič, R., Hribernik, M., Ilič, U., Bakšić, D., Novosel, D Jamarstvo v Sloveniji in na Hrvaškem. Ljubljana: Jamarska zveza Slovenije, Jamarska reševalna služba: 66 str. (februar 2016). Nyyssönen, M., Tran, H. M., Karaoz, U., Weihe, C., Hadi, M. Z., Martiny, J. B. H., Martiny, A. C., Brodie, E. L Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol 4: 282. Ortiz, M., Legatzki, A., Neilson, J. W., Fryslie, B., Nelson, W. M., Wing, R. A., Soderlund, C. A., Pryor, B. M., Maier, R. M Making a living while starving in the dark: metagenomic insights into the energy dynamics of a carbonate cave. ISME J 8: Oulas, A., Pavloudi, C., Polymenakou, P., Pavlopoulos, G.A., Papanikolaou, N., Georgios Kotoulas, G., Arvanitidis, C., Iliopoulos, I Next-generation sequencing data derived from biodiversity studies. Bioinform Biol Insights 9: Pang, M., Abdullah, N., Lee, C., Ng, C Isolation of high molecular weight DNA from forest topsoil for metagenomic analysis. Asia Pac J Mol Biol Biotechnol 16: Papić, B Biotehnološki potencial metagenomskih knjižnic iz mikrobnih skupnosti kraških jam. Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo: 78 str. Pašić, L., Kovče, B., Sket, B., Herzog-Velikonja, B Diversity of microbial communities colonizing the walls of a Karstic cave in Slovenia. FEMS Microbiol Ecol 71: Porca, E., Jurado, V., Žgur-Bertok, D., Saiz-Jimenez, C., Pašić, L Comparative analysis of yellow microbial communities growing on the walls of geographically distinct caves indicates a common core of microorganisms involved in their formation. FEMS Microbiol Ecol 81: Poretsky, R., Rodriguez, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T Strengths and limitations of 16S rrna gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS One 9: e

44 Privé, F., Newbold, C. J., Kaderbhai, N. N., Girdwood, S. G., Golyshina, O. V., Golyshin, P. N., Scollan, N. D., Huws, S. A Isolation and characterization of novel lipases/esterases from a bovine rumen metagenome. Appl Microbiol Biotechnol 99: Quail, M. A., Matthews, L., Sims, S., Lloyd, C., Beasley, H., Baxter, S. W Genomic libraries: construction and screening of fosmid genomic libraries. V: Orgogozo, V., Rockman, M. V. (Eds.), Molecular methods for evolutionary genetics (Methods in molecular biology, 722). Humana Press, New York, pp Raddadi, N., Cherif, A., Daffonchio, D., Neifar, M., Fava, F Biotechnological applications of extremophiles, extremozymes and extremolytes. Appl Microbiol Biotechnol 99: Schloss, P. D., Westcott, S. L., Ryabin, T., Hall, J. R., Hartmann, M., Hollister, E. B., Lesniewski, R. A., Oakley, B. B., Parks, D. H., Robinson, C. J., Sahl, J. W., Stres, B., Thallinger, G. G., van Horn, D. J., Weber, C. F Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol 75: Shendure, J., Ji, H Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol 26: Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D., Gibson, T. J., Karplus, K., Li, W., Lopez, R., McWilliam, H., Remmert, M., Söding, J., Thompson, J. D., Higgins, D. G Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol 7. Simon, C., Herath, J., Rockstroh, S., Daniel, R Rapid identification of genes encoding DNA polymerases by function-based screening of metagenomic libraries derived from glacial ice. Appl Environ Microbiol 75: Staley, J., Konopka, A Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu Rev Microbiol 39: Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol 30: Terrón-González, L., Medina, C., Limón-Mortés, M. C., Santero, E Heterologous viral expression systems in fosmid vectors increase the functional analysis potential of metagenomic libraries. Sci Rep 3: Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F Metagenomics a guide from sampling to data analysis. Microb Inform Exp 2: 3. Wooley, J.C., Godzik, A., Friedberg, I A primer on metagenomics. PLoS Comput Biol 6: e Yamanaka, K., Reynolds, K. A., Kersten, R. D., Ryan, K. S., Gonzalez, D. J., Nizet, V., Dorrestein, P. C., Moore, B. S Direct cloning and refactoring of a silent lipopeptide biosynthetic gene cluster yields the antibiotic taromycin A. PNAS 111:

45 4. POGLAVJE Raziskovanje prilagoditev gliv za življenje v skrajnostnih okoljih s pomočjo GSO Martina Turk POVZETEK Skrajnostna (skrajna) okolja so tista, kjer so abiotski dejavniki nad ali pod določenimi vrednostmi in je tako zaradi ostrih pogojev življenja prisotnih le malo vrst organizmov. Eden ključnih omejujočih dejavnikov uspevanja organizmov v teh okoljih predstavlja dostopnost vode (vodna aktivnost), ki jo lahko zmanjšujejo, na primer visoke koncentracije topljencev v vodnih raztopinah (slana okolja) ali zamrznitev vode (polarna okolja). Kljub sovražnemu, negostoljubnemu okolju pa lahko v takih pogojih (pre)živijo številni mikroorganizmi, med njimi so kot pomembni predstavniki teh mikrobnih združb tudi glive. Glive skrajnostnih okolij kot evkarionti predstavljajo obetajoče modelne organizme za proučevanje mehanizmov prilagoditev na stres. Razumevanje teh prilagoditev pa nam lahko pomaga pri povečanju tolerance za stres ekonomsko pomembnih organizmov, od poljščin do industrijskih evkariontskih mikroorganizmov. Pri proučevanju prilagoditev gliv na stres je pogost korak priprava gensko spremenjenih mikroorganizmov z metodami molekulskega kloniranja. V našem laboratoriju kot prejemna (gostiteljska) organizma tuje DNA večinoma uporabljamo bakterijo Escherichia coli in kvasovko Saccharomyces cerevisiae kot lahko gojljiva, hitro rastoča mikroorganizma, za katera obstaja velik nabor molekulskih orodij in laboratorijskih tehnik. Še pred razvojem sekvenciranj naslednjih generacij smo za iskanje in študij genov, povezanih s povišano toleranco za stres (večinoma na povišane koncentracije soli) uporabljali genomske in cdnaknjižnice, kjer smo fragmente DNA razrezanega genoma oz. cdna ligirali v vektor, tako pripravljeno knjižnico nato namnožili v E. coli in nato z označenimi sondami iskali tarčne gene (primeri: komponente poti HOG, encimi za modifikaciji maščobnih kislin, glicerolni transporterji ). Sledila je uporaba metodologije funkcionalnega presejanja, kjer smo za identifikacijo genov, vpletenih v povišano toleranco za stres, pripravili ekspresijske knjižnice cdna ekstremotolerantnih gliv v S. cerevisiae, čemur je sledilo pregledovanje teh knjižnic in iskanje transformant s pridobljeno funkcijo (angl. gain-of-function). V zadnjem času potencialne tarčne gene, identificirane na osnovi sekvenciranega genoma, izrazimo v gostiteljskem organizmu in nato spremljamo njihovo funkcijo pri različnih skrajnostnih pogojih. KLJUČNE BESEDE: ekstremofilne glive, ekstremotolerantne glive, funkcionalno presejanje, toleranca za stres. 1. UVOD Še nekaj desetletij nazaj smo smatrali, da v določenih okoljih zaradi nepremostljivih fizikalno-kemijskih ovir življenje ni mogoče. Tako imenovana skrajnostna (ekstremna) okolja naj bi bila praktično sterilna. Za to domnevo se je pokazalo, da ne drži in da je življenje prisotno v vseh okoljih, kjer je voda v tekočem stanju. Odkrili so številne bakterije, arheje pa tudi evkariontske organizme v teh skrajnostnih okoljih in jih zaradi njihove rasti pri teh pogojih poimenovali ekstremofili. To odkritje, skupaj z novimi podatki o preživetju mikroorganizmov v vesolju, namiguje na dejstvo, da je življenje bolj običajno, kot se je prej domnevalo in najbrž ni omejeno le na Zemljo (Rothschild in Mancinelli, 2001). Med skrajnostna (ekstremna) okolja (slika 4-1) bi lahko šteli tista, kjer so abiotski dejavniki nad ali pod določenimi vrednostmi in je tako zaradi ostrih pogojev življenja prisotnih le malo vrst organizmov. Ti ekstremni dejavniki so lahko fizikalni (temperatura, sevanje, pritisk, električni tok) ali kemijski (slanost, izsušitev, ph, kisikovi radikali, toksične kovine, kot so Zn, Co, Cd, Hg, Pb, As, in druge toksične spojine, organska topila). Z antropocentričnega vidika tako na primer ekstremna okolja označujejo temperature, ki so višje od 40 C ali nižje od 10 C, ph-vrednosti, ki so višje od 9 ali nižje od 5, višja slanost od 3,5 % 37

46 NaCl (m/v), nizka vsebnost kisika, tlak, ki je višji od 1 atmosfere, in vodna aktivnost (a w ), ki je nižja od 0,95. A B C D Slika 4-1: Skrajnostna okolja. A. Ledenik Upsala (Patagonija, Argentina). B. Vroči vrelec Punch Bowl Spring (Yellowstone, Wyoming, ZDA). C. Puščavska planota Giza pri Kairu (Egipt). D. Sečoveljske soline (Slovenija, foto M. Černigoj). Vodna aktivnost, ki predstavlja dostopnost vode za organizem, je eden ključnih omejujočih dejavnikov uspevanja organizmov v skrajnostnih okoljih. Visoke koncentracije topljencev v vodnih raztopinah zmanjšujejo dostopnost vode. Pri vodni aktivnosti a w = 0,85 uspevajo izključno ekstremofilni organizmi. Vodna aktivnost a w = 0,85 recimo ustreza 17-odstotni koncentraciji raztopine NaCl (približno 3 M NaCl), ki je kot topljenec v naravi pogosto prisoten. Poleg vodne aktivnosti vpliva na to, kateri organizmi bodo v takem okolju prisotni, tudi kemična sestava slane vode in toksičnost nekaterih ionov (Horikoshi in sod., 2011; Rothschild in Mancinelli, 2001; Javor, 1989). Organizem, ki uspeva samo v okolju z določenim skrajnostnim fizikalno-kemijskim dejavnikom, je torej ekstremofilen. Če je teh ekstremnih dejavnikov več, govorimo o poliekstremofilnih organizmih. Če pa organizmi skrajnostne pogoje le prenašajo (ne rastejo pa optimalno pri njih), jih označujemo kot ekstremotolerantne (Horikoshi in sod., 2011; Rothschild in Mancinelli, 2001). 2. GLIVE V SKRAJNOSTNIH OKOLJIH Prvotna odkritja prokariontskih mikroorganizmov v skrajnostnih okoljih so vodila do mišljenja, da lahko v takih okoljih uspevajo samo arheje in bakterije, evkarionti pa ne. Ta domneva se je ne tako dolgo nazaj pokazala za napačno, kmalu so odkrili tako ekstremofilne kot ekstremotolerantne evkariontske organizme, med katerimi so bile številne glive. Iz okolij s povišano slanostjo so tako na primer izolirali številne kserofilne, halofilne in halotolerantne glive iz redov Wallemiales (Basidiomycota), Capnodiales, 38

47 Dothideales in Eurotiales (Ascomycota) (Gunde-Cimerman in sod., 2000; Gunde-Cimerman in sod., 2009). Med njimi so bile med drugim tako melanizirane črne kvasovkam podobne glive, kot sta Aureobasidium pullulans (Zalar in sod., 1999; Zalar s sod, 2008) in Hortaea werneckii (Zalar in sod., 1999), kot tudi kserofilne in halofilne glive rodu Wallemia (Zalar in sod., 2005, Jančič in sod. 2015) (slika 4-2). Tudi v zelo hladnih okoljih z nizko vodno aktivnostjo (zaradi tvorbe kristalov ledu) so izolirali številne glive, tako filamentozne kot kvasovke, med kvasovkami pa so prevladovale bazidiomicetne kvasovke rodov Cryptococcus in Rhodotorula (Zalar in Gunde-Cimerman, 2014; Butinar in sod., 2007). A B C D cm Slika 4-2: Glive, izolirane iz izjemno slanih okolij. A. Poliekstremotolerantna gliva Aureobasidium pullulans na definiranem gojišču YNB. B. Ekstremno halotolerantna gliva Hortaea werneckii na definiranem gojišču YNB s 17 % NaCl (m/v). C. Halofilna gliva Wallemia ichthyophaga na definiranem gojišču YNB s 17 % NaCl (m/v). D. Kristal halita z vraščeno glivo Wallemia ichthyophaga (foto C. Gostinčar) PRILAGODITVE GLIV NA SKRAJNOSTNA OKOLJA Da bi preživeli v takih skrajnostnih okoljih, so se tako pri evkariontih kot prokariontih razvile številne morfološke, fiziološke in biokemijske prilagoditve, ki jim omogočajo soočanje z osmotskim in ionskim stresom, temperaturnimi spremembami, s povišano intenziteto svetlobe in nihanji v koncentracijah kisika in ostalih plinov. Raziskave ekstremofilnih evkariontov so bile v preteklosti dokaj zapostavljene v primerjavi z prokariontskimi ekstremofili (Horikoshi in sod., 2011). Zato so glive skrajnostnih okolij tako pomembne in jih lahko obravnavamo kot obetavne modelne organizme za proučevanje evkariontskih mehanizmov prilagoditev na stres. Toleranca za stres je rezultat številnih prilagoditev od strukture celic (sestava membran, celična stena, melanizacija celične stene ) do celičnih procesov (signalizacija, transportni sistemi, metabolizem ozmolitov ) (Gostinčar in sod., 2011; Gostinčar in sod., 2015; Plemenitaš in sod., 2014). 39

48 Za razumevanje prilagoditev na povišano koncentracijo soli in na nizke temperature v našem laboratoriju kot modelne organizme uporabljamo glive, izolirane iz slanih okolij (askomicetni glivi Aureobasidium pullulans in Hortaea werneckii in bazidiomicetno Wallemia ichthyophaga) ter glive, izolirane iz hladnih okolij ledeniškega ledu (bazidiomicetni kvasovki Cryptococcus liquefaciens in Rhodotorula mucilaginosa). Vsaka uspeva v drugačnemu koncentracijskemu razponu soli in ima drugačen temperaturni razpon (kardinalne temperature) rasti (slika 4-3). Slika 4-3: Temperaturni in slanostni razpon rasti izbranih ekstremofilnih oz. ekstremotolerantnih gliv. Razumevanje prilagoditev ekstremofilnih in ekstremotolerantnih gliv na skrajnostna okolja pa nam lahko pomaga pri povečanju tolerance za stres ekonomsko pomembnih organizmov, tako poljščin kot tudi industrijskih evkariontskih mikroorganizmov. 3. RAZISKAVE PRILAGODITEV GLIV NA SKRAJNOSTNA OKOLJA Pri proučevanju prilagoditev na stres nekonvencionalnih organizmov, kot so ekstremofilne in ekstremotolerantne glive, kmalu naletimo na prepreke, ko želimo karakterizirati produkt nekega neznanega gena ali najti gene, ki so odgovorni za določeno lastnost, pa nimamo molekularnih orodij za to (plazmidi, mutante z odstranjenimi geni in podobno). V takšnem primeru lahko uporabimo prejemne (gostiteljske) organizme, v katere vključimo DNA ali gene iz gliv, ki jih proučujemo, in si tako pomagamo pri identifikaciji genov oz. njihovih funkcij. Večinoma uporabljamo standardna modelna organizma, bakterijo Escherichia coli in kvasovko Saccharomyces cerevisiae, ki sta dobro proučena in hitro rastoča mikroorganizma, za katera obstaja širok nabor molekulskih orodij in laboratorijskih tehnik. Lahko pa uporabimo tudi druge dobro proučene glivne modele, kot so Aspergillus nidulans, Candida albicans, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe in Komagataella (Pichia) pastoris. 40

49 Tako smo uporabili različne metode iskanja genov, ki prispevajo k toleranci za stres in bi lahko bili biotehnološko zanimivi METODA ISKANJA TARČNIH GENOV Še pred razvojem različnih tehnologij sekvenciranja naslednje generacije smo za iskanje in študij genov, povezanih s povišano toleranco za stres (večinoma na povišane koncentracije soli), pripravili in uporabljali genomske in cdna-knjižnice (slika 4-4). Slika 4-4: Metoda iskanja tarčnih genov. Iz donorskega organizma, ki smo ga gojili pri ustreznih pogojih, smo najprej izolirali DNA ali RNA. V primeru DNA smo nato nadaljevali z restrikcijo in genomsko DNA razrezali na primerno velike fragmente (približno 2 kb). Izolirano RNA pa smo reverzno prepisali v cdna. Fragmente razrezane genomske DNA oz. cdna smo ligirali v vektor (bakteriofag), nato pa tako pripravljeno knjižnico s transdukcijo vnesli v gostiteljske celice E. coli in jo tako pomnožili (ojačili). Nato smo določili titer tako pripravljene knjižnice v bakteriofagu. Za iskanje tarčnih genov smo najprej pripravili sonde DNA (krajši fragmenti DNA, zelo podobni iskanemu genu, ki smo jih pripravili na osnovi primerjave sorodnih genov sorodnih gliv), nato smo jih označili z radioaktivnim fosforjem ali pa z digoksigeninom. Potem smo celice bakterije E. coli 41

