UNIVERZA V LJUBLJANI

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijski program: Biologija in gospodinjstvo Izolacija in genotipizacija bakterije Salmonella enterica iz plazilcev v ujetništvu Mentorica: Jerneja Ambrožič Avguštin Kandidatka: Metka Farkaš Somentorica: Martina Turk Ljubljana, september 2016

2 II Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija biologije in gospodinjstva. Opravljeno je bilo v laboratoriju Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Študijska komisija je za mentorico diplomskega dela imenovala doc. dr. Jernejo Ambrožič Avguštin, za somentorico doc. dr. Martino Turk in za recenzentko doc. dr. Polono Zalar. Mentorica: doc. dr. Jerneja Ambrožič Avguštin Somentorica: doc. dr. Martina Turk Recenzentka: doc. dr. Polona Zalar Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: Članica: Članica: Članica: prof. dr. Marjanca STARČIČ ERJAVEC Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo doc. dr. Jerneja AMBROŽIČ AVGUŠTIN Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo doc. dr. Martina TURK Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo doc. dr. Polona ZALAR Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, oddelek za biologijo Datum zagovora: Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Metka Farkaš

3 III KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dn DK KG plazilci/salmonella enterica/antibiotiki/virulentni dejavniki KK AV FARKAŠ, Metka SA AMBROŽIČ AVGUŠTIN, Jerneja (mentor)/ TURK, Martina (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2016 IN IZOLACIJA IN GENOTIPIZACIJA BAKTERIJE SALMONELLA ENTERICA IZ PLAZILCEV V UJETNIŠTVU TD DIPLOMSKO DELO (univerzitetni študij) OP IX, 57 str., 8 tab., 13 sl., 2 pril., 65 vir. IJ sl JI sl/en AI Plazilci so v zadnjih letih vse bolj priljubljeni hišni ljubljenčki, pogosto pa se uporabljajo kot učni pripomoček v šolah. Velikokrat se omenjajo kot možni prenašalci salmonele, zato je pri delu z njimi potrebna previdnost in ustrezna higiena. Pri plazilcih zajetih v raziskavo smo salmonelo potrdili pri 42,4% živali. Največ okuženih je bilo kuščarjev (58,8%), sledile so kače (42,9%), pri želvah salmonele nismo identificirali. Večina izolatov je pripadala vrsti Salmonella enterica subsp. enterica, v štirih primerih smo izolirali bakterijo Salmonella enterica subsp. arizonae. Izmed vseh sevov je bilo 33,3% takšnih, ki so bili odporni proti izbranim protimikrobnim učinkovinam. Največkrat proti streptomicinu. Preverili smo tudi prisotnost genov za beta-laktamaze iz skupine CTX-M za odpornost proti kinolonom (qnr). Čeprav sta bila dva izolata odporna proti ampicilinu, nismo potrdili prisotnosti genov blactx-m in genov skupine qnr. Pri salmonelah iz plazilcev smo potrdili prisotnost genov za virulentne dejavnike (inva, spob, sifa, spvc), od tega največkrat inva (92,3%). Veliko izolatov je vsebovalo dva ali tri testirane gene za virulentne dejavnike. Zaradi prisotnosti virulentnih dejavnikov so salmonele lahko potencialno patogene za ljudi. Da preprečimo prenos salmonele, moramo paziti na ustrezno higieno rok in opreme za plazilce. Poleg tega pa se odsvetuje stik s plazilci mlajšim otrokom, osebam z oslabljenim imunskim sistemom in starejšim osebam.

4 IV KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dn DC CX reptiles/salmonella enterica/antibiotics/virulence factors CC AU FARKAŠ, Metka AA AMBROŽIČ AVGUŠTIN, Jerneja (supervisor)/turk, Martina (co-supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2016 TI ISOLATION AND GENOTYPISATION OF SALMONELLA ENTERICA FROM CAPTIVE REPTILES DT Graduation thesis (University studies) NO IX, 57 p., 8 tab., 13 fig., 2 ann., 65 ref. LA sl AL sl/en AB Reptiles are becoming increasingly popular in recent years as pets, and they are often used as a teaching aid in schools. They are often cited as potential carriers of salmonella, so working with them requires caution and proper hygiene. In surveyed reptiles salmonella was confirmed in 42.4% of the animals. The most infected were lizards (58.8%), followed by snakes (42.9%), while in turtles they were not identified. Most of the isolates belonged to Salmonella enterica subsp. enterica, in four cases Salmonella enterica subsp. arizonae was isolated. Thirty-three percent of salmonella strains were resistant against the tested antimicrobials, majority to streptomicin. We also verified the presence of genes for beta-lactamases and quinolone resistance genes (qnr). Although there were two isolates resistant to ampicillin, we did not confirm the presence of bla genes and qnr genes. In salmonella strains from reptiles we also confirmed the presence of genes for virulence factors (inva, spob, sifa, spvc), of which 92.3% strains contained inva. The majority of strains contained two or three of the tested genes for virulence factors. Due to the presence of virulence factors salmonella strains from reptiles are potentially pathogenic for humans. To prevent transmission of salmonella, we must pay attention to proper hand hygiene and equipment for reptile handling. Moreover, young children, people with weakened immune systems and the elderly should avoid all contact with reptiles.

5 V KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA..III KEY WORDS DOCUMENTATION...IV KAZALO VSEBINE...V KAZALO TABEL VII KAZALO SLIK...VIII KAZALO PRILOG IX 1 UVOD NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE PREGLED OBJAV UPORABA ŽIVALI V UČNE NAMENE Plazilci v izobraževanju in kot hišni ljubljenčki ZNAČILNOSTI PLAZILCEV ZDRAVSTVENA TVEGANJA PRI ŽIVALIH - ZOONOZE Zoonoze plazilcev Mikobakterioza in klamidofiloza Okužbe z aeromonasi in pseudomonasi Salmoneloza Pogostost okužb s salmonelo pri plazilcih in njen prenos na človeka Preprečevanje prenosa okužb na človeka BAKTERIJE RODU SALMONELLA Klasifikacija Virulentni dejavniki Odpornost proti antibiotikom Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom in kinolonom MATERIAL IN METODE IZOLACIJA BAKTERIJ RODU SALMONELLA IZ PLAZILCEV Vzorci Načrt dela Predbogatitev Bogatitev Selektivna izolacija salmonel v čisti kulturi IDENTIFIKACIJA BAKTERIJ RODU SALMONELLA IZ PLAZILCEV Fenotipska identifikacija z biokemijskimi testi Genotipska identifikacija na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rrna UGOTAVLJANJE ODPORNOSTI SALMONEL PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM Difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju Inkorporacijski antibiogram... 30

6 VI 3.4 GENOTIPSKA METODA ZA UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI BETA-LAKTAMAZ Z RAZŠIRJENIM SPEKTROM DELOVANJA (ESBL) SKUPINE CTX-M IN GENOV ZA PLAZMIDNO POSREDOVANO KINOLONSKO REZISTENCO (PMQR) SKUPINE QNR Pomnoževanje genov beta-laktamaz z razširjenim spektrom delovanja skupine CTX-M (blactx-m) Pomnoževanje genov za plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco (PMQR) skupine QNR UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI NEKATERIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV PRI IZOLATIH SALMONEL IZ PLAZILCEV REZULTATI PRISOTNOST VRST IZ RODU SALMONELLA PRI PLAZILCIH ODPORNOST IZOLIRANIH SEVOV PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM Prisotnost genov ESBL skupine CTX M in PMQR skupine QNR PRISOTNOST IZBRANIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV RAZPRAVA IN SKLEPI RAZPRAVA Prisotnost bakterij rodu Salmonella pri plazilcih Odpornost salmonel proti antibiotikom in prisotnost virulentnih dejavnikov SKLEPI POVZETEK VIRI ZAHVALA PRILOGE

7 VII KAZALO TABEL str. Tabela 1: Univerzalni bakterijski oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje gena za 16S rrna Tabela 2: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov ESBL skupine CTX M (blactx-m) Tabela 3: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov qnr Tabela 4: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov izbranih virulentnih dejavnikov Tabela 5: Rezultati biokemijskih testov za salmonelo in sorodne vrste Tabela 6: Rezultati izbranih biokemijskih testov za izolate salmonel iz plazilcev Tabela 7: Rezultati odpornosti salmonel iz plazilcev proti izbranim antibiotikom Tabela 8: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev

8 VIII KAZALO SLIK str. Slika 1: Kolonije bakterije Salmonella enterica subsp. enterica na selektivnem gojišču XLD. (Foto: M. Farkaš) Slika 2: Odvzem brisa iz kloake pri kraljevem pitonu (Foto: M. Turk) Slika 3: Predbogatitev vzorcev iztrebkov v gojišču BPW (epruvete na levi) in bogatitev vzorcev v gojišču MKTT (epruvete na desni) (Foto: M. Turk) Slika 4: Mešana kultura s kolonijami potencialnih salmonel na selektivnih in diferencialnih trdnih gojiščih XLD (levo, rožnate kolonije s črnim centrom) in SSA (desno, prosojne kolonije s črnim centrom) Slika 5: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev Slika 6: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi ustanovami Slika 7: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med posameznimi zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi ustanovami Slika 8: Primer difuzijskega antibiograma po Kirby-Bauerju pri sevu salmonele z oznako EXB L373 (Foto: M. Farkaš) Slika 9: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov beta-laktamaz (ESBL) skupine CTX M Slika 10: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov qnr pri izbranih sevih salmonel iz plazilcev Slika 11: Prisotnost izbranih virulentnih dejavnikov pri salmonelah iz plazilcev Slika 12: Število sevov salmonel iz plazilcev, ki vsebujejo določeno število virulentnih dejavnikov Slika 13: Prikaz prisotnosti izbranih virulentnih dejavnikov (v odstotkih) glede na vrsto plazilca iz katerega je bila izolirana salmonela

9 IX KAZALO PRILOG str. Priloga 1: Seznam plazilcev, vključenih v analizo za prisotnost salmonele Priloga 2: Delna nukleotidna zaporedja gena za 16S rrna izolatov salmonel iz plazilcev... 61

10 1 1 UVOD Živali so se v šolah sprva uporabljale kot demonstracijski material ali za seciranje (Balcombe, 2000). S spremembami učnih načrtov pa se je spremenil tudi namen in pogostost uporabe živali v šolah (McGriffin, 1980). Prav otroštvo je ključno obdobje za razvoj zavesti in pozitivnega odnosa do živali, ki je pomemben za ohranjanje biotske raznovrstnosti (Ballouard, 2011). V izobraževalnih ustanovah so med najpogosteje gojenimi živalmi predvsem glodavci (miši, skakači, hrčki), ribe, žuželke (paličnjaki) in plazilci (želve, kače, kuščarji). Plazilci pa so v zadnjem času zelo priljubljeni tudi kot hišni ljubljenčki, oziroma domače živali. Vse naštete živali so lahko vir okužb s patogenimi mikroorganizmi, zato je potrebna previdnost pri rokovanju z njimi. Med najbolj pomembne zoonoze (bolezni, ki se prenašajo z živali na ljudi) uvrščamo antraks, brucelozo, mikrosporijo, listeriozo, tuberkulozo, salmonelozo in še nekatere druge zoonoze (Ebani in Fratini, 2005). Po navedbah Uprave za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin RS (UVHVVR, 2013) so najpogostejše povzročiteljice zoonoz pri ljudeh bakterije rodov Campylobacter in Salmonella. Pri živalih se lahko te bolezni pojavljajo brez specifičnih zunanjih znakov, pogosto pa so te bakterije tudi normalni prebivalci njihove črevesne mikrobiote, zato je njihovo prisotnost težko ugotoviti. Za človeka pa lahko te živali predstavljajo vir okužbe. Vir okužbe s salmonelo je najpogosteje uživanje kontaminiranih živil ali pa stik z obolelimi živalmi. Tudi pri ljudeh je veliko okužb brez kliničnih znakov, ali pa so v blagih oblikah, bolezen mine sama v nekaj dnevih. Znaki so driska, slabost, bolečine v trebuhu in povišana telesna temperatura. Smrtnost je manj kot 1% (UVHVVR, 2015; Hollinger 2000). Vse pogosteje se kot prenašalci salmonele na človeka omenjajo tudi plazilci, ki jih imajo ljudje za domače živali (Pedersen s sod. 2009; Ebani in Fratini 2005; de Jong s sod. 2005). Primarno se bakterije nahajajo v prebavnem traktu živali, preko iztrebkov pa se okužba lahko prenese tako na druge živali, kot tudi na človeka. Čeprav se plazilci omenjajo kot prenašalci salmonel, je v literaturi le malo podatkov o patogenosti teh sevov, torej o prisotnosti genov z zapisi za virulenčne dejavnike, ki omogočajo okužbo ter širjenje in razmnoževanje salmonele v gostitelju (Ibarra in Steele-Mortimer, 2009). Tudi podatkov o odpornosti salmonel, ki jih najdemo pri plazilcih, proti različnim antibiotikom je zelo malo (Ebani s sod., 2005; Corrente s sod., 2004). S poznavanjem prisotnosti genov za virulenčne dejavnike bi lahko primerjali seve, izolirane iz plazilcev s sevi, izoliranimi iz obolelih ljudi, in tako ugotavljali njihov patogeni potencial.

