UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE Timotej BEDJANIČ ZNOTRAJCELIČNI ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL EKSTRAKTOV RAZLIČNIH SORT PARADIŽNIKA MAGISTRSKO DELO Maribor, 2019
UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE VARNOST HRANE V PREHRAMBENI VERIGI Timotej BEDJANIČ ZNOTRAJCELIČNI ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL EKSTRAKTOV RAZLIČNIH SORT PARADIŽNIKA MAGISTRSKO DELO Maribor, 2019
POPRAVKI:
III Komisijo za zagovor in oceno magistrskega sestavljajo: Predsednica: izr. prof. dr. Metka ŠIŠKO Mentor: izr. prof. dr. Tomaž LANGERHOLC Članica komisije: izr. prof. dr. Janja KRISTL Lektor: mag. Vesna Käfer Magistrsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Datum zagovora: 31. maj 2019
Bedjanič T. Znotrajcelični antioksidativni potencial ekstraktov različnih sort paradižnika. IV Znotrajcelični antioksidativni potencial ekstraktov različnih sort paradižnika UDK: 635.64:577.1(043)=163.6 Plodovi paradižnika vsebujejo različne snovi z antioksidativnimi lastnostmi, vendar med različnimi sortami paradižnika prihaja do razlik v tipih in koncentracijah teh antioksidativnih snovi. Ker je paradižnik v središču številnih epidemioloških raziskav, ki potrjujejo pozitivne učinke na zdravje ljudi, smo želeli preveriti znotrajcelični antioksidativni potencial ekstraktov različnih sort paradižnika z uporabo barvila DCFH-DA na makrofagni celični liniji TLT. V raziskavi smo uporabili 39 različnih sort paradižnika. Z uporabo celičnega modela v pogojih in vitro so rezultati potrdili različen znotrajcelični antioksidativni potencial pri različnih sortah paradižnika. Ugotovili smo, da je imela najvišji znotrajcelični antioksidativni potencial sorta paradižnika 'Osu Blue', najnižjega pa sorta 'Ildi'. V povrečju so najbolj zavirale oksidativni stres sorte z vijoličasto obarvanimi plodovi, najmanj pa tiste z oranžnimi plodovi. Korelacije med antioksidativnim potencialom in vsebnostjo suhe snovi, titracijskimi kislinami ali vsebnostjo vitamina C v plodu nismo ugotovili. Ključne besede: antioksidanti / DCFH-DA / znotrajcelični antioksidativni potencial / paradižnik OP: IX, 57 s., 10 pregl., 3 graf., 59 ref. Intracellular antioxidative potential od different tomato variety extracts Tomato fruits contain various substances with antioxidant properties, but there are differences in the types and concentrations of these antioxidant substances among the different varieties of tomatoes. Because epidemiological findings confirm the observed positive effects on human health, the aim of the study was to determine intracellular antioxidative potential od different tomato variety extracts using the DCFH-DA dye on the TLT macrophage cell line. In the study we used 39 different varieties of tomatoes. Using the cell model in vitro, the results confirmed different intracellular antioxidant potential in different tomato varieties. We found that the highest intracellular antioxidative potential had the tomato variety 'Osu Blue' and the lowest 'Ildi'. Varieties with violet-colored fruits inhibited oxidative stress the most and the least affective were varieties with orange-colored fruits. Correlations between the antioxidative potential and the dry matter content, titration acids or the content of vitamin C in the tomato fruit have not been established.
Bedjanič T. Znotrajcelični antioksidativni potencial ekstraktov različnih sort paradižnika. V Keywords: antioxidants / DCFH-DA / intracellular antioxidative potential / tomato NO: IX, 57 P., 10 Tab., 3 Graph, 59 Ref
VI Kazalo vsebine 1. UVOD... 1 2. PREGLED OBJAV... 3 2.1. Reaktivne kisikove spojine... 3 2.2. Antioksidanti... 4 2.2.1. Notranji antioksidanti... 5 2.2.2. Zunanji antioksidanti... 9 2.3. Oksidativni stres... 9 2.3.1. Lipidna peroksidacija... 11 2.3.2. Oksidacije proteinov... 12 2.3.3. Oksidacije DNA... 12 2.4. Splošne značilnosti paradižnika... 13 2.5. Kemijska sestava plodov paradižnika... 14 2.6. Antioksidanti v paradižniku... 17 2.6.1. Karotenoidi... 17 2.6.2. Askorbinska kislina... 19 2.6.3. Fenoli... 20 2.7. Antioksidativni celični test z uporabo 2,7 diklorofluorescein diacetata (DCFH-DA)... 21 3. MATERIALI IN METODE... 23 3.1. Rastlinski material... 23 3.2. Laboratorijska oprema... 24 3.3. Kemikalije... 24 3.3.1. Priprava ekstraktov paradižnika... 25 3.3.2. Priprava HBSS... 25 3.3.3. Priprava raztopine troloksa... 26
VII 3.3.4. Priprava raztopine DCFH-DA... 26 3.3.5. Priprava tert-butil hidroperoksida (t-buooh)... 27 3.4. Gojenje celične linije... 27 3.4.1. Nanos celic na mikrotitrske plošče... 28 3.4.2. Določanje antioksidativnega potenciala ekstraktov različnih kultivarjev paradižnika na celicah... 28 3.5. Izračun antioksidativnega potenciala vzorcev... 30 3.6. Statistika... 30 4. REZULTATI Z RAZPRAVO... 32 4.1. Vpliv kultivarja na znotrajcelični antioksidativni potencial... 32 4.2. Vpliv barve kultivarja na znotrajcelični antioksidativni potencial... 37 4.3. Korelacija med antioksidativnim potencialom in ostalimi spremenljivkami... 43 5. SKLEPI... 50 6. VIRI... 51
VIII Kazalo preglednic Preglednica 1: Najpomembnejši antioksidanti in njihova razdelitev glede na...kemijsko strukturo.... 5 Preglednica 2: Kemijska sestava paradižnika.... 16 Preglednica 3: Uporabljena laboratorijska oprema.... 24 Preglednica 4: Prikaz nanosa testnih substanc na mikrotitrske plošče.... 29 Preglednica 5: Test normalnosti porazdelitve podatkov med kultivarji... 35 Preglednica 6: Test normalnosti porazdelitve podatkov med barvnimi razredi... 38 Preglednica 7: Test homogenosti varianc... 38 Preglednica 8: Statistično značilne razlike v antioksidativnem potencialu med...različnimi barvnimi skupinami kultivarjev... 40 Preglednica 9: Zbirna tabela rezultatov meritev vzorcev paradižnika.... 44 Preglednica 10: Rezultati Spearmannovega korelacijskega testa povezanosti...posameznih spremenljivk..... 47 Kazalo grafikonov Grafikon 1: Grafični prikaz izmerjenega znotrajceličnega antioksidativnega... potenciala različnih kultivarjev paradižnika. Na osi x so prikazani...kultivarji, na osi.y pa izmerjene vrednosti mikromolnega ekivalenta...troloksa na gram suhe snovi ( mol ET/g SS).... 33 Grafikon 2: Graf kvartilov vseh vzorcev paradižnika s prikazano najnižjo in najvišjo...vrednostjo, mediano in rangom, kjer je skoncentrirana polovica...podatkov okrog mediane. Na y-osi ležijo vrednosti mikromolnega...ekivalenta troloksa na gram suhe snovi ( mol ET/g SS).... 34 Grafikon 3: Grafični prikaz izmerjenega znotrajceličnega antioksidativnega... potenciala različnih barvnih skupin kultivarjev paradižnika. Na y-osi
