UNIVERZA V LJUBLJANI

UNIVERZ V LJUBLJNI BIOTEHNIŠK FKULTET ODDELEK Z ŽIVILSTVO Valentina BUCIK NTIOKSIDTIVN UČINKOVITOST LISTOV IN STORŽKOV HMELJ DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij Ljubljana, 23

UNIVERZ V LJUBLJNI BIOTEHNIŠK FKULTET ODDELEK Z ŽIVILSTVO Valentina BUCIK NTIOKSIDTIVN UČINKOVITOST LISTOV IN STORŽKOV HMELJ DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij NTIOXIDNT CTIVITY OF HOP LEVES ND HOP CONES GRDUTION THESIS University study Ljubljana, 23

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. II Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija živilske tehnologije. Opravljeno je bilo na Katedri za biokemijo in kemijo živil Oddelka za živilstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Za mentorico diplomskega dela je imenovana prof. dr. Nataša Poklar Ulrih in za recenzenta prof. dr. Rajko Vidrih. Mentorica: prof. dr. Nataša Poklar Ulrih Recenzent: prof. dr. Rajko Vidrih Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: Član: Član: Datum zagovora: Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji. Valentina Bucik

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. III ŠD Dn KLJUČN DOKUMENTCIJSK INFORMCIJ DK UDK 633.79:547.56:577.(43)=63.6 KG V S hmelj/humulus lupulus/listi hmelja/storžki hmelja/fenolne spojine/antioksidanti/ antioksidativna učinkovitost/geografsko poreklo/dpph test/frp test/ BUCIK, Valentina POKLR ULRIH, Nataša (mentorica)/ VIDRIH, Rajko (recenzent) KZ SI- Ljubljana, Jamnikarjeva Z LI 23 IN TD OP IJ JI I Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo NTIOKSIDTIVN UČINKOVITOST LISTOV IN STORŽKOV HMELJ Diplomsko delo (univerzitetni študij) XII, 55 str., 23 pregl., 7 sl., 6 pril., 44 vir. sl sl/en Namen diplomske naloge je bil določiti antioksidativno učinkovitost v listih in storžkih hmelja. Za vzorce smo uporabili etanolne ekstrakte hmelja iz različnih geografskih območij, in sicer Slovenije, vstrije, Nemčije in Češke iz let 28 in 2. ntioksidativno učinkovitost smo določili z analizo sposobnosti lovljenja prostih DPPH radikalov in analizo sposobnosti redukcije s tako imenovanim FRP testom. Storžki hmelja vsebujejo več fenolnih spojin kot listi hmelja in so boljši lovilci prostih radikalov ter antioksidativno učinkovitejši, medtem ko so se listi hmelja izkazali kot redukcijsko sposobnejši, kar kaže na raznolikost delovanja antioksidativnih učinkovin v ekstraktih hmelja. Sorta hmelja ne vpliva bistveno na antioksidativno učinkovitost in redukcijsko sposobnost hmelja, država porekla in leto pridelave nekoliko vplivata na oba testa. Količina fenolnih spojin in sposobnost lovljenja prostih radikalov sta premosorazmerni, medtem ko sta količina fenolnih spojin in redukcijska sposobnost hmeljnih ekstraktov obratnosorazmerni. Kot antioksidativno najbolj učinkovit se je izkazal ekstrakt storžkov hmelja sorte urora nemškega porekla iz leta 28. Najboljšo redukcijsko sposobnost so izkazali listi hmelja sorte urora češkega porekla iz leta 2. KEY WORDS DOCUMENTTION

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. IV DN Dn DC UDC 633.79:547.56:577.(43)=63.6 CX hops/ Humulus lupulus/hop leaves/hop cones/phenolic compounds/antioxidants/ antioxidative activity/geographical origin/ DPPH test/frp test/ U BUCIK, Valentina POKLR ULRIH, Nataša (supervisor)/ VIDRIH, Rajko (reviewer) PP SI- Ljubljana, Jamnikarjeva PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology PY 23 TI NTIOXIDNT CTIVITY OF HOP LEVES ND HOP CONES DT NO L L B Graduation thesis (university studies) XII, 55 p., 23 tab., 7 fig., 6 ann., 44 ref. sl sl/en The main object of the graduation thesis was to determine the antioxidative activity in hop leaves and hop cones. Our samples were ethanolic extracts of hops from different geographical origin, from Slovenia, ustria, Germany and Czech Republic, harvested in years 28 and 2. ntioxidative activity was measured as capability to scavenge free DPPH radicals and as reducing power with FRP test. Hop cones containe more phenolic compounds than hop leaves and are better free radical scavengers than hop leaves which have higher reducing power. This points to diversity of antioxidant actions in hop extracts. Hop variety does not influence significantly the antioxidative activity and reducing power, geographical origin and year of harvest have a slight influence on antioxidative activity an reducing power of hops. The content of phenolic compounds is proportional to antioxidative activity, but quantity of phenolic compounds and reducing power of hop extracts are inversly proportional. The most effective antioxidant was extract of hop cones urora variety of German origin harvested in year 28. Greatest reducing power showed extract of hop leaves urora variety of Checz origin harvested in year 2.

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. V KZLO VSEBINE KLJUČN DOKUMENTCIJSK INFORMCIJ... III KZLO VSEBINE... V KZLO PREGLEDNIC... VII KZLO SLIK... IX KZLO PRILOG... X OKRJŠVE IN SIMBOLI... XII UVOD.... NMEN NLOGE... 2.2 DELOVNE HIPOTEZE... 2 2 PREGLED OBJV... 3 2. HMELJ... 3 2.. Botanična razvrstitev... 3 2..2 Podnebne zahteve... 3 2..3 Zgradba hmeljne rastline... 4 2..3. Podzemni deli... 4 2..3.2 Nadzemni deli... 4 2..3.3 Generativni organi... 5 2..4 Tehnološka zrelost hmelja... 7 2..5 Sorte hmelja... 7 2..5. urora... 9 2..5.2 Magnum... 9 2..6 Kemijska sestava hmelja... 2..6. Hmeljne smole... 2..6.2 Eterično olje... 2..6.3 Fenolne spojine... 2..6.4 Flavonoidi... 4 2..6.4. Ksantohumol... 4 2.2 PROSTI RDIKLI, OKSIDCIJ IN NTIOKSIDNTI... 5 2.2. Prosti radikali... 5 2.2.2 Oksidacija in avtooksidacija... 6

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. VI 2.2.3 ntioksidanti... 6 3 MTERILI IN METODE DEL... 8 3. MTERILI... 8 3.. Vzorci hmelja... 8 3..2 Reagenti... 8 3..3 parature... 8 3..4 Pribor... 8 3..5 Priprava raztopin... 9 3.2 METODE... 9 3.2. Priprava vzorca... 9 3.2.2 ntioksidativna učinkovitost vzorcev... 9 3.2.3 naliza sposobnosti redukcije... 2 4 REZULTTI Z RZPRVO... 2 4. NTIOKSIDTIVN UČINKOVITOST Z DPPH TESTOM... 22 4.2 NLIZ SPOSOBNOSTI REDUKCIJE... 35 5 SKLEPI... 49 6 POVZETEK... 5 7 VIRI... 5 ZHVL PRILOGE

