UNIVERZA V LJUBLJANI

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA DIPLOMSKO DELO BERNARDA FINŽGAR

2 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijski program: Biologija in gospodinjstvo Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov DIPLOMSKO DELO Mentorica: prof. dr. Nina Gunde-Cimerman Kandidatka: Bernarda Finžgar Somentorica: doc. dr. Polona Zalar Ljubljana, marec 2012

3 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. II Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa Biologija in gospodinjstvo. Opravljeno je bilo v laboratorijih Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Študijska komisija na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete je za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr. Nino Gunde-Cimerman, za somentorico doc. dr. Polono Zalar in za recenzentko prof. dr. Ines Mandić-Mulec. Mentorica: prof. dr. Nina Gunde-Cimerman Somentorica: doc. dr. Polona Zalar Recenzentka: prof. dr. Ines Mandić-Mulec. Komisija za oceno in zagovor: Predsednica: doc. dr. Barbara Vilhar Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Članica: prof. dr. Nina GUNDE-CIMERMAN Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Članica: doc. dr. Polona ZALAR Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Članica: prof. dr. Ines MANDIĆ-MULEC. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Podpisana se strinjam z objavo svoje diplomske naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji. Datum zagovora: Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Bernarda Finžgar

4 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. III ŠD Dn KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA DK 577.2: (043.2)=163.6 KG glive/kvasovke/saccharomyces cerevisiae/morfologija/naravni habitati/its rdna/industrijska okolja/življenjski krog AV FINŽGAR, Bernarda SA GUNDE-CIMERMAN, Nina (mentorica)/zalar, Polona (somentorica)/mandić- MULEC, Ines (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2012 IN TD OP IJ JI Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov diplomsko delo (univerzitetni študij) XII, 79 str., 23 pregl., 16 sl., 7 pril., 85 vir. sl sl/en AI Pivska kvasovka Saccharomyces cerevisiae je že od 60. let 20 stoletja evkariontski eksperimentalni organizem, ki je postal leta 1996 z določitvijo celotnega nukleotidnega zaporedja genoma še pomembnejši. Čeprav njena biokemijska vloga v fermentacijskem procesu dolgo časa ni bila pojasnjena, smo njen metabolizem in produkte uporabljali že tisočletja (npr. kruh, pivo, vino). Kvasovka S. cerevisiae je pomembno orodje za pridobivanje rekombinantnih proteinov (genska manipulacija). Predstavlja pa tudi velik potencial na področju biogoriv, proizvodnje bioetanola iz odpadnih materialov, kot je lignoceluloza. Kvasovka sicer pogosto naseljuje antropogena okolja, manj pa je znanega o njeni ekologiji. Namen diplomskega dela je bila selektivna izolacija vrste S. cerevisiae iz antropogenih in manj običajnih naravnih okolij. Cilj naloge je bila pridobitev sevov s potencialno neobičajnimi metaboličnimi lastnostmi za to vrsto, ki bi bile uporabne pri sintezi bioetanola. V sklopu diplomske naloge smo nabrali 273 različnih vzorcev, ki smo jih razdelili v 27 različnih skupin. Z uporabo selektivnega gojišča z dodatkom 10 % etanola smo izolirali 122 kvasnih kultur, ki smo jih sprva proučevali na ravni morfologije (barva, oblika) in mikromorfologije kolonij (velikost in oblika celic). Preverjali smo, ali so sevi homo- ali heterotalični ter v ta namen proučevali prisotnost spolnih struktur (aski, askospore) na acetatnem agarju. Dokončna identifikacija je potekala na molekularno-genetskem nivoju s primerjavo nukleotidnih zaporedij regij notranjih distančnikov 1 in 2, vključno s 5,8S rdna zaporedjem (ITS rdna). Iz 122 vzorcev smo izolirali 44 sevov kvasovke vrste S. cerevisiae. Vrsto S. cerevisiae smo najpogosteje izolirali iz vinogradniških vzorcev ter vod industrijskih okolij, posamezne seve pa smo izolirali tudi iz mlečnih izdelkov, sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov, tal pod sadnim drevjem, sadjem in zelenjavo, iz žuželk, domačega kisa, razgrajenega lesa, svežega in gnilega sadja in zelenjave ter iz silaže. Sevom S. cerevisiae smo določili asimilacijski, fermentacijski in temperaturni profil ter opazovali odstopanja med posameznimi sevi.

5 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. IV ND Dn KEY WORDS DOCUMENTATION DC 577.2: (043.2)=163.6 CX fungi/ yeast/saccharomyces cerevisiae/morphology/natural habitat/its rdna/ industrial environment/life cycle AU FINŽGAR, Bernarda AA GUNDE-CIMERMAN, Nina (supervisor)/zalar, Polona (co-advisor)/mandić- MULEC, Ines (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Faculty of education, Biology home ecomomics University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2012 TI DT Isolation of yeast Saccharomyces cerevisiae from unusual natural habitats Graduation Thesis (University studies) NO XII, 79 p., 23 tab., 16 fig., 7 ann., 85 ref. LA AL sl sl/en AB Baker yeast Saccharomyces cerevisiae has been an eukarontic experimental organism since 1960s, becoming even more significant with the determination of its complete nucleotide genome sequence in Even though its biochemical function in the fermentation process had long remained unclear, its metabolism and products (eg. bread, beer, wine) have been used for millennia. S. cerevisiae yeast represents an important organism for production of recombinant proteins (gene manipulation). Moreover, it exhibits great potential for biofuels and the process of bioethanol production from waste materials such as lignocellulose. The yeast is generally found in anthropogenic environments, yet little is known about its ecology. The purpose of this given thesis was to perform a selective isolation of the S. cerevisiae species from both anthropogenic and less common natural habitats. The aim was to aquire strains with metabolic properties that would be potentially uncommon for the species, yet effective in bioethanol synthesis. In the scope of the research, 273 collected samples were divided into 27 different groups. Through the use of a selective growth medium with the addition of 10 % ethanol, 122 yeast cultures were isolated and initially defined according to their morphology (colour, shape) and micromorphology (cell size and shape). In order to identify the strains according to their homothallic or heterothallic properties, the presence of sexual structures (asci, ascospores) was examined on acetate agar. The concluding identification took place at the molecular genetic level through the comparison of nucleotide sequencing of the regions of internal transcribed spacers 1 and 2, including the 5.8S rdna sequence (ITS rdna). From the 122 samples, 44 strains of the S. cerevisiae yeast were isolated. The S. cerevisiae species was typically isolated from vinicultural samples and industrial environment waters, whereas individual strains were isolated also from dairy products, freshly squeezed non-pasteurized juices, the ground beneath fruit trees, fresh or rotten fruits and vegetables, insects, vinegar, decomposed wood, and from silage. The S. cerevisiae strains were determined according to their assimilation, fermentation and temperature profiles, and the differences among individual strains were examined.

6 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. V KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... III KEY WORDS DOCUMENTATION... IV KAZALO PREGLEDNIC... VIII KAZALO SLIK... IX KAZALO PRILOG... X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI... XI 1 UVOD NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE PREGLED OBJAV KVASOVKA SACCHAROMYCES CEREVISIAE Osnovna opredelitev kvasovke Saccharomyces cerevisiae Taksonomija kvasovke Saccharomyces cerevisiae Uporaba kvasovke Saccharomyces cerevisiae skozi zgodovino do danes Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Oblika in velikost celic in kolonij kvasovke Saccharomyces cerevisiae Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Genom kvasovke Saccharomyces cerevisiae Ribosomska DNA kvasovk Hibridi rodu Saccharomyces Življenjski krog kvasovke Saccharomyces cerevisiae Razmnoževanje kvasovke Saccharomyces cerevisiae Fermentacijski sistemi in produkti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Potrebna temperatura in ph za rast kvasovk Kisik kot vir energije Prehrana in presnova pri kvasovkah Presnova ogljika pri kvasovkah Presnova sladkorjev do etanola Ostali produkti presnove sladkorjev Presnova dušika pri kvasovkah Tehnološko industrijska uporabnost produktov kvasovk Izrabljanje produktov kvasovke S. cerevisiae v prehrambeni industriji Uporaba kvasovke S. cerevisiae v pivovarstvu Proizvodnja bioetanola z razgradnjo lignoceluloze Uporabnost kvasovke S. cerevisiae pri rekombinantnih tehnikah Ekologija kvasovke S. cerevisiae in njeni habitati Poznana nahajališča kvasovke S. cerevisiae iz industrijskih procesov Nahajališča kvasovke S. cerevisiae v naravi METODIKA PROUČEVANJA KVASOVK... 14

7 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. VI Metodika izolacije kvasovk Vzorčenje, izolacija in gojenje kvasovk na gojiščih Metode identifikacije kvasovk Klasične metode identifikacije kvasovk Morfološke metode Fiziološke značilnosti Molekularne metode identifikacije MATERIAL IN METODE MATERIAL Mikrobiološka gojišča za gojenje kvasovk Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae Raztopine, pufri in zmesi Reagenti Kemikalije Laboratorijska oprema METODE Vzorčenje Izolacija kvasovk iz nabranih vzorcev Priprava vzorcev in anaerobno gojenje v tekočem gojišču Aerobno gojenje na trdem gojišču Izbira in redčenje kulture do posameznih kolonij Shranjevanje Določevanje fenotipskih lastnosti Morfologija kolonij Morfologija kvasnih celic Morfologija askospor Določevanje genotipskih lastnosti Izolacija genomske DNA Izolacija genomske DNA z izolacijskim kitom Prepman Ultra Ekstrakcija DNA z mehansko lizo Verižna reakcija s polimerazo (PCR) Gelska elektroforeza Določanje in obdelava nukleotidnega zaporedja Shranjevanje izoliranih kvasovk Asimilacijske, fermentacijske in encimske lastnosti Asimilacijske lastnosti Fermentacijske lastnosti Encimske lastnosti Temperaturni testi Parjenje haploidnih sevov Saccharomyces cerevisiae... 31

8 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. VII 4 REZULTATI OPIS VZORCEV Izolacija kvasovk glede na skupine vzorcev Brezalkoholne gazirane pijače Citrusi Domači kis Gnilo sadje in zelenjava Gobe, lišaji Gozdna stelja (listni drobir) Jagodičevje Mlečni izdelki Razgrajen les Silaža Sladki sadeži Sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo Vinogradniški vzorci Voda iz industrijskih okolij Tla pod sadnimi drevesi, sadjem, zelenjavo Žuželke (vinske mušice) IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA KVASOVKE S. CEREVISIAE Vzorci, iz katerih smo izolirali kvasovko Saccharomyces cerevisiae Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Fiziološki testi sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae Parjenje haploidnih sevov na acetatnem agarju RAZPRAVA IN SKLEPI RAZPRAVA Rod Saccharomyces Druge kvasovke SKLEPI ANALIZA UČNIH NAČRTOV ZA OSNOVNO ŠOLO Obravnavanje mikroorganizmov v izobraževalnem procesu POVZETEK VIRI PRILOGE... 80

9 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. VIII KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae Preglednica 2: Seznam reagentov s proizvajalci Preglednica 3: Seznam kemikalij s proizvajalci Preglednica 4: Seznam laboratorijske opreme Preglednica 5: Seznam možnih nahajališč oz. vzorčenih substratov za uspevanje kvasovke S. cerevisiae Preglednica 6: PCR-mešanica za en vzorec Preglednica 7: PCR-program Preglednica 8: Pregled skupin vzorcev glede na izvor in število vzorcev, število vseh kvasnih izolatov in izolatov kvasovke S. cerevisiae kot delež med vsemi kvasnimi izolati Preglednica 9: Opis vzorcev po skupinah glede na kraj, število vseh odvzetih vzorcev in število pozitivnih izolatov na kvasovke Preglednica 10: Spisek kvasnih izolatov iz površin gob in lišajev Preglednica 11: Spisek kvasnih izolatov iz mlečnih izdelkov Preglednica 12: Spisek kvasnih izolatov iz razgrajenega lesa Preglednica 13: Spisek kvasnih izolatov iz silaže Preglednica 14: Spisek kvasnih izolatov iz sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov Preglednica 15: Spisek kvasih izolatov iz vinogradniških vzorcev Preglednica 16: Spisek kvasih izolatov iz vod v industrijskih okoljih Preglednica 17: Spisek kvasih izolatov iz tal pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo Preglednica 18: Izolati vseh sevov S. cerevisiae z opisom vzorca za izolacijo Preglednica 19: Morfološke lastnosti izoliranih sevov S. cerevisiae Preglednica 20: Primerjava ITS zaporedij sevov S. cerevisiae s tipskim sevom: primerjava dolžine pomnožka in zaporedja, odstotka podobnosti po BLAST algoritmu in odstotka ujemanja (sorodnosti) Preglednica 21: Asimilacijski profili sevov S. cerevisiae po 21 dneh inkubacije Preglednica 22: Rezultati fermentacijskih testov glukoze, saharoze, maltoze in ksiloze pri izbranih sevih S. cerevisiae po 28 dneh inkubacije Preglednica 23: Kombinacije parjenja sevov S. cerevisiae, ki tvorijo askospore

10 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. IX KAZALO SLIK Slika 1: Kolonije in oblika celic S. cerevisiae Slika 2: Shematski prikaz enot rdna Slika 3: Življenjski krog kvasovke (menjava haploidne in diploidne generacije) Slika 4: Zastopanost posamezne skupine vzorcev glede na število vseh vzorcev Slika 5: Osnovne izolacijske plošče gojišča MEA s kloramfenikolom Slika 6: Število vseh kvasnih izolatov razporejeno na izolate sevov vrste S. cerevisiae in na izolate drugih kvasovk po skupinah vzorcev Slika 7: Zastopanost posameznih vrst kvasovk med izolati Slika 8: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz mlečnih izdelkov Slika 9: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz vinogradniških vzorcev Slika 10: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz voda industrijskih okolij Slika 11: Primerjava števila nabranih vzorcev s številom vseh izolatov kvasovk in številom izoliranih sevov S. cerevisiae po skupinah vzorcev Slika 12: Deleži izoliranih sevov S. cerevisiae po skupinah vzorcev Slika 13: Osnovna izolacijska gojišča MEA + Ch in YM s kolonijami S. cerevisiae Slika 14: Posamezne kvasne celice različnih sevov S. cerevisiae Slika 15: Mikrografije mikroskopskih preparatov po acidorezistentnem barvanju sevov S. cerevisiae pod različnimi povečavami Slika 16: Parjenje sevov S. cerevisiae pri 400 in 1000 povečavi

11 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. X KAZALO PRILOG Priloga A: Opis vzorcev s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev za vse seve kvasovk. Priloga B: Opis vzorcev, iz katerih nismo izolirali kvasovk, s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev.

12 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. XI OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ATP energetsko bogata molekula adenozin 5-trifosfat ATPaza adenozintrifosfataza, encim, ki katalizira hidrolizo APT-ja v ADP in fosfat BLAST osnovno iskalno orodje lokalne poravnave (Basic Local Alignment Search Tool) bp CBS Ch CTAB DNA dntp EDTA EtOH EXF FADH 2 GTP ITS MEA mrna bazni par mikrobiološka zbirka gliv Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht kloramfenikol cetil trimetil amonijev bromid deoksiribonukleinska kislina deoksinukleotid trifosfat etidiaminotetrocetna kislina etanol Mikrobiološka zbirka gliv na Katedri za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov, Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani koencim, prenašalec elektronov (»Flavin Adenine Dinucleotide«) energetsko bogata molekula gvanozin 5-trifosfat notranji distančniki, ki ločujejo rdna posameznih ribosomskih podenot (»Internal Transcribed Spacer«) agar s sladnim ekstraktom (»Malt Extract Agar«) obveščevalna (»Messenger«) RNA, ki prenaša genetično sporočilo iz jedra do ribosomov v citoplatmi mtdna mitohondrijsko zaporedje DNA NAD NADH NCBI PCR PDA rdna koencim, prenašalec elektronov (»Nicotinamide Adenine Dinucleotide«) na NAD vezan vodikov elektron internetna baza podatkov»national Center for Biotechnology Information«polimerazna verižna reakcija (»Polymerase Chain Reaction«) krompirjev agar z glukozo (»Potato Dextrose Agar«) zaporedje DNA, ki kodira ribosomsko RNA

13 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. XII RNAza RNA sp. TBE TE Tris trna UREA YCB YE YM YNB encim, ki cepi molekule RNA ribonukleinska kislina vrsta (»species«) Tris-boratni elektroforezni pufer Tris-EDTA 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol prenašalna (»Transfer«) RNA, ki prenaša potrebne aminokisline za sintezo beljakovin do mrna na ribosomih sečnina oz. organska spojina (NH 2 ) 2 CO za presnovo dušikovih spojin definirano gojišče z univerzalnim virom ogljika, brez vira dušika (»Yeast Carbon Base«) kvasni ekstrakt (»Yeast extract«) agar s sladno-kvasnim ekstraktom (»Yeast-Malt extract«) definirano gojišče z univerzalnim virom dušika, brez vira ogljika (»Yeast Nitrogen Base«)

14 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 1 1 UVOD Eden glavnih problemov današnje družbe je zadovoljitev energetskih potreb in zamenjava surovin fosilnih materialov z obnovljivimi viri. S tem bi zmanjšali onesnaževanje s toplogrednimi plini. Bioetanol predstavlja primeren in vzdržen obnovljiv alternativni vir energije, primeren je tudi kot transportno gorivo, predvsem pa bi veliko doprinesel k zmanjševanju emisij toplogrednih plinov v primerjavi z naftnim bencinom. Dandanes je vsa proizvodnja bioetanola usmerjena v tehnologijo prve generacije, pri katerih uporabljajo surovine, kot so trsni sladkor ali žitni škrob, vendar je produkcija nezadovoljiva glede na potrebe. Velik potencial za proizvodnjo etanola kot goriva predstavljajo lignocelulozni materiali kot druga generacija biogoriv. Glavni obetajoči viri so različni odpadni produkti lignoceluloze v kmetijstvu (koruzna stebla, pšenična in ječmenova slama, vlakna sladkornega trsa), odpadni produkti iz gozdov, papirne industrije in komunalnih vod. Procesi uporabe lignoceluloznih zalog za produkcijo bioetanola so še vedno v razvojni fazi in potrebujejo tehnološki preboj, da bodo postopki postali ekonomično izvedljivi. Procese sestavljajo štiri glavne tehnološke operacije: predhodna obdelava surovin materialov, hidroliza ogljikovih polimerov v sladkorje, fermentacija sladkorjev z mikroorganizmi do etanola in destilacija oz. separacija do čistega etanola. Med mikroorganizmi je predvsem kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae prednostni organizem, ki je sposoben produkcije etanola. Zaradi tega se mednarodni evropski 7. okvirni projekt NEMO (Novel high performance enzymes and micro-organisms for conversion of lignocellulosic biomass to bioethanol) v okviru enega od glavnih ciljev osredotoča na izboljšavo lastnosti kvasovk, predvsem vrste S. cerevisiae. Namen je vzgojiti bolj učinkovit mikroorganizem, primeren za razgradnjo heksoznih in pentoznih sladkorjev, v kombinaciji z visoko toleranco na povišan etanol, temperaturo in biomasne inhibitorje. Projekt temelji na raziskovanju in razvijanju novih tehnologij z uporabo nenavadno visokozmogljivih encimov in najbolj tolerantnih mikroorganizmov. Etanolni doprinos fermentacije ksiloze in arabinoze (pentoze) je dokaj nizek v primerjavi s heksoznimi sladkorji, zato poleg večjega doprinosa etanola poskušajo zmanjšati ostale produkte (npr. ksilitol in glicerol). Vrsta Saccharomyces cerevisiae je poznana že iz zgodovine s tradicionalnih področij pridelave kruha, vina, piva in mošta. Zasledili so jo v vinogradih, grozdju in drugem sadju, na insektih, hrastovem in drugem lubju in v tleh pod drevesi (Diezmann in Dietrich, 2009; Erlend s sod., 2006), kot kvarljivca hrane in pri ostalih fermentacijskih procesih (Pitt in Hocking, 1999). Na splošno lahko izpostavimo, da se kvasovka nahaja v zelo raznolikih habitatih v naravi, saj za svojo rast potrebuje zadostno količino ogljikovih virov (npr. glukozo, fruktozo, manozo, galaktozo, saharozo in maltozo ob prisotnosti kisika) (Boulton in Quain, 2001). V diplomskem delu smo želeli dobiti vpogled v naravne habitate kvasovke Saccharomyces cerevisiae. Na podlagi že opisanih nahajališč v literaturi in možnih nahajališč smo nabirali različne vzorce ter iz njih z uporabo selektivne metode izolacije osamili kvasovke. Osredotočili smo se na kvasovke, ki so bile morfološko podobne vrsti Saccharomyces cerevisiae. Izolate smo najprej morfološko okarakterizirali in jih nato identificirali na

15 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 2 osnovi molekularnogenetskih značilnosti. Preverjali smo tudi njihove metabolične sposobnosti asimilacije različnih virov ogljika in dušika ter fermentacijo. 1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE V diplomskem delu smo imeli namen izolirati čim večje število sevov kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz naravnih, raznolikih nahajališč, poznanih že iz literature, in iz različnih potencialnih nahajališč. Cilj diplomske naloge je bil, da seve kvasovke S. cerevisiae morfološko opredelimo na podlagi fenotipskih lastnosti (morfologija kolonij, mikroskopska morfologija celic, acidorezistentno barvanje askospor, UREA testi) in izolate molekularno identificiramo s pomočjo genotipskih lastnosti kvasovke do vrste z nukleotidnim zaporedjem ITS rdna z uporabo metode PCR. Predvidevali smo, da se pojavljajo določene razlike med sevi kvasovk glede zmožnosti asimilacije različnih virov ogljika, dušika in zmožnosti rasti pri različnih temperaturah. Glede teh lastnosti smo pričakovali možne razlike med sevi v sklopu znotrajvrstne variabilnosti.

