Microsoft Word - AAsem2011_NKostevsek.doc

Transkripcija

1 Univerza v Ljubljani Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerzitetni študijski program Kemija Izbirni sklop analizna in anorganska kemija Avtomatizirana analiza Seminar 2011 Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza ( ). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu napake ali druge nepravilnosti. Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

2 NOVOSTI NA PODROČJU AVTOMATSKE TRDNO-FAZNE EKSTRAKCIJE (SPE) NA OBNOVLJIVIH POVRŠINAH V PRETOČNEM SISTEMU Seminarska naloga pri predmetu Avtomatizirana analiza Avtor: Nina Kostevšek Mentor: prof. dr. Boris Pihlar Ljubljana, april 2011

3 KAZALO 1 POVZETEK OSNOVE ON-LINE TRDNO-FAZNA EKSTRAKCIJA (on-line SPE) KONCEPT DELČNEGA INJICIRANJA RAZVOJ INSTRUMENTACIJE »JET-RING«CELICA in»rotating-rot«pretočna CELICA LAB-ON-VALVE (laboratorij na ventilu) FI-BI z pretočno celico domače izdelave in komercilano pretočno celico Magnetna pretočna celica ANALITIČNI POSTOPKI PRI DELČNEM INJICIRANJU Modifikacije delcev Nalaganje analita Tehnike detekcije APLIKACIJE PRETOČNEGA DELČNEGA INJICIRANJA Okoljski testi Celični testi Študije afinitet pri kinetiki in afinitetna kromatografija Imunološki testi Čiščenje in kvantitavtivna analiza DNA in specifičnih biomarkerjev Trendi v prihodnosti LITERATURA

4 SLOVAR: SPE- solid-phase extraction - ekstrakcija na trdni fazi BI- bead-injection - delčno injiciranje SI- sequential injection - sekvenčno injiciranje 1 POVZETEK Ekstrakcija na trdni fazi-spe ( ang. solid-phase extraction) je najbolj vsestranska metoda za odstranjevanje motečih zvrsti pri pripravi vzorcev. V zadnjih letih je bil narejen velik napredek pri avtomatizaciji analitskih postopkov, ki vsebujejo SPE v povezavi z pretočnimi injektorskimi sistemomi. Pri on-line SPE testih se je pojavil problem zanesljivosti kot posledica vedno manjših izvedb delčnega reaktorja, kontaminacije trdnih površin in možnega puščanja sestavnih delov. Analiza z delčnim injiciranjem (ang. bead-injection analysis-bi) temelji na avtomatski obnovi sorbenta (material, ki absorbira tekočine ali pline). V nadaljevanju so predstavljene nove možnosti za izvedbo delčne injektorske analize in alternativne možnosti za on-line kemijskederivativne reakcije. Opisanih je tudi nekaj najpomembnejših okoljskih in bioanalitskih aplikacij, ki so bile uporabjene v zadnjih nekaj letih. 2 OSNOVE [1] [2] [3] Kompleksnost matrik vzorcev na okoljskem, biološkem, industijskem in biotehnološkem področju, lahko privede do težav pri njihovem direktnem določevanju kljub uporabi modernih analitskih tehnik. To je posledica odvisnosti analitskih rezultatov od sestave komponent matriksa, in tudi dejstva, da je koncentracija analita večkrat pod lineranim območjem detektorja. Zato se je pojavila potreba po razvoju enostavne, robustne in zanesljive predpriprave vzorca, s katero odstranimo moteče komponente in hkrati izboljšamo detekcijo analita z predkoncentracijo. Če bi to opravljali ročno, bi bil ta korak zahteven in zamuden, težko bi ga sistematično kontrolirali in bi veliko doprinesel k napaki (npr. okužba vzorca) in to bi lahko odločilno vplivalo na točnost in natančnost rezultatov [1]. Pretočna injektorska analiza (ang. FIA - flow-injection analysis) je pripeljala do velikega napredka pri pripravi vzorca zaradi učinkovtosti, robustnosti, hitrega delovanja in zanesljivosti. Pri razvoju pretočne injektorske analize govorimo o treh generacijah: (1) pretočno injiciranje (ang. FI-flow injection), (2) sekvenčno ijniciranje (ang. SI-sequential injection) in (3) t.i.»laboratorij na ventilu«sistem (ang. LOV lab-on-valve). Prvi dve generaciji igrata pomebno vlogo pri miniaturizaciji in avtomatizaciji predpriprave vzorca. Zamenjali sta 3