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. VII KZLO PREGLEDNIC Preglednica : Slovenske sorte hmelja (Čerenak in Ferant, 22)... 9 Preglednica 2: Razvrstitev fenolnih spojin (bram, 2)... 2 Preglednica 3: Vsebnost polifenolnih spojin v navadnem hmelju (Humulus lupulus) (lekseeva in sod., 24)... 3 Preglednica 4: Oštevilčenje ekstraktov fenolnih spojin iz listov in storžkov dveh kultivarjev hmelja iz štirih držav.... 2 Preglednica 5: Povprečna masna koncentracija skupnih fenolnih spojin v ekstraktih listov in storžkov dveh kultivarjev hmelja.... 22 Preglednica 6: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L, S in L3, S3)... 24 Preglednica 7: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L2, S2 in L4, S4)... 25 Preglednica 8: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L5, S5 in L7, S7)... 26 Preglednica 9: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L6, S6 in L8, S8)... 27 Preglednica : Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L9, S9 in L, S)28 Preglednica : Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L, S in L2, S2)... 29 Preglednica 2: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L3, S3 in L5, S5) 3 Preglednica 3: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L4, S4 in L6, S6)... 3 Preglednica 4: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) hmelja urejeni po antioksidativni učinkovitosti od najbolj do najmanj učinkovitega antioksidanta... 32 Preglednica 5: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L, S in L3, S3)... 37 Preglednica 6: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L2, S2 in L4, S4). 38 Preglednica 7: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L5, S5 in L7, S7)... 39 Preglednica 8: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L6, S6 in L8, S8)... 4 Preglednica 9: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L9, S9 in L, S)... 4

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. VIII Preglednica 2: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L, S in L2, S2)... 42 Preglednica 2: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L3, S3 in L5, S5)... 43 Preglednica 22: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L4, S4 in L6, S6) 44 Preglednica 23: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) hmelja urejeni po redukcijski sposobnosti od najboljšega do najslabšega reducenta.... 45

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. IX KZLO SLIK Slika : Podzemni deli hmeljne rastline (Rode in sod., 22)... 4 Slika 2: Oblike listov hmelja (Rode in sod., 22)... 5 Slika 3: Moško socvetje in zgradba moškega cveta (Čerenak in Ferant, 22)... 5 Slika 4: Storžek hmelja: -zunanji videz; 2-lističi storžka; 3-vretence (Rode in sod., 22)... 6 Slika 5: Dozorelo žensko socvetje hmelja sorte urora (IHPS, 23)... 7 Slika 6: Lupulin (Stevens in Page, 24)... Slika 7: Kemijska struktura lupulona () in humulona (2) (Gerh ӓuser,... 25) Slika 8: Osnovna strukturna formula flavonoidov (bram, 2)... 4 Slika 9: Kemijska struktura ksantohumola (Tabata in sod., 997)... 5 Slika : Vrednost IC 5 za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28... 33 Slika : Vrednost IC 5 za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28... 33 Slika 2: Vrednost IC 5 za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2... 34 Slika 3: Vrednost IC 5 za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2... 34 Slika 4: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28... 46 Slika 5: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28... 46 Slika 6: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2... 47 Slika 7: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2... 47

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. X KZLO PRILOG PRILOG : Rezultati, meritve in grafi DPPH testa Priloga : Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L, S in L3, S3) Priloga 2: Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L2, S2 in L4, S4) Priloga 3: Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L5, S5 in L7, S7) Priloga 4: Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L6, S6 in L8, S8) Priloga 5: Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L9, S9 in L, S) Priloga 6: Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L, S in L2, S2) Priloga 7: Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L3, S3 in L5, S5) Priloga 8: Meritve, rezultati in grafi DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L4, S4 in L6, S6) PRILOG B: Rezultati, meritve in grafi FRP testa Priloga B: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L, S in L3, S3) Priloga B2: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L2, S2 in L4, S4) Priloga B3: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L5, S5 in L7, S7) Priloga B4: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L6, S6 in L8, S8) Priloga B5: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L9, S9 in L, S)

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. XI Priloga B6: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L, S in L2, S2) Priloga B7: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L3, S3 in L5, S5) Priloga B8: Meritve, rezultati in grafi FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L4, S4 in L6, S6)

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. XII OKRJŠVE IN SIMBOLI absorbanca DPPH 2,2 difenil pikril hidrazil IC 5% koncentracija fenolnih spojin, ki je odgovorna za 5 % zmanjšanje začetne količine prostih radikalov EDT etilendiamintetraocetna kislina FS fenolne spojine GRS Splošno priznani kot varni (ang. Generally recognized as safe) ha hektar IHPS Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije k smerni koeficient premice L L6 vzorci listov hmelja S S6 vzorci storžkov hmelja SS suha snov γ masna koncentracija

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. UVOD Hmelj, ki ga pridelujemo danes, izhaja iz divje rastočih hmeljev Evrope in zahodne zije (Ferant, 22). Ljudstva v Mezopotamiji in Starem Egiptu so že pripravljala napitke iz žita in drugih rastlin, vendar trdnega dokaza o uporabi hmelja v tem času ni. Suhi hmelj pa so nedvomno uporabljala staroslovanska ljudstva, ki so ga med preseljevanjem zanesla tudi v naše kraje (Majer in sod., 22). V 2. stoletju je gospodarska pridelava hmelja razširjena po vseh celinah med petintridesetim in petinpetdesetim vzporednikom, severno in južno od ekvatorja (Pavlovič, 22). V pridelavi ene od osnovnih sestavin piva prednjačijo nemški in ameriški hmeljarji, na tretjem mestu je Češka. Površine hmeljišč v svetu obsegajo okoli 5 ha različnih grenčičnih in aromatičnih sort hmelja, pridelek hmelja pa dosega približno ton in okoli ton grenčic. Hmeljišča v Sloveniji po obsegu predstavljajo okoli 3 % svetovnih površin hmeljišč, torej okoli 4 ha, na katerih 4 hmeljarskih posestev prideluje pretežno aromatične sorte, ki so plod dolgoletnega žlahtnjenja hmelja na IHPS. Najbolj razširjene sorte hmelja, pridelanega v Sloveniji so urora, Bobek, Celeia in Savinjski golding, pa tudi nemška sorta Magnum. Hmeljarstvo je v Sloveniji izvozno najizrazitejša panoga kmetijstva. Približno 9 % slovenskega hmelja je namenjeno izvozu na tuje trge. Hmelj je zelnata trajnica, ovijalka. Je dvodomna rastlina, kar pomeni, da na eni rastlini najdemo le moške ali le ženske cvetove. Življenjska doba nasadov hmelja je običajno od dvanajst do petnajst let, lahko pa tudi več kot dvajset let (Ferant, 22). Goji se z namenom pridobivanja sekundarnih metabolitov, predvsem alfa- in beta-kislin, pivu pa se dodaja zaradi njegove edinstvene arome in osvežujoče grenkobe (Kondo, 24.) V listih in storžkih hmelja najdemo fenolne spojine (FS) in sicer fenolne kisline, flavonoide in proantocianidine. V hmeljarstvu se uporabljajo le storžki, hmeljevi listi pa so stranski produkt in potencialen vir fenolnih spojin. Stranskim proizvodom predelave rastlinskih živil se namenja pozornost kot surovini za pridobivanje visoko vrednih učinkovin, ki bi imele uporabno vrednost GRS dodatkov v živilskih izdelkih ter pri pripravi funkcionalnih živil in nutracevtikov (bramovič in sod., 28). V današnjem času je trend povpraševanja po živilih in pripravkih z antioksidativnim delovanjem v stalnem naraščanju. Večina osveščenih potrošnikov se zaveda koristi in pozitivnih učinkov prehrane bogate z antioksidanti, dasiravno je James Watson, prejemnik Nobelove nagrade za fiziologijo in medicino za odkritje strukture DN, pred kratkim objavil znanstveni članek v katerem oporeka tem trditvam. V obsežni raziskavi med pojavnostjo raka in vnosom antioksidanta vitamina E ugotavlja, da se je med jemalci vitamina E pojavnost raka na prostati celo rahlo zvišala (Watson, 23). Dokazali so tudi, da se bolnikom z rakom pankreasa med obsevanjem poveča količina endogenih antioksidantov, ki preprečijo apoptozo (programirana celična smrt) rakavih celic.