16 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 3 2 PREGLED OBJAV 2.1 KVASOVKA SACCHAROMYCES CEREVISIAE Osnovna opredelitev kvasovke Saccharomyces cerevisiae Kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae je enocelični mikroorganizem iz kraljestva gliv, ki se razmnožuje z brstenjem, zatorej ne tvori spor v/na plodiščih (Walker, 2009). Je najbolj natančno proučen evkariontski organizem na celičnem, molekulskem in genetskem nivoju, zato služi kot model ekoloških in evolucijsko-genetskih študij (Landry s sod., 2006) Taksonomija kvasovke Saccharomyces cerevisiae Kvasovko S. cerevisiae taksonomsko uvrščamo med askomicetne glive kvasovke (Walker, 2009). Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae je prikazana v preglednici 1. Preglednica 1: Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae (NCBI). Taksonomska kategorija Opredelitev S. cerevisiae Domena Eukarya (evkariont) / Opisthokonta Kraljestvo Fungi (glive) Podkraljestvo Dikarya Deblo Ascomycota / Saccharomyceta Poddeblo Saccharomycotina Razred Saccharomycetes (kvasovke) Red Saccharomycetales Družina Saccharomycetaceae Rod Saccharomyces Vrsta Saccharomyces cerevisiae Glive (lat. Fungi) so evkariontski organizmi, ki jih uvrščamo v posebno kraljestvo. Predstavljajo obsežno in raznoliko skupino organizmov, ki jih medsebojno povezuje morfologija, način prehranjevanja in ekologija. So heterotrofni organizmi, saj je njihova rast odvisna od organsko vezanega ogljika. Kot saprofiti pridobijo za svoj obstoj potrebna hranila iz odmrlih delov organizmov s pomočjo razgradnje na račun zelo raznolikih hidrolitičnih encimov. Manjše organske molekule pa nato absorbirajo v celice preko celične stene in membrane (Solomon s sod., 2005). Kraljestvo gliv delimo na štiri debla glede na tvorbo spolnih spor: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota in Basidiomycota. Včasih so askomicetne glive razporejali glede na ureditev askov, danes pa askomicetne glive razvrščamo na podlagi razvoja askov in plodišč, po načinu in odprtju askov ter sproščanju askospor. Posebnost debla Ascomycota so glive, ki jih uvrščamo v red Saccharomycetales, saj tvorijo posamezne celice, ki jih imenujemo kvasovke. Kvasovke so kljub podobni rasti in ekološkim podobnostim heterogena skupina. Najdemo jih tako med zigomicetnimi,

17 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 4 bazidiomicetnimi (npr. Cryptococcus spp. in Rhodotorula spp.) in askomicetnimi glivami (npr. Saccharomyces spp.) (Walker, 2009) Uporaba kvasovke Saccharomyces cerevisiae skozi zgodovino do danes Vrsta Saccharomyces cerevisiae je sinonim za kvasovke, katere predstavnike imenujemo po vrsti kvasovke v pivskem sladu, opazovani leta Ta vrsta je po vsej verjetnosti najstarejši gojeni mikroorganizem. Zapisi pričajo o uporabi kvasovke pri varjenju piva v Sumeriji in Babilonu že 6000 let pr. n. št. V tistem času je bila S. cerevisiae uporabljena tudi v Gruziji pri obdelavi grozdja in v Egiptu kot krušni kvas (Feldman, 2005). Na njeno uporabo kaže tudi najdba kvasovke v keramičnem posodi za vino v grobnici enega od prvih kraljev Egipta, Scorpiona I, ki je vladal 3150 let pr. n. št. (Landry s sod., 2006). Kvasovka S. cerevisiae lahko fermentira sladkor (Feldman, 2005). Biokemijska vloga kvasovke v fermentacijskem procesu dolgo časa ni bila pojasnjena, kljub temu da so produkt procesa uporabljali že tisočletja. To specifično lastnost so uporabljali pri proizvodnji alkoholnih pijač (npr. vino, pivo), prehrani (npr. kruh, kefir) in medicinski uporabi (npr. antibiotiki in encimi). Van Leeuwenhoek je leta 1680 prvi opazoval kvasne celice pod mikroskopom (Kavanagh, 2005). Zaradi edinstvenih lastnosti je postala raziskovalni organizem. Prve študije o kvasovki je zapisal Louis Pasteur (Études sur la bière) leta 1857 (Feldman, 2005), šele leta 1863 pa je dokončno pojasnil toliko let nepoznano biokemijsko vlogo Saccharomyces cerevisiae v fermentacijskem procesu (Feldman, 2005; Kavanagh, 2005). Kvasovka S. cerevisiae je postala modelni eksperimentalni organizem okoli leta 1960, ko so jo začeli uporabljati kot eksperimentalni sistem v molekularni biologiji. Kasneje, leta 1980, je bila uporabljena kot gostiteljski organizem pri proizvodnji zdravila za hepatitis B (Feldman, 2005). Leta 1996 pa je postala prvi evkariontski organizem, pri katerem so določili celotno nukleotidno zaporedje genoma (Feldman, 2005; Kavanagh, 2005). Po sekveniranju genoma so znanstveniki določili funkcijo 6000 genov (Solomon s sod., 2005). V naslednjih letih je kvasovka postala uporabna referenca za določitev homologije sekvenc pri človeških, živalskih ali rastlinskih genih in pri primerjalnih študijah mnogih enoceličnih organizmov (Feldman, 2005). Kvasovka je imela pomembno vlogo pri razvoju različnih tehnologij in je utrla pot biološkim raziskavam z uporabo tehnike rekombinantnih DNA (Kavanagh, 2005). Ugotovljeno je, da je kvasovka idealni sistem za uspešno proučevanje celične zgradbe in osnovnih celičnih mehanizmov. V primerjavi z ostalimi evkariontskimi modelnimi organizmi ima Saccharomyces cerevisiae naslednje prednosti: - Je enocelični organizem, ki ga v nasprotju z bolj kompleksnimi evkarionti, lahko gojimo na različnih gojiščih, kar zagotavlja popoln nadzor nad okoljskimi parametri. - Je uporaben mikroorganizem za različne klasične in genetske tehnike. - Je primer, s katerim so dokazali, da so se bistvene celične funkcije ohranile vse od kvasovk do sesalcev. - Generacijski čas kvasovke je približno 80 min, saj je masovna produkcija celic zato hitra. - Enostavni postopki izolacije visoke molekulske mase DNA za rdna, mrna in trna (Feldman, 2005; Walker, 2009).

18 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 5 Čeprav je kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae dobro proučena kot modelni eksperimentalni organizem s poznanim nukleotidnim zaporedjem celotnega genoma, pa kljub temu zelo malo vemo o njenih naravnih habitatih in populacijski genetiki (Sampaio in Gonçalve, 2008) Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Oblika in velikost celic in kolonij kvasovke Saccharomyces cerevisiae Vrsta S. cerevisiae tvori na trdih gojiščih okrogle do eliptične kolonije z gladkim robom. Profil kolonije je gladek, lahko pa je kolonija tudi popkasto oblikovana (umbilicirana kolonija). Kolonije so rahlo pigmentirane kremne barve (Barnett s sod., 2000; Walker, 2009) in mazave. V tekočem gojišču lahko opazimo sedimentacijo in flotacijo celične mase. Sedimentacija je granulirana (Pitt in Hocking, 1999). Velikost kvasnih celic je lahko zelo različna glede na razvojno stopnjo, vrste in pogoje za rast. Celice vrste Saccharomyces cerevisiae (glej sliko 1) so eliptične do jajčaste oblike, dolge od 5 do 10 µm in široke od 1 do 7 µm. Povprečni celični volumen kvasovke je 29 µm 3 za haploidno in 55 µm 3 za diploidno celico (Feldman, 2005). Askospore so kroglaste oblike in gladke. Aski so lahko kroglasti ali elipsoidni (Pitt in Hocking, 1999). Slika 1: Kolonije in oblika celic S. cerevisiae (Pitt in Hocking, 1999; CBS baza podatkov). A: kolonija na MEA, B, C: celice kolonije različne povečave, D: aski in askospore Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Genom kvasovke Saccharomyces cerevisiae Genom kvasovke S. cerevisiae je znan že več kot deset let. Kvasni genom vsebuje okoli 6000 genov, ki so locirani na 16 kromosomih (Landry s sod., 2006). Vsebuje relativno majhen, zelo racionalno izkoriščen genom z 12,5 Mb neponavljajočih zaporedij DNA. (Kavanagh, 2005; Feldman, 2005). Na začetku zaporedja je 1200 genov ribosomskih ponovitev (rdna), ki kodirajo RNA in beljakovine. Ta regija se pogosto uporablja pri filogenetskih študijah (Feldman, 2005). Poleg jedrnega genoma, ki v haploidnem laboratorijskem sevu predstavlja 70 do 80 % skupne dednine, vsebujejo kvasovke še mitohondrijsko DNA (Kavanagh, 2005).

19 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov Ribosomska DNA kvasovk Glavni razlog za pogosto uporabo ribosomske DNA v molekularno-genetski identifikaciji je prisotnost gena v številnih kopijah. Poleg tega so ribosomi prisotni pri vseh kvasnih celicah in so evolucijsko zelo ohranjeni (van de Peer s sod., 1997). Vsaka enota rdna je sestavljena iz nukleotidnega zaporedja za ribosomsko RNA, ki kodira malo podenoto 18S rdna (SSU) in veliko podenoto 28S rdna (LSU), ter 5.8S rdna. Te funkcionalne regije so ločene med seboj z vmesniki. SSU (»small subunit«) rdna in LSU (»large subunit«) rdna sta ločeni z zunanjima prepisnima vmesnikoma (ETS) in neprepisnima vmesnikoma (NTS). Oba vmesnika imenujemo medgenska vmesnika (IGS). 5.8S rdna je vrinjena med dva notranja prepisna vmesnika (ITS1, ITS2). Regija ITS se nahaja znotraj zapisa za 18S in 28S. Geni, ki kodirajo posamezno enoto rdna (18S, 5.8S in 28S) se navadno nahajajo v tandemu, te pa se lahko ponavljajo od sto do tisočkrat v genomu in predstavljajo približno 10 % celotnega genoma (Hwang in Kim, 1999). Slika 2: Shematski prikaz enot rdna (Hwang in Kim, 1999: 216). ETS zunanja prepisna vmesnika, NTS zunanji neprepisni vmesnik, IGS medgenski vmesnik (ETS, NTS), ITS1 in ITS2 notranja prepisna vmesnika Za kvasovko S. cerevisiae je značilno, da ima regijo rdna bogato z adeninom in timinom (A + T). Avtonomna ponavljajoča sekvenca (Autonomously replicating sequence ARS) je pri kvasovki S. cerevisiae: (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) (Palzkil s sod., 1986) Hibridi rodu Saccharomyces Evoluciji hibridov vrst Saccharomyces lahko sledimo preko zapisa DNA. Zelo sorodne vrste imajo te zapise zelo identične in jih uvrščamo v skupino Saccharomyces sensu stricto; druge, manj kompatibilne oz. manj podobne seve pa v skupino Saccharomyces sensu lato (Sampaio in Gonçalve, 2008). Sodobnejše filogenetske študije v rodu Saccharomyces priznavajo osem vrst: S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus, S. pastorianus, S. uvarum, S. cariocanus, S. kudriavzevii in S. mikatae. Večina teh vrst se je razvijala ločeno. Vrsti S. pastorianus in S. bayanus pa naj bi bili hibrida, saj je v njunih genomih zaslediti nukleotidna zaporedja tako S. cerevisiae kot S. uvarum (Sampaio in Gonçalve, 2008). Kvasovke rodu Saccharomyces sensu stricto predstavljajo šest vrst in en naravni hibrid (Liti s sod., 2006). V skupino Saccharomyces sensu stricto, poleg S. cerevisiae, spadajo še najbližji sorodniki S. bayanus, S. pastorianus in S. paradoxus (Boulton in Quain, 2001). Najbližji sorodnik S. cerevisiae po sekvenci je S. paradoxus (Liti s sod., 2006). Najbolj sorodne znotraj skupine delimo lahko v dve skupini, in sicer S. bayanus in S. pastorianus ter S. cerevisiae in S.

20 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 7 paradoxus glede na temperaturno odzivnost (Boulton in Quain, 2001). Nekateri dokazi jasno kažejo, da različne temperature rasti posameznih vrst igrajo pomembno vlogo pri križanju različnih vrst Saccharomyces in nastajanju novih hibridov (Sampaio in Gonçalve, 2008). Skupini cerevisiae in bayanus sta zmožni rasti pri nižji maksimalni in optimalni temperaturi in imata značilen transport fruktoze preko aktivnega protonskega transporta. Križanci med skupinama cerevisiae in bayanus so stabilni genetski hibridi. Jedro in mitohondrijska DNA sta podedovana od enega organizma s fragmenti DNA obeh organizmov (Boulton in Quain, 2001). Edino vrst S. kudriavzevii in S. uvarum sta zmožni rasti pri še nižji temperaturi kot S. cerevisiae in S. paradoxus iz skupine Saccharomyces sensu stricto (Liti s sod., 2006). Odkriti so bili tudi hibridi med vrstama Saccharomyces cerevisiae in Saccharomyces kudriavzevii, hibridi med S. cerevisiae in S. bayanus in trojni hibrid S. bayanus S. cerevisiae S. kudriavzevii (Gonzalez s sod., 2006) Življenjski krog kvasovke Saccharomyces cerevisiae Razmnoževanje kvasovke Saccharomyces cerevisiae Kvasovka Saccharomyces cerevisiae je zelo dobro proučen organizem z zelo jasno določenim, kompleksnim življenjskim krogom (Landry s sod., 2006; Kavanagh, 2005). Življenjski krog kvasovke lahko delimo na dve stopnji: (1) nespolno razmnoževanje poteka v obliki brstenja ter (2) spolno razmnoževanje kot parjenje in sporulacija (nastanek askospor). Bistvo življenjskega kroga kvasovke je, da celice izmenjujejo spolno in nespolno fazo (glej sliko 3) (Landry s sod., 2006). Slika 3: Življenjski krog kvasovke (menjava haploidne in diploidne generacije). Kvasovko S. cerevisiae po navadi v naravi najdemo kot enocelični diploidni (2n) organizem (Landry s sod., 2006; Hartwell, 1974). Razmnoževanje in rast celic S. cerevisiae so v splošnem vezani na brstenje. To je nespolno razmnoževanje (mitoza), ki poteka na specifični lokaciji na površini materinske celice. Brstenje zagotavlja, da hčerinska celica dobi celotno kopijo genetskega materiala materinske celice (Kavanagh, 2005). Po prepisu genetskega materiala na obe nastajajoči celici se del celične stene

21 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 8 podaljša in zraste v hčerinsko celico. Novonastali brst lahko odpade, ko je še zelo majhen, ali pa zraste na materinski celici skoraj do končne velikosti. Včasih nekaj brstov ostane med seboj povezanih (Zalar in Gunde-Cimerman, 2002). Brazgotine brsta (t. i. porodne brazgotine) so specifične in se kažejo kot izbokline na celični površini. Ostanejo na obeh celicah po delitvi in nastanku nove hčerinske celice (Feldman, 2005). Po poteku mitoze nastaneta torej dve genetsko enaki diploidni celici. Proces nespolnega razmnoževanja lahko omejujejo določeni okoljski parametri. Pomanjkanje hranil (npr. dušika) ali prisotnost nefermentabilnih virov ogljika lahko izzove pri kvasovkah spolno razmnoževanje (mejozo). Diploidne celice z mejozo tvorijo tetrado štirih haploidnih askospor (štiri genetsko različne celice) v aska, katerega steno predstavlja stena prej diploidne celice (Landry s sod., 2006). Proces običajno poteka aerobno (Calum in Grei, 2008). Z razpadom aska se sprostijo štiri haploidne askospore (Feldman, 2005). Nastale haploidne askospore po mejozi se lahko ob prisotnosti potrebnih hranil naprej nespolno razmnožujejo z mitozo, kar imenujemo kaljenje (Herskowitz, 1988). Kvasovka ostane v haploidni fazi do srečanja celice nasprotnega paritvenega tipa poteče parjenje (Raspor, 1996). Pri kvasovkah S. cerevisiae sta poznana dva paritvena tipa: a in (dve različni haploidni askospori). Paritveni tip a in α sta dve celici, ki se med sabo 100 % privlačita zaradi delovanja feromonov. Pri parjenju a in α celic dobimo a/α diploidne celice (Landry s sod., 2006). Posebnost kvasovke vrste S. cerevisiae je, da haploidne celice lahko spremenijo paritveni tip s pomočjo DNA-preureditve (Herskowitz, 1988). Novo nastali enocelični diploidni (2n) organizmi tako sklenejo življenjski krog kvasovke. Do zaustavitve kaljenja lahko pride tudi takrat, ko so v bližini prisotne celice drugih kvasovk, s katerimi lahko poteka paritev (Herskowitz, 1988). Tako lahko nastanejo hibridi s sorodnimi vrstami kvasovk Saccharomyces sensu stricto. Diploidni hibridi nastanejo z združitvijo celic dveh različnih vrst. Ti hibridi se razmnožujejo nespolno z mitozo. Pri njih produkcija spor z mejozo ni mogoča zaradi razlike v genetskem materialu, ki ga v nov organizem doprinese vsaka vrsta (Calum J. M., Greig, 2008) Fermentacijski sistemi in produkti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Potrebna temperatura in ph za rast kvasovk Večina laboratorijskih in industrijskih kvasovk najbolje uspeva v temperaturnem območju med 20 in 30 C. Optimalna rast za kvasovko S. cerevisiae je območje med 25 do 35 C (Pitt in Hocking, 1999), torej je kvasovka termotolerantna (Rupnik s sod., 2005). Nekateri sevi kvasovke so sposobne rasti tudi v območju od 10 C do 39 C (Pitt in Hocking, 1999). Večina kvasovk raste najbolje na gojiščih med ph 4,5 in 6,5. Znotrajcelični ph kvasovk je reguliran v sorazmerno ozkem območju, predvsem preko delovanja ATP-azne protonske membranske črpalke. Pri kvasovki S. cerevisiae je ph okoli 5 (Walker, 2009) Kisik kot vir energije Kot vsi organizmi tudi kvasovke potrebujejo vir energije za preživetje. Energijo pridobivajo s celičnim dihanjem, pri katerem se s pomočjo kisika oksidirajo organske molekule. Energija se shranjuje v kemijskih vezeh ATP-ja. Poznamo dve vrsti celičnega