50 inficirali s bakteriofagi knjižnice in jih nacepili na plošče trdnega gojišča, po inkubaciji in nastanku plakov pa smo le-te odtisnili in jih tako prenesli na nitrocelulozno membrano. Membrano smo nato uporabili v analizi odtisa po Southernu, kjer smo z označenimi sondami iskali podobna DNA-zaporedja tarčnih genov na membrani. Ko smo ugotovili, v katerem plaku se nahaja iskani gen, smo iz plaka eluirali fag, iz njega pomnožili vstavljen fragment gena z verižno reakcijo s polimerazo in nato s sekvenciranjem določili njegovo nukleotidno zaporedje. Ob dobljenem nukleotidnem zaporedju celotnega gena smo ga prenesli v ustrezen plazmid in vstavili v kvasovko S. cerevisiae ter nato preverjali lastnosti tako pripravljene transformante pri različnih pogojih rasti. Na ta način smo pri ekstremofilnih modelnih glivah določili komponente signalne poti odziva na povišano osmolarnost (pot HOG) (Turk in Plemenitaš, 2002; Lenassi in Plemenitaš, 2007; Fettich in sod., 2011), desaturaze in elongaze maščobnih kislin (Gostinčar in sod., 2009) ter še nekatere encime, kot je na primer 3'-fosfoadenozin-5'-fosfataza (Vaupotič in sod., 2007). Za protein 3'-fosfoadenozin-5'-fosfatazo so ugotovili, da poveča toleranco za sol pri glivah (Vaupotič in sod., 2007), zato so želeli to domnevo preveriti tudi pri rastlinah. Fragment tega proteina so vstavili v rastlinski modelni organizem Arabidopsis thaliana in ugotovili, da se je toleranca za sol pri transgenih rastlinah povečala (Buh Gašparič in sod., 2013). Za identifikacijo genov, ki se diferencialno izražajo pri različnih stresnih pogojih, se pri raziskavah ekstremofilnih gliv uporabljali tudi nekatere druge metode. Tako so za določitev, kateri geni se diferencialno izrazijo pri H. werneckii ob povišani in znižani slanosti, uporabili metodi supresijske subtrakcijske hibridizacije (Vaupotič in Plemenitaš, 2007) in pa diferencialni prikaz restrikcijskih fragmentov (angl. restriction fragment-differential display) (Petrovič in sod., 2002) METODA FUNKCIONALNEGA PRESEJANJA Ker je metoda iskanja tarčnih genov relativno zamudna, iščemo namreč vsak gen posebej, smo razvili metodologijo funkcionalnega presejanja. Pri tej zmogljivi metodi lahko s presejalnim testom najdemo več genov, ki so vpleteni v povišano toleranco za stres in bi lahko bili biotehnološko zanimivi. Pripravili smo ekspresijske knjižnice cdna ekstremotolerantnih gliv v kvasovki S. cerevisiae, čemur je sledilo presejanje teh knjižnic in iskanje transformant s pridobljeno funkcijo (angl. gain-of-function) (slika 4-5). Tudi tu smo iz donorskega organizma, ki smo ga gojili pri ustreznih stresnih pogojih, najprej izolirali RNA. To RNA smo nato reverzno prepisali v cdna in pripravili klonsko knjižnico cdna v vektorskem prenašalnem plazmidu. Knjižnico smo nato namnožili (ojačili) v E. coli in jo prenesli v končni plazmidni vektor z mestnospecifično rekombinacijo, jo ponovno namnožili v E. coli in nato s transformacijo prenesli v S. cerevisiae. Tako dobljeno ekspresijsko knjižnico cdna v S. cerevisiae smo nato pregledovali pri različnih selekcijskih dejavnikih (nizka temperatura, različni topljenci, ki lahko inhibitorno delujejo na rast) in izolirali transformante s povečano toleranco za preučevani stres. Iz transformant smo nato izolirali plazmide, s PCR pomnožili in s sekvenciranjem določili nukleotidna zaporedja insertov cdna v njih ter te inserte identificirali. Za iskanje genov, odgovornih za povišano toleranco za sol in nizke temperature, smo pripravili ekspresijsko knjižnico cdna kvasovke Rhodotorula mucilaginosa v S. cerevisiae in nato iskali transformante, ki so lahko rasle pri povišani koncentraciji različnih soli oz. pri nizkih temperaturah ter na ta način identificirali gene, ki so bili za to odgovorni (Gostinčar in sod., 2012). 42

51 Slika 4-5: Metoda funkcionalnega presejanja GENOMSKE/TRANSKRIPTOMSKE METODE ISKANJA ZANIMIVIH GENOV Tretja metodologija, ki jo uporabljamo sedaj, pa je identifikacija potencialnih tarčnih genov na osnovi znanega genoma (rudarjenje genoma) oz. transkriptoma preučevanih organizmov, njihova pomnožitev in prenos v gostiteljski organizem (na primer v S. cerevisiae) ter nato presejanje transformant in njihova analiza, spremljanje njihovih funkcij pri različnih skrajnostnih pogojih (slika 4-6). Bioinformacijska analiza genomov in transkriptomov naših modelnih organizmov je pokazala, da imajo ekstremofilne in ekstremotolerantne glive številne prilagoditve, ki jim omogočajo uspevanje v skrajnostnih pogojih (Lenassi in sod. 2013; Zajc in sod., 2013; Gostinčar in sod., 2014). Primer za to metodo je identifikacija amilaz v genomih vrst Aureobasidium pullulans, A. subglaciale, A. melanogenum in A. namibiae, njihov prenos v S. cerevisiae in analiza izražanja. V genomih smo identificirali 2 3 alfa in 2 gama amilazi pri vsaki vrsti. Nukleotidna kodirajoča zaporedja genov za te amilaze smo pomnožili, jih z naključno mutagenezo z eppcr (napakam podvržena verižna reakcija s polimerazo) mutirali, da bi dobili amilaze z izboljšanimi lastnostmi, ter jih nato vstavili v ekspresijski in integracijski plazmid in s transformacijo prenesli v laboratorijske in industrijske seve S. cerevisiae. Najuspešnejše transformante smo izbrali glede na velikost kolonij in cone razgradnje škroba na 43

52 selektivnem gojišču s škrobom in potem še analizirali njihove lastnosti (fitnes) in sposobnost razgradnje različnih vrst škroba (Klofutar, 2015; Rozman, 2015). Slika 4-6: Genomske/transkriptomske metode iskanja zanimivih genov. 4. ZAKLJUČEK Raziskave ekstremofilov so privedle do napredka na številnih znanstvenih poljih od molekularne biologije (na primer termofilne DNA/RNA-polimeraze), evolucijske biologije (raznolikost življenja na zemlji) do biotehnologije. Biotehnološke raziskave ekstremofilov imajo tako velik komercialni potencial v agronomiji, kemijski, živilski in farmacevtski industriji ter pri bioremediaciji. Zaradi pomanjkanja molekularnih orodij in laboratorijskih tehnik za delo z nekonvencionalnimi mikroorganizmi je pri raziskavah ekstremofilov in njihovih prilagoditev na skrajnostna okolja potrebno biti bolj iznajdljiv. Tako je priprava gensko spremenjenih organizmov z vstavitvijo genov ekstremofilov v gostiteljske modelne organizme, kot sta bakterija E. coli in kvasovka S. cerevisiae, pri teh raziskavah lahko v veliko pomoč. 5. LITERATURA Buh Gašparič, M., Lenassi, M., Gostinčar, C., Rotter, A., Plemenitaš, A., Gunde-Cimerman, N., Gruden, K., Žel, J Insertion of a specific fungal 3'-phosphoadenosine-5'-phosphatase motif into a plant homologue improves halotolerance and drought tolerance of plants. PloS One 8: e Butinar, L., Spencer-Martins, I., Gunde-Cimerman, N Yeasts in high Arctic glaciers: the discovery of a new habitat for eukaryotic microorganisms. Antonie Van Leeuwenhoek 91:

53 Fettich, M., Lenassi, M., Veranič, P., Gunde-Cimerman, N., Plemenitaš, A Identification and characterization of putative osmosensors, HwSho1A and HwSho1B, from the extremely halotolerant black yeast Hortaea werneckii. Fungal Genet Biol 48: Gostinčar, C., Gunde-Cimerman, N., Grube, M Polyextremotolerance as the fungal answer to changing environments.. V: Bakermans, C. (ur.). Microbial evolution under extreme conditions, (Life in extreme environments, vol. 2). Berlin: De Gruyter, Gostinčar, C., Gunde-Cimerman, N., Turk, M Genetic resources of extremotolerant fungi: a method for identification of genes conferring stress tolerance. Bioresource Technol 111: Gostinčar, C., Lenassi, M., Gunde-Cimerman, N., Plemenitaš, A Fungal adaptation to extremely high salt concentrations. Adv Appl Microbiol 77: Gostinčar, C., Turk, M., Plemenitaš, A., Gunde-Cimerman, N The expressions of [delta]9-,[delta]12- desaturases and an elongase by the extremely halotolerant Hortaea werneckii are salt dependent. FEMS Yeast Res 9: Gostinčar, C., Ohm, R., Kogej, T., Sonjak, S., Turk, M., Zajc, J., Zalar, P., Grube, M., Sun, H., Han, J., Sharma, A., Chiniquy, J., Ngan, C.Y., Lipzen, A., Barry, K., Grigoriev, I., Gunde-Cimerman, N Genome sequencing of four Aureobasidium pullulans varieties: biotechnological potential, stress tolerance, and description of new species. BMC Genomics 15:1 28. Gunde-Cimerman, N. Ramos, J., Plemenitaš, A Halotolerant and halophilic fungi. Mycol Res 113: Gunde-Cimerman, N. Zalar, P., De Hoog, G.S., Plemenitaš, A Hypersaline waters in salterns: natural ecological niches for halophilic black yeasts. FEMS Microbiol Ecol 32: Horikoshi, K., Antranikian, G., Bull, A.T., Robb, F.T., Stetter, K.O Extremophiles handbook, Springer Japan, pp Jančič, S., Nguyen, H.D.T., Frisvad, J.C., Zalar, P., Schroers, H.-J., Seifert, K.A., Gunde-Cimerman, N A taxonomic revision of the Wallemia sebi species complex. PloS One 10: Javor, B Hypersaline environments: microbiology and biogeochemistry. Berlin Heidelberg New York London Paris Tokyo, Springer-Verlag. Klofutar, D Izboljšanje aktivnosti amilaze glive Aureobasidium pullulans z naključno mutagenezo: diplomsko delo. Ljubljana. 43 str. Lenassi, M., Gostinčar, C., Jackman S., Turk, M., Sadowski, I., Nislow, C., Gunde-Cimerman, N., Plemenitaš, A., in sod Whole genome duplication and enrichment of metal cation transporters revealed by De Novo genome sequencing of extremely halotolerant black yeast Hortaea werneckii. PloS one 8: Lenassi, M., Plemenitaš, A Novel group VII histidine kinase HwHhk7B from the halophilic fungus Hortaea werneckii has a putative role in osmosensing. Curr Genet 51: Petrovič, U., Gunde-Cimerman, N., Nina, Plemenitaš, A Cellular responses to environmental salinity in the halophilic black yeast Hortea werneckii. Mol Microbiol 45: Plemenitaš, A., Lenassi, M., Konte, T., Kejžar, A., Zajc, J., Gostinčar, C., Gunde-Cimerman, N Adaptation to high salt concentrations in halotolerant/halophilic fungi: a molecular perspective. V: Papke, R.T. (ur.). Proceedings of Halophiles 2013, (Frontiers in microbiology, Vol. 5). Lausanne: Frontiers Media 5: Rothschild, L.J., Mancinelli, R.L Life in extreme environments. Nature 409: Rozman, J Stabilno izražanje heterolognih glivnih amilaz v industrijskih sevih Saccharomyces cerevisiae: diplomsko delo. Ljubljana. 44 str. Turk, M., Plemenitaš, A The HOG pathway in the halophilic black yeast Hortea werneckii: isolation of the HOG1 homolog gene and activation of HwHog1p. FEMS Microbiol Lett 216: Vaupotič, T., Gunde-Cimerman, N., Plemenitaš, A Novel 3'-phosphoadenosine-5'-phosphatases from extremely halotolerant Hortaea werneckii reveal insight into molecular determinants of salt tolerance of black yeasts. Fungal Genet Biol 44: Vaupotič, T., Plemenitaš, A Differential gene expression and Hog1 interaction with osmoresponsive genes in the extremely halotolerant black yeast Hortaea wernecki. BMC Genomics 8: Zajc, J., Liu, Y., Dai, W., Yang, Z., Hu, J., Gostinčar, C., Gunde-Cimerman, N Genome and transcriptome sequencing of the halophilic fungus Wallemia ichthyophaga: haloadaptations present and absent. BMC Genomics 14: Zalar, P., De Hoog, G.S., Gunde-Cimerman, N Ecology of halotolerant dothideaceous black yeasts. V: De Hoog, G.S. (ur.). Ecology and evolution of black yeasts and their relatives. Stud Mycol 43: Zalar, P., De Hoog, G.S., Schroers, H.-J., Frank, J.M., Gunde-Cimerman, N Taxonomy and phylogeny of the xerophilic genus Wallemia (Wallemiomycetes and Wallemiales, cl. et ord. nov.). Antonie Van Leeuwenhoek 87:

54 Zalar, P., Gostinčar, C., De Hoog, G.S., Uršič, V., Sudhadham, M., Gunde-Cimerman, N Redefinition of Aureobasidium pullulans and its varieties. Stud Mycol 61: Zalar, P., Gunde-Cimerman, N Cold-adapted yeasts in Arctic habitats. V: Buzzini, P. (ur.), Margesin, R. (ur.). Cold-adapted yeasts: biodiversity, adaptation strategies and biotechnological significance. Berlin [etc.]: Springer Verlag

55 5. POGLAVJE O vinu, pivu in biogorivu GS-kvasovke Cene Gostinčar POVZETEK Gensko spreminjanje kvasovke Saccharomyces cerevisiae predstavlja priložnost za izboljšanje tako tradicionalnih postopkov njihove uporabe (vinarstvo, pivovarstvo) kot tudi novejših tehnologij (proizvodnja biogoriv). Odpor javnosti proti gensko spremenjenim organizmom je razvoj tega področja sicer deloma upočasnil, a številni rezultati vendarle pričajo o tem, da lahko z vnosom tuje DNA kvasovkam dodamo lastnosti, ki po eni strani izboljšajo sam proizvodni proces, po drugi pa tudi kvaliteto končnega izdelka. Viri genov, ki jih vstavimo v kvasovko, so teoretično povsem poljubni, v praksi pa zaradi filogenetske bližine logično izbiro predstavljajo druge glive. Nekatere od njih, zlasti glive iz ekstremnih okolij, predstavljajo ogromen in v veliki meri še neizkoriščen potencial za izboljšanje industrijsko pomembnih lastnosti S. cerevisiae, med drugim tudi za zelo zaželeno povečanje tolerance te kvasovke za stres. KLJUČNE BESEDE: Saccharomyces cerevisiae, fermentacija, pivovarstvo, vinarstvo, etanol, bioetanol, biogorivo. 1. UVOD Pekovska kvasovka Saccharomyces cerevisiae je s človekom povezana že tisočletja. Prvi zapisi pričajo o pridelavi vina na Kitajskem že pred 9000 leti, na sredozemskem območju Mediterana pa naj bi se začelo pred leti (McGovern in sod., 2004). Sodeč po najnovejših raziskavah so vrsto do pred približno leti sestavljale geografsko ločene in z gozdnimi sistemi povezane divje populacije, po udomačitvi kvasovke na območju vzhodnega Sredozemlja pa se je začela tudi selitev udomačenih sevov vzdolž človeških migracijskih poti (Eberlein in sod., 2015). Vinske kvasovke so zelo podobne divjim sevom s hrastovih dreves glede na filogenetske raziskave naj bi se ločitev populacij zgodila pred leti, kar ustreza tudi zgodovinskim virom o začetku vinarstva (Eberlein in sod., 2015). Kljub dolgi zgodovini uporabe S. cerevisiae je mikroorganizme in procese, ki sodelujejo pri nastanku vina, človek odkril šele v 19. in 20. stoletju. Antoine-Laurent de Lavoisier je prepoznal kemične reakcije fermentacije sladkorjev v etanol in ogljikov dioksid, Louis Pasteur pa biološko osnovo teh reakcij. Šele to je po tisočletjih tradicionalnih postopkov omogočilo, da so se začele vinarske tehnologije izboljševati na podlagi znanstvenih spoznanj (Eberlein in sod., 2015). Uporaba žveplanja, analitične kemije in dodajanje začetnih čistih kultur mikroorganizmov so pomenile prelom s starim načinom vinarstva in četudi so pogosto zbujale pomisleke, brez njih ne bi bilo vina, kot ga poznamo danes. Podobne pomisleke sproža tudi uporaba gensko spremenjenih (GS) kvasovk, le da je tu odpor pridelovalcev in javnosti morda še večji. Ob pogosto paničnih odzivih na uporabo gensko spremenjenih organizmov (GSO) v kmetijstvu in prehrani, ob pomanjkanju znanja in celo ob psevdoznanstvenih manipulacijah je genetsko inženirstvo v vinarstvu kljub drugačnim obljubam še vedno v povojih, povsem podobna pa je tudi zgodba v pivovarstvu. Edino v proizvodnji biogoriv je uporaba GS-kvasovk nekoliko bolje sprejeta. A ob velikih potencialih, ki jih ima uporaba GS-kvasovk tako v uveljavljenih kot tudi v novih biotehnoloških postopkih, in ob hkratnem hitrem kopičenju dokazov o varnosti takšne uporabe, si je težko zamisliti, da se ne bi prej ali slej zmanjšale ovire za napredek tudi na tem področju. 47