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 2. NMEN NLOGE V okviru diplomskega dela želimo določiti celokupno količino fenolnih spojin in njihov antioksidativni potencial v etanolnih ekstraktih, pridobljenih iz hmeljevih listov in storžkov kultivarjev Magnum in urora z različnim geografskim poreklom (Slovenija, vstrija, Nemčija, Češka) in letom pridelave 28 in 2..2 DELOVNE HIPOTEZE Pričakujemo, da bodo storžki vsebovali več fenolnih spojin kot listi. Geografsko poreklo in leto pridelave hmelja naj ne bi bistveno vplivalo na vsebnost fenolnih spojin.

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 3 2 PREGLED OBJV 2. HMELJ Rastlino hmelja sestavljajo podzemni vegetativni deli, nadzemni vegetativni deli in razmnoževalni oz. generativni deli. Nadzemni deli na koncu vsake rastne sezone propadejo, prezimijo le podzemni deli (Ferant, 22). Hmelj vsebuje veliko biološko aktivnih komponent, grenčičnih in polifenolnih spojin ter eteričnih olj (Chesnokova in sod., 29). Po literaturnih podatkih vsebujejo hmeljni storžki 4 4 % polifenolnih spojin. Njihova vsebnost z zorenjem narašča, vendar je razlika med aromatičnimi in visokogrenčičnimi kultivarji; pri aromatičnih se vsebnost polifenolnih spojin v času zorenja veča, medtem ko se pri visokogrenčičnih kultivarjih niža (Dale, 987, cit. po Donko in sod., 23). Hmelj je naravni vir ksantohumola. To je preniliran halkon z dokazanim izjemno širokim spektrom mehanizmov antikancerogenega delovanja med različnimi stadiji te bolezni (Gerhäuser in sod., 22). Posušeni hmeljevi storžki vsebujejo od % do, % ksantohumola, ki se nahaja v lupulinskih žlezah skupaj z alfa- in beta-kislinami ter eteričnimi olji (Hrastar in sod., 26). 2.. Botanična razvrstitev Botanično hmelj uvrščamo med dvokaličnice, v red koprivovcev (Urticales) skupaj z navadno koprivo. Pripada družini Cannabaceae (Rode in sod., 22; Pavlovič in sod., 22), kamor spada tudi Cannabis sativa, indijska konoplja (Stevens, 967). Hmelj je zelnata trajnica, ovijalka. Je dvodomna rastlina, kar pomeni, da na eni rastlini najdemo le moške ali le ženske cvetove (Rode in sod., 22). V rodu Humulus sta dve vrsti: navadni hmelj Humulus lupulus in enoletni japonski hmelj Humulus japonicus, ki v storžkih nima hmeljnih smol in eteričnega olja, zato je za varjenje neuporaben se pa uporablja kot okrasna rastlina vzpenjalka (Stevens, 967). 2..2 Podnebne zahteve Optimalna temperatura za rast hmelja je med 5 C in 8 C, medtem ko se biološki procesi začnejo spomladi z dnem, ko je povprečna dnevna temperatura zraka več dni zaporedoma višja od 4 C do 5 C. Glede preskrbljenosti z vodo je zahtevna rastlina, zato se uvršča med rastline vlažnih območij. V rastni dobi potrebuje hmeljna rastlina okoli 5 do 6 mm pravilno razporejenih padavin. Količina padavin v času cvetenja in storžkanja hmelja je ključnega pomena za količino alfa-kislin. Občutljiv je tudi glede pomanjkanja svetlobe, ki vpliva na začetek cvetenja. Glede na čas cvetenja poznamo rastline dolgega in kratkega dne ter nevtralne rastline; hmelj je rastlina kratkega dne. Sončevo obsevanje ima dvojni vpliv na rastlino; v pozitivni smeri deluje pri nastanku alfa-kislin, hkrati pa lahko povzroči preveliko izsušitev tal in s tem negativno vpliva na rast in razvoj rastline. Pomembno vlogo pri pridelavi hmelja ima pomembno vlogo tudi veter; le-ta je večkrat negativna, saj povečuje izhlapevanje vode, ovira napeljavo vodil, odvija napeljane

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 4 poganjke in tudi poškoduje vrhove. Močnejši sunki vetra lahko žičnico tudi porušijo (Pavlovič in sod., 29; Rode in sod., 22). 2..3 Zgradba hmeljne rastline 2..3. Podzemni deli Podzemni deli pri zreli hmeljni rastlini so sestavljeni iz koreninskega tkiva in tkiva stebla, ki skupaj tvorita koreniko ali štor. Korenika vsako leto prirašča, njena življenjska doba je do 25 let in je odvisna od pogojev na rastišču, kultivarja in načina obdelave (Rode in sod., 22). Slika : Podzemni deli hmeljne rastline (Rode in sod., 22) 2..3.2 Nadzemni deli Vegetativne nadzemne dele predstavljajo steblo, stranski poganjki in listi (Ferant, 22). Glavno steblo ali hmeljna trta se razvije iz očesca, ki je najprej belo, ko pa prodre na površino, ozeleni (Rode in sod., 22). Ko hmeljna trta zraste v višino okoli 5 cm, se močno razraste in se začne vzpenjati in ovijati v smeri urinega kazalca po opori. Pri pridelovanju nekaj trt usmerimo na vodilo, ostale pa odstranimo. Samo steblo je v prerezu šesterorobo in razdeljeno na kolenca ali nodije. Barva je od zelene do rdečkaste, odvisno od sorte in rastnih razmer. V dobi najhitrejše rasti rastlina hmelja prirašča tudi do 25 cm na dan, premer ima od 7 do 4 mm, v višino pa zraste od 7 do 9 m (Ferant, 22). Zalistniki (panoge, stranski poganjki) se razvijejo iz rastnih vršičkov med listom in steblom na vsakem kolencu stebla. Na njih se razvijejo še dodatni stranski poganjki, na katerih se razvijejo storžki (Ferant, 22; Rode in sod., 22).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 5 Listi so na steblu in stranskih poganjkih razporejeni parno na vsakem nodiju in si ležijo nasprotno. Ob peclju so listne ploskve srčaste in pernato razdeljene; starejši listi so tri- ali petkrpati. Površina listov je dlakava, rob je vedno nazobčan, listne žile pa so lepo vidne. Običajno so listi široki toliko, kot so dolgi. Barve so od svetlo do temno zelene, kar je odvisno od sorte in zunanjih dejavnikov, predvsem od prehrane rastline (Ferant, 22). Slika 2: Oblike listov hmelja (Rode in sod., 22) 2..3.3 Generativni organi Razmnoževalni organi hmelja so majhni in v grozdasta socvetja združeni moški cvetovi, ki se nahajajo na zgornjih stranskih poganjkih moške rastline in v premer merijo okoli 6 mm. Cvetno odevalo sestavlja pet rumenkasto zelenih venčnih listkov in pet izrazitih prašnikov na kratkih filamentih. Ko se cvet popolnoma razvije, se prašnice odprejo in v njih nastaja cvetni prah, ki se raznaša z vetrom (Ferant, 22; Rode in sod., 22). Slika 3: Moško socvetje in zgradba moškega cveta (Čerenak in Ferant, 22)