22 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 9 dihanja anaerobno in aerobno. Če kvasovka lahko raste tako ob prisotnosti, kot tudi v odsotnosti kisika, jo imenujemo fakultativni aerob ali pa fakultativni anaerob, odvisno od prednostnega načina rasti npr. fakultativni anaerob preferenčno raste aerobno (Petro, 2010). Kvasovke vrste S. cerevisiae so fakultativno anaerobni organizmi in so na splošno nezmožni rasti pod striktno anaerobnimi pogoji. Kisik je potreben kot dejavnik rasti, poleg tega pa ga potrebujejo za zagotavljanja terminalnih elektronskih akceptorjev pri celičnem dihanju, pri biosintezi membranskih maščobnih kislin in sterolov. S. cerevisiae je auksotrofična. To je lastnost organizma, nezmožnega sintetizirati esencialne organske spojine, potrebne za rast. Če so prisotni steroli in določene nenasičene maščobne kisline, je kvasovka S. cerevisiae sposobna rasti tudi v anaerobnih pogojih (Verduyn s sod., 1990) Prehrana in presnova pri kvasovkah Kvasne celice za rast potrebujejo makrohranila (vir ogljika, dušika, kisika, žvepla, fosforja, kalija in magnezija), elemente v sledovih (npr. Ca, Cu, Fe, Mn in Zn) in rastne faktorje (organske komponente, ki jih ne uporabljajo kot vir energije) (Walker, 2009) Presnova ogljika pri kvasovkah V prisotnosti kisika praktično vse vrste kvasovk lahko oksidirajo sladkorje z dihanjem v mitohondrijih. Prav tako so sposobne pretvoriti sladkor v etanol in CO 2 (Raspor, 1996). Kvasovka S. cerevisiae dobro raste na heksozah (glukozi, fruktozi, manosi in galaktozi) in preprostih oligosaharidih (maltozi, saharozi in rafinozi) (Sampaio in Gonçalve, 2008; Boulton in Quain, 2001). Za te vrste sladkorjev je značilno, da jih S. cerevisiae lahko fermentira v alkohol in ogljikov dioksid. Ostale ogljikove substrate, kot so etanol, glicerol in acetati, pa kvasovka lahko uporabi le ob zadostnem viru kisika (Walker, 2009) Presnova sladkorjev do etanola Različne vrste kvasovk so sposobne asimilirati in fermentirati različne vrste sladkorjev. Njihov potencial je povezan s transportnimi sistemi v celični membrani in razpoložljivimi hidrolitičnimi encimi, ki jih izločajo v okolje (Raspor, 1996). Osnovna presnova sladkorjev pri kvasovkah temelji na fermentaciji in respiraciji. Sladkor (glukozo) preko glikolize pretvori v piruvat. Če je prisoten kisik, nato poteče respiracija, če kisika ni, pa fermentacija. Pri alkoholni fermentaciji sladkorjev S. cerevisiae oksidira koencim NADH v NAD, ki je potreben za nastanek piruvata. Pri tem sodeluje encim piruvat dekarboksilaza, ki dekarboksilira piruvat v acetaldehid, ki ga nato reducira alkoholna dehidrogenaza do alkohola. Regeneracija NAD je potrebna za ohranjanje redoks ravnotežja, da ne pride do zaustavitve glikolize (Walker, 2009; Kavanagh, 2005). Aerobna respiracija glukoze je pri kvasovkah energetsko učinkovita presnova, ki zajema glikolizo in ciklus citronske kisline (Krebsov cikel), elektronsko transportno verigo in oksidativno fosforilacijo (Walker, 2009). Kvasovke vrste S. cerevisiae imajo tako imenovan»crabtree efekt«. Sposobne so fermentirati visoke koncentracije sladkorjev, če je prisoten kisik (respirofermentator) (Walker, 2009). Crabtree efekt je alkoholna fermentacija ob prisotnosti kisika, ko glukoza

23 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 10 preseže določeno mejno koncentracijo. Ob prisotnosti presežka sladkorja poteče aerobna fermentacija glukoze v etanol, ta pa zagotavlja velik del energije, ki je potrebna za tvorbo biomase (Verduyn s sod., 1990). Kvasovke delimo na Crabtree pozitivne in negativne. Kvasovke, kot je Saccharomyces cerevisiae, ki kopičijo etanol tudi v prisotnosti kisika, imenujemo Crabtree pozitivne kvasovke, ostale, ki razgradijo sladkor do CO 2, pa Crabtree negativne kvasovke (Piškur s sod., 2006; Wardrop s sod., 2004) Ostali produkti presnove sladkorjev Pri fermentaciji alkoholnih pijač (npr. pri pivu, vinu, destiliranih žganih pijačah, jabolčniku) lahko poleg etanola in ogljikovega dioksida opazimo tudi druge produkte presnove. Ti metaboliti so razni derivati alkoholov (npr. izoamil alkohol, butanol), polioli (npr. glicerol), estri (npr. etil acetat), organske kisline (npr. sukcinat) in aldehidi (npr. acetaldehid) (Walker, 2009; Kavanagh, 2005) Presnova dušika pri kvasovkah Kvasovke potrebujejo za rast dušik. Amonijev sulfat je pogosto uporabljeno hranilo v gojiščih za rast kvasovk, ker na ta način lahko zagotovimo tako asimilacijo dušika kot žvepla. Nekatere kvasovke lahko kot vir dušika uporabljajo tudi nitrat in nitrit. Tudi veliko organskih dušikovih virov, kot so npr. aminokisline, peptidi, purini, pirimidini in amini, lahko zagotovi potrebe kvasne celice po dušiku (Walker, 2009) Tehnološko industrijska uporabnost produktov kvasovk Kvasovke so pomembne pri tradicionalni biotehnologiji kot tudi pri moderni biotehnologiji. Kvasovke rodu Saccharomyces predstavljajo konkurenco ostalim kvasovkam z edinstveno kombinacijo lastnosti, kot so hitra rast, tudi ob visoki koncentraciji sladkorjev, dobra sposobnost za proizvodnjo in porabo etanola in toleranca na več okoljskih stresorjev, kot so visoka koncentracija etanola in nizka koncentracija kisika (Piškur s sod., 2006). Poleg tega, da kvasovko S. cerevisiae uporabljamo pri različnih tehnologijah proizvodnje hrane, je pomembna tudi pri tehnologijah za raziskavo dednine, uporabljamo pa jo tudi kot gostiteljski organizem pri tehnologijah za heterologne proteine. Je nepogrešljiva pri proizvodnji protiteles, hormonov, encimov, npr. amilaz, proteaz, barvil in arom (Walker, 2009). Kvasovka S. cerevisiae je organizem, pri katerem so izolirali encima alkohol dehidrogenazo in invertazo (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Še posebej je zanimiva zaradi svoje tradicionalne prisotnosti v človeških okoljih in je splošno priznana kot varen organizem, zato jo uporabljamo pri eksperimentalnem delu (Raspor, 1996). Poleg vseh naštetih komercialnih sektorjev (živila, kemikalije, industrijski encimi, farmacija) pa je pomembna tudi z vidika kmetijstva in okolja (Walker, 2009) Izrabljanje produktov kvasovke S. cerevisiae v prehrambeni industriji Kvasovka S. cerevisiae je nenadomestljiva v tehnologiji proizvodnje piva, vina, sakeja, pekovskega kvasa in kruha, sira, kisa, alkoholnih destilatov, energije, krmnega kvasa, uporabnih kemikalij in aditivov. Njihovi proizvodi so skoraj nepogrešljivi (Piškur s sod., 2006).

24 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 11 Vrsta S. cerevisiae med kvasovkami zasluži posebno mesto, saj je njena uporaba v prehrambene namene skoraj tako stara kot naša civilizacija (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Produkcija etanola in proizvodnja CO 2 je za človeka najvažnejša tehnološka lastnost kvasovke, ki jo izkoriščajo za vzhajanje pekovskih izdelkov. Specifični produkti kvasovk dajejo živilom svojevrstne organoleptične lastnosti (Raspor, 1996; Kavanagh, 2005) Uporaba kvasovke S. cerevisiae v pivovarstvu V pivovarstvu poteka proizvodnja piva kot semi-aerobni proces, ki ga lahko reguliramo s temperaturo in mešanjem. V primeru pivovarskih produktov je glavni vir ogljika ječmen. Večina kvasovk ne fermentira škroba, zato amilaza in glukoamilaza ječmen pretvorita v slad. Na ta način škrob hidrolizira do sladkorjev, ki jih kvasovke lahko fermentirajo do etanola (Kavanagh, 2005). V tem postopku poteča kvasna flokulacija (kosmičenje), kar je nespolno in reverzibilno združenje celic. Celice se držijo druga druge in tvorijo kosmiče. V pivovarski industriji uporabljajo predvsem kvasovko S. cerevisiae, da lahko njene celice preprosto in stroškovno učinkovito ločijo od fermentacijskega produkta (Zhao in Bai, 2009; Kavanagh, 2005) Proizvodnja bioetanola z razgradnjo lignoceluloze Dandanes je bioetanol zelo pomemben v industriji goriva. Tudi plastiko, kot je na primer polietilen, lahko proizvedejo iz etanola. Bioetanol so uporabljali že med 2. svetovno vojno, vendar je bila proizvodnja tedaj ekonomsko nekonkurenčna. V zadnjih treh desetletjih pa se temu zopet posveča ogromno raziskav (Taherzadeh in Karimi, 2007). Produkcija etanola kot goriva temelji na surovinah z visoko vsebnostjo saharoze (trsni sladkor), na škrobne surovine in na lignocelulozno biomaso (Sánchez in Cardona, 2008). Manj kot 4 % etanola proizvedejo iz olj, ostali etanol pa proizvajajo preko fermentacije bioloških virov. Trenutno ga največ proizvajajo iz sladkorjev in škrobnih materialov, vendar ima največji potencial v prihodnosti lignoceluloza. Lignocelulozni material je obnovljiv, velikokrat neuporabljen in zelo dostopen vir surovin. Glavni viri lignoceluloze so predvsem ostanki lesne industrije, komunalni odpadki, odpadne vode in rastlinski odpadni produkti. Ti materiali vsebujejo polimerizirane sladkorje v obliki celuloze in hemiceluloze, ki jih lahko razgradimo s hidrolizo in kasneje fermentiramo v etanol s pomočjo mikroorganizmov (Taherzadeh in Karimi, 2007). Lignocelulozni material vsebuje predvsem zmes ogljikovih polimerov (celulozo in hemicelulozo holoceluloza), lignina in rudnin (Taherzadeh in Karimi, 2007). Ogljikove hidrate v lignoceluloznem materialu je potrebno spremeniti s hidrolizo (kemična in encimska) v enostavne sladkorje še pred fermentacijo. Celulozo in hemicelulozo lahko fermentiramo v etanol, lignin pa ostane stranski produkt. Po hidrolizi nastanejo poleg heksoz tudi pentoze, predvsem ksiloza je glavni sladkor po hidrolizi hemiceluloze. Med fermentacijo morajo biti mikroorganizmi sposobni učinkovite razgradnje in velikega izkoristka, morajo biti odporni na proteinske inhibitorje in fermentirati etanol iz pentoz (Taherzadeh in Karimi, 2007). Kvasovka S. cerevisiae ima najbolj obetavne lastnosti, ki jo uvrščajo med prednostne mikroorganizme za pridelavo bioetanola druge generacije. Glavna pomanjkljivost je, da kvasovka ne fermentira ksiloze (Taherzadeh in Karimi, 2007; Semenčenko s sod., 2011).

25 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 12 Lastnosti kvasovke, da fermentira pentoze je možno spremeniti tudi z genetskim inženirstvom oziroma s tehnologijo rekombinantne DNA. Pri tem ostaja organizem toleranten na etanol in pridobi sposobnost, da presnavlja dodaten substrat. Drugi pristop k rešitvi tega problema pa je uporaba drugih mikroorganizmov (kvasovk in bakterij), ki so sposobni fermentirati tudi pentozo (V. Semenčenko s sod., 2011). Glavni problem pri proizvodnji bioetanola je fermentacija zmesi heksoz in pentoz ob prisotnosti inhibitorjev. V ta namen želijo razviti mikroorganizem, ki bi bil sposoben razgradnje obeh vrst sladkorjev. Naslednji problem je okoljevarstveni, saj bi morali biti trdi ostanki proizvodnje etanola in odpadna voda, ki nastanejo v etanolnem obratu, spremenjeni v druge produkte ali razgradljivi (Taherzadeh in Karimi, 2007) Uporabnost kvasovke S. cerevisiae pri rekombinantnih tehnikah Poleg produkcije etanola je druga pomembna metabolična aktivnost tudi sinteza homo- in heterolognih proteinov (Raspor, 1996). Kvasovke kot gostiteljski sistem so primerni za intracelularno in ekstracelularno izražanje genov različnega izvora (humanega, živalskega, rastlinskega ali virusnega). Izražanje tujih genov vključuje več korakov. Začne se z vključitvijo tuje kodirajoče sekvence DNA (cdna) v primerno ekspresijsko kaseto (vektor), ki vsebuje kvasni promotor in terminator. Nadaljnji postopek poteka z vključitvijo oz. vnosom vektorja v ustrezen gostiteljski sev ter stabilno vzdrževanje le-tega v celicah. Sledi sinteza heterolognega proteina pri specifičnih, točno določenih pogojih gojenja in kot končna faza izolacija in čiščenje tarčnega proteina (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Kvasovka S. cerevisiae je zaradi svojih lastnosti pomembno orodje za pridobivanje rekombinantnih proteinov. Je primeren gostiteljski organizem za uspešno produkcijo številnih proteinov: protiteles, hormonov, rastnih dejavnikov ter drugih farmacevtsko pomembnih makromolekul. Dobro poznavanje njene genetike in fiziologije omogoča uspešno načrtovanje vektorjev, posttranslacijskih modifikacij, visokoprodukcijskih gostiteljskih sevov in enostavno gensko manipulacijo. Dobro poznavanje njenih molekularnih in biokemijskih lastnosti omogoča razvoj specifičnih, tako klasičnih kot rekombinantnih genskih tehnik (Novak-Štagoj in Podobnik., 2006). Poleg številnih prednosti pa ima uporaba S. cerevisiae tudi nekaj pomanjkljivosti, kot so: nezmožnost rasti do visokih gostot, neučinkovito izločanje proteinov v gojišče, prekomerna in nepravilna glikozilacija (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Čeprav obstajajo številne omejitve pri uporabi te kvasovke kot gostitelja heterolognih proteinov, pa prednosti uporabo odtehtajo. Prednost kvasovk v primerjavi s kompleksnejšimi gostitelji, kot so sesalske celice, je v tem, da so preprostejše, enostavnejše, njihovo gojenje je cenejše in poznavanje boljše (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Prednost S. cerevisiae je še v tem, da ima status GRAS (Generally Regarded As Safe) in za večino genskih manipulacij ni etično sporna. Prvi ekspresijski vektorji so bili razviti prav za S. cerevisiae (Raspor, 1996). Na njihovi osnovi se je že v zgodnjih 80 letih prejšnjega stoletja razvila proizvodnja številnih, zlasti farmacevtsko zanimivih rekombinantnih proteinov v industrijskem merilu (kot so npr.: inzulin, hepatitis B antigen, uratna oksidaza, glukagon, stimulator rasti granulocit-makrofaga, trombocitni rastni dejavnik, hirudin/desirudin, hirudin/lepirudin) (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006).

26 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov Ekologija kvasovke S. cerevisiae in njeni habitati Kvasovko Saccharomyces cerevisiae štejemo med udomačene enocelične organizme, ki so jih v preteklosti izolirali iz njenega naravnega habitata za potrebe človeku pomembnih fermentacij in industrij (Landry s sod., 2006; Sampaio in Gonçalve, 2008). V naravnem ekosistemu jo običajno težje zasledimo, nekaj raziskav pa kaže, da naj bi S. cerevisiae v naravnem okolju obstajala mnogo pred človeško uporabo za fermentacijo (Sampaio in Gonçalve, 2008). Danes S. cerevisiae najdemo v okoljih, ki jih dobro poznamo zaradi industrijskih procesov, kot so pridelava kruha, vina, jabolčnika in piva. V industriji s hrano je ena glavnih krivcev za kvar hrane (Pitt in Hocking, 1999; Carter s sod., 2009). Vendar pa kvasovko S. cerevisiae najdemo tudi v naravi (Pitt in Hocking, 1999; Carter s sod., 2009). Naravni habitati S. cerevisiae so še vedno dokaj neraziskani (Sampaio in Gonçalve, 2008). V literaturi je navedeno, da S. cerevisiae lahko osamimo iz vinogradov, grozdja in drugega sadja, pri fermentacijskih procesih, iz insektov, hrastovega lubja ali tal poleg hrasta in drugih listnatih dreves (Erlend s sod., 2006). Kvasovko S. cerevisiae v naravi običajno najdemo v diploidni fazi (Kavanagh, 2005). To so industrijski udomačeni sevi, ki smo jih iz človeškega fermentacijskega okolja prenesli v naravo. Naravni divji sevi so haploidni in so manj odporni kot industrijski sevi, ki pri izolatih običajno prevladujejo. Prisotnost obeh, udomačenih in divjih sevov, so zasledili v naravi na izolatih iz sadja, v produktih iz grozdja, izcedkih dreves in v sadnih sokovih. Našli pa so jih tudi na insektih, ki jih sladki rastlinski sokovi in smole različnih dreves privlačijo (Fay in Benavides, 2005; Kavanagh, 2005) Poznana nahajališča kvasovke S. cerevisiae iz industrijskih procesov Kvasovke poseljujejo habitate, ki vsebujejo bogat vir ogljika. Najbolj so proučene predvsem kvasovke S. cerevisiae v habitatih, ki so tehnološko pomembni za človeka, kot so fermentacija vina, pridelava grozdja v vinogradih in vse stopnje fermentacije do končnih produktov. Prisotnost kvasovk je povezana z vsebnostjo sladkorja. Ko vsebnost sladkorja pada, narašča pri fermentaciji količina etanola. Kvasovke, ki niso tolerantne na etanol, odmrejo, prevladajo pa kvasovke S. cerevisiae, ki so tolerantne na etanol (Boundy- Mills, 2006). Glavni tehnološko-okoljevarstveni pomen kvasovke S. cerevisiae je tudi ta, da pretvorijo saharide in tako zaščitijo določena hranila pred razpadom. Njihovi metabolični proizvodi, npr. alkohol pri S. cerevisiae, omogoča konverzijo živila v novo obliko ob sočasnem konzerviranju (Raspor, 1996). Kvasovke vrste S. cerevisiae so torej našli v smolah različnih dreves, pri fermentaciji vina, viskija in kakava (Pitt in Hocking, 1999), na razpadlem lesu, različnem sadju (Boundy- Mills, 2006) in palminem vinu (Ibekwe s sod., 2006). Izolirali so jo tudi iz različnih sokov in ekstraktov, pokvarjenih naravnih sokov, raznih osvežilnih pijač, ki so bile izpostavljene staranju (npr. mineralna voda, pomarančni sok z mehurčki, izotonični napitki), in sokov pred pasterizacijo. Prav tako je znano, da so kvasovko S. cerevisiae izolirali iz mlečnih produktov, kot je sir, jogurt in skuta. Poleg tega so jih našli tudi v fermentiranih mlečnih izdelkih in kefirju (Pitt in Hocking, 1999).