11 2 1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE Namen diplomske naloge je bil izolirati bakterije rodu Salmonella pri plazilcih, ki živijo v ujetništvu. Za analizo smo iztrebke plazilcev ali brise njihove kloake zbirali v šolah in izobraževalnih ustanovah, ki imajo terarije s plazilci, ter tudi pri zasebnih gojiteljih. Poskusili smo ugotoviti, kolikšen del preučevanih živali je bil okužen s salmonelo. Pri izoliranih sevih salmonel smo se osredotočili na ugotavljanje prisotnosti nekaterih genov, ki nosijo zapise za virulenčne dejavnike. Preverjali pa smo tudi odpornost sevov proti izbranim antibiotikom in poskušali ovrednotiti patogenost salmonel iz plazilcev za človeka. Delovne hipoteze: 1. Bakterije iz rodu Salmonella so zelo pogoste bakterije v prebavilih plazilcev. 2. Sevi salmonel, izoliranih iz plazilcev so občutljivi za testirane antibiotike, imajo pa gene za določene virulenčne dejavnike in so tako lahko patogeni za ljudi.

12 3 2 PREGLED OBJAV 2.1 UPORABA ŽIVALI V UČNE NAMENE Biologija je veda o življenju, zato bi se morala tudi ukvarjati z živimi organizmi, vendar je bil poudarek klasične biologije v šolah predvsem na sistematiki in morfologiji, kjer so se uporabljali na različne načine preparirani organizmi (McGriffin, 1980). Živali so se v šolah uporabljale že od nekdaj, kot demonstracijski material, ali pa so učenci sami secirali mrtve živali (Balcombe, 2000). Posledično učenci v mnogih šolah nikoli niso prišli v stik z živimi organizmi. V zadnjih desetletjih pa je prišlo do sprememb v učnih načrtih in s tem do večje uporabe živali v šolah (McGriffin, 1980). Kot navaja Balcombe (2000) je to spodbudilo učence, da so izvajali vaje in znanstvene raziskave. Težava pa se je pojavila, ker so se pri tem živali pogosto poškodovale. Zelo znani so na primer poskusi na živih žabah. Zaradi porasta učnih ur, kjer so se izvajali takšne vrste poskusi, je bila javnost močno zaskrbljena. Uvedli so pravila, ki so prepovedala poskuse na sesalcih, ptičih, plazilcih, dvoživkah in ribah, ki bi lahko živalim povzročali bolečino ali pa bi bili škodljivi za njihovo zdravje. V Sloveniji rejo in gojitev živali v šolah urejata Zakon o veterinarskih merilih (Ur. list, št. 93/05) in Zakon o zaščiti živali (Ur. list, št. 16/07). Vsaka reja ali gojitev mora izpolnjevati predpisane pogoje glede prostorov, namestitve, oskrbe in zdravstvenega varstva živali. Osnovne in srednje šole, ki začasno zadržujejo ali redijo živali, morajo določiti oskrbovalca živali, ki je zadolžen za oskrbo živali. Živali morajo biti pod rednim nadzorom, zagotovljeno morajo imeti ustrezno bivališče, hrano in vodo. Pomembna pa je tudi svoboda gibanja in mikroklimatski pogoji. Živali v osnovnih in srednjih šolah so namenjene opazovanju, drugi posegi in poskusi na živalih pa so prepovedani (Ornik, 2007). Živali se pri učnih urah uporabljajo iz več razlogov. Prvi je gotovo ta, da učenci lahko vidijo ali občutijo živali iz različnih skupin. Na primer, da lahko občutijo kačo in spoznajo, da ni sluzasta in mrzla, temveč presenetljivo suha, njeno telo pa ima sobno temperaturo. Drugi razlog je razumevanje obnašanja živali, kar najlaže dosežemo z opazovanjem. Živali v šoli pa imajo tudi pomembno vlogo pri razvijanju odgovornosti (McGriffin, 1980). Tudi Tomažič I. (2008) ugotavlja pomen neposredne izkušnje z živaljo na spremembo odnosa do živali in znanja o njej. V raziskavi, v katero so bili vključeni učenci sedmih razredov je bilo ugotovljeno, da lahko z neposredno izkušnjo učenci pridobijo več znanja, prav tako pa je bil potrjen pozitiven vpliv na znižanje intrapersonalnih ovir ob stiku z živalmi. Kot pravi Lačen (2009) je narava najboljši vir informacij, zato se učitelji velikokrat odločajo za opazovanje in tudi gojenje živali v razredu. V raziskavi je potrjeno, da ima uporaba živih živali v razredu pozitivne učinke. Izboljša se dojemanje in spoznavanje lastnosti živali Plazilci v izobraževanju in kot hišni ljubljenčki Hišne živali so živali, ki se vzrejajo, redijo ali gojijo za družbo, rekreacijo ali pomoč človeku, njihov skrbnik pa mora poskrbeti za dobro počutje živali, jim nuditi primerno namestitev, hrano in vodo (Uradni list RS, 2009).

13 4 Ljudje se za hišne živali odločajo iz različnih razlogov, dokazan pa je ugoden učinek na zdravje ljudi, ki imajo pozitivne izkušnje z živalmi. Pri odločitvi za vrsto živali je pomembno, da razmislimo, kakšno vlogo bo žival imela v našem življenju, kakšen življenjski stil imamo in koliko časa se bomo posvečali živali (Radford, 2011). Eksotične živali, med katere štejemo tudi plazilce, so v današnjem času zelo priljubljene. Predstavljene so v trgovinah za male živali, pojavljajo se v filmih in reklamah (Case, ). Melissa Kaplan (1997a) opozarja, na kaj vse moramo biti pozorni, oziroma o čem vse moramo razmisliti, preden se odločimo za nakup plazilca. Večina plazilcev ima zelo specifične potrebe glede hrane, prav tako pa tudi glede okolja, oziroma bivališča, ki se mora čimbolj približati razmeram v njihovem naravnem okolju (vlaga, toplota). Veliko otrok in tudi odraslih ljudi se po začetnem navdušenju kmalu naveliča skrbeti za žival, sploh če jim ta vzame več časa, kot so ob nakupu predvidevali, zato je pomembno, da se zavedamo trajne obveze do živali. Žival lahko tudi zraste in preraste terarij. Pred nakupom se je o željeni vrsti plazilca dobro čim bolj podučiti, ter pomisliti tudi na to, da bo žival morda potrebovala veterinarsko oskrbo, ki je v naši bližini ni. Svojo vlogo pri odločitvi za vrsto plazilca ima tudi cena živali, zato je potrebno že v začetku razmisliti, koliko denarja smo pripravljeni vložiti, ne samo za žival, ampak tudi njeno bivališče in hrano. Pri hrani velja omeniti tudi to, da je potrebno nekatere vrste plazilcev hraniti z živim plenom. Strokovnjaki ocenjujejo, da od 50-90% plazilcev umre že v prvem letu ujetništva, velik odstotek že med transportom. Kasneje pa zaradi nepoznavanja potreb živali ali odrekanja veterinarske oskrbe. Od vseh vrst živali, ki jih ljudje imamo za hišne ljubljenčke, so plazilci edini, ki v ujetništvu ne dočakajo višje starosti kot v svojem naravnem okolju (Kaplan, 1997a). Plazilci se uporabljajo tudi v izobraževalne namene, pri tem pa se srečujemo z enakimi težavami, kot pri uporabi ostalih vrst, saj plazilci niso nič bolj, oziroma nič manj nevarni od ostalih vrst. Prav tako so nekateri bolj primerni, drugi manj. Res pa je, da lahko z uporabo plazilcev v izobraževanju vplivamo na razširjen negativen pogled nanje (Kaplan, 1997b). Glede plazilcev (predvsem kač) ima veliko otrok predsodke, vezane na strah in gnus, kljub temu pa jih večina ljudi, ki obišče vivarij, želi videti od blizu (Tomažič K., 2008). Pri uporabi plazilcev v izobraževalne namene pri učencih prihaja do osebne rasti in razvoja. Učenci poleg dejstev o plazilcih, klasifikaciji, ekologiji in obnašanju živali uvidijo tudi, kakšno vlogo ima žival v ekosistemu. Učenci so predvsem sposobni sprejeti več bolj kompleksnih informacij. S tem, ko učenec premaga strah, da se živali tudi dotakne, gradi tudi svojo samozavest in samospoštovanje (Kaplan, 1997b). Cilj učenja s plazilci pa je predvsem doseči, da plazilci niso strašni plenilci, ter da si žival ne glede na to, ali je hladnokrvna ali toplokrvna zasluži spoštovanje, ter da je pomembno ohranjanje vseh živalskih vrst in njihovih ekosistemov. Izobraževanja lahko potekajo v različnih okoljih, šolah, parkih in knjižnicah. Vse pogosteje pa se izobraževanje povezuje z zabavo (npr. rojstnodnevna zabava). Na takšnih srečanjih so predstavljene značilnosti plazilcev, razmnoževanje, prehrana in njihovo naravno okolje. Živali za razstave morajo biti dobro prilagojene na ujetništvo, nekatere morajo biti navajene na dotike, predvsem pa je pomembno, da so zdrave (Kaplan, 1997b).

14 5 2.2 ZNAČILNOSTI PLAZILCEV Plazilci (razred Reptilia) so skupina štirinožnih vretenčarjev (oziroma so potomci štirinožnih vretenčarjev), njihova telesna temperatura se prilagaja okolju (poikilotermni organizmi). So prvi kopenski vretenčarji, ki so neodvisni od življenja v vodi, tudi razvoj zarodkov poteka v celoti na kopnem (Mršić, 1997). Plazilci, z izjemo želv, imajo podaljšano telo z okončinami ali brez njih. Jasno je izražen vratni del telesa, na hrbtenici pa so lepo razvidne posamezne regije telesa (vratna, hrbtna, ledvena, križna, repna). Pri kačah, ki nimajo okončin, je prišlo do sprememb v telesnih regijah. Telo plazilcev je zaradi življenja na kopnem zaščiteno z močnim slojem poroženelih in roženih celic na površini povrhnjice, prav tako pa imajo vsi plazilci tudi okostenine v usnjici. Kožne tvorbe (nameščenost in oblika tvorb) so pomemben taksonomski znak za določanje vrste in pripadnost posameznim skupinam. Koža plazilcev je tudi brez žlez, izjema so kuščarji, pri katerih so žleze nameščene na zadnjih nogah, močneje pa so razvite pri samcih. Poroženela plast kože se stalno obnavlja, kjer se odmrli vrhnji sloj ob levitvi odlušči (Tome, 2003). Na glavi plazilcev so dobro razvite oči z vekami, ki so pri kačah in gekonih zrasle v prozorno veko, ki popolnoma prekriva oko. Želve in kuščarji (z izjemo slepcev) imajo dobro razvite okončine, ki so pri morskih želvah preoblikovane v plavuti. Na nogah je po pet prstov z močnimi kremplji. Slepci še imajo v telesu ostanke oplečja in okončin, pri kačah pa so okončine popolnoma pokrnele. Spolni dimorfizem se pri plazilcih kaže predvsem v velikosti in obarvanosti telesa, samice pa so praviloma večje od samcev (Mršić, 1997). Plazilci imajo nestalno telesno temperaturo, ki je odvisna od temperature okolja. Če se temperatura v okolju zniža pod določeno mejo otrpnejo, kar pomeni, da se preneha vsako gibanje, upočasnjeni pa so tudi ostali življenjski procesi. Razširjeni so po vsem svetu, z izjemo severnega in južnega tečaja, ter nad nadmorsko višino 3500 m. Največ vrst pa živi v tropskih krajih (Mršić, 1997). V Sloveniji živi 22 avtohtonih vrst plazilcev in 1 neavtohtona vrsta (želva vrste Trachemys scripta, kamor spadata rdečevratka in rumenovratka) (Krofel, 2009). Na svetu najdemo več kot 6550 živečih vrst plazilcev, ki jih uvrščamo v 4 rede, 48 družin in 905 rodov (Mršič, 1997; Tome, 2003). RED želve (Testudines) luskarji (Squamata) PODRED kritovratke (Cryptodira) vijevratke (Pleurodira) kuščarji (Sauria) kolutniki (Amphisbaenia) kače prakuščarji (Rhynchocephalia) krokodili (Crocodylia)

15 6 2.3 ZDRAVSTVENA TVEGANJA PRI ŽIVALIH - ZOONOZE Zoonoze so bolezni oziroma infekcije, ki se po naravni poti neposredno ali posredno prenašajo od živali na ljudi. Do okužbe lahko pride z neposrednim stikom z okuženo živaljo, zaužitjem kontaminirane hrane, lahko pa tudi s posrednim stikom iz kontaminiranega okolja (Uprava RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin, 2015). V Sloveniji, kjer v programu spremljanja zoonoz in povzročiteljev zoonoz sodeluje več institucij (Uprava za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin RS, Zdravstveni inšpektorat RS in Nacionalni inštitut za javno zdravje), se spremljanje izvaja pri živalih, živilih živalskega izvora, živilih neživalskega izvora in krmi za živali. Že Pačnik (2008) navaja, da se veterinarji v vsakodnevni praksi pogosto srečujejo z eksotičnimi živalmi, med katere uvrščamo ptice, male sesalce, plazilce, dvoživke in tudi druge vrste, njihovo število pa se je v zadnjih letih zelo povečalo. Ptice so lahko prenašalci bakterije Chlamydophila psitaci. Simptomi okužbe pri ljudeh so podobni simptomom gripe, bolezen pa lahko napreduje v hudo pljučnico z možnimi drugimi zapleti. Ljudje se lahko okužijo tudi z bakterijami iz rodu Salmonella sp., pogoste pa so tudi okužbe z mikobakterijami vrste Mycobacterium avium. Med malimi sesalci, kamor veterinarji uvrščajo kunce, morske prašičke, činčile, podgane in druge, so zoonoze zelo številne. Pogoste so različne glivične okužbe, pojavljajo pa se tudi kampilobakterioza, salmoneloza, listerioza in druge bolezni. Tudi plazilci so mnogokrat prenašalci različnih mikrobov, povzročiteljev zoonoz Zoonoze plazilcev V zadnjih letih narašča število plazilcev, ki jih ljudje gojijo kot domače živali. Najpogostejše so želve, pogosti pa so tudi kuščarji in kače. Te živali so lahko videti povsem zdrave, vendar so lahko prenašalci različnih patogenov, ki pod stresnimi pogoji povzročijo infekcijo pri živali, lahko pa pride tudi do prenosa mikrobov na človeka, sploh če lastnik ni podučen o pravilni higieni in negi živali. S plazilcev na človeka se pogosto prenašajo salmonele, mikobakterije, klamidije in klamidofile, ter aeromonasi in pseudomonasi (Ebani in Fratini, 2005). Tako bolane živali kot tiste brez simptomov okužbe, so pogosti prenašalci tudi drugih bakterij. Mednje spadajo Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Proteus spp., in druge (Ebani in Fratini, 2005) Mikobakterioza in klamidofiloza Bakterije rodu Mycobacterium so povzročiteljice mikobakterioz in so prisotne v vodi, prahu in zemlji. Tam lahko plazilci pridejo v stik z njim. Plazilci imajo razvito naravno odpornost proti mikobakterijam, saj se okužba pri njih pojavi zelo redko, oziroma šele takrat, ko je njihov imunski sistem močno načet. Mikobakterije iz plazilcev so potencialno patogene za ljudi, Mycobacterium chelonae in Mycobacterium fortuitum povzročata predvsem bolezni pljuč, lahko pa tudi lokalne okužbe kože, osteomielitis, ter poškodbe mehkega tkiva, Mycobacterium cansasii pa povzroča kronične pljučne bolezni podobne pljučni tuberkulozi (Ebani in Fratini, 2005).