56 2. MODELNI ORGANIZEM Kvasovka S. cerevisiae (natančneje, njen laboratorijski sev S288c) je leta 1996 postala prvi evkariontski organizem z določenim celotnim nukleotidnim genomskim zaporedjem (Goffeau in sod., 1996). Seveda pa je že mnogo pred tem postala laboratorijski modelni organizem, nekakšna evkariontska ustreznica bakterije E. coli, s katero je delo bistveno lažje kot z modelnimi rastlinami in živalmi, pa vendar je slednjim vsaj na celični ravni hkrati precej bolj podobna kot bakterijam. Menjavo haploidnih in diploidnih generacij je pri kvasovkah opazil (in leta 1918 tudi objavil) že Jan Šatava, vendar so njegova opažanja zaradi objave v češkem jeziku ostala bolj ali manj neznana, dokler jih ni leta 1935 potrdil Øjvind Winge. Ta je skupaj z Ottom Laustsenom kasneje tudi uspešno izvedel prvo analizo tetrad askospor in pokazal, da dedovanje lastnosti v askosporah poteka po Mendlovih zakonih. Laustsen je izpopolnil metodo za izločitev in osamitev (disekcijo) askospor, ki je postala nepogrešljivo orodje genetike kvasovk. Leta 1943 sta Gertrude in Carl Lindegren odkrila paritvena tipa S. cerevisiae in ju poimenavala a in α, ugotovila pa sta tudi, da je vrsta heterotalična torej da obstajajo organizmi dveh relativno stabilnih paritvenih tipov vendar pa je v genomu zapis za oba paritvena tipa, zaradi česar lahko kvasovka svoj paritveni tip tudi spremeni (povzeto v Barnett, 2007). Genetika kvasovk je bila že od vsega začetka tesno povezana z biotehnološkim potencialom te vrste. Øjvind Winge je delal v Carlsbergovem laboratoriju na Danskem, kjer se je ukvarjal ne le s S. cerevisiae, temveč tudi z ječmenom in hmeljem, torej s ključnimi sestavinami za pivovarsko dejavnost svojega delodajalca sta Winge in Laustsen objavila prvega v vrsti člankov o genetiki metabolizma sladkorjev. Kmalu po ugotovitvi, da se v sposobnosti fermentacije nekaterih sladkorjev različni sevi S. cerevisiae (in sorodnih vrst) razlikujejo, pa so raziskovalci že pričeli te lastnosti s križanjem prenašati med sevi (Barnett, 2007). Že mnogi od zgodnjih (seveda pa tudi kasnejših) poskusov na S. cerevisiae so se ukvarjali s temami, katerih biotehnološko uporabnost je bilo enostavno uvideti. To dejstvo je skupaj s hitrim razvojem metod za delo s kvasovko S. cerevisiae botrovalo temu, da je ta vrsta še danes najbolje preučena od vseh gliv, čeprav je bilo mnogo raziskav v zadnjih letih opravljenih tudi na vrstah, kot so Schizosaccharomyces pombe, medicinsko pomembnih Candida albicans in Cryptococcus neoformans, za industrijo zanimivi Kluyveromyces lactis in drugih. Z razvojem molekulskega kloniranja in določitvijo celotnega genomskega zaporedja S. cerevisiae se je delo na tej kvasovki še pospešilo. Danes je priprava gensko spremenjenih kvasovk rutinsko delo, pa naj kvasovke pri tem služijo le kot orodje molekularnih biologov ali pa je cilj izboljšanje njihovih biotehnološko pomembnih lastnosti z genskim spreminjanjem. In četudi so laboratorijski sevi za eksperimentalno delo posebej prilagojeni in je zato delo z industrijskimi sevi težje, bi bili najverjetneje tudi GS-industrijski sevi v praksi že vsakdanji pojav, če tega ne bi preprečili strahovi javnosti pred GSO. Slika 5-1: Pekovska kvasovka S. cerevisiae in tetrade njenih haploidnih askospor. A. Vegetativne celice S. cerevisiae. B. Tetrade haploidnih askospor kvasovk, ki so nastale z mejozo. 48

57 3. VINARSTVO Vloga kvasovk S. cerevisiae v vinu še zdaleč ni omejena le na proizvodnjo etanola. Vplivajo tudi na količino preostalega sladkorja in arome, v določenih pogojih pa so odgovorne celo za nastanek zdravju škodljivih snovi. Vse to so področja, ki so bila v preteklih letih predmet intenzivnih raziskav. Eno od bolj presenetljivih je morda prizadevanje za zmanjšanje količine proizvedenega etanola. Zanj obstaja več razlogov. Koncentracija etanola v vinu je v zadnjih dvajsetih letih naraščala, delno zaradi pridelave bolj sladkih sort in kasnejših trgatev (predelava bolj zrelega grozdja izboljša aromo vina), morda pa tudi zaradi podnebnih sprememb (de Orduna, 2010). To po eni strani lahko povzroči težave že med fermentacijo: večje koncentracije sladkorjev in etanola so za kvasovke stresne in lahko zmanjšajo učinkovitost fermentacije, ovirajo pa tudi sekundarno bakterijsko fermentacijo jabolčne kisline (več o slednji v nadaljevanju). Po drugi strani imajo večje koncentracije etanola negativne posledice tudi na končni izdelek: občutno vplivajo na zaznavo arome vina, niso skladne z zdravstvenimi in cestnoprometnimi smernicami o zmanjšanju uživanja alkohola, v nekaterih državah pa vodijo tudi v višjo ceno vina zaradi povezave med koncentracijo alkohola in obdavčitvijo pijače (Tilloy in sod., 2015). Četudi je vino z manj etanola mogoče pridelati z uporabo sort grozdja z manj sladkorjev (ali žlahtnjenjem novih sort v ta namen), pa tudi z odstranjevanjem etanola po ferementaciji, je zmanjšanje z uporabo posebej za to prirejenih kvasovk bistveno cenejša, v nekaterih primerih pa tudi z vidika kvalitete končnega produkta boljša in zato bolj privlačna metoda (Tilloy in sod., 2015). Zmanjšano količino proizvedenega etanola je mogoče doseči s preusmeritvijo metabolizma v biomaso (pri čemer je težava omejena količina virov dušika v grozdnem moštu) ali v druge metabolite, zlasti glicerol. Slednji nastaja tudi med običajno fermentacijo (običajno so njegove koncentracije med 5 in 9 g/l). Glicerol lahko izboljša senzorične lastnosti vina, pa tudi ščiti kvasovke pred osmotskim stresom med fermentacijo, zato je njegova prisotnost celo zaželena. Povečano sintezo najlažje dosežemo s povečanim izražanjem glicerol-3-fosfat-dehidrogenaz GPD1 ali GPD2 (Nevoigt, 2008). Težava s tem pristopom je, da lahko poveča tudi (nezaželeno) nastajanje acetaldehida, ocetne kisline in acetoina. Seveda pa zmanjšanje količine etanola ni edini cilj žlahtniteljev. Uporaba kvasovke S. cerevisiae s pektinolitično aktivnostjo bi na primer omogočila boljše procesiranje grozdja in pospešila zbistritev mošta in vina. Pektini namreč ne le v vinu, temveč tudi v drugih vejah živilske industrije pogosto povzročajo težave zaradi povečane motnosti in viskoznosti sadnih sokov, s tem pa otežujejo njihovo ekstrakcijo, filtracijo in bistrenje. Gensko spremenjene kvasovke s pektinolitično aktivnostjo bi te težave vsaj delno odpravile in prednosti pektinolitičnih sevov potrjujejo tudi poskusi (Fernandez-Gonzalez in sod., 2005). Glede na status, ki ga vino uživa v družbi, in glede na pozornost, ki je posvečena tudi najmanjšim podrobnostim v njegovem vonju in okusu, najbrž ni presenetljivo, da je ena od tarč spreminjanja S. cerevisiae vpliv kvasovke na arome, prisotne v vinu. Te so seveda v veliki meri odvisne od uporabljenega grozdja, ne pa izključno. In vloga kvasovk v oblikovanju vinske cvetice se utegne v prihodnosti še povečati. Četudi terpenoli bistveno vplivajo na aromo vina, kvasovka S. cerevisiae ni posebno učinkovit producent monoterpenov, saj nima sintaz monoterpenov. A z dodatkom gena za S-linalool-sintazo se izoprenoidna biosintezna pot kvasovke bistveno spremeni. Poskusi so pokazali, da spremenjen sev kvasovke proizvaja linalool v koncentracijah, ki jih zazna tudi človek (Herrero in sod., 2008). Pri sortah grozdja, ki imajo monoterpenov dovolj, le da so ti vezani na sladkorje in zato brez okusa, je mogoče aromo izboljšati tudi z dodajanjem encimov, ki prekinejo vez v monoterpenil-glikokonjugatih in sprostijo aromatične terpene ali pa z uporabo GS-kvasovk s tovrstno encimsko aktivnostjo (Schuller in Casal 2005). 49

58 Poleg glavne fermentacije (pretvorbe) sladkorjev v etanol, za katero je v večji meri odgovorna kvasovka S. cerevisiae, je za kvaliteto vina bistvena tudi že zgoraj omenjena mlečnokislinska fermentacija jabolčne kisline, s katero se jabolčna kislina pretvori v mlečno kislino in ogljikov dioksid. Fermentacija je bistvena za zmanjšanje kislosti in povečanje stabilnosti vina, zanjo pa je odgovorna bakterija Oenococcus oeni. Vendar potek te fermentacije ni vedno idealen. Učinkovitost bakterije lahko zmanjšajo številni dejavniki, od previsokih koncentracij etanola, nizkega ph, nizkih temperatur, do tekmovanja s kvasovkami in drugimi bakterijami, pomanjkanja hranil in drugih dejavnikov. Prisotnost drugih bakterijskih vrst lahko vodi tudi v kopičenje toksičnih snovi, kot so biogeni amini (Husnik in sod., 2006). Ob vsem naštetem so predosti kvasovke, ki bi bila hkrati sposobna etanolne fermentacije in mlečnokislinske fermetnacije jabolčne kisline, za vinarje več kot očitne. Takšno kvasovko so pridobili z vstavitvijo gena za malatpermeazo (mae1) iz Schizosaccharomyces pombe in malolaktičnega gena (mlea) iz O. oeni. Nastali sev ML01 je postal prva GS-kvasovka v komercialni uporabi in je že leta 2005 v ZDA in Kanadi dobil oznako GRAS (splošno prepoznan kot varen; angl. generally regarded as safe) (Husnik in sod., 2006). In nazadnje, če že omenjamo nevarnost nastajanja toksičnih snovi v vinu, povejmo, da so GS-kvasovke ena od možnih rešitev tudi na tem področju. Urea in etanol v vinu lahko reagirata v potencialno rakotvoren etilkarbamat. GS-sev kvasovke s povečanim izražanjem gena DUR1,2 pa ureo pretvori, še preden se izloči iz celic in nato namesto tega izloči amonijak, s tem pa kvasovka odstrani pogoje za nastajanje etilkarbamata (Coulon in sod., 2006). Seveda se tudi ob uporabi GS-kvasovk pojavljajo podobni pomisleki, kot ob drugih gensko spremenjenih organizmih, zlasti o varnosti za ljudi ob uporabi v prehranski industriji, in o morebitnih tveganjih ob sproščanju v okolje. Ko govorimo o sproščanju v okolje, moramo nedvomno upoštevati, da je S. cerevisiae mikroorganizem, hkrati pa moramo poznati njeno biologijo in način uporabe. V vinarstvu je tako po eni strani uporaba kvasovk bolj omejena (na prostor, v katerem poteka fermentacija) v primerjavi z GSrastlinami na poljih, po drugi strani pa je hipotetično širjenje mikroorganizma v okolje bistveno težje nadzorovati, kot to velja za rastline. Ob tem ni nepomemben podatek, da je kvasovka S. cerevisiae v naravi izjemno redka in se pojavlja le v zelo specifičnih pogojih. Tveganja sproščanja GS-kvasovk v okolje je skušalo ovrednotiti več raziskav, ki niso potrdile razlogov za strah (Perez-Torrado in sod., 2015). Izkazalo se je namreč, da je širjenje komercialnih sevov kvasovk omejeno na bližnjo okolico vinske kleti ( m), pa še to le v času vrenja mošta, v ostalih delih leta pa njihove prisotnosti ni bilo mogoče dokazati (Valero in sod., 2005). Poskusi na vinogradih v rastlinjakih so pokazali, da celo GS-kvasovke, ki bi utegnile imeti zaradi vnesenih lastnosti selekcijsko prednost, niso iz okolja izrinile niti ne-gs-kvasovk niti drugih mikroorganizmov (Perez-Torrado in sod., 2015). Varnost uživanja vina, pridelanega s pomočjo GS-kvasovk, je mogoče obravnavati podobno kot ostalo hrano, ki vsebuje gensko spremenjene sestavine. Kljub dolgoletni prisotnosti in številnim raziskavam ni resnih in znanstveno preverljivih študij, ki bi kazale, da je uživanje hrane z GS-sestavinami bolj tvegano od hrane, pridelane na konvencionalen način. Poleg tega se je gensko spreminjanje kvasovk v odziv na izražene zadržke javnosti spremenilo, tako da je možnost očitanih hipotetičnih (a nikoli dokazanih) tveganj še dodatno zmanjšalo. V ta namen je količina vnesene tuje DNA, kolikor je mogoče majhna, genetska stabilnost je večja zaradi vključevanja v genomsko DNA kvasovk (namesto kloniranja v plazmidih), selekcijske označevalce z odpornostjo proti antibiotikom pa se nadomešča z drugimi ali pa se jih iz kvasovke po uspešni vključitvi želenega fragmenta DNA odstrani (Cebollero in sod., 2007). 50

59 4. PIVOVARSTVO Pri uporabi GS-kvasovk v pivovarstvu naletimo na načelni ravni na podobne strahove, vprašanja in rešitve kot v vinarstvu. Značilnosti, ki naj bi jih imela idealna pivovarska kvasovka, pa so seveda specifične. Ena od teh je proizvodnja nizkokaloričnega piva. Ječmenov slad vsebuje več ogljikovih hidratov, ki jih običajna kvasovka S. cerevisiae ni sposobna razgraditi, na primer dekstrinov ali škroba (Hammond, 1995). Ti ogljikovi hidrati so zato prisotni tudi v pivu in zvišujejo njegovo kalorično vrednost. Sevi kvasovk, v katerih izrazimo gene za ustrezne encime, takšne sestavljene sladkorje razgradijo v enostavne (v opisanem primeru jih lahko z glukoamilazo razgradimo do glukoze) in uporabijo v svojem metabolizmu (Park in sod., 2014). Industrijsko zanimivi bi bili tudi sevi kvasovk z zmanjšano proizvodnjo diacetila, ki v pivu nastaja iz α- acetolaktata in lahko negativno vpliva na aromo piva (Steensels in sod., 2012). A čeprav se, kot smo videli, zahteve pivovarjev in vinarjev v mnogočem razlikujejo, so med njimi tudi stične točke in ena od njih je želja po zmanjšanju količine etanola v pijači. Povpraševanje po pivu z manj (ali brez) alkohola tudi v tem primeru narašča zaradi zdravstvenih, zakonskih (vožnja pod vplivom alkohola) in davčnih razlogov. A podobno, kot pri vinu, so tudi pri pivu trenutno uporabljane metode proizvodnje piva z manj alkohola pomanjkljive. Bodisi gre za manipulacije same fermentacije ali pa odstranjevanje etanola po fermentaciji, proizvedeno pivo pa ima posledično neprijeten priokus ali pa premalo arome. Tudi v tem primeru je uporaba seva S. cerevisiae, ki namesto dela etanola proizvede povečano količino glicerola, najbolj obetavna metoda za proizvodnjo nizkoalkoholne pijače (Nevoigt in sod., 2002). 5. BIOGORIVA Bioetanol je eno ključnih biogoriv in večinoma ga še vedno proizvajamo s kvasovko S. cerevisiae, četudi je za ta namen vse prej kot idealna (a vendarle boljša od alternativ). Njene pomanjkljivosti so se pokazale že pri pridelavi prve generacije biogoriv: biogoriv, pridobljenih iz poljščin, v primeru proizvodnje bioetanola zlasti iz pridelkov, bogatih s sladkorji (sladkorni trs) in škrobom (koruza). Če je S. cerevisiae odlična za fermentacijo glukoze in saharoze, pa so njene zmogljivosti pri drugih substratih močno omejene. Že fermentacija škroba ni mogoča, ne da bi ga prej razgradili z mešanico amilaz ali pa amilaze izrazili kar v sami GS-kvasovki (van Zyl in sod., 2012). Še na večje težave naletimo pri drugi generaciji biogoriv. Ta se uveljavljajo, ker je pridelavo prve generacije, ki v gorivo predeluje kmetijske pridelke in s tem posega v proizvodnjo hrane ter krme, etično težko upravičiti. Druga generacija biogoriv zato temelji na obnovljivih surovinah, ki hkrati niso niti hrana za ljudi, niti krma živali. Tipičen primer takšnega substrata je lignocelulozni material. A na žalost je celulozo, hemicelulozo, še posebno pa lignin, bistveno težje razgraditi na produkte, ki jih lahko kvasovka S. cerevisiae fermentira v etanol. Kljub različnim metodam razgradnje, od fizikalnih in kemijskih do encimskih, te ostajajo precejšnja ovira za proizvodnjo bioetanola. Hkrati pa proizvedejo fermentacijsko osnovo, ki je za življenje kvasovke vse prej kot idealna. Poleg številnih stresnih dejavnikov so težava tudi visoke koncentracije različnih inhibitorjev rasti, ki se sprostijo ob razgradnji lignoceluloznih materialov ali med industrijskim procesom (med drugim visokih koncentracij ocetne kisline in NaCl). Največje težave pa nismo še niti omenili: to je neučinkovitost kvasovke S. cerevisiae v fermentaciji pentoz (Kim in sod., 2013). Pentoze, zlasti ksiloza in arabinoza, predstavljajo velik delež sladkorjev v razgrajeni lignocelulozni biomasi (delež ksiloze je tipično med % (Mosier in sod., 2005)). Zato je pridobitev seva kvasovke S. 51