IX...ležijo vrednosti mikromolnega ekvivalenta troloksa na gram suhe snovi...( mol ET/g SS)... 39
1 1. UVOD Človek je tekom življenja izpostavljen številnim notranjim in zunanjim dejavnikom, ki v našem organizmu povzročajo nastajanje reaktivnih kisikovih spojin (ROS). Te nastajajo v nizkih koncentracijah, ki pa povzročajo oksidativni stres. Slednji vodi do številnih makroskopskih in s starostjo pogojenih posledic. Nastajanja ROS ne moremo popolnoma odstraniti, lahko pa na njihovo pogostost in obseg vplivamo s stilom življenja in prehranjevanja. Področje raziskovanja prostih radikalov v bioloških sistemih je eno najbolj dinamičnih in zaradi številnih vzrokov spada med najbolj zapletene. Za nadzor nad količino ROS v organizmu so se v času evolucijskega razvoja razvili kompleksni antioksidativni obrambni sistemi za boj proti škodljivemu delovanju kisikovih radikalov. Antioksidanti so zelo heterogena skupina snovi in jih lahko delimo v skupine po različnih kriterijih: po izvoru, po strukturi, po fizikalno kemičnih lastnostih, po mehanizmu delovanja in po možnosti obnavljanja (Pečar in Mravljak 2015). V zadnjem času so v središču mnogih raziskav zaradi ugodnih učinkov na zdravje ljudi predvsem zunanji antioksidanti. To so molekule, ki delujejo antioksidativno in jih celice prevzamejo iz okolja ter ljudje zaužijejo s hrano (Halliwell 1996). Glavna naravna vira zunanjih antioksidantov v človeški prehrani sta sadje in zelenjava, zaužijemo pa jih lahko tudi s prehranskimi dopolnili. Paradižnik (Solanum lycopersicum L.) je zaradi svoje celoletne razpoložljivosti in dostopnih cen ena od najbolj razširjenih svežih zelenjadnic v industrializiranem svetu. V zadnjem času je v središču številnih epidemioloških raziskav, ki potrjujejo pozitivne učinke na zdravje zaradi prisotnosti različnih antioksidativnih molekul, kot so karotenoidi, zlasti likopen, askorbinska kislina, vitamin E in fenolne spojine, zlasti flavonoidi (Frusciante in sod. 2007). Pri paradižniku obstaja veliko kultivarjev, katerih plod se razlikuje po velikosti, obliki, pigmentaciji in vsebnosti antioksidativnih molekul, saj prihaja do razlik med tipi in koncentracijami karotenoidov ter koncentracijo askorbinske kisline in fenolov v plodu (Hanson in sod. 2004). Razlike so povezane z genotipom, pa tudi z več dejavniki, kot so faza zorenja, v kateri je plod in postopki pridelave.
2 Čeprav je bilo za mnoge učinkovine iz plodov paradižnika s kemijskimi metodami za vrednotenje antioksidativne aktivnosti dokazano, da so učinkoviti antioksidanti, pa je antioksidativna učinkovitost teh lahko povsem drugačna v bolj zapletenem celičnem okolju. Celični testi so pomembno novo orodje za merjenje antioksidativne aktivnosti različnih snovi, saj upoštevajo tudi absorpcijo, metabolizem in distribucijo bioaktivnih spojin v celici in tako lahko bolje napovedo antioksidativno vedenje določene snovi v bioloških sistemih (Wolfe 2008). Namen magistrske naloge je bil optimizirati metodo za določitev znotrajceličnega antioksidativnega potenciala ekstraktov različnih sort paradižnika z uporabo barvila DCFH- DA na makrofagni celični liniji TLT in določiti protokol, ki bo podal najbolj relevantne rezultate in podal smernice za merjenje antioksidativne aktivnosti naravnih ekstraktov paradižnika z uporabo celičnega modela v pogojih in vitro. Preučiti, katere sorte paradižnika imajo najvišji oziroma najnižji celični antioksidativni potencial, preveriti sortno variabilnost vzorcev in raziskati razlike med različnimi barvnimi skupinami paradižnikov. Želeli smo preveriti, ali ima znotrajcelični antioksidativni potencial pozitivno korelacijo z drugimi merljivimi parametri v paradižniku, t.j. vsebnostjo suhe snovi, titracijskimi kislinami in izmerjenim vitaminom C v plodu. V nalogi smo postavili naslednje hipoteze: Hipoteza 1: Predvidevamo, da obstajajo statistično značilne razlike v celični antioksidativni aktivnosti posameznih kultivarjev paradižnika. Hipoteza 2: Predvidevamo, da obstajajo statistično značilne razlike v celični antioksidativni aktivnosti med različnimi barvnimi skupinami paradižnikov. Hipoteza 3: Predvidevamo, da ima znotrajcelični antioksidativni potencial pozitivno korelacijo z vsebnostjo suhe snovi, titracijskimi kislinami in izmerjenim vitaminom C v plodu.
3 2. PREGLED OBJAV 2.1. Reaktivne kisikove spojine Proste radikale je prvi opisal Moses Gomberg pred več kot stoletjem, v bioloških sistemih pa so jih odkrili v petdesetih letih prejšnjega stoletja (Lushchak 2014). V današnjem času so prosti radikali definirani kot posamezni atomi, ioni in molekule, ali njihovi deli, ki imajo na vsaj eni orbitali nesparjen elektron (Bayr 2005). Izstopajoči značilnosti večine radikalov sta njihova velika kemična reaktivnost in s tem povezana kratka življenjska doba (μs do ms) (Pečar in Mravljak 2015). Reaktivne kisikove spojine (ROS) so skupni izraz, ki zajema kisikove proste radikale, kot so superoksidni (O2 - ), hidroksilni (HO ), peroksilni (ROO ) in hidroperoksilni (HOO - ) radikal ter nekatere neradikalne derivate kisika, ki se lahko zlahka pretvorijo v radikale, med katere spadajo vodikov peroksid (H2O2), hipoklorna kislina (HOCl) in ozon (O3) (Irani 2007). ROS v živih organizmih so posledica normalnega celičnega metabolizma ali celični produkti pri izpostavitvi zunanjim vplivom oksidacije in jih glede na izvor delimo na notranje in zunanje (Birben in sod. 2012). Notranji viri večjih količin ROS v organizmih so mitohondriji, endoplazmatski retikulum, peroksisomi, ter celične in jedrne membrane (Starkov 2008), glavni vzroki pa so spontane enoelektronske redoks reakcije in avtooksidacije, uhajanje elektronov iz dihalne verige v mitohondrijih, encimske reakcije, metabolizem nekaterih snovi in radikalske reakcije v procesih vnetja oziroma v primerih aktivacije imunskega sistema (Pečar in Mravljak 2015). Zunanji viri ROS so elektromagnetna sevanja s primerno energijo, ultrazvok, ozon ter razni povzročitelji, kot so cigaretni dim ter različni onesnaževalci (ksenobiotiki, organska topila in pesticidi) (Abram 2000). Zaradi izjemne reaktivnosti in težnje po zapolnitvi vrzeli na eni izmed orbital ROS zelo hitro reagirajo z bližnjimi molekulami, najpogosteje na tri načine: odvzem vodikovega atoma, adicija na dvojno vez ali z reakcijo dveh radikalov. Pomembne so predvsem reakcije med radikali in neradikali. Pri reakciji med dvema radikaloma se prosta elektrona združita v kovalentno vez, pri reakciji med radikalom in neradikalom pa vedno nastane nov radikal. Ker je v telesu večina molekul neradikalskih, lahko na ta način že en
