Eksperimentalno določanje vpliva procesnih parametrov proizvodnje kefirnih zrn s statistično metodo

metodo Univerza v Mariboru Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Aleksander Rauter Eksperimentalno določanje vpliva procesnih parametrov proizvodnje kefirnih zrn s statistično metodo Diplomska naloga Maribor, 2009

metodo Stran 4 Zahvala Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Andreji Goršek za pomoč, vodenje in potrpljenje pri opravljanju diplomskega dela. Za pomoč in nasvete pri delu v laboratoriju se zahvaljujem Marku Tramšku. Prav posebna zahvala pa velja staršem, ki sta mi omogočila študij.

metodo Stran 5 Eksperimentalno določanje vpliva procesnih parametrov proizvodnje kefirnih zrn s statistično metodo Povzetek V diplomskem delu opisujemo eksperimentalni potek določanja optimalnih procesnih parametrov za proizvodnjo kefirnih zrn in določitev prispevka posameznih procesnih parametrov pri optimalnih rastnih pogojih za kefirna zrna. Vse poizkuse smo opravljali v laboratorijskem šaržnem reaktorju (reakcijski kalorimeter RC1e). Sledeč strokovni literaturi smo za optimizacijske parametre izbrali temperaturo rastnega medija, masno koncentracijo glukoze in kvasa, ter vrtilno frekvenco mešala. S pomočjo Taguchi-jeve metode smo načrtovali parcialni faktorialni eksperiment z navedenimi optimizacijskimi kriteriji. Vsak poizkus je potekal 24 ur. Eksperimentalne rezultate smo obdelali z analizo variance, s katero smo pri idealnih rastnih pogojih kefirnih zrn določili prispevek posameznih optimizacijskih kriterijev. V drugem delu eksperimentalnega dela smo preverili še vpliv različnih vrst kravjega mleka na prirast kefirnih zrn pri zgoraj določenih optimalnih pogojih. V strokovni literaturi smo glede tega zasledili le študije odvisnosti prirastka kefirnih zrn od vsebnosti mlečnih maščob. Rezultatov teh ugotovitev z našimi eksperimenti nismo mogli potrditi. Ključne besede: kefir, kefirno zrno, optimiranje rasti, Taguchi-jeva metoda, procesni parametri UDK: 66.01:637.1(043.2)

metodo Stran 6 Experimental determination of the influence of process parameters in kefir grain production with a statistical method Abstract In this diploma work the experimental determination of the optimum process parameters for kefir grain production, as well as the determination of the contribution of the process parameters at the optimal conditions for kefir grains is described. All experiments have bean carried out in a laboratory batch reactor (reaction calorimeter RC1e). According to scientific, data we have chosen for the optimization parameters the temperature of the growth medium, the mass concentration of glucose and yeasts as well as the degree of agitation. According to Taguchi s principles we have planed a partial factorial experiment with the above mentioned optimization criteria. Every trail took 24 hours. The experimental results have been processed with the analysis of variance which has, at optimal conditions for kefir grain growth, given the contribution of the separate optimization criteria. In the second part of the experimental work we have evaluated the influence of different cow milk types on kefir grain growth at the above determined conditions. Scientific data indicated a correlation between kefir grain growth and the milk fat content. But we have been unable to confirm such a correlation. Key words: kefir, kefir grain, growth optimisation, Taguchi s method, process parameters UDK: 66.01:637.1(043.2)

metodo Stran 7 Vsebina 1 UVOD...15 2 TEORETIČNI DEL...17 2.1 Kefir...17 2.1.1 Kaj je kefir?...17 2.1.2 Izvor in zgodovina kefirja...17 2.1.3 Zdravilni učinki kefirja...18 2.1.4 Lastnosti kefirja...20 2.2 Kefirna zrna...20 2.2.1 Kaj so kefirna zrna...20 2.2.2 Mikroorganizmi v kefirnem zrnu...21 2.2.3 Faktorji vpliva na rast kefirnih zrn...23 2.2.4 Skladiščenje in reaktivacija kefirnih zrn...24 2.3 Proizvodni postopki kefirja...24 2.3.1 Klasična metoda...25 2.3.2 Ruska metoda...26 2.3.3 Moderna metoda...26 2.4 Pregled izvedenih raziskav...27 2.4.1 Identifikacija mikrobne populacije...28 2.4.2 Optimiranje rastnih pogojev in povečanje prirasti kefirnih zrn...28 2.4.3 Zdravilni učinki...29 2.4.4 Alternativne raziskave...29 3 METODE IN MATERIALI...30 3.1 Kemikalije...30 3.2 Laboratorijska oprema...32 3.3 Aparature in računalniška oprema...32 3.4 Taguchi-jeva metoda...34 3.4.1 Strategija načrtovanja procesa...35 3.4.2 Nova disciplina...35 3.4.3 Predhodno razmišljanje...36 3.4.4 Osnovna metodologija...36 3.4.5 Zaporedje poteka eksperimentov...37 3.4.6 Načrtovanje eksperimentov za preiskavo faktorjev šuma...37 3.4.7 Prednosti ponovitev...37 3.5 ANOVA...38

metodo Stran 8 3.5.1 Dvostopenjska ANOVA...41 4 EKSPERIMENTALNI DEL...43 4.1 Priprave na eksperimentalno delo...43 4.1.1 Priprava OT za eksperimentalni del...43 4.2 Eksperimentalno delo...45 4.2.1 Aktivacija in vzdrževanje aktivnosti kefirnih zrn...45 4.2.2 Gravimetrično določanje prirasta kefirnih zrn...45 4.2.3 Določanje optimalnih rastnih pogojev...46 4.2.4 Določanje vpliva vrste mleka na prirast kefirnih zrn...46 5 REZULTATI...47 5.1 Določanje optimalnih rastnih pogojev...47 5.1.1 Numerični rezultati eksperimentalnih meritev...47 5.1.2 Grafična analiza vpliva procesnih parametrov proizvodnje kefirnih zrn...48 5.1.3 Analiza variance in kvantitativno vrednotenje vpliva procesnih parametrov na prirast kefirnih zrn...51 5.2 Preverjanje vpliva vrste mleka...53 5.2.1 Numerična analiza vpliva vrste mleka...53 5.2.2 Grafična analiza vpliva vrste mleka...54 6 SKLEP...55 7 VIRI IN LITERATURA...56 8 PRILOGE...59 8.1 Življenjepis...59

metodo Stran 9 Seznam slik Slika 2-1: Izvorno področje kefirja in kefirnih zrn v Kavkaškem gorovju....17 Slika 2-2: Oblika in videz kefirnih zrn...20 Slika 2-3: Prikaz velikosti kefirnih zrn....21 Slika 3-1: Shematski prikaz reakcijskega kalorimetra RC1e...33 Slika 5-1: Vpliv temperature na prirast kefirnih zrn....49 Slika 5-2: Vpliv masne koncentracije kvasa na prirast kefirnih zrn....50 Slika 5-3: Vpliv masne koncentracije glukoze na prirast kefirnih zrn....50 Slika 5-4: Vpliv vrtilne frekvence na prirast kefirnih zrn....51 Slika 5-5: Vpliv sestave mleka na prirast kefirnih zern....54

metodo Stran 10 Seznam preglednic Preglednica 2-1: Največkrat identificirane bakterije v kefirnih zrnih...22 Preglednica 2-2: Največkrat identificirane kvasovke v kefirnih zrnih....23 Preglednica 3-1: Osnovna kemijska sestava uporabljenih vrst mleka...31 Preglednica 3-2: Število poizkusov po faktorialni in Taguchi-jevi metodi načrtovanja...36 Preglednica 3-3: Pregled osnovnih veličin pri analizi ANOVA....38 Preglednica 4-1: Faktorji s pripadajočimi nivoji...43 15 Preglednica 4-2: Osnovna oblika OT L 16 (2 )...44 Preglednica 4-3: Štiri nivojska oblika OT L 16....44 Preglednica 4-4: Okrajšana prilagojena OT L 16 za poskusne postavitve....45 Preglednica 5-1: Rezultati poizkusov glede na preglednico 4 2....47 Preglednica 5-2: Absolutne in relativne prirasti kefirnih zrn...48 Preglednica 5-3: Vsote prirasti po faktorjih na posameznem nivoju....49 Preglednica 5-4: Rezultati analize variance ANOVA....51 Preglednica 5-5: Rezultati ponovljene analize variance ANOVA...52 Preglednica 5-6: Prirast zrn glede na različne vrste mleka...53 Preglednica 5-7: Absolutna in relativna prirast kefirnih zrn glede na različne vrste mleka....53

metodo Stran 11 Uporabljene kratice ANOVA BE Ca CH EV HO MA MSD NA OT O3 V A V B1 V B6 V D V E analysis of variance (ang) analiza variance beljakovine kalcij ogljikovi hidrati energijska vrednost holesterol maščobe mean square deviation (ang) povprečje kvadratov deviacije niacin ortogonalna tabela ω3 nenasičene maščobne kisline vitamin A vitamin B1 vitamin B6 vitamin D vitamin E

metodo Stran 12 Uporabljeni simboli e eksperimentalna napaka 1 E(S m ) statistično pričakovana vrednost 1 C.F. correction factor (ang) korekcijski faktor 1 f število prostostnih stopenj 1 F razmerje varianc 1 f e število prostostnih stopenj napake 1 f m vrtilna frekvenca min -1 f T celotno število prostostnih stopenj 1 m razlika med povprečno in ciljno vrednostjo 1 m masa g n število poizkusov 1 N število meritev 1 N e efektivno število ponovitev 1 P procentni (odstotni) prispevek % ph vrednost ph 1 q z volumski pretok zraka L/min r število ponovitev 1 S vsota kvadratov 1 S' čista vsota kvadratov 1 S e deviacija okrog povprečja (vsota kvadratov napake) 1 S m povprečna vsota kvadratov (deviacija) 1 S T vsota kvadratov vseh meritev 1 S/N signal to noise ratio (ang) razmerje signala proti šumu 1 t čas poizkusa h T vsota meritev 1 T temperatura C V varianca 1 V e napaka variance 1 V m povprečna varianca 1 V T celotna varianca 1 w CH masni delež ogljikovih hidratov % w CO2 masni delež CO 2 % w CN masni delež proteinov % w H2O masni delež vode %