16 7 Klamidofilozo povzročajo obligatni intracelični paraziti, bakterije iz rodu Chlamydophila. Bolezen je razširjena tako pri domačih kot divjih živalih, prisotna pa je tudi pri človeku, pogosto kot atipična pljučnica. Bolezen je bila opažena pri hladnokrvnih živalih, vendar je število okužb verjetno višje, kot navaja literatura, saj kronični znaki bolezni niso vidni, da gre za okužbo živali s temi bakterijami pa ponavadi ugotovimo šele, ko žival pogine (Ebani in Fratini, 2005) Okužbe z aeromonasi in pseudomonasi Bakterije iz rodov Aeromonas in Pseudomonas so po Gramu negativne bakterije, splošno razširjene v okolju in so potencialno patogene za ljudi in živali. Velikokrat jih odkrijejo pri živalih, ki imajo dermatitis, stomatitis, okužbo kloake, ušesno ali dihalno okužbo ter ognojke(ebani in Fratini, 2005) Salmoneloza Salmoneloze so bolezni, ki jih povzročajo bakterije rodu Salmonella. Plazilci se s salmonelo lahko okužijo ob neposrednem stiku z drugo okuženo živaljo ali s hrano. Možna je tudi okužba jajc skozi lupino. Pri želvjih jajcih npr. lahko salmonela že v roku ene ure prodre iz zunanjosti v jajce. Bakterije se zadržujejo v prebavnem traktu živali, znaki okužbe pa največkrat niso vidni, vse dokler pod stresnimi pogoji ne pride do izbruha bolezni. Klinični znaki okužbe s salmonelo so lahko zelo različni. Salmonela lahko povzroči septikemijo, pljučnico, abscese, hipovolemični šok ter smrt pri okuženih živalih (Ebani in Fratini, 2005). Po podatkih je salmonela velikokrat izolirana tako iz plazilcev v ujetništvu, kot iz prosto živečih. Živali, ki ne kažejo kliničnih znakov salmoneloze, ni potrebno zdraviti. Če pa se okužene živali uporabljajo na razstavah ali so v stiku z otroki, jih je potrebno umakniti, ni pa jih potrebno usmrtiti. Potrebno je le ustrezno zdravljenje (Mitchell, 2001). Mitchell (2001) prav tako navaja, da je bila salmonela prvič izolirana iz kuščarja vrste Heloderma suspectum leta 1944, čeprav se navajajo tudi nepotrjene informacije iz leta V skupini petih kuščarjev vrste Heloderma suspectum so 4 živali umrle v roku 18 ur do treh mesecev. V kači, najdeni na puranji farmi so prav tako potrdili prisotnost salmonele, to pa je bil tudi prvi primer, kjer so bili prisotni kar trije različni serotipi salmonel. Prvo poročilo o prisotnosti salmonele pri želvah je potrdilo prisotnost v jetrih, vranici, pljučih in črevesju. O salmonelozi so poročali tudi iz krokodilje farme. Prizadete živali so bile shirane, septikemija pa je privedla do smrti Pogostost okužb s salmonelo pri plazilcih in njen prenos na človeka O prvem primeru prenosa okužbe s salmonelo iz želve na človeka so poročali že leta 1943, pogostost prenosov pa je v naslednjih dvajsetih letih naraščala, težave pa so se pojavljale predvsem pri otrocih. Od leta 1990 se je pogostost s plazilci povezanih okužb dramatično zvišala, kar je posledica vse večje priljubljenosti plazilcev kot hišnih ljubljenčkov (Mitchell, 2001). Po ocenah Centrov za nadzor in preventivo CDC (Centers for Disease Control and Prevention), se v Združenih državah Amerike vsako leto pojavi okrog primerov

17 8 salmoneloze pri ljudeh, ki je povezana s plazilci ali dvoživkami (Center for Food security & Public Health, ). Želve, ter mnogi drugi plazilci, se v živalskih vrtovih lahko prosto gibljejo, saj niso nevarni ljudem. Salmonela pa je zelo odporna in obstojna v okolju, lahko se indirektno prenaša in povzroči okužbo. Znan je primer okužbe v Denverju, kjer je zbolelo veliko otrok, ki so obiskali živalski vrt, okužili pa so se posredno, preko lesene ograde. Kot navaja Bauwens s sod. (2006), so v živalskem vrtu v Antwerpnu v raziskavi zbrali vzorce iz iztrebkov zdravih in bolnih plazilcev, pregledali pa so tudi vzorce iz okolja (ograde, kuhinja, javni prostori). Potrjena je bila prisotnost salmonele v vzorcih iz okolja, prav tako pa so bili sevi bakterije najdeni v 47 (47%) od 100 vzorcev iz iztrebkov. Od skupno 66 sevov, ki so bili serotipizirani jih je 29 (43,9%) predstavljalo vrsto Salmonella enterica subsp. enterica, 3 (4,5) subsp. salamae, 29 (43,9) subsp. arizonae ali diarizonae, 4 (6,1%) subsp. houtenae, pri 1 (1,5%) pa je prišlo do avtoaglutinacije. V istem obdobju so bili testirani tudi vzorci plazilcev in ptic. Ob primerjavi rezultatov je bilo ugotovljeno, da se salmonela pogosteje pojavlja pri hladnokrvnih živalih. Od 91 vzorcev iz živalskega vrta v Rimu in vzorcev zasebnih gojiteljev, ki so bili testirani z uporabo standardnega protokola za izolacijo salmonele iz hrane, jih je bilo kar 46 (50,5%) pozitivnih na salmonelo. S tem je bila potrjena visoka razširjenost sevov salmonele pri plazilcih, zlasti pri kačah in kameleonih, nasprotno pa je bila pri želvah zelo nizka. Večina serotipiziranih sevov je pripadala vrsti Salmonella enterica subsp. enterica (Corrente s sod., 2004). Kljub opozorilom nevarnosti salmoneloze pri ljudeh, ki se pojavlja kot posledica stika s plazilci, število plazilcev gojenih v ujetništvu še vedno narašča. Vzorci iztrebkov in brisov iz kloak, ki so bili zbrani v Braziliji, so v 39,1% vsebovali bakterije iz rodu salmonela (Abalem de sá, Solari, 2001). V Južni Ameriki (Francoska Gvajana) so bili zbrani vzorci prosto živečih plazilcev in plazilcev iz ujetništva. V 23,2 % so živali bile okužene s salmonelo. Isti serotipi (64,3%) pa so bili izolirani tudi pri obolelih ljudeh. Plazilci so lahko vir okužbe in predstavljajo tveganje za javno zdravje, sploh če se ti pogosto pojavljajo v okolici hiš in živine. Nekateri plazilci so tudi hrana ljudem, zato je higiena pri pripravi in higiena v kuhinjah zelo pomembna (Gay, 2014). Tudi Ebani s sod. (2004) poroča o prisotnosti salmonele pri plazilcih. V letih 2001 in 2002 so pri pregledu vzorcev, ki so bili zbrani v trgovini z živalmi v Italiji v 23,93% ugotovili prisotnost sevov Salmonella enterica. Ta se je največkrat pojavila pri kuščarjih (60,27% vseh pozitivnih živali). Prisotnost salmonele v iztrebkih pri želvah je nižja v primerjavi s kuščarji in kačami. Od 38 pregledanih želv je bila salmonela potrjena le v enem primeru, medtem, ko je bilo s salmonelo okuženih kar 61% kuščarjev in 73,8% kač. Najpogostejša je bila Salmonella enterica subsp. enterica, nato pa Salmonella enterica subsp. diarizonae, sta v svoji raziskavi ugotovila Geue in Löschner (2002). Živalski vrtovi imajo pogosto posebne oddelke, kjer potekajo delavnice in izobraževanja, pri katerih obiskovalci pridejo v stik s plazilci. Tako je tudi v živalskem vrtu v Kopenhagnu. Plazilci so razdeljeni v dve skupini, glavno zbirko plazilcev in plazilce, ki so namenjeni izobraževanju in rokovanju. Izmed vseh odvzetih vzorcev iz kloak plazilcev (obe skupini) je bilo 35% živali pozitivnih za salmonelo. Največ ravno na oddelku, kjer s plazilci pridejo v stik tudi obiskovalci. Največ je bilo okuženih kač, sledile so želve, najmanj okuženih osebkov pa je bilo med kuščarji. Izmed vseh serotipiziranih salmonel je prevladovala Salmonella enterica subsp. diarizonae (Hydeskov s sod., 2013).

18 9 Pasmans s sod. (2005) se je v raziskavi osredotočil na kuščarje v ujetništvu. Pregledali so iztrebke in brise iz kloak kuščarjev zasebnih gojiteljev, trgovin s plazilci in iz zoološkega inštituta. Med vzorci, pridobljenimi z brisi, je bilo za salmonelo pozitivnih 62,5%, med vzorci iz iztrebkov pa je bil odstotek salmonele še višji 75,8 %. Vsi serotipi salmonel so predstavljali vrsto Salmonella enterica, prevladovala je Salmonella enterica subsp. enterica. Med leti 1995 in 2006 so na Danskem pregledali plazilce živalskih vrtov, trgovin z živalmi, nekaj pa je bilo tudi zasebnih gojiteljev. Ugotovitve potrjujejo potencialno nevarnost okužb v živalskih vrtovih in tudi doma. Vsi izolati salmonele so pripadali vrsti Salmonella enterica,, največ je bilo Salmonella enterica subsp. enterica, pogosti pa sta bili tudi Salmonella enterica subsp. diarizonae in Salmonella enterica subsp. houtenae (Pedersen s sod., 2009). Pfleger s sod. (2003) je v raziskavo zajel 103 plazilce, pregledani pa so bili njihovi iztrebki. Pri kačah je bila salmonela prisotna v 24%, pri kuščarjih v 17%, ter pri želvah v 3%. Med vsemi izoliranimi salmonelami je prevladovala Salmonella enterica subsp. enterica. Ugotovil je da, četudi je odstotek za salmonelo pozitivnih živali nizek, te še vedno predstavljajo tveganje, zato je pri rokovanju z njimi zelo pomembna higiena. Po navedbah Mermina s sodelavci (2004), okužba s salmonelo pri ljudeh največkrat povzroči drisko, lahko pa se pojavijo tudi hujše zdravstvene težave, kot sta sepsa in meningitis, ki sta za dojenčke ali osebe z oslabljenim imunskim sistemom lahko smrtna. Glavni vir okužbe so še vedno jajca in surovo meso. Pri preučevanju izbruhov bolezni pa se je pokazala tudi povezava okužbe s salmonelo po direktnem ali posrednem stiku s plazilci. Prav okužba preko plazilcev pogosteje pripelje do hospitalizacije. V letih 1996 in 1997 so bili v raziskavo vključeni ljudje, pri katerih je bila potrjena salmoneloza. Vsem so bila postavljena vprašanja o morebitnem stiku s plazilci (lastništvo plazilca, obisk razstave, trgovine z živalmi). S študijo je bilo v teh letih potrjenih kar okužb, ki so bile posledice stika s plazilci, okužbe pa so bile neposredne ali posredne, ker lahko salmonela dolgo preživi v okolju, tudi do 6 mesecev v iztrebkih, ter 6 tednov v vodi. Med leti 1994 in 1996 so v Kanadi opazili povečano število salmoneloz v povezavi s plazilci. Že prej, med leti 1960 in 1970 pa je bilo opaziti porast z želvami povezane salmoneloze, zaradi česar je takrat prišlo do spremembe zakonodaje in tudi do prepovedi uvoza želv v Kanado. V obdobju med 1991 in 1996 je bilo opaženih veliko različnih serotipov salmonel pri eksotičnih živalih, najpogosteje pri želvah in kuščarjih. V istem obdobju so bili pregledani tudi vzorci pri ljudeh. Veliko serotipov je bilo enakih kot pri eksotičnih živalih, prav tako pa so bili med izoliranimi serotipi tudi takšni, ki se praviloma pojavljajo predvsem pri hladnokrvnih živalih (Woodward s sod.,1997). Whitten s sod. (2015) v svoji študiji predstavlja s plazilci povezane okužbe. V anketnih vprašalnikih, ki so služili kot pripomoček za nadaljne raziskave in ki so jih izpolnjevali s salmonelo okuženi bolniki, so bila vključena tudi vprašanja v zvezi s plazilci (stik s plazilci, prehrana plazilca). Med leti 1996 in 2011 je bilo skupno 3,5% okuženih ljudi, ki so potrdili stik s plazilci. Največkrat so bili to kuščarji, nato kače, ali pa kombinacija več plazilcev. V zadnjih letih se je v Severni Ameriki in v Evropi povečalo število okužb ljudi, ki so v povezavi z razstavami živali. Te so vedno pogostejša oblika razvedrila in tudi izobraževanja, saj omogočajo neposreden stik z živalmi. Izbruhe največkrat povzročijo poleg bakterije Salmonella enterica tudi Cryptosporidium parvum in Escherichia coli. Od