4 sam radikal sproži obsežno verižno reakcijo (Osredkar 2012). V majhnih in zmernih koncentracijah ROS v organizmu sodelujejo pri fizioloških celičnih procesih, kot so encimske reakcije, transport elektronov v mitohondriju, prenos signala, ekspresija genov, in pri celičnih odzivih, kot je obramba proti okužbam (Irani 2007). Nasprotno pri visokih koncentracijah povzročijo neželene spremembe celičnih komponent, kot so lipidi, beljakovine in nukleinske kisline (Birben in sod. 2012). 2.2. Antioksidanti Nadzor nad količino ROS v organizmu je zagotovljen ne le preko njihove proizvodnje, ampak tudi preko njihove eliminacije (Nimse in Pal 2015). Živi organizmi imajo zapletene antioksidativne sisteme, ki jih sestavljajo različni encimski sistemi in ostale snovi pod skupnim imenom antioksidanti. Poznamo več obrambnih mehanizmov, ki jih delimo v primarni, sekundarni in terciarni. Pri primarnem obrambnem mehanizmu gre za preprečevanje nastanka radikalov. Sekundarni mehanizmi nevtralizirajo radikale, terciarni pa poskrbijo za popravilo morebitnih poškodb zaradi delovanja radikalov (Osredkar 2012). Antioksidant je vsaka snov, ki je sposobna že v nizki koncentraciji (v primerjavi s koncentracijo substrata, ki je tarča radikalov) zadržati ali zavreti oksidacijo substrata. Antioksidanti zaščitijo celico pred ROS na več načinov, kot so vezava kovinskih ionov in encimska odstranitev oksidantov, ali pa sami neposredno reagirajo z ROS (Halliwell in Gutteridge 2015). V tem procesu antioksidanti postanejo radikali, ki so običajno manj reaktivni. Nekatere organizem obnavlja, drugi pa se po nadaljnjih pretvorbah izločijo iz telesa (Cornelli 2009). Obramba pred ROS ne sloni le na enem antioksidantu, ampak so na voljo številne molekule (encimi in manjše molekule), ki se povezujejo v kompleksno delujočo antioksidativno mrežo (Pečar in Mravljak 2015). Glede na izvor ločimo notranji in zunanji obrambni sistem. Notranji obrambni sistem vključuje encimske in neencimske spojine, ki jih lahko celice sintetizirajo same (Sies 2018). Zraven teh pa lahko celice prevzamejo iz okolja številne molekule, ki delujejo antioksidativno in jih imenujemo zunanji antioksidanti, ter so v središču mnogih raziskav
5 zaradi ugodnih učinkov na zdravje ljudi (Halliwell 1996). 2.2.1. Notranji antioksidanti Notranji antioksidanti so antioksidanti, ki so jih celice sposobne sintetizirati same in jih delimo na primarne in sekundarne. Med primarne antioksidativne obrambne sisteme sodijo encimski (superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza) in neencimski (glutation, tioredoksin) obrambni sistemi (Preglednica 1). Primarni obrambni sistem ohranja raven oksidantov v zmernih količinah. Kadar pa se pojavijo poškodbe, prevzamejo vlogo obrambe sekundarni obrambni sistemi, med katere uvrščamo proteolitične sisteme, lipolitične encime in popravljalne sisteme DNA (Zakrajšek 2014). Najučinkovitejši notranji antioksidanti so encimi, katerih koncentracija se lahko prilagaja potrebam organizma. Prednosti encimov pred antioksidanti zunanjega izvora so, da je informacija za encim zapisana v genu in je njegova sinteza načeloma vedno možna. S sintezo teh encimov celica lahko prilagaja svoj antioksidativni odziv. Encimi so velike molekule, ki so prisotne na določenih mestih celic in praktično ne difundirajo med celicami. Zato je njihovo gibanje močno omejeno in so dejavni v celici, kjer so nastali in na mestu, kjer so. Tudi njihovo nadomeščanje od zunaj ni možno (Pečar in Mravljak 2015). Preglednica 1: Najpomembnejši antioksidanti in njihova razdelitev glede na kemijsko...strukturo (Osredkar 2012). ENCIMSKI OBRAMBNI SISTEM Superoksid dismuntaza Katalaza Tioredoksin reduktaza Tioredoksin peroksidaza Glutation reduktaza Glutation peroksidaza NEENCIMSKI OBRAMBNI SISTEM Glutation Sečna kislina Melatonin Melanin transferin Transferin Ubikvinon Q10 Bilirubin Tioredoksin
6 2.2.1.1. Superoksid dismutaza Superoksid dismutaza (SOD) spada v skupino encimov, ki katalizirajo pretvorbo superoksidnega radikala do kisika in vodikovega peroksida (Irani 2007). Je metaloencim, ki za svojo aktivnost potrebuje kovinske ione (Culotta in sod. 2006). Superoksidni radikal nastaja endogeno pri celičnih procesih, kjer se porablja kisik (Osredkar 2012), glavni vir nastanka superoksidnega radikala pa je elektronska transportna veriga (2 % kisika v celici se pretvori v O2 - ) (Chance in sod. 1979). Na notranji membrani mitohondrija je umeščen poseben sistem proteinov, ki sestavlja elektronsko transportno verigo (kompleks I, II, III, IV). Na kompleksu I in III je možna konkurenčna reakcija, saj je na teh dveh mestih okoliški kisik konkurenčni akceptor elektrona. Elektron torej bodisi potuje naprej po elektronski verigi ali pa se veže na okoliški kisik in v tej enoelektronski reakciji nastane superoksidni radikal (Pečar in Mravljak 2015). V ostalih delih celice ali zunajceličnem prostoru so viri nastanka superoksidnega radikala predvsem enoelektronske oksidacije z nevezanimi kovinskimi ioni in različnimi fenolnimi spojinami (Pečar in Mravljak 2015). SOD so posredniki prenosa elektrona med molekulami superoksidnega radikala in pospešijo prenos elektrona iz ene molekule superoksidnega radikala na drugo molekulo superoksidnega radikala. V reakciji sicer nastane vodikov peroksid, ki je še vedno oksidant, vendar ni več radikal (Nimse in Pal 2015). O2 - + O2 - O2 + H2O2 Pri ljudeh so prisotne tri oblike SOD. SOD1 (nahaja se v citoplazmi) in SOD3 (nahaja se v ekstracelularnem prostoru) v aktivnem centru vsebujeta baker in cink. Prisotna pa je tudi SOD2, ki pa je mitohondrijska in ima v aktivnem mestu mangan (Birben in sod. 2012). Ker SOD odstranjujejo prvi radikal v skupini ROS, so ti encimi ključni člen antioksidativne obrambe v skoraj vseh celicah, ki so v stiku s kisikom.