5 separacijske/predkoncentracijske tehnike, ki so se prej izvajale ročno. SPE tehnika, ki temelji na interakcijah tekoče-trdno, je najpogosteje uporabljena on-line tehnika za pripravo vzorca. Pogosto pride do irreverzibilnih sprememb na reaktivnih površinah trdne faze. Da bi odstranili to pomanjkljivost, je nastala tretja generacija pretočnih injektorskih tehnik- SI-LOV. Miniaturiziran LOV sistem omogoča kakršnikoli kemijski ali fizikalni proces, ki vključuje kontroliranje pretoka, homogene reakcije, tekoče-trdne interakcije na ventilu in hkratno optično detekcijo številnih procesov z optičnimi vlakni [3]. Sestava LOV obsega monolitično strukturo z mikrokanali in to omogoča avtomatiziran natančen vnos in transport suspenzij z delci-delčno injiciranje (BI). BI se uporablja pri izvajanju številnih on-line SPE procesov, ki vključujejo obnovo površine sorbenta med analizami [2]. Čeprav je na voljo veliko ekstrakcijskih tehnik za izolacijo analita iz kompleksnega vzorca, SPE igra pomembno vlogo pri pripravi vzorca, zaradi enostavne uporabe, avtomatizacije, nizke cene in velike izbire komercialno dostopnih sorbentov razlučnih proizvajalcev. Klasični SPE sorbenti zadržijo analite na podlagi neselektivnih interakcij (hidrofobnih ali hidrofilnih) in to lahko vodi tudi do vezave motečih zvrsti. Z uporabo»po meri«narejenih sorbentov so se povečale tudi možnosti za uporabo SPE. Z avtomatizacijo SPE, ki temelji na pretočnem sistemu, lahko dobimo učinkovo in direktno metodo, ki poveže pripravo vzorca z kromatografijo [2]. 3 ON-LINE TRDNO-FAZNA EKSTRAKCIJA (on-line SPE) [1] [6] Sorbtivna ekstrakcija je prevladujoča avtomatizirana metoda za pripravo vzorca, ki se uporablja na pretočnih sistemih, zaradi njenega enostavnega delovanja, visoke ločljivosti in sposobnosti predkoncentriranja in minimalne porabe organskih topil. Najpogosteje se uporablja mikrokolona, ki je napolnjena z primernim sorbtivnim materialom in postavljena znotraj pretočnega sistema pred detektor [1]. Cilj je izboljšati občutljivost analitičnega postopka in/ali premagati nizko občutljivost detektorskega sistema do komponent vzorca z predkoncentriranjem analita ali odstranitvijo motečih komponent iz težavnih vzorcev (visoka koncentracija soli ali proteinov v matrici), brez da bi vzorec razredčili. Številni trdno-fazni reaktorji so bili uspešno vgrajeni v pretočni sistem. Začasno zadržanje nizke koncentracije posameznih kovinskih ionov in nabitih (bio)molekul na podlagi elektrostatskih interakcij v ionskoizmenjevalni mikrokoloni ali kelatnih reaktorjih je običajna praksa v pretočnih trdno-faznih ekstrakcijskih sistemih. Derivatizirani nepolarni kovinski kelati (iminodiacetati, ditiokarbamati, ditiofosfati ali kvinolinati) ali hidrofobne zvrsti (organski polutanti, barvila in zdravila) so bili predkoncentrirani na reverzno-faznih materialih (oktadecil-kemijsko modificiran silikagel, politetrafluoroeten-ptfe delci ali drugi polimerni sorbenti) in ločeni zaradi hidrofobnih ali π-π interakcij. Ciljne spojine se neposredno obdržijo na reaktivnih površinah ali pa jih po in-line derivatizaciji pretvorimo v primerno obliko. S takšno ekstrakcijo se lahko izognemo motečim vplivom alkijskih in zemeljsko-alkalijskih elementov pri določanju sledov kovin s pametno izbiro kelatnega reagenta [1]. Kot je že bilo navedeno, so se pretočni SPE sistemi vgrajevali v trajno zaprte reaktorske kolone. Na takšnih sorbtivnih kolonah se lahko pojavi problem pri dolgotrajnem delovanju zaradi zamašitve kolone in posledično se pojavi velik protitlak, ki ga lahko ublažimo z povratnim 4