19 10 leta 1990 so bili v ZDA vsaj štirje večji izbruhi bolezni, ki so bili posledica razstave živali (Keen, 2007) Preprečevanje prenosa okužb na človeka Odkrivanje in odpravljanje salmonele pri plazilcih ni dovolj učinkovita rešitev za preprečevanje salmoneloze pri ljudeh. Do sedaj je bilo narejenih veliko poskusov, ki bi preprečili širjenje salmoneloze pri plazilcih, vendar neuspešno. V perutninski industriji se proti salmoneli uspešno uporablja cepivo, ki pa je brez učinka pri plazilcih. Do okužbe, ki se prenese s plazilca na človeka ne more priti, če se človek zgolj dotakne plazilca, se pa možnosti za okužbo povečajo, če z delom telesa, ki je bil v stiku s plazilcem sežemo v usta (Gray, 2011). Bauwens (2006) ugotavlja, da je potrebno izboljšati preventivne ukrepe, ter izpostavlja pomen dobre higienske prakse, saj se s tem lahko zmanjša tveganje za prenos okužb. Mnogo ljudi še vedno misli, da se s salmonelo lahko okužijo le preko hrane, ne vedo pa, da je prenos okužbe možen tudi z želvami in kuščarji, ter preko njihove hrane. CDC (2016) opozarja, da si je po rokovanju s plazilci, stikom z njihovim terarijem ali hrano vedno potrebno umiti roke. Pomembno je tudi, da otroci, mlajši od pet let, ljudje z oslabljenim imunskim sistemom, ter odrasli nad petinšestdeset let ne rokujejo s plazilci, saj je pri njih povečano tveganje za okužbo (Radford, 2011). Paziti je potrebno tudi pri stiku s hrano za plazilce ali z njihovimi terariji, če plazilce kopamo je pomembno, da pri tem ne uporabljamo kuhinjskega korita ali umivalnika v kopalnici, temveč imamo v ta namen posodo, ki je ne uporabljamo v druge namene. Plazilcev tudi ne poljubljamo ali si jih stiskamo k obrazu, saj s tem povečamo tveganje za okužbo (CDC, 2016). Pomembno je tudi, da plazilcem ne dovolimo prostih izhodov po kuhinji ali kopalnici, ter da so naše živali zdrave, veterinarsko pregledane, imajo primerno hrano in oskrbo (Gray, 2011). Veterinarji v zasebnih klinikah ali v zooloških inštitucijah imajo pomembno vlogo pri preventivi in osveščanju. Lastniki plazilcev in obiskovalci živalskih vrtov pa morajo biti obveščeni o možnostih tveganja pri rokovanju s plazilci (Mitchell, 2001). 2.4 BAKTERIJE RODU Salmonella Bakterije rodu Salmonella so po Gramu negativne palčke, ki jih uvrščamo v družino enterobakterij (razred gamaproteobakterij). Poimenovane so po ameriškem bakteriologu Danielu Elmer Salmonu. Velikost bakterije se giblje med 0,7-1,5 2,0 5,0 µm. Njene kolonije (slika 1) so okrogle, velike od 2 4 mm. Bakterija je fakultativno anaerobna in gibljiva (s peritrihimi flageli), ima fermentativni in respiratorni tip metabolizma (Garrity s sod., 2005).

20 11 Slika 1: Kolonije bakterije Salmonella enterica subsp. enterica na selektivnem gojišču XLD. (Foto: M. Farkaš) Bakterije so patogene tako za ljudi, kot za živali. Pri ljudeh povzročajo enterično mrzlico, gastroenteritis in septikemijo (Garrity s sod., 2005). Kot navaja Yan s sodelavci (2003) okužba s salmonelo največkrat mine brez večjih zapletov, kljub temu pa se včasih (v manj kot 5% primerov) ne moremo izogniti uporabi antibiotikov, predvsem pri rizičnih skupinah kot so starejši ljudje, bolniki po presaditvah ali z oslabljenim imunskim sistemom in otrocih. Habitat salmonel je omejen predvsem na prebavni trakt pri ljudeh in živalih. Njeno prisotnost v vodi, hrani, ali okolju pa lahko razlagamo kot kontaminacijo z iztrebki. Nekateri serovarji (serotipi) so omejeni na gostiteljske vrste, npr. serovar Salmonella Abortusovis (povzroča splave) je omejen samo na ovce (Wray, 2000). Pri ljudeh so zelo redko odkrite Salmonella enterica subsp. salmae, subsp. arizonae in diarizonae, se pa zelo pogosto pojavljajo v prebavilih hladnokrvnih živali (Garrity s sod., 2005). Pri plazilcih so pogosto ugotovljeni različni serotipi Salmonella enterica subsp. enterica, poleg njih pa najdemo tudi bakterije Salmonella enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica, ter tudi Salmonella bongori. Salmonela se lahko prenaša na ljudi ali druge živali preko iztrebkov. Okuženi ljudje so lahko prenašalci po več mesecev ali celo več kot leto. Preko 90% plazilcev je lahko prenašalcev salmonele, do sedaj pa so pri enem osebku izolirali kar pet različnih serotipov (The Center for Food Security & Public Health, 2013) Klasifikacija Sama klasifikacija salmonel v taksonomski sistem oziroma razdelitev rodu v posamezne vrste je bila že večkrat revidirana in zna biti precej zavajajoča. Po Bergey-u (2005) je rod sestavljen iz dveh vrst Salmonella bongori in Salmonella enterica, ta je razdeljena še v šest podvrst, poimenovanih (ali oštevilčenih); enterica (I), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), indica (VI) in salamae (II). Poleg tega je v veljavi tudi še sistem razdelitve (klasifikacijska shema po White Kauffmann) v različne serotipe (serovare) glede na imunske reakcije z antigeni; K- kapsularni antigen (tudi Vi), H flagelarni antigen in O

21 12 somatski antigen (zunanji polisaharidni del lipopolisaharidov v zunanji membrani po Gramu negativnih bakterij). Issenhuth Jeanjean (2014) v dopolnitvi White Kauffmann in Le Minorjeve sheme poroča o 63 novih serovarih, ki so bili odkriti med leti 2008 in Vrsta Salmonella bongori obsega 22 serovarov, Salmonella enterica pa 2637 serovarov, od tega jih 1586 pripada subsp. enterica, 522 subsp. salamae, 102 subsp. arizonae, 338 subsp. diarizonae, 76 subsp. houtenae ter 13 subsp. indica. Tako je recimo eden od najpogostejših povzročiteljev salmoneloze pri ljudeh sev Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, ki ga krajše označujemo kot Salmonella Enteritidis. Salmonella Enteritidis je tudi najpogosteje izolirana iz jajc, medtem, ko so s Salmonella Choleraesuis pogosto okuženi prašiči (Yan, 2003). Serovari iz vrste Salmonella bongori so največkrat najdeni v okolju, pogosto pa so izolirani tudi iz hladnokrvnih živali, medtem, ko se pri sesalcih in pri ljudeh zelo redko pojavijo (Yan, 2003). Leta 2004 je bila predlagana še tretja vrsta rodu Salmonella, S. subterranea (Shelobolina s sod., 2004) Virulentni dejavniki Kot virulenco definiramo sposobnost organizma, da povzroči bolezen v določenem gostitelju (Johnson, 1991). Salmonele vsebujejo veliko genov za virulenco. Mnogo teh genov se nahaja na tako imenovanih otokih patogenosti (SPI Salmonella pathogenicity islands) na njihovem kromosomu. Otoki patogenosti imajo zapise za določene dejavnike virulence, ki so ključni za patogenezo bakterije (Marcus s sod., 2000). Virulentni dejavniki, ki so kodirani na SPI 1, so odgovorni za vstop bakterije v gostitelja, na SPI 2, 3 in 4 pa so zapisi za virulentne dejavnike, ki omogočijo razmnoževanje in preživetje salmonele v gostitelju. Virulentni dejavniki, kodirani na SPI 5 se vključujejo v fazo vnetja. Poleg kromosoma se geni za virulentne dejavnike nahajajo tudi na plazmidih, kjer najdemo npr. gene spvrabcd. Produkte teh genov bakterije potrebujejo za rast in preživetje znotraj makrofagov (Kastelec in Harlander, 2006). Geni spv so pomembni za razmnoževanje bakterij v gostiteljskih celicah. Gen spvc se nahaja na plazmidu povezanim z virulenco, njegov produkt ima fosfotreoninliazno aktivnost. Lahko inaktivira z mitogenom-aktivirane protein kinaze (MAPK) Erk 1/2, JNK in p38 v človeških celicah (Ibbara in Steele Mortimer, 2009; Kaur in Jain, 2011). Virulentni dejavniki, kodirani na SPI 1, so odgovorni za vdor salmonele v črevesne celice in pojav driske. Na SPI 1 se nahajajo geni sipa, sipb, sopa, sopb, sopc, sopd, sope, sptp in inva. SopB je fosfoinozitid fosfataza, ki hidrolizira fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfat v fosfatidilinozitol-3-fosfat, ter tako spodbuja reorganizacijo aktinskega citoskeleta, izločanje Cl - in preoblikovanje plazmaleme gostiteljske celice (Ibbara in Steele Mortimer, 2009; Kaur in Jain, 2011). Produkt gena inva pa je strukturni protein sekrecijskega sistema tipa III (T3SS1), ki je vključen v vdor salmonele v celice črevesnega epitelija (Hur s sod., 2011). Na SPI 2 so geni spic, ssef, sseg, sifa, sifb in drugi, ki omogočajo preživetje salmonele v gostiteljski celici in sistemske okužbe. SifA je potreben za integriteto membrane salmonele-vsebujoče vakuole (SCV; Salmonella-containing vacuole) in za tvorbo s salmonelo-induciranih filamentov (SIF). Tvorba teh je nujna za razmnoževanje salmonele v gostiteljski celici (Kaur in Jain, 2011).

22 Odpornost proti antibiotikom Antibiotiki so naravne učinkovine, ki jih proizvajajo glive ali bakterije. Na mikroorganizme delujejo tako, da zavirajo njihovo rast in razmnoževanje, delujejo bakteriostatično, ali povzročijo propad celice oziroma imajo baktericidno delovanje. S pojmom protimikrobna učinkovina pa označujemo tako naravne, kot tudi sintetične snovi, ki prav tako delujejo bakteriostatično ali baktericidno. Danes se izraza velikokrat ne ločujeta več, predvsem v splošni rabi se uporablja izraz antibiotik, tudi kadar govorimo o sintetičnih snoveh (Madigan in Martinko, 2006; Reeves, 2012). Antibiotike delimo v več skupin, npr. aminoglikozidi, beta-laktamski antibiotiki, tetraciklini, kinoloni in drugi. Streptomicin se uvršča med aminoglikozidne antibiotike, ki se vežejo na ribosomsko podenoto 30S. Tudi tetraciklin deluje baktericidno tako, da inhibira sintezo proteinov z vezavo na ribosomsko podenoto 30S. Kloramfenikol pa se veže na ribosomsko podenoto 50S. Beta-laktamski antibiotiki se na podlagi njihove kemijske strukture nadalje delijo v skupine, vsem pa je skupen beta-laktamski obroč in delovanje zavirajo sintezo celične stene. Delimo jih na peniciline (npr. penicilin, ampicilin), cefalosporine (npr. ceftazidim, cefotaksim), karbapeneme (npr. imipenem, ertapenem), monobaktame (npr. aztreonam) in inhibitorje beta-laktamaz (npr. klavulanska kislina). Uporabljajo se tako v veterini, kot v medicini. Kinoloni so skupina sintetičnih antibiotikov, glede na razvoj jih delimo v štiri generacije, predstavnik prve generacije je na primer nalidiksična kislina, druge generacije pa norfloksacin in v humani medicini najpogosteje uporabljan kinolon ciprofloksacin. Tako kot beta-laktamski antibiotiki se tudi kinoloni uporabljajo v veterini in medicini, zavirajo pa delovanje topoizomeraz tipa II (DNA-giraze pri Gram-negativnih bakterijah, topoizomeraze IV pri Gram-pozitivnih bakterijah). Fluorokinoloni (pogosto uporabljen je ciprofloksacin), uspešno delujejo proti Gram negativnim bakterijam (npr. Escherichia coli, Enterobacter, Salmonella) (Reeves, 2012). Odpornost bakterij proti protimikrobnim sredstvom ni fenomen našega stoletja ali posledica industrializacije, temveč gre za naraven ekološki pojav, v katerem mikroorganizmi tekmujejo med sabo, kar je privedlo tudi do razvoja obrambnih mehanizmov. Kot pravi Helmuth (2000) antibiotiki, ki so danes v uporabi, vplivajo tako na biokemijske, kot tudi na fiziološke procese v prokariontskih celicah. S splošno uporabo protimikrobnih sredstev je bil pojav odpornosti opažen skoraj pri vseh bakterijskih vrstah in proti vsem sredstvom, ki so na voljo (Helmuth, 2000). Problem odpornosti bakterij proti antibiotikom se v zadnjih letih povečuje in predstavlja večje tveganje za javno zdravje. Med leti 1989 in 1990 je bilo kar 29% izolatov salmonel odpornih proti vsaj eni protimikrobni učinkovini. Pri salmoneli je zaskrbljujoč tudi podatek o večkratni odpornosti, ki je bila opažena proti ampicilinu, kloramfenikolu, streptomicinu in tetraciklinu (Yan s sod., 2003). Znani so različni načini, s katerimi si bakterije zagotovijo odpornost proti antibiotikom. Salmonela je tako zaradi svoje Gram negativne celične stene odporna proti vankomicinu, ki s svojimi velikimi molekulami ne more prodreti v celico. Salmonela lahko proizvede tudi določene encime, s katerimi vpliva na antibiotike, velikokrat pa je odpornost proti antibiotikom posledica mutacij tarčnih mest (Yan s sod., 2003). Odpornost proti antibiotikom bakterijam omogočajo tudi plazmidi, do večkratne odpornosti pa lahko pride ob pretirani uporabi antibiotikov v bolnišnicah, ali če se antibiotiki dodajajo v živalsko krmo. Tako je serovar Typhi okrog 1990 razvil odpornost proti že poznanim antibiotikom (Garrity s sod., 2005).