metodo Stran 13 w maščob masni delež maščob % w mk masni delež mlečne kisline % w mkb masni delež mlečno kislinskih bakterij % w Na masni delež NaCl % w OH volumski delež alkohola % w pepel masni delež pepela % w ss masni delež suhe snovi % w st masni delež starterja % w y masni delež kvasovk % w ye masni delež ekstrakta kvasovk % X i vsota rezultatov meritev s faktorjem X na nivoju i 1 X i povprečna vrednost faktorja X na nivoju i 1 Y rezultat meritev 1 Y povprečje meritev 1 Y 0 ciljna vrednost meritve 1 Y opt teoretični optimalni prirast 1

metodo Stran 14 Grške črke Δγ zrn absolutni prirast kefirnih zrn g/l Δγ zrn,r relativni prirast kefirnih zrn % γ CO2 masna koncentracija CO 2 g/l γ diacetil masna koncentracija diacetila mg/l γ glukoza masna koncentracija glukoze g/l γ kvas masna koncentracija kvasa g/l γ Mg masna koncentracija MgSO 4 *7H 2 O g/l γ O2 masna koncentracija kisika mg/l γ urea masna koncentracije sečnine g/l γ zrn masna koncentracija kefirnih zrn g/l γ zrn,0 začetna masna koncentracija kefirnih zrn g/l γ zrn,24 masna koncentracija kefirnih zrn po 24 urah g/l σ 2 splošna varianca 1 ζ masno razmerje 1

metodo Stran 15 1 UVOD V 80-ih letih se je povečala poraba fermentiranih mlečnih izdelkov [1, 2]. Med njimi je tudi kefir pridobival na pomenu. Razlogi za to so njegova prehranska vrednost in njegovi edinstveni zdravilni učinki, ter želja ljudi po izboljšanju zdravstvenega stanja s pomočjo hrane [3, 4]. K priljubljenosti kefirja niso pripomogle zgolj njegove prehranske vrednosti in vsebnost vitaminov, mineralov in esencialnih aminokislin. Pomemben del so prispevali tudi rezultati raziskav, ki so potrdili prisotnost mnogih bioaktivnih snovi, ki kefir uvršajo med pomembne probiotične izdelke. Ravno številčna in kompleksna probiotična kultura, ki kefir razlikuje od običajnih probiotičnih izdelkov, mu daje edinstveni okus kot tudi blagodejne učinke. [4, 5] Termin»probiotik«izvira iz leta 1965, ko je predstavljal snov ali organizem, ki prispeva k uravnoteženosti črevesne mikroflore. Ena zadnjih definicij probiotikov se glasi:»probiotiki so živi mikroorganizmi, ki zaužiti v zadostnem številu izražajo zdravstvene prednosti preko meja osnovne prehranske vrednosti (Schaafsman, 1996).«[5] Kot že omenjeno, je kefir fermentiran mlečni izdelek osvežujočega, rahlo kislega okusa, ki vsebuje manjše količine alkohola in CO 2, ter različnih aromatskih komponent odgovornih za njegove organoleptične lastnosti. Prvotna domovina kefirja so severna pobočja Kavkaškega gorovja, ki leži med Črnim in Kaspijskim morje. Beseda»kefir«pa izvira iz turške besede»kef«oz.»keyif«, kar pomeni prijeten okus oz. dobro počutje. [5, 6] Kefir so sprva pripravljali iz ovčjega mleka, kasneje tudi kozjega in kravjega mleka v usnjenih vrečah. Dandanes se kefir proizvaja tudi iz kokosovega, riževega in sojinega mleka [1, 5]. Sprva se je kefir proizvajal le na Kavkazu, od koder je konec 19., začetek 20. stoletja prišel v Rusijo in se razširil po državah nekdanje Sovjetske zveze. Od tam je kefir prišel v vzhodno in srednjo Evropo od koder se je razširil po skorajda celem svetu. Dandanes sega domača in tudi industrijska proizvodnja kefirja od Finske do Grčije in Turčije, od Brazilije in Argentine do Tajvana in celo Japonske, kjer pridobiva na pomenu [1, 5, 6]. Kefirna zrna so bela do bledo rumena zrna, ki po videzu spominjajo na kose koral ali kose cvetače. Sestavljena so iz naravne mešanice simbiotskih mikroorganizmov [2, 5, 7]. Najverjetneje so nastala po naključju, ko so nomadi nosili mleko v vrečah iz kozjih kož. Pri tem so se najverjetneje povezali mlečni proteini in mikroflora v vrhnji plasti ovčjega mleka in tvorili to kar danes poznamo kot kefirno zrno [5, 8]. Nova kefirna zrna je mogoče dobiti le z gojenjem obstoječih zrn, kar se godi samostojno pri proizvodnji kefirja. Vendar so prirasti kefirnih zrn pri tem majhni. Zato so se za potrebe industrijske proizvodnje kefirnih zrn, za industrijsko proizvodnjo kefirja, razvili kontinuirni kultivacijski postopki. Ti so dali dnevni prirastek, Δγ zrn,r = (5 7) %, kefirnih zrn. Vendar to za industrijsko proizvodnjo kefirja še ni zadostovalo [9]. Zato se raziskujejo postopki in pogoji za proizvodnjo kefirnih zrn z višjimi prirastki. Po pregledu objavljene strokovne literature smo zasledili mnogo raziskav na temo kefirja in kefirnih zrn. V večini so se članki ukvarjali z določanjem mikrobiološke sestave kefirnih

metodo Stran 16 zrn, kot tudi alternativnimi možnostmi uporabe kefirnih zrn. Manjši del strokovne literature pa se je ukvarjal z določanjem optimalnih rastnih pogojev kefirnih zrn. Glede na te vire smo ugotovili, da so poglavitni faktorji, ki vplivajo na prirast kefirnih zrn, menjava mleka v rednih intervalih, temperatura, spiranje zrn, prisotnost hranil v rastnem mediju in mešanje le tega [9]. Hkrati smo ugotovili tudi, da so rezultati drugih raziskovalcev glede optimalnih rastnih pogojev le pogojno uporabni zaradi različnih virov uporabljenih kefirnih zrn, kot tudi zaradi spreminjanja mikrobiološke sestave kefirnih zrn, ki je naravni proces odvisen od več faktorjev. Zato smo se odločili, da v okviru diplomskega dela določimo optimalne rastne pogoje uporabljenih kefirnih zrn in da določimo relativne vplive posameznih preiskovanih faktorjev na celokupni prirastek kefirnih zrn. Na tak način bi pri nadaljnjih raziskavah lahko izločili faktorje, ki nimajo bistvenega vpliva na končni rezultat.

metodo Stran 17 2 TEORETIČNI DEL 2.1 Kefir 2.1.1 Kaj je kefir? Kefir je eden najstarejših, viskoznih, kipečih fermentiranih mlečnih napitkov. Pripravlja se z inokulacijo mleka s kefirnimi zrni, ki so mešana kultura različnih bakterij in kvasovk v matrici iz proteinov, lipidov in sladkorjev [10]. Kefirjev osvežujoč učinek je posledica nizke vsebnosti CO 2, alkohola, mlečne kisline in drugih aromatskih komponent nastalih med fermentacijo. Primeren je tudi za ljudi, ki ne prenašajo mlečnega sladkorja, ker mlečno kislinske bakterije in laktozo fermentirajoče kvasovke porabijo približno četrtino laktoze [1, 2, 4, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15]. Zadnje čase pa se ob klasičnem mlečnem kefirju pojavlja še vodni ali sladkorni kefir, ki je francoski napitek. Dobi se z gojenjem kefirnih zrn v sladkani vodi, kateri se lahko doda različno sadje, na primer fige, ali v limoninem soku [2, 10, 12]. 2.1.2 Izvor in zgodovina kefirja Nekoč je kefir predstavljal fermentiran mlečni izdelek, ki je izviral iz severnih področij Kavkaškega gorovja, ki leži med Kaspijskim in Črnim morjem, v Aziji, slika 2 1. Na tem področju so ljudje uživali in pripravljali kefir mnoga stoletja in pri tem uživali v vseh njegovih blagodejnih učinkih. Mnogi izmed njih so dočakali starost tudi sto in več let [2, 5, 6, 11, 12, 14, 16, 17]. Slika 2-1: Izvorno področje kefirja in kefirnih zrn v Kavkaškem gorovju.