6 izpiranjem. Nadaljne slabosti on-line SPE pri večkratni uporabi površin so (ang.carry-over effect) prenašalni efekt-kar pomeni, da lahko naš analit zaradi predhodne uporabe kolone drugače reagira, pride do krčenja ali nabrekanja sorbenta, slabega delovanja bistvenih delov, vključno z izgubo funkcionalnih skupin (to je problem pri materialih,ki so impregnirani z reagentom) in tudi do deaktivacije površine zaradi ireverzibilne vezave motečih zvrsti. Vsem tem težavam se da izogniti z uporabo obnovljivih površin ali z uporabo BI, kjer se lahko trdnofazni material obnovi vsak analitičen cikel [1]. Delci z imobiliziranim primernim sorbentom se injicirajo v pretočni sistem, se zadržijo v pretočni celici, skozi katero potuje analizna raztopina z kontroliranim pretokom, in tam poteče vezava analita na delce. Po opravljeni meritvi se delci zavržejo in lahko začnemo z novo meritvijo [6]. 4 KONCEPT DELČNEGA INJICIRANJA [1] Pristop z delčnim injiciranjem je bil sprva prilagojen optičnemu zaznavanju v sekvenčnem injektorju in je bil uveden kot učinkovito orodje pri avtomatizaciji imunoloških testov z uporabo razpršitvene reflektometrične detekcije. Miniaturiziran delčni injekcijski senzor porabi zelo majnhe količine derivatizacijskega reagenta in tako analit postane predkoncentriran in je lahko detektiran preko optičnih vlaken v posebaj zgrajenih pretočnih celicah, ki zadržijo aktivne površine, hkrati pa tekočina prosto teče skozi. Po vsaki uporabi se delci sorbenta odstranijo z reverznim tokom tekočine in površina senzorja se obnovi z injiciranjem sveže raztopine. Tak koncept optičnega zaznavanja na trdnih površinah, tudi imenovan BI spektroskopija, predstavlja dobro alternativo on-line SPE postopkom z eluatno detekcijo. BI omogoča sproten nadzor sorbcijskega procesa. Prednost je tudi v tem, da ni potrebe po popolni reverzibilnosti sorbcije ali elucije. To velja na primer za vezavo Fe(II)-1,10-fenantrolina na kelatne delce, ker so eluenti kot dušikova kislina ali EDTA, neučinkoviti za odstranitev kelatov iz delcev. Ne glede na to, da sta optični poti in reakcijski čas v BI shemi krajši v primerjavi z stacionarno tekočinsko spektrofotometrijo, ne pride do poslabšanja občutljivosti, ker se analit imobilizira na majhni površini senzorja, kjer poteka reakcija v presežku trdnega reagenta. Da bi regenerirali delce brez avtomatizacije, je nujno zagotoviti enako velikost delcev in sferično obliko reagenta in s tem preprečimo popačitve oblike kanalov. Reverznofazni, kemijsko modificiran silikagel ni najboljša izbira v tem primeru, zaradi njihove nepravilne oblike in razporeditve velikosti delcev. Delci z ogrodjem iz polistirena-divinilbenzena, polivinilpirolidona ali aragoze izpolnjujejo prej opisane zahteve, v kolikor so popolnoma sferični in enakih velikosti. Uporaba micelarnih medijev ali pomožnih neprekinjenih kanalov za ponovno kroženje suspenzije z delci je potrebna za zanesljivo delovanje hidrofobnih občutljivih zvrsti z višjo gostoto kot voda v cevkah. 5