23 14 Odpornost salmonele proti antibiotikom je moč zaznati predvsem v razvitejšem svetu, medtem ko so raziskave ruralnih območij in divjine pokazale zelo nizko odpornost. Odpornost proti kinolonom, še posebno fluorokinolonom, je bila opažena že leta 1980, od takrat pa se pojavlja vedno pogosteje, kar je zaskrbljujoče, saj fluorokinolone uvrščamo med novejše antibiotike, ki so v splošni uporabi tako v medicini, kot tudi veterini. Tako so zabeležena poročila o vse manjši občutljivosti za ciprofloksacin in nalidiksično kislino (Helmuth, 2000). Domače živali, vključno s plazilci, so se pokazale kot možen vir okužbe s salmonelo, število teh pa se v zadnjih letih povečuje. Žal pa je le malo podatkov o odpornosti bakterij, izoliranih iz plazilcev, proti antibiotikom. Tako so na Tajvanu v študijo med leti 2005 in 2006 zajeli plazilce iz živalskega vrta, trgovin z malimi živalmi in z univerze. Salmonela je bila potrjena pri 30,9 % živali. Prevladovale so kače, sledili so kuščarji, najmanj okuženih pa je bilo želv. Serotipizirane salmonele so bile odporne proti antibiotikom, 6,9% je bilo odpornih na 4 ali več antibiotikov. Največ sevov je bilo odpornih proti streptomicinu (14,7%) in tetraciklinu (9,2%). Odpornost proti nalidiksični kislini so zaznali samo pri želvah. Zaznana je bila tudi odpornost proti ampicilinu (6,9%), medtem ko odpornosti proti ciprofloksacinu in norfoksacinu ni bilo (Chen s sod., 2010). Corrente s sod. (2004) je že pred tem potrdil odpornost salmonel, izoliranih iz plazilcev, proti streptomicinu (32,6%), tetraciklinu (19,6%), ampicilinu (17,4%) ter tudi odpornost sevov proti nalidiksični kislini (13,1%). O odpornosti proti klavulanski kislini, ceftazidimu in ciprofloksacinu ne poroča. Ebani s sod. (2005) je prav tako potrdil antibiotično odpornost salmonel, izoliranih iz plazilcev. Med izoliranimi sevi so bili vsi odporni vsaj na en antibiotik ali več. Veliko je bilo odpornih proti ampicilinu (27,4%) medtem, ko so vsi sevi razen enega pokazali občutljivost za kloramfenikol, ter v 75,34% tudi za tetraciklinu Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom in kinolonom Odpornost proti beta-laktamskim antibiotikom je lahko posledica prisotnosti encima betalaktamaze. Ta encim prekine beta-laktamski obroč tako, da cepi amidno vez. Nekatere Gram - negativne bakterije so zaradi svoje lipopolisharidne zunanje membrane naravno odporne proti beta-laktamskim antibiotikom (Reeves, 2012). Beta-laktamaze lahko delimo na podlagi njihovih fenotipskih lastnosti ali na podlagi molekularnega razvrščanja, torej na podlagi nukleotidnega ali aminokislinskega zaporedja encimov. Nekatere beta-laktamaze posredujejo odpornost tudi proti tretji in četrti generaciji cefalosporinov (ceftazidim, cefotaksim). To so beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja (Extended-Spectrum Beta Lactamases) ali krajše ESBL (Bush s sod, 1995; Samaha Kfuory in Araj, 2003). ESBL nadalje delimo v več skupin. V skupino CTX M so uvrščeni encimi, ki najverjetneje izhajajo iz bakterij rodu Kluyvera in so se prenesli na plazmide drugih bakterij, geni za beta-laktamaze CTX M se najpogosteje nahajajo na konjugativnih plazmidih. Beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja skupine CTX M sodijo med najbolj razširjene in so najpogostejši vzrok odpornosti enterobakterij proti cefalosporinom (Bonnet, 2004). Razvrščamo jih v 5 podskupin (CTX- M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 in CTX-M-25) (Woodford, 2010). Odpornost bakterij proti kinolonom se povezuje predvsem z njihovo pretirano uporabo. Odpornost proti njim nastaja zaradi mutacij v nukleotidnih zaporedjih kromosomskih genov za DNA-girazo ali topoizomerazo IV (topoizomeraze tipa II). Do odpornosti lahko

24 15 privedejo tudi spremembe v izražanju različnih membranskih črpalk in porinov, ki uravnavajo akumulacijo antibiotika v celici. Identificirali so tudi tretjo obliko odpornosti,. Gre za prenosljive gene na plazmidih, ki posredujejo nizko raven odpornost proti kinolonom in fluorokinolonom. To tretjo skupino genov označujemo kot gene za plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco ali krajše PMQR (plasmid-mediated quinolone resistance). Med njimi so tudi tako imenovani geni qnr, ki kodirajo proteine iz pentapeptidnih ponovitev, le-ti se vežejo in tako zaščitijo topoizomeraze tipa II pred inhibicijo s kinoloni. Poznanih je več različic genov qnr: qnra, qnrb, qnrs, ter qnrc in qnrd (Robicsek s sod., 2006; Reeves, 2012; Jacoby, 2005).

25 16 3 MATERIAL IN METODE 3.1 IZOLACIJA BAKTERIJ RODU Salmonella IZ PLAZILCEV VZORCI Vzorce, iz katerih smo izolirali bakterije, smo zbirali od marca 2010 do februarja Zbirali smo iztrebke in vzorce brisov iz kloak (slika 2) plazilcev zasebnih gojiteljev, v raziskavo pa smo zajeli tudi nekaj šol in visokošolskih zavodov iz Ljubljane in okolice. Slika 2: Odvzem brisa iz kloake pri kraljevem pitonu (Foto: M. Turk) NAČRT DELA Bakterije smo iz iztrebkov in brisov najprej izolirali in identificirali po normativu, ki se uporablja v mikrobiologiji živil in krme za ugotavljanje vrst rodu Salmonella (ISO standard 6579:2002). Ker pa smo ugotovili, da so rezultati zadovoljivi tudi s krajšim postopkom, smo kasneje metodo priredili tako, da smo sveže iztrebke resuspendirali (oziroma vatenke z brisi potopili) v gojišču BPW in jih stresali pri 37 ºC in 200 obratih/min eno uro ter s tem skrajšali čas predbogatitve za 17 ur, nato pa smo zopet sledili prej omenjenemu postopku (slika 3). Gojišča, ki smo jih uporabili v postopku izolacije in identifikacije smo pripravljali sami. Uporabili smo recepte iz mednarodnega standarda ((ISO standard 6579:2002, gojišči BPW in MKTT). Preostale recepte za gojišča pa smo povzeli po bakteriološkem priročniku (Gerhardt s sod., 1994).

26 17 PREDBOGATITEV 1 g (1ml) vzorca ali vatenka - bris + 9 ml BPW 1 ura, 37 C, stresanje 200 obratov/min BOGATITEV 1 ml suspenzije vzorca v BPW + 9 ml MKTT 24 ur, 37 C, stresanje 200 obratov/min SELEKTIVNA IZOLACIJA 10 μl suspenzije vzorca na selektivno gojišče XLD ali SSA 24 ur, 37 C IZOLACIJA ČISTE KULTURE IDENTIFIKACIJA Z BIOKEMIJSKIMI TESTI MOLEKULARNO BIOLOŠKA IDENTIFIKACIJA NA OSNOVI ZAPOREDJA GENA ZA 16S rrna Slika 3: Prikaz postopka izolacije in identifikacije salmonel iz iztrebkov/brisov kloak plazilcev.

27 18 GOJIŠČA IN GOJENJE Predbogatitev PEPTONSKA VODA (BUFFERED PEPTONE WATER - BPW) Kazein hidrolizat Natrijev klorid (NaCl) Dinatrijev hidrogen fosfat dodekahidrat (Na2HPO4 12H20) Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) Destilirana voda 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g 1000 ml Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi ob rahlem segrevanju. ph smo umerili na 7,0 z 1M NaOH in raztopino razdelili v infuzijske stekleničke. Avtoklavirali smo 15 min pri 121 ºC. GOJENJE Iztrebke ali vatenke z brisi smo dali v epruvete, jih označili, ter dodali BPW v razmerju 1:10. Kjer smo imeli iztrebke resuspendirane v vodi smo vzeli 1 ml suspenzije iztrebka in dodali 9 ml BPW. Vzorce smo dobro premešali s pomočjo vibracijskega mešala, da so se čim bolj resuspendirali, nato pa smo epruvete z vzorci stresali pri 37 C in 200 obratih/min približno 1 uro (slika 3) Bogatitev Gojišče MKTT (MULLER KAUFFMANN TETRATHIONAT NOVOBIOCIN) Osnovno gojišče: Mesni ekstrat Encimatsko razgrajen kazein Natrijev klorid (NaCl) Kalcijev karbonat (CaCO3) Natrijev tiosulfat pentahidrat (Na2S2O3 5H2O) Soli žolčnih kislin (Oxbile) Barvilo Brilliant green Destilirana voda 4,3 g 8,6 g 2,6 g 38,7 g 47,8 g 4,78 g 9,6 g 1000 ml Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, tako da je raztopina vrela 5 minut. Nato smo umerili ph na 8,2 z 1M NaOH.

28 19 Raztopina joda in jodida: Jod Kalijev Jodid (KI) Destilirana voda 20,0 g 25,0 g 100 ml Popolnoma smo raztopili kalijev jodid v 10 ml sterilne destilirane vode, nato smo dodali jod in dolili sterilno destilirano vodo do 100 ml. Raztopine nismo avtoklavirali. Raztopina novobiocina: Novobiocin - kalcijeva sol Destilirana voda 0,04 g 5 ml Novobiocin smo raztopili v destilirani vodi, nato pa raztopino sterilizirali s filtracijo Sestava celotnega gojišča: Osnovno gojišče Raztopina joda in jodida Raztopina novobiocina 1000 ml 20 ml 5 ml V osnovno gojišče smo sterilno dodali 5 ml raztopine novobiocina in dobro premešali, nato smo dodali še 20 ml raztopine joda in jodidater ponovno dobro premešali. Po 9 ml gojišča smo nato razdelili v sterilne epruvete. GOJENJE V vsako epruveto smo dodali po 1 ml gojišča BPW s kulturo iz predbogatitve. Zopet smo dobro premešali, ter epruvete 24 ur inkubirali ob stresanju 200 obratov/min pri temperaturi 37 C (slika 3). Slika 3: Predbogatitev vzorcev iztrebkov v gojišču BPW (epruvete na levi) in bogatitev vzorcev v gojišču MKTT (epruvete na desni) (Foto: M. Turk)

29 Selektivna izolacija salmonel v čisti kulturi Za selektivno izolacijo salmonel iz vzorcev smo uporabili selektivni in diferencialni trdni gojišči agar Salmonella Shigella ter ksiloza lizin deoksiholatni agar. Gojišče SSA (SALMONELLA SHIGELLA AGAR) Goveji ekstrakt Pepton Laktoza Barvilo Brilliant green Nevtralno rdeče Natrijev deoksiholat Natrijev tiosulfat Železov citrat Natrijev citrat Agar Destilirana voda 5 g 5 g 10 g 0,33 g 0,08 g 8 g 8,5 g 1 g 8,5 g 15 g 1000 ml Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, ph umerili na 7,5 z 1M NaOH in segrevali dokler gojišče ni zavrelo. Nato smo gojišče razlili na sterilne petrijeve plošče. Gojišče XLD (KSILOZA LIZIN DEOKSIHOLATNI AGAR) Ksiloza L lizin Laktoza Saharoza Natrijev klorid (NaCl) Kvasni ekstrat Fenol rdeče Natrijev deoksiholat Natrijev tiosulfat Železov amonijev citrat Agar Destilirana voda 3,5 g 5 g 7,5 g 7,5 g 5 g 3 g 0,08 g 2,5 g 6,8 g 0,8 g 15 g 1000 ml Kemikalije smo raztopili v destilirani vodi, ph umerili na 7,4 z 1M NaOH in segrevali do vretja. Gojišče smo nato razlili v sterilne petrijeve plošče. GOJENJE Po 24 urah smo pregledali vzorce, ki smo jih bogatili v gojišču MKTT, ter iz vsake epruvete s plastično ezo nacepili po 10 μl kulture na selektivni gojišči SSA in XLD. Plošče smo inkubirali 24 ur pri 37 C. Po končani inkubaciji smo pregledali selektivna gojišča, ter na njih označili kolonije, ki bi po obliki in barvi lahko predstavljale salmonelo (prosojne brezbarvne kolonije s ali brez črnega centra na agarju SSA (slika 4), rožnate kolonije (laktoza pozitivne) s ali brez črnega centra na agarju XLD (slika 1 in 4).