metodo Stran 18 Nomadska ljudstva na Kavkazu so kozje, ovčje ali kravje mleko običajno prenašala v usnjenih vrečah, iz kozjih ali ovčjih kož. Včasih so namesto usnjenih vreč za fermentacijo uporabljali tudi lesene in lončene posode. Vreče z mlekom so čez dan obešali na sonce, ponoči pa v hišah blizu ognjišč ali vrat, kjer jih je vsakdo, ki je prišel ali odšel, rahlo sunil in tako premešal vsebino. Po končani fermentaciji, ko so odstranili del kefirja, so le tega nadomestili s svežim mlekom. Tako so dobili kontinuirno fermentacijo [1, 2, 6, 8, 18, 19]. Prve znanstvene študije o kefirju so bile objavljene konec 19. stoletja [19]. V prvih letih 20. stoletja je Vse Ruska Zdravstvena Družba najela brata Blandov, da jim pridobita kefirna zrna. To jima je tudi uspelo s pomočjo mlade zaposlene Irine Sakharov, ki je omrežila Kavkaškega princa Bek-Mirza Barchorov. Ker pa ji le ta ni hotel dati želenih kefirnih zrn, se je odpravila. Zato jo je princ dal ugrabiti, vendar sta jo brata Blandov rešila. Z njuno podporo je Irina tožila princa pred Carskim sodiščem in za povračilo zahtevala, da ji princ izroči nekaj kefirnih zrn. S temi kefirnimi zrni se je Irina 1908 vrnila v Moskvo [13]. Septembra istega leta pa so v Moskvi v trgovine prišle že tudi prve steklenice kefirja [19]. Vse do tridesetih let 20. stoletja, ko so pričeli z veliko količinsko proizvodnjo kefirja v Rusiji, so kefir izdelovali v dvostopenjskem procesu, kjer so sveže mleko inokulirali s kefirnimi zrni, ki so jih po fermentaciji odstranjevali z odcejanjem na situ. Pri tem nastalo fermentirano mleko so inokulirali v sveže mleko. Tako pripravljen izdelek pa ni imel enakih lastnosti kot originalni kefir. Zato so v petdesetih letih delavci na All-Union Dairy Research Institute razvili novo metodo za proizvodnjo kefirja [19]. Industrijska proizvodnja kefirja je na začetku potekala le v Rusiji. Od tam se je sprva razširila v vzhodno in srednjo Evropo, od tam pa po celem svetu [2, 6, 14]. Komercialno se kefir danes proizvaja še na Finskem, Norveškem, Švedskem [1, 6, 12, 19], Madžarskem, Poljskem, v Švici, v državah nekdanje Sovjetske Zveze, na Danskem, v Franciji, Nemčiji, Kanadi in Jugovzhodni Aziji [19]. Kefir je prav tako dobro znan v Grčiji, Avstriji, Braziliji in Izraelu [12]. Poznajo ga tudi v Združenih državah in na Japonskem, kjer pridobiva na priljubljenosti [1, 12]. Domača proizvodnja kefirja pa se je razširila vse do Argentine, Tajvana, Portugalske, Turčije in Francije [4]. Beseda»kefir«naj bi izvirala iz turške besede»kef«[6, 17],»keif«[11] oz.»keyif«[5] kot tudi»ker«[2], kar v prevodu pomeni»dober okus«ali»dobro počutje«, ter»alkoholno«oz.»fermentirano«. Dandanes izraz kefir predstavlja celo skupino fermentiranih mlečnih izdelkov. Le ti so lahko izdelani s pomočjo kefirnih zrn, starter kultur iz kefirnih zrn [12] ali čistih mikrobioloških kultur. Različni starterji in različni proizvodni postopki dajejo izdelke različne sestave [5], čvrstosti in prehrambenih ter organoleptičnih lastnosti. Vendarle se vsi tako pripravljeni izdelki še vedno imenujejo kefir. Skozi čas in različne okoliščine se je izraz»kefir«spreminjal, danes je znan še pod mnogimi drugimi imeni: búlgaros, kefer, kefyr, kepi, kephir, kewra, kiaphur, kippe, kippi, knapon, matsoni, matsoun, muda kekiya, mudu keiya, talai [2, 4, 6, 10, 13, 14]. 2.1.3 Zdravilni učinki kefirja Več tisoč let uporabe kefirja je dokazalo, da mikroorganizmi v njem niso patogeni [12]. Pri rednem uživanju kefirja pride do izraza izboljšanje počutja [13]. Kefir, kot tudi ostali probiotiki, odraža koristne učinke na imunski sistem v sluznici, verjetno zaradi vsebnosti komponent bakterijskih celičnih sten [4]. Večina prednosti uživanja kefirja je enakih kot pri drugih klasičnih probiotikih [2]. Za razliko od njih vsebuje kefir prijazne bakterije, ki jih v drugih probiotikih ni. Sem spadajo Lactobacilus Caucasus, Leuconostoc in nekatere vrste bakterij rodu Acetoacter in Streptococcus. Enako velja za koristne kvasovke Saccharomyces kefir in Torula kefir, ki uničujejo škodljive glive v sluznici [11].

metodo Stran 19 Zaradi spremenljive sestave kefirnih zrn in s tem tudi kefirja, ni mogoče dokazati specifičnih učinkov v vseh vrstah kefirja [12]. To med drugim botruje mnogim blagodejnim in zdravilnim lastnostim, ki so opisane v Ruski znanstveni in zdravstveni literaturi. Le ta vsebuje mnogo člankov o uporabi kefirja za zdravljenje širokega spektra bolezni in infekcij. Ta seznam sprva ne izraža nobene smiselne povezave med naštetimi boleznimi. Iz tega seznama bolezni so v Ruskih bolnicah in sanatorijih kefir uporabljali pri zdravljenju želodčnih ran (peptic ulcer), boleznih žolča, kroničnem črevesnem katarju, pri bronhitisu in pljučnici [18]. Uporabljal se je tudi pri urejanju prebavnih motenj, arteriosklerozi in alergičnih obolenjih. Uporabljal se je kot alternativno medicinsko sredstvo tudi za zdravljenje tuberkuloze, raka in motnjah prebavnega trakta [12]. Svež kefir (star do 12 ur) pospešuje prebavo, po 30 do 48 urah fermentacije pa zaustavlja drisko [8]. Ta na videz nepovezani seznam bolezni postane smiseln z upoštevanjem dejstva, da prijazne kulture v kefirju proizvajajo specifične antibiotike [11]. Ti pa izražajo širok spekter antitumorskih [16], antibakterioloških lastnosti [18] v in vivo eksperimentih proti širokemu spektru Gram pozitivnih in negativnih bakterij, kot tudi nekaterim vrstam gliv [5]. Vendar je literatura o tem zahodnim znanstvenikom pogosto težje dostopna. Antitumorske lastnosti kefirja in kefirnih zrn so med tem že dokazali na Japonskem v živalskih poskusih. Pri tem so živali, ki so uživale kefir ali kefirna zrna pred izpostavitvijo karcinogenu redkeje dobile rakava obolenja, pri zaužitju po izpostavitvi pa se je obseg in hitrost rasti raka zmanjšal [5, 18]. V literaturi najdemo še druge zdravilne učinke kefirja. Mednje spadajo učinki na maščobe in sladkor v krvi; razstrupljanje organizma in izboljšanje odzivnosti na zdravila in blaženje njihovih stranskih učinkov, antioksidativne lastnosti, ki zavirajo procese staranja in skleroze, učinki na reproduktivne funkcije, zvišanje imunske odpornosti, zmanjšanje vsebnosti zaužitih nitratov, z visoko vsebnostjo fosforja pomaga kefir izboljšati prebavljivost in presnovo sladkorjev, beljakovin in maščob [11], prav tako zmanjšanje zamašenost kože [16]. V kefirju se nahajajo tudi večje količine vitaminov, mineralov in esencialnih aminokislin, ki telesu pomagajo pri okrevanju po poškodbah in boleznih, ter pri ohranjanju vitalnosti. Prav tako se v njem nahajajo lahko prebavljivi celotni proteini [5]. Med največkrat omenjenimi vitamini v kefirju so vitamini skupine B (B1, B2, folna kislina in biotin, ki olajša asimilacijo drugih B vitaminov), kot tudi vitamini skupine K [1, 2, 5, 11, 18] in P [14]. Med fermentacijo kefirja nastajajo tudi aminokisline valin*, levcin*, lizin*, serin, alanin [4] in triptofan* (z * so označene esencialne aminokisline). Triptofan skupaj z veliko zalogo kalcija in magnezija v kefirju skrbi za sproščen in zdrav živčni sistem [11]. Vsi do sedaj navedeni zdravilni učinki kefirja so posledica delovanja živih mikroorganizmov v kefirju in njihovega tvorjenja varovalnih snovi. Tvorba le teh je odvisna od vitalnosti kefirjeve kulture in tehnološko proizvodnih postopkov [16]. Čeprav je kefir običajno izdelan na osnovi kravjega mleka ali mleka drugih živali in je s tem živilo živalskega izvora, ima številne lastnosti živil rastlinskega izvora in je zato tudi vedno bolj priljubljen med vegetarijanci [16]. Iz navedenih razlogov je razvidno, da je kefir primeren izdelek za nedonošenčke, otroke, nosečnice in doječe matere, bolnike, starejše ljudi in ljudi, ki ne prenesejo laktoze [5, 16]. Da bi zdravilne učinke kefirja lahko uživali zares vsi, ne glede na to, če so nad kefirjem navdušeni ali ne, ga je mogoče uporabiti pri pripravi najrazličnejših jedi. Zelo primeren je za pripravo solatnih prelivov, hladnih juh, frapejev in sladoledov. Uporablja se lahko kot kvaša za mesne jedi ali pri pripravi polivk za mesne jedi [16].