7 2.2.1.2. Katalaza Katalaze so hemoproteini, ki odstranjujejo vodikov peroksid in s tem preprečujejo nastanek hidroksilnega radikala (Osredkar 2012). Je pogost encim, ki je v skoraj vseh živih organizmih, ki so izpostavljeni kisiku. Katalizira pretvorbo vodikovega peroksida v vodo in kisik (Irani 2007). 2H2O2 2H2O + O2 Katalaza je eden najučinkovitejših encimov, saj samo ena molekula katalaze lahko pretvori 6 bilijonov molekul vodikovega peroksida v vodo in kisik na minuto (Sharma 2014). Pri živalih je katalaza prisotna v vseh organelih, še posebej veliko pa jo je v jetrih. Katalaza v eritrocitih varuje eritrocite pred vodikovim peroksidom, ki nastaja s dismutacijo superoksidnega radikala, ki se tvori pri avtooksidaciji hemoglobina. Ker vodikov peroksid prehaja membrane, eritrociti s svojo katalazo varujejo tudi druga tkiva pred ekstracelularnim peroksidom. Katalazna aktivnost v celicah pa je z izjemo eritrocitov večinoma locirana v peroksisomih, saj so tam locirani številni encimi, ki tvorijo peroksid (Pečar in Mravljak 2015). 2.2.1.3. Glutation Glutation (GSH) je tripeptid (γ-l-glutamil-l-cisteinil-glicin) in je eden glavnih neencimskih antioksidativnih sistemov (Pizzorno 2014). GSH je molekula z mnogimi funkcijami v celici. Je učinkovit lovilec hidroksilnih radikalov, reagira s singletnim kisikom in je substrat za glutation peroksidazo. Uvrščamo ga med endogene snovi, ki izvajajo razstrupljanje, saj sodeluje v številnih metabolnih procesih in reagira z elektrofilnimi produkti lipidne peroksidacije in mnogimi reaktivnimi elektrofili eksogenega izvora (Pečar in Mravljak 2015). Glutation antioksidativni sistem sestavljata encima glutation peroksidaza (GSH-Px) in
8 glutation reduktaza (GR) ter njun substrat, glutation (GSH). GSH-Px katalizira redukcijo vodikovega peroksida ali organskih peroksidov do vode, pri čemer pride do oksidacije glutationa, ki se pri tem pretvori v dimerno obliko (GSSG). V molekuli GSH je tiolna skupina (-SH) reducent, ki lahko nudi vodik oziroma elektron. Sledi regeneracija reducirane oblike glutationa, ki jo katalizira glutation reduktaza. Pri tej reakciji kot vir energije služi oksidacija NADPH (Birben in sod. 2012). Redoks stanje celice je odvisno od razmerja med GSH in GSSG, kot tudi celotne koncentracije glutationa. Zdrave celice v mirovanju imajo razmerje GSH/GSSG >100, medtem ko razmerje med oksidativnim stresom pade med 1 in 10 (Pizzorno 2014). 2.2.1.4. Tioredoksin Tioredoksini so majhni redoks proteini, kjer se v aktivnem centru nahajata dva ohranjena cisteina in skupaj z tioredoksin redukatazo in NADPH tvorijo tioredoksinski sistem (Masutani in Yodoi 2002). Poznamo različne tioredoksine, kot sta citoplazemski tioredoksin (Trx1) in mitohondrijski tioredoksin (Trx2). V celicah ima tioredoksin vlogo reducenta (elektron donorja) encimov peroksidaz, odvisnih od tioredoksina (TPx), ribonukleotid reduktaze in metionin sulfoksid reduktaz (encimi, ki reducirajo oksidirane metioninske stranske verige v proteinih) (Pečar in Mravljak 2015). Tioredoksinski sistem reducira disulfidne vezi in sulfenično kislino različnih proteinov, saj tiolni skupini v aktivnem centru vstopata v redoks reakcije z disulfidnimi skupinami. Zaradi teh lastnosti je pomemben člen antioksidativne mreže in je pomemben za uravnavanje bioloških funkcij, v katerih je pomembno redoks stanje sulfhidrilnih skupin (Meng in sod. 2017). Oksidirani tioredoksini se reducirajo s tioredoksin reduktazami, ki za redukcijo potrebujejo NADPH, kot donor elektronov (Pečar in Mravljak 2015).
9 2.2.2. Zunanji antioksidanti Opisani encimi notranjega izvora v prejšnjem poglavju delujejo v smeri učinkovitega odstranjevanja superoksidnega radikala in peroksida, ki imata veliko težnjo po tvorbi hidroksilnega radikala, vendar pa ti visokomolekularni encimi ne reagirajo s hidroksilnim radikalom. Kljub njegovi izjemni učinkovitosti notranji antioksidativni sistem sam po sebi ne zadostuje, zato smo ljudje odvisni od različnih vrst antioksidantov, ki se nahajajo v prehrani (Pietta 2000). Molekule, ki delujejo antioksidativno in jih mikroorganizmi prevzamejo iz okolja ter ljudje zaužijejo s hrano, imenujemo zunanji antioksidanti (Halliwell 1996). Vsebnost in količina takšnih molekul je torej zelo zaželena lastnost v živilih. V primeru antioksidantov zunanjega izvora je naše telo stalno odvisno od njihove prisotnosti v hrani, njihove resorpcije iz prebavil in od njihove stabilnosti na jetrne encime. So pretežno majhne molekule, ki se lahko gibljejo v celicah in med njimi (Pečar in Mravljak 2015). Zunanji antioksidanti lahko delujejo kot lovilci prostih radikalov, predvsem hidroksilnega radikala, ali pa sprožijo sintezo notranjih antioksidantov. Najpomembnejši antioksidanti zunanjega izvora so askorbinska kislina, tokoferol, karotenoidi in fenoli rastlinskega izvora, glavna naravna vira zunanjih antioksidantov v človeški prehrani pa sta sadje in zelenjava, zaužijemo pa jih lahko tudi s prehranskimi dopolnili (Abushita in sod. 1997). Notranja sinteza nekaterih antioksidantov se s starostjo zmanjšuje, zato postanejo vse bolj pomembni zunanji viri (Pečar in Mravljak 2015). 2.3. Oksidativni stres Oksidativni stres je del normalne fiziologije celice in ima, če poteka v primerno omejenem obsegu, koristne učinke pri vzdrževanju homeostaze. Brez oksidativnega stresa se celice, tkiva in organizmi ne bi ustrezno odzivali na dogajanje v okolici. Zato se v zadnjih letih pojavlja razlikovanje med pozitivnim oksidativnim stresom in oksidativnim stresom. Posamezni predstavniki ROS so sestavni deli nekaterih signalnih poti in povzročijo izražanje ustreznih genov, posledično sintezo proteinov, in odgovor na dogajanje v okolici (Pečar in Mravljak 2015). Jasno je, da sta procesa generacije in eliminacije ROS tesno povezana. Živi