7 5 RAZVOJ INSTRUMENTACIJE 5.1»JET-RING«CELICA in»rotating-rot«pretočna CELICA [3] [1] Pretočna celica je lahko zasnovana tudi kot»jet-ring celica«za izvajanje BI in sprotno zaznavanje sprememb v optičnih lastnostih delcev po vzpostavitvi interakcij trdno-tekoče (merjenje absorbance, fluorescence in refleksne spektroskopije). V takšni izvedbi celice lahko potrebujemo mikroliter ali še manj vzorca in reagenta. Takšen pristop je tudi poznan pod imenom mikrosekvenčno injiciranje (μ-si)[3]. Razvoj instrumentacije za BI, ki so ga vpeljali Ruzicka in sodelavci, temelji na mreži SI, ki je opremljena z tako imenovano jet-ring celico. Ime jet-ring pride iz oblike in delovanja delčne retencijske celice, ki je bila narejena kot del pretočnega kanala z vstavitvijo trdne palice in tako se je oblikovala odprtina O-oblike med palico in steno kanala vse okrog palice (slika 1). Samo raztopine lahko prehajajo skozi to odptino. Delci, ki so preveliki, da bi prešli skozi odprtino se naberejo nad palico in stalni pritok nove raztopine jih pritiska na palico. Ko se tok tekočine obrne, jih hitro odplavi vstran [1]. Za zajetje in izpust delcev, ki so veliki 5-7 mikrometrov v SI kanalih je bila oblikovana pretočna celica z vrtečo se palico (»rotating-rot flow cell«). Mikrokolona z obnovljivim sorbentom je bila narejena za zajetje večjih delcev (>15 mikrometrov) v pretočni celici, tako se majhni delci s funkcionalnimi skupinami ujamejo na večjih in s tem večji delci delujejo kot filter [1]. Slika 1: jet-ring celica in delovanje delčnega injiciranja [1] 5.2 LAB-ON-VALVE (laboratorij na ventilu) [3] [4] [1] Prvi LOV mikrosistem je bil enotni monolitski ventil iz Perspexa (polimetil metakrilat) s šetimi vhodi. Povezuje številne laboratorijske naprave za različne analize in vključuje vhode, ki te naprave povezujejo, delovne kanale in pretočno celico. Cevke so postavljene na treh nivojih, da čimbolj olajšajo tekočinske operacije. Centralni pretočni kanal, preko katerega so povezani ostali individualni kanali, se uporablja za komunikacijo s črpalko [3]. Večfunkcijska pretočna celica omogoča več miniaturiziranih operacij, raztapljanje vzorca na ventilu, dodajanje ali mešanje reagenta in tudi inkubacijo. Opremljena je z optičnimi vlakni, ki so 6

8 povezana z zunanjim svetlobnim virom in detektorjem in s tem je omogočeno sprotno zaznavanje poteka reakcij [3]. Tak pristop je sklopljen z SI in predstavlja prednost pri avtomatizaciji in minituarizaciji BI sistema brez vgrajenih mikrolukenj. Enota z mikrocevkami je narejena v osnovi iz polimetil metakrilata (Perspex), ampak pogosteje se uporablja polivinklorid, politereterketon (PEEK) ali politerimid (ULTEM). Sestavljena je iz enojne monolitične strukture, nameščena na vrhu multipozicijskega ventila (slika 2). LOV je bil zasnovan za različne laboratorijske teste, omogoča tudi spreminjanje sorbentov, zato je dobil ime laboratorij na ventilu. Izdelan je tako, da združi mikrokanale, v katerih se zadržujejo delčni reagenti, in točke, kjer pride do mešanja in derivatizacije analita. Lahko bi ga poimenovali kot multifunkcijsko pretočno celico, ki v realnem času dostavi analit z vsebujočimi delci[4]. Zaprta reaktorska kolona se generira in situ s črpanjem delcev iz stranskih odprtin na ventilu. Prednost je v tem, da je sorbent na LOV lahko enako obravnavan kot tekočine. Trdne zvrsti so lahko avtomatsko transportirane med različnimi pozicijami na koloni. Zadržanje trdnih snovi znotraj kolone je olajšano z uravnavanjem pozicije kolone z ustreznimi zamaški (palice, ki se gibljejo navzdol in navzgor ali sama optična vlakna). Detekcija na ventilu bi lahko bila realizirana pri eluatu enako kot pri običajnem SPE. V nasprotju z LOC (lab-on-chip = laboratorij na čipu) napravami, odprta sestava SI-LOV omogoča izvajanje BI po želji, brez potrebe po preoblikovanju enote. 7

9 Slika 2: SI-LOV sistem. Povečana LOV enota 5.3 FI-BI z pretočno celico domače izdelave in komercilano pretočno celico [1] BI je bil prilagojen FI sistemu kot cenejša alternativna možnost bolj prefinjene SI. Spremenili so jet-ring celico, ki je ponavadi uporabljena v FI sistemih, da ustreza enosmernemu toku. Celico so opremili z LED virom svetlobe in fototranzistorskim detektorjem na drugi strani celične odprtine. Podobno kot pri jet-ring celicah in LOV enotah, dvižne palice pustijo prostor med palico in izhodom kanala, da raztopina teče skozi medtem ko se delci nabirajo na palici. Mehansko kontrolirana premična palica za blokiranje pretoka se uporablja za zajetje delcev in njihov izpust namesto reverznega toka. Gibanje usmerja elektromagnetni pogon, ki je priključen na palico. Po vsaki analizi se palica pomakne daleč nazaj in s tem omogoči dovolj prostora, da uporabljene delce tok odnese ven. 8