metodo Stran 20 2.1.4 Lastnosti kefirja Najpomembnejša lastnost kefirja je, da njegov okus ni posledica metabolne aktivnosti ene same vrste mikroorganizmov, ki so enakomerno razporejeni po celi količini mleka [1, 6]. Njegove lastnosti so močno odvisne od lastnosti mleka, iz katerega je kefir narejen [4, 14]. Bolj mastno, kot je mleko, iz katerega je kefir, bolj bo le-ta na koncu kremast [11]. Skorajda vsi viri opisujejo kefir kot kisel, gaziran, rahlo alkoholni napitek, ki je po konsistenci podoben jogurtu [8, 10]. Za avtentični kefir je značilna vsebnost kvasovk in okus po kvasu [1, 2, 8]. ph kefirja je med, ph = (4,2 4,6) [12]. Vsebnost CO 2 je za kefir iz kefirnih zrn, γ CO2 = (0,85 1,05) g/l, za kefir iz čistih kultur pa do, γ CO2 = 1,7 g/l [4], oz. procentualno med, w CO2 = (0,08 2) % [1]. Tudi kar se tiče količine vsebovanega alkohola različni avtorji navajajo različne podatke. Domač kefir lahko vsebuje do, w OH = 2 % alkohola [1, 2, 14], medtem ko industrijski kefir vsebuje do, w OH = 0,1 % alkohola [2]. Pri daljšem zorenju kefirja, dva do tri dni, se poveča vsebnost alkohola in kislin [8]. Tudi za mlečno kislino, ki je prevladujoča kislina v kefirju [4], avtorji navajajo razločne podatke, ki segajo od, w mk = (0,8 1) % [1, 2, 14]. Kefirjev edinstveni okus je posledica kopice aromatskih komponent nastalih med fermentacijo [1, 12]. Med aromatske komponente od že naštetih še spadajo diacetil, γ diacetil = (1 4) mg/l [2] in acetaldehid, nekaj mg/l [1, 2, 12]. Med drugim so za okus še odgovorne sledeče kisline: mravljična, jantarna, ocetna in propanojska kislina [1]. Prav tako tudi aceton [1, 2], propan aldehid, 2-butan-on, izoamil alkohol in maščobne kisline s kratkimi verigami [2]. Podobno kot mleko ima tudi kefir kratek rok uporabnosti, ki je običajno do tri dni [12]. 2.2 Kefirna zrna 2.2.1 Kaj so kefirna zrna Kefirna zrna so simbiotski skupek bakterij in kvasovk, ki jih med seboj povezuje netopna matrica. Po virih [1, 11, 14, 20] matrico sestavlja polisaharid kefiran, medtem ko viri [2, 5, 10] kot sestavne dele matrice ob kefiranu navajajo še proteine, lipide in celične preostanke neznane sestave. V praktično vsej literaturi so kefirna zrna opisana kot bele do bledo rumene kepice nepravilnih oblik, ki po videzu spominjajo na cvetove cvetače, kuhan riž, koščke koral ali pokovko (slika 2 2). Kar se tiče opisa velikosti kefirnih zrn so podatki v literaturi precej različni. Velikost zrn se navaja vse od nekaj milimetrov do treh centimetrov (slika 2 3). Čeprav so po videzu kefirna zrna sluzasta in krhka temu ni tako. Matrica v kefirnih zrnih jim daje elastičnost in trdnost. S tem postanejo kefirna zrna precej obstojna. [1, 2, 4, 5, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21] Slika 2-2: Oblika in videz kefirnih zrn.

metodo Stran 21 Slika 2-3: Prikaz velikosti kefirnih zrn. Iz kemijskega stališča gledano kefirno zrno sestavlja približno, w H2O = (85 90) %, vode [2, 14]. V suhem zrnu pa sestavlja kefirno zrno približno, w CH = 57%, ogljikovih hidratov, pretežno polisaharidov, w CN = 33 %, proteinov, w maščob = 4 %, maščob in, w pepel = 6 %, pepela [2, 14, 22]. Polisaharid kefiran v matrici je razvejan polisaharid, ki ga sestavljata glukoza in galaktoza v razmerju, ζ = 1:1 [1, 2, 20]. Med makro elementi v zrnu so zastopani K, Ca, P in Mg. Med mikroelementi pa Cu, Zn, Fe, Mn, Co in Mo. Kefirna zrna prav tako vsebujejo vitamine skupine B, B1, B2 in B5 [22]. V kefirnem zrnu se nahajajo pretežno mlečno kislinske bakterije rodov Laktokoki, Laktobacili, Leukonostok in Streptokoki. Prav tako se v zrnu nahajajo še ocetno kislinske bakterije in mešanica kvasovk [5, 6, 11, 13, 21, 23]. Točna kombinacija bakterij in kvasovk se razlikuje predvsem glede na izvor kefirnega zrna [1, 14, 18, 23, 24]. Po viru [2] je edino, kar je približno konstantno v kefirnih zrnih, gledano z mikrobiološkega stališča, razmerje kvasovk proti mlečno kislinskim bakterijam. Prav tako sta precej konstantni tudi razmerji hetero fermentativnih proti homo fermentativnim vrstam mikroorganizmov in razmerje mezofilnih proti termofilnim vrstam mikroorganizmov. Pod mikroskopom predstavljajo laktobacili 66 %, koki 16 %, kvasovke pa 18 % populacije mikroorganizmov [2]. Mikroorganizmi v kefirnem zrnu niso enostavno pomešani med seboj, ampak imajo visoko stopnjo organiziranosti [14]. Na površinskih predelih zrna prevladujejo kratki, dolgi in ukrivljeni laktobacili, v notranjosti zrna pa prevladujejo kvasovke. V vmesnem področju se ravnotežje med kvasovkami in bakterijami spreminja proporcionalno z razdaljo od jedra. [1, 6, 14, 15] Ker nastanek kefirnih zrn še vedno ni razložen, se nova kefirna zrna proizvajajo s pomočjo rasti in delitve obstoječih kefirnih zrn [2, 20]. Ravno nerazumevanje spontanega nastanka kefirnih zrn preprečuje izdelavo le-teh s pomočjo čistih kultur iz kefirne mikroflore [2]. Vendar so prva kefirna zrna morala nekako nastati. Po virih [2, 15] so le ta nastala s fizičnim povezovanjem približno 30 vrst bakterij in kvasovk. To bi se naj zgodilo v usnjenih vrečah iz kozjih kož napolnjenih z mlekom, ki se je inokliralo z mikrofloro ovčjega prebavnega sistema. Tej zmesi pa bi se naj dodala kultura mikroorganizmov iz povrhnje lege v mleku. 2.2.2 Mikroorganizmi v kefirnem zrnu Kot smo že omenili v predhodni točki so mikroorganizmi v kefirnem zrnu v glavnem iz rodov Laktobacilov, Laktokokov, Leukonostok, Streptokokov, ocetno kislinskih bakterij in kvasovk. Vendar lahko natančna kombinacija bakterij in kvasovk v kefirnem zrnu močno variira glede na različne izvore kefirnih zrn [1, 10, 14, 18, 23, 24]. Prav tako k raznolikosti

metodo Stran 22 mikrobne populacije prispevajo različni kultivacijski pogoji [13, 23], pogoji shranjevanja in vzdrževanja zrn. Kateri mikroorganizmi točno se določijo v vzorcu kefirnega zrna je odvisno tudi od uporabljene metode identifikacije mikroorganizmov [2]. Zaradi tega lahko dva znanstvenika v istih kefirnih zrnih določita različno mikrobiološko sestavo. Ob upoštevanju teh dejstev podajamo pregled mikroorganizmov v kefirnem zrnu, kot jih podajajo avtorji različnih znanstvenih člankov in drugih strokovnih virov. V preglednici 2 1 se nahajajo identificirane bakterije, v preglednici 2 2 pa identificirane kvasovke. Preglednica 2-1: Največkrat identificirane bakterije v kefirnih zrnih. Mlečno kislinske bakterije Lactobacillus acidophilus 2, 4, 6, 14, 23 Lactobacillus hilgardii 4 Lactobacillus brevis 2, 4, 6, 14, 23 2, 4, 6, 14, 23-1 Lactobacillus kefir Lactobacillus casei 2, 4, 6, 14, 23 Lactobacillus kefiranofaciens Lactobacillus caucasicus 14 2, 4, 6 Lactobacillus kefirgranum Lactobacillus cellobiosus 14 Lactobacillus lactis subsp. lactis 14 Lactobacillus delbrueckii 4 Lactobacillus paracasei 4 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus parakefir 2, 14 14, 23-2 2, 4, 6, 14 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei 14 Lactobacillus fermentum 4, 6, 14, 23 Lactobacillus paracasei subsp. tolerans 14 Lactobacillus fructivorans 4 2, 4, 6, 14, 23 Lactobacillus parakefiri Lactobacillus gasseri 6 Lactobacillus plantarum Lactobacillus helveticus 2, 4, 23 Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus helveticus subsp. jugurti 14 Lactobacillus viridescens 2, 4, 14 4, 14 4, 6, 14 Ocetno kislinske bakterije Acetobacter aceti 4, 23 Acetobacter resens 23 Acetobacter pasteurianus 4 Acetobacter sp. 4 Laktokoki Lactococcus filant 14 Lactococcus lactis subsp. lactis 2, 4 Lactococcus lactis 23 Lactococcus 2, 4, 14 Lactococcus lactis subsp. cremoris lactis subsp. lactis biovar. 2, 14-3 diacetilatis Leukonostok Leuconostoc 6 Leuconostoc mesenteroides subsp. Leuconostoc dextranicum 14 dextranicum 2 Leuconostoc kefir 14 Leuconostoc mesenteroides subsp. Leuconostoc lactis 2 mesenteroides 2 Leuconostoc mesenteroides 4, 14, 23 Leuconostoc sp. 4 Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris 2 Druge bakterije Bacillus sp. 4 Escherichia coli 4 Bacillus subtilis 4 Micrococcus sp. 4 Enterococcus durans 4 Streptococcus thermophilus 2, 4 1 V viru 23 je mikroorganizem poimenovan Lactobacillus kefiri. 2 V viru 23 je mikroorganizem poimenovan Lactobacillus parakefiri. 3 V viru 14 je mikroorganizem poimenovan Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis.