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 6 Ženski cvetovi na ženski rastlini hmelja so združeni v socvetja, katerega osnovo sestavlja vretence z nodiji. Na vsakem nodiju je par krovnih lističev ali braktej in par prilistov oz. brakteol. Na dnu vsakega prilista je poenostavljen cvet. Ko socvetje dozoreva, se krovni lističi in prilisti povečajo, opekasto prekrijejo in oblikujejo; tako nastane značilna oblika hmeljevega storžka, ki doseže velikost od 2 do 4 mm, odvisno od sorte (Ferant, 22). Slika 4: Storžek hmelja: -zunanji videz; 2-lističi storžka; 3-vretence (Rode in sod., 22) Med zorenjem storžka se na dnu brakteol oblikujejo lupulinske žleze, v katerih se nakopiči eterično olje in grenčične smole, najpomembnejše snovi pri varjenju piva (Stevens, 967). Število, oblika in velikost lupulinskih žlez so značilnosti kultivarja. Količina učinkovin v žlezah je delno odvisna tudi od pridelovalnih pogojev. Lupulinske žleze so lahko različnih tipov po obliki in so vse zelo rahlo vezane na površino (Rode in sod., 22). Med transportom, obiranjem in sušenjem ter pakiranjem se del lupulinskih žlez odlušči in izgubi, kar privede do izgube učinkovin in zmanjšanja kakovosti pridelka. Osemenjene in neosemenjene storžke razlikujemo po obliki krovnih lističev in prilistov. Osemenjeni storžki imajo grobo vretence in so večji, manj zbiti, imajo manj lupulinskih žlez, zato so manj obstojni (Ferant, 22).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 7 Slika 5: Dozorelo žensko socvetje hmelja sorte urora (IHPS, 23) 2..4 Tehnološka zrelost hmelja Hmelj je tehnološko zrel takrat, ko storžki vsebujejo najvišjo vrednost alfa-kislin, dosežejo maksimalno velikost in maksimalno maso, tipično strukturo eteričnih olj in ko je kakovostno strojno obiranje zagotovljeno (Čeh in Zmrzlak, 22). Ob žetvi vsebuje okoli 8 % vlage, ki se po sušenju zmanjša na okoli %. Navadno je hmelj uporabljen po 4 do 2 mesecih po obiranju (Stevens, 967). Tehnološko zrel hmelj ima zaprte storžke s svetlozelenim svilenim leskom in izenačene po velikosti. Storžki so polni lupulina, prožni, pri tiskanju šelestijo in se pri padcu odbijejo od tal. Če jih zmečkamo, ostane na prstih lepljiva rumenkasta sled (Majer in sod., 22). Hmelj, obran pred tehnološko zrelostjo je slabše kakovosti in vsebuje preveč vlage (Čeh in Zmrzlak, 22), storžki so neprožni, majhni, neizenačene velikosti, travnato zelene barve z malo lupulina in razprtimi lističi, zato pri sušenju izpada iz njih. Imajo neizrazit in prazen vonj, ob obiranju hitro ovenejo in se sesedejo (Majer in sod., 22). Prepozno obran hmelj ima drobljive, odprte storžke, rumene ali rjavkaste barve in manjšo vsebnost alfa-kislin, pri obiranju pa prihaja do večjih izgub zaradi osipanja in drobljenja (Čeh in Zmrzlak, 22; Majer in sod., 22). Lističi storžka odpadajo in z njimi tudi lupulin. So neprijetne in ostre arome (Majer in sod., 22). Trajanje tehnološke zrelosti se pri različnih sortah razlikuje; pri urori traja dvajset dni, pri Buketu sedemnajst, pri Savinjskemu goldingu pa le sedem do deset dni, ob vročem in suhem vremenu tudi manj, do pet dni. V tem času je treba posamezno sorto obrati (Čeh in Zmrzlak, 22). 2..5 Sorte hmelja Sorte hmelja delimo glede na pridelovalne lastnosti, količino grenčice ter kakovost arome. Po pridelovalnih lastnostih ločimo sorte predvsem na čas zrelosti; zgodnje, srednje pozne in pozne sorte (Čerenak in Ferant, 22).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 8 Med zgodnje sorte uvrščamo Savinjski golding, ki doseže tehnološko zrelost med. in 2. avgustom, srednje pozne so urora, Bobek in Styrian gold, ki so tehnološko zrele med 2. in 3. avgustom, pozni sorti sta Celeia in Dana, ki dozorita v prvi dekadi septembra (Čeh in Zmrzlak, 22). Glede na količino grenčice in aromo, oziroma glede na količino alfa-kislin, delimo sorte hmelja v tri skupine, katerih meje niso jasno določene (Čerenak in Ferant, 22). romatični hmelj s količino alfa-kislin do 8 % v suhi snovi, je hmelj s tipično hmeljsko aromo in majhno količino grenčičnih smol. Predstavnik te skupine je Savinjski golding. Grenčični hmelj s količino alfa-kislin 8 do 4 % v suhi snovi in z večjo količino grenčičnih smol ter prijetno aromo je urora. Visoko grenčični hmelj z visoko vsebnostjo alfa-kislin (nad 4 % v suhi snovi) pa je Dana. Jelinek in sodelavci (2) pa delijo hmelj glede na količino grenčice in aromo v štiri skupine, in sicer: Hmelj s fino aromo (3,5 do 4 % alfa-kislin v suhi snovi); romatičen hmelj (3,5 do 6,5 % alfa-kislin v suhi snovi); Grenčični hmelj (več kot 8 % alfa-kislin v suhi snovi); Hmelj z visoko vsebnostjo alfa-kislin (nad 5 % alfa-kislin v suhi snovi). Razmerje med alfa- in beta-kislinami v hmelju nam lahko poda koristne informacije za identifikacijo sorte. Vrednost tega razmerja je višja v hmelju z visoko vsebnostjo alfakislin in v grenčičnem hmelju, medtem ko je v hmelju s fino aromo in aromatičnem hmelju nižja. Ta delitev se lahko uporabi le v zadnjem koraku identifikacije, za verifikacijo rezultatov, saj vsebnost alfa-kislin v hmelju variira. Vsekakor pa kemijska sestava storžkov hmelja ni sortno odvisna. Veliko faktorjev vpliva na vsebnost sekundarnih metabolitov, ki jih moramo vzeti v obzir. Ti faktorji so rastna sezona, pridelovalno območje, klimatski pogoji, razmere shranjevanja in mnogi drugi (Jelinek in sod., 2).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 9 Preglednica : Slovenske sorte hmelja (Čerenak in Ferant, 22) Sorta* Savinjski golding Osnovna razvrstitev lfa-kisline (% v SS) Eterično olje (% v SS) Pridelek (t/ha) aromatični 2,8-6,,3-,7,2-2,2 hil grenčični 9,4-,3,5-,8,2-2, polon grenčični 9,-,,8-,2,2-2, tlas grenčični 9,3-,9,9-3,,3-3, urora aromatični 7,2-2,6,9-,6,6-3,2 Blisk grenčični 5,-7,,4-3,4,5-3, Bobek aromatični 3,5-7,8,7-4,,3-3,5 Buket aromatični 6,4-,,2-4,2,3-2,8 Cekin aromatični 4,-7,,4-2,3,5-2,8 Celeia aromatični 3,-8,7,6-3,6,-3,2 Cerera aromatični 3,4-7,,3-2,8,8-3, Cicero aromatični 6,-9,5,9-2,3,7-2,8 Dana grenčični 2,5-9,3 3,-4,6,8-2,8 Styrian gold aromatični 3,5-6,5,3-2,3,6-2,4 *Sorte, ki so označene s krepko pisavo se trenutno pridelujejo v Sloveniji. 2..5. urora Kultivar urora je križanec med angleško sorto Northern Brewer in slovenskim divjim moškim hmeljem. Zrelost kultivarja je srednje pozna. Vsebuje,,8 ml eteričnega olja v g vzorca in več kot 9 % alfa-kislin, od teh 24 % kohumulona, ki naj bi med alfakislinami prispeval največji delež grenkobe. Razmerje med alfa- in beta-kislinami je 2 (Schönberger, 29; Šuštar-Vozlič in sod., 22). Je aromatična sorta, požlahtnjena na IHPS. Odlikujejo jo dobre agronomske lastnosti za pridelavo in spravilo hmelja. Prepoznavna je po prijetni hmeljni aromi in grenčici, ki se odražata v zelo dobri pivovarski vrednosti (IHPS, 23). V raziskavi, izvedeni na IHPS (Hrastar in sod., 26), v kateri so preučevali vpliv sorte in lokacije na vsebnost ksantohumola v hmelju, so ugotovili, da je imela urora med sortami, gojenimi v Sloveniji, največji povprečni delež ksantohumola v storžkih in drugo največjo povprečno vsebnost alfa-kislin. 