27 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 14 Na splošno bioetanol proizvajajo s fermentacijo sladkorjev in škrobnih materialov. V prihodnosti pričakujejo, da bo lignoceluloza glavni vir za produkcijo etanola poleg ostalih omenjenih. Zato lahko pričakujemo, da bi lahko našli kvasovko S. cerevisiae tudi med gozdnimi ostanki (les, lubje, smola, trhlovine), komunalnimi odpadki, odpadnimi vodami in raznimi rastlinskimi odpadnimi produkti (tudi listna stelja, humus, listni drobir) (Pitt in Hocking, 1999; Taherzadeh in Karimi, 2007) Nahajališča kvasovke S. cerevisiae v naravi Vedno več raziskav kaže, da S. cerevisiae zaseda in poseljuje večje število habitatov, ki niso povezani s človeško aktivnostjo (Landry s sod., 2006). Večina kvasovk se nahaja v tleh ali na razpadajočih organskih odpadkih v okolju ter sodelujejo pri procesu kroženja organskih in anorganskih snovi. Njihov cikel je v nekaterih primerih, npr. pri fermentaciji mošta v vino, proučevan, vendar še vedno niso pojasnjeni vsi odnosi v kroženju in razširjanju teh mikroorganizmov (Raspor, 1996). Prednostni habitati kvasovk so sicer rastlinska tkiva (listi, cvetovi in plodovi), nekatere vrste pa lahko najdemo tudi v parazitskem razmerju z živalmi. Nekaj vrst kvasovk je možno izolirati iz specifičnih ali ekstremnih okoljih, kot so nahajališča z zelo nizko vodno aktivnostjo (okolja z visoko vsebnostjo sladkorja ali soli), nizko temperaturo (npr. polarna območja) ali kjer je zelo majhna prisotnost kisika (npr. prebavni trakt živali). Kvasovko S. cerevisiae so zasledili v vodi, na rastlinah, živalih in insektih (Walker, 2009). Nove vrste so odkrili pri raziskavah habitatov, kot so listje, čebele, hrošči, druge žuželke in drugi nevretenčarji, kumare in druga zelenjava, brezalkoholne gazirane pijače, mlečni izdelki, čiste vode in morska okolja (Boundy-Mills, 2006). Veliko izolatov vrste Saccharomyces cerevisiae so izolirali iz vinogradov, in sicer v povezavi z grozdjem (grozdne jagode, ki so jih ptiči ali insekti poškodovali), iz poškodovanega sadja, iz tal pod drevesi (predvsem drevesne vrste Quercus), iz izcedkov sadnih dreves in smol (Sampaio in Gonçalve, 2008; Landry s sod., 2006), ter iz riževega vina in drugih vrst vin (Sujayas sod., 2003). Kvasovko so našli tudi v rastlinskih tekočinah različnih drevesnih vrst (npr. smole in drugi izločki dreves), v tleh pod drevesi in na površini gob (Sampaio in Gonçalve, 2008). Kvasovka S. cerevisiae poseljuje mnogo habitatov. Z raziskavami v zadnjih letih so ugotovili, da vsaka populacija določenega habitata skriva pomembne genetske variacije (Landry s sod., 2006). Glavni dejavniki so predvsem klima, geografska lokacija, temperatura, padavine, habitat, vsebnost makro- in mikrohranil, kisik, vlaga, ph, prisotnost metabolitov in toksinov (Boundy-Mills, 2006). 2.2 METODIKA PROUČEVANJA KVASOVK Metodika izolacije kvasovk Vzorčenje, izolacija in gojenje kvasovk na gojiščih Kvasovke lahko osamimo iz vzorcev z uporabo bodisi selektivnih (nizek ph gojišča, visoko koncentracijo etanola ali sladkorja) ali bogatitvenih metod (gojišča z dodatkom

28 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 15 specifičnih virov ogljika, npr. etanola, rafinoze). V obeh primerih gojiščem dodajamo antibiotike, ki zavrejo rast drugih mikroorganizmov (Sampaio in Gonçalve, 2008). Osnovna sestava gojišča za rast in vzdrževanje kvasovk vsebuje sladni ali kvasni ekstrakt s peptonom in glukozo (Walker, 2009). Za rast potrebujejo vir ogljika (npr. glukoza, fruktoza, saharoza) in dušika (npr. pepton, tripton), določene vitamine, minerale in rastne faktorje, ki so za vsako vrsto specifični. Pogosto gojiščem dodajamo tudi dodatke (npr. kvasni ekstrakt, sladni ekstrakt). YM (»Yeast-Malt extract«) in MEA (»Malt extract agar«) gojišči sta zelo pogosti za izolacijo, uporabljajo pa jih tudi za vzdrževanje in shranjevanje kvasnih kultur v tekoči ali trdni obliki. Gojiščem lahko dodamo različne dodatke, kot npr. sol (10 % NaCl), kloramfenikol (Ch) in etanol (10 % EtOH). Takšna gojišča pogosto uporabljamo za izolacijo kultur, medtem ko za rast specifične vrste ali skupine kvasovk uporabljamo selektivne ali diferencialne medije (Boundy-Mills, 2006). Nekatere fizikalno-kemijske dejavnike zagotovimo s sestavo gojišč (ph), druge pa z zunanjim okoljem (temperatura, kisik). Gojimo jih pod pogoji, ki so za mikroorganizme najbolj optimalni (Rupnik s sod., 2005) Metode identifikacije kvasovk Določevanje kvasovk temelji večinoma na morfoloških znakih fenotipske lastnosti. Za določitev je potrebna gojitev na gojišču. Pomembne so značilnosti kulture, kot so barva, oblika in struktura kolonij (Guarro s sod., 1999; Tarr, 2004). Prepoznava vrst kvasovk s pomočjo morfoloških znakov je pogosto močno omejena. Vse lastnosti, kot so rast, celična morfologija, rezultati fermentacijskih in asimilacijskih testov, lahko zelo varirajo med sevi znotraj vrste (Kurtzman, 2006). Zato se vzporedno z morfološkimi znaki za prepoznavo oz. identifikacijo uporabljajo fiziološke in biokemijske tehnike. Za razliko od teh so molekularne tehnike splošno uporabnejše, saj so genotipski znaki prisotni povsod in so neodvisni od ekspresije (Guarro s sod., 1999). Uporabljamo primerjave nukleotidnih zaporedij DNA, saj tako lahko natančno identificiramo vrsto (Kurtzman, 2006) Klasične metode identifikacije kvasovk Morfološke metode Vrste kvasovk lahko identificiramo in karakteriziramo na podlagi več različnih kriterijev, kot so celična morfologija (npr. način celične delitve in oblika spor), fiziologija (npr. testi fermentacije sladkorjev) in imonulogija (npr. imunoflurescenca) (Walker, 2009). Morfološke lastnosti vegetativnih in spolnih struktur kvasovk so pomembne pri prepoznavanju rodov kvasovk, poleg tega pa upoštevamo tudi izgled kolonij. K slednjemu prištevamo barvo kolonij, površino, profil ter rob kolonij. Kvasovka S. cerevisiae se razmnožuje tudi spolno, kar opazimo kot menjavo generacij s tvorbo značilnih celic (askospor). Tvorbo askospor lahko pri nekaterih rodovih kvasovk izzovemo s specifičnimi gojišči (acetatni agar za rod Saccharomyces, redčen V8 agar za rod Metschnikowia, malt agar za rod Pichia). Za razvoj askospor je pomembna tudi temperatura, saj večina rodov sporulira pri temperaturi od 20 do 25 ºC. Izgled askospor je prav tako pomemben taksonomski znak (Zalar, 2011). Askospore lahko opazujemo z različnimi barvanji, npr. pri rodu Saccharomyces z acidorezistentnim barvanjem askospore so acidorezistentne in se

29 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 16 ne razbarvajo s kislim alkoholom. Acidorezistentno barvanje je diferencialno barvanje, pri katerem preparat obarvamo z barvilom karbolfuksin, ter razbarvamo s kislim alkoholom. Zaradi značilne sestave celične stene ostanejo obarvane le acidorezistentne askospore. Sledi barvanje s kontrastnim barvilom metilenskim modrilom. Pri kvasovki S. cerevisiae se askospore obarvajo rdeče, aski in vegetativne celice pa modro (Barnett s sod., 2000) Fiziološke značilnosti Asimilacijske in fermentacijske lastnosti kvasovk so še vedno tiste ključne lastnosti, na podlagi katerih kvasovke opisujemo in identificiramo do nivoja vrst. Prav tako je pomemben temperaturni razpon rasti, rast ob prisotnosti oz. odsotnosti določenih vitaminov, cikloheksimida ter toleranca visokih koncentracij glukoze in NaCl. Kot dodatne lastnosti se uporabljajo zmožnost sinteze škroba, ocetne kisline, hidroliza sečnine in diazonium modro B-reakcija. Za kvasovko Saccharomyces cerevisiae je značilno, da asimilira D-glukozo, naslednje vire ogljika pa sevi lahko asimilirajo ali ne: D-galaktozo, saharozo, maltozo, trehalozo, rafinozo, malezitozo, melebiozo, škrob, glicerol, D-manitol, etanol, nekateri sevi asimilirajo tudi D-glukozid in laktat (Boulton in Quain, 2001; Barnett s sod., 2000). Kvasovka lahko tolerira 10 % NaCl oz. 50 % glukoze v gojišču. Raste pri optimalni temperaturi 25 C, maksimalna temperatura rasti pa je 30 C do 35 C, včasih tudi od 37 oz. do 42 C. Škroba ne sintetizira, niti ne ocetne kisline, prav tako pa ne hidrolizira sečnine, reakcija diazonium modro pa je negativna (Barnett s sod., 2000) Molekularne metode identifikacije Prepoznava vrst kvasovk s pomočjo zgoraj opisanih morfoloških in fizioloških znakov je pogosto močno omejena. Zato se vzporedno s fenotipskimi znaki za prepoznavanje vrst oz. identifikacijo uporabljajo zanesljivejše metode na ravni genotipa (Guarro s sod., 1999; Kurtzman, 2006). V taksonomiji kvasovk je najbolj pogosto uporabljeno zaporedje 26 S rdna oz. D1/D2 domena zaporedja LSU (Kurtzman s sod., 2011). Vrste in seve lažje ločimo na podlagi variabilnejših zaporedij, kot je ITS rdna. Pri tem je poleg samega zaporedja pomembna tudi dolžina pomnožene DNA, saj je le-ta različna pri različnih vrstah kvasovk (van der Vossen s sod., 2003; Sujaya s sod., 2003). Glavni razlogi za uporabo regije ITS, ki kodirajo ribosomsko RNA, je pojavljanje v več kopijah v tandemskem zaporedju, poleg tega pa so ribosomi prisotni v vseh organizmih in imajo skupni evolucijski izvor (Guarro s sod., 1999; Kurtzman, 2006). Metoda verižne reakcije s polimerazo (»Polymerase Chain Reaction«PCR) z izbranim parom oligonukleotidnih začetnikov ob določenih pogojih pomnoži del jedrne DNA. Nukleotidna zaporedja pomnožkov uporabljamo za identifikacijo in jih primerjamo z nukleotidnimi zaporedji v javno dostopnih bazah (Kurtzman, 2006; Zalar, 2011).

30 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL Mikrobiološka gojišča za gojenje kvasovk TEKOČA GOJIŠČA YM Z 10 % ETANOLOM IN KLORAMFENIKOLOM sladni ekstrakt 3 g ph 4 5 kvasni ekstrakt pepton glukoza kloramfenikol destilirana voda 3 g 5g 10 g 0,10 g do 1000 ml Ustrezne količine sestavin raztopimo v destilirani vodi in steriliziramo v avtoklavu (121 C, 1,2 atm, 15 min). Po avtoklaviranju, ko se gojišče že ohladi, aseptično dodamo 100 ml 96 % etanolom (EtOH). V sterilne epruvete aseptično odpipetiramo 10 ml gojišča in jih zapremo z zamaškom. GOJIŠČE MEA PO BLAKESLEE-JU (»MALT EXTRACT AGAR«) (Samson in sod., 2004) sladni ekstrakt 20 g ph 5,0 5,5 pepton glukoza agar destilirana voda 1,0 g 20 g 20 g do 1000 ml Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi, po potrebi segrevamo. Uravnamo vrednost ph gojišča med 5,0 in 5,5. Steriliziramo v avtoklavu (121 C, 1,2 atm, 15 min) in vroče gojišče razlijemo v sterilne petrijevke oz. epruvete. GOJIŠČE MEA S KLORAMFENIKOLOM (Andrews in Pitt, 1987) Postopek priprave gojišča je enak kot pri gojišču MEA, s tem, da dodamo 0,05 g kloramfenikola v 1 l gojišča, in sicer pred avtoklaviranjem. GOJIŠČE PDA (»POTATO DEXTROSE AGAR«) predpripravljeno gojišče - krompirjev agar (proizvajalec Biolife, Italija) 42 g destilirana voda do 1000 ml

31 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 18 Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi v mikrovalovni pečici. Gojišče steriliziramo v avtoklavu (121 C, 1,2 atm, 15 min) in vroče razlijemo v sterilne petrijevke oz. epruvete Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae ACETATNI AGAR (Scott, 1979) natrijev acetat 9,8 g ph 7 glukoza NaCl MgSO 4 7H 2 O 10 g 12 g 7 g YE (Yeast Extract) 2,5 g agar destilirana voda 20 g do 1000 ml Ustrezno količino sestavin raztopimo s pomočjo mikrovalovne pečice v destilirani vodi. Steriliziramo z avtoklavom (121 C, 1,2 atm, 15 min) in aseptično odpipetiramo po 2 ml v epruvete oz. prelijemo ustrezno količino na sterilne petrijevke. UREAZNI AGAR pepton 1 g ph 6,8 7 NaCl KH 2 PO 4 glukoza fenol rdeče agar destilirana voda 5 g 2g 1 g 1,8 g 20 g do 900 ml Ustrezno količino sestavin raztopimo z mikrovalovno pečico v destilirani vodi. Steriliziramo v avtoklavu (121 C, 1,2 atm, 15 min). sečnina 20 g sečnine/100 ml destilirane vode Pripravimo raztopino 20 % sečnine in jo steriliziramo preko membranskega filtra s premerom por 0,22 μm. Raztopino aseptično dodamo na 55 C ohlajeno gojišče, premešamo z magnetnim mešalom in aseptično odpipetiramo po 2 ml v male epruvete.

32 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 19 GOJIŠČA ZA FERMENTACIJSKE TESTE Osnovno gojišče: kvasni ekstrakt 4,5 g ph 7 pepton destilirana voda 7,5 g do 1000 ml raztopina bromtimol modro 40 ml (50 mg raztopimo v 75 ml destilirane vode) Osnovno gojišče z ustreznimi količinami raztopimo v destilirani vodi. V velike epruvete z durhamovimi cevkami odpipetiramo po 9 ml osnovnega gojišča in avtoklaviramo (121 C, 1,2 atm, 15 min). Sladkorji: D-glukoza, maltoza, saharoza, d-ksiloza Po 20 g sladkorja raztopimo v 100 ml destilirane vode in steriliziramo s filtracijo preko 0,22 µm membranskih filtrov Millipore. Po avtoklaviranju osnovnega gojišča v epruvete z durhamovimi cevkami aseptično dodamo 1 ml koncentrirane raztopine sladkorja. GOJIŠČA ZA TEMPERATURNE TESTE YNB (»Yeast Nitrogen Base«) YNB (Difco) glukoza (NH 4 ) 2 SO 4 agar destilirana voda 1,7 g 20 g 5 g 22 g do 1000 ml Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi. Steriliziramo z avtoklavom (121 C, 1,2 atm, 15 min) in aseptično prelijemo v sterilne petrijevke. TRDA GOJIŠČA ZA TESTE ASIMILACIJE OGLJIKOVIH SPOJIN YNB (»Yeast Nitrogen Base«) z dodanim virom ogljika Osnovno gojišče: YNB (NH 4 ) 2 SO 4 agar destilirana voda 1,7 g 5 g 20 g do 900 ml

33 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 20 Iz ustrezne količine sestavin raztopimo v destilirani vodi z mikrovalovno pečico osnovno gojišče. Steriliziramo osnovno gojišče v avtoklavu (121 C, 1,2 atm, 15 min). Ohladimo na 55 C in dodamo raztopino s posameznim virom ogljika. Premešamo z magnetnim mešalom in prelijemo na sterilne petrijevke. Raztopina posameznega dodanega vira ogljika: dodani vira ogljika destilirana voda 5 g do 100 ml Viri ogljika: D-glukoza, D-galaktoza, L-sorboza, D-glukozamin, D-riboza, D-ksiloza, L- arabinoza, L-ramnoza, maltoza, a,a trehaloza, celobioza, melibioza, rafinoza, melezitoza, škrob, glicerol, ribitol, D-manitol, mio-inozitol, D-glukuronat, sukcinat, citrat, fruktoza, sorbitol. V stekleni čaši pripravimo 5 % raztopino posameznega vira ogljika, ki jo filtrsko steriliziramo preko membranskih filtrov s premerom por 0,22 μm ter dodamo osnovnemu gojišču po avtoklaviranju. TRDA GOJIŠČA ZA TESTE ASIMILACIJE DUŠIKOVIH SPOJIN YCB (»Yeast Carbon Base«) z dodanim virom dušika Osnovno gojišče: YCB agar destilirana voda 17 g 20 g do 900 ml Ustrezno količino sestavin osnovnega gojišča raztopimo z mikrovalovno pečico v destilirani vodi. Steriliziramo v avtoklavu (121 C, 1,2 atm, 15 min). Osnovno gojišče ohladimo na 55 C, mu aseptično dodamo ustrezno raztopino in pred prelivanjem na petrijevke premešamo z magnetnim mešalom. Raztopina posameznega dodanega viri dušika/100 ml destilirane vode: nitrat (KNO 3 ) nitrit (NaNO 2 ) L-lizin 0,78 g 0,26 g 0,56 g Iz ustreznih sestavin pripravimo raztopine in jih filtrsko steriliziramo preko membranskih filtrov s porami premera 0,22 μm. Aseptično dodamo raztopino osnovnemu gojišču po avtoklaviranju.