metodo Stran 23 Preglednica 2-2: Največkrat identificirane kvasovke v kefirnih zrnih. Kvasovke Brettanomyces anomalus 2, 4 2, 4, 6, 23 Kluyveromyces marxianus Candida friedricchi 4, 6, 14-4 Kluyveromyces marxianus var. marxianus 14 Candida holmii 4, 6, 14 Mycotorula kefyr 14 Candida inconspicua 4 Mycotorula lactis 14 Candida kefyr 4, 6-5 2, 4, 6 Pichia fermentans Candida lambica 4, 23 2, 4, 6, 14 Saccharomyces cerevisiae Candida maris 4 4, 14 Saccharomyces dairensis Candida pseudotropicalis 4, 14 Saccharomyces delbrueckii 4, 6-6 Candida tannotelerans 4 2, 4, 14, 23 Saccharomyces exiguus Candida tenuis 4 Saccharomyces globus 14 Candida valida 14 Saccharomyces turicensis 2, 4 Candida valida 6 4 Saccharomyces sp. 4 Debaryomyces hansenii 2 2, 4, 6, 14-7 Saccharomyces unisporus Geotrichum candidum 23 14, 23 Torula kefir Issatchenkia occidentalis 4 Torulopsis holmii 6 Kluyveromyces fragilis 14 2, 4, 6, 14 Torulaspora delbrueckii Kluyveromyces lactis 14 Zygosaccharomyces florentinus 14 2.2.3 Faktorji vpliva na rast kefirnih zrn Glede na strokovne vire vplivajo na rast kefirnih zrn temperatura pri inokulaciji in pri fermentaciji, ki hkrati predstavlja razmnoževalno fazo kefirnih zrn, koncentracija kefirnih zrn, tip mleka, količina maščob v mleku, različni dodatki k mleku in mešanje rastnega medija in kefirnih zrn. Na rast kefirnih zrn pa bi naj imelo vpliv tudi prepihovanje rastnega medija. Temperaturni interval gojenja kefirja, opisan v strokovni literaturi, je, T = (18 30) C [9]. Pri virih, ki navajajo več različnih temperatur, so te običajno razporejene v enakomernih korakih. Časi poizkusov ki jih za proizvodnjo kefirnih zrn navajajo strokovni viri segajo, t = 18 h [9] do t = 24 h [9, 23]. Običajno so bili časi poizkusov, t = 24 h, kar je tudi priporočeni čas fermentacije kefirja. Seveda je rast kefirnih zrn odvisna tudi od začetne koncentracije le-teh. Glede koncentracije kefirnih zrn v rastnem mediju vsak vir navaja drugačne podatke. Koncentracije kefirnih zrn segajo vse od, γ zrn = 5 g/l [7] do γ zrn = 100 g/l [9, 23]. Kefirna zrna so se v večini primerov gojila v kravjem mleku. Uporabljeno mleko je bilo pri tem pasterizirano ali tudi ne. Vsebnost mlečnih maščob je bila v različnih virih, w maščob = (2 4) % [9]. Pri nekaterih virih ni povsem jasna količina vsebovanih mlečnih maščob, saj so mleka opisana le s pojmi kot so: pol mastno ali polno mastno, posneto in pol posneto mleko. Vsebnost mlečnih maščob v tako opisanih vrstah mleka variira glede na državo, v kateri so bili poskusi izvedeni in glede na tam veljavno prehrambeno zakonodajo. Kot alternativni rastni medij v literaturi [20] se navaja nevtralizirano sirotko, v drugi literaturi [7] pa sintetični rastni medij, ki vsebuje obsežen seznam različnih snovi. 4 V viru 14 je mikroorganizem poimenovan Candida friedrichii. 5 V viru 6 je mikroorganizem poimenovan Candida kefir. 6 V viru 6 je mikroorganizem poimenovan Saccharomyces delbrueki. 7 V viru 14 je mikroorganizem poimenovan Saccharomyces unispores.

metodo Stran 24 Sintetičnim medijem so se kot hranilo dodajali čisti monosaharidi in disaharidi ter njihove kombinacije v različnih razmerjih. Uporabljena monosaharida sta bila glukoza in fruktoza. Med disaharidi pa saharoza, laktoza in maltoza [7]. Rastnemu mediju se je dodajal tudi ekstrakt kvasovk v koncentracijah, w ye = (4 20) g/l [7, 9, 23]. Sintetičnemu mediju se je prav tako dodajala sečnina s koncentracijo, γ urea = 5 g/l [23] in MgSO 4 *7H 2 O, γ Mg = 5 g/l [23]. ph sintetičnega rastnega medija se je uravnal na, ph = 5,5, z nasičeno raztopino Na 2 CO 3 [7]. Mešanje se je glede na različne vire izvajalo na različne načine. Vir [9] navaja neprekinjeno mešanje z vrtilno frekvenco, f m = 130 min -1, medtem ko vir [23] navaja uporabo stresalnika pri enaki vrtilni frekvenci. Vir [3] pa navaja le, da je za rast kefirnih zrn optimalno 3 do 5 kratno mešanje rastnega medija, pri čemer podaja načina mešanja ali pa vrtilne frekvence mešanja. Glede spiranja kefirnih zrn, vsi viri navajajo, da uporaba destilirane vode ali vodovodne vode upočasnjuje rast kefirnih zrn in zato ni priporočljivo. Vir [7] pa še posebej navaja prezračevanje rastnega medija s pretokom zraka, q z = 3 L/min, kar naj bi zagotavljalo povsem aerobne rastne pogoje s koncentracijami kisika med, γ O2 = (6,5-7,2) mg/l. 2.2.4 Skladiščenje in reaktivacija kefirnih zrn Pri množični proizvodnji kefirnih zrn postane problem skladiščenja le-teh neizogiben. Vse metode skladiščenja kefirnih zrn niso enako primerne ali učinkovite. Prav tako ima vsaka metoda svoje prednosti in slabosti. Že takoj na začetku je potrebno omeniti, da sušenje kefirnih zrn, ki je zelo običajni delovni korak pri pripravi kefirnih zrn na skladiščenje, ne sme biti izvedeno pri povišanih temperaturah, saj tega mikroflora v kefirnih zrnih ne bi preživela [20]. Primernejše je sušenje kefirnih zrn pri sobni temperaturi za 36 do 48 ur. Tako posušen zrna lahko obdržijo svojo aktivnost 12 do 18 mesecev [2, 10, 14, 25]. Tak način skladiščenja tudi omenja mnogo nestrokovnih člankov, ki so jih objavili različni ljudje na svojih spletnih straneh in v forumih. Za daljše skladiščenje je primerna tudi liofilizacija. Vendar pri njej odmre velik del kvasovk v kefirnih zrnih. Zato je potrebno tako pripravljenim vzorcem dodati še dodatno količino kvasov iz kefirnih zrn, da pri uporabi liofiliziranega vzorca ponovno dobimo uravnoteženo mikrofloro [20]. Za kratkoročno skladiščenje je možno tudi, da kefirna zrna speremo z ohlajeno prekuhano vodo in jih nato v vodi ali mleku skladiščimo pri temperaturi, T = (4 7) C od 8 do 10 dni [8, 14, 25]. Pri periodičnem menjavanju mleka je lahko čas skladiščenja še daljši [20]. Skladiščena zrna je pred uporabo potrebno ponovno reaktivirati. Za reaktivacijo kefirnih zrn je na razpolago mnogo postopkov. Vendar imajo vsi postopki zelo podoben princip. Kefirna zrna prenesemo v manjšo količino vode ali mleka s temperaturo okrog, T = 20 C. Nato pustimo zrna mirovati, t = (12 24) h in postopek nekajkrat ponovimo. Pri reaktivaciji kefirnih zrn v mleku je potrebno upoštevati, da kefir, proizveden v prvih dneh reaktivacije, še ni primeren za uživanje. [8, 10] 2.3 Proizvodni postopki kefirja Kefir se danes industrijsko proizvaja v glavnem po treh metodah, klasični, ruski in sodobni metodi. Klasična metoda se je razvila kot prva in dejansko predstavlja le industrializacijo domače proizvodnje kefirja. Ruska metoda že predstavlja naslednji korak pri industrijski