30 21 Slika 4: Mešana kultura s kolonijami potencialnih salmonel na selektivnih in diferencialnih trdnih gojiščih XLD (levo, rožnate kolonije s črnim centrom) in SSA (desno, prosojne kolonije s črnim centrom). Vcepek je bil bogatitvena kultura iztrebkov v gojišču MKTT. Za izolacijo čiste kulture smo uporabljali že prej omenjeni selektivni in diferencialni gojišči SSA in XLD, ter osnovno gojišče hranilni agar. Gojišče HRANILNI AGAR Hranilna juha (nutrient broth) Natrijev klorid (NaCl) Agar Destilirana voda 8 g 5 g 15 g 1000 ml Kemikalije (razen agarja) smo raztopili, gojišče avtoklavirali 15 min pri 121 ºC in ga sterilno razlili v petrijeve plošče. GOJENJE Iz selektivnih gojišč SSA in XLD, na katerih smo označili kolonije, ki bi lahko potencialno bile salmonele, smo nato le-te izolirali v čisti kulturi. Posamezno kolonijo smo precepili naprej na selektivno gojišče, po 24-urni inkubaciji pri 37 C pa na hranilni agar. Če kultura ni bila čista smo postopek ponovili. 3.2 IDENTIFIKACIJA BAKTERIJ RODU Salmonella IZ PLAZILCEV Za identifikacijo izoliranih bakterij smo uporabili izbor biokemijskih testov, s katerimi lahko razlikujemo salmonele od ostalih sorodnih enterobakterij (ISO standard 6579:2002, Gerhardt s sod., 1994). Fenotipsko identifikacijo pa smo potrdili še z genotipsko identifikacijo na osnovi delnega nukleotidnega zaporedja gena za 16S rrna. Za vse čiste kulture domnevnih izolatov salmonel smo naredili preparat in ga barvali po Gramu, nato smo izvedli različne biokemijske teste, tako smo dobili njihove delne fenotipske profile in jih na osnovi teh rezultatov identificirali s pomočjo Bergeyevega priročnika determinativne bakteriologije (Holt s sod., 1994). V začetku testiranja smo uporabili več različnih biokemijskih testov, kasneje pa smo jih nekaj opustili. Za te izbrane seve, prepoznane kot

31 22 salmonele, smo nato identifikacijo potrdili še s pomočjo njihovega nukleotidnega zaporedja gena za 16S rrna Fenotipska identifikacija z biokemijskimi testi CITRATNI TEST S citratnim testom ugotavljamo sposobnost mikroorganizmov, da uporabljajo citrat kot edini vir ogljika. Mikroorganizem, ki lahko uporablja citrat, bo uporabljal amonijevo sol kot vir N in ob tem sproščal amonijak, zaradi česar gojišče postane alkalno, kar se odraža v spremembi barve indikatorja. Rezultat je pozitiven, če opazimo spremembo barve iz zelene v modro, negativen pa, kadar ni spremembe barve in rasti. Natrijev klorid (NaCl) MgSO4 NH4H2PO4 Na3C6H5O7 2H2O KH2PO4 Bromtimol modro (0,2 odstotna raztopina) Agar Destilirana voda 5 g 0,2 g 1 g 5 g 1 g 40 ml 20 g 1000 ml Sestavine smo raztopili v destilirani vodi, umerili ph na 6,8, ter razdelili v srednje epruvete v vsako po 3,5 ml. Epruvete smo avtoklavirali in pripravili poševna gojišča. V epruvete s poševnim gojiščem smo nacepili kolonijo, ter inkubirali za 4 dni pri 37 C. Pri nacepljanju smo pazili, da s cepilno zanko nismo prenašali hranil iz drugih gojišč, ter s tem vplivali na rezultate testa. INDOLNI TEST Z indolnim testom ugotavljamo razgradnjo triptofana do indola, ki ga lahko razgrajujejo bakterije z encimom triptofanazo. To ugotavljamo z aldehidnim reagentom (Kovacsev reagent), ki reagira z indolom, tako dobimo obarvan produkt. Rezultat je pozitiven, če je indikator na vrhu gojišča rdeč (rdeč obroč) in negativen, če je rumen. Pepton (tripton 10 g ali casiton 15 g) NaCl Destilirana voda 20 g 5 g 1000 ml Sestavine smo natehtali in raztopili v destilirani vodi, umerili ph na 7,2 in gojišče razdelili v majhne epruvete po 5ml in avtoklavirali. Indikator: Kovascev reagent para-dimetilaminobenzaldehid izoamil alkohol koncentrirana HCl 3 g 75 ml 25 ml

32 23 V tekoče gojišče smo nacepili kolonijo, nato inkubirali 24 ur pri 37 C. Po inkubaciji smo v vsako epruveto dodali 3 kapljice Kovacsevega reagenta, rahlo pretresli ter spremljali pojav rdečega obroča na vrhu gojišča. TEST LDC Ugotavljamo prisotnost encima lizin dekarboksilaze, ki dekarboksilira aminokislino lizin, pri čemer nastanejo bazični amini. Rezultat je pozitiven, če se gojišče obarva vijoličasto in negativen, če ne spremeni barve. Če se spremeni tudi barva v kontrolni epruveti, je potrebno teste ponoviti. Pepton Mesni ekstrat Piridoksal Glukoza Bromkrezol modro 1-odstotna raztopina Destilirana voda 5 g 5 g 5 mg 0,5 g 0,625 ml 1000 ml Sestavine smo zatehtali in raztopili v destilirani vodi, umerili ph na 6,0 ter gojišče avtoklavirali. Ločeno smo pripravili aminokislino lizin v 10-odstotni koncentraciji (10 g L- lizin hidroklorida raztopimo v 100 ml destilirane vode) in raztopino sterilno prefiltrirali. V osnovno gojišče smo sterilno dodali raztopino lizina (100 ml na 900 ml osnovnega gojišča, končna koncentracija 1-odstotna), razdelili v sterilne majhne epruvete, v vsako po 2.5 ml in prekrili s sterilnim mineralnim oljem. Pripravili smo tudi kontrolne epruvete brez dodane aminokisline. Nacepili smo tekoče gojišče z aminokislino in kontrolno gojišče brez aminokisline, ter inkubirali 4 dni pri 37 C, ob dnevnem spremljanju sprememb. TEST OF S tem testom ugotavljamo, ali bakterija razgrajuje ogljikove hidrate po oksidativni, ali po fermentativni poti. Sprememba barve iz zelene v rumeno da pozitiven rezultat. Test vedno izvajamo v dveh epruvetah, ena je pokrita z mineralnim oljem (F anaerobna), druga ne (O aerobna) Pepton Natrijev klorid (NaCl) K2HPO4 Agar Bromtimol modro 1- odstotna vodna raztopina Destilirana voda 2 g 5 g 0,3 g 3 g 3 ml 1000 ml Raztopili smo sestavine, ter umerili ph na 7,2. Po avtoklaviranju smo dodali sladkor (najpogosteje glukozo, pripravili smo 10-odstotno raztopino sladkorja v destilirani vodi in jo sterilno prefiltrirali) do končne koncentracije 1% in razdelili po 3-4 ml v male sterilne epruvete. Polovico epruvet smo prekrili s sterilnim mineralnim oljem.

33 24 Kolonije smo vbodno nacepili v gojišče prekrito z mineralnim oljem, kjer smo ugotavljali fermentativno razgradnjo škroba (F) in v gojišče brez mineralnega olja, kjer smo ugotavljali oksidativno razgradnjo škroba (O). Inkubirali smo 24 ur pri 37 C, nato pa ugotavljali spremembo barve. Sprememba v epruveti O oksidativna razgradnja sladkorja, sprememba v obeh epruvetah fermentativna razgradnja sladkorja, ni spremembe v epruvetah ni razgradnje sladkorja. OKSIDAZNI TEST Uporabljamo ga za ugotavljanje prisotnosti encima citokrom c oksidaze, ki lahko oksidira dodani akceptor elektronov tetrametil-p-fenilen diamin dihidroklorid, ta se ob tem obarva. Rezultat je pozitiven, če se kultura, ki smo jo nanesli na reagent, po 10 do 15 sekundah obarva intenzivno modro, negativen pa kadar se kultura ne obarva. Oksidazni reagent: 1-odstotna raztopina tetrametil-p-fenilen diamina v DMSO Na košček sterilnega filter papirja smo kapnili malo oksidaznega reagenta in nanj s lesenim zobotrebcem ali plastično cepilno zanko nanesli kolonijo. Spremljali smo spremembo barve. KATALAZNI TEST Katalazni test uporabljamo za ugotavljanje prisotnosti encima katalaze, ki katalizira reakcijo pretvorbe dveh molekul vodikovega peroksida do vode in kisika. Rezultat je pozitiven, če ob nanosu kulture v vodikov peroksid opazimo mehurčke kisika, ter negativen, če teh ni. Reagent: 3-odstotni vodikov peroksid v destilirani vodi Na objektno steklo smo kanili kapljico vodikovega peroksida, ter vanjo s cepilno zanko vnesli kulturo, rahlo pomešali in opazovali reakcijo. TEST ONPG Z ONPG ugotavljamo prisotnost encima β-galaktozidaze, ki cepi laktozo in druge β- galaktozide. Rezultat testa je pozitiven, če se gojišče obarva rumeno, če pa ostane brezbarvno, je negativen. 1. Raztopina ONPG ONPG (orto-nitrofenil- galaktopiranozid) Na fosfatni pufer; 0,01 M, ph 7,5 0,6 g 100 ml

34 25 2. Peptonska voda, 1-odstotna Pepton Natrijev klorid (NaCl) Destilirana voda 1 g 0,5 g 100 ml Naredili smo raztopino ONPG in jo sterilno filtrirali. Pripravili smo še peptonsko vodo ter jo avtoklavirali. Sterilno smo dodali 1 del raztopine ONPG v 3 dele peptonske vode. Raztopino smo razdelili v sterilne male epruvete, v vsako po 1,5 ml. V peptonsko vodo z ONPG smo s cepilno zanko vnesli kulturo. Nato smo inkubirali 24 ur pri 37 C, ter nato opazovali spremembo barve raztopine. TEST TSI (trojni sladkor z železom) S tem testom ugotavljamo fermentacijo glukoze, laktoze in saharoze ter produkcijo H2S. Ob fermentaciji sladkorjev nastanejo kisline, zato se ph gojišča zniža in barva indikatorja se spremeni iz rdeče v rumeno. Rezultat: Kislo dno RUMENO Kisla poševna ploskev RUMENA Glukoza + Laktoza + in/ali saharoza + Kislo dno RUMENO Alkalno dno RDEČE Alkalna poševna ploskev RDEČA Alkalna poševna ploskev RDEČA Glukoza + Laktoza- Saharoza- Glukoza- Laktoza- Saharoza- Produkcijo H2S opazimo kot temno obarvano dno gojišča. Produkcijo plina ob fermentaciji opazimo kot dvig gojišča z dna epruvete ali razpoke v gojišču. Mesni ekstrat Kvasni ekstrat Pepton Laktoza Saharoza Glukoza Železov (III) amonijev citrat Natrijev klorid (NaCl) Natrijev tiosulfat Agar Fenol rdeče 3 g 3 g 20 g 10 g 10 g 1 g 0,3 g 5 g 0,3 g 12,5 g 0,024 g

35 26 Komponente smo raztopili v destilirani vodi, uravnali ph na 7.3, segreli, da smo raztopili agar in razdelili v srednje epruvete, v vsako po 4 ml, ter avtoklavirali. Po avtoklaviranju smo epruvete naložili na poševno stojalo, da smo dobili poševna gojišča. Na poševno gojišče smo nacepili kulturo od zgoraj navzdol, nato pa s cepilno zanko zabodli še v dno gojišča. Po urah inkubacije pri 37 C smo odčitali rezultate. VOGES-PROSKAUERJEV TEST Uporabljamo ga za dokazovanje butandiolske fermentacije glukoze, kjer nastanejo nevtralni produkti kot je acetoin. Rezultat je pozitiven, če se ob dodatku reagentov v zgornjem delu gojišča razvije rožnato rdeča barva, negativen pa, če ni spremembe barve. K2HPO4 Pepton Glukoza Destilirana voda 0,5 g 0,5 g 0,5 g 100 ml Sestavine smo raztopili v destilirani vodi, ter umerili ph na 7,5. Raztopino smo razdelili v male epruvete, v vsako po 2 ml in avtoklavirali. Indikator: 40-odstotni KOH, 5-odstotni α naftol v 96-odstotnem etanolu V epruvete z gojiščem smo nacepili kulturo, ter inkubirali 48 h pri 37 C. Nato smo najprej dodali štiri kapljice α naftola v 96-odstotnem etanolu, nato pa še dve kapljici KOH. Spremljali smo spremembo barve. UREAZNI TEST (po Christensenu) Ugotavljamo prisotnost encima ureaze, ki cepi ureo do amoniaka. Rezultat je pozitiven, če se gojišče obarva rožnato, negativen pa, če sprememb v barvi ni Pepton Natrijev klorid (NaCl) Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) Glukoza Fenol rdeče (2-odstotna raztopina) Agar Destilirana voda Urea Destilirana voda 1g 5 g 2 g 1 g 6 ml 20 g 900 ml 20 g 100 ml