34 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 21 TRDA GOJIŠČA ZA UGOTAVLJANJE ENCIMSKIH AKTIVNOSTI Osnovno gojišče za pektinazno aktivnost (hidroliza pektina) pri ph 5 (pektinaza) in ph 7 (pektinliaza): pektin citrusov YNB agar destilirana voda 10 g 6,7 g 20 g do 1000 ml Ustrezne količine sestavin raztopimo z magnetnim mešalom v destilirani vodi. Posebej moramo biti pozorni, da se pektin pred sterilizacijo popolnoma raztopi. Steriliziramo pri 110 C 10 min in aseptično prelijemo na sterilne petrijevke. Reagent: CTAB 10 g/100 ml Gojišče po inkubaciji prelijemo z reagentom CTAB in tako opazimo rezultat encimske aktivnosti. Osnovno gojišče za celulolitična aktivnost (hidroliza karboksimetil celuloze): karboksimetil celuloza celobioza YNB agar destilirana voda 10 g 5 g 6,7 g 20 g do 1000 ml Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi. Pred sterilizacijo dobro raztopimo vse sestavine s segrevanjem na mešalniku, še preden dodamo agar. Steriliziramo v avtoklavu (121 C, 1,2 atm, 15 min) in aseptično prelijemo na sterilne petrijevke. Reagent: kongo rdeče 3 g/100 ml Gojišče po inkubaciji prelijemo z reagentom kongo rdeče in tako opazimo rezultat encimske aktivnosti Raztopine, pufri in zmesi RAZTOPINA RNA-ZE pankreatična RNAza natrijev acetat (0,01 M) 10 mg 1 ml ph 7,4 (uravnavamo z dodatkom 1M Tris Cl)

35 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 22 CTAB PUFER Tris 24,2 g ph 7,5 (uravnamo z 1M HCl) NaCl Na-EDTA CTAB ultra čista voda 82 g 7,4 g 20 g do 1000 ml TE PUFER Tris 1,2 g ph 8 (uravnamo z 1M HCl) Na-EDTA ultra čista voda 0,4 g do 1000 ml MEŠANICA SILIKAGELA IN CELITA silikagel celit 30 g 15 g PUFER 1 TAE Tris baza ocetna kislina 242,0 g 57,1 ml 0,5 M EDTA (ph 8) 100 ml destilirana voda do 1000 ml 50 TBE pufer smo 50-krat redčili z destilirano vodo in dobili 1 TAE pufer, ki smo ga uporabili. 5 NANAŠALNI PUFER bromtimol modro ksilen cianol glicerol destilirana voda 2,5 g 2,5 g 300 ml do 1000 ml ELEKTROFOREZNI GEL agaroza 0,3 g

36 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov TAE pufer 30 ml Reagenti Preglednica 2: Seznam reagentov s proizvajalci. Reagent PrepMan Ultra ITS4: mesto vezave na 3' koncu 28S rdna: nukleotidno zaporedje (5' proti 3'): TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ITS5: mesto vezave: na 5' koncu 18S rdna: nukleotidno zaporedje (5' proti 3'): GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G Microbank (sistem za shranjevanje kvasovk) Proizvajalec Applied Biosystems, California, ZDA Jena Bioscience GmbH, Jena, Nemčija Pro-Lab Diagnostics, Kanada Kemikalije Preglednica 3: Seznam kemikalij s proizvajalci. Kemikalija 10 PCR pufer brez MgCl2 Lestvica: "100bp DNA Ladder Plus" RNA-ze Taq polimeraza (5U/μl) Agar agar Celit Citrat D-ksiloza Etanol 70 % MgSO 4 7 H 2 O Nitrit (NaNO 2 ) Pepton Silikagel Sečnina (Urea) a,a trehaloza Bromtimol modro Celobioza CTAB D-glukozamin D-riboza Fenol rdeče Fruktoza Karboksimetil celuloza Proizvajalec Fermentas,. Life Sciences, Litva Merck, Darmastadt, Nemčija Sigma Chemical C., St. Luis, Mo., ZDA se nadaljuje

37 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 24 nadaljevanje Kemikalija Karbol fuksin Kloramfenikol Kongo rdeče L-arabinoza L-lizin L-sorboza Melibioza Mio-inozitol Na acetat NaCl Rafinoza Ribitol Sorbitol Sukcinat D-galaktoza D-manitol Glukoza KH 2 PO 4 L-ramnoza Metilensko barvilo Na-EDTA Saharoza Tris baza HCl Kloroform Etanol 96 % (EtOH) Glicerol Sladni ekstrakt dntp Potato dextrose agar Agaroza Maltoza Škrob Proizvajalec Sigma Chemical C., St. Luis, Mo., ZDA Kemika, Zagreb, Hrvaška Chemo d. d., Ljubljana, Slovenija Applied Biosystems, California, ZDA Carl Roth Gmbh+Co Difco laboratories, Detroit, Michigan, ZDA Beton, Dickinson and Company, Sparks, MD Nitrat (KNO 3) YCB Zorka Šabac YNB YE (kvasni ekstrakt) Biolife Italiana S.r.l. Pektinski citrat / Kisli alkohol (HCl + EtOH) /

38 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov Laboratorijska oprema Preglednica 4: Seznam laboratorijske opreme. Naziv Oznaka modela Proizvajalec Aparatura za PCR Eppendorf, Nemčija Avtoklav A-63C Kambič, Slovenija Avtomatske pipete Eppendorf, Nemčija Digestorij Variolab Molibien W90 Waldner, Nemčija Digitalna kamera DP12 Olympus, Japonska Električni transformator za elektroforezo Consort E143 Sigma-Aldrich, ZDA Elektroforezna banjica E33 Hoefer, ZDA Filtri s premerom por 0,22 μm Millex Millipore Corporate Headquarters, ZDA Hladilnik 4 C Elektronik Gorenje, Slovenija Homogenizator Inkubator 30 C Retsch, Nemčija Sutjeska, Jugoslavija Laminarij IBK 1V2 Iskra, Slovenija Ledomat Elektra-Bema, Slovenija Magnetno mešalo Rotamix 550MMH Tehtnica, Slovenija Mikroskop Olympus BX51 Olympus, Japonska Mikrovalovna pečica Gorenje, Slovenija ph meter Metrom 713 Železniki, Slovenija Plinski gorilnik (Bunsenov) TLOS, Hrvaška Stereomikroskop Steri SV11 z virom svetlobe KL1500 LCD Zeiss, Nemčija Tehtnice ET-1111 Tehtnica, Slovenija Transluminator Vodna kopel Vrtinčasto mešalo (vortex) Zamrzovalnik (-20 C) Zamrzovalnik (-80 C) Syngene, Velika Britanija Pharmacia Biotech, Švedska Železniki, Slovenija Lieberr, Nemčija Semilab, Nemčija 3.2 METODE Vzorčenje Pred vzorčenjem smo določili seznam možnih nahajališč kvasovke S. cerevisiae, iz katerega smo izhajali pri zbiranju vzorcev in kasnejšemu grupiranju vzorcev. Upoštevali smo nahajališča, iz katerih je bila kvasovka Saccharomyces cerevisiae že izolirana, in druga možna nahajališča. Seznam je predstavljen v preglednici 5. Kraj in čas vzorčenja je bil poljuben in vnaprej nedoločen. Vzorčenje se je začelo v začetku oktobra 2008 in je trajalo do konca februarja 2010 v posameznih večjih sklopih, glede na sezonsko možnost nabiranja vzorcev. Kraji vzorčenja so bili različni. Večino vzorcev smo nabrali v Sloveniji, nekaj vzorcev je bilo tudi iz ZDA (3 vzorci tal iz vulkanskih predelov; Salt Lake), 10 vzorcev tal iz Nemčije (Mönchengladbach), vzorec

39 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 26 olivnega olja iz Dugega otoka in vzorec rdeče murve iz Pule. Vzorci so bili večinoma iz Jesenic in okolice, Bistrice ob Sotli, Brega pri Žirovnici, Apač, Mrzlega vrha nad Idrijo, Ljubljane, Mozirja, Portoroža, Sečovelj, Blejskega Vintgarja, doline Triglavske Bistrice, Visoč, Tržiča, Pirana in Vojskega pri Idriji. Podrobnejši opisi nahajališč vzorcev so opisani v prilogi (priloga A in B). Preglednica 5: Seznam možnih nahajališč oz. vzorčenih substratov za uspevanje kvasovke S. cerevisiae. brezalkoholne gazirane pijače buče za kuhanje (razpoke, semena, stiskalnica za olje) citrusi cvetovi z veliko nektarja čebelji panji deževniki domači kis domači siri in mlečni izdelki gnilo sadje in zelenjava gobe, lišaji gozdna stelja (listni drobir) hrošči, ki vrtajo v les (črevo) hrošči, ličinke industrijska okolja voda iztrebki plazilcev jabolčna čežana jagodičevje kaktusi kislo zelje kompost lubje med morska voda (pristaniška, umazana) odpadna voda ribje pridelovalne industrije olivno olje onesnažena tla razgrajen les silaža sladka voda sladki plodovi, smolni vršički, smola sladkorni trs slana voda iz solin nižje slanosti slive sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo šampanjec tla (zemlja) pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje tla (zemlja) pod zelenjavo vabe DG18 v ribogojnici in soline vinogradi (tla, zamaški, sodi, stiskalnice, mošt) voda iz ribogojnic vzorci rib z nafto/asfaltom kontaminirana tla zemlja, kjer raste sladkorna pesa žuželke (vinske mušice) Tekoče vzorce smo odvzeli v sterilne posodice (npr. vzorec sirotke, mošta, sveže stisnjenega soka pred pasterizacijo, vodne usedline, slivove brozge, kisa ). Večje količine tekočin smo shranjevali v 1,5-litrske PVC-plastenke (npr. odpadne vode za filtracijo). Trdne vzorce, kot so zemlja, gnilobe, sir, vinske mušice, silaža, jabolka iz kisa, itd., smo shranili v PVC-vrečke za shranjevanje živil. Brise gob, lista limone in površine kože brancina smo vzorčili s sterilnimi vatenkami, ki smo jih po odvzemu brisov shranili v plastičnih epruvetah. Vzorce smo nanesli v selekcijska gojišča takoj, oz. po največ 14 dneh. V slednjem primeru smo vzorce shranili na 4 C. Vsakemu vzorcu smo dodali oznako B in zaporedno številko (npr. B45). Če smo iz enega vzorca odvzeli več izolatov smo to označili z hierarhijo zaporednih črk tik za številko (npr. B45A).

40 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov Izolacija kvasovk iz nabranih vzorcev Priprava vzorcev in anaerobno gojenje v tekočem gojišču Vzorce smo namestili v tekoča gojišča z 10 % etanola kot selekcijskim faktorjem (YM + 10% EtOH s kloramfenikolom). V primeru tekočih vzorcev smo dodali po 1000 µl vzorca v 10 ml gojišča, v primeru trdnih vzorcev pa cca. 1 žličko vzorca. Če smo vzorčili brise, smo inkubirali v gojišču odrezan konec vatenke, če pa smo vzorce koncentrirali s filtracijo, pa smo v tekoče gojišče dali kar filter papir z oborino, ki se je na njem ulovila. Vse epruvete smo označili z dodeljenimi oznakami in jih inkubirali v anaerobnih loncih, v katerih smo vzpostavili naslednjo atmosfero: N 2 80 %, CO 2 10 % in H 2 10 %. V lonec smo dodali paladijev katalizator ter lonec inkubirali pri 30 C teden dni Aerobno gojenje na trdem gojišču Po tednu dni inkubacije smo aseptično iz vsake epruvete odvzeli po 100 µl gojišča z usedlino. V tekočem gojišču je bila rast kvasovk opazna kot motnost. Odvzeti vzorec smo nacepili na petrijevke z osnovnim gojiščem MEA z antibiotikom kloramfenikolom. Petrijevke smo inkubirali aerobno en teden pri 30 C Izbira in redčenje kulture do posameznih kolonij Po inkubaciji smo pregledali rast mešanih kultur na osnovnih gojiščih. Na njem so se razrasle različne kolonije, včasih je bilo gojišče popolnoma preraslo, na nekaterih gojiščih pa kvasovke niso rasle. Slednja gojišča smo inkubirali dodatnih sedem dni na 30 C, po tem času pa smo jih zavrgli. Glede na morfologijo kolonij smo določili, katere kolonije bomo izolirali. Izbrali smo tiste kolonije, ki so bile bele do krem barve, po obliki okrogle, robovi kolonij pa so bili gladki. Površina kolonije naj bi bila gladka, profil kolonije nekoliko izbokel in njen ustroj mazave. Ustrezne kolonije smo izolirali z nanosom do posameznih kolonij na gojišče MEA s kloramfenikolom. Kjer je bilo gojišče popolnoma preraščeno, smo vzorec cepili do posameznih kolonij in iz njih izolirali čiste kulture. Izolate smo ustrezno označili tako, da smo za oznako vzorca dodali podčrtaj in veliko tiskano črko (npr. B45_A). Če je bilo na gojišču prisotnih več kolonij, smo jim določili določeno hierarhijo oznak (npr. B45_A, B45_B, itd.). Zopet smo petrijevke zalepili s parafilmom, jih narobe obrnili in inkubirali en teden pri 30 C. Postopek cepljenja do posameznih kolonij smo ponavljali toliko časa, dokler nismo dobili povsem čiste kulture Shranjevanje Posamezno čisto kolonijo smo sterilno prenesli iz osnovnega gojišča na poševnike z osnovnim gojiščem MEA, ki smo jih zaprli z vatenim zamaškom in jih zaščitili s cigaretnimi papirčki. Poševnike z rastočimi kulturami smo shranjevali v hladilniku pri 4 C.

41 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov Določevanje fenotipskih lastnosti Morfologija kolonij S pomočjo stereomikroskopa in s prostim očesom smo opazovali barvo in obliko kolonij, rob, površino in profil kolonij (glej poglavje Izbira in redčenje kulture do posameznih kolonij) Morfologija kvasnih celic Za opazovanje morfologije celic smo pripravili mikroskopske preparate, ki smo jih pripravili v 60 % mlečni kislini. Pokrili smo jih s krovnim steklom in opazovali obliko celic s svetlobnim mikroskopom Olympus BX-51 in jih fotografirali z digitalno kamero Olympus DP Morfologija askospor Acidorezistentno barvanje (barvanje po Zehl-Neelsenu) je diferencialno barvanje za ugotavljanje prisotnosti askospor. Acetatna gojišča smo pripravili v malih epruvetah z zamaškom (glej poglavje Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae). Na gojišče smo sterilno nacepili s cepilno zanko čisto kulturo. Inkubirali smo na 30 C en teden. Po inkubaciji smo barvali askospore po postopku acidorezistentnega barvanja. Kvasovke smo razmazali po površini objektnega stekla, na katero smo prej kapnili fiziološko raztopino. Objektno steklo smo trikrat potegnili čez plamen, da smo celice fiksirali. Na objektnik smo kapnili karbol fuksin in ga pustili delovati 5 minut. Barvilo smo nato odlili in ga nato sprali s 70 % etanolom. Razbarvali smo s kislim alkoholom in sprali z destilirano vodo. Nato smo na objektnik kapnili metilensko barvilo in ga pustili delovati 3 minute. Preparat smo sprali z vodo in ga pustili, da se posuši. Te preparate smo pogledali s svetlobnim mikroskopom Olympus BX-51 in jih fotografirali z digitalno kamero Olympus DP-12. Askospore se pri tem obarvajo rdeče-roza, stene askov in vegetativne celice pa modro Določevanje genotipskih lastnosti Izolacija genomske DNA Izolacija genomske DNA z izolacijskim kitom Prepman Ultra V sterilne mikrocentrifugirke (2 ml) smo sterilno odpipetirali 100 µl reagentnega kita za izolacijo DNA Prepman Ultra. Sveže kolonije smo zajeli s cepilno zanko in jih dodali kitu za izolacijo. Nato smo tretirali vzorce v mikrocentrifugirkah v vroči kopeli (100 C) 10 minut. Vzorce smo po 10 minutah pobrali iz kopeli in jih ohlajali 2 minuti. Nato smo jih centrifugirali pri rpm (obratih na minuto) oz g 2 minuti. Supernatant z DNA smo odpipetirali v sveže mikrocentrifugirke, ki smo jih shranili v zamrzovalnik pri - 20 C Ekstrakcija DNA z mehansko lizo Ekstrakcija DNA z mehansko lizo se uporablja za izolacijo DNA-gliv, predvsem tistih s tršo celično steno. Ta postopek smo uporabili samo enkrat, in sicer za vzorce, pri katerih ni bilo mogoče izolirati DNA z izolacijskim kitom Prepman Ultra.

42 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 29 V mikrocentrifugirko (2 ml) z oglatim dnom s silikagelno mešanico in kovinsko kroglico odpipetiramo 300 µl CTAB pufra. S sterilno spatulo smo prenesli v CTAB pufer 1 večjo cepilno zanko čiste kulture kvasovk iz shranjenih poševnikov (glej poglavje Shranjevanje). Material smo strli s homogenizatorjem do homogenata 1 minuto. Nato smo odpipetirali dodatnih 200 µl CTAB pufra in premešali na mešalu. Inkubirali smo 30 minut v vodni kopeli pri 65 C. Nato smo mikrocentrifugirki dodali v digesoriju 500 µl kloroforma in premešali na mešalu za 1 2 sekundi. Mešanico v mikrocentrifugirki smo centrifugirali še 5 minut pri rpm ( g). Zgornjo vodno fazo smo odpipetirali v novo sterilno mikrocentrifugirko, preostanek pa zavrgli v odlagalnik. Odpipetiranemu delu smo dodali 800 µl 96 % etanola predhodno ohlajenega na -20 C. Nato smo previdno ročno premešali raztopino in jo inkubirali v mikrocentrifugirkah pri temperaturi -20 C preko noči. Naslednji dan smo mikrocentrifugirke centrifugirali 5 minut pri rpm ( g). Previdno smo odpipetirali supernatant in sprali preostali pelet s 500 µl 70 % etanola, ohlajenim na -20 C. Sledilo je centrifugiranje 5 minut pri rpm ( g) in pazljivo odpipetiranje etanola, ne da bi se dotaknili peleta. Pelet smo nato osušili na zraku do suhega in ga resuspendirali v 49 µl TE pufru in dodali 1 µl RNAze. Mikrocentrifugirko smo inkubirali 5 30 minut v topli sobi pri 37 C. Postopek priprave vseh reagentov je opisan v poglavju Raztopine, pufri in zmesi Verižna reakcija s polimerazo (PCR) Polimerazna verižna reakcija (PCR) temelji na pomnoževanju določenih delov rdna s pomočjo specifičnih začetnih oligonukleotidov. Za pomnoževanje ITS rdna regije smo uporabili oligonukleotidna začetnika ITS4 in ITS5. Pomnožek pa vključuje 5,8S rdna in dva vmesna distančnika ITS1 in ITS2 skupno ITS rdna (McCullough, 1998). PCR-mešanico smo pripravljali v mikrocentrifugirki (1,5 ml) v določenih količinskih razmerjih, opisanih v preglednici 6. Mešanico smo pripravljali na ledu in jo aseptično odpipetirali v mikrocentrifugirka za PCR. PCR-vzorec za negativno kontrolo je predstavljala mešanica brez DNA. Preglednica 6: PCR-mešanica za en vzorec. Reagent Koncentracija Količina (µl) Bidestilirana H 2 O 26,32 MgCl 2 25 mm 0,5 10 pufer Dream Taq brez MgCl2 3,5 dntp (AB) nukleotidi 10 mm 0,7 Oligonukleotidni začetek 1 (ITS4) 10 pmol/μl 1,4 Oligonukleotidni začetek 2 (ITS5) 10 pmol/μl 1,4 Dream Taq polimeraza 5 U/μl 0,18 Izolirana DNA 1 Program za pomnožitev ITS rdna regije z verižno reakcijo s polimerazo je opisan v preglednici 7. Po končani reakciji smo prisotnost pomnožkov preverili z gelsko elektroforezo.