10 organizmi posedujejo dobro uravnotežene sisteme, kar ima za posledico določeno stopnjo ROS v stanju dinamičnega ravnovesja. Vendar se lahko to ravnovesje v določenih okoliščinah poruši. Razlogi za porušenje ravnovesja so povečana raven notranjih in zunanjih spojin, ki vstopajo v proces avtooksidacije, izčrpanje zalog antioksidantov z nizko molekulsko maso, inaktivacija antioksidativnih encimov, zmanjšanje proizvodnje antioksidativnih encimov in antioksidantov z nizko molekulsko maso in določene kombinacije dveh ali več zgoraj naštetih dejavnikov (Lushchak 2014). Oksidativni stres lahko preprosto definiramo kot porušeno ravnotežje med ROS in antioksidanti v prid ROS (Sies 1997). V normalnih razmerah raven ROS niha v določenem obsegu, ki ga določajo usklajeno delovanje sistemov njihovega nastajanja in odstranjevanja. Zaradi prej naštetih razlogov se lahko raven ROS močno poveča. Če lahko antioksidativni sistemi ustrezno obvladajo povečane količine ROS, se ta raven vrne na začetne nivoje. Te dogodke lahko imenujemo akutni oksidativni stres, ki ima določene fiziološke posledice, kot je povišano izražanje antioksidantov in sorodnih encimov. V nekaterih primerih pa celica ne more nevtralizirati povečanih količin ROS in vrniti raven ROS na začetno raven. Celo okrepljeno izražanje antioksidantov in s tem povezanih encimov tega ne zmore storiti. Zaradi tega lahko povečana raven ROS vpliva na različne celične komponente, kar močno moti homeostazo. To stanje lahko imenujemo kronični oksidativni stres (Lushchak 2014). Ko pride do oksidativnega stresa, celice poskušajo preprečiti učinke oksidanta in obnoviti redoks ravnotežje z aktivacijo ali inhibicijo genov, ki kodirajo obrambne encime, transkripcijske faktorje in strukturne proteine (Birben in sod. 2012). Pod oksidativnim stresom celice običajno blokirajo splošne programe njihovega življenjskega cikla, kot sta reprodukcija ali obsežna biosinteza, da razvijejo odzive za preprečevanje ali nevtralizacijo negativnih učinkov ROS (Lushchak 2014). V telesu nimamo nobenega čutila, ki bi nas opozorilo na oksidativni stres, ki je tako na svojem začetku na makroskopski ravni nezaznaven. Posledice oksidativnega stresa pa so lahko vidne kmalu, v nekaj dneh, ali šele čez desetletja, odvisno od organa, kjer poteka oksidativni stres, in od njegove intenzitete (Pečar in Mravljak 2015). Škoda, nastala v celicah zaradi delovanja ROS, se kopiči in z leti lahko privede do nastanka degenerativnih starostnih bolezni, kot so rak, bolezni srca in ožilja, upada imunskega sistema, disfunkcije možganov in staranja organizma. Biomedicinska literatura navaja številne korelacije med reaktivnimi kisikovimi zvrstmi in etiologijo preko 100 bolezenskih
11 stanj (Jereb in sod. 2014). Povišanje ROS v organizmu lahko prizadene številne, če ne vse življenjske procese. Posledice tega povečanja se razlikujejo in so odvisne od stopnje in mesta proizvodnje ROS, učinkovitosti antioksidativnih sistemov in tarčnih mest, s katerimi ROS reagirajo. Glavne tarče ROS so DNA, lipidi in proteini (Lushchak 2014). 2.3.1. Lipidna peroksidacija Lipidna peroksidacija je lokalizirana oksidacija fosfolipidov v bioloških membranah, ki jo sprožajo dovolj reaktivni radikali. Sprožilni radikal je vsak radikal, ki lahko odvzame fosfolipidni molekuli vodikov atom (Halliwell in Chirico 1993). V večstopenjskih procesih se alkilni deli fosfolipidov ob potrošnji kisika pretvarjajo v produkte, ki so krajši alkani. Nastajajo manjše vodotopne spojine, ki lahko reagirajo z nukleofilnimi skupinami proteinov ali z nukleofilnimi deli purinov in pirimidinov v DNA. Zaradi tega je lipidna peroksidacija eden izmed pomembnih, če ne kar glavni vzrok za mnoga degenerativna obolenja in za mutacije DNK v jedru (Pečar in Mravljak 2015). Proces lipidne peroksidacije formalno razdelimo na več faz: - prva faza (iniciacija) je začetek oksidacije lipidov. To fazo sprožijo samo reaktivni radikali. Reakcija se začne z napadom kisikovega radikala na lipid ter odvzemom vodika iz metilne skupine polinenasičene maščobne kisline (Halliwell in Gutteridge 2015); - druga faza je širitev oksidacije, kjer se v membrani vzpostavi verižni sistem oksidacij, ki ga poganja kisik. V reakciji propagacije lipidni radikal reagira z molekularnim kisikom ter tvori peroksidni radikal (ROO ). Peroksidni radikal lahko odvzame vodik iz bližnje nenasičene maščobne kisline, pri čemer nastaneta lipidni hidroperoksid (ROOH) ter nov lipidni radikal. Tako pride do verižne reakcije lipidne peroksidacije (Halliwell in Gutteridge 2015); - tretja faza je zaključek oksidacije lipidov. Verižna reakcija lipidne peroksidacije se konča z razpadom lipidnih hidroperoksidov. Z njihovo razgradnjo se tvorijo sekundarni produkti lipidne peroksidacije (Halliwell in Gutteridge 2015).
12 Reakcijo, pri kateri se peroksidira več tisoč verig maščobnih kislin, lahko sproži že en sam hidroksilni radikal. Lipidna peroksidacija povzroči poškodbe lipidnega dvosloja celične membrane, kar lahko povzroči spremembo njene propustnosti, izpad funkcije membranskih encimov, motnje prenosa signalov preko transmembranskih receptorskih sistemov in nazadnje propad celične membrane (Osredkar 2012). 2.3.2. Oksidacije proteinov Protein lahko strukturno razdelimo na peptidno verigo, ki je ogrodje proteinske molekule, in stranske verige aminokislin. Oksidacije proteinov lahko potekajo hkrati, tako na peptidni verigi kot na stranskih verigah aminokislin. Produkti oksidacije so odvisni od mesta, kjer se je ta začela, in od povzročitelja (sprožilnega radikala) oksidacije, kar vodi v nastanek velikega števila produktov (Pečar in Mravljak 2015). ROS lahko povzroči fragmentacijo peptidne verige, spremembo električnega naboja beljakovin, navzkrižno vezavo proteinov in oksidacijo specifičnih aminokislin ter s tem povečanje občutljivosti na proteolizo z razgradnjo s specifičnimi proteazami. Cisteinski in metioninski ostanki so še posebej dovzetni za oksidacijo. Oksidacija sulfhidrilnih skupin ali metioninskih ostankov beljakovin povzroča konformacijske spremembe, odvijanje beljakovin in razgradnjo proteina (Birben in sod. 2012). Oksidativna modifikacija proteinov lahko povzroči tudi izgubo funkcije, kot na primer oksidacija fibrinogena zavira nastajanje strdkov (Irani 2007). 2.3.3. Oksidacije DNA Oksidativne poškodbe DNA vključujejo odcepitev nukleinske baze, pretrganje verige DNA, poškodbe, delecije ali translokacije purinskih in pirimidinskih baz, ter navzkrižne kovalentne povezave med DNA in bližnjim proteinom (Birben in sod. 2012). Pojavljajo se tri oksidativne substitucije kot posledica oksidativnega stresa, in sicer gvanin/citozin,