10 5.4 Magnetna pretočna celica [5] [1] Ruzicka in sodelavci [5] so predstavili SI imunološke analize z magnetnimi delci z detekcijo nevezanih označenih protiteles v tekoči fazi, ki omogoča študijo kinetike v imunokemijskih sistemih z uporabo obnovljive reakcijske površine, ki se tvori z imomagnetnimi delci. Na sliki 3 so prikazani posametni koraki te analize. Ta metoda je bila kasneje razširjena na trdno-fazno optično detekcijo. Magnetni delci so z aragozo prekrit železov oksihidroksid (FeOOH). Ti so primerni za večstopenjske teste (npr. imunološke teste). Neodimov magnet ali magnetna žica se nahaja pod (imunološkim) reaktorjem in se premika navzgor in navzdol in tako zajame magnetne delce na mestu ali pa jih pusti, jih odnese tok nosilne tekočine. Slika 4 prikazuje zgradbo magnetne pretočne celice in SI sistema za kemiluminscenčni test, ki temelji na BI. V tej odprti celici, kjer imamo konstanten tok tekočine, je malo verjetno da bo prišlo do zgoščevanja ali zlepljaja delcev skozi večstopenjsko inkubacijo in spiranje, ki sta potrebna pri imunoloških testih. Najpomemnejša omejitev tega pretočnega sitema za BI izvira iz kovinske narave delcev, kar ovira zasledovanje reakcij pri nizkih ph vrednostih [1] 9

11 Slika 3: Skica posameznih korakov pri imunološkem testu s sekvenčnim injiciranjem [5] 10

12 Slika 4: (A) SI sistem za kemiluminescenčno imunološko metodo z uporabo magnetnih mikrodelcev (B) Pretočna celica za zadržanje protiteles na magnetnih kroglicah [1] 6 ANALITIČNI POSTOPKI PRI DELČNEM INJICIRANJU [1] 6.1 Modifikacije delcev Čeprav so komercialno dostopni ionski izmejevalci ali polimerni delci lahko direktno uporabni za BI, moramo osnovne sorbente prilagoditi, da se selektivno vežejo na površino delcev in tako 11

13 reagirajo z analitom. Ker so delci obnovljivi, je BI zelo primerna za odpravo pomanjkljivosti SPE (kratka življenjska doba absorbiranega sorbenta zaradi postopnega izpiranja in pronicanja v vzorec), ki vključuje fizično imobilizacijo reaktantov. V bioloških testih so bila protitelesa in antigeni imobilizirani na magnetne ali polisaharidne delce. Ti so se prav tako izkazali za primerne substrate pri gojenju celic. Pri okoljskih testih sledi kovin, so polimerni delci napolnjeni z ligandi (npr. karbazidi ali azo spojine) off-line, ker je časovni okvir za kvantitativno impregnacijo površine delcev lahko izbran glede na ligand-sorbent kinetiko. V primerjavi z online postopki, je pri off-line zagotovljena višja koncentracija reagenta na sorbentu in to bi naj vodilo k izboljšanju obogatitvenih faktorjev (ang. enrichment factor) in volumna analita, ki se pretoči. Optimizacija imobilizacijskih postopkov (ph in reakcijski čas) z merjenjem stopnje izkoristka reakcije se lahko izvaja»at-line«v SI-LOV z dodatkom mikroreaktorja, ki meša delce, na stranskih izhodih na ventilu in sprotnem opazovanju liganda, ki se naloži na površino delcev. 6.2 Nalaganje analita Sorpcija analita na sam ionsko-izmenjevalni gel je bila pogosta praksa v SI-LOV-BI sistemu za določevanje sledi kovinskih ionov, čeprav bi jo lahko izkoristili tudi za analizo zdravil in biomolekul, ki so se naložile in temu bi sledili z UV-VIS ali fluorescenčnimi meritvami. Analit bi načeloma lahko obdržali na sorbentu pred dodatkom kromogenega reagenta za heterogene derivatizacije na delcih pri spektrofotometričnih meritvah v trdni fazi. Na primer železo, baker in živo srebro so bili ločeni od osnovnega vzorca preko absorbcije na kelatni ligand pred derivatizacijo z amonijevim pirolidin ditiokarbamatom, 1,10-fenatrolinom ali ditiozinom. Tak pristop je omejen na uporabo pri reakcijah, kjer se barva hitro razvije brez elucije nastalega kelata. Za reševnje zgoraj navedenih pomanjkljivosti so raziskovalci razvili homogeno fazno derivatizacijo, ko analit reagira in-line z ligandom pred absorpcijo dobljenega produkta na delce. Takšna reakcija lahko vodi do izboljšanja selektivnosti in poveča afiniteto analita do sorbtivnega materiala. Na primer, kovine v sledovih se po derivatizaciji na nenabitem kelatu ali oborini selektivno vežejo na reverzno-fazni material (PTFE ali oktadecil kemijsko modificoran kopolimer). Indirektno določitev zdravil (prometazin ali ftrifluoroperazin) bi lahko opravili z online oksidacijo z Fe(III) z kasnejšim kompleksiranjem in kompleks bi določili z trdno-fazno spekrofotometrično detekcijo kelata na anionskem izmenjevalcu. 6.3 Tehnike detekcije Pomebna prednost BI je sposobnost povezave z različnimi instrumenti. Najpogosteje se uporablja v kombinaciji s spektrofotometrijo. BI spektroskopija ima tudi aplikacije z fluorometrično in kemiluminescenčno detekcijo. Najpomembnejša zahteva pri BI spektrofotometriji je optična transparentnost delcev, s tem se prepreči previsoko ozadje in sipanje svetlobe. Ne samo enoprametrski, ampak tudi dvoparametrski BI spektrofotometrični ali spektrofluorometrični senzorji so bili narejeni za detekcijo sledov kovin (Zn in Cu ali Al in Be) z uporabo neselektivnih kelatnih reagentov in selektivno elucijo ali absorbcijo. Potrebni so še 12