2..5.2 Magnum Po zrelosti srednje pozen nemški kultivar hmelja Magnum je križanec med ameriško sorto Galena in moškim križancem 75/5/3. Je srednjearomatičen in z njim hmeljeno pivo ima visoko grenčično vrednost ter dobro kakovost grenčice, sam hmelj pa odlikuje velik pridelek in visoka vsebnost alfa-kislin; 2 5 %, od teh je okoli 25 % kohumulona. Vsebnost eteričnih olj v g vzorca je,8 ml, razmerje med alfa- in beta-kislinami pa je 2,8 (Šuštar-Vozlič in sod., 22; Ferant in Košir, 22). V že prej omenjeni raziskavi so Hrastar in sodelavci (26) ugotovili, da je po povprečni vrednosti deleža ksantohumola med sortami, gojenimi v Sloveniji drugi po vrsti, takoj za uroro, ima pa največji povprečni delež alfa-kislin v isti kategoriji (Hrastar in sod., 26).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 2..6 Kemijska sestava hmelja Sestavine hmeljnega storžka so hmeljne smole, eterično olje in polifenoli. V splošnem so smole nehlapne trdne ali poltrdne amorfne snovi z veliko molsko maso, ki se izločajo iz rastline, ko je le-ta izpostavljena vročini ali stresu. Navadno so svetlo rumene do temno rjave barve, brez vonja in okusa ter prosojne. Topne so v večini organskih topil, v vodi pa ne. Smole lahko vsebujejo majhne količine hlapnih fenolnih spojin (Brewer, 2). Eterična olja so po kemijski sestavi ekstremno kompleksne zmesi, ki vsebujejo spojine vseh glavnih funkcionalnih skupin. Izoliramo jih lahko s parno destilacijo, s solventno ali CO 2 ekstrakcijo ter mehansko neposredno iz rastline (Brewer, 2). Hmeljni storžki vsebujejo snovi, ki dajejo pivu okus, vonj in obstojnost. Za pivovarstvo pomembne sestavine hmelja, grenčične snovi in smole, se nahajajo v lupulinu, zato je le-ta najpomembnejši del hmeljnega storžka (Rode in sod., 22). Slika 6: Lupulin (Stevens in Page, 24) 2..6. Hmeljne smole Skupne smole predstavljajo trde smole in mehke smole. Mehke smole imajo lastnosti kislin in jih imenujemo alfa- in beta-kisline. lfa-kisline so sestavljene iz petih sorodnih spojin, med katerimi je največ humulona, kohumulona in adhumulona, beta-kisline pa so zmes sorodnih spojin, od katerih so najpogosteje zastopane lupulon, kolupulon in adlupulon (Rode in sod., 22; Stevens, 967; Stevens in Page, 24).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. Slika 7: Kemijska struktura lupulona () in humulona (2) (Gerh ӓuser, 25) lfa-kisline so v vodi slabo topne. V procesu proizvodnje piva pride med segrevanjem do izomerizacije, ki jih pretvori v vroči vodi bolj topne in grenke izoalfa kisline, ki so nosilci kakovosti in intenzivnosti grenčice. Na osnovi analitične vrednosti alfa-kislin se določi odmerek hmelja za hmeljenje sladice. Tudi beta-kisline so v vodi slabo topne in ne prehajajo v pivino, zato ne prispevajo h grenkemu okusu piva. Izločijo se med usedlino ali s hmeljnimi tropinami (Rode in sod., 22; Virant, 22). Vsebnost alfa-kislin v storžku predstavlja enega pomembnejših tržnih parametrov v okviru globalnega povpraševanja po hmelju, saj je pri večini odkupljenega hmelja kot najpomembnejši kriterij izpostavljena vsebnost teh grenčičnih snovi (Pavlovič in sod., 29). lfa- in beta-kisline imajo zaradi specifične kemijske strukture enak učinek kot ionoforni antibiotiki, ki zmanjšujejo populacijo grampozitivnih bakterij in praživali v prebavilih prežvekovalcev (Srečec in sod., 2), zato se lahko preventivno dodajajo v koncentrirana krmila. Poleg tega zmanjšujejo tudi emisijo metana iz živalskih iztrebkov. 2..6.2 Eterično olje Hlapne snovi, ki dajejo storžku značilen vonj, so eterična olja, sestavljena iz več sto različnih komponent, med drugimi so tu prisotni mircen, humulen in seskviterpeni (Ferant in Košir, 22; Stevens, 967). Hmelj vsebuje približno - 3 % eteričnega olja in ker je hlapno se njegova vsebnost med sušenjem in skladiščenjem zmanjšuje, pri daljšem nepravilnem skladiščenju pa lahko pride do oksidacije, kar povzroča neprijeten vonj (Ferant in Košir, 22). 2..6.3 Fenolne spojine Fenolne spojine so sekundarni metaboliti. To so spojine, ki nastajajo v rastlinah in mikroorganizmih in niso naravnost vključene v osnovni metabolizem. Za rastlino so posebnega pomena, tako s fiziološkega kot z morfološkega vidika, saj so pomembni pri rasti in reprodukciji. kumulirajo se predvsem v epidermalnem tkivu rastline in sodelujejo v zaščiti pred zunanjimi stresi (UV, mikrobi, insekti), učinkujejo kot vizualni markerji (cvetovi, sadeži) ter vplivajo na senzorične lastnosti (barva, okus, aroma) živilskih izdelkov. V celici so v vakuoli ali pa so vezani na elemente celične stene. V človeškem organizmu ne nastajajo (bram in sod., 2; bramovič in sod., 28).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 2 Molekule fenolnih spojin vsebujejo vsaj en aromatski obroč in vsaj eno hidroksilno (-OH) skupino na tem obroču. Razdelimo jih lahko na več načinov, najbolj enostaven pa je tisti, po katerem so razvrščene po številu ogljikovih atomov v molekuli, kar prikazuje preglednica 2. Preglednica 2: Razvrstitev fenolnih spojin (bram, 2). Št. C -atomov Osnovni skelet Skupina 6 C 6 Fenoli 7 C 6 C Fenolne kisline 8 C 6 C 2 Fenilocetne kisline 9 C 6 C 3 Hidroksicimetne kisline Fenilpropeni Kumarini Izokumarini Kromoni C 6 C 4 Naftokinoni 3 C 6 C C 6 Ksantoni 4 C 6 C 2 C 6 Stilbeni ntrakinoni 5 C 6 C 3 C 6 Flavonoidi 8 (C 6 C 3 ) 2 Lignani Neolignani 3 (C 6 C 3 C 6 ) 2 Biflavonoidi (C 6 C 3 ) n Lignini n (C 6 ) n Melanini (C 6 C 3 C 6 ) n Kondenzirani tanini Strukturno najpreprostejše fenolne spojine so fenolne kisline. Vse fenolne spojine so sekundarni metaboliti in vse, razen flavonoidov, nastajajo iz fenilalanina ali njegovega prekurzorja šikiminske kisline. Pivo je zaradi fenolnih spojin, posebej kohumulona, grenko, rdečo barvo vinu pa dajo antociani in sicer malvin (bram in Simčič, 997). Telo lažje absorbira antioksidativne učinkovine iz piva, kot pa iz rdečega vina (Kondo, 24). Rastlina začne akumulirati fenolne spojine, ko je izpostavljena različnim virom stresa (npr. pomanjkanju vode). Čeh in sodelavci (27) so primerjali vsebnost antioksidativnih komponent v hmelju, ki so ga gojili pod različnimi pogoji. V redno zalivanih rastlinah iz rastlinjaka so določili manj polifenolov, kot v rastlinah, izpostavljenih naravnim pogojem na polju. Sklenili so, da je rastlina, izpostavljena stresu bogatejši vir polifenolnih spojin, kot rastlina, ki ima idealne pogoje za rast (Čeh in sod., 27). Fenolne spojine v hmelju vplivajo na barvo, aromo, peno in stabilnost okusa piva, količina in sestava pa je odvisna predvsem od sorte hmelja (Ferant in Košir, 22). Glavni polifenolni spojini v hmelju sta prenilirana flavonoida ksantohumol in dihidroflavonol