36 27 Zatehtali smo sestavine, ki so navedene pod 1. (brez agarja), jih raztopili v destilirani vodi, ter umerili ph na 6,9 in dodali agar. Raztopino smo avtoklavirali. Zatehtali smo še ureo in jo raztopili v destilirani vodi, jo sterilno filtrirali in dodali v raztopino po avtoklaviranju (končna koncentracija uree v gojišču je 2-odstotna). Gojišče smo razdelili v epruvete, v vsako po 1 ml. Na poševna gojišča smo nacepili kulturo, inkubirali 24 ur pri 37 C, nato pa odčitali rezultate Genotipska identifikacija na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rrna IZOLACIJA DNA Reagenti: PrepMan Ultra Samle Preparation Reagent (Thermo Fischer Scientific) Štiriindvajseturne čiste kulture izolatov smo uporabili za izolacijo DNA. V 1,5 ml centrifugirko po Eppendorfu smo dali 30 μl reagenta ter vanjo vnesli po eno kolonijo kulture. Celice smo resuspendirali v reagentu na vibracijskem mešalu in jih kuhali 15 minut, jih nato ohladili, sledilo pa je 10-minutno centrifugiranje pri g in sobni temperaturi. Po centrifugiranju smo v nove centrifugirke odpipetirali supernatant, ki je predstavljal našo matrično DNA. Do verižne reakcije s polimerazo smo supernatant shranili pri -20 C. PCR verižna reakcija s polimerazo Za celokupno 50 μl reakcijo za PCR smo na ledu pripravili mešanico reagentov (velja za eno reakcijo): 10 polimerazni pufer z MgCl2 (Thermo Fischer Scientific) 5 μl 10 mm dntp (mešanica deoksiribonukleotidov, Applied 0,5 μl Biosystems) 10 mm oligonukleotidni začetnik 27F 0,5 μl 10 mm oligonukleotidni začetnik 1495r 0,5 μl H2O MilliQ 42,37 μl polimeraza DreamTaq (5U/ μl, Thermo Fischer Scientific) 0,125 μl Tabela 1: Univerzalni bakterijski oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje gena za 16S rrna. 27F (16S rrna bakterijski) 1495r (16S rrna bakterijski) 5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 V 0,2 ml centrifugirke za PCR smo odpipetirali po 49 μl mešanice reagentov in dodali še 1 μl supernatanta (matrična DNA). Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo s padajočo temperaturo prileganja (touchdown PCR) po programu; začetna denaturacija pri 94 ºC 5 minut, sledi 5 ciklov z denaturacijo pri 94 ºC po

37 28 30 sekund, prileganje pri 60 ºC za 30 sekund in podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund. Sledi 5 ciklov (denaturacija pri 94 ºC 30 sekund, prileganje pri 55 ºC za 30 sekund in podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund) in 30 ciklov (denaturacija pri 94 ºC za 30 sekund, prileganje pri 50 ºC za 30 sekund, podaljševanje pri 72 ºC za 60 sekund), zaključi pa se s končnim podaljševanjem pri 72 ºC za 7 minut. AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA Reagenti: agaroza, Tris-acetatni-EDTA pufer (TAE), barvilo SybrSafe (Invitrogen), 5- kratni nanašalni pufer, mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, Thermo Fischer Scientific) 50-kratni pufer TAE (uporabljali smo 1-kratni TAE) Tris baza 242 g Ocetna kislina 57,1 ml 0,5 M EDTA ph ml Destilirana voda 1000 ml 5-kratni nanašalni pufer Bromfenol modro Ksilen cianol Glicerol Destilirana voda 0,25 g 0,25 g 30 ml 100 ml Z agarozno gelsko elektroforezo smo preverili, če je bila reakcija PCR uspešna. Pripravili smo 1-odstotni agarozni gel z 1-kratnim pufrom TAE, ki smo mu dodali barvilo SybrSafe (10 µl na 100 ml 1-odstotne agaroze) in ga razlili v pripravljeni nosilec. Ko se je agarozni gel strdil, smo na gel nanesli po 3 μl reakcijske mešanice, ki smo ji prej dodali 2 μl nanašalnega pufra. Na gel smo nanesli tudi 2 μl mešanice fragmentov DNA znanih velikosti (standard DNA). Elektroforezo smo izvajali pri 120 V. Po končani elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali. Velikost pomnožene DNA smo določili primerjalno s fragmenti DNA znanih velikosti. SEKVENCIRANJE GENA ZA 16S rrna IN IDENTIFIKACIJA IZOLATOV Vzorce z uspešno pomnoženim delom gena za 16S rrna smo poslali na ugotavljanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje) v Macrogen (Južna Koreja). Med objavljenimi nukleotidnimi zaporedji podatkovne zbirke Ribosomal Database Project-II smo s pomočjo zbirkinih iskalnikov poiskali homologe dobljenim delnim nukleotidnim zaporedjem gena za 16S rrna (priloga 1) naših izolatov ( ). Čiste bakterijske kulture identificiranih sevov smo shranili v Mikrobiološko zbirko Ex Infrastrukturnega centra Mycosmo (MRIC UL) pri -80 C v vialah sistema Microbank (Pro-Lab Diagnostic).

38 UGOTAVLJANJE ODPORNOSTI SALMONEL PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM Vse izolirane seve, za katere smo na osnovi fenotipskega profila in nukleotidnega zaporedja gena za 16S rrna dokazali, da so salmonele, smo testirali za občutljivost proti izbranim antibiotikom. Uporabili smo dve metodi in sicer difuzijski antibiogram po Kirby- Bauerju in inkorporacijski antibiogram Difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju Ta metoda difuzijskega antibiograma z diski je kvalitativna metoda, kjer lahko ugotovimo le, ali je sev občutljiv ali odporen proti testiranemu antibiotiku. Pri izvedbi smo sledili navodilom Ameriškega društva za mikrobiologijo (Cavalieri s sod., 2005) MUELLER HINTONOVO GOJIŠČE Mesni ekstrat Encimatsko razgrajen kazein Škrob Agar Destilirana voda 3 g 17,5 g 1,5 g 17 g 1000 ml Kemikalije (razen agarja) smo raztopili, dodali agar, gojišče avtoklavirali 15 min pri 121 ºC in ga sterilno razlili po 25 ml v sterilne petrijeve plošče. V epruvete s 5 ml sterilne fiziološke raztopine (0,9% NaCl) smo vnesli polno ezo kulture celic, jih resuspendirali, nato smo z dodajanjem fiziološke raztopine uravnali motnost bakterijske suspenzije na gostoto 0,5 po McFarlandovemu standardu. To suspenzijo celic smo nato nacepili na gojišče Mueller-Hinton z vatenko tako, da smo ploščo trikrat prebrisali. Na plošče s konfluentno nacepljeno kulturo smo položili komercialno pripravljene antibiotične diske enakomerno oddaljene eden od drugega in po inkubaciji ur pri 37 C izmerili premere cone inhibicije rasti (premer v milimetrih) okrog vsakega diska, te podatke pa primerjali s kriteriji za interpretacijo premerov con inhibicije rasti. Uporabili smo naslednje antibiotične diske (Oxoid, Thermo Fischer Scientific): TE tetraciklin (30 μg) IMP imipenem (10 μg) S streptomicin (10 μg) NOR norfloksacin (10 μg) NA nalidiksična kislina (30 μg) CIP ciprofloksacin (5 μg) CTX cefotaksim (30 μg) CAZ ceftazidim (30 μg) CAZ/CLA ceftazidim/klavulanska kislina (30/10 μg) Za branje rezultatov pa smo uporabili naslednje kriterije za interpretacijo premerov con inhibicije rasti (CLSI standards M100-S24, 2014):

39 30 Antibiotik Rezistenca Vmesno Občutljivost TE IMP S NOR NA CIP CTX CAZ CAZ/CLA Inkorporacijski antibiogram Za ugotavljanje odpornosti sevov salmonel proti antibiotiku ampicilinu smo pripravili hranilni agar s koncentracijo antibiotika 100 mg/l. Založno koncentracijo ampicilina smo naredili tako, da smo raztopili 100 mg antibiotika v 1 ml destilirane vode in sterilizirali s filtracijo. Nato smo v pripravljen hranilni agar (priprava opisana zgoraj), ohlajen na 55 C dodali 1 ml založne raztopine ampicilina in agar razlili v sterilne petrijeve plošče. Na ploščo z ampicilinom smo nanesli po eno kolonijo 24-urne čiste kulture posameznega seva, gojene na hranilnem agarju (4 seve na ploščo). Za preverjanje učinkovitosti antibiotika v gojišču smo kot kontrolo uporabili sev Escherichia coli BL-11, ki smo ga nacepili na gojišče z ampicilinom in brez. Po inkubaciji 48 ur pri 37 C smo na ploščah pregledali, če so naše kulture rastle. Rast pomeni rezistenco, če ni rasti pa občutljivost bakterije za ampicilin pri koncentraciji 100 mg/l. 3.4 GENOTIPSKA METODA ZA UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI BETA- LAKTAMAZ Z RAZŠIRJENIM SPEKTROM DELOVANJA (ESBL) SKUPINE CTX-M IN GENOV ZA PLAZMIDNO POSREDOVANO KINOLONSKO REZISTENCO (PMQR) SKUPINE QNR Pomnoževanje genov za beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja skupine CTX-M (blactx-m) Za ugotavljanje prisotnosti genov blactx-m pri sevih salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 2. Priprava mešanice za PCR (multipla reakcija) za 1 vzorec: - 12,5 μl 2 mešanice reagentov DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) - 1 μl vsakega začetnika F (M1, M2, M8, M9, M25) - 1 μl vsakega začetnika R (M1, M2, M8, M9, M25) - 0,5 μl H2O Program za PCR: 94 C 5 minut 94 C 25 sekund 52 C 40 sekund 72 C 50 sekund 72 C 6 minut 30X

40 31 Tabela 2: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov ESBL skupine CTX M (blactx-m) Gen nukleotidno zaporedje (5' - 3') blactx - M1 CTX - M1 F (AAAAATCACTGCGCCAGTTC) 415 CTX - M1 R (AGCTTATTCATCGCCACGTT) blactx - M2 CTX - M2 F (CGACGCTACCCCTGCTATT) 552 CTX - M2 R (CCAGCGTCAGATTTTTCAGG) blactx - M8 CTX - M8 F (TCGCGTTAAGCGGATGATGC) 666 CTX - M8 R (AACCCACGATGTGGGTAGC) blactx - M9 CTX - M9 F (CAAAGAGAGTGCAACGGATG) 205 CTX - M9 R (ATTGGAAAGCGTTCATCACC) blactx - M25 CTX - M25 F (GCACGATGACATTCGGG) 327 CTX - M25 R (AACCCACGATGTGGGTAGC) velikost pomnožka (bp) referenca Woodford s sod., 2006 Vse reagente smo hranili na ledu ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim mešalom. V 0,2 ml centrifugirke po Eppendorfu smo odpipetirali po 23 μl reakcijske mešanice za PCR ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 2 μl matrične DNA (pripravljene kot je opisano pod poglavjem 3.2.2). Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo po protokolu, opisanem zgoraj. Po končani verižni reakciji smo preverili uspešnost pomnoževanja z agarozno gelsko elektroforezo kot je opisano zgoraj (poglavje 3.2.2) s spremembami, uporabili smo 2- odstotni agarozni gel, nanašali po 5 μl reakcijske mešanice, kot mešanico fragmentov DNA znanih velikosti (standard DNA) pa smo uporabili GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Thermo Fischer Scientific). Na gel smo nanesli tudi dve pozitivni kontrolni reakciji (pomnoženi geni CTX-M8, CTX-M9 in CTX-M25). Po končani elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali. Pogledali smo razvrstitev pomnožkov in velikost pomnoženih fragmentov DNA določili primerjalno z uporabo nanešenega standarda DNA Pomnoževanje genov za plazmidno posredovano kinolonsko rezistenco (PMQR) skupine QNR Za ugotavljanje prisotnosti genov qnr pri sevih salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 3. Priprava PCR mešanice (multipla reakcija) za 1 vzorec: - 12,5 μl 2 mešanice reagentov DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) - 1 μl vsakega začetnika F (A, B, S) - 1 μl vsakega začetnika R (A, B, S) - 5,5 μl H2O Priprava mešanice za 1 vzorec (qnrc ali qnrd): - 12,5 μl 2 mešanice reagentov DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) - 1 μl začetnik F (C ali D) - 1 μl začetnik R (C ali D) - 9,5 μl H2O

41 32 Tabela 3: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov qnr. gen nukleotidno zaporedje (5' - 3') velikost pomnožka (bp) qnra qnra - F (AGAGGATTTCTCACGCCAGG) 580 qnra - R (TGCCAGGCACAGATCTTGAC) qnrb qnrb - F (GGMATHGAAATTCGCCACTG) 264 qnrb - R (TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA) qnrs qnrs - F (GCAAGTTCATTGAACAGGGT) 428 qnrs - R (TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG) qnrc qnrc - F (GGGTTGTACATTTATTGAATCG) 308 qnrc - R (CACCTACCCATTTATTTTCA) qnrd qnrd - F (CGAGATCAATTTACGGGGAATA) 582 qnrd - R (AACAAGCTGAAGCGCCTG) referenca Cattoir s sod., 2007 Wang s sod., 2009 Cavaco s sod., 2009 Vse reagente smo hranili na ledu ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim mešalom. V 0,2 ml centrifugirke po Eppendorfu smo odpipetirali po 24 μl reakcijske mešanice za PCR ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 1 μl matrične DNA (pripravljene kot je opisano pod 3.2.2). Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo. PCR smo izvedli po naslednjem programu: 95 C 5 minut 94 C 30 sekund 52 C 30 sekund 30X 72 C 1 minuta 72 C 7 minut Po končani verižni reakciji smo preverili uspešnost pomnoževanja z agarozno gelsko elektroforezo, kot je opisano za gene blactx-m (poglavje 3.4.2). Na gel smo nanesli tudi pozitivne kontrolne reakcije, kjer smo pomnoževali dele genov qnr. Po končani elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali. Ugotavljali smo prisotnost pomnožkov in velikost pomnoženih fragmentov DNA določili primerjalno z uporabo nanešenega standarda DNA.