60 cerevisiae, ki bi te sladkorje učinkovito fermentiral v etanol, eden od ključnih izzivov v proizvodnji goriv druge generacije, ki so se ga lotili že mnogi in z različnimi metodami. A četudi so nabor substratov, ki jih lahko metabolizira kvasovka S. cerevisiae, poskušali s križanjem povečati že v zgodnjih raziskavah pekovske kvasovke (Barnett, 2007), je na področju fermentacije pentoz uspeh konvencionalnih metod žlahtnjenja ostal močno omejen. Tudi v tem primeru se je izkazalo, da je genetsko inženirstvo možna rešitev prej domala nepremostljive težave. A tudi v tem primeru rešitev še zdaleč ni enostavna. Učinkovite fermentacije pentoz namreč ni mogoče doseči z manipulacijo enega ali dveh genov. V študiji, ki so jo izvedli Demeke in sod. (2013), so na primer v industrijski sev kvasovke S. cerevisiae vstavili kaseto kar trinajstih transgenov, vključno z genom za D-ksilozno izomerazo in encimi pentoza-fosfatne poti iz bakterije Clostridium phytofermentans. S tem so količino proizvedenega etanola iz lignoceluloznega hidrolizata povečali za kar 32 % (Demeke in sod., 2013). 6. GLIVE IZ EKSTREMNIH HABITATOV KOT VIR GENOV ZA IZBOLJŠANJE LASTNOSTI S. cerevisiae Že z zgornjim kratkim pregledom uporabe kvasovke S. cerevisiae v različnih industrijskih panogah smo ugotovili, da je idealna kvasovka vinarjev precej drugačna od želja pivovarjev ali celo proizvajalcev bioetanola. Medtem ko prvi in drugi želijo zmanjšati delež proizvedenega etanola, je cilj slednjih ravno obraten. In če je vpliv kvasovk na aromo fermentiranega proizvoda za prve in druge ključen (pri čemer se tudi med njimi želena aroma razlikuje), je za slednje to seveda lastnost, ki še zdaleč ni bistvena. A vse tri panoge imajo tudi skupno točko: v vseh treh primerih proizvodnemu procesu koristi dobra toleranca kvasovk za stres (Steensels in sod., 2012; Li in sod., 2015; Perez-Torrado in sod., 2015). Toleranca za stres ni enostavna lastnost. Dolgo je veljalo, da se mehanizmi tolerance med različnimi vrstami stresa bistveno razlikujejo. A preučevanje na številne strese tolerantnih vrst gliv kaže, da osnovne prilagoditve ostajajo presenetljivo podobne, od sinteze zaščitnih molekul z nizko molekulsko maso do zaščite pred reaktivnimi kisikovimi spojinami (Gostinčar in sod., 2015). Nekatere glive, med katerimi še zlasti izstopajo melanizirane (t. i. črne) glive, so razvile sposobnost prilagajanja na ekstremne razmere, v katerih propade večina živih bitij (Gunde-Cimerman in sod., 2000; Butinar in sod., 2007; Gostinčar in sod., 2010; Gostinčar in sod., 2012b). Ekstremofilne in ekstremotolerantne glive so odličen vir genov za izboljšanje tolerance za stres pri kvasovki S. cerevisiae, med drugim tudi zato, ker so pekovski kvasovki sorodne bolj kot drugi potencialni donorji (zlasti bakterije ali arheje). Raziskave molekularnih mehanizmov tolerance za stres so pokazale, da so prilagoditve večplastne in segajo od senzorskih sistemov za zaznavanje okolja (Lenassi in Plemenitaš, 2007; Konte in Plemenitaš, 2013) do sinteze majhnih zaščitnih molekul (Managbanag in Torzilli, 2002; Kogej in sod., 2006; Gostinčar in sod., 2012b), prilagoditve sestave membrane (Gostinčar in sod., 2009; Turk in sod., 2004; Turk in sod., 2007), melanizacije in strukturnih sprememb celične stene (Kogej in sod., 2004; Kogej in sod., 2007; Kralj Kunčič in sod., 2010) ter vzdrževanja znotrajceličnega ionskega ravnovesja (Kogej in sod., 2005). Poskusi na kvasovki S. cerevisiae in celo rastlinah so pokazali, da lahko (v nasprotju s pričakovanji) en sam protein (3'-fosfoadenozin-5'-fosfataza), še več, celo en sam aminokislinski motiv iz homologa tega proteina v za stres tolerantnih glivah do neke mere izboljša toleranco organizma za sol (Vaupotič in sod., 2007; Buh Gašparič in sod., 2013). Podobno spodbudne rezultate je dala posebej v ta namen prilagojena visoko zmogljiva metoda za identifikacijo biotehnološko zanimivih genov iz ekstremotolerantnih gliv. Z izdelavo ekspresijske knjižnice cdna za stres tolerantnih gliv v kvasovki Saccharomyces cerevisiae in presejanjem za transformante, ki so pridobile zmožnost rasti v stresnih pogojih, je bilo mogoče določiti več 52

61 genov iz halotolerantne kvasovke Rhodotorula mucilaginosa, ki so povečali toleranco za sol pri kvasovki S. cerevisiae (Gostinčar in sod., 2012a). Velik korak naprej v tovrstnih raziskavah pomenijo tudi določitve nukleotidnih zaporedij celotnih genomov, ki so zaradi tehnološkega napredka danes mogoče tudi v primeru preučevanja nekonvencionalnih organizmov in brez milijonskih denarnih vložkov. Primerjalna genomika je na primer pokazala na številne prilagoditve ektremno tolerantnih gliv na ekstremne razmere (Lenassi in sod., 2013; Zajc in sod., 2013; Gostinčar in sod., 2014). Pa tudi na druge značilnosti teh gliv: za črno kvasovko Aureobasidium pullulans (in sorodne vrste) se je denimo izkazalo, da vsebuje izjemno število genov za zunajcelične encime, vključno s tremi geni za α-amilaze in tremi geni za γ-amilaze (Gostinčar in sod., 2014). Vse to so geni, ki imajo pomemben potencial za izboljšanje industrijskih sevov S. cerevisiae. 7. ZAKLJUČEK Kvasovka S. cerevisiae sodi med najstarejše in najpogosteje uporabljene mikroorganizme v biotehnologiji. Po tisočletjih uporabe in nenamernega žlahtnjenja v tradicionalnih postopkih nam danes razvoj mikrobiologije, genetike, genomike, biotehnologije in genetskega inženirstva omogočajo načrtno žlahtnjenje za uporabo v posameznih industrijskih panogah. Različne uporabe namreč zahtevajo kvasovke z različnimi lastnostmi in za nekatere od teh lastnosti se je izkazalo, da v praksi lahko uvedemo le z genskim inženiringom. Seveda pa moramo imeti za to na voljo ustrezne vire genov, ki jih vstavimo v kvasovko S. cerevisiae. Čeprav so druge glivne vrste med različnimi možnimi viri logična izbira, so zlasti nekonvencionalne vrste kvasovk in filamentoznih gliv na tem področju še vedno zapostavljene. A s hitrim napredkom, zlasti na področju genomike, se tudi to stanje hitro spreminja. 8. LITERATURA Barnett, J. A A history of research on yeasts 10: foundations of yeast genetics. Yeast 24: Buh Gašparič, M., Lenassi, M., Gostinčar, C., Rotter, A., Plemenitaš, A., Gunde-Cimerman, N., Gruden, K., Žel, J Insertion of a specific fungal 3 '-phosphoadenosine-5 '-phosphatase motif into a plant homologue improves halotolerance and drought tolerance of plants. Plos One 8: e Butinar, L., Spencer-Martins, I., Gunde-Cimerman, N Yeasts in high Arctic glaciers: the discovery of a new habitat for eukaryotic microorganisms. Antonie Van Leeuwenhoek 91: Cebollero, E., Gonzalez-Ramos, D., Tabera, L., Gonzalez, R Transgenic wine yeast technology comes of age: is it time for transgenic wine? Biotechnol Lett 29: Coulon, J., Husnik, J. I., Inglis, D. L., van der Merwe, G. K., Lonvaud, A., Erasmus, D. J., van Vuuren, H. J. J Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae to minimize the production of ethyl carbamate in wine. Am J Enol Viticult 57: de Orduna, R. M Climate change associated effects on grape and wine quality and production. Food Res Int 43: Demeke, M. M., Dietz, H., Li, Y. Y., Foulquie-Moreno, M. R., Mutturi, S., Deprez, S., Den Abt, T., Bonini, B. M., Liden, G., Dumortier, F., Verplaetse, A., Boles, E., Thevelein, J. M Development of a D- xylose fermenting and inhibitor tolerant industrial Saccharomyces cerevisiae strain with high performance in lignocellulose hydrolysates using metabolic and evolutionary engineering. Biotechnol Biofuels 6: 89. Eberlein, C., Leducq, J. B., Landry, C. R The genomics of wild yeast populations sheds light on the domestication of man's best (micro) friend. Mol Ecol 24: Fernandez-Gonzalez, M., Ubeda, J. F., Cordero-Oterob, R. R., Gururajan, V. T., Briones, A. I Engineering of an oenological Saccharomyces cerevisiae strain with pectinolytic activity and its effect on wine. Int J Food Microbiol 102: Goffeau, A., Barrell, B. G., Bussey, H., Davis, R. W., Dujon, B., Feldmann, H., Galibert, F., Hoheisel, J. D., Jacq, C., Johnston, M., Louis, E. J., Mewes, H. W., Murakami, Y., Philippsen, P., Tettelin, H., Oliver, S. G Life with 6000 genes. Science 274: Gostinčar, C., Grube, M., de Hoog, G. S., Zalar, P., Gunde-Cimerman, N Extremotolerance in fungi: evolution on the edge. FEMS Microbiol Ecol 71:

62 Gostinčar, C., Gunde-Cimerman, N., Grube, M Polyextremotolerance as the fungal answer to changing environments. In: Bakermans, C. (Ed.), Microbial evolution under extreme conditions. de Gruyter, Berlin, pp Gostinčar, C., Gunde-Cimerman, N., Turk, M. 2012a. Genetic resources of extremotolerant fungi: a method for identification of genes conferring stress tolerance. Bioresour Technol 111: Gostinčar, C., Muggia, L., Grube, M. 2012b. Polyextremotolerant black fungi: oligotrophism, adaptive potential, and a link to lichen symbioses. Front Microbiol 3: 390. Gostinčar, C., Ohm, R. A., Kogej, T., Sonjak, S., Turk, M., Zajc, J., Zalar, P., Grube, M., Sun, H., Han, J., Sharma, A., Chiniquy, J., Ngan, C. Y., Lipzen, A., Barry, K., Grigoriev, I. V., Gunde-Cimerman, N Genome sequencing of four Aureobasidium pullulans varieties: biotechnological potential, stress tolerance, and description of new species. BMC Genomics 15: 549. Gostinčar, C., Turk, M., Plemenitaš, A., Gunde-Cimerman, N The expressions of D 9 -, D 12 -desaturases and an elongase by the extremely halotolerant black yeast Hortaea werneckii are salt dependent. FEMS Yeast Res 9: Gunde-Cimerman, N., Zalar, P., de Hoog, S., Plemenitaš, A Hypersaline waters in salterns natural ecological niches for halophilic black yeasts. FEMS Microbiol Eco, 32: Hammond, J. R. M Genetically-modified brewing yeasts for the 21st Century. Progress to date. Yeast 11: Herrero, O., Ramon, D., Orejas, M Engineering the Saccharomyces cerevisiae isoprenoid pathway for de novo production of aromatic monoterpenes in wine. Metab Eng 10: Husnik, J. I., Volschenk, H., Bauer, J., Colavizza, D., Luo, Z. L., van Vuuren, H. J. J Metabolic engineering of malolactic wine yeast. Metab Eng 8: Kim, S. R., Park, Y. C., Jin, Y. S., Seo, J. H Strain engineering of Saccharomyces cerevisiae for enhanced xylose metabolism. Biotechnol Adv 31: Kogej, T., Gostinčar, C., Volkmann, M., Gorbushina, A. A., Gunde-Cimerman, N Mycosporines in extremophilic fungi novel complementary osmolytes? Environ Chem 3: Kogej, T., Ramos, J., Plemenitaš, A., Gunde-Cimerman, N The halophilic fungus Hortaea werneckii and the halotolerant fungus Aureobasidium pullulans maintain low intracellular cation concentrations in hypersaline environments. Appl Environ Microbiol 71: Kogej, T., Stein, M., Volkmann, M., Gorbushina, A. A., Galinski, E. A., Gunde-Cimerman, N Osmotic adaptation of the halophilic fungus Hortaea werneckii: role of osmolytes and melanization. Microbiol 153: Kogej, T., Wheeler, M. H., Lanišnik Rižner, T., Gunde-Cimerman, N Evidence for 1,8- dihydroxynaphthalene melanin in three halophilic black yeasts grown under saline and non-saline conditions. FEMS Microbiol Lett 232: Konte, T., Plemenitaš, A The HOG signal transduction pathway in the halophilic fungus Wallemia ichthyophaga: identification and characterisation of MAP kinases WiHog1A and WiHog1B. Extremophiles 17: Kralj Kunčič, M., Kogej, T., Drobne, D., Gunde-Cimerman, N Morphological Response of the Halophilic Fungal Genus Wallemia to High Salinity. Appl Environ Microbiol 76: Lenassi, M., Gostinčar, C., Jackman, S., Turk, M., Sadowski, I., Nislow, C., Jones, S., Birol, I., Gunde- Cimerman, N., Plemenitaš, A Whole genome duplication and enrichment of metal cation transporters revealed by de novo genome sequencing of extremely halotolerant black yeast Hortaea werneckii. PLoS ONE 8: e Lenassi, M., Plemenitaš, A Novel group VII histidine kinase HwHhk7B from the halophilic fungi Hortaea werneckii has a putative role in osmosensing. Curr Genet 51: Li, H. X., Wu, M. L., Xu, L. L., Hou, J., Guo, T., Bao, X. M., Shen, Y Evaluation of industrial Saccharomyces cerevisiae strains as the chassis cell for second-generation bioethanol production. Microb Biotechnol 8: Managbanag, J. R., Torzilli, A. P An analysis of trehalose, glycerol, and mannitol accumulation during heat and salt stress in a salt marsh isolate of Aureobasidium pullulans. Mycologia 94: McGovern, P. E., Zhang, J. H., Tang, J. G., Zhang, Z. Q., Hall, G. R., Moreau, R. A., Nunez, A., Butrym, E. D., Richards, M. P., Wang, C. S., Cheng, G. S., Zhao, Z. J., Wang, C. S Fermented beverages of preand proto-historic China. Proc Natl Acad Sci USA 101: Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y. Y., Holtzapple, M., Ladisch, M Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresour Technol 96: Nevoigt, E Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 72:

63 Nevoigt, E., Pilger, R., Mast-Gerlach, E., Schmidt, U., Freihammer, S., Eschenbrenner, M., Garbe, L., Stahl, U Genetic engineering of brewing yeast to reduce the content of ethanol in beer. FEMS Yeast Res 2: Park, J. Y., Lee, J. Y., Choi, S. H., Ko, H. M., Kim, I. C., Lee, H. B., Bai, S Construction of dextrin and isomaltose-assimilating brewer's yeasts for production of low-carbohydrate beer. Biotechnol Lett 36: Perez-Torrado, R., Querol, A., Guillamon, J. M Genetic improvement of non-gmo wine yeasts: strategies, advantages and safety. Trends Food Sci Technol 45: Schuller, D., Casal, M The use of genetically modified Saccharomyces cerevisiae strains in the wine industry. Appl Microbiol Biotechnol 68: Steensels, J., Snoek, T., Meersman, E., Nicolino, M. P., Aslankoohi, E., Christiaens, J. F., Gemayel, R., Meert, W., New, A. M., Pougach, K Selecting and generating superior yeasts for the brewing industry. Cerevisia 37: Tilloy, V., Cadiere, A., Ehsani, M., Dequin, S Reducing alcohol levels in wines through rational and evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae. Int J Food Microbiol 213: Turk, M., Abramovic, Z., Plemenitas, A., Gunde-Cimerman, N Salt stress and plasma-membrane fluidity in selected extremophilic yeasts and yeast-like fungi. FEMS Yeast Res 7: Turk, M., Mejanelle, L., Šentjurc, M., Grimalt, J. O., Gunde-Cimerman, N., Plemenitaš, A Salt-induced changes in lipid composition and membrane fluidity of halophilic yeast-like melanized fungi. Extremophiles 8: Valero, E., Schuller, D., Cambon, B., Casal, M., Dequin, S Dissemination and survival of commercial wine yeast in the vineyard: a large-scale, three-years study. FEMS Yeast Res 5: van Zyl, W. H., Bloom, M., Viktor, M. J Engineering yeasts for raw starch conversion. Appl Microbiol Biotechnol 95: Vaupotič, T., Gunde-Cimerman, N., Plemenitaš, A Novel 3'-phosphoadenosine-5'-phosphatases from extremely halotolerant Hortaea wernecki reveal insight into molecular determinants of salt tolerance of black yeasts. Fungal Genet Biol 44: Zajc, J., Liu, Y., Dai, W., Yang, Z., Hu, J., Gostinčar, C., Gunde-Cimerman, N Genome and transcriptome sequencing of the halophilic fungus Wallemia ichthyophaga: haloadaptations present and absent. BMC Genomics 14:

64 6. POGLAVJE Uporaba GSO pri preučevanju interakcij proteinov z naravnimi in umetnimi lipidnimi membranami Matej Skočaj in Kristina Sepčić POVZETEK V 90-ih letih prejšnjega stoletja je bila predstavljena teorija o membranskih raftih, ki te s holesterolom in sfingomielinom obogatene domene bioloških membran označi kot ključne strukturne in signalizacijske komponente evkariontskih celic. Membranski rafti so udeleženi v osnovnih bioloških procesih v zdravem organizmu, saj omogočajo delovanje ustaljenih signalizacijskih poti, obenem pa njihova nefukcionalnost ali okvara privede do različnih bolezenskih in patoloških stanj. Za membranske rafte je bilo tako ugotovljeno, da igrajo pomembno vlogo v nevroloških (Alzheimerjeva, Parkinsonova in prionske bolezni) in kardiovaskularnih boleznih, v karcinogenezi in pri imunskih boleznih, kot je npr. sistemski lupus eritematozus, ter pri okužbi z virusom HIV, kar naredi te membranske domene izjemno zanimive tarče v luči farmakoloških pristopov za zdravljenje in preprečevanje omenjenih bolezni. Toksini in drugi proteini, ki specifično prepoznavajo in se vežejo na lipide, prisotne v membranskih raftih (predvsem na sfingomielin in holesterol), kot tudi različni derivati teh proteinov, so zelo dobri kandidati za proučevanje strukture in funkcije membranskih raftov. V našem laboratoriju smo razvili stabilno, netoksično rekombinantno fluorescenčno različico proteina ostreolizina A, za katerega smo pokazali, da se veže na s holesterolom in sfingomielinom obogatena področja v membranah evkariontskih celic, s čimer smo tudi dokazali obstoj membranskih raftov v evkariotskih celicah. Razvita molekula bi lahko v prihodnosti služila kot ključno orodje v osnovnih in aplikativnih biomedicinskih raziskavah biologije membranskih raftov in z njimi povezanih patoloških stanj. Razvili smo tudi nekatere druge rekombinantne proteine in njihove derivate, ki se specifično vežejo z lipidi, ki so obogateni v membranskih raftih. V prispevku bomo predstavili uporabo rekombinantnih proteinov, ki specifično prepoznavajo in se vežejo na lipide, prisotne v membranskih raftih, kakor tudi uporabo njihovih netoksičnih derivatov, za proučevanje strukture in funkcije membranskih raftov v umetnih lipidnih sistemih ter v fiksiranih in živih celicah. KLJUČNE BESEDE: membranski lipidi, membranski rafti, ostreolizin A. 1. UVOD Še konec 19. stoletja so biološke membrane opisovali le kot nekakšno oborino (precipitat) na površini celic (Overton, 1899). Na prelomu 20. stoletja pa je Charles Overton ugotovil, da skozi celice, poleg vode, prehajajo tudi nekateri ioni in nepolarne snovi. Leto 1917 je bilo s stališča zgodovine raziskovanja membran prelomno. Irving Langmuir je takrat spisal zelo odmeven članek, kjer je trdil, da so lipidi na interfazi voda/zrak s polarnimi glavami obrnjeni proti vodni fazi, medtem ko so z nepolarnimi repi obrnjeni proti zraku (Langmuir, 1917). V nadaljevanju sta leta 1925 profesor Evert Gorter in njegov asistent François Grendel s klasičnim eksperimentom pokazala, da je površina lipidov, ekstrahiranih iz eritrocitov, dvakrat večja kot površina celic. Tako sta prva v zgodovini opisala lipidni dvosloj (Gorter in Grendel, 1925). Desetletje pozneje so odkrili, da so v bioloških membranah tudi proteini (Danielli in Davson, 1935). V 60. letih prejšnjega stoletja je bilo pokazano, da imajo vse membrane podobno strukturo ter da je lipidni dvosloj asimetričen in bolj podoben tekočini kot trdnini (Robertson, 1959; Champan, 1975). Leta 1972 je bil predstavljen model tekočega mozaika bioloških membran, kjer je bilo prvič omenjeno, da se membranski proteini delijo na transmembranske in periferne (Singer in Nicolson, 1972). Dobrih dvajset let nazaj pa je bil predstavljen model membranskih mikrodomen, ki je rešil problem razvrščanja in razporeditve lipidov in proteinov v polariziranih sesalskih celicah (Simons in van Meer, 1988). Kljub temu, da sedaj vemo, da v membranah človeških celic najdemo med in

65 različnih vrst lipidov, je področje raziskovanja bioloških membran v celični biologiji še vedno dokaj prezrto (Sud in sod., 2007; Lingwood in Simons, 2010). 2. STRUKTURA BIOLOŠKIH MEMBRAN Membranske lipide lahko razdelimo v tri glavne skupine: glicerofosfolipide, sfingolipide in holesterol. Največji delež predstavljajo glicerofosfolipidi. Njihovo ogrodje predstavlja polialkohol glicerol, na katerem so zaestreni dva maščobnokislinska ostanka in fosfatna skupina. Glicerofosfolipidi so tipično cilindrične geometrične oblike. Zaradi vsaj ene cis-nenasičene acilne verige so običajno pri sobni temperaturi v tekočem fizikalnem stanju. Ogrodje sfingolipidov, med katere prištevamo tudi glikolipide, predstavlja aminoalkohol sfingozin. Najpomembnejši predstavnik te skupine lipidov je sfingomielin. Ker imajo v svoji strukturi veliko nasičenih maščobnokislinskih verig, se pakirajo tesneje skupaj, zaradi česar pri sobni temperaturi preidejo v gel stanje. V bioloških membranah jih pogosto najdemo skupaj s holesterolom, s katerim tvorijo tako imenovane membranske rafte (van Meer in sod., 2008). Evkariontske celice imajo za razliko od prokariontskih več vrst specifičnih celičnih razdelkov, ki so od preostanka citoplazme ločeni z membrano. Ključna razlika med plazemsko membrano in ostalimi znotrajceličnimi membranami je v tem, da slednje (skoraj) ne vsebujejo holesterola. Holesterol naj bi deloval kot nekakšno lepilo, ki skupaj poveže lipide plazemske membrane in jo tako naredi mehansko bolj odporno (van Meer in sod., 2008) MEMBRANSKI RAFTI Membranski rafti so najbolj preučevane membranske domene v sesalskih celicah. Obogateni so s sfingolipidi, holesterolom in specifičnimi proteini (Lingwood in Simons, 2010). Trenutni model celičnih membran predpostavlja, da so sfingolipidi in holesterol ključne molekule, ki naj bi v bioloških membranah omogočale nastanek tako imenovane tekoče urejene faze (angl. liquid ordered phase, l 0 ) (McConnell in Vrljic, 2003). Tekoča urejena faza v modelnih lipidnih sistemih naj bi ustrezala terminu membranskih raftov v bioloških sistemih. Membranski rafti so nekaj 10 nm velike, dinamične in nestabilne domene, katerih molekulska sestava se spreminja na časovni skali, manjši od sekunde (Hancock, 2006; Kenworthy in sod., 2000; Subczynski in Kusumi, 2003), zato jih je zelo težko preučevati. Udeleženi so v ključnih bioloških procesih v zdravem organizmu, saj delujejo kot podlage (platforme) za ustaljene signalizacijske poti v celicah. Njihova nefunkcionalnost ali nepravilno delovanje lahko privede do različnih patoloških in bolezenskih stanj. Vpleteni so v prenos bioloških signalov, ključno vlogo pa igrajo tudi pri procesih endoin eksocitoze, v membranskem transportu, pri imunskem odgovoru, pri vstopu patogenih mikroorganizmov v celice in pri vezavi mnogih ligandov (Simons in Ikonnen, 1997; London, 2002; Edidin, 2003; Lingwood in Simons, 2010; Simons in Gerl, 2010; Simons in Sampaio, 2011). Membranski rafti se tako kažejo kot izjemno zanimive tarče v luči farmakoloških pristopov za zdravljenje mnogih patoloških stanj (Michel in Bakovic, 2007) OZNAČEVANJE MEMBRANSKIH RAFTOV Z NELITIČNIMI DERIVATI TOKSINOV Ker so biološke membrane ključne sestavine celic, raziskovanje membranskih raftov pa dokaj novo, a nadvse aktualno področje biomedicinskih raziskav, se kaže potreba po razvoju novih tehnik, metod in pristopov za njihovo preučevanje. Posledično se v zadnjem času poleg novih mikroskopskih metod razvijajo tudi molekularna orodja za detekcijo teh domen. Najbolj obetavne molekule za označevanje raftnih domen so ravno netoksične, fluorescenčno označene različice naravnih toksinov, ki se lahko specifično vežejo na komponente membranskih raftov. Mednje uvrščamo ekvinatoksin II iz morske vetrnice Actinia equina in lizenin iz deževnika Eisenia foetida, ki se vežeta na membranski sfingomielin, perfringolizin O iz po Gramu pozitivne bakterije Clostridium perfringens, ki se veže na membranski holesterol, podenoto B toksina kolere iz bakterije Vibrio cholerae, ki se veže na gangliozid G M1, ter plevrotolizin A2 iz glive Pleurotus eryngii in ostreolizin A in glive Pleurotus ostreatus, ki se vežeta na 57

66 kombinacijo sfingomielina in holesterola (povzeto v Skočaj in sod., 2013). Med njimi je bila fluorescenčno označena podenota B toksina kolere dolgo časa edina komercialno dostopna molekula, za katero je bilo ugotovljeno, da se specifično veže na komponente membranskih raftov (Zhuang in sod., 2002). 3. OSTREOLIZIN A IN PLEVROTOLIZIN B Bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus) je užitna goba, ki jo najdemo v gozdovih Evrope, Severne Amerike in Azije (Cohen in sod., 2002). Ker jo je enostavno gojiti, ter zaradi visoke hranilne vrednosti in nizke vsebnosti maščob, je bukov ostrigar tretja najpomembnejša vrsta gob v prehranski industriji (Carlile in sod., 2001; Cohen in sod., 2002). Že leta 1979 so v bukovem ostrigarju odkrili citolitični protein, ki so ga poimenovali plevrotolizin (Bernheimer in Avigad, 1979). Leta 2002 so Berne in sodelavci iz plodnih teles bukovega ostrigarja in iz gobe topolovke (Agrocybe aegerita) izolirali in biokemijsko karakterizirali dva domnevno citolitična proteina, ostreolizin A (OlyA) in egerolizin, s čimer so definirali tudi novo egerolizinsko družino proteinov (PFO6355). Do sedaj je bilo odkritih več kot 350 predstavnikov te družine proteinov, ki jih najdemo tudi v bakterijah, rastlinah, žuželkah in virusih (Wang in sod., 2006; Berne in sod., 2009; Zhang in sod., 2011; Novak in sod., 2015). Za to družino proteinov je značilno, da so kisli in relativno majhni, njihova biološka vloga pa še ni natančno znana (Berne in sod., 2009; Novak in sod., 2015). Glivni egerolizini naj bi bili vpleteni v nastanek plodnih teles, tisti iz bakterij in nitastih gliv pa v interakcijah patogen gostitelj (Berne in sod., 2002; Vidic in sod., 2005; Berne in sod., 2009; Novak in sod., 2015). OlyA je del bikompetentnega citolitičnega kompleksa, ki je odgovoren za vezavo na s sfingomielinom in holesterolom obogatene membranske domene. Skupaj s 59-kDa proteinsko komponento plevrotolizinom B, ki v svoji strukturi vsebuje domeno MACPF (angl. membrane attack complex/perforin) tvori transmembranske pore v modelnih lipidnih sistemih kakor tudi v naravnih bioloških membranah. OlyA se torej veže na celične membrane, a sam ne lizira celic (Ota in sod., 2013; Lukoyanova in sod., 2015). V naših prvih raziskavah smo uporabljali naravni izolat proteina OlyA, za katerega se je v nadaljevanju pokazalo, da je imel zelo majhno količino primesi plevrotolizina B (v nadaljevanju bomo za naravni izolat uporabljali izraz Oly). V teh raziskavah smo pokazali, da se Oly veže na biološke in umetne lipidne membrane, obogatene s sfingomielinom in holesterolom (Sepčić in sod., 2004). V nadaljnjih raziskavah smo pokazali, da se Oly veže na membransko frakcijo sesalskih celic, ki jo pridobimo po ekstrakciji z detergenti (angl. detergent resistant membranes; DRM) iz ovarijskih celic kitajskega hrčka. Tako izolirana membranska frakcija celic naj bi bila obogatena s komponentami membranskih raftov. Vezava na DRM ni bila mogoča v primeru predhodne inkubacije celic z metil-β-ciklodekstrinom (MβCD), ki iz celičnih membran odtegne holesterol (Sepčić in sod., 2004; Chowdhury in sod., 2008). Za vezavo Oly na umetne lipidne membrane je bila nujna prisotnost skupine 3β-OH v molekuli holesterola, hkrati pa je na vezavo vplivalo tudi število dvojnih vezi in metilacija steroidnega skeleta ter zgradba njihovih alkilnih verig (Rebolj in sod., 2006; Rebolj in sod., 2010). Oly ni spreminjal fluidnosti membrane, kar je nujno potrebna lastnost dobrega označevalca membran (Sepčić in sod., 2003; Sepčić in sod., 2004; Rebolj in sod., 2010). Izolat Oly smo v nadaljevanju uporabili za označevanje membran hondrocitov in ovarijskih celic kitajskega hrčka ter pokazali točkovno vezavo na membrane celic (Maličev in sod., 2007; Chowdhury in sod., 2008). Z uporabo fluorescenčnih protiteles proti Oly smo pokazali, da se Oly veže na celične domene, obogatene s sfingomielinom in holesterolom (Resnik in sod., 2011; Lokar in sod., 2012). Na maligni celični liniji T24 smo pokazali, da so nanocevke, ki jih tvorijo te celice, prav tako obogatene s sfingomielinom in holesterolom (Lokar in sod., 2012). Dvojno imunsko označevanje z Oly in intrinzičnim raftnim proteinom kaveolinom ali podenoto B toksina kolere v raziskavi Chowdhury in sodelavci (2008) ni pokazalo kakršne koli kolokalizacije, kar napeljuje na dejstvo, da so v celičnih membranah prisotne funkcionalno in strukturno različne raftne domene. 58

67 3.1. PRIPRAVA IN KARAKTERIZACIJA FLUORESCENČNIH FUZIJSKIH KONSTRUKTOV OSTREOLIZINA A V nadaljevanju raziskav na Katedri za biokemijo smo z namenom uporabe proteina OlyA za neposredno označevanje membranskih raftnih domen v živih sesalskih celicah razvili različice OlyA, označene s fluorescenčnim proteinom mcherry, ki so predstavljene na Sliki 6-1. V sklopu raziskave smo proizvedli tudi domeno 4 perfringolizina O, označeno z zelenim ojačenim fluorescenčnim proteinom (angl. enhanced green fluorescent protein; egfp). Podrobni rezultati, o katerih bo govora v nadaljevanju, so povzeti tudi v članku Skočaj in sodelavci (2014). OlyA mcherry H 6 H 6 mcherry OlyA OlyA mcherry mcherry OlyA D4-PFO EGFP H 6 Slika 6-1: Domenska shema pripravljenih fluorescenčnih fuzijskih konstruktov ostreolizina A (OlyA) in domene 4 perfringolizina O (D4-PFO). H 6 : heksahistidinski rep; EGFP: ojačan zeleni fluorescenčni protein. Fluorescenčne različice OlyA smo izrazili v bakteriji E. coli in jih v nadaljevanju kot topne proteine izolirali in očistili z nikelj-afinitetno in ionsko-izmenjevalno kromatografijo. Za pripravo C- in N- terminalnih fuzijskih različic OlyA, označenih z mcherry, smo se odločili, saj smo v preteklosti ugotovili, da se rekombinantni OlyA ob blokiranem N-terminalnem delu ne veže na umetne lipidne vezikle, sestavljene iz sfingomielina in holesterola v molekulskem razmerju 1 : 1, ob prisotnosti plevrotolizina B pa ni sposoben lize govejih eritrocitov. V nadaljevanju smo zato najprej preverili hemolitično aktivnost različic OlyA ob prisotnosti plevrotolizina B in potrdili, da so aktivni le tisti proteini, ki imajo prost N- terminalni del molekule. Iste različice smo uporabili pri testu vezave na umetne lipidne vezikle z različno sestavo z uporabo površinske plazmonske resonance. Podobno kot v prejšnjih poskusih smo tudi tu ugotovili, da se proteini z blokiranim N-terminalnim delom molekule ne vežejo na vezikle, sestavljene iz sfingomielina in holesterola, ali na vezikle, sestavljene iz totalnega membranskega ekstrakta eritrocitov. Molekule OlyA, ki so imele prost N-terminalni del (N-konec), so se na vezikle obeh sestav vezale podobno kot naravni protein. Na podlagi omenjenih poskusov smo se odločili, da bomo OlyA-mCherry v nadaljevanju uporabili kot najprimernejšo molekulo za označevanje raftnih domen v živih sesalskih celicah UPORABA FLUORESCENČNEGA FUZIJSKEGA PROTEINA OlyA-mCherry ZA OZNAČEVANJE IN SPREMLJANJE MEMBRANSKIH RAFTOV V ŽIVIH CELICAH V nadaljevanju raziskave smo kot celični model izbrali celice MDCK (angl. Madin-Darby canine kidney cells), ki so epitelna celična linija iz ledvic zdravega koker španjela. Z imunodetekcijo membranskega proteina okludina smo pokazali, da so bile celice, uporabljene v poskusih, že polarizirane, kar pomeni, da sta se že izoblikovali apikalna in bazolateralna membrana. Vezavo fluorescenčnih različic proteina OlyA smo najprej preverili na fiksiranih celicah MDCK. Rezultati so potrdili teste hemolitične aktivnosti in 59

68 vezave na umetne lipidne vezikle. Na celice MDCK so se vezale le tiste fluorescenčne različice OlyA, ki so imele prost N-terminalni del molekule. Pred nadaljevanjem označevanja živih celic smo najprej izvedli test citotoksičnosti (MTS), ki nam pove, ali so preiskovane molekule toksične za tarčno celično linijo. Akutni 1-urni in kronični 24-urni citotoksični test sta pokazala, da noben od rekombinantnih proteinov ni toksičen za preiskovano celično linijo, kar je ključna lastnost dobrega označevalca. S prenosom proteinov po Westernu pa smo ugotovili, da aktivni rekombinantni proteini ne aktivirajo in ne inhibirajo aktivnih signalizacijskih poti, ki so pod vplivom tirozinskih kinaz. Ker se je OlyA-mCherry izkazal za netoksično molekulo, smo s poskusi označevanja nadaljevali na živih celicah. Podobno kot v primeru fiksiranih celicah smo tudi tu opazili, da so vezave sposobne le fluorescenčne različice OlyA, ki imajo prost N-konec molekule (slika 6-2). Vsi pregledani mikroskopski preparati so pokazali, da so jedra ohranila svoje morfološke značilnosti, kar se ujema z rezultati citotoksičnega testa MTS. Če smo celice in aktivne proteine inkubirali dlje kot 5 min, smo opazili, da se proteini internalizirajo v žive celice (slika 6-2B), kar smo v nadaljevanju tudi podrobneje raziskali. Da je vezava OlyA-mCherry res odvisna od hkratne prisotnosti sfingomielina in holesterola, smo preverili na tak način, da smo celice predhodno inkubirali bodisi v raztopini MβCD, ki iz celičnih membran specifično odtrga holesterol, ali v raztopini sfingomielinaze, ki hidrolizira membranski sfingomielin. Ker v nobenem primeru nismo opazili vezave OlyA-mCherry, smo sklepali, da sta za njegovo vezavo nujno potrebni obe lipidni zvrsti in tako potrdili poskuse, pridobljene s površinsko plazmonsko resonanco na umetnih lipidnih veziklih. Na podlagi poskusov na živih celicah MDCK lahko trdimo, da je OlyA-mCherry zelo primerna molekula za označevanje membranskih raftov, saj za razliko od nekaterih ostalih označevalcev za celic ni toksičen, obenem pa hkrati prepozna oba ključna raftna lipida. Ta lastnost predstavlja prednost v odnosu do ostalih raftnih označevalcev, ki se vežejo bodisi na sfingomielin bodisi holesterol, tj. lipida, ki sta prisotna tudi v ne-raftnih domenah. A 5 min B 60 min Slika 6-2: Označevanje živih celic MDCK s fluorescenčnim fuzijskih proteinom OlyA-mCherry. Reprezentativni sliki označevanja celic MDCK pri 37 C z 0,5 µm OlyA-mCherry po 5 min (levo) in po 60 min (desno). Merilo: 10 µm. Modro: jedra (DAPI); rdeče: domnevni rafti (OlyA-mCherry). Ker smo pri označevanju živih celic MDCK v primeru daljših inkubacij opazili, da se OlyA-mCherry internalizira v celice, nas je zanimalo, katere so poti te internalizacije in kateri so tisti razdelki ali strukture, v katerih se proteini koncentrirajo. Mikroskopske analize slik dvojnega imunooznačevanja z OlyAmCherry in z označevalci različnih celičnih kompartmentov ali struktur so pokazale, da se OlyA-mCherry v celice internalizira po raftni, od kaveolina-1 odvisni poti in v mnogo manjši meri po flotilinski ali klatrinski poti endocitoze. Po 5 minutah smo znatni delež OlyA-mCherry zaznali v zgodnjih endosomih; 60