14 nadaljni testi, zaradi omejene kromatografske ločljivosti BI kolone. Sklopitev BI z elektrotermalno atomsko absorcijsko spektrometrijo (ET-AAS) z neposrednim uvajanjem sorbenta, ki je napolnjen z kovino, v grafitnih pečeh je možno pri grafitnih delcih zaradi pirolize pred atomizacijo kovine. (Piroliza je postopek razkroja snovi pri višji temperaturi in za gorljive snovi tudi brez dostopa zraka, saj sicer pride do sežiga snovi). Poleg prej omenjenih detektorjev, BI je lahko sklopljen tudi z voltametrično, induktivno sklopljeno plazemsko- masno spektrometrijo (ICP-MS), atomsko fluorescenčno spektrometrijo (AFS), MS in radiometričnimi instrumenti, čeprav se v vseh primerih zahteva detekcija eluata. 7 APLIKACIJE PRETOČNEGA DELČNEGA INJICIRANJA Tukaj dobimo pregled BI aplikacij na okoljskem in bioanalitičnem področju. 7.1 Okoljski testi [1] Večina analiz, ki potekajo na tem področju, je osredotočena na detekcijo sledov anorganskih elementov v težavnih okoljskih vzorcih, ki vsebujejo visoke koncentracije razopljenih soli (npr. morska voda, slanice, vzorci tal). Ločitev osnovnega vzorca z sočasno obogatitvijo kovine je bila izvedena s pomočjo SI-LOV-BI predkoncentracije in detekcije eluata z ET-AAS ali AFS. SI-BI je prav tako primerna za separacijo sledov kovin (Cr(III) in Cr(VI)) preko selektivne ohranitve oksidacijskih stanj na primernih sorbentih (kationski ali anionski izmenjevalci) ali preko zaporednih določitev posameznih zvrsti in skupne vsebnosti anorganskih kovin z in-line homogeno/heterogeno redoks reakcijo in predkoncentracijo v dani sorptivni mikrokoloni. Uporabljajo se tudi hibridni pretočni sistemi ( ang.msfi-multi-syringe flow injection oz. pretočni sistem z večkratnim vbrizganjem) v kombinaciji z BI-LOV za razširitev na miniaturizirane sisteme. BI v LOV pristopu se ne uporablja zgolj za predkoncentracijo kovinskih zvrsti, ampak tudi organskih onesnaževalcev pred uporabo separacije z reverzno-fazne tekočinsko kromatogtafijo (LC). Sklopitev BI-LOV z MSFI se je izkazala za zanesljivo pri kvantitativni eluciji absorbiranih zdravil, medtem ko se je za učinkovitega izkazal tudi LC trak eluata. 7.2 Celični testi [7] [1] Pretočna injekcijska analiza na obnovljivih površinah se uporablja za izvajanje farmakoloških testov na živih celicah. Celični testi so ključnega pomena za študije novih farmacevtskih izdelkov in njihovih reakcij. Takšni testi ponavadi vključujejo dodajanje veliko različnih zdravil v celice in opazovanje rakcij in detekcijo odzivov celic. Takšni postopki zahtevajo tehnike, ki ne uničijo celic, medtem ko zagotovijo ponovljive čase in natančno injiciranje reagentov. BI je imela pomebno vlogo pri izboljšanju celičnih testov. Leta 1999 sta Hodder in Ruzicka [7] predstavila novo aplikacijo SI-BI z uporabo delcev kot mikroprenašalcev živih celic za merjenje višine znotrajceličnega kalcija. Celice so bile nanešene na mikroprenašalne delce, ki služijo kot enkratno in obnovljiva površina na kateri izvršimo analizo. Visoka gostota celic je tako lahko nanešena na majhen volumen jet-ring celice, ki je nameščena znotraj fluorescenčnih 13