43 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 30 Preglednica 7: PCR-program. Proces Temperatura Interval Št. ciklov začetna denaturacija 94 C 1 minuta 1 denaturacija 94 C 35 sekund vezava začetnih oligonukleotidov 55 C 53 sekund podaljševanje verige DNA 72 C 30 sekund končno podaljševanje verige DNA 72 C 10 minut 1 zaključek 4 C Gelska elektroforeza Za preizkus uspešnosti pomnožitve smo uporabili 1 % agarozni gel z 1 TAE pufrom. V gel smo dodali barvilo, ki obarva DNA produkte»syber green«ter gel nalili v nosilec za strjevanje gela. Gel smo vstavili v elektroforetsko banjico v 1 TAE pufer. V prvo vdolbinico na gelu smo odpipetirali 2 µl DNA-lestvico (Gene ruler 100 bp DNA), v naslednje vdolbinice pa po 5µl vzorcev (1,5 µl nanašalnega pufra in 4 µl PCR produkta). Elektroforeza je potekala pri 100 V. Po končani elektroforezi smo gel pogledali v transiluminatorju G-box, ga fotografirali in obdelali z računalniškim programom Gene snap Določanje in obdelava nukleotidnega zaporedja Nukleotidna zaporedja (sekvence) so določili v podjetju Macrogen (Seul, Koreja). Pridobljena nukleotidna zaporedja smo poiskali in pregledali z najbolj sorodnimi in jih na ta način določili preko zaporedij v bazi podatkov NCBI ( v bazi GeneBank na spletu s funkcijo BLAST Shranjevanje izoliranih kvasovk Izolirane in identificirane kvasovke smo shranili v zbirki ekstremofilnih mikroorganizmov EX na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete. Sveže kulture smo shranili v zamrzovalniku na -80 C s sistemom MicroBank. Večjo količino čiste kolonije kvasovk smo s cepilno zanko prenesli na kroglice mikrocentrifugirke MicroBank, pretresli, odpipetirali tekočino in shranili na ustrezno mesto v zamrzovalnik Asimilacijske, fermentacijske in encimske lastnosti Pri kvasovkah identificiranih kot Saccharomyces cerevisiae smo preverjali določena odstopanja znotraj različnih sevov na podlagi asimilacijskih, fermentacijskih in encimskih lastnosti Asimilacijske lastnosti Za preverjanje asimilacijskih lastnosti smo pripravili ustrezna gojišča (glej poglavje Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae) za preverjanje asimilacije na dušik in ogljik. Iz posameznega seva kvasovke Saccharomyces cerevisiae smo pripravili suspenzijo celic v destilirani vodi v mikrocentrifugirkah (1,5 ml). V obliki kapljic smo jih nanesli na

44 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. 31 različna ustrezna gojišča. Ta gojišča smo zalepili s parafilmom in jih inkubirali 21 dni pri 30 C. Po 7., 14. in 21. dnevu smo pregledovali rast na ploščah v primerjavi z negativno kontrolo osnovnega gojišča YCB oz. YNB za asimilacijo dušika oz. ogljika. Končne rezultate smo podali po 21 dneh inkubacije Fermentacijske lastnosti Pri kvasovkah identificiranih kot Saccharomyces cerevisiae smo preverjali fermentacijske sposobnosti (poglavje Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae). Pripravili smo suspenzijo celic 20 sevov Saccharomyces cerevisiae v destilirani vodi (cca. polovica cepilne zanke v 0,5 ml). Osnovnemu gojišču smo dodali sterilno s pipeto 50 µl suspenzije in inkubirali na 30 C 2 3 tedne. Posamezne vmesne rezultate smo si večkrat zapisovali. Pozitivna reakcija je bila, če se je gojišče zakisalo (obarvalo rumeno) in se je sproščal CO 2 (nastanek mehurčka v durhamovi cevki) Encimske lastnosti Preverjali smo pektinsko in celulolitično aktivnost sevov Saccharomyces cerevisiae. Pripravili smo ustrezna gojišča po postopku opisanem v poglavju Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae. Iz posameznih sevov S. cerevisiae smo pripravili suspenzijo v mikrocentrifugirkah (1,5 ml) in suspenzije po kapljicah nanašali na ustrezna gojišča. Plošče z gojišči smo inkubirali teden dni na 30 C. Pozitivna reakcija pri pektinazni aktivnosti je bila opazna po dodatku 1 % CTAB, in sicer kot cona zbistritve okoli kolonij. Pri celulolitični aktivnosti smo seve cepili na enak način kot pri pektinazni aktivnosti, gojišča pa smo prelili z 0,03 % kongo rdečim in inkubirali 15 minut. Reagent smo nato odlili in sprali z 1 M NaCl. V tem primeru je bila pozitivna reakcija vidna kot intenzivno svetlo rumen obroč okoli kolonij Temperaturni testi Za različne seve kvasovke Saccharomyces cerevisiae smo preverjali rast pri različnih temperaturah. Iz posameznih sevov kvasovke smo pripravili suspenzijo z destilirano vodo v mikrocentrifugirkah (1,5 ml) in jo nanesli na osnovno YNB gojišče z glukozo. Plošče smo zlepili s parafilmom in jih inkubirali pri 10 C, 20 C, 25 C, 30 C in 37 C. Rezultate smo preverjali vsak teden, tri tedne zaporedoma Parjenje haploidnih sevov Saccharomyces cerevisiae Izbrali smo seve S. cerevisiae, ki po rasti na acetatnem agarju niso tvorili askospor. S kombinacijami teh različnih sevov S. cerevisiae smo želeli ugotoviti, če so kompatibilni paritveni tipi oz. ali tvorijo askospore. Pripravili smo gojišče, opisano v poglavju in nanesli določene kombinacije sevov na gojišča. Petrijevke smo zalepili s parafilmom in jih inkubirali samo 7 dni pri 30 C. Po tednu dni smo celice barvali po postopku acidorezistentnega barvanja (glej poglavje Morfologija askospor) in jih pregledali s svetlobnim mikroskopom Olympus BX-51 ter jih fotografirali z digitalno kamero Olympus DP-12.

45 32 4 REZULTATI 4.1 OPIS VZORCEV Vseh 273 vzorcev smo združili v 27 skupin (glej Preglednico 8). Iz 273 vzorcev smo osamili 122 kvasnih kultur (izolatov). Način selektivne izolacije, ki smo ga uporabili (10 % EtOH in anaerobna inkubacija) je selekcioniral kvasovke. Filamementozne glive smo zasledili samo pri 6 % izolatov. Največ vzorcev smo zajeli iz naslednjih skupin: gobe in lišaji (14 %), vinogradniški vzorci (10 %), vzorci rib (10 %) in vode industrijskih okolij (8 %) (glej sliko 4). Vsaka skupina vzorcev, iz katere smo izolirali vsaj en sev kvasovk, bo predstavljena po poglavjih v nadaljevanju. Vsi vzorci z vsemi kvasnimi izolati in nahajališči vzorcev so opisani v prilogi (priloga A). Preglednica 8: Pregled skupin vzorcev glede na izvor in število vzorcev, število vseh kvasnih izolatov in izolatov kvasovke S. cerevisiae kot delež med vsemi kvasnimi izolati. Skupina vzorcev brezalkoholne gazirane pijače buče za kuhanje (razpoke, semena, stiskalnica za olje) Izvor vzorca Mrzli vrh nad Idrijo, Ljubljana (SI) Št. vzorcev Št. kvasnih izolatov 2 1 Apače (SI) 1 0 citrusi Jesenice (SI) 6 1 domači kis Breg pri Žirovnici, Mozirje, Jesenice (SI) Št. izolatov S. cerevisiae (%) (20 %) gnilo sadje in zelenjava Breg pri Žirovnici (SI) (33 %) gobe, lišaji gozdna stelja (listni drobir) jagodičevje Blejski Vintgar, dolina Triglavske Bistrice, Vojsko pri Idriji (SI) Jesenice, dolina Triglavske Bistrice (SI) Breg pri Žirovnici, Jesenice (SI) kislo zelje Breg pri Žirovnici (SI) 5 0 med Breg pri Žirovnici (SI) 1 0 mlečni izdelki Breg pri Žirovnici, Visoče, Jesenice (SI) morska voda v pristanišču Portorož (SI) 1 0 olivno olje Dugi otok (HR) 1 0 onesnažena tla Jesenice (SI) 5 0 razgrajen les sladki plodovi (npr. slive) Jesenice, dolina Triglavske Bistrice, Breg pri Žirovnici (SI) Breg pri Žirovnici (SI), Pula (HR) (27 %) (8 %) (100 %) silaža Breg pri Žirovnici (SI) (14 %) slana voda iz solin nižje slanosti Sečovlje (SI) 10 0 se nadaljuje

46 nadaljevanje Skupina vzorcev smolni vršički, smola, lubje sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo tla pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje Izvor vzorca Breg pri Žirovnici, Jesenice (SI) Št. vzorcev Št. kvasnih izolatov Št. izolatov S. cerevisiae (%) Breg pri Žirovnici (SI) (50 %) Breg pri Žirovnici, Bistrica ob Sotli (SI) tla, kjer raste sladkorna pesa Mönchengladbach (D) 10 0 vinogradniški vzorci (tla, zamaški, sodi, stiskalnice za grozdje, mošt) Bistrica ob Sotli, Breg pri Žirovnici, Jesenice (SI) (29 %) (56 %) voda iz industrijskih okolij Jesenice, Tržič (SI) (50 %) vzorci rib Piran (SI) 26 0 z nafto/asfaltom kontaminirana tla žuželke (vinske mušice) Jesenice (SI), Salt Lake (ZDA) Jesenice, Breg pri Žirovnici (SI) (100 %) SKUPAJ (36 %) Vse odvzete vzorce smo inkubirali v tekočem selekcijskem gojišču v anaerobni atmosferi (glej poglavje Izolacija kvasovk iz nabranih vzorcev), jih nanesli na gojišče MEA+Ch in kvasovke izolirali do čistih kultur. Kvasovke smo z uporabo selektivne izolacijske tehnike izolirali iz 45 % vzorcev. Primeri nekaterih osnovnih izolacijskih gojišč so prikazani na sliki 5. Kolonije, ki so bile morfološko podobne kvasovki S. cerevisiae (barva, oblika kolonije), smo nacepili do čistih kultur in izolate molekularno identificirali na podlagi ITS zaporedja. Največ (tretjina) sevov je po identifikaciji pripadalo iskani kvasovki S. cerevisiae (36 %) (glej Preglednico 8). Identifikacija izolatov je opisana v naslednjem poglavju.

47 34 sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo (2,6%) smolni vršički, smola, lubje (2,9%) jagodičevje (2,9%) domači kis (3,3%) citrusi (2,2%) gobe, lišaji (13,9%) vinogradniški vzorci (10,3%) tla, kjer raste sladkorna pesa (3,7%) slana voda iz solin nižje slanosti (3,7%) vzorci rib (9,5%) tla pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje (4,0%) silaža (4,0%) mlečni izdelki (5,1%) gnilo sadje in zelenjava (5,5%) razgrajen les (6,2%) voda iz industrijskih okolij (8,4%) gobe, lišaji (13,9%) vinogradniški vzorci (10,3%) vzorci rib (9,5%) voda iz industrijskih okolij (8,4%) razgrajen les (6,2%) gnilo sadje in zelenjava (5,5%) mlečni izdelki (5,1%) silaža (4,0%) tla pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje (4,0%) slana voda iz solin nižje slanosti (3,7%) tla, kjer raste sladkorna pesa (3,7%) domači kis (3,3%) jagodičevje (2,9%) smolni vršički, smola, lubje (2,9%) sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo (2,6%) citrusi (2,2%) gozdna stelja (1,8%) kisanje zelja (1,8%) onesnažena tla (1,8%) žuželke (vinske mušice) (1,8%) z nafto/asfaltom kontaminirana tla (1,5%) brezalkoholne gazirane pijače (1 %) sladki plodovi (npr. slive) (0,7%) buče za kuhanje (0,4%) med (0,4%) morska voda v pristanišču (0,4%) olivno olje (0,4%) Slika 4: Zastopanost posamezne skupine vzorcev glede na število vseh vzorcev (N = 273).

48 35 Slika 5: Osnovne izolacijske plošče gojišča MEA s kloramfenikolom. A, B, C: vinogradniški vzorci (tla, zamaški, sodi, stiskalnice, mošt), D, F: vzorci sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov, E: vzorci domačih sirov in mlečnih izdelkov

49 4.1.1 Izolacija kvasovk glede na skupine vzorcev Izolati vseh kvasovk so predstavljeni v preglednici 9 po skupinah vzorcev. Izolacije, pri katerih smo izolirali kvasovke, so po skupinah prikazane na sliki 6 skupaj s številom sevov kvasovke S. cerevisiae. Preglednica 9: Opis vzorcev po skupinah glede na kraj, število vseh odvzetih vzorcev in število pozitivnih izolatov na kvasovke. Skupina vzorcev brezalkoholne gazirane pijače Opis vzorcev (kvasni izolati v oklepaju) Kraj odvzema vzorca 36 Št. Št. kvasnih vzorcev izolatov - kombuča (EXF-4926) Ljubljana 2 1 citrusi - sok limone (EXF-6210) Jesenice 6 1 domači kis gnilo sadje in zelenjava gobe, lišaji gozdna stelja (listni drobir) jagodičevje mlečni izdelki razgrajen les silaža sladki plodovi (npr. slive) sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo - goba za kisanje jabolčnega kisa (EXF-4923), - jabolčni kis (EXF-5296), - jabolčni mošt (EXF-4927), - jabolka iz jabolčnega kisa (EXF-6305), - usedlina jabolčnega kisa (EXF-6307) - gnile rumene kolerabe (EXF-5733), - gnila breskev (EXF-6215), - gnil stročji fižol (EXF-6216) - neidentificirane drevesne gobe (EXF-6222), - bris površine gobe Pseudohydnum gelatinosum (EXF-6262, EXF-6263) - mešani listni drobir (EXF-6212, EXF-6303) - maline (EXF-6208, EXF-6209, EXF-5732, EXF- 6211) - kefir (EXF-5288, EXF-5289, EXF-5295, EXF-6230, EXF-6233), - voda kislega mleka (EXF-4924), - sirotka (EXF-6231), - ovčji sir (EXF-6232), - kajmak (EXF-6237, EXF-6238, EXF-6239), - kravji sir z orehi (EXF-6240), - kravji sir (EXF-5871, EXF-6241, EXF-5872), - trhel les (EXF-6300, EXF-6301, EXF-6302, EXF- 5868, EXF-5869, EXF-6220, EXF-6264, EXF-6221, EXF-6242), - staro žaganje (EXF-6304, EXF-6223, EXF-6224) - koruzna silaža (EXF-5284, EXF-6225, EXF-6226, EXF-6227, EXF-6228), - del koruznega storža (EXF-6229, EXF-6306) - slive (EXF-5287) - jagodni sok (EXF-5290, EXF-5291, EXF-5292), - hruškov sok (EXF-5297, EXF-4925), - jabolčni sok (EXF-5293) Breg pri Žirovnici Breg pri Žirovnici Blejski Vintgar, Vojsko Jesenice, dolina Triglavske Bistrice Jesenice 8 4 Breg pri Žirovnici, Visoče, Jesenice Jesenice, dolina Triglavske Bistrice Breg pri Žirovnici Breg pri Žirovnici Breg pri Žirovnici se nadaljuje

50 nadaljevanje Skupina vzorcev vinogradniški vzorci (tla, zamaški, sodi, stiskalnice, mošt) voda industrijskih okolij tla pod sadnimi drevesi, sadjem zelenjavo žuželke (vinske mušice) Opis vzorcev (kvasni izolati v oklepaju) - mošt (EXF-5272, EXF-4909, EXF-4911), - vinski kamen (EXF-5273, EXF-4913, EXF-4915), - tla, kamor se steka vino (EXF-4912, EXF-5274), - grozdni peclji (EXF-5275, EXF-5277, EXF-4917, EXF-5278, EXF-4919, EXF-4922) - tropine (EXF-4914, EXF-5276, EXF-5280, EXF-6235, EXF-6236), - koruzni liček kot čep na sodu (EXF-4916, EXF-4918, EXF-5279, EXF-5282, EXF-4921), - grozdje (EXF-4920), - mlado vino (EXF-5294), - leseni sod za vino (EXF-6217) - usedline odpadne vode iz skal (EXF-6218, EXF-6219, EXF-5870), - odplake iz avtopralnice (EXF-6243, EXF-6252, EXF- 6253, EXF-6254, EXF-6255), - onesnažena voda potokov (EXF-6244, EXF-6245, EXF-6308, EXF-6309, EXF-6246, EXF-6247, EXF- 6248, EXF-6249, EXF-6250, EXF-6251, EXF-5874, EXF-6261, EXF-5875), - odpadne vode pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke (EXF-5873, EXF-6256, EXF-6257, EXF-6258, EXF-6259) - tla pod jabolkom (EXF-5283, EXF-6214), - tla pod grozdjem (EXF-5285, EXF-5286), - tla pod paradižnikom (EXF-6213), - tla pod breskvijo (EXF-5735) - tla, kjer je ležalo grozdje (EXF-5281) Kraj odvzema vzorca Bistrica ob Sotli Jesenice, Tržič Breg pri Žirovnici, Bistrica ob Sotli Št. vzorcev 37 Št. kvasih izolatov vinske mušice z ličinkami (EXF-5734, EXF-6234) Jesenice 5 2 SKUPAJ

51 38 vinogradniški vzorci voda industrijskih okolij mlečni izdelki 4 11 sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterilizacijo 3 3 žuželke (vinske mušice) tla (zemlja) pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo sladki plodovi (npr. slive) silaža razgrajen les 1 11 gnilo sadje in zelenjava 1 2 domači kis 1 4 jagodičevje 4 gozdna stelja (listni drobir) 2 gobe, lišaji 3 citrusi brezalkoholne gazirane pijače št. izolatov kvasovk izolati sevov vrste S. cerevisiae izolati drugih vrst kvasovk Slika 6: Število vseh kvasnih izolatov (N = 122) razporejeno na izolate sevov vrste S. cerevisiae (N = 44) in na izolate drugih kvasovk (N = 78) po skupinah vzorcev. Zastopanost posameznih vrst kvasovk, ki so se pojavljale med izolati, je prikazana na sliki 7. Prevladuje iskana kvasovka S. cerevisiae, ostale vrste pa so zastopane v manjšini. Ostale izolate smo identificirali kot vrste Candida albicans, C. ethanolica, C. glabrata, C. paludigena, C. tropicalis, C. zemplinina, C. zeylanoides, Clavispora lusitaniae, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia orientalis, Kazachstania unispora, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Metschnikowia aff. fructicola, Metschnikowia pulcherrima, Pichia guilliermondii, Pichia membranifaciens, Pichia sporocuriosa, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces paradoxus, Saccharomycodes ludwigii, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces bailii in nekaj izolatov kot rod Candida ter razred Saccharomycetes.