69 celičnih razdelkih, ki neposredno komunicirajo s plazemsko membrano in za katere je bilo ugotovljeno, da vsebujejo povišane koncentracije sfingomielina in holesterola (van Meer in Kroon, 2011). Po 30 minutah inkubacije smo OlyA-mCherry zasledili v od kaveolina-1 odvisnih celičnih razdelkih. Rezultati spremljanja poti endocitoze OlyA-mCherry se skladajo s teorijo o vlogi kaveol pri kroženju membranskih raftov (Lajoie in Nabi, 2010). Devetdeset minut po začetku endocitoze smo OlyA-mCherry zaznali v objedrni regiji Golgijevega aparata, kar nakazuje na prisotnost raftnih domen v teh strukturah in potrjuje nedavna opažanja o raftnih domenah v Golgijev aparatu (Mishra in sod., 2010). V nadaljevanju smo izvedli še mikroskopske primerjalne kolokalizacijske študije med OlyA-mCherry in drugimi predlaganimi označevalci membranskih raftov, ki so omenjeni v poglavju 1.2 (slika 6-3). Ugotovili smo, da kolokalizacije med OlyA-mCherry in sfingomielinskima označevalcema lizeninom in ekvinatoksinom II ni. Podenota B toksina kolere, ki označuje gangliozid G M1, se tudi ni izkazala kot primeren označevalec, saj je tega lipida v preučevanih celicah zelo malo, posledično je bila tudi kolokalizacija zelo šibka. Podobni rezultati dvojnega označevanja so bili tudi v primeru OlyA-mCherry in domene 4 perfringolizina O, ki se veže na membranski holesterol. Tudi v tem primeru smo določili le šibko prekrivanje fluorescenčnih signalov. Največjo stopnjo prekrivanja smo zasledili v primeru intrinzičnega celičnega proteina kaveolina-1 (slika 6-3E), kar se sklada z opažanji, da je kaveolin raftni protein. Kljub temu, da spada flotilin-1 tudi med intrinzične raftne proteine, pa v tem primeru kolokalizacije nismo uspeli potrditi. Na podlagi tega dela raziskave smo zaključili, da OlyA-mCherry prepozna specifične populacije membranskih mikrodomen, različne od tistih, ki jih prepoznajo ostali označevalci. Rezultati naše raziskave potrjujejo ugotovitve drugih avtorjev o heterogenosti membranskih raftnih domen evkariontskih celic (Pike, 2004; de Almeida in sod., 2005; Hancock, 2006). Slika 6-3: Dvojno označevanje fiksiranih celic MDCK, ki smo jih hkrati inkubirali z OlyA-mCherry in toksini, ki se vežejo na lipidne komponente membranskih raftov (A-D) in dvojno označevanje živih celic MDCK s kombinacijo OlyA-mCherry in imunskim označevanjem intrinzičnih raftnih označevalcev (E,F). Celice so bile v vseh primerih inkubirane 10 min z OlyA-mCherry (1 M ) in ustreznim lipidnim označevalcem. Rdeče: OlyAmCherry; zeleno: drugi lipidni označevalci; modro: jedra (DAPI). Rumen signal na sliki 6-3E predstavlja kolokalizacijo OlyA-mCherry in kaveolina-1. Merilo: 20 M. EqTII-Alexa488; fluorescenčno označena nelitična trojna cisteinska mutanta ekvinatoksina II; GST-lizenin; z glutation-s-transferazo označen lizenin; D4-PFO-EGFP; fluorescenčno označena domena 4 perfringolizina O; CT-B-Alexa488, fluorescenčno označena podenota B toksina kolere. 61

70 V naši raziskavi smo poleg plazmidov, ki vsebujejo zapise za fluorescenčne različice OlyA in ki smo jih izražali v bakterijah, razvili tudi plazmide za zapisom za iste proteine, ki so zmožni izražanja v sesalskih celicah. Na ta način smo želeli preveriti, ali se s sfingomielinom in holesterolom obogatene domene nahajajo tudi v znotrajceličnih, citosolu izpostavljenih membranah. Ugotovili smo, da teh domen v znotrajceličnih membranah ni, kar se ujema z že znanimi dejstvi o razporeditvi sfingomielina in holesterola med lumensko in zunajcelično plastjo plazemske membrane in o lipidni sestavi razdelkov evkariontskih celic (van Meer in Hoetzl, 2010). 4. ZAKLJUČEK Če povzamemo napisano, lahko vidimo, da fluorescenčni fuzijski protein OlyA-mCherry specifično označuje s sfingomielinom in holesterolom obogatene domene v plazemskih membranah evkariontskih celic. Tako pripravljena molekula OlyA-mCherry ohrani svojo biološko aktivnost in lipidno specifičnost. Z njo lahko tudi spremljamo kroženje membranskih raftov. OlyA-mCherry in njegove izpeljanke kažejo velik potencial za uporabo na različnih področjih biomedicinskih raziskav. Razen pokazane uporabne vrednosti za študij strukture in funkcije membranskih raftov v živih celicah, bi se OlyA v fuzijskih različicah z različnimi proteini lahko v prihodnosti uporabljal kot dostavno sredstvo za te proteine v zgodnje endosome in pozne kaveolarne strukture. Naše zadnje raziskave nakazujejo tudi na možnost potencialne uporabe fuzijskih fluorescenčnih variant OlyA za diagnostiko rakavih sprememb v votlih telesnih organih, kot sta mehur in maternični vrat. 5. LITERATURA Berne, S., Križaj, I., Pohleven, F., Turk, T., Maček, P., Sepčić, K Pleurotus and Agrocybe hemolysins, new proteins hypothetically involved in fungal fruiting. Biochim Biophys Acta 1570: Berne, S., Lah, L., Sepčić, K Aegerolysins: structure, function, and putative biological role. Protein Sci 18: Bernheimer, A. W., Avigad, L. S A cytolytic protein from the edible mushroom, Pleurotus ostreatus. Biochim Biophys Acta 585: Carlile, M. J., Watkinson, S. C., Gooday, G. W The Fungi, Academic Press, London, pp Chapman D Phase transitions and fluidity characteristics of lipids and cell membranes. Q Rev Biophys 8: Chowdhury, H. H., Rebolj, K., Kreft, M., Zorec, R., Maček, P., Sepčić, K Lysophospholipids prevent binding of a cytolytic protein ostreolysin to cholesterol-enriched membrane domains. Toxicon 51: Cohen, R., Persky, L., Hadar, Y Biotechnological applications and potential of wood-degrading mushrooms of the genus Pleurotus. Appl Microbiol Biotechnol 58: Danielli, J. F., Davson, H A contribution to the theory of permeability of thin films. J Cell Comp Physiol 5: de Almeida, R. F., Loura, L. M., Fedorov, A., Prieto, M Lipid rafts have different sizes depending on membrane composition: a time-resolved fluorescence resonance energy transfer study. J Mol Biol 346: Edidin, M Lipids on the frontier: a century of cell-membrane bilayers. Nat Rev Mol Cell Biol 4: Gorter E, Grendel F On Bimolecular Layers of Lipoids on the Chromocytes of the Blood. J Exp Med 41: Hancock, J. F Lipid rafts: contentious only from simplistic standpoints. Nat Rev Mol Cell Biol 7: Kenworthy, A. K., Petranova, N., Edidin, M High-resolution FRET microscopy of cholera toxin B-subunit and GPI-anchored proteins in cell plasma membranes. Mol Biol Cell 11: Lajoie, P., Nabi, I. R Lipid rafts, caveolae, and their endocytosis. Int Rev Cell Mol Biol 282: Langmuir, I The constitution and fundamental properties of solids and liquids: II. Liquids. J Am Chem Soc 39: Lingwood, D., Simons, K Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science 327: Lokar, M., Kabaso, D., Resnik, N., Sepčić, K., Kralj-Iglič, V., Veranič, P., Zorec, R., Iglič, A The role of cholesterol-sphingomyelin membrane nanodomains in the stability of intercellular membrane nanotubes. Int J Nanomedicine 7: London, E Insights into lipid raft structure and formation from experiments in model membranes. Curr Opin Struct Biol 12:

71 Lukoyanova, N., Kondos, S. C., Farabella, I., Law, R. H., Reboul, C. F., Caradoc-Davies, T. T., Spicer, B. A., Kleifeld, O., Traore, D. A., Ekkel, S. M., Voskoboinik, I., Trapani, J. A., Hatfaludi, T., Oliver, K., Hotze, E. M., Tweten, R. K., Whisstock, J. C., Topf, M., Saibil, H. R., Dunstone, M. A Conformational changes during pore formation by the perforin-related protein pleurotolysin. PLoS Biol 13: e Maličev, E., Chowdhury, H. H., Maček, P., Sepčić, K Effect of ostreolysin, an Asp-hemolysin isoform, on human chondrocytes and osteoblasts, and possible role of Asp-hemolysin in pathogenesis. Med Mycol 45: McConnell, H. M., Vrljic, M Liquid-liquid immiscibility in membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct 32: Michel, V., Bakovic, M Lipid rafts in health and disease. Biol Cell 99: Mishra, R., Grzybek, M., Niki, T., Hirashima, M., Simons, K Galectin-9 trafficking regulates apical-basal polarity in Madin-Darby canine kidney epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 107: Novak, M., Kraševec, N., Skočaj, M., Maček, P., Anderluh, G., Sepčić, K Fungal aegerolysin-like proteins: distribution, activities, and applications. Appl Microbiol Biotechnol 99: Ota, K., Leonardi, A., Mikelj, M., Skočaj, M., Wohlschlager, T., Künzler, M., Aebi, M., Narat, M., Križaj, I., Anderluh, G., Sepčić, K., Maček, P Membrane cholesterol and sphingomyelin, and ostreolysin A are obligatory for pore-formation by a MACPF/CDC-like pore-forming protein, pleurotolysin B. Biochimie 95: Overton, E Ueber die allgemeinen osmotischen Eigenschaften der Zelle. Vierteljahrschr Naturf Ges Zurich 44: Pike, L. J Lipid rafts: heterogeneity on the high seas. Biochem J 378: Rebolj, K., Bakrač, B., Garvas, M., Ota, K., Šentjurc, M., Potrich, C., Coraiola, M., Tomazzolli, R., Dalla Serra, M., Maček, P., Sepčić, K EPR and FTIR studies reveal the importance of highly ordered sterolenriched membrane domains for ostreolysin activity. Biochim Biophys Acta 1798: Rebolj, K., Poklar Ulrih, N., Maček, P., Sepčić, K Steroid structural requirements for interaction of ostreolysin, a lipid-raft binding cytolysin, with lipid monolayers and bilayers. Biochim Biophys Acta 1758: Resnik, N., Sepčić, K., Plemenitaš, A., Windoffer, R., Leube, R., Veranič, P Desmosome assembly and cell-cell adhesion are membrane raft-dependent processes. J Biol Chem 286: Robertson, J. D The ultrastructure of cell membranes and their derivatives. Biochem Soc Symp 16: Sepčić, K., Berne, S., Potrich, C., Turk, T., Maček, P., Menestrina, G Interaction of ostreolysin, a cytolytic protein from the edible mushroom Pleurotus ostreatus, with lipid membranes and modulation by lysophospholipids. Eur J Biochem 270: Sepčić, K., Berne, S., Rebolj, K., Batista, U., Plemenitaš, A., Šentjurc, M., Maček, P Ostreolysin, a poreforming protein from the oyster mushroom, interacts specifically with membrane cholesterol-rich lipid domains. FEBS Lett 575: Simons, K., Gerl, M. J Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat Rev Mol Cell Biol 11: Simons, K., Sampaio, J. L Membrane organization and lipid rafts. Cold Spring Harb Perspect Biol 3: a Simons, K., Ikonen, E Functional rafts in cell membranes. Nature 387: Simons, K., van Meer, G Lipid sorting in epithelial cells. Biochemistry 27: Singer, S. J., Nicolson, G. L The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 175: Skočaj, M., Bakrač, B., Križaj, I., Maček, P., Anderluh, G., Sepčić, K The sensing of membrane microdomains based on pore-forming toxins. Curr Med Chem 20: Skočaj, M., Resnik, N., Grundner, M., Ota, K., Rojko, N., Hodnik, V., Anderluh, G., Sobota, A., Maček, P., Veranič, P., Sepčić, K Tracking cholesterol/sphingomyelin-rich membrane domains with the ostreolysin A-mCherry protein. PloS ONE 9: e Subczynski, W. K., Kusumi, A Dynamics of raft molecules in the cell and artificial membranes: approaches by pulse EPR spin labeling and single molecule optical microscopy. Biochim Biophys Acta 1610: Sud, M., Fahy, E., Cotter, D., Brown, A., Dennis, E. A., Glass, C. K., Merrill, A. H. Jr., Murphy, R. C., Raetz, C. R., Russell, D. W., Subramaniam, S LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Res 35: D van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol 9: van Meer, G., Hoetzl, S Sphingolipid topology and the dynamic organization and function of membrane proteins. FEBS Lett 584:

72 van Meer, G., de Kroon, A. I Lipid map of the mammalian cell. J Cell Sci 124: 5 8. Vidic, I., Berne, S., Drobne, D., Maček, P., Frangež, R., Turk, T., Štrus, J., Sepčić, K Temporal and spatial expression of ostreolysin during development of the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). Mycol Res 109: Wang, L., Xue, J., Seaborn, C. P., Arif, B. M., Cheng, X. W Sequence and organization of the Trichoplusia ni ascovirus 2c (Ascoviridae) genome. Virology 354: Zhang, S., Clark, K. D., Strand, M. R The protein P23 identifies capsule-forming plasmatocytes in the moth Pseudoplusia includens. Dev Comp Immunol 35: Zhuang, M., Oltean, D. I., Gómez, I., Pullikuth, A. K., Soberón, M., Bravo, A., Gill, S. S Heliothis virescens and Manduca sexta lipid rafts are involved in Cry1A toxin binding to the midgut epithelium and subsequent pore formation. J Biol Chem 277:

73 7. POGLAVJE GSO, uporabljeni za študije parodontoze in biologije heteronemertina Matej Butala POVZETEK Toksini igrajo pomembno vlogo pri lastni obrambi in osvojitvi ekološke niše organizmov. V študijah uporabljamo specifično spremenjene toksine, da bi razumeli delovanje teh proteinov in biologijo procesov, v katere so vpleteni. V poglavju je tudi predstavljena uporabnost molekulskega kloniranja. Izdelali smo konstrukte plazmidov z zapisi za sintezo rekombinantnih proteinov, sprožili njihovo sintezo v bakteriji Escherichia coli ter rekombinantne proteine očistili. Predstavim, da je sinteza heterolognih proteinov pogosto težavna. Opisana je tudi uporabnost molekularnih orodij za študije prepisa genov. Vsa ta orodja so nam omogočila študije razvoja parodontoze ter boljše razumevanje biologije heteronemertina. V zaključku še izpostavim vprašanje, ali je primerno, da takšne organizme z nelastnimi (tujimi) geni, zapisanimi na plazmidih, poimenujemo kot gensko spremenjene organizme? KLJUČNE BESEDE: toksin Cdt, parborlizin, plazmidni konstrukt, prepis genov. 1. UVOD Iz naravnega okolja, kot sta na primer ustna votlina in globokomorsko dno, je zahtevno pridobiti določen protein iz nekega organizma. Postopek zahteva osamitev organizma iz naravnega okolja in vzpostavitev laboratorijskih pogojev za rast organizma ter izolacijo naravnega protein iz celice oziroma tkiva organizma. Visoko zmogljive metode za določitev nukleotidnih zaporedij, sklopljene s primerjavo identificiranih zaporedij ali prevedenih identificiranih zaporedij z nukleotidnimi zaporedji, na primer v podatkovni zbirki GenBank na strežniku National Center for Biotechnology Information (NCBI) ali anotiranimi aminokislinskimi zaporediji v podatkovni zbirki Swiss-Prot na strežniku UniProt (Benson in sod., 2014; Boutet in sod., 2016), so močno alternativno orodje za prepoznavo genov z zapisom za preučevani protein. Prepoznani tarčni gen lahko izrazimo v primernem ekspresijskem organizmu. 2. PARBORLIZIN NITKARJA Parborlasia corrugatus Organizmi v okolju so pogosto v kontaktu in kompeticiji s predstavniki lastne ali druge vrste. V kolikor te interakcije vplivajo na preživetje in razmnoževanje, so te vrste z evolucijskega pogleda socialne. Organizmi, ki so podvrženi tekmovanju za svoj habitat, so razvili obrambne mehanizme, ki jim omogočajo osvojitev določene ekološke niše. V ta namen sintetizirajo številne učinkovine (Antonov in sod., 2008; Berne in sod., 2003), nekatere izmed njih so tudi biotehnološko uporabne (Shakeri in Sahebkar, 2015). Antarktični morski organizmi so slabo preučeni in predstavljajo bogat repertoar sekundarnih metabolitov, ki jim omogočijo prednost v tekmi za npr. svetlobo, prostor, nutriente (Whelan in sod., 2014). Deblo nitkarjev (Nemertea) vključuje ~ 1500 vrst predvsem morskih organizmov, za katere je že dolgo znano, da sintetizirajo številne toksine, ki jih uporabljajo pri plenjenju ter obrambi pred plenilci (Whelan in sod., 2014; Bacq, 1936). Eden takih primerov je nitkar Parborlasia corrugatus, ki živi na Antarktiki. Odrasli nitkar P. corrugatus doseže do 2 m v dolžino in 2 cm v širino, njegovo telo pa je citotoksično za številne morske organizme (Heine in sod., 1991) (slika 7-1). 65