15 mikroskobskih objektivnih leč. Prednost tega pristopa je, da so sveže celice izpostaljene dani koncentraciji kemikalij in so zamenjane pri vsakem testu. Raziskovanje celičnega odziva na dodano zdravilo ali kemikalijo je bolj natančno kot pri klasičnih pritopih, ker ni prenašalnega (ang. carry-over) efekta in izgube celične aktivnosti čez določen čas. S stalnim opazovanjem sprememb v signalu na delcih dobimo vrhove, ki nam dajo informacijo o kinetiki celičnega testa in mejno koncentracijo reagenta, ki povzroči celični odziv. Podobne uporabe delcev kot mikropreanašalcev živih celic so bile razširjene na LOV. Na primer, poraba glukoze in nastanek laktata je možno hitro in občutljivo detektirati zaradi velike koncentracije imobiliziranih celic. Raziskovali so tudi celičnelice aktivnosti na osnovi sprostitve protonov iz celice v LOV. Delci z imobiliziranim ph indikatorjem se nahajajo v kolonah. Protoni, ki izhajajo iz celice, so se nalagali med ustavitvijo pretoka in so reagirali z imobiliziranim indikatorjem. To je povzročilo spremembo barve na indikatorskih delcih in to se lahko detektira s trdno-fazno spektrofotometrijo. 7.3 Študije afinitet pri kinetiki in afinitetna kromatografija [1] BI-LOV sistem je lahko uspešno uporabljen kot avtomatski sistem za raziskovanje kinetike biomolekul in njihove afinitete do vezave ali sprostitve. Modelna študija je bila izvedena z nekovalentno vezavo delcev, ki so bile prekrite z strepatvidinom in biotinilatnimi konjugati. To prikazuje uporabnost LOV pri veliko analitičnih instrumentih poleg optičnih spektrofotometrov. Podobna minituarizirana naprava je bila tudi razvita za kritično primerjavo BI spektroskopije z afinitetno kromatografijo, ki vključuje detekcijo eluata. Rezultati, dobljeni iz dveh različnih načinov detekcije, dopolnjujejo drug drugega in nam dajo celotno sliko biomolekularne aociacije in disociacije med tarčnimi biomolekulami in bioligandi, ki so imobilizirani na površino delcev. Medtem ko afinitetna kromatografija nudi izboljšano občutljivost v primerjavi z BI spektroskopijo (10-krat boljša občutljivost), BI spektroskopija pa nudi unikatne možnosti za zasledovanje irreverzibilne vezave biomolekul na kromatografsko kolono. 7.4 Imunološki testi [1] Časovna usklajenost natančnega mikro-tekočinsko delovanja na SI-LOV skupaj s konceptom obnovljivih trdnih površin omogoča avtomatsko izvedbo večstopenjske metode (npr. imunoloških testov). Na ventilu se delci zadržijo z uporabo čepov na koncu cevi in optičnih vlaken, ki so bile že prej narejene za ostale LOV aplikacije. Čeprav je možno analizirati veliko manj vzorcev v primerjavi s standardno metodo (96-well plate immunoassay), je čas analize veliko krajši (manj kot 30 min, pri stand. metodi 5-8h) in tudi za rokovanje z aparaturo ne potrebujemo izkušenih medicinskih tehnikov. Zato je primerna metoda za takojšnje klinične rezultate in za nizko so srednje veliko število vzorcev. Volumen vzorca, ki je potreben za analizo, je nekje 50 μl ali manj (stand. metoda μL). 7.5 Čiščenje in kvantitavtivna analiza DNA in specifičnih biomarkerjev [1] 14