metodo Stran 25 proizvodnji kefirja. Glavna razlika med klasično in rusko metodo je v tem, da ruska metoda uporablja kefir, dobljen po klasični metodi kot matično kulturo za proizvodnjo kefirja v drugi stopnji. Zadnji korak pri industrializaciji proizvodnje kefirja pa predstavlja sodobna metoda, pri kateri se kefir proizvaja s pomočjo čistih, definiranih kultur mikroorganizmov. Tradicionalno se je kefir na Kavkazu proizvajal iz surovega mleka, kateremu so dodali kefirna zrna. Mleko je nato pri sobni temperaturi fermentiralo 24 ur. Po tem času se nastali kefir odstrani z odtakanjem od kefirnih zrn, ki jih zadržijo z roko [13]. Tako so se lahko pripravile le majhne količine kefirja, ki je imel rok uporabnosti le dva do tri dni [14]. Domača proizvodnja kefirja se bistveno ne razlikuje od tradicionalne proizvodnje kefirja. Največji razliki sta verjetno v tem, da se pri domači proizvodnji uporablja pretežno toplotno obdelano mleko. Mleku s temperaturo, T = (18 25) C se doda, w zrn = (2 10) % [5, 8, 12, 20] kefirnih zrn za, t = (12 48) h [5, 8, 11, 12, 13, 20]. Po končani fermentaciji se kefirna zrna odstranijo s pomočjo cedila [8, 11, 12, 13, 20]. Odstranjena zrna nato lahko uporabimo za proizvodnjo nove šarže kefirja. Pri tem je priporočljivo, da se del kefirjevega napitka prenaša iz ene v drugo šaržo [10]. Pripomočki, uporabljeni pri proizvodnji kefirja, naj ne-bi bili iz kovine, kajti kisline v kefirju bi lahko omogočile tem kovinam vstop v organizem [10]. 2.3.1 Klasična metoda Klasična proizvodna metoda kefirja je dejansko le industrializirana proizvodnja kefirja, kot se izvaja tradicionalno ali doma. Seveda tudi tu velja, da se je potrebno izogibati uporabi kovinskih pripomočkov. Vendar nerjaveča posoda ali pribor ne predstavlja pretiranega tveganja. Kljub temu se bolj priporoča uporaba steklenih ali plastičnih pripomočkov [10]. Po toplotni obdelavi mleka in standardizaciji vsebnosti maščob v mleku na, w maščob = (2 4) % [9], se mleko s temperaturo, T = (18 25) C [1, 2, 9, 14, 21, 23, 25] inokulira. Po inokulaciji z masnim deležem kefirnimi zrni, w zrn = (2 10) %, [1, 14, 21, 23] poteka fermentacija pri enostopenjskih procesih običajno 24 ur [1, 9, 14, 21, 23]. Pri dvostopenjskih procesih je prva faza inokulacija in primarna fermentacija, ki poteka pri enakih temperaturah, kot enostopenjski proces. Trajanje prve stopnje pa je skrajšano na, t = (6 20) h [1, 2, 25]. V tem času ne nastane zmeraj dovolj metaboličnih produktov odgovornih za okus, aromo in konsistenco kefirja. Zato obstaja še stopnja zorenja [2]. V tej stopnji se tvorijo vsi metabolični produkti. Stopnja zorenja lahko traja, t = (12 72) h in običajno poteka pri temperaturi, T = (8 10) C [1, 25]. Čas zorenja je odvisen od časa in temperature primarne fermentacije. Prav tako je od primarne faze fermentacije odvisen čas hlajenja kefirja na temperaturo zorenja. Krajši, kot je čas primarne fermentacije, počasnejše je hlajenje in daljši je čas zorenja, daljša primarna fermentacija pa seveda pomeni hitrejše hlajenje in krajši čas zorenja. Po končani fermentaciji oz. zorenju, v primeru dvostopenjskega procesa, se kefirna zrna odstranijo iz kefirja s precejanjem ali filtriranjem [1, 9, 14, 21, 23, 25]. Odstranjena kefirna zrna se nato nežno očistijo s čisto vodo in uporabijo za inokulacijo nove šarže mleka. V primeru prebitka kefirnih zrn se lahko po spiranju, le-ta, posušijo in shranijo za poznejšo uporabo [1, 5, 9 21]. Alternativa uporabi svežih kefirnih zrn je uporaba liofiliziranih kefirnih zrn. Le-ta je seveda potrebno pred uporabo rehidrirati. To izvedemo z dvakratnim prenosom kefirnih zrn v sterilno raztopino NaCl, w Na = 0,9 %, nato pa še v mleko pri, T = 25 C, vsakokrat za, t = 24 h [25]. Iz ravnokar navedenega so razvidne sledeče slabosti klasične metode. Le-ta je delovno intenzivna, saj jo sestavlja kar nekaj delovnih korakov. Vsak izmed njih pa predstavlja možni vir kontaminacije proizvodnje [12]. Prav tako je količina kefirnih zrn, potrebnih za proizvodnjo velika, glede na količino proizvedenega kefirja. Problem pa običajno predstavlja kratki rok trajanja tako proizvedenega kefirja, ki je običajno do tri dni [14].

metodo Stran 26 Seveda ima klasična proizvodnja tudi svoje prednosti. Predvsem je to avtentičnost tradicionalnega kefirja in s tem povezani zdravilni učinki. Kot navedeno v razdelku 1.1.4, so zdravilni učinki kefirja posledica pestre in številčne probiotične mikrobne populacije. 2.3.2 Ruska metoda Ruska metoda proizvodnje kefirja predstavlja naslednji korak v industrializaciji proizvodnje kefirja. Od klasične proizvodne metode se razlikuje predvsem v tem, da je sestavljena iz dveh korakov, ki uporabljata različne starter kulture za proizvodnjo kefirja [12, 14]. Prva stopnja proizvodnje je zelo podobna klasični metodi. Toplotno obdelano mleko se inokulira z masnim deležem kefirnih zrn, w zrn = (2 3) %, [2, 12, 14] za, t = 24 h, [6, 14] pri temperaturi, T = (20 28) C [6, 14]. V tem času je koristno zagotoviti mešanje mleka [6]. Po odstranitvi kefirnih zrn s precejanjem ali filtriranjem dobimo kefir, kot pri klasični metodi. Pri ruski metodi ta kefir predstavlja količinski starter za drugi proizvodni korak [2, 6]. Tako pridobljeni količinski starter vsebuje vse glavne rodove mikroorganizmov, prisotnih v kefirnem zrnu. Število živih mlečno kislinskih bakterij in kvasovk na mililiter je lahko enako visoko kot v samem kefirnem zrnu. Razlika med mikrobiološko sestavo količinskega starterja in kefirnega zrna je lahko višje število kokov kot laktobacilov [23]. V drugi proizvodni stopnji se toplotno obdelano mleko inokulira z, w st = 1 3 %, količinskega starterja iz prve stopnje [6, 12, 14]. Druga fermentacija traja, t = (12 24) h [6, 12, 14] pri, T = (20 25) C [14]. Po končani drugi stopnji se kefir ohladi na temperaturo hladilnika, pri kateri se lahko nato skladišči [6]. Največja prednost ruske metode pred klasično je manjša poraba kefirnih zrn na enoto proizvedenega kefirja. Pri enaki porabi kefirnih zrn se po ruski metodi proizvede približno trideset krat toliko kefirja kot po klasični metodi. Zato je ruska metoda tudi delovno manj intenzivna od klasične proizvodne. Tako je tudi primernejša za industrijsko proizvodnjo [12]. Večja proizvodnja kefirja, ki je posledica dveh zaporednih fermentacij in je prednost ruske metode, je hkrati tudi njena slabost. Večkratno cepljenje mleka namreč povečuje možnost kontaminacije končnega izdelka. Druga slabost oz. pomanjkljivost ruske metode je proizvodnja kefirja indirektno iz kefirnih zrn. Zato tako proizvedeni kefir nima več avtentičnega okusa in drugih organoleptičnih lastnosti. Prav tako pa so delno vprašljivi tudi zdravilni učinki, ki so značilni za kefir, proizveden po tradicionalni metodi. 2.3.3 Moderna metoda Kot zadnja se je razvila moderna metoda proizvodnje kefirja, ki namesto kefirnih zrn za proizvodnjo uporablja čiste, definirane kulture mikroorganizmov. Kot pri predhodnih dveh metodah je tudi pri moderni metodi potrebno mleko pred uporabo toplotno obdelati. To izvedemo s homogenizacijo mleka na, w ss = 8%, suhe snovi, ki se doseže s, t = (5 10) min, gretjem mleka na, T = (90 95) C [5]. Po homogenizaciji se v proizvodnem delu ločita dva glavna postopka. Eden s hkratno inokulacijo mleka z mlečno kislinskimi bakterijami in kvasovkami. Alternativno lahko imamo dve ločeni fermentaciji. Eno z mlečno kislinskimi bakterijami, drugo pa z kvasovkami [1, 12, 14]. Pri zaporednem cepljenju mleka se prvo inokulira z, w mkb = (1 8) %, mlečno kislinskih bakterij pri, T = (18 27) C, za, t = (18 24) h [1, 5, 15]. Čas fermentacije se lahko določa tudi s ph vrednostjo, ko ta doseže vrednost 4,4, se fermentacija zaključi [1]. Med ali po hlajenju fermentiranega mleka na, T = (12 14) C, ali na, T = (3 10) C, ga inokuliramo z, w y = (0,02 0,2) %, kvasovk. Druga fermentacija traja, t = 24 h. Po končani drugi fermentaciji se končni izdelek skladišči pri, T = 4 C [1, 5]. Bakterijski starter običajno vsebuje laktobacile in laktokoke. Drugi starter pa vsebuje Candido kefir in Lactobacilus Brevis [1].

metodo Stran 27 Za inokulacijo se uporabi bakterijski starter, ki vsebuje Lactobacillus delbrueckii spp. Bulgaricus, Streptococcus salivarius spp. thermophilus (jogurt starter), Lb. acidophilus, Lc. Lactis in Leuconostoc spp. Prva stopnja fermentacije traja, t = 6 h, pri, T = 32 C, druga fermentacija pa, t = 24 h, pri, T = 20 C, s starterjem iz kvasovk in sicer v steklenicah, ki prenesejo visok tlak, saj nastaja CO 2. Po končani fermentaciji se steklenice skladiščijo pri, T = 4 C [1]. Pri vzporednem cepljenju dveh ločenih šarž mleka, se ena cepi z bakterijskim starterjem, enako kot pri zaporednem cepljenju. Druga šarža mleka pa se cepi s starterjem, ki vsebuje Candido kefir in Lactobacillus brevis. Fermentacija z kvasovkami poteka, t = 18 h, pri, T = 33 C. Ko sta obe fermentaciji končani, se fermentirana mleka premešajo in ohladita na temperaturo skladiščenja, pri kateri zorijo. Tako pripravljen kefir ima rok uporabnosti približno 10 dni [1]. Pri proizvodnih postopkih, ki potekajo v dveh korakih, je potrebno pri inokulaciji kvasovk dodajati saharozo, če inokulat vsebuje laktozo ne fermentirajoče kvasovke kot so na primer Saccharomices cerevisiae [2]. Ne glede na različico moderne metode, je najzahtevnejši del proizvodnje določiti prave kombinacije bakterij in kvasovk, ki bodo dale organoleptične in zdravilne učinke tradicionalnega kefirja [12]. Čiste kulture bakterij in kvasovk se izolirajo iz kefirnih zrn [2, 14]. Za potrebe moderne metode proizvodnje kefirja so bili eksperimentalno razviti tudi različni mikroorganizmi, ki bi nadomestili mikrofloro kefirnih zrn, poenostavili proizvodnjo kefirja oz. omogočili njegovo modifikacijo [2]. Naprej pripravljene mešanice mikroorganizmov ali čiste kulture so dostopne v liofilizirani obliki. Za pripravo matične kulture se 1 gramska vrečka liofiliziranega starterja prenese v toplotno obdelano mleko (V = 3 L) pri temperaturi, T = 20 C, za, t = 20 h. Matična kultura pri tem vsebuje približno 80 % laktokokov, 5 % laktobacilov in 5 % kvasovk [1]. Prednost moderne metode pred rusko in klasično proizvodno je predvsem v standardizaciji proizvedenega kefirja. To omogoča uporaba čistih in definiranih mikrobioloških kultur. Pri ruski in klasični proizvodni metodi pa se mikroflora kefirnih zrn oz. matične kulture s časom spreminja. Druge prednosti moderne metode so še poenostavitev proizvodnega postopka in zmanjšano tveganje za kontaminacijo kefirja, saj se lahko pri nekaterih postopkih uporabijo direktno liofilizirane kulture. Pri tem ni potrebno pripravljati matične kulture, kar odstrani en proizvodni korak in zmanjša možnost kontaminacije. Možnost kontroliranega spreminjanja mikrobiološke sestave omogoča tudi proizvodnjo kefirja s prav posebnimi ali specifičnimi lastnostmi. Ravno ta prednost pa predstavlja tudi eno največjih slabosti moderne metode. Definiranje prave mikrobiološke mešanice, z enakimi organoleptičnimi lastnostmi, kot jih ima tradicionalni kefir, je torej zelo zahtevno [2, 12]. 2.4 Pregled izvedenih raziskav V literaturi smo zasledili mnogo raziskav iz področja kefirja in kefirnih zrn. Avtorji so se omejili predvsem na identifikacijo mikrobne populacije, določanje optimalnih proizvodnih pogojev kefirja in povečanje prirasti kefirnih zrn. Raziskovali so tudi zdravilne učinke kefirja in kefirnih zrn, kot tudi alternativne možnosti uporabe kefirnih zrn in njihove mikroflore v različne druge namene. V tem diplomskem delu smo analizirali procesne parametre, ki vplivajo na povečanje prirasti kefirnih zrn.