13 gvanin/timin, citozin/timin. Prevladujoča sprememba DNA pa je 8-hidroksilacija gvanina (8-OH-G) (Lushchak 2014). Nastanek 8-OH-G je najbolj znana poškodba DNA, ki nastane zaradi oksidativnega stresa in je potencialni biomarker kancerogeneze. Promotorske regije za vezanje transkripcijskega faktorja vsebujejo zaporedja, bogata z gvaninom in citozinom, ki so dovzetna za oksidacijske napade. Nastanek 8-OH-G DNA v veznih mestih za transkripcijski faktor lahko spremeni vezavo transkripcijskih faktorjev in tako spremeni izražanje sorodnih genov (Birben in sod. 2012). Manjše nenadzorovane oksidacije DNA lahko celica popravlja, a le v omejenem obsegu, večje poškodbe pa povzročijo smrt celice. Število manjših in nepopravljenih sprememb, ki se z delitvijo prenašajo na naslednjo generacijo, s staranjem narašča. Postopoma zajame takšen obseg, da se na makroskopski ravni pojavijo simptomi, ki so tipični za posamezne bolezni (Pečar in Mravljak 2015). Večina teh sprememb DNA ima pomembno vlogo pri rakotvornosti, staranju in nevrodegenerativnih, kardiovaskularnih in avtoimunskih boleznih (Birben in sod. 2012). Zaradi poškodb DNA prihaja do zaustavitve ali sproženja transkripcije in indukcije signalnih poti, napak pri podvojevanju DNA ter nestabilnosti genoma (Cooke in sod. 2003). Oksidacije DNA so ali pogubne za celico, ki v procesu apoptoze propade, ali pa so takšne, da celica preživi, vendar ni več povsem enaka prvotni celici. Tukaj ima svojo vlogo tudi imunski sistem, ki večino takih spremenjenih celic odstrani, če jih le prepozna kot telesu tuje celice. Kadar se to ne zgodi, se lahko v mutiranih celicah naključno pojavi tak nabor lastnosti, ki celice sili v hitro razmnoževanje in invazivnost. V tem primeru imamo opravka z rakavim obolenjem (Pečar in Mravljak 2015). 2.4. Splošne značilnosti paradižnika Paradižniki spadajo v družino razhudnikovk (Solanaceae) in izvirajo iz Južne Amerike. Latinsko poimenovanje za paradižnik je Solanum lycopersicum L., čeprav se v literaturi pojavljajo tudi alternativna imena, kot sta Lycopersicon lycopersicum (L) H. Karst. in Lycopersicon esculentum Mill (Slimestad in sod. 2008). Paradižnik je ena od najbolj razširjenih svežih zelenjadnic v industrializiranem svetu, njegova priljubljenost ne izhaja le
14 iz svežega pridelka, ampak se kot surovina uporablja v številnih živilsko predelovalnih procesih. Tako na trgu najdemo produkte iz paradižnika, kot so posušen paradižnik, konzerviran paradižnik, paradižnik v prahu, predeluje se ga v koncentrat, mezge, sokove. Predelava paradižnika se je začela leta že leta 1847, ko je Harrison Woodhull Crosby razvil metodo konzerviranja paradižnikov (Ram in Dasgupta 2004). Paradižnik je klimakterijsko sadje, kar omogoča pobiranje pridelka, preden doseže končno zrelost. To je zelo priročna lastnost, ki je zelo pomembna za pridelovalce in trgovce. Zagotavlja dodaten čas za rokovanje z izdelkom in za transport do končnega uporabnika ter podaljšuje rok uporabnosti in zmanjšuje biološke in kemijske dejavnike tveganja za onesnaženje živila (Weingerl in Unuk 2015). Paradižnik je že dolgo cenjen zaradi svojih organoleptičnih in kulinaričnih lastnosti, v zadnjem času pa postaja priljubljen zaradi dietetskih in zdravstvenih lastnosti, saj vsebuje različne snovi z antioksidativnimi lastnostmi in je rezervoar različnih molekul (George in sod. 2004). Redno uživanje paradižnikov je povezano z zmanjšanim tveganjem kroničnih degenerativnih bolezni. Epidemiološke ugotovitve potrjujejo pozitivne učinke na zdravje zaradi prisotnosti različnih antioksidativnih molekul, kot so karotenoidi, zlasti likopen, askorbinska kislina, vitamin E in fenolne spojine, zlasti flavonoidi (Frusciante in sod. 2007). Čeprav so določene vrste sadja in zelenjave boljši vir teh molekul, pa je zaradi svoje celoletne razpoložljivosti in dostopnih cen povprečna dnevna poraba paradižnika pri človeku veliko višja kot pri vseh drugih vrstah sadja in zelenjave (Abushita in sod. 1997). 2.5. Kemijska sestava plodov paradižnika Na kemično sestavo plodu (Preglednica 2) vplivajo kultivar, izbrana agrotehnika pridelovanja, podnebne in talne razmere, količina hranil in namakanja, najbolj vpliven dejavnik pa je stopnja zrelosti plodu (Hernández in sod. 2008). Zorenje plodov paradižnika vključuje različne morfološke, fiziološke, biokemične in molekularne spremembe spojin, vključno z razgradnjo klorofila in sintezo karotenoidov, zlasti likopena. Med procesom zorenja se spreminjajo prehranska vrednost in dietetične lastnosti plodu (Ilahy in sod. 2011). V paradižniku najdemo organske kisline, topne sladkorje, aminokisline, pigmente in več kot 400 aromatičnih spojin, ki prispevajo k njegovim organoleptičnim lastnostim (Hernández in
15 sod. 2008). Drugi dejavniki, za katere se pričakuje, da bodo imeli velik vpliv na hranilno vrednost plodov paradižnika, so selektivna uporaba le določenih delov plodu zaradi neenakomerne porazdelitve hranil in predelava zaradi toplotno povzročene razgradnje hranil (Vinha in sod. 2014). Paradižnikov plod se med kultivarji razlikuje po velikosti, obliki in pigmentaciji z značilnimi barvami od bele, rožnate, rdeče, vijolične, oranžne, rumene in zelene (Mes in sod. 2008). Barva plodov je odvisna od kombinacij raznih pigmentov, to so predvsem likopen, α-, β- karoten in drugi karotenoidi. Likopen je odgovoren za rdečo in β -karoten za oranžno barvo v perikarpu paradižnika. Karotenoidi se kopičijo v času zorenja paradižnika med procesom diferenciacije kloroplastov, ki vsebujejo klorofil, v kromoplaste, ki vsebujejo karotenoide. Različne mutacije na tej poti lahko povzročijo pomanjkanje sposobnosti za sintezo karotenoidov ali razgradnjo klorofila in s tem paradižnike različnih barv. Vijolični in črni paradižniki proizvajajo karotenoide, vendar klorofila ne razgradijo v celoti. To povzroča temno rjavkasto barvo sadja od kombiniranih zelenih, rdečih in oranžnih pigmentov. Več nedavno razvitih kultivarjev pa vsebuje tudi antocianin, kar daje plodu vijoličasto barvo. Rumene in oranžne odtenke paradižniku daje tudi rumena barva flavonoidov (Choi in sod. 2014). Poleg vode so glavne sestavine paradižnikov ogljikovi hidrati (zlasti glukoza in fruktoza), pa tudi nekatere pomembne topne in netopne prehranske vlaknine, ki jih tvorijo pektini, hemiceluloze in celuloza (Frusciante in sod. 2007). Med organskimi kislinami je najbolj zastopana citronska kislina, čeprav so bile odkrite tudi nekatere druge, kot so ocetna, jabolčna, mravljična, mlečna in fumarna. Stopnja zrelosti plodov je pogosto povezana z vsebnostjo organskih kislin ali pa z razmerjem med vsemi sladkorji in vsemi kislinami, kar služi tudi kot kazalec kakovosti plodov (Pinela in sod. 2012).