74 Slika 7-1: Heteronemertin P. corrugatus. Vir: Smithsonian's National Museum of Natural History (Združene Države Amerike). Berne in sodelavci (2003) so izolirali naravni citotoksin heteronemertina P. corrugatus, parborlizin, in pridobili N-končno aminokislinsko zaporedje tega ~ 10 kda proteina. Naravni parborlizin je liziral sesalske eritrocite. Z namenom boljše karakterizacije parborlizina smo namesto težavne in zamudne izolacije naravnega proteina pridobili nukleotidno zaporedje parborlizina in poskusili izolirati rekombinantni protein (Butala in sod., 2015). Na podlagi N-terminalnega aminokislinskega zaporedja parborlizina smo izdelali degenerirane začetne oligonukleotide ter kot matrično DNA v verižni reakciji s polimerazo uporabili cdna, pridobljeno iz mrna, izolirane iz tkiva heteronemertina. Pridobili smo nukleotidna zaporedja sedmih izooblik parborlizina, vključke, zaporedje posamezne izooblike P1, P2 ali P3, smo preko mest za restrikcijska encima NdeI in XhoI vstavili v plazmidni vektor pet21c (Novagen) (slika 7-2). Tako smo pridobili plazmidni konstrukt za sintezo proteina s heksahistidinskim repom na C-koncu proteina. 66

75 Slika 7-2: A. Restrikcijska karta okoli 5800 baznih parov (bp) velikega plazmidnega konstrukta z vstavljenim vključkom za izoobliko parborlizina. Aktivnost promotorja T7 sprožimo ob dodatku izopropil-βtiogalaktopiranozida. Heksahistidinski rep (His 6 ) omogoči izolacijo sintetiziranega rekombinantnega proteina z nikelj-afinitetno kromatografijo. Ampicilin na sliki označuje gen bla za β-laktamazo. Restrikcijska karta je pripravljena s programom Vector NTI. B. Shematski prikaz izooblike parborlizina z mestom za proteazo trombin (rumeno), domeno TolAIII (rdeče - služi za izboljšanje topnosti parborlizina) ter His 6 na C-koncu proteina. C. Poravnava aminokislinskih zaporedij treh izooblik (P1-P3) parborlizina. Plazmidni konstrukt (slika 7-2A) smo s tranformacijo vnesli v celice E. coli Rosetta-gamiB (F - ompt hsds B (r B - m B - ) gal dcm lacy1 ahpc (DE3) gor522::tn10 trxb prare (Cam R, Kan R, Tet R )). V slednjem bakterijskem sevu je izboljšana tvorba disulfidnih vezi in s tem zvitje rekombinantnih evkariontskih proteinov. Rekombinantni polipeptidi parborlizina so bazični in vsebujejo 5 6 cisteinov (slika 7-2), kar nakazuje, da strukturo proteina zagotavljajo do tri disulfidne vezi, ki proteinu verjetno zagotavljajo stabilnost pri različnih fizikalno-kemijskih pogojih. Slednje potrjuje tudi dejstvo, da je homolog parborlizina, nevrotoksični toksin A-III nitkarja Cerrebratulus lacteus, prav tako sestavljen iz okoli 90 aminokislin in vsebuje tri disulfidne mostičke in je zelo stabilen tudi ob segrevanju nad 80 C (Kem, 1994; Blumenthal, 1980). Omenjene značilnosti nakazujejo na biotehnološki potencial parborlizina. Po sprožitvi sinteze rekombinantnega proteina smo pridobili parborlizin v nanomolarni (nm) koncentraciji. Glede na 67

76 analize so pridobljene različice rekombinantnega proteina zelo hidrofobne in se lepijo na površine laboratorijskega materiala. Rekombinantni protein smo tako pridobili v prenizki koncentraciji za nadaljnje študije, te pa bodo usmerjene v izboljšanje postopkov izolacije rekombinantnega parborlizina. 3. CITOTOKSIN CDT BAKTERIJE Aggregatibacter actinomycetemcomitans Parodontoza je kronična vnetna bolezen obzobnih tkiv, ki se v začetnem obdobju kaže z oteklino in rdečino dlesni, v napredovani fazi pa nastanejo obzobni žepi ter tako prizadet zob postane majav (Kassebaum in sod., 2014). Vnetje in izzvani imunski odziv gostitelja lahko posledično privedeta do izgube zob. Bolezen sprožijo bakterije v biofilmu zobnih oblog. Takšna mikrobna združba je pritrjena ob robu dlesni in lahko vsebuje več kot 700 različnih bakterijskih vrst (Aas in sod., 2005). Z nastankom parodontalne bolezni se povezuje predvsem po Gramu negativne anaerobne in fakultativno anaerobne bakterije, kot sta bakteriji Porphyromonas gingivalis in Tannerella forsythia, a izstopajoča v več pogledih je bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Bakterija A. actinomycetemcomitans je lahko del normalne bakterijske flore (Kononen in sod., 2007), določene seve pa se povezuje z nastankom agresivnejših oblik parodontalne bolezni (Slots in Ting, 1999). Bakterijo A. actinomycetemcomitans povezujejo tudi z nastankom ognojkov mehkih tkiv, endokarditisa, zaradi aterogenih lastnosti pa še z boleznimi srca in ožilja. Ob nastanku parodontoze se ravnovesje mikrobne flore poruši (Hajishengallis in sod., 2012). Bakterija A. actinomycetemcomitans se pri pacientih s parodontitisom namnoži do takšne mere, da najverjetneje poruši normalno ustno floro in omogoči razrast patogenih bakterij. Bakterija A. actinomycetemcomitans sintetizira nabor virulentnih dejavnikov: fimbrije za kolonizacijo obzobnega žepa, kolagenazo za poškodbo obzobnih tkiv ter toksina (levkotoksin in cytholethal distending toxin (Cdt)), ki zavirata lokalni vnetno-imunski odziv v dlesni (Henderson in sod., 2010). Izvedli smo preliminarno raziskavo, da bi prepoznali specifičnosti bakterijskih sevov A. actinomycetemcomitans v plakih obzobnih tkiv Slovencev (Obradović in sod., 2014). Pri sedemnajstih (57 %) pacientih z zmernim do napredujočim kroničnim parodontitisom smo izolirali bakterijo A. actinomycetemcomitans. Pri dveh izolatih smo identificirali še neopisano različico toksina Cdt, kar bi lahko bila specifičnost v naši regiji. Z namenom karakterizacije aktivnosti nove različice toksina Cdt smo podobno kot v primeru rekombinantnega parborlizina izvedli molekulsko kloniranje in vstavili vključek za toksin Cdt v vektor pet21c. S tako pripravljenim plazmidnim konstruktom smo transformirali celice E. coli BL21(DE3) in sprožili sintezo rekombinantnega toksina Cdt. Ta izkazuje specifične biokemijske lastnosti in pomembnost toksina pri razvoju parodontoze. 4. PLAZMIDNI KONSTRUKTI ZA ŠTUDIJE PREPISA GENOV Za študije molekulskih mehanizmov uravnavanja prepisa genov, predvsem genov za virulentne dejavnike, kot so toksini bakterij ali faktorjev, ki omogočajo bakteriji adaptacijo na stresne razmere v okolju, smo pripravili: (i) plazmidne konstrukte za sintezo spremenjenih transkripcijskih faktorjev za študije interakcije proteina z DNA ali (ii) plazmidne konstrukte za analizo uravnavanja prepisa genov. (i) Prepoznava konformacijske spremembe transkripcijskega faktorja, ki omogoči specifično uravnavanje prepisa genov. Protein LexA je transkripcijski faktor, ki je precej razširjen med bakterijami (Butala in sod., 2009) (slika 7-3). 68

77 Slika 7-3: Struktura podenote proteina LexA bakterije E. coli (PDB: 1jhh, veriga a) Označena sta katalitična ostanka serin-119 in lizin-156 ter v rumenem cepitvena regija in v rdečem cepitveno mesto proteina. Protein LexA je ključni protein bakterijskega odziva na poškodbo DNA in uravnava prepis številnih genov za virulentne dejavnike bakterij. V normalno rastoči bakteriji je protein intakten in utiša prepis genov (Erill in sod., 2007). V redkih bakterijah protein LexA deluje tudi kot aktivator prepisa genov (Tapias in sod., 2002). Ob poškodbi DNA se na mestu poškodbe tvori nukleoproteinski filament RecA-enoverižna DNA, ki sproži inaktivacijo proteina LexA ter tako sprožitev odziva SOS in popravilo poškodovane DNA (Little, 1991). Za razjasnitev konformacijske spremembe ob specifični vezavi proteina LexA na DNA smo izvedli simulacijo molekulske dinamike (slika 7-4) (Butala in sod., 2007). Iz simulacije smo predvideli, da je DNA-vezavna domena LexA zelo gibljiva in se mora nasproti dimerizacijski domeni sukati za 180 (sliki 7-4A in 4B). A B C D Slika 7-4: Simulacija molekulske dinamike vezave dveh proteinov LexA (zeleno, rumeno) na operator. A. Drsenje proteina LexA v nevezani konformaciji po DNA. B. Prepoznava specifičnega nukleotidnega zaporedja v DNA-vezani konformaciji. C, D. Spremembe DNA ob specifični vezavi LexA. 69

78 V namen dokaza te hipoteze smo pripravili plazmidne konstrukte za pridobitev različic proteina LexA (Butala in sod., 2007). Glede na tridimenzionalno strukturo LexA, nevezanega na DNA, smo določene aminokisline proteina LexA, navedene v Preglednici 7-1, spremenili v cistein. S točkovno mutagenezo plazmida z zapisom za divji tip LexA smo pridobili plazmidna konstrukta za sintezo rekombinantnih različic LexA. Posamezni plazmidni konstrukt smo vstavili s transformacijo v bakterijo E. coli BL21(DE3) in pridobili očiščeni različici proteina LexA s spremenjenima paroma aminokislin. Preglednica 7-1: Plazmidni konstrukti za sintezo proteina LexA in mutiranih različic LexA. w.t. divji tip. Različica represorja Aminokislinska sprememba Plazmidni konstrukt LexA w.t. pmb1 LexA-C13-C91 D13C, Q91C pivb13/91 LexA-C20-C87 S20C, P87C pivb20/87 Ob oksidaciji derivatov proteina LexA smo dokazali, da se protein zaklene v konformaciji, ki ni vezana na DNA. V reducirajočih pogojih se protein zopet odklene, kar je pogoj za vezavo na tarčno nukleotidno zaporedje. Dokazali smo, da je potrebna velika konformacijska sprememba v LexA, da se protein veže na tarčna zaporedja nukleotidov (Butala in sod., 2007). Slednje so kasneje dokazali tudi z eksperimentalno določeno tridimenzionalno strukturo kompleksa LexA-DNA (Zhang in sod., 2010). Študije dokažejo, da je za specifično vezavo proteinov na DNA poleg ustreznih fizikalno-kemijskih pogojev potreben značilen redosled nukleotidov in ustrezne konformacije proteina ter DNA. (ii) Plazmidni konstrukti za študije uravnavanja izražanja genov. Za študije prepisa genov, torej aktivnosti preučevanih promotorjev, pogosto sledimo izražanju promotorskih področij, spojenih s poročevalskim genom lacz brez lastnega promotorja, z zapisom za encim β-galaktozidaza (Sambrook in sod., 1989). Taki genski konstrukti so lahko na kromosomu ali na plazmidih. V kolikor uporabimo plazmide za takšne študije, sta pomembna velikost in število kopij plazmidne DNA. Plazmidni vektor prw50, z zapisom za poročevalski gen lacz brez lastnega promotorja, se pogosto uporablja za študije izražanja genov. Zaradi velikosti in majhnega števila kopij prw50 v bakteriji je izražanje genov primerljivo z izražanjem genov na bakterijskem kromosomu. Vpliv dodatnega zvijanja plazmida na izražanje genov je zaradi velikosti skoraj izničen (Browning in sod., 2004). Primer uporabe molekulskega kloniranja za študije prepisa genov je modifikacija promotorskega elementa 10 promotorja za bakteriocin, kolicin K. Nukleotidno zaporedje promotorskega elementa 10 (TAGGTT) smo spremenili v za podenoto σ 70 konsenzno zaporedje E. coli (TATAAT). S tem smo ob transformaciji modificiranega plazmida v bakterijo E. coli pridobili močnejši promotor, kar se izkaže kot zvečana sinteza encima β-galaktozidaza v primerjavi z izhodiščnim promotorjem. Obratno bi lahko zaporedje elementa 10 promotorja spremenili tako, da bi pridobili nedelujoč promotor in s tem dokazali, da ni drugih promotorskih elementov na izbranem odseku promotorskega področja gena. 70

79 5. ZAKLJUČEK Molekulsko kloniranje je pomembno preoblikovalo molekularnobiološke in biokemijske raziskave. Ta tehnologija nam je omogočila pridobitev evkariontskih in prokariontskih rekombinantnih proteinov, ki jih v naravni obliki nismo zmožni izolirati (Obradović in sod., 2014; Butala in sod. 2015; Fornelos in sod., 2015), ali pridobiti vpogled v značilnosti transkripcijskih faktorjev ter za študije aktivnosti promotorjev (Butala in sod., 2007; Butala in sod., 2008). In še komentar na definicijo: O gensko spremenjenem organizmu (GSO) govorimo takrat, ko se pridobi nek organizem, z izjemo človeka, ali mikroorganizem, ki ima genski material spremenjen s postopki, ki spreminjajo genski material drugače, kot to poteka v naravnih razmerah s križanjem ali naravno rekombinacijo. Kot definirano, pojem GSO v primeru bakterij s plazmidnim konstruktom s tujo DNA ni najprimernejši. Genskega zapisa bakterije ob transformaciji s plazmidnim konstruktom nismo spremenili. Npr., če bakterijo gojimo brez selekcijskega pritiska, bodo hčerinske celice v nekaj generacijah nehale podvojevati plazmidni konstrukt. Bo takrat bakterija še vedno razumljena kot GSO? Verjetno bi bil bolj ustrezen termin za organizme, ki smo jih uporabili v študijah (Obradović in sod., 2014; Fornelos in sod., 2015), genomsko spremenjeni organizmi. 6. LITERATURA Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol 43: Antonov, A. S., Avilov, S. A., Kalinovsky, A. I., Anastyuk, S. D., Dmitrenok, P. S., Evtushenko, E. V., Kalinin, V. I., Smirnov, A. V., Taboada, S., Ballesteros, M., Avila, C., Stonik, V. A Triterpene glycosides from Antarctic sea cucumbers. 1. Structure of liouvillosides A1, A2, A3, B1, and B2 from the sea cucumber Staurocucumis liouvillei: new procedure for separation of highly polar glycoside fractions and taxonomic revision. J Nat Prod 71: Bacq, Z. M Les poisons des nemertiens. Bull Acad R Belg Clin Sci 22: Benson, D. A., Clark, K., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W GenBank. Nucleic Acids Res 42: D Berne, S., Sepčić, K., Križaj, I., Kem, W. R., McClintock, J. B., Turk, T Isolation and characterisation of a cytolytic protein from mucus secretions of the Antarctic heteronemertine Parborlasia corrugatus. Toxicon 41: Blumenthal, K. M Structure and action of heteronemertine polypeptide toxins. Disulfide bonds of Cerebratulus lacteus toxin A-III. J Biol Chem 255: Boutet, E., Lieberherr, D., Tognolli, M., Schneider, M., Bansal, P., Bridge, A. J., Poux, S., Bougueleret, L., Xenarios, I UniProtKB/Swiss-Prot, the manually annotated section of the UniProt KnowledgeBase: how to use the Entry View. Methods Mol Biol 1374: Browning, D. F., Cole, J. A., Busby, S. J Transcription activation by remodelling of a nucleoprotein assembly: the role of NarL at the FNR-dependent Escherichia coli nir promoter. Mol Microbiol 53: Butala, M., Hodošček, M., Anderluh, G., Podlesek, Z., Žgur-Bertok, D Intradomain LexA rotation is a prerequisite for DNA binding specificity. FEBS Lett 581: Butala, M., Podlesek, Z., Žgur-Bertok, D The SOS response affects thermoregulation of colicin K synthesis. FEMS Microbiol Lett 283: Butala, M., Žgur-Bertok, D., Busby, S. J The bacterial LexA transcriptional repressor. Cell Mol Life Sci 66: Butala, M., Šega, D., Tomc B, Podlesek, Z., Kem, W. R., Küpper, F. C., Turk, T Recombinant expression and predicted structure of parborlysin, a cytolytic protein from the Antarctic heteronemertine Parborlasia corrugatus. Toxicon 108: Erill, I., Campoy, S., Barbe, J Aeons of distress: an evolutionary perspective on the bacterial SOS response. FEMS Microbiol Rev 31: Fornelos, N., Butala, M., Hodnik, V., Anderluh, G., Bamford, J. K., Salas, M Bacteriophage GIL01 gp7 interacts with host LexA repressor to enhance DNA binding and inhibit RecA-mediated auto-cleavage. Nucleic Acids Res 43: Hajishengallis, G., Darveau, R. P., Curtis, M. A The keystone-pathogen hypothesis. Nat Rev Microbiol 10: Heine, J. N., McClintock, J. B., Slattery, M., Weston, J Energetic composition, biomass, and chemical defense in the common Antarctic nemertean Parborlasia corrugatus McIntosh. J Exp Mar Biol Ecol 153:

80 Henderson, B., Ward, J. M., Ready, D Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans: a triple A* periodontopathogen? Periodontol : Kassebaum, N. J., Bernabe, E., Dahiya, M., Bhandari, B., Murray, C. J., Marcenes, W Global burden of severe periodontitis in : a systematic review and meta-regression. J Dent Res 93: Kem, W. R Structure and membrane actions of a marine worm protein cytolysin, Cerebratulus toxin A-III. Toxicology 87: Kononen, E., Paju, S., Pussinen, P. J., Hyvonen, M., Di Tella, P., Suominen-Taipale, L., Knuuttila, M Population-based study of salivary carriage of periodontal pathogens in adults. J Clin Microbiol 45: Little, J. W Mechanism of specific LexA cleavage: autodigestion and the role of RecA coprotease. Biochimie 73: Obradović, D., Gašperšič, R., Seme, K., Maček, P., Butala, M Genotype characterization of (opportunistic pathogen) Aggregatibacter actinomycetemcomitans strains from Slovenian patients with chronic periodontitis: a preliminary study. Zobozdravstveni vestnik 69: Sambrook, J., Fritsch, F. E., Maniatis, T Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Shakeri, A., Sahebkar, A Anti-cancer products from marine sponges: progress and promise. Recent Pat Drug Deliv Formul 9: Slots, J., Ting, M Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in human periodontal disease: occurrence and treatment. Periodontol : Tapias, A., Fernandez, S., Alonso, J. C., Barbe, J Rhodobacter sphaeroides LexA has dual activity: optimising and repressing reca gene transcription. Nucleic Acids Res 30: Whelan, N. V., Kocot, K. M., Santos, S. R., Halanych, K. M Nemertean toxin genes revealed through transcriptome sequencing. Genome Biol Evol 6: Zhang, A. P., Pigli, Y. Z., Rice, P. A Structure of the LexA-DNA complex and implications for SOS box measurement. Nature 466:

81 8. POGLAVJE Gensko spremenjene vinske mušice Gregor Belušič POVZETEK Vinska mušica je že sto let predmet intenzivnih genetskih raziskav, zato je danes najpomembnejši evkariontski modelni organizem. V prispevku so predstavljeni biologija mušice, gojenje v laboratoriju, zgodovina raziskav, osnove klasičnih in molekularno genetskih pristopov k raziskavam mušice, pomen mušice kot modelnega organizma v nevrobiologiji, razvojni biologiji in humani medicini ter raziskave na Oddelku za biologijo od leta 2000 do danes, v katerih vinska mušica nastopa kot model za študij zaznave svetlobe in celične signalizacije. KLJUČNE BESEDE: vinska mušica, Drosophila melanogaster, mutacije, balanserski kromosomi, egfp, fototransdukcija. 1. UVOD Vinska mušica, Drosophila melanogaster, je že dobrih sto let delovni konj bioloških laboratorijev (Ashburner in sod., 2005). Sodi med modelne organizme, torej med tiste organizme, ki omogočajo posebej natančen, analitičen in invaziven študij življenjskih procesov na vseh ravneh, od molekule do vedenja. Čeprav, tako kot glista Caenorhabditis elegans, mušica spada med nevretenčarje, pri njej lahko preučujemo zapletene fiziološke procese, kompleksna vedenja, učenje, genetiko, razvojne procese in zakonitosti. Drosophila je torej pravi živalski modelni organizem, vendar poskusi na njej niso regulirani z zakonodajo o zaščiti živali, ki kot poskusne živali posebej ščiti samo vretenčarje in glavonožce. Tudi zakonodaja o GSO jo večinoma uvršča med gensko spremenjene organizme 1. varnostnega razreda (GSO1), saj kot prejemni organizem in kot GSO z različnimi vključki ne povzroča bolezni ali sprememb pri zdravih ljudeh, živalih ali rastlinah. Zato je lahko mušica, kot preprosta žival, vendar z vsemi atributi uravnavanega, kompleksnega organizma, idealen objekt za študij življenjskih procesov, bolezni ali zdravil. Raziskovalcem omogoča velik kvalitativen preskok glede na omejitve, ki jih srečujemo pri študiju celičnih kultur ali prokariontskih organizmov. 2. BIOLOGIJA IN GOJENJE VINSKE MUŠICE Vinsko mušico odlikujeta kratek razvojni krog in visok reproduktivni potencial. Pri temperaturi 25 C se iz oplojenega jajčeca ličinka izleže v približno 24 urah, iz nje pa se pojavi odrasla žival v približno 9 dneh. Temperatura ima velik vpliv na hitrost razvoja mušice: ta traja 7 dni pri 29 C, 9 dni pri 25 C, 11 dni pri 22 C, 19 dni pri 18 C. Pri nižjih temperaturah se lahko razvijejo nekoliko večje telesne celice, kar lahko nekoliko olajša eksperimentiranje. Temperature nad 27 C izzovejo degenerativne spremembe v nevronih (Miquel in sod., 1976). Vinsko mušico lahko vsekakor uspešno gojimo pri sobni temperaturi. Odrasle živali lahko živijo do 3 mesecev. Vinska mušica je zelo primerna in nezahtevna za gojenje v laboratoriju (Ashburner in Roote, 2007), saj je majhna, v kulturi jo lahko vzdržujemo v visoki gostoti, posodje ( ml plastične posodice z zamaški iz poliuretana ali bombaža) in hranilna gojišča pa so sorazmerno poceni. Vinske mušice se prehranjujejo s kvasovkami, ki uspevajo zlasti na načetem ali prezrelem sadju. Zato gojišča pripravljamo iz pekovskega kvasa, koruzne moke, sladkorja, agarja, vitamina C in konzervansov, ki preprečujejo plesnenje. Mušice v visoki gostoti same preprečujejo pojav plesni, mutirani ali transgeni sevi s šibkejšo rodnostjo pa zaradi plesni pogosto propadejo. V gojiščih so pogoste okužbe s patogenimi bakterijami, zlasti pa s pršicami. Pršic, ki uspevajo v gojiščih, je nekaj 100 vrst; večina jih z mušicami samo tekmuje za hrano in so komenzalske, mnoge pa parazitirajo na jajcih, ličinkah ali odraslih mušicah. 73

82 Zaradi pršic nove seve po prihodu v laboratorij nastanimo v karanteni, obstoječe seve pa pogosto precepljamo, približno na teden ali dva, saj razvoj pršic ponavadi zaostaja za razvojem mušic. Mušice spolno dozorijo v slabem dnevu. Spol določa kombinacija spolnih kromosomov (XX, XY). Samice so nekoliko večje od samčkov, imajo večje oči in segmentirano svetlo-temno obarvan zadek. Samčki imajo zadnja dva segmenta zadka enovito temno obarvana (od tod ime melanogaster žival s temnim trebuhom) in na sprednjih nogah značilne temne izrastke. V gojišču se najprej pojavijo odrasle samice, proti koncu generacije pa prevladujejo samčki. Ob križanju potrebujemo neoplojene device, ki jih izoliramo takoj po izleganju, prepoznamo pa jih po mehki, prosojni kutikuli, skozi katero lahko vidimo temnozelen mekonij v prebavilu. Slika 8-1: Vinska mušica. A. Jajce. B. Ličinka z označeno glavo. C. Samica. D. Samček. E. Zadek device z mekonijem. Viri slike: A. Uporabnik JWSchmidt na en.wikipedia izvirnik na en.wikipedia; CC BY-SA 3.0, B. Uporabnik J. Albert Vallunen lastno delo, CC BY- SA 2.5, C. E. G. Belušič. Mušico odlikujejo dokaj zapletena paritvena vedenja, ki obsegajo vibracijski napev, ples, kopulacijo; živali obeh spolov so lahko tudi teritorialne in agresivne (Baier in sod., 2002), v naravi pa lahko v ravni trajektoriji migrirajo več kilometrov na dan (Coyne in sod., 1982). Vinske mušice so zelo tolerantne do hipoksije ali anoksije. Zato lahko pri delu z njimi uporabljamo anestezijo s CO 2, ki ga kot plin dovajamo z rahlim pihanjem skozi porozno podlago za mušice (slika 8-5). Anestezija deluje hipoma, mušice so ji lahko izpostavljene nekaj minut, zbudijo se v slabi minuti, posledice anestezije pa so subtilne, vendar trajne in merljive (Colinet in Renault, 2012). 3. ZGODOVINA RAZISKAV Drosophila je v biološke laboratorije vstopila približno leta 1910, ko jo je Thomas Hunt Morgan na Univerzi Columbia izbral za modelni organizem, pri katerem je želel preučevati evolucijo v epruveti oziroma svojo hipotezo, da so spontane mutacije in ne naravni izbor gonilo evolucije. V laboratorijski 74

83 kulturi je hitro prepoznal mutirane mušice, ki so s svojimi belimi sestavljenimi očmi zelo izstopale med rdečeokimi mušicami divjega tipa. Spoznal je, da lahko s križanji zlahka vzpostavi trajno kulturo belookih mušic, in da je mutacija vezana na spolni kromosom X. S tem je postavil temelj kromosomski teoriji dedovanja, za katero je leta 1933 prejel Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino. Vinska mušica je zatem za nekaj desetletij ostala v senci tedaj novih in lažje razumljivih modelnih organizmov za genetske raziskave, kot so kvasovke in bakterije. Ponoven vzpon je sledil v poznih šestdesetih in sedemdesetih letih 20. stoletja. Postala je osrednji model razvojno bioloških raziskav in leta 1995 predmet nove Nobelove nagrade za fiziologijo in medicino (C. Nüsslein-Vollhard, E. Wieschaus, E. Lewis za razumevanje, kako geni določajo razvoj telesne osi). Leta 2000 je bil objavljen njen celoten genom (Adams in sod., 2000). Danes ostaja mušica najbolj intenzivno preučevan evkariontski organizem. 4. GENETIKA VINSKE MUŠICE 4.1. GENOM IN KROMOSOMI Genom vinske mušice je sorazmerno preprost: 165 milijonov baznih parov, ki tvorijo približno genov, se nahaja na štirih parih kromosomov. Geni so neredundantni in se večinoma pojavljajo v eni sami kopiji. Slika 8-2: Kromosomi vinske mušice. V jedru lahko prepoznamo tri pare avtosomov (kromosomi 2, 3, 4) in en par spolnih kromosomov (XX, XY). Avtosom 4 je zelo majhen, tako da ga pogosto izpuščajo iz opisa sevov. V slinavkah najdemo orjaške, politene kromosome. Ti nastanejo z kratno delitvijo kromatid, tako da jih tvori sestrskih kromatid, ki so popolnoma lateralno povezane. Orjaški kromosomi kažejo jasno prepoznavne regije, v katerih poteka intenzivno prepisovanje genov. Uporabljamo jih za kartiranje genov na kromosome (Langer-Safer in sod., 1982). Klasična genetska križanja olajšuje dejstvo, da med mejozo v testisih praktično ni rekombinacije. V ovarijih je rekombinacije le malo (1 2 rekombinaciji na mejozo, nič rekombinacije v heterokromatinu in na 4. kromosomu) BALANSERSKI KROMOSOMI Eno najmočnejših genetskih orodij pri mušici so tako imenovani balanserski kromosomi (angl. balancer chromosomes) (Greenspan, 2004). To so kromosomi, ki nosijo multiple inverzije. Zaradi tega se ob mejozi nikoli ne rekombinirajo. V DNA nosijo eno ali več letalnih, vendar recesivnih mutacij. Homozigotno stanje s parom balanserskih kromosomov je letalno in homozigoti ne proizvedejo ličink. Obenem pa balanserski kromosomi nosijo dominantne gene, ki proizvedejo značilne zunanje telesne znake oz. označevalce. Zato so ličinke ali odrasli heterozigoti z balanserskimi kromosomi zlahka prepoznavni. 75

84 Slika 8-3: Telesa mušic z balanserskimi kromosomi. Levi stolpec, divji tip (wt); desni stolpec, sevi z balanserskimi kromosomi Cy (curly wings, kodrasta krila) in Sb (stubble, toge dlačice). Balanserske kromosome uporabljamo predvsem za vzdrževanje sevov z mutacijami, ki so homozigotno letalne. Z balanserskimi kromosomi lahko tudi na zelo eleganten način izvedemo križanja, pri katerih želimo v potomstvu proizvesti sev z več ali manj mutacijami, kot jih imajo starši. Če na balanserski kromosom uvedemo želeno mutacijo, potem jo na ta način učinkovito opremimo z zunanjim telesnim znakom. Slika 8-4: Vzdrževanje homozigotno letalne mutacije (X) s križanjem z balanserskimi kromosomi. 76

85 Najznamenitejši balanserski kromosomi so stari že skoraj sto let (Ward, 1923). Slika 8-5: Križanje vinskih mušic v laboratoriju Skupine za integrativno fiziologijo in fiziologijo živali. Levo spredaj, posodice z gojišči z balansiranimi mušicami. Sredina, lupa z nastavkom za anestezijo mušic s CO 2. Desno v ozadju, usmrtilnik z etanolom. Preglednica 8-1: Najpomembnejši balanserski kromosomi in njihov fenotip. Kromosom Ime balanserskega Dominantni fenotip kromosoma X (First) FM7 Bar eye stebričasto oko 2 (Second) SM5 ali CyO Curly wings kodrasta krila 3 (Third) TM3 ali TM6 Stubble bristles strniščaste dlake 4.3. MUTAGENEZA IN MUTANTE Mutante vinske mušice pridobivamo na več načinov. Najbolj razširjena je mutageneza z izpostavljanjem jajc kemijskim mutagenom (EMS, etilmetilsulfonat) ali radiaciji. Kemijska mutageneza proizvaja točkovne mutacije, ki pa so pogosto težavne za kartiranje, pri njej pa nastajajo dvojni zadetki. Mutageneza z rentgenskimi žarki povzroča kromosomske mutacije velike delecije, translokacije ali inverzije. Mutirane seve označujemo na osnovi načel uveljavljene nomenklature (Grigliatti, 1998). Divjega tipa (wild type, wt) ne navajamo. Mutacije na homolognih kromosomih označujemo v obliki ulomka z enim kromosomom v števcu in drugim v imenovalcu. Kromosome med seboj ločujemo s podpičjem. Imena mutant so okrajšana z dvema ali več črkami. Dominantne mutacije pišemo z veliko, recesivne z malo začetnico. Aleli so nadpisani. Gene označujemo s poševnimi malimi tiskanimi črkami, proteine z velikimi tiskanimi črkami. sev CyO Sb ; ; y Slika 8-6: Primer oznake seva. Prikazana je oznaka seva, ki ima na enem X-kromosomu mutacijo sevenless (sev odsoten fotoreceptor št. 7, R7), na drugem X-kromosomu mutacijo za svetlo barvo telesa yellow (y), en kromosom št. 2 je balanser z mutacijo Curly wings (CyO), drugi kromosom št. 2 je brez mutacij (+), en kromosom št. 3 je balanser z mutacijo Stubble (Sb), drugi kromosom št. 3 je brez mutacij (+). 77

86 V izvirniku so imena mutant deskriptivna in pogosto duhovita, npr.: Anachronism, armadillo, baboon, beaten path, Brahma, brainiac, breathless (mutacija, ki prizadene razvoj trahej), daughters against decapentaplegic, dissatisfaction (prizadene spolno vedenje), gypsy (mobilni genetski element), tinman (mutanta brez srca) 4.4. TRANSGENEZA TRANSPOZONI Mutageneza in transgeneza s transpozoni omogoča lažje ciljanje in kartiranje mutacij (Grigliatti, 1998). Hibridna disgeneza poteka s transpozoni, imenovanimi P-elementi. Zgodnje embrije mikroinjiciramo z mešanico dveh plazmidov: en plazmid vsebuje želeni gen, lociran med dvema obrnjenima ponovitvama, drugi plazmid pa vsebuje transpozazo. Na ta način ustvarimo mozaične potomce, ki imajo delno transgene telesne celice, vsebujejo pa tudi transgene gamete. Transgen je označen s telesnim označevalcem, npr. z genom za temno kutikulo ali rdeče oči, tako da omogoča selekcijo uspešno transficiranih potomcev TEHNIKA ZA IZRAŽANJE TRANSGENOV Tehnika, ki jo najpogosteje uporabljajo za izražanje transgenov v poljubnih tipih celic ali tkiv, se imenuje UAS/GAL4 Enhancer Trap System (Brand in Perrimon, 1993). Sistem obsega dva dela: gen GAL4, ki kodira protein kvasovk za aktivacijo transkripcije, in pospeševalec UAS (angl. upstream activation sequence), na katerega se GAL4 specifično veže ter tako aktivira transkripcijo. Sevi GAL4 nudijo širok izbor za ekspresijo genov znotraj različnih tipov celic, tkiv, razvojnih stadijev. Na drugi strani lahko izbiramo med izredno širokim naborom konstruktov UAS. Med najpomembnejše konstrukte UAS sodijo: fluorescenčni proteini (zeleni GFP, rdeči RFP) kanalski rodopsin Channelrhodopsin, kanalski rodopsin Halorhodopsin (ionska kanala, ki ju odpira svetloba, in ki omogočata optogenetsko krmiljenje nevronov v živčevju živali; Channelrhodopsin je prepusten za katione in omogoča vzburjenje nevronov, Halorhodopsin je prepusten za Cl anione in omogoča utišanje nevronov) Shibire, protein, ki omogoča utišanje sinaptičnega prenosa z izpostavitvijo živali temperaturi > 29 C genetsko kodirani kalcijevi indikatorji GECI (angl. genetically encoded calcium indicators), skupina hibridnih fluorescenčnih proteinov, ki emitirajo kratko ali dolgovalovno fluorescenco prek mehanizma FRET (= prenos energije z resonanco fluorescence) v odvisnosti od koncentracije Ca 2+ v celici. Slika 8-7: Oko belooke vinske mušice, ki vsebuje transgen egfp-trpl. egfp-trpl je konstrukt zelenega fluorescenčnega proteina egfp in od svetlobe odvisnega ionskega kanala TRPL. Mušice so bile izpostavljene 12 h temi (T) oziroma 20 min svetlobi (S). V temi se konstrukt nahaja predvsem v svetločutnem delu fotoreceptorja (rabdomu), na svetlobi pa se premakne v neaktivni del fotoreceptorjev, v somo. Zato je fluorescenčni signal iz globoke psevdopupile (obroč v središču očesa) v temi močan, na svetlobi pa šibak. Slikano s fluorescenčnim mikroskopom (modra ekscitacija, zelena emisija). 78