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 3 dihidrokvercetin. Skupino flavonolov v hmelju predstavljata kvercetin in kampferol (lekseeva in sod., 24). Preglednica 3: Vsebnost polifenolnih spojin v navadnem hmelju (Humulus lupulus) (lekseeva in sod., 24) Spojina Vsebnost % g/kg Fenolne spojine (skupne) 2,8 28 Flavonoidi (skupni, sorodni rutinu),5 5 Flavonoli,6 6 Kvercetin,, Kampferol,6,6 Izoramnetin - - Miricetin - - Dihidroflavonoli Dihidrokvercetin Prenilirani halkoni Ksantohumol Prenilirani flavanoni Izoksantohumol 5 25,5,5 Derivati cimetne kisline,82,82 Ferulna kislina,4,4 Klorogenska kislina,33,33 Kaftarna kislina (sorodna ferulni kislini),35,35 Največ preniliranih flavonoidov in flavanonov ljudje dobimo s pivom, ki jih vsebuje okoli 4 mg/l (Stevens in sod., 23). Hmelj je praktično edini vir naravnih preniliranih flavonoidov ksantohumola in izoksantohumola. Ksantohumol, oz. prenilirani flavonoidi so znani po svoji antikancerogeni učinkovitosti in upočasnjevanju rasti rakavih celic (Tabata in sod., 997). Hmelj je tudi bogat vir flavonolov in taninov, ki pa jih lahko najdemo v celotnem kraljestvu rastlin (Stevens in Page, 24). V litru piva, nemškem ležaku znamke Pilsener, je 53 mg polifenolnih spojin. Le-te so temeljnega pomena za fizikalno-kemično