16 Preglednica 2: Kemijska sestava paradižnika (Souci in sod. 2008). KOMPONENTE ENOTA POVPREČNA VREDNOST Voda 94,2 Beljakovine 0,95 g/100 g Maščobe 0,21 Prehranska vlakna 0,95 Glukoza 1081 Ogljikovi hidrati Fruktoza 1358 mg/100 g Saharoza 84 Celuloza 360 Magnezij 11 Kalcij 8,9 Elementi Železo 316 mg/100 g Fosfor 22 Kobalt 1,7 Jod 1,1 B1 μg/100 g 93 B2 μg/100 g 58 Vitamini K μg/100 g 5,6 C mg/100 g 19 Pantotenska kislina μg/100 g 310 Folna kislina μg/100 g 22 Palmitinska kislina (16:0) 32 Stearinska kislina (18:0) 5 Maščobne kisline Palmitooleinska (16:1) 2 mg/100 g Oleinska kislina (18:1) 23 Linolna kislina (18:2) 91 Linolenska kislina (18:3) 9
17 2.6. Antioksidanti v paradižniku Paradižnik je dobil status funkcionalne hrane ob upoštevanju številnih epidemioloških raziskav zaradi svoje vloge pri zmanjševanju tveganja za nastanek določenih vrst raka (Frusciante in sod. 2007). Antioksidanti v paradižniku vključujejo karotene, kot je β-karoten in predvsem likopen, vitamine, kot sta askorbinska kislina in tokoferol, ter fenolne spojine, kot so flavonoidi. Razlike v vsebnosti antioksidantov med kultivarji paradižnika so povezane z genotipom, pa tudi z več dejavniki, kot so faza zorenja, v kateri je plod, postopki pridelave (razpoložljivost vode, mineralnih hranil) in podnebnimi dejavniki (predvsem svetlobo in temperaturo) (Pinela in sod. 2012). Številne študije so že pokazale, da epikarp in semena plodov paradižnika vsebujejo bistveno višje ravni predvsem fenolov in karotenoidov kot pulpa (Vinha in sod. 2014). Ker sta ta dela plodu zelo bogata vira antioksidativnih spojin, njuna vključitev v predelavo lahko povzroči približno 40-53 % povečanje količine vseh glavnih antioksidantov v končnem produktu iz paradižnika (Toor in Savage 2005). Več študij (Toor in Savage, 2005; Kotíková in sod. 2011), kjer so merili skupno antioksidativno aktivnost, izmerjeno z uporabo metode obarvanja ABTS / TEAC, je pokazalo, da lipofilni antioksidanti, ki vsebujejo karotene, prispevajo manj kot četrtino k skupni antioksidativni aktivnosti. Veliko večjo vlogo imajo hidrofilni antioksidanti, zlasti askorbinska kislina in različne fenolne spojine. Je pa potrebno poudariti, da je zaščitna vloga paradižnika predvsem posledica sinergističnega učinka med različnimi vrstami antioksidantov (Ilahy in sod. 2011). Sinergizem med antioksidanti se lahko pojavi zaradi različnih mehanizmov. Lahko z regeneracijskimi reakcijami, ali pa tudi z žrtveno oksidacijo (kjer en antioksidant z odstranjevanjem radikalov varuje drugega). S tem antioksidanti v organizmu podaljšujejo antioksidativni učinek drug drugega (García-Alonso in sod. 2015). 2.6.1. Karotenoidi Karotenoidi so velika skupina izredno lipofilnih barvil, ki niso topni v vodi, vendar pa so dobro topni v maščobah in nepolarnih topilih. Opisanih je že preko 700 karotenoidov (Kotíková in sod. 2011). Karotenoidi, ki vsebujejo v molekuli kisik, so poznani kot ksantofili
18 (lutein, zeaksantin), tisti brez kisika (so nenasičeni ogljikovodiki) pa kot karoteni ( -karoten, -karoten, likopen). Karotenoidi se v naših prebavilih absorbirajo, tkivne in plazemske koncentracije karotenoidov pa so zaradi nizke topnosti v vodi odvisne od prehrane. Za boljšo absorpcijo je v prehrani potrebne nekaj maščobe. V krvi so karotenoidi v lipoproteinih, v tkivih pa v zalogah maščob, v hidrofobni notranjosti membran, ali pa se vežejo na hidrofobne domene nekaterih proteinov (Pečar in Mravljak 2015). Likopen je karotenoid, ki daje paradižniku značilno rdečo barvo in je med karotenoidi najboljši odstranjevalec singletnega kisika. Ravno zaradi te lastnosti ter visoke vsebnosti v plodovih je pri večini kultivarjev paradižnika najbolj izpostavljen karotenoid. Iz kemičnega vidika je likopen simetrični tetraterpen, sestavljen iz 8 izoprenskih enot, ki vsebujejo 11 konjugiranih in 2 nekonjugirani dvojni vezi med ogljikovimi atomi (Amarowicz 2011). Likopen predstavlja med 60 % in 74 % karotenoidov, prisotnih v rdečih kutivarjih paradižnikov in paradižnikovih proizvodih. Ta spojina lahko obstaja v različnih konfiguracijah, vendar je prevladujoča oblika, ki jo najdemo v paradižnikih in izdelkih iz paradižnika (približno 95 %), trans-likopen. Na vsebnost likopena v plodu paradižnika vpliva veliko dejavnikov, kot so zrelost, kultivar in toplotna obdelava (Periago in sod. 2002). Likopen najdemo predvsem v kromoplastu rastlinskih tkiv. V paradižniku se biosinteza likopena dramatično poveča v času zorenja, ko se kloroplast transformira v kromoplast (George in sod. 2004). Uživanje večjih količin živil, ki vsebuje likopen, so povezali z zmanjšanim tveganjem za kronične bolezni, kot so rak in bolezni srca in ožilja (Chang in sod. 2006). Likopen ima največjo antioksidativno aktivnost med vsemi prehranskimi antioksidanti in vitro. Prevladujoč mehanizem je fizikalno dušenje (quenching), pri katerem karotenoid pretvori singletni kisik v tripletni kisik tako, da absorbira pri obratu spina elektrona presežno energijo, ki se nato kot toplota sprosti v okolje (Pečar in Mravljak 2015). Likopen lahko igra tudi vlogo pri odstranjevanju hipoklorove kisline (HOCl). Ta kislina prispeva k patologiji ateroskleroze, vnetnih bolezni, dihalnega stresa, akutnega vaskulitisa in raka. Oksidacijo likopena preko HOCl spremlja sprememba barve likopena od rdeče do brezbarvne (Amarowicz 2011). Ob teh lastnostih se je pokazalo tudi, da likopen sproži komunikacijo med celicami in modulira hormone, imunski sistem in druge presnovne poti (George in sod. 2004).