42 UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI NEKATERIH VIRULENTNIH DEJAVNIKOV PRI IZOLATIH SALMONEL IZ PLAZILCEV Za preverjanje prisotnosti genov virulentnih dejavnikov inva, sopb, sifa in spvc pri sevih salmonel, izoliranih iz plazilcev, smo pripravili po 25 μl celokupne reakcijske mešanice za PCR na vzorec in uporabili oligonukleotidne začetnike, navedene v tabeli 4. Vse reagente smo ves čas hranili na ledu, ter jih pred uporabo dobro premešali z vibracijskim mešalom. 2 mešanica reagentov DreamTaq PCR Master Mix (Thermo 12,5 μl Fischer Scientific) 10 mm 5'- oligonukleotidni začetnik F 1 μl 10 mm 3'- oligonukleotidni začetnik R 1 μl H2O MilliQ 9,5 μl V 0,2 ml centrifugirke za PCR smo odpipetirali po 24 μl reakcijske mešanice ter na koncu v vsako centrifugirko dodali še 1 μl matrične DNA (priprava opisana zgoraj, poglavje 3.2.2). Tabela 4: Oligonukleotidni začetniki, uporabljeni za pomnoževanje genov izbranih virulentnih dejavnikov. gen velikost nukleotidno zaporedje (5' 3') pomnožka (bp) sopb-f CCTCAAGACTCAAGATG 220 sopb-r TACGCAGGAGTAAATCGGTG spvc-f ACTCCTTGCACAACCAAATGCGGA 571 spvc-r TGTCTCTGCATTTCGCCACCATCA sifa-f ATGCCGATTACTATAGGCAATGG 1011 sifa-r TTATAAAAAACAACATAAACAGCCG inva-f ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT 244 inva-r AGACGACTGGTACTGATCGATAAT referenca Hur s sod., 2011 Vzorce smo dali v aparaturo za PCR (PCR Mastercycler ep Gradient, Eppendorf) in izvedli verižno reakcijo s polimerazo. Za gena sopb in inva po programu: 94 C 5 minut 94 C 30 sekund 52 C 30 sekund 30X 72 C 30 sekund 72 C 10 minut Za gen spvc po programu: 95 C 5 minut 94 C 30 sekund 55 C 30 sekund 30X 74 C 1 minuta 74 C 10 minut

43 34 Za gen sifa po programu: 95 C 5 minut 94 C 30 sekund 55 C 30 sekund 30X 74 C 1,5 minut 74 C 10 minut Po končani verižni reakciji smo preverili uspešnost pomnoževanja z agarozno gelsko elektroforezo, kot je opisano za gene blactx-m (poglavje 3.4.2). Kot standard DNA smo uporabili mešanico fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, Thermo Fischer Scientific). Na gel smo nanesli tudi pozitivne kontrolne reakcije, kjer smo pomnoževali dele genov izbranih virulentnih dejavnikov (navedenih v tabeli 4). Po končani elektroforezi smo gel osvetlili z UV transluminatorjem (G-Box Chemi, Syngene) in ga fotografirali. Ugotavljali smo prisotnost pomnožkov in velikost pomnoženih fragmentov DNA določili primerjalno z uporabo nanešenega standarda DNA.

44 število pregledanih živali 35 4 REZULTATI 4.1 PRISOTNOST VRST IZ RODU SALMONELLA PRI PLAZILCIH Plazilci so vedno bolj priljubljene domače živali, ki pa se vse pogosteje omenjajo kot prenašalci salmonele na človeka. Zato smo proučili, kolikšen del plazilcev, gojenih po šolah in visokošolskih zavodih ter pri zasebnih gojiteljih v Ljubljani in okolici, je okuženih s salmonelo. Ker se salmonele primarno nahajajo v prebavnem traktu živali, preko iztrebkov pa se lahko prenesejo na druge živali ali človeka, smo pregledali iztrebke in brise iz kloak 66-ih plazilcev. Največji odstotek pregledanih vzorcev so predstavljale kače, ki jih je bilo 42 (63,6%), 17 (25,8%) je bilo kuščarjev, ter 7 (10,6%) želv (priloga 1). Od vseh pregledanih živali jih je bilo s salmonelo okuženih kar 42,4 % (28 okuženih živali od 66-ih). Največji delež okuženih živali smo zasledili pri kuščarjih (10 pozitivnih na salmonelo; 58,8 %), pri kačah je bil odstotek okuženih živali nekoliko nižji (18 pozitivnih živali; 42,9 %), pri želvah pa salmonele nismo zasledili (slika 5) kače kuščarji želve pozitivni negativni Slika 5: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev. Primerjali smo tudi število živali, okuženih s salmonelo, med zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi ustanovami (slika 6). Pri zasebnih gojiteljih je bila salmonela izolirana iz 17 živali (40,5 %) in sicer pri 13-ih kačah (56,6%) in 4-h kuščarjih (44,4 %). Iz izobraževalnih ustanov pa je bilo 11 živali pozitivnih na salmonelo (45,8%), od tega 5 kač (55,6 %) in 6 kuščarjev (75 %).

45 število pregledanih živali kače kuščarji želve kače kuščarji želve zasebni gojitelji izobraževalne ustanove pozitivni negativni Slika 6: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi ustanovami. Če si ogledamo še razmerja okuženih/ neokuženih živali s salmonelo med posameznimi gojitelji (slika 7) lahko opazimo, da so bile pri nekaterih izobraževalnih ustanovah vse pregledane živali okužene s salmonelo (kuščarji pri ustanovi A in kače pri ustanovi F). Slika 7: Razmerje med številom okuženih (pozitivni) in neokuženih (negativni) živali s salmonelo pri posameznih skupinah testiranih plazilcev primerjalno med posameznimi zasebnimi gojitelji in izobraževalnimi ustanovami. Vse domnevne izolate salmonel smo najprej identificirali z izbranimi biokemijskimi testi. Izbor biokemijskih testov s podanimi rezultati, ki smo jih uporabili za ločevanje salmonel od sorodnih enterobakterij, je predstavljen v tabeli 5.

46 37 Tabela 5: Rezultati biokemijskih testov za salmonelo in sorodne vrste (povzeto po Holt, 1994). biokemijski test Salmonella Proteus Citrobacter Shigela LDC ONPG ( + S. sonnei) Indol - - (+ P. vulgaris) + (- C. freundii) +, - H2S + +, - - (+ C. freundii) - Ureaza - + +, - - fermentacija glukoze fermentacija -, + - d - laktoze Legenda; (+) 90 % ali več sevov je pozitivnih; (-) 90 % ali več sevov je negativnih; (+,-) variabilna lastnost; (d) 11-89% sevov je pozitivnih. Rezultati fenotipskih lastnosti salmonel, dobljeni z izbranimi biokemijskimi testi, so predstavljeni v tabeli 6. Fenotipski profili testiranih sevov so večinoma odgovarjali profilu salmonele.

47 38 Tabela 6: Rezultati izbranih biokemijskih testov za izolate salmonel iz plazilcev. EXB TSI oznaka LDC ONPG indol urea seva glukoza laktoza H2S L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L , - L Legenda: LDC: (+) prisotnost encima lizin dekarboksilaze; ONPG: (+) prisotnost encima β galaksidaze; INDOL: (+) prisotnost encima triptofanaze TSI (trojni sladkor z železom): (+) (fermentacija glukoze in/ali laktoze, H 2S (+) produkcija vodikovega sulfida; UREA: (+) prisotnost encima ureaze S krepko pisavo so označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rrna potrdili, da gre za vrsto Salmonella enterica subsp. arizonae. Atipični rezultati so označeni s sivo. Pri sevih S31, S32B, S33B, S34, S35, S38, S39, S40, S41 in L335 biokemijskih testov nismo opravljali.

48 39 Da bi potrdili fenotipsko identifikacijo smo vse izolate salmonel še genotipsko identificirali s pomnožitvijo in sekvenciranjem dela gena za 16S rrna in primerjali njihova zaporedja s homologi iz podatkovne zbirke Ribosomal Database Project II. Ugotovili smo, da se večina sevov uvršča v podvrsto Salmonella enterica subsp. enterica, le v štirih primerih (sevi EXB L352, L353, L354 in L370) smo izolirali podvrsto Salmonella enterica subsp. arizonae (priloga 1). Testirane živali so bile okužene ali z eno ali z drugo podvrsto. Z analizo nukleotidnega zaporedja dela gena za 16S rrna smo pri nekaterih izolatih ugotovili, da ne gre za salmonele in jih izločili iz nadaljnega dela. Večinoma so bili to izolati rodov Providencia, Citrobacter, Pseudomonas in Klebsiela. 4.2 ODPORNOST IZOLIRANIH SEVOV PROTI IZBRANIM ANTIBIOTIKOM Za vse izolirane seve salmonel iz plazilcev smo ugotavljali, ali so občutljivi ali odporni proti desetim izbranim antibiotikom. Uporabili smo tetraciklin, streptomicin (aminoglikozidni antibiotik), beta-laktamske antibiotike iz skupin penicilinov (ampicilin), karbapenemov (imipenem) in cefalosporinov 3. generacije (cefotaksim in ceftazidim, tudi v kombinaciji s inhibitorji beta-laktamaz, kot je klavulanska kislina) ter kinolone (nalidiksična kislina) in fluorokinolone (norfloksacin in ciprofloksacin). Izvedli smo difuzijski antibiogram po Kirby-Bauerju za vse testirane antibiotike (slika 8) razen za ampicilin (inkorporacijski antibiogram). Premeri con inhibicije rasti in rast na ploščah z ampicilinom so podani v tabeli 7. Slika 8: Primer difuzijskega antibiograma po Kirby-Bauerju pri sevu salmonele z oznako EXB L373 (Foto: M. Farkaš)

49 40 Tabela 7: Rezultati odpornosti salmonel iz plazilcev proti izbranim antibiotikom Antibiotiki EXB oznaka seva TE IMP S NOR NA CIP CTX CAZ CAZ/CLA AMPc S S32B S33B S S S S S S L L L L L L L L L L L L L L L L L * L L L L L L L L L L L L L

50 41 Legenda: TE tetraciklin (30 μg), IMP imipenem (10 μg), S streptomicin (10 μg), NOR norfloksacin (10 μg), NA nalidiksična kislina (30 μg), CIP ciprofloksacin (5 μg), CTX cefotaksim (30 μg), CAZ ceftazidim (30 μg), CAZ/CLA ceftazidim/klavulanska kislina (30/10 μg), AMPc ampicilin (100 mg/l) Številke predstavljajo premer cone inhibicije rasti (v mm). Temneje obarvano okence sev je odporen proti testiranem antibiotiku; zvezdica (*) ob številki sev je intermediaren. Pri inkorporacijskem antibiogramu za ampicilin AMPc; (+) rast (odpornost proti AMPc), (-) ni rasti (občutljivost proti AMPc). S krepko pisavo so označeni sevi, za katere smo na osnovi nukleotidnega zaporedja gena za 16S rrna potrdili, da gre za vrsto Salmonella enterica subsp. arizonae. Proti antibiotikom je bilo odpornih razmeroma malo sevov, izmed 39 sevov le 13 (33,3%). Od tega je bilo 11 sevov (28,2%) takšnih, ki so bili odporni proti enemu izmed uporabljenih antibiotikov. Tako sta bila 2 seva (5,1%) odporna proti tetraciklinu in 9 sevov (23,1%) proti streptomicinu. Samo dva seva (5,1%) sta pokazala hkratno odpornost proti dvema izbranima antibiotikoma, sev L373 proti streptomicinu in ampicilinu, sev L330 pa proti tetraciklinu in ampicilinu. V enem primeru je bil sev intermediaren proti streptomicinu. Vsi sevi, ki so bili odporni proti antibiotikom so bili sevi podvrste Salmonella enterica subsp. enterica. Pri sevih podvrste Salmonella enterica subsp. arizonae (L352, L353, L354 in L370) odpornosti nismo zaznali Prisotnost genov ESBL skupine CTX-M in PMQR skupine QNR Pri vseh sevih salmonel smo s PCR preverili prisotnost genov za beta-laktamaze z razširjenim spektrom delovanja (ESBL) skupine CTX-M (podskupine M1, M2, M8, M9 in M25) (slika 9).

51 42 Slika 9: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov beta-laktamaz (ESBL) skupine CTX-M. Ob desnem robu je nanešena mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler 50bp DNA Ladder (Thermo Fischer Scientific). Od 39 sevov pri nobenemu nismo zasledili pomnožka prave velikosti za gene blactx-m. Prav tako smo preverili tudi prisotnost genov za plazmidno posredovano odpornost proti kinolonom (PMQR) skupine QNR, ki so povezani z nizko odpornostjo proti fluorokinolonom (slika 10). Ugotovili smo, da izolirani sevi salmonel iz plazilcev nimajo genov za plazmidno posredovano odpornost proti kinolonom skupine QNR.

52 43 Slika 10: Agarozni gel po elektroforezi z nanešenimi pomnožki PCR za ugotavljanje prisotnosti genov qnr pri izbranih sevih salmonel iz plazilcev. Ob robovih je nanešena mešanica fragmentov DNA znanih velikosti (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Fischer Scientific)). Kot pozitivna kontrola je na desni strani vsakega gela tik pred standardom DNA nanešena pozitivna kontrola (kontroli) z označeno velikostjo.