52 39 Candida albicans Candida ethanolica Candida glabrata Candida paludigena Candida sp. Candida tropicalis Candida zemplinina Candida zeylanoides Clavispora lusitaniae Dekkera bruxellensis Hanseniaspora uvarum Issatchenkia orientalis Kazachstania unispora Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus Metschnikowia aff. fructicola Metschnikowia pulcherrima neidentificirano Pichia guilliermondii Pichia membranifaciens Pichia sporocuriosa Rhodotorula mucilaginosa Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces paradoxus Saccharomycetes Saccharomycodes ludwigii Torulaspora delbrueckii Wickerhamomyces anomalus Yarrowia lipolytica Zygosaccharomyces bailii 0,8% 0,8% 0,8% 3,3% 0,8% 1,6% 1,6% 1,6% 0,8% 4,9% 3,3% 5,7% 0,8% 3,3% 3,3% 0,8% 0,8% 7,4% 0,8% 0,8% 1,6% 4,1% 36,1% 2,5% 3,3% 0,8% 1,6% 0,8% 0,8% 4,1% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% Odstotek zastopanosti kvasnih izolatov Slika 7: Zastopanost posameznih vrst kvasovk med izolati (N = 122). Z rdečo barvo je označen stolpec zastopanosti izolatov kvasovke S. cerevisiae Brezalkoholne gazirane pijače To skupino predstavljata vzorca gaziranih pijač Cocta in kombuča. Iz slednje smo izolirali in identificirali kvasovko Candida ethanolica (EXF-4926) Citrusi Vzorce iz te skupine so predstavljale neškropljene rastline, in sicer: listi limone, sladki izločki lista limone, sok limone, olupki limone, sredica limone. Od vseh vzorcev smo kvasovke izolirali iz soka iztisnjene limone ter izolat identificirali kot Issatchenkia orientalis (EXF-6210).

53 Domači kis Nabrali smo skupno 9 vzorcev jabolčnega in vinskega kisa ter še druge vzorce, ki so bili povezani s pripravo kisa:»gobe«za kisanje, jabolka oz. grozdje pri kisanju, usedline in mošt. Iz vseh vzorcev smo pridobili 5 izolatov, ki smo jih uvrstili v vrste: Saccharomyces cerevisiae (EXF-5296 vzorec iz jabolčnega kisa), Saccharomycodes ludwigii (EXF-4927 vzorec iz jabolčnega mošta) in Zygosaccharomyces bailii (EXF-4923 vzorec iz»gobe«za pripravo jabolčnega kisa stare 2 leti). Dva izolata sta ostala neidentificirana: EXF-6305 (vzorec jabolka iz jabolčnega kisa) in EXF-6307 (vzorec iz usedlin jabolčnega kisa) Gnilo sadje in zelenjava Iz petnajstih vzorcev smo izolirali samo tri izolate kvasovk, ki smo jih uvrstili v dve različni vrsti: Issatchenkia orientalis (EXF-6215: iz gnile breskvine koščice; EXF-6216: iz gnilega stročjega fižola) in Saccharomyces cerevisiae (EXF-5733: iz gnile kolerabe). Ostali vzorci brez izolatov so bili nabrani iz breskev, brokolija, solate, jabolka, fižola, kumar in buč Gobe, lišaji V to skupino smo uvrstili vzorce brisov površine gob, ki so bili večinoma nabrani v pragozdu Vojsko pri Idriji. Seznam gob je opisan v prilogi B. Poleg teh smo v skupino uvrstili tudi neidentificirane lišaje in ostale gobe. Skupno število nabranih vzorcev je bilo 38, od teh smo identificirali tri izolate z dvema različnima vrstama: Saccharomyces paradoxus in Zygosaccharomyces bailii. Opis substratov z identifikacijami in oznakami sevov je prikazan v preglednici 10. Preglednica 10: Spisek kvasnih izolatov iz površin gob in lišajev. Identificirana vrsta EXF številka seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija Saccharomyces paradoxus EXF-6222 nedoločene drevesne gobe Zygosaccharomyces bailii EXF-6262 EXF-6263 navadna ledenka Pseudohydnum gelatinosum navadna ledenka Pseudohydnum gelatinosum 40 Blejski Vintgar Vojsko pri Idriji Vojsko pri Idriji Gozdna stelja (listni drobir) Kvasovke smo poskušali izolirati iz 5 različnih vzorcev različne stopnje razgradnje gozdnega materiala (listje, veje, iglice, humus). Iz vzorca mešanega listnega drobirja smo izolirali in identificirali kvasovko Issatchenkia orientalis (EXF-6212), en izolat (EXF- 6303) pa je ostal neidentificiran Jagodičevje To skupino predstavlja 8 vzorcev različnih vrst jagodičevja (maline, robide, jagode, ribez, kosmulje) in izdelkov iz jagodičevja. Izolirali in identificirali smo le 4 izolate: Issatchenkia orientalis (EXF-6209), Pichia sporocuriosa (EXF-6208 in EXF-6211), Saccharomyces paradoxus (EXF-5732).

54 Mlečni izdelki Vzorčili smo 14 različnih mlečnih izdelkov: domači kefir, kefirjeve gobice, kislo mleko, sirotko, različne vrste sirov (kozji, ovčji, kravji, z dodatki npr. orehi in sir v slanici), kajmak, feta sir. Iz teh vzorcev smo izolirali in identificirali 15 sevov, ki smo jih uvrstili v 6 različnih vrst in en rod. Zastopanost posamezne vrste kvasovk je prikazana na sliki 8. Izolirali smo naslednje vrste: Candida zeylanoides, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica in rod Candida. Izolati, identifikacije in natančen opis substratov so prikazni v preglednici % 7% 7% Saccharomyces cerevisiae 4 sevi 27% 13% 13% 27% Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces marxianus Candida zeylanoides Kluyveromyces lactis Candida sp. Dekkera bruxellensis Yarrowia lipolytica Slika 8: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz mlečnih izdelkov (N =15). Preglednica 11: Spisek kvasnih izolatov iz mlečnih izdelkov. Identificirana vrsta EXF številka seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija Candida sp. EXF-6241 kravji sir Visoče Candida zeylanoides EXF-6237 kajmak Jesenice EXF-6238 kajmak Jesenice Dekkera bruxellensis EXF-4924 voda kislega mleka Breg pri Žirovnici Kluyveromyces lactis EXF-6230 kefir Visoče EXF-6240 kravji sir z orehi Visoče EXF-6231 sirotka Visoče Kluyveromyces marxianus EXF-6232 ovčji sir v slanici Visoče EXF-6233 kefir Visoče EXF-5288 kefir Breg pri Žirovnici EXF-5289 kefir Breg pri Žirovnici Saccharomyces cerevisiae EXF-5295 kefirjeva gobica Breg pri Žirovnici EXF-5871 kravji sir Visoče EXF-5872 kravji sir Visoče Yarrowia lipolytica EXF-6239 kajmak Jesenice

55 Razgrajen les Ta skupina zajema 17 vzorcev razkrojenega lesa, npr. staro žaganje, trhel les. Šest kvasnih izolatov smo uvrstili v naslednje vrste: Candida paludigena, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae in dva izolata v razred Saccharomycetes. Štirje izolati (EXF- 6300, EXF-6301, EXF-6302, EXF-6304) so ostali neidentificirani (preglednica 12). Preglednica 12: Spisek kvasnih izolatov iz razgrajenega lesa. Identificirana vrsta Candida paludigena EXF števila seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija EXF-5868 trhel les dolina Triglavske Bistrice EXF-6220 trhel les dolina Triglavske Bistrice EXF-6264 trhel les dolina Triglavske Bistrice EXF-6221 trhel les dolina Triglavske Bistrice Kluyveromyces lactis EXF-6242 trhel les blizu onesnaženega potoka Jesenice neidentificirano EXF-6301 trhel les blizu onesnaženega potoka Jesenice EXF-6302 trhel les blizu onesnaženega potoka Jesenice EXF-6304 žaganje dolina Triglavske Bistrice EXF-6300 trhel les blizu onesnaženega potoka Jesenice Saccharomyces cerevisiae EXF-5869 trhel les dolina Triglavske Bistrice Saccharomycetes (razred) EXF-6223 žaganje dolina Triglavske Bistrice EXF-6224 žaganje dolina Triglavske Bistrice Silaža Nabrali smo 11 vzorcev silaže, ki so jih predstavljali različni deli koruze po različnih postopkih obdelave le-te do nastanka silaže. Izolirali smo 7 izolatov kvasovk, ki smo jih uvrstili v 6 različnih vrst kvasovk: Candida tropicalis (EXF-6225, EXF-6228), Kazachstania unispora (EXF-6227), Metschnikowia aff. fructicola (EXF-6229), Saccharomyces cerevisiae (EXF-5284) in Wickerhamomyces anomalus (EXF-6226). Izolat EXF-6306 je ostal neidentificiran (glej Preglednico 13). Preglednica 13: Spisek kvasnih izolatov iz silaže. Identificirana vrsta EXF število seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija Saccharomyces cerevisiae EXF-5284 koruzna silaža Breg pri Žirovnici Candida tropicalis EXF-6225 koruzna silaža Breg pri Žirovnici EXF-6228 koruzna silaža Breg pri Žirovnici Kazachstania unispora EXF-6227 koruzna silaža Breg pri Žirovnici Metschnikowia aff. fructicola EXF-6229 svež storž koruze spodnji del Breg pri Žirovnici neidentificirano EXF-6306 svež storž koruze spodnji del Breg pri Žirovnici Wickerhamomyces anomalus EXF-6226 koruzna silaža Breg pri Žirovnici Sladki sadeži To skupino predstavljata samo vzorca sadežev rdeče murve in sliv. Iz slednje smo izolirali in identificirali en sev kvasovke S. cerevisiae (EXF-5287).

56 Sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo Vzorčili smo sedem vzorcev nepasteriziranih sadnih sokov: jabolčni, hruškov, jagodni, bezgov in breskov. Izolate smo uvrstili v dve različne vrste: Saccharomyces cerevisiae (EXF-5297, EXF-4925, EXF-5293), Torulaspora delbrueckii (EXF-5291, EXF-5292) in en izolat v razred Saccharomycetes (EXF-5290) (preglednica 14). Preglednica 14: Spisek kvasnih izolatov iz sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov. Identificirane vrste Saccharomyces cerevisiae Saccharomycetes (razred) Torulaspora delbrueckii EXF številka seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija EXF-5297 hruške sok (tepke, moštarce) Breg pri Žirovnici EXF-4925 hruške sok (tepke, moštarce) Breg pri Žirovnici EXF-5293 jabolčni sok Breg pri Žirovnici EXF-5290 jagodni sok z dodatkom sladkorja Breg pri Žirovnici EXF-5291 jagodni sok z dodatkom sladkorja Breg pri Žirovnici EXF-5292 jagodni sok Breg pri Žirovnici Vinogradniški vzorci V to skupino smo uvrstili 28 vzorcev. Ta skupina vzorcev je zelo raznolika in predstavlja vzorce, ki so bili nabrani v vinogradu: deli grozdja (grozdne jagode, peclji) in tropine. Večina vzorcev je bila nabrana v zidanicah oz. v prostoru, kjer se stiska grozdje: stiskalnica za grozdje, tla, kamor se je scejalo vino ob stiskanju, čepi sodov, vinski kamen v sodih, različno star mošt in vino. Identificirali smo 7 različnih vrst: Clavispora lusitaniae, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii in en izolat razreda Saccharomycetes. Opisi vzorcev po posameznih vrstah za vsak sev so predstavljeni v preglednici 15, deleži vseh vrst pa so prikazani na sliki 9. 4% 4% 4% 4% 4% 7% Saccharomyces cerevisiae 15 sevov 55% 18% Saccharomyces cerevisiae Dekkera bruxellensis Zygosaccharomyces bailii Clavispora lusitaniae Kluyveromyces lactis Pichia membranifaciens Saccharomycetes Hanseniaspora uvarum Slika 9: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz vinogradniških vzorcev (N = 27).

57 Preglednica 15: Spisek kvasih izolatov iz vinogradniških vzorcev. Identificirane vrste EXF številka seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija Clavispora lusitaniae EXF-6217 leseni tramovi, podpora za sode Bistrica ob Sotli Dekkera bruxellensis EXF-4913 vinski kamen Bistrica ob Sotli EXF-4918 ličkanje, zgornji čep na sodu (vino) Bistrica ob Sotli EXF-4921 ličkanje, spodnji čep (vino) Bistrica ob Sotli EXF-5274 tla, na katera se je scejalo vino Bistrica ob Sotli EXF-4915 vinski kamen Bistrica ob Sotli Hanseniaspora uvarum EXF-4922 peclji, belo grozdje Breg pri Žirovnici Kluyveromyces lactis EXF-5279 ličkanje, zgornji čep na sodu (vino) Bistrica ob Sotli Pichia membranifaciens EXF-5278 peclji, rdeče grozdje Bistrica ob Sotli Saccharomyces cerevisiae EXF-4909 mošt izpod stiskalnice Bistrica ob Sotli EXF-4914 tropine, rdeče grozdje, stare 10 dni Bistrica ob Sotli EXF-4920 enkrat stisnjen grozd Bistrica ob Sotli EXF-5273 vinski kamen, rdeče vino Bistrica ob Sotli EXF-4911 čist rdeč mošt Bistrica ob Sotli EXF-4912 prostor, kjer se vino steka na beton Bistrica ob Sotli EXF-4916 ličkanje, spodnji čep na sodu, mošt, 1. dan Bistrica ob Sotli EXF-4919 peclji, belo grozdje Bistrica ob Sotli EXF-5280 tropine po drugem stiskanju, belo grozdje Bistrica ob Sotli EXF-5282 ličkanje, spodnji čep (vino) Breg pri Žirovnici EXF-5294 rdeče domače vino, staro 7 dni Breg pri Žirovnici EXF-5276 tropine rdeče grozdje, staro 10 dni Bistrica ob Sotli EXF-5272 rdeč mošt s tropinami Bistrica ob Sotli EXF-4917 peclji, rdeče grozdje Bistrica ob Sotli EXF-4909 mošt izpod stiskalnice Bistrica ob Sotli EXF-5277 peclji, rdeče grozdje Bistrica ob Sotli Saccharomycetes (razred) EXF-5275 peclji, rdeče grozdje, staro 10 dni Bistrica ob Sotli Zygosaccharomyces bailii EXF-6235 tropine Jesenice EXF-6236 tropine Jesenice Voda iz industrijskih okolij Nabrali smo 23 različnih vzorcev, ki smo jih odvzeli iz odpadnih vod različnih industrijskih proizvodenj, npr. pri proizvodnji lepenke, voda iz čistilnih naprav, avtopralnic, ali drugače onesnažena voda (reke, potoki, izviri, meteorne vode). Vzorce so predstavljali bodisi vzorci vode, usedline ali manjši kosi odpadnega materiala iz vode. Iz teh vzorcev smo izolirali in identificirali 26 izolatov, ki smo jih uvrstili v osem različnih vrst. Največji delež izolatov predstavlja vrsta Saccharomyces cerevisiae (13 izolatov), Rhodotorula mucilaginosa (5 izolatov) ter Candida zemplinina (2 izolata). Preostale posamične izolate pa smo uvrstili v naslednje vrste: Candida albicans, Candida glabrata, Hanseniaspora uvarum, Pichia guilliermondii in Saccharomyces paradoxus. En izolat (EXF-6308) je ostal neidentificiran. Deleži vseh vrst so prikazani na sliki 10. Izolati, identifikacije in natančen opis substratov so prikazni v preglednici 16.

58 45 4% 4% 4% 4% 4% 4% 7% Saccharomyces cerevisiae 13 sevov 50% 19% Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula mucilaginosa Candida zemplinina Candida albicans Candida glabrata Hanseniaspora uvarum Pichia guilliermondii ni bilo identificirano Saccharomyces paradoxus Slika 10: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz voda industrijskih okolij (N = 26). Preglednica 16: Spisek kvasih izolatov iz vod v industrijskih okoljih. Identificirana vrsta EXF številka Opis vzorca za izolacijo Lokacija seva Candida albicans EXF-6259 vzorec pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič Candida glabrata EXF-6251 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice Candida zemplinina EXF-6244 onesnažena voda potoka Blejščica Tržič EXF-6309 onesnažena voda Jesenice Hanseniaspora uvarum EXF-6245 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice neidentificirano EXF-6308 onesnažena voda potoka na Tomšičevi cesti Jesenice Pichia guilliermondii EXF-6253 odplake iz avtopralnice Jesenice Rhodotorula mucilaginosa Saccharomyces cerevisiae EXF-6243 odplake iz avtopralnice Jesenice EXF-6252 odplake iz avtopralnice Jesenice EXF-6254 odplake iz avtopralnice Jesenice EXF-6255 odplake iz avtopralnice Jesenice EXF-6261 onesnažena voda potoka Blejščica Tržič EXF-6218 usedline skal v odpadni vodi Jesenice EXF-6219 usedline skal v odpadni vodi Jesenice EXF-5873 vzorec pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič EXF-6246 onesnažena voda potoka na Tomšičevi cesti Jesenice EXF-6247 onesnažena voda potoka na Tomšičevi cesti Jesenice EXF-6248 onesnažena voda potoka na Tomšičevi cesti Jesenice se nadaljuje

59 nadaljevanje Identificirana vrsta Saccharomyces cerevisiae EXF številka seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija EXF-6249 onesnažena voda potoka na Tomšičevi cesti Jesenice EXF-6250 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice EXF-5874 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice EXF-6256 vzorec pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič EXF-6257 vzorec pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič EXF-6258 vzorec pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič EXF-5875 onesnažena voda reke Mošenik Tržič Saccharomyces paradoxus EXF-5870 usedline skal v odpadni vodi Jesenice Tla pod sadnimi drevesi, sadjem, zelenjavo Zadnja skupina so vzorci tal (zemlja) pod različnimi sadnimi drevesi, pod sadeži (npr. jabolko, grozdje, breskev) in pod zelenjavo (npr. paradižnik, kumara, brokoli). Nekateri sadeži in zelenjava so bili tudi že nagniti. Nabrali smo 11 vzorcev in iz njih pridobili 7 izolatov, ki pripadajo štirim različnim vrstam: Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia orientalis, Metschnikowia pulcherrima in Saccharomyces cerevisiae. Natančnejši podatki o izolatih in izvoru so podani v preglednici 17. Preglednica 17: Spisek kvasih izolatov iz tal pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo. Identificirane vrste Hanseniaspora uvarum Issatchenkia orientalis EXF številka seva EXF-5285 EXF-5286 EXF-6213 EXF-6214 Metschnikowia pulcherrima EXF-5283 Saccharomyces cerevisiae EXF-5735 EXF-5281 Opis vzorca za izolacijo tla, kjer je ležal rdeč grozd in razpadlo listje trte tla, kjer je ležal rdeč grozd in razpadlo listje trte tla pod gnilim paradižnikom tla pod gnilim jabolkom tla pod gnilim jabolkom tla pod gnilo breskvijo tla, kjer so bile tropine grozdja Lokacija Breg pri Žirovnici Breg pri Žirovnici Bistrica ob Sotli Bistrica ob Sotli Breg pri Žirovnici Bistrica ob Sotli Bistrica ob Sotli Žuželke (vinske mušice) Pet vzorcev so predstavljale vinske mušice, ki smo jih nabrali s sadja, sladkorja, kisa in grozdja. Kot vrsto Saccharomyces cerevisiae smo identificirali dva izolata: sev EXF-6734 je bil izoliran iz vinskih mušic na soku kosmulja-marabela in sev EXF-6234 izoliran iz vinskih mušic na grozdju.