16 BI-LOV je bil pred kratkim predlagan za temelj pri določevanju nuklinskih kislin. Uporabili so silikagel kot obnovljiv SPE material za čiščenje DNA iz človeške krvi. Delci so bili stisnjeni v odprtino LOV, da zadržijo DNA, ki so jo kasneje sprali za polimerazno verižno reakcijo (PCR) in elektroforetsko ločitev. Čiščenje DNA so opazovali on-line fluorometrično za kolono z uporabo fluorescenčnega barvila etidijevega fluorida. Nekateri uporabljajo tudi posebaj funcionalizirane delce za pojasnitev in določitev specifičnega DNA zaporedja. Povečana občutljivost, ki so jo dosegli z BI-spektroskopsko detekcijo, omogoča določevanje DNA v pmol (pikomol = mola). Ta sistem se lahko uporabi v vseh testih, ki vključujejo identifikacijo življenjsko nevarnih mikroorganizmov. 7.6 Trendi v prihodnosti [7] [1] Trenuten razvoj mikrotestov gre vedno bolj v smeri analize makromolekul (DNA, imunoglobina G IgG, proteinov) in vzorcev z neraztopljenimi snovmi (koloidi, celice, delci). Tukaj pa se pojavijo težave, če mikrokanali postanejo preozki in predolgi. Glavni cilj pri miniaturiciji teh metod je, da se zmanjša poraba reagentov in s tem nastanek odpada. To lahko dosežemo že, če zmanjšamo volumen vzorca. Težava ni v izdelavi čim manjših cevk, ampak v meji detekcije vzorca. Pri spektroskopskih meritvah se to kaže kot najmanjši še sprejemljiv volumen detektorja [7]. Je za pričakovati, da se bo BI še naprej razvijal v različnih oblikah in bo postal analizno orodje, ki bo omogočalo obdelavo velikega števila vzorcev. Sklopitev LOV z afinitetno kromatografijo s številnimi detektorskimi sistemi (BI-spektroskopija, MS, amperometrija, fluorometrija) je uporabna pri bioanalitiki, ki vključuje raziskave naravnih produktov, zdravil, proteinske in DNA analize, kot tudi v kliničnih analizah za hiter pregled in diagnostiko. SI-LOV-BI ponuja veliko možnosti na okoljskem področju za odstranjevanje sestavin matriksa v izcednih vodah in za sočasno reakcijo z analitom v on-line testih tal ali sedimentov. Zaenkrat ni še nobenih prizadevanj za razložitev sorpcijskih sposobnosti materialov v pretočnih sistemih,ki so opremljeni z on-line trdnimi kolonskimi reaktorji. Shemi ekstrakcije in sorpcije bi se lahko razširili na radioizotope kot indikatorjev ali kot bistvene sestavine pri izotopskem redčenju v geokemijskih analizah in nukleranih raziskavah, ki vključujejo probleme shranjevanja radioaktivnih odpadkov in ravnanje z njimi. Možne so tudi aplikacije BI sistemov z radiokemijsko detekcijo za avtomatizacijo dela z radioaktivnimi snovmi v zaprtem sistemu. Kar zadeva nove sorptivne materiale, je za pričakovati polimerne delce z vtisnjenimi molekulami (ang. moleculary-imprint), ki se pripravijo z polimerizacijo suspenzije ali obarjalno polimerizacijo, kar izboljša selektivnost analita in bi se lahko uporabljalo pri BI spektroskopiji ali za BI sorbente pred separacijo z tekočinsko kromatografijo [1]. 15

17 8 LITERATURA [1] M. Miro, S. K. Hartwell, J. Jakmunee, K. Grudpan,E. H. Hansen, Recent developments in automatic solid-phase extraction with renewable surfaces exploiting flow-based approaches, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 27, No. 9, 2008 [2] H.M.Oliveira, M.A.Segundo, J.L.F.C.Lima, M. Miro, V. Cerda, Exploiting automatic online renewable moleculary imprinted solid-phase extraction in lab-on-valve format as front end to liquid chromatography: application to the determination of riboflavin in foodstuffs, Anal. Bioanal. Chem. 397, 77-86, 2010 [3] J. Wang, E. H. Hansen, Sequential injection lab-on-valve: the third generation of flow injection analysis, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 22, No. 4, 2003 [4] M. Miró, E. H. Hansen, Miniaturization of environmental chemical assays in flowing systems: The lab-on-a-valve approach vis-à-vis lab-on-a-chip microfluidic devices, Anal. Chim. Acta Vol , 46 57, 2007 [5] H. Pollema, J. Ruzicka, G. D. Christian, Sequential Injection Immunoassay Utilizing Immunomagnetic Beads, 64, ,1992 [6] M.J.Ruedas Rama, A. Ruiz Medina, A. Molina Diaz, New contributions of bead-injection spectroscopy-flow-injection analysis: determination of cobalt, Anal. Bioanal. Chem. 376, , 2003 [7] J. Ruzicka, Lab-on-valve:universal analyzer based on sequential and bead injection, Analyst, 125, ,