metodo Stran 28 2.4.1 Identifikacija mikrobne populacije Pri identifikaciji mikroflore kefirnega zrna, so pozornost usmerjali na spreminjanje sestave mikroflore glede na izvor kefirnih zrn, proizvodne postopke in skladiščenj, katerim so bila zrna izpostavljena, kot tudi na stopnjo v proizvodnji, v kateri je bil vzorec kulture odvzet. Rezultati teh raziskav so potrdili naravno spreminjanje mikrobiološke sestave kefirnih zrn in posledično tudi proizvedenega kefirja s časom [4, 23, 26]. V drugih študijah so se ukvarjali z zasledovanjem mikrobiološke raznolikosti na poti od kefirnega zrna do kefir iz kefirnih zrn in kefirja iz kefirja kot količinskega starterja [3, 27]. Ker se mikrobiološka sestava na tej poti lahko močno spremeni, je za proizvodnjo pravega kefirja potrebno uporabljati izključno kefirna zrna in ne drugih starterjev [4]. Pri identifikaciji mikrobne populacije v kefirnem zrnu je potrebno upoštevati metodo proizvodnje kefirja, izvor kefirnih zrn in uporabljeno metodo mikrobne identifikacije. Le z upoštevanjem vseh teh faktorjev so različne raziskave med seboj primerljive. Če pa teh faktorjev ne upoštevamo dobimo kot rezultat visoko raznolikost mikrobne populacije [4, 23]. Obsežne so tudi raziskave glede organoleptičnih lastnosti kefirja v odvisnosti od različnih faktorjev in posledično optimizacije proizvodnih postopkov. Med preiskovanimi faktorji so bili velikost inokuluma, čas in temperatura fermentacije, hitrost hlajenja in čas zorenja kefirja, kot tudi mešanje fermentacijske mešanice. Na organoleptične lastnosti ima vpliv tudi vrsta mleka (kravje, ovčje, kozje, konjsko, ) in vsebnost maščob v njem [4, 12, 28]. Povsem lastno področje raziskav predstavljajo študije, ki proučujejo mešanje čistih definiranih mikrobioloških kultur za proizvodnjo pravega kefirja oz. kefirja, ki je zelo podoben pravemu. Take mešanice kultur so za uporabo v modernih proizvodnih postopkih dosegljive v liofilizirani obliki [3, 12]. 2.4.2 Optimiranje rastnih pogojev in povečanje prirasti kefirnih zrn Pri moderni proizvodnji kefirja s kontinuirnim gojenjem v mleku prirast mikrobne biomase v kefirnem zrnu znaša, Δγ zrn,r = (5 7) % na dan, kar je premalo za industrijsko proizvodnjo kefirnih zrn. Pri pregledu raznih znanstvenih virov smo ugotovili, da na prirast kefirnih zrn vpliva kombinacija različnih faktorjev. Mednje sodijo temperatura, spiranje zrn, različni dodatki k rastnemu mediju, redno menjavanje mleka in mešanje [7, 9, 23]. Na prirast kefirnih zrn pa vplivajo tudi vsebnost maščob v mleku, velikost inokuluma in stopnja aeracije [6, 7, 9]. Temperaturni interval rasti kefirnih zrn je, T = (4 35) C [9, 13]. Optimalno področje rasti zrn je bistveno ožje, običajno v intervalu, T = (22 30) C [7, 9, 23, 26]. Natančni optimum je zmeraj odvisen od mikrobiološke sestave kefirnega zrna in ostalih pogojev v rastnem mediju. Po viru [26] lahko temperatura med potekom fermentacije kefirja niha v področju T = (18 30) C. Klub temu, da različni viri (predvsem zahodni) priporočajo spiranje kefirnih zrn pred vsako uporabo. Nekateri navajajo, da spiranje upočasnjuje rast mikroorganizmov v zrnih. Vzhodna literatura in ljudje, ki se z gojenjem kefirja ukvarjajo že od mladih let, spiranja kefirnih zrn z vodo ne priporočajo. Nobena študija pa ne vsebuje empiričnih dokazov, ki bi potrdili ali ovrgli te trditve [9, 26]. Kot dodatek mleku se v literaturi največkrat navajajo ekstrakt kvasovk, sečnina ali triptoza [9, 23]. Vendar so poizkuse proizvodnje kefirnih zrn izvajali v ozračenem sintetičnem mediju. S pretokom zraka (q z = 3 L/min) so zagotovili aerobne pogoje s koncentracijo kisika, γ O2 = (6,5 7,2) mg/l. Ob dodatku ogljikovih hidratov, kot so bili glukoza in fruktoza ter saharoza, laktoza in maltoza v različnih koncentracijah, so bili dodani še (NH 4 ) 2 SO 4, KH 2 PO 4, MgSO 4 *7H 2 O, kot tudi ekstrakt kvasovk. ph vrednost sintetičnega rastnega

metodo Stran 29 medija je bila 5,5 in se je regulirala s pomočjo nasičene raztopine Na 2 CO 3. Izkazalo se je, da pri dodatku posameznega sladkorja dosega najvišje prirastke fruktoza. Pri kombinaciji sladkorjev pa najvišji prirastek daje mešanica glukoze in saharoze v razmerju, ζ = 1:3 [7]. Glede mešanja smo v objavljenih virih zasledili le dve uporabljeni hitrosti mešanja. Rastnega medija s kefirnimi zrni sploh niso mešali ali pa so ga mešali z vrtilno frekvenco mešala, f m = 130 min -1. Pri poizkusih so uporabljali mešala v posodah oz. manjše posode na stresalnikih. Rezultati so, ne glede na način mešanja, pokazali znatno povišanje prirastka kefirnih zrn pri poskusih z mešanjem glede na poskuse, pri katerih mešanja ni bilo. Mešanje je najverjetneje izboljšalo prenos hranilnih snovi med rastnim medijem in kefirnimi zrni [9, 23]. Vsebnost maščob v rastnem mediju je, glede na rezultate v literaturi, igrala le manjšo vlogo. Saj so pol mastna mleka v poskusih brez mešanja dajala le nekoliko višje prirastke kefirnih zrn kot polno mastna mleka pri enakih pogojih. V poskusih z mešanjem se je že tako ali tako majhna razlika, med pol mastnim in polno mastnim mlekom, skorajda povsem izničila [6, 7, 9]. Velikost inokuluma je glede na različne študije vire variirala. Običajne koncentracije so od γ zrn = (5 100) g/l. Enako velja za čas fermentacije kefirja. V različnih virih so podani časi fermentacije, t = (12 48) h. Vsi poskusi, povezani s proučevanjem prirasti kefirnih zrn pa so trajali, t = 24 h [7, 9, 23]. V študiji [23] je bilo tudi ugotovljeno, da koncentracija mikroorganizmov v kefirnem zrnu pri daljši neprekinjeni proizvodnji kefirja ali intenzivnem gojenju kefirnih zrn počasi upada. Naravnega upadanja koncentracije mikroorganizmov pri intenzivnem gojenju kefirnih zrn ni bilo zaznati v primerih, ko se je rastnemu mediju dodal ekstrakt kvasovk ali sečnina. Praktično vse raziskave, ki so preučevale prirast kefirnih zrn, so sledile podobnemu vzorcu. Sprva se je določil temperaturni optimum za prirast kefirnih zrn. Temu je sledilo določanje vpliva ostalih faktorjev na prirast kefirnih zrn, kot tudi njihova optimizacija. 2.4.3 Zdravilni učinki Raziskave zdravilnih učinkov kefirja in kefirnih zrn izvajajo po celem svetu. Nekateri preverjeni učinki in domnevni učinki, ki se preiskujejo, so bili že omenjeni v podrazdelku 2.1.4. Raziskujejo pa se tudi antimikrobne lastnosti kefirnih zrn. V in vitro poskusih so kefirna zrna pokazala antimikrobno aktivnost proti širokemu spektru Gram pozitivnih in negativnih bakterij, kot tudi proti nekaterim vrstam gliv [12]. 2.4.4 Alternativne raziskave Raziskave o uporabnosti kefirnih zrn se izvajajo tudi na drugih področjih živilske industrije. V to področje spadajo na primer raziskave o uporabnosti kefirnih zrn kot nadomestku za pekovski kvas. Tako bi naj kruh zaradi antimikrobnih učinkov omenjenih v podrazdelku 2.4.3 dobil boljši okus in daljši rok uporabnosti. Enaka študija se ukvarja tudi z možnostjo uporabe različnih odpadkov živilske industrije kot rastni medij za množično proizvodnjo kefirnih zrn. Med te odpadke spadajo mlečna sirotka, melasa, preostanki predelave citrusov, škrob in še druge snovi [7]. Nekatere študije se ukvarjajo tudi z raziskavami možnosti uporabe imobiliziranih kvasovk iz kefirnih zrn za industrijsko proizvodnjo etanola v temperaturnem območju, T = (5 30) C [4].