60 4.2 IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA KVASOVKE S. CEREVISIAE Vzorci, iz katerih smo izolirali kvasovko Saccharomyces cerevisiae Med vsemi vzorci, iz katerih smo izolirali kvasovke na MEA + Ch ploščah, smo iskali kolonije s fenotipskimi lastnostmi kvasovke Saccharomyces cerevisiae in izolirali 122 sevov. Od 27 skupin vzorcev smo kvasovko S. cerevisiae identificirali iz 11 skupin vzorcev. Izolirali smo 44 različnih sevov kvasovke S. cerevisiae (glej Preglednico 18). V kar nekaj primerih je bilo število vzorcev veliko, izolatov pa malo ali jih sploh ni bilo. Pri izoliranih sevih kvasovke S. cerevisiae sta takšna primera v skupini vzorcev: gobe in lišaji, razgrajen les. Ostala odstopanja so prikazana na sliki 11. Deleži vseh 44 sevov po skupinah vzorcev so predstavljeni na sliki 12. Največji delež izoliranih Saccharomyces cerevisiae je bil v skupinah: vinogradniški vzorci (34 %), vode industrijskih okolij (30 %) in mlečni izdelki (9 %). Preglednica 18: Izolati vseh sevov S. cerevisiae z opisom vzorca za izolacijo EXF številka izolata Opis vzorca za izolacijo Kraj odvzema vzorca EXF-4909 svež mošt iz stiskalnice Bistrica ob Sotli EXF-4911 mošt iz rdečega grozdja Bistrica ob Sotli EXF-4912 tla, kjer se vino steka na beton Bistrica ob Sotli EXF-4914 tropine rdečega grozdja (stare 10 dni) Bistrica ob Sotli EXF-4916 koruzno ličkanje na spodnjem čepu sodu (mošt star 24 h) Bistrica ob Sotli EXF-4917 peclji rdečega grozdja Bistrica ob Sotli EXF-4919 peclji belega grozdja Bistrica ob Sotli EXF-4920 grozdje (enkrat stisnjeno) Bistrica ob Sotli EXF-4925 sok zmletih hrušk Breg pri Žirovnici EXF-5272 mošt iz rdečega grozdja s tropinami Bistrica ob Sotli EXF-5273 vinski kamen rdečega vina Bistrica ob Sotli EXF-5276 tropine rdečega grozdje (stare 10 dni) Bistrica ob Sotli EXF-5277 peclji rdečega grozdja Bistrica ob Sotli EXF-5280 tropine po drugem stiskanju belega grozdja Bistrica ob Sotli EXF-5281 tla, kjer so bile tropine grozdja (staro 10 dni) Bistrica ob Sotli EXF-5282 koruzno ličkanje na spodnjem čepu soda (vino) Bistrica ob Sotli EXF-5284 koruzna silaža Breg pri Žirovnici EXF-5287 slive (zmlete) Breg pri Žirovnici EXF-5289 kefir (iz kefirjeve kulture) Breg pri Žirovnici EXF-5293 jabolčni sok Breg pri Žirovnici EXF-5294 rdeče domače vino (staro 7 dni) Breg pri Žirovnici EXF-5295 kefir (iz kefirjeve kulture) Breg pri Žirovnici EXF-5296 jabolčni kis Breg pri Žirovnici EXF-5297 sok zmletih hrušk Breg pri Žirovnici EXF-5733 gnile rumene kolerabe Breg pri Žirovnici EXF-5734 vinske mušice z ličinkami v soku marabele in kosmulje Jesenice EXF-5735 zemlja pod gnilo breskvijo Bistrica ob Sotli EXF-5869 trhel les dolina Triglavske Bistrice se nadaljuje 47

61 Število vzorcev / izolatov nadaljevanje EXF številka izolata Opis vzorca za izolacijo EXF-5871 domač kravji sir Visoče EXF-5872 domač kravji sir Visoče odpadna voda pred vstopom v čistilno napravo pri EXF-5873 proizvodnji lepenke Tržič EXF-5874 odpadna voda pri potoku Ukova Jesenice EXF-5875 odpadne vode pri potoku Mošenik Tržič EXF-6218 usedlina odpadne vode, ki se zliva v potok Tomšičeva Jesenice EXF-6219 usedline pri izviru potoka Tomšičeva Jesenice EXF-6234 ličinke vinskih mušic z vinskim kisom Jesenice EXF-6246 odpadna voda potoka Tomšičeva Jesenice EXF-6247 odpadna voda, ki teče v potok Tomšičeva Jesenice EXF-6248 odpadna voda potoka Tomšičeva Jesenice EXF-6249 odpadna voda potoka Tomšičeva Jesenice EXF-6250 odpadna voda pri potoku Ukova Jesenice EXF-6256 odpadne vode pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič EXF-6257 odpadne vode pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič EXF-6258 odpadne vode pred vstopom v čistilno napravo pri proizvodnji lepenke Tržič Kraj odvzema vzorca število nabranih vzorcev število vseh izolatov kvasovk število izoliranih sevov S. cerevisiae Slika 11: Primerjava števila nabranih vzorcev (N = 142) s številom vseh izolatov kvasovk (N = 110) in številom izoliranih sevov S. cerevisiae (N = 44) po skupinah vzorcev.

62 49 tla pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo 2 seva 5% razgrajen les 1 sev 2% žuželke (vinske mušice) 2 seva 5% domači kis 1 sev 2% gnilo sadje in zelenjava 1 sev 2% silaža 1 sev 2% sladki plodovi 1 sev 2% vinogradniški vzorci 15 sevov 34% sveže stiskani sadni sokovi pred pasterizacijo 3 sevi 7% mlečni izdelki 4 sevi 9% vinogradniški vzorci mlečni izdelki žuželke (vinske mušice) domači kis gnilo sadje in zelenjava voda iz industrijskih okolij 13 sevov 30% voda iz industrijskih okolij sladki plodovi Slika 12: Deleži izoliranih sevov S. cerevisiae po skupinah vzorcev (N = 44). sveže stiskani sadni sokovi pred pasterizacijo tla pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo razgrajen les silaža Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Kvasovko S. cerevisiae smo lahko v prvi fazi identificirali na podlagi morfoloških lastnosti, kot so oblika in barve kolonij na izolacijski plošči MEA s kloramfenikolom. Opazovali smo morfologijo kolonij z naslednjimi lastnostmi, ki so značilne za vrsto S. cerevisiae: krem-bež barva, gladki robovi, tip profila kolonije je gladek, lahko tudi z izboklino na sredini, velikost kolonije pa je zelo različna (slika 13). Kolonije domnevne vrste smo pregledali s svetlobnim mikroskopom pri 100, 400 in 1000 povečavi. Celice S. cerevisiae so splošno eliptične do jajčaste oblike (glej sliko 14). V preglednici 19 so prikazane morfološke lastnosti posameznih izoliranih sevov Saccharomyces cerevisiae glede na obliko celic, barvo in obliko celic pri acidorezistentnem barvanju in na gojišču s sečnino. Kvasovka S. cerevisiae ne hidrolizira sečnine, kar je razvidno tudi iz lastnosti tipskega seva CBS Hidroliza sečnine ni bila opazna pri nobenem sevu, razen izjeme seva EXF-5869, ki se je obarval roza. Izbrani primeri mikroskopskih posnetkov acidorezistentnega barvanja sevov Saccharomyces cerevisiae so prikazani na sliki 15. Barva celic po acitorezistentem barvanju je različna glede na vsebnost askov, vegetativnih celic (modro) in askospor (roza).

63 50 Slika 13: Osnovna izolacijska gojišča MEA + Ch in YM s kolonijami S. cerevisiae. A: EXF-5284, B: EXF-5280, C: EXF-5295, D: EXF-5296, E: EXF-5297, EXF-4925, F: EXF-4914

64 Preglednica 19: Morfološke lastnosti izoliranih sevov S. cerevisiae. EXF izolat Mikroskopiranje izolatov Prisotnost askospor/vegetativnih celic EXF-4909 OG A, KV EXF-4911 OG A, KV EXF-4912 OG A, KV EXF-4914 OK A, KV EXF-4916 OK A, KV EXF-4917 OG A EXF-4919 OG A, KV EXF-4920 OG A EXF-4925 OG KV EXF-5272 OG A, KV EXF-5273 OG A, KV EXF-5276 OG A, KV EXF-5277 OG KV EXF-5280 OG KV EXF-5281 OG A, KV EXF-5282 OG A, KV EXF-5284 OK A, KV EXF-5287 OG A, KV EXF-5289 OG KV EXF-5293 OG A, KV EXF-5294 OG A, KV EXF-5295 OG A, KV EXF-5296 OG A, KV EXF-5297 OK A, KV EXF-5733 OK A, KV EXF-5734 OK, P A, KV EXF-5735 OK A, KV EXF-5869 OK KV EXF-5871 OK, P KV EXF-5872 OK, P KV EXF-5873 OK, P A, KV EXF-5874 OK, P KV EXF-5875 OK, P A, KV EXF-6218 O KV EXF-6219 OK KV EXF-6234 OK, P A, KV EXF-6246 OK A, KV EXF-6247 OK A, KV EXF-6248 OK A, KV se nadaljuje 51

65 nadaljevanje EXF izolat Mikroskopiranje izolatov Prisotnost askospor/vegetativnih celic EXF-6249 OK KV EXF-6250 OK, P KV EXF-6256 OK A, KV EXF-6257 OK, P A, KV EXF-6258 OK, P A, KV Mikroskopiranje izolatov (oblike celic): OK okrogle, P podolgovate, OG oglate. Prisotnost askospor/vegetativnih celic po acidorezistentnem barvanju: KV vegetativne kvasne celice, A askospore. 52

66 53 Slika 14: Posamezne kvasne celice različnih sevov S. cerevisiae (1000 povečava, merilca so na posameznih slikah) A: EXF-4919, B: EXF-5734, C: EXF-6219, D: EXF-5733, E: EXF-5873, F: EXF-6218, G: EXF-4925, H: EXF-6249

67 54 Slika 15: Mikrografije mikroskopskih preparatov po acidorezistentnem barvanju sevov S. cerevisiae pod različnimi povečavami (400, 1000 ; merilca so na posameznih slikah). A: EXF-6234, B: EXF-5735, C: EXF-6249, D: EXF-5875, E: EXF-5874, F: EXF-6246, G: EXF: 6257, H: EXF-5733, I: EXF Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae Seve S. cerevisiae smo identificirali do nivoja rodu in vrste na molekularni genetski ravni, in sicer na podlagi nukleotidnih zaporedij ITS rdna. Preglednica 20 prikazuje vse seve S. cerevisiae v primerjavi z ITS zaporedjem tipskega seva CBS1171. Izolirane seve smo primerjali glede na podobnost / razlike v zaporedju. Podatke smo primerjali po podobnosti izračunane po BLAST algoritmu (NCBI) in ujemanju s tipskim sevov po dolžini ITS zaporedja in bazah v njem. Kljub slabi kvaliteti nukleotidnega zaporedja smo v preglednici podali tudi te. Slabo kvaliteto zaporedji pripisujemo pojavljanju zaporednih istih nukleotidov, kar povzroči napake v sekveniranju (prekrivanje nukleotidnega zaporedja). Zaradi tega je samo del nukleotidnega zaporedja jasen, kar smo videli na kromatogramu (izpis sekvence določenega dela gena).

68 Preglednica 20: Primerjava ITS zaporedij sevov S. cerevisiae s tipskim sevom: primerjava dolžine pomnožka in zaporedja, odstotka podobnosti po BLAST algoritmu in odstotka ujemanja (sorodnosti). Izolacijska številka izolata Dolžina ITS pomnožka Število vseh baz v ITS zaporedju % podobnosti po BLAST algoritmu 55 Ujemanje (sorodnost) s tipskim sevom (%) CBS1171 T neznano % 100 % EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % 100 % EXF % 99 % EXF % 87 %* EXF % 76 %* EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % 100 % EXF % 85 %* EXF % 100 % EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % 82 %* EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % 98 % EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % 90 % EXF % 99 % EXF % 95 % EXF % 99 % EXF % 94 % EXF % 98 % EXF % 99 % EXF % 96 % EXF % 96 % EXF % 97 % EXF % 96 % EXF % 98 % EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % 98 % EXF % 99 % EXF % 99 % EXF % * EXF % 90 % * se nadaljuje

69 nadaljevanje Izolacijska številka izolata Dolžina ITS pomnožka Število vseh baz v ITS zaporedju % podobnosti po BLAST algoritmu 56 Ujemanje (sorodnost) s tipskim sevom (%) EXF % 86 %* EXF % 98 % * EXF % 72 %* EXF % 98 % EXF % 98 % * slaba kvaliteta nukleotidnega zaporedja Fiziološki testi sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae Asimilacijski profili in rezultati temperaturnih testov sevov izolatov S. cerevisiae so podani v preglednici 21. Vse seve smo primerjali s podatki, veljavnimi za vrsto (CBS baza podatkov). Izstopajo sevi EXF-6256, EXF-6257, EXF-6258 v asimilaciji ksiloze, laktoze in ribitola. Sev EXF-5869 asimilira ksilozo. Sevi EXF-5289, EXF-5295, EXF-5871 in EXF-5872 asimilirajo laktozo. L-arabinozo asimilirajo sevi EXF-6257, EXF-6256, EXF- 6249, trehalozo asimilirajo sevi EXF-6250, EXF-6219, EXF-6218, EXF-5869, EXF-5734, EXF-5733, sukcinat asimilirajo sevi EXF-5875 in EXF-5284 ter L-arabinozo asimilirajo sevi EXF-6250, EXF-6248, EXF-6247, EXF-5733 in EXF V preglednici 22 so podani rezultati naključno izbranih dvajsetih sevov iz vsake skupine vzorcev S. cerevisiae za fermentacijske teste glukoze, saharoze, maltoze in ksiloze. Preverjali smo tudi encimsko aktivnost za pektinsko in celulolitično aktivnost sevov vseh izolatov S. cerevisiae, vendar rasti na teh gojiščih pri nobenem sevu ni bilo.

70 D-glukoza D-galaktoza L-saharoza D-glukozamin D-riboza D-ksiloza L-arabinoza L-ramnoza maltoza trehaloza celobioza melibioza laktoza rafinoza melezitoza škrob glicerol ribitol D-manitol mio-inozitol fruktoza sorbitol saharoza D-glukuronat sukcinat citrat metanol etanol nitrat nitrit L-lizin 10- %NaCl 10 C 20 C 25 C 30 C 37 C Preglednica 21: Asimilacijski profili sevov S. cerevisiae po 21 dneh inkubacije. 57 EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w - w w w / / w w w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w w - w w w / / w + w EXF w w w w w - w w w / / w + w EXF w w w w w + / / w + w EXF w w w w - - w w w / / w + w se nadaljuje

71 D-glukoza D-galaktoza L-saharoza D-glukozamin D-riboza D-ksiloza L-arabinoza L-ramnoza maltoza trehaloza celobioza melibioza laktoza rafinoza melezitoza škrob glicerol ribitol D-manitol mio-inozitol fruktoza sorbitol saharoza D-glukuronat sukcinat citrat metanol etanol nitrat nitrit L-lizin 10- %NaCl 10 C 20 C 25 C 30 C 37 C nadaljevanje 58 EXF w w w w - - w w w / / w + w + + w EXF w w w - - w w w / / w + w EXF w w w - - w w w / / w + w EXF w w w w w / / w w w EXF w w - w w w / / w w w EXF w w w w w / / w w w EXF w w w w w / / w w w EXF w w w w w / / w w w EXF w w w w / / w w w EXF w w w w w / / w w w EXF w w w w / / w w w EXF w w w w + w / / w w w EXF w w w w w w / / w w w EXF w w w w / / w w w EXF w w w w / / w w w EXF w w w w / / w w w EXF w w w w / / w w w EXF w w - w w w / / w w w EXF w w - w w w / / w w w EXF w w w w / / w w w / - w w w + / - - / / EXF w w - w / w / / w w w se nadaljuje

72 D-glukoza D-galaktoza L-saharoza D-glukozamin D-riboza D-ksiloza L-arabinoza L-ramnoza maltoza trehaloza celobioza melibioza laktoza rafinoza melezitoza škrob glicerol ribitol D-manitol mio-inozitol fruktoza sorbitol saharoza D-glukuronat sukcinat citrat metanol etanol nitrat nitrit L-lizin 10- %NaCl 10 C 20 C 25 C 30 C 37 C nadaljevanje 59 EXF w w - - w - w w / / w w w / w w w w + / - - / / EXF w w - - w - w w / / w w w / w w w w + / - - / / EXF w w - - w / / w w w / - - w w + / - - / / S. cerevisiae (lastnosti vrste)* w / / / rast, - ni rasti, w šibka rast, / - ni definirano; 1. vrstica: viri C, viri N, drugi viri in temperatura rasti, *(Barnett, 2000).

73 60 Preglednica 22: Rezultati fermentacijskih testov glukoze, saharoze, maltoze in ksiloze pri izbranih sevih S. cerevisiae po 28 dneh inkubacije. Glukoza Saharoza Maltoza Ksiloza EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF EXF S. cerevisiae (lastnosti vrste)* Rumena barva tekočega gojišča in mehurček s CO 2 predstavlja pozitiven rezultat (+), v nasprotnem primeru je rezultat negativen (-) zelena obarvanost gojišča in brez mehurčka; *(Barnett, 2000) Parjenje haploidnih sevov na acetatnem agarju Izbrali smo seve S. cerevisiae, ki so se po acidorezistentnem barvanju obarvali modro (prisotne le vegetativne kvasne celice). Z uporabo gojišča acetatnega agarja lahko izzovemo spolno razmnoževanje oz. mejozo vegetativnih kvasnih celic, če sta si seva kompatibilna (paritveni tip a in α). Končni produkt mejoze so haploidne askospore. S parjenjem različnih haploidnih sevov S. cerevisiae smo želeli ugotoviti kompatibilnost različnih paritvenih tipov, ki jo opazimo, kot tvorbo askospor (roza obarvane strukture). Kombinacije sevov in rezultati paritve so podani v preglednici 23. Po parjenju so dvojice sevov EXF-5871 in EXF-4925 ter EXF-5872 in EXF-5871 poleg vegetativnih sevov tvorile tudi askospore (glej sliko 16). Ugotovili smo, da so ti sevi heterotalični, kar je značilno za naravne izolate.

74 61 Preglednica 23: Kombinacije parjenja sevov S. cerevisiae, ki tvorijo askospore. EXF-5289 EXF-4925 EXF-5871 EXF-5872 EXF-6250 EXF-5874 EXF-5280 KV KV KV KV KV KV EXF-5289 KV KV KV KV KV EXF-4925 A, KV KV KV KV EXF-5871 A, KV KV KV EXF-5872 KV KV EXF-6250 KV kvasne vegetativne celice (modro obarvane na mikroskopskem preparatu), A askospore (roza obarvane na mikroskopskem preparatu); kombinacije sevov so v tabeli označene z vijolično barvo. KV Slika 16: Parjenje sevov S. cerevisiae pri 400 in 1000 povečavi (merilca so na posameznih slikah). A: EXF-5871 in EXF-4925, B: EXF-5872 in EXF Vegetativne celice so obarvane modro, askospore pa rdeče.