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 4 stabilnost, formacijo pene, grenkobnost, vonj in preprečevanje okusa po»postanem«(piendl in Biendl, 2). V raziskavi o vplivu predelave hmelja na fenolne spojine in antioksidativno učinkovitost piva so Leitao in sodelavci (2) ugotovili, da je skupna antioksidativna učinkovitost med varjenjem piva ostala nespremenjena, medtem ko se je vsebnost polifenolnih komponent povečala. Vzrok za povečano vsebnost polifenolov tiči v hmeljenju in fermentaciji, saj so se polifenolne spojine ekstrahirale v prisotnosti alkohola (Leitao in sod. 2). 2..6.4 Flavonoidi Flavonoidi so spojine, ki imajo skupaj 5 C-atomov in osnovno strukturo (C 6 C 3 C 6 ), ki se imenuje flavon. So zelo razširjena skupina vodotopnih fenolnih spojin. Poznanih je več kot 8 flavonoidov (bram in sod., 2), ki jih ločimo po nesladkornem delu molekule, aglikonu. Tako jih delimo na flavone, flavonole, katehine, flavanone, dihidroflavonole, flavan-3,4-diole, antocianidine, izoflavone, neoflavone, halkone, dihidrohalkone in avrone. V naravi običajno najdemo glikolizirane flavonoide, ki imajo največkrat na C-3 atomu (lahko tudi na C-5 ali C-7 atomu) vezane različne sladkorje kot so glukoza, galaktoza, arabinoza, ramnoza, ksiloza, manoza, glukuronska ali galakturonska kislina. V skupino flavonoidov prištevamo tudi halkone, ki strukturno sicer niso flavonoidi, pač pa so njim kemično in biosintetsko zelo sorodne spojine (bram, 2; bram in Simčič, 997). Slika 8: Osnovna strukturna formula flavonoidov (bram, 2) 2..6.4. Ksantohumol Ksantohumol je bil izoliran in poimenovan leta 93. Najdemo ga le v rastlini hmelja, kjer je glavni preniliran flavonoid ženskega socvetja. Sicer je strukturno preprost preniliran halkon, kemično in biosintetsko sorodna spojina flavonoidom, zato ga tudi uvrščamo v to skupino. Glavni vir ksantohumola v človeški prehrani je pivo (bram in Simčič, 997; Stevens in Page, 24). Vsebnost ksantohumola v hmelju je lahko merilo kvalitete v surovem materialu in v izdelkih, katerih sestava temelji na hmeljnem ekstraktu (lekseeva in sod., 24).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 5 Posušeni hmeljevi storžki vsebujejo do, % ksantohumola ki je, skupaj z alfa- in beta-kislinami ter eteričnimi olji del lupulina, spremlja pa ga še najmanj 3 drugih preniliranih flavonoidov, vendar v manjših koncentracijah (Hrastar in sod., 26; Stevens in Page, 24). Čeprav je ksantohumol glavni preniliran flavonoid v hmelju, ga je v pivu zelo malo, saj med varjenjem piva izomerizira v flavanon. Ksantohumol in ostali prenilirani flavonoidi iz hmelja so potencialna preventivna antikancerogena sredstva, saj inhibirajo aktivacijo rakavih celic, inducirajo protirakave encime in inhibirajo rast tumorjev. V rastlinah naj bi varovali ženske generativne organe pred insekti in ostalimi herbivori (Stevens in Page, 24). Slika 9: Kemijska struktura ksantohumola (Tabata in sod., 997) Zaradi vse večjega zavedanja potrošnikov o prednosti izdelkov z blagodejnim učinkom na metabolizem, ima pivovarska industrija možnost uvedbe novega izdelka, ki bi ga lahko uvrščali med funkcionalna živila. Piva v to skupino ne moremo uvrstiti zaradi vsebnosti alkohola, medtem ko bi pivo s povečano vsebnostjo ksantohumola to lahko bilo (Hrastar in sod., 26). Z žlahtnjenjem hmelja bi lahko pridelali sorte s povečano vsebnostjo ksantohumola in manjšo vsebnostjo alfa-kislin. To bi lahko storili tako, da bi prekinili metabolično pot alfa-kislin in s tem pridobili več poliketidov in terpenoidnih prekurzorjev, potrebnih za nastanek preniliranih flavonoidov. lternativna pot za proizvajanje hmelja z visoko vsebnostjo obeh učinkovin bi lahko bila povečanje lupulinskih žlez v storžkih (Stevens in Page, 24). 2.2 PROSTI RDIKLI, OKSIDCIJ IN NTIOKSIDNTI 2.2. Prosti radikali Prosti radikali, ali pravilneje radikali, so atomi, molekule ali ioni z vsaj enim elektronom brez para. So zelo reaktivni in težijo k doseganju stabilnega stanja. Zato zelo hitro reagirajo z naslednjo molekulo, v katero so se zaleteli. Prosti radikali poškodujejo celične strukture,