metodo Stran 30 3 METODE IN MATERIALI Eksperimentalni del raziskav v okviru diplomskega dela smo opravljali v laboratoriju za bioreakcijsko tehniko. Prvi del je predstavljal določanje optimalnih rastnih pogojev kefirnih zrn v polnomastnem kravjem mleku. Pri tem smo preverjali vpliv temperature (T = 20, 22, 24 in 26 C), masne koncentracije glukoze (γ glukoze = 0, 10, 20 in 30 g/l), masne koncentracije kvasa (γ kvas = 0, 10, 20 in 30 g/l) ter vrtilne frekvence mešala (f m = 0, 50, 70 in 90 min -1 ) na prirast kefirnih zrn. V drugem, dodatnem delu raziskav, smo pri optimalnih rastnih pogojih preverili še vpliv sestave mleka na prirast kefirnih zrn. Vse eksperimente smo izvajali v steklenem reaktorju RC1e proizvajalca METTLER TOLEDO. 3.1 Kemikalije Pri poskusih smo uporabljali sledeče kemikalije: vodovodna voda, za spiranje kefirnih zrn in opreme; sladkor D (+) glukoza, brezvodna, (C 6 H 12 O 6 ) proizvajalca FLUKA, w = 99,9 %; svež pekovski kvas proizvajalca ŽITO; aktivirana kefirna zrna mlekarne Kele & Kele iz Laz pri Logatcu; sveže, pasterizirano mleko proizvajalca Ljubljanske mlekarne, s 3,5% mlečne maščobe. V drugem delu poskusov smo uporabili ob prvem mleku uporabili še pet drugih vrst mleka. Sestava posameznih vrst mleka je opisana v preglednici 3 1. Splošne lastnosti kemikalij D (+) glukoza je znana pod imeni grozdni sladkor in dekstroza. Je najpogostejši monosaharid. Kot taka se nahaja v mnogih sadežih, krvi in medu. Kemijsko vezana pa se nahaja v saharozi, maltozi, laktozi, celulozi in škrobu ter še drugih ogljikovih hidratih [29]. Svež pekovski kvas je koncentrirana suspenzija Saccharomices cerevisiae. Za vsak poskus smo uporabljali svežega. Kefirna zrna smo natančno opisali že v razdelku 2.2. Uporabljali smo sveže pasterizirano mleko s 3,5 % mlečne maščobe proizvajalca Ljubljanske mlekarne. Po tem bi se dalo sklepati, da je mleko definirana kemikalija s konstantno sestavo. Vendar temu ni tako. Ob kefirnih zrnih je mleko najbolj kompleksna kemikalija, uporabljena v naši poskusni postavitvi.

metodo Stran 31 Preglednica 3-1: Osnovna kemijska sestava uporabljenih vrst mleka. Mleko 1 2 3 4 5 6 EV (kj / kcal) 262 / 62 188 / 45 193 / 46 151 / 36 193 / 46 265 / 63 BE (g) 3,2 3,3 3,2 3,2 3,2 3,3 CH (g) 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,7 MA (g) 3,5 1,5 1,6 0,5 1,6 3,5 Ca (mg) 120 120 120 160 NA (mg) 3,60 V A (mg) 0,16 0,03 0,03 V B1 (mg) 0,26 0,05 V B6 (mg) 0,40 V D (μg) 0,05 V E (mg) 2,00 O3 (mg) 30 OH (mg) 1,50 Razlaga indeksov mlek in okrajšav: 1 Sveže polno mleko, Ljubljanske mlekarne 2 Lejko mlejko + 5 Vitaminov, Pomurske mlekarne 3 Alpsko mleko omega 3, Ljubljanske mlekarne 4 Alpsko mleko posneto, Ljubljanske mlekarne 5 Alpsko mleko Kalcij, Ljubljanske mlekarne 6 Haltbare Vollmilch, Avstrijska mlekarna Almliesel EV energijska vrednost BE beljakovine CH ogljikovi hidrati MA maščobe Ca kalcij NA niacin V A vitamin A V B1 vitamin B1 V B6 vitamin B6 V D vitamin D V E vitamin E O3 ω3 nenasičene maščobne kisline HO holesterol

metodo Stran 32 3.2 Laboratorijska oprema Pri eksperimentih smo uporabljali sledečo opremo: Filterni papir črni trak z oznako 391 proizvajalca SARTORIUS, za sušenje kefirnih zrn. Na tak način se je voda hitreje odvedla iz kefirnih zrn. Urna stekla različnih velikosti so služila različnim namenom. Večja smo uporabljali za pokrivanje steklenih čaš s paralelkami kefirnih zrn v mirovanju. Manjša urna stekla pa smo uporabljali kot podlage na katerih smo tehtali in sušili kefirna zrna. Plastično cedilko smo uporabljali za ločevanje kefirnih zrn od kefirja (napitka). Prav tako smo v njej pod tekočo vodo odstranjevali trdne ostanke mleka in kefirja iz kefirnih zrn. Leseno kuhalko smo uporabljali za mešanje kefirnih zrn med pranjem v cedilu. Plastična žlička se je uporabljala za prenašanje kefirnih zrn iz posode v posodo in tudi za doziranje kefirnih zrn. Spatulo smo uporabljali za doziranje pekovskega kvasa in pripravo njegovih raztopin. Z laboratorijsko žličko smo dozirali in pripravljali raztopine glukoze. Steklene čaše z volumnom 200, 400 in 600 ml smo uporabljali za praznjenje reaktorja, kot tudi za pripravo raztopin kvasa in sladkorja, ki smo jih potrebovali pri posameznih poskusih. 1000 ml čaša pa se je uporabljala za shranjevanje in aktivacijo kefirnih zrn, ki so bila v mirovanju. Digitalni tehtnici tipa PG 5002-S in PG 5002-S ELTA RANGE proizvajalca METTLER-TOLEDO smo uporabljali za doziranje dodatkov rastnemu mediju, kot tudi za gravimetrično določanje prirastka kefirnih zrn v poizkusu. V steklenem šaržnem reaktorju RC1e proizvajalca METTLER-TOLEDO smo izvajali vse poskuse. S POLYSTAT-om cc3 proizvajalca HUBER smo nastavljali in vzdrževali temperaturo v steklenem reaktorju RC1e. Relativno vsebnost kisika v posameznih poskusih v reaktorju smo merili s kisikovo elektrodo O 2 4100e proizvajalca METTLER-TOLEDO. Za povezovanje zunanjih naprav in reaktorja z računalnikom smo uporabljali povezovalni element RD10 DOSING CONTROLLER proizvajalca METTLER. Programska oprema MS-Windows WinRC na osebnem računalniku, je služila kot orodje za nastavljanje in vzdrževanje poskusnih pogojev. Hkrati pa je tudi služila kot program za shranjevanje vseh merilnih pogojev. 3.3 Aparature in računalniška oprema Poizkuse smo izvajali v avtomatskem reakcijskem kalorimetru RC1e proizvajalca METTLER-TOLEDO, ki je shematsko prikazan na sliki 3 1. Celotni sistem RC1e sestavljajo reakcijski kalorimeter s termostatom in elektronsko regulacijo, mešalom, črpalko za kroženje olja, merilni sistem, kemijski reaktor in osebni računalnik s programsko opremo MS Windows WinRC. Za povezovanje in regulacijo perifernih naprav sistema z osebnim računalnikom so na razpolago trije regulatorji DR10 DOSING

metodo Stran 33 CONTROLLER, proizvajalca METTLER. Srce sistema je šaržni reaktor (V = 2 L) z dvojnim plaščem in sidrastim mešalom. Pri uporabi steklenega pokrova je sistem uporaben pri atmosferskem tlaku, s kovinskim pokrovom pa v tlačnem področju od 0,5 do 2 bara. Za višje tlake je potrebno uporabiti kovinski reaktor. V pokrovu so ob odprtini za mešalo puščene še štiri odprtine, preko katerih je mogoče vstaviti dodatne merilne naprave. V našem primeru sta to bili kisikova elektroda O 2 4100e proizvajalca METTLER-TOLEDO in termometer. [30, 31] Sistem se uporablja za kvantitativno določanje toplotnih učinkov kemijskih reakcij in fizikalnih premen, za ovrednotenje procesnega razvoja in optimizacije procesov. RC1e omogoča avtomatsko izvajane osnovnih operacij v kemijskem laboratoriju, kot so: mešanje, segrevanje in hlajenje, dodajanje komponent, kontrola ph, destilacija, obtok in kristalizacija. Reakcije se lahko izvajajo pri izotermnih ali adiabatnih pogojih, pri konstantnem ph ali tlaku, kot tudi z viskoznejšimi snovmi. [30] Slika 3-1: Shematski prikaz reakcijskega kalorimetra RC1e