19 β-karoten je med karotenoidi najpomembnejši prekurzor lipidotopnega vitamina A (retinol). Vitamin A lahko nastane iz okrog 60 karotenoidov (ne iz likopena), od teh paradižnik vsebuje -karoten, -karoten in -kriptoksantin (Kotíková in sod. 2011). Karotenoidi so manj učinkoviti antioksidanti v primerjavi z drugimi antioksidanti iz mreže, kot so flavonoidi ali askorbinska kislina, vendar pa pozitivne učinke na organizem dosegajo tudi preko drugih mehanizmov, kot so sinergizem in vpliv na signalne poti (Pečar in Mravljak 2015). 2.6.2. Askorbinska kislina Askorbinska kislina je najpomembnejši vodotopni neencimski antioksidant in hkrati kofaktor vsaj osmih encimov. Rastline in večina živali lahko sintetizirajo askorbat iz glukoze. Pri določenih vrstah, tudi človeku, pa je med evolucijo prišlo do okvare gena za encim, ki katalizira zadnjo stopnjo biosinteze. Zato smo odvisni od vitamina C, ki ga dobimo s hrano (Pečar in Mravljak 2015). Askorbinska kislina je verjetno najbolj znana esencialna snov v klasifikaciji vitaminov, ki jih laična populacija pogosto povezuje s pozitivnimi učinki na organizem. V paradižniku askorbinska kislina skupaj s fenolnimi spojinami predstavlja glavni vodotopni antioksidant in prispeva največji delež k skupni antioksidativni aktivnosti (Guil-Guerrero in Rebolloso-Fuentes 2009). Paradižnik vsebuje zmerne količine askorbinske kisline, ki pa je odvisna od kultivarja, načina gojenja (razpoložljivost vode, mineralnih hranil), dejavnikov okolja (svetloba in temperatura) ter zrelosti pri obiranju (Chang in sod. 2006). Najvišjo vrednost doseže pri optimalni zrelosti plodu. V drugih fazah zrelosti je v povprečju za 40 % nižja, z manjšimi razlikami med stopnjami zrelosti. Raven askorbinske kisline začne upadati z vsakim dnem po optimalni zrelosti. Po treh dneh se lahko raven zmanjša že za 25-50 % (Weingerl in Unuk 2015). Askorbat kot antioksidant reagira z mnogimi radikali v telesu, saj jih reducira in tako odstranjuje. Zmožen je inhibirati lipidno peroksidacijo ter regenerira (reducira) tokoferolni radikal nazaj v vitamin E. Askorbat ima tudi dovolj visok redoks potencial, da v zaužiti hrani reducira železo iz Fe 3+ do Fe 2+ in tako omogoči njegovo absorpcijo v dvanajstniku. Kot
20 kofaktor v aktivnih centrih encimov reducira ione železa ali bakra. V odsotnosti askorbata kolagen ni pravilno hidroksiliran in ne tvori pravilnih vlaken, kar povzroči slabo celjenje ran in krhkost žilnih sten. Pomanjkanje askorbata v prehrani pri človeku povzroči skorbut (Pečar in sod. 2015). 2.6.3. Fenoli Fenoli in polifenoli so najširše zastopana skupina sekundarnih metabolitov v rastlinskem svetu. Fenol je vsaka spojina, ki ima hidroksilno (-OH) skupino na benzenovem obroču (Pečar in Mravljak 2015). Poznamo že več kot 4000 naravno razpoložljivih rastlinskih fenolov s farmakološkimi učinki, o katerih so poročali kot o antioksidativnih spojinah (Periago in sod. 2002). Glavni dejavnik pri določanju koncentracije fenolov v sadju in zelenjavi je genetski nadzor, vpliv pa imajo tudi številni agronomski, geografski in sezonski dejavniki (Ilahy in sod. 2011). Fenolne spojine se kopičijo predvsem v epikarpu zaradi zaščite pred ultravijoličnim sevanjem in kot obrambne kemikalije pred patogeni in plenilci. Fenolne spojine zavirajo lipidno peroksidacijo, odstranjujejo proste radikale in imajo sposobnost keliranja kovinskih ionov, predvsem ionov železa in bakra (Pinela in sod. 2012). V reakciji z radikali je ključna fenolna skupina, ki lahko ponudi ali vodikov atom ali elektron v primeru fenolatnega aniona. Število hidroksilnih skupin in njihov medsebojni položaj je odločujoč za antioksidativno aktivnost (Pečar in Mravljak 2015). Glavni fenoli v plodovih paradižnika, ki so opredeljeni v literaturi, so kvercin, rutin, naringenin, kaempferol in hidroksicinamične kisline, zlasti kavna in klorogenska kislina (Periago in sod. 2002; Slimestad in sod. 2008; Pinela in sod. 2012). Več nedavno razvitih kultivarjev, ki izhajajo iz križanja paradižnika s sorodnimi vrstami ali je gensko spremenjenih, vsebuje tudi antocianin (Choi 2014).
21 2.7. Antioksidativni celični test z uporabo 2,7 diklorofluorescein diacetata (DCFH- DA) Za vrednotenje antioksidativne aktivnosti ekstraktov sadja in zelenjave se uporablja več kemijskih metod in vitro, kot so ORAC, TRAP, TEAC, ABTS, DPPH, in temeljijo na prenosu vodikovega atoma ali na prenosu elektrona, kar privede do spremembe absorpcijskega koeficienta v vidnem delu spektra po kemijski redukciji radikala/molekule/iona, ki antioksidant reducira (Gülçin 2012). Čeprav je bilo za mnoge učinkovine iz živil ali prehranskih dopolnil s temi metodami in vitro dokazano, da so učinkoviti antioksidanti, pa je antioksidativna učinkovitost teh v celicah in organizmih povsem drugačna zaradi celične absorpcije, metabolizma ter stranskih produktov njihove reakcije z oksidanti v bolj zapletenem celičnem okolju (Bast in Haenen 2002; Shahidi in Zhong 2015). Iz tega razloga so bili razviti celični antioksidativni testi za kvantitativno merjenje sposobnosti antioksidantov pri zaviranju oksidacije v celicah (Shahidi in Zhong 2015). Celični testi so pomembno novo orodje za merjenje antioksidativne aktivnosti različnih snovi, saj upoštevajo tudi absorpcijo, metabolizem in distribucijo bioaktivnih spojin v celici in tako lahko bolje napovedo antioksidativno vedenje določene snovi v bioloških sistemih (Wolfe in sod. 2008). Ena izmed metod je celični test z uporabo 2,7 - diklorofluorescin diacetata (DCFH-DA). DCFH-DA je najbolj razširjeno barvilo za odkrivanje znotrajceličnega nivoja ROS v celicah (Kalyanaraman in sod. 2012). Mehanizem delovanja je tak, da nepolarni DCFH-DA prečka celično membrano in se v celici deacetilira s celularnimi esterazami do nefluorescentnega diklorofluorescina (DCFH), ki zaradi svoje bolj polarne narave nato ostaja v znotrajceličnem prostoru. DCFH pa se ob prisotnosti ROS oksidira v visoko fluorescenten diklorofluorescin (DCF), kar nam omogoča, da s čitalcem izmerimo intenziteto fluorescence. Izmerjena intenzivnost fluorescence je sorazmerna količini ROS v celici (Wolfe in Liu 2007; Meng in sod. 2017). Obstaja pa nekaj pomislekov in omejitev pri uporabi barvila DCFH-DA. Rezultati so lahko odvisni od privzema barvila v celico. Ugotovili so, da DCFH in DCF nista popolnoma ujeta v znotrajceličnem prostoru, kot je bilo splošno znano. Ko so bile endotelijske celice, ki so bile predhodno izpostavljene DCFH-DA, izpostavljene mediju brez
22 DCFH-DA, so se stopnje DCFH in DCF zmanjšale znotraj celic in povečale izven celice (Wolfe in Liu, 2007). Ta metoda nam ne nudi specifičnosti za določeno vrsto ROS, saj več intermediatov oksidira DCFH do DCF. Oksidacija lahko poteče tudi ob prisotnosti citokroma c (hemski protein, ki se sprosti iz mitohondrija v citosol med apoptozo) neposredno ali posredno preko peroksidaznega mehanizma, zato je stabilnost celične linije pomembna lastnost (Girard-Lalancette in sod. 2009). Omejitev predstavlja tudi, da ni standardizirane metode in protokola, ki bi nudila primerljivost rezultatov med laboratoriji. Obstajajo razlike v celičnih linijah, vrstah oksidantov, medijih, koncentracijah reagentov, časovnih intervalih ter kvantifikaciji oksidativnega stresa, ki jih raziskovalci uporabljajo (Wolfe in Liu 2007; Shahidi in Zhong 2015).