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 6 vključno z nukleinskimi kislinami in geni. So rezultat normalne celične presnove (dihanja) in posledica dejavnikov okolja: UV in gama žarkov, toplote, kajenja, onesnaženega okolja... Tudi nekatere snovi in zdravila (npr. alkohol, analgetiki, anestetiki) povzročajo nastanek prostih radikalov. Porušeno ravnotežje med prostimi radikali in antioksidanti imenujemo oksidativni stres (Korošec, 2). Nastajajo pri homolitski cepitvi kovalentne enojne vezi: -B + B... () Reakcija med radikalom in stabilno spojino B, privede do nastanka novega radikala B, prvotni radikal pa preide v neradikalsko obliko: + B + B... (2) Tako tvorba enega radikala vodi k nastanku naslednjega, zato te ponavljajoče dogodke imenujemo radikalska verižna reakcija. Najpomembnejši kisikovi prosti radikali so superoksidni anion ( O 2 - ), tripletni kisik ( 3 O 2 ), singletni kisik ( O 2 ), hidroksilni radikal ( OH), vodikov peroksid (H 2 O 2 ), radikal dušikovega oksida (NO ) in peroksilni radikal (ROO ) (bramovič, 2; Korošec, 2). DPPH oz. molekula,-difenil-2-pikrilhidrazil je stabilen radikal, ki nastane zaradi premestitve prostega elektrona po molekuli kot celoti, zato molekule ne dimerizirajo, kot pri večini drugih prostih radikalih. Delokaliziran prosti radikal je tudi vzrok za temno vijolično barvo, značilno za absorpcijsko območje v etanolni raztopini pri okoli 52 nm (Molyneux, 23). 2.2.2 Oksidacija in avtooksidacija Oksidacija lipidov v živilih povzroča priokuse in tvorbo neželjenih kemijskih spojin, ki lahko škodujejo zdravju. vtooksidacija je počasen a temeljit proces, sestavljen iz treh faz, imenovanih iniciacija ali začetek, propagacija ali nadaljevanje in terminacija ali zaključek. Med iniciacijsko fazo se tvorijo alkilni radikali, ki kasneje reagirajo s kisikovimi molekulami med fazo propagacije in tvorijo hidroksilne in peroksilne radikale. V terminacijski fazi dva radikala tvorita stabilen produkt (Brand-Williams in sod., 995). 2.2.3 ntioksidanti ntioksidanti so po definiciji živilske stroke tiste sestavine ali dodatki živilom, ki so bodisi lovilci prostih radikalov, tvorijo kelate s kovinskimi ioni ali pa kot reducenti kako drugače preprečujejo ali zmanjšujejo pojav žarkosti živil in druge oksidativne spremembe senzoričnih ali prehranskih lastnosti živil. Po definiciji dietetikov in nutricionistov pa so to še endogene in eksogene snovi, ki ščitijo telo pred kvarnim vplivom prostih radikalov, kovinskih ionov in raznih drugih oksidantov (Vidrih in Kač, 2).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 7 ntioksidanti rastlinskega porekla so pomembna sestavina živil s pozitivnim učinkom na zdravje, saj so sposobni odstranjevanja reaktivnih kisikovih in dušikovih radikalov. Oksidativni stres povzroča prehitro staranje organizma in degenerativne bolezni, kot so kardiovaskularna bolezen in rak. Hmelj sicer ni hrana, so pa v njem prisotni antioksidanti pomembni za pivovarsko industrijo. V okviru proizvodnje in skladiščenja piva delujejo kot zaščita proti nezaželenim senzoričnim spremembam, ki povzročajo postan okus izdelka in imajo pozitiven učinek na zdravje uživalcev piva (Krofta in sod., 28). ntioksidanti so strukturno zelo raznolike spojine; lahko so: hidrofilni in lipofilni, polarni ali nepolarni, encimski ali neencimski. Po izvoru so lahko naravni ali sintetični. Strukturno različni antioksidanti imajo včasih enak mehanizem delovanja, nekateri učinkujejo celo preko več možnih mehanizmov. Delujejo z neposrednim reagiranjem z reaktivnimi radikalskimi zvrstmi ali pa preprečijo oz. upočasnijo njihov nastanek. Pri tem se molekule antioksidantov pretvarjajo v oblike, ki imajo še vedno antioksidativen učinek ali pa ne. Glede na način učinkovanja jih opredelimo na primarne in sekundarne antioksidante (bramovič, 2). Primarni antioksidanti so spojine, ki se uspešno vključujejo v reakcije lovljenja radikalov, vsebujejo hidroksilno skupino (fenolne spojine), sulfhidrilno skupino (cistein, glutation) ali aminsko skupino (sečna kislina, spermin, proteini). Sem uvrščamo tudi askorbinsko kislino in β-karoten. Sekundarni antioksidanti sami ne pretvarjajo radikalov v stabilnejše zvrsti, ampak delujejo tako, da zmanjšajo učinek prooksidantov in povečajo učinkovitost primarnih antioksidantov, zato jih imenujemo sinergisti. V skupino spojin, ki so sposobne vezave kovinskih ionov v komplekse, uvrščamo EDT, citronsko, vinsko, fosforjevo(v) in fitinsko kislino, polifosfate, fosfolipide, aminokisline, peptide, proteine in flavonoide. Lovilci prostega kisika pa so askorbinska kislina, askorbil palmitat, β-karoten in sulfiti (bramovič, 2). Spojine, ki se v živilski industriji uporabljajo kot antioksidanti in se pridobivajo zgolj s kemijsko sintezo so sintetični antioksidanti. Sem sodijo butiliran hidroksitoluen (BHT), butiliran hidroksianizol (BH), terciarni butiliran hidroksikinon (TBHQ) in eritorbinska kislina. Propil galat, oktil galat in dodecil galat pa so estri galne kisline (bramovič, 2). Vloge antioksidantov in sekundarnih metabolitov v rastlinah so različne; rastline ščitijo pred škodljivimi vplivi sončnih žarkov, varujejo jih pred napadi virusov, bakterij, gliv in s trpkim in grenkim okusom pred rastlinojedimi živali. Ob okužbi rastline ali napadu škodljivcev se z geni določena izgradnja sekundarnih metabolitov pospeši, kar lahko škoduje rastlini in ravno zaradi tega se ne kopičijo v živi citoplazmi celic, ampak v ločenih predelkih, včasih ločeno v vakuolah ali pa celo tkivih, v katerih ni več živih celic (Kreft in sod., 2).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 8 3 MTERILI IN METODE DEL 3. MTERILI 3.. Vzorci hmelja Magnum (poreklo Slovenija, vstrija, Nemčija, Češka leto 28 in 2 listi in storžki) urora (poreklo Slovenija, vstrija, Češka leto 28 in 2 listi in storžki). Za uroro iz Nemčije smo imeli za analizo samo storžke iz leta 28, oboje pa za leto 2. 3..2 Reagenti Etanol (96 %, Merck, Nemčija) DPPH reagent (Sigma, Nemčija) Folin-Ciocalteu reagent (Fluka, Švica) Triklorocetna kislina (Merck, Nemčija) Kalijev ferocianid (Kemika, Zagreb) Železov triklorid (Carlo Erba Reagenti, Italija) Kalijev hidrogenfosfat (Merck, Nemčija) Natrijev hidrogenfosfat (Merck, Nemčija) Natrijev karbonat (lkaloid, Hrvaška) 3..3 parature Tehtnica PB32-S (Mettler Toledo, Švica) Tehtnica T2 (Mettler Toledo, Švica) Tehtnica Exacta 22 EB (Tehtnica, Železniki) Vodna kopel (Kambič, Slovenija) Mini centrifuga 545C (Eppendorf, Nemčija) Centrifuga Centric 322B (Tehtnica, Železniki) Spektrofotometer HP 8453 (Hewlett-Packard, ZD) Vrtinčnik MS3 Basic (IK, Nemčija) 3..4 Pribor Stekleni inventar: epruvete, čaše, bučke, merilne bučke, pipete, merilne pipete, liji, merilni valji, steklene palčke, erlenmajerice. Ostalo: štoparica, kapalke, tehtalne ladjice, kivete (Brand), pipete (Eppendorf), mikrocentrifugirke, plastične epruvete, parafilm, aluminijasta folija, spatule, rokavice (Purple Nitrile Exam Gloves, Kimberly - Clark).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 9 3..5 Priprava raztopin 2 % CCl 3 COOH: v čašo smo zatehtali 4 g CCl 3 COOH in dopolnili z destilirano vodo do 2 g ter raztopino mešali na magnetnem mešalu pol ure. % K 4 [Fe(CN) 6 ]: v čašo smo zatehtali g K 4 [Fe(CN) 6 ] in dopolnili z destilirano vodo do g ter postavili na magnetno mešalo za pol ure. % FeCl 3 : v čašo smo zatehtali g FeCl 3 in dopolnili z destilirano vodo do g ter raztopino mešali na magnetnem mešalu pol ure., M raztopina DPPH : na tehtalno ladjico smo natehtali 4 mg na sobno temperaturo temperiranega reagenta DPPH, ga kvantitativno prenesli v čašo in prilili 2 ml 96 % etanola. Čašo z raztopino smo zavili v aluminijasto folijo in raztopino 5 minut mešali na magnetnem mešalu. Fosfatni pufer, 5 mm, ph 6,8: zatehtali smo 3,38 g KH 2 PO 4 in 3,53 g Na 2 HPO 4 in ju kvantitativno prenesli v čašo. Zatem smo raztopino 5 minut mešali na magnetnem mešalu, prenesli v bučko in dopolnili z destilirano vodo do oznake ml. Priprava pufra je prirejena točno za ph 6,8. 3.2 METODE 3.2. Priprava vzorca Iz posušenih vzorcev hmeljevih listov in storžkov dveh sort hmelja (urora in Magnum) iz štirih držav (vstrija, Nemčija, Češka in Slovenija) iz let 28 in 2, je Neda Lazić pripravila ekstrakte, ki so bili do analize antioksidativne učinkovitosti shranjeni v zmrzovalniku pri temperaturi -2 C. 3.2.2 ntioksidativna učinkovitost vzorcev ntioksidativno učinkovitost vzorcev smo določali s primerjalnim fotometričnim sledenjem izginjanja barve stabilnega prostega radikala DPPH. Princip metode temelji na redukciji radikala DPPH z antioksidantom ter posledičnim zmanjšanjem absorbance (Brand-Williams in sod., 995). Za analizo smo pripravili slepi vzorec, modelno raztopino DPPH radikala in vzorce ekstraktov različnih razredčitev. Slepi vzorec je bila destilirana voda, modelna raztopina je vsebovala ml 96 % etanola. Ekstrakte smo predhodno redčili s 96 % etanolom. Meritve smo izvedli za vsak ekstrakt v štirih razredčitvah in vsako razredčitev v treh paralelkah, zato smo pripravili po tri mikrocentrifugirke za posamezno razredčitev. V posamezne mikrocentrifugirke smo pipetirali po,75 ml 96 % etanola in 5 ml primerno razredčenega ekstrakta in dobro premešali na vrtinčniku. V modelno raztopino smo pipetirali 5 ml raztopine DPPH radikala, istočasno vklopili merilec časa in v presledkih 5 sekund pipetirali po 5 ml DPPH radikala v naslednje mikrocentrifugirke z vzorci.

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 2 Po 5 minutah smo merili absorbanco pri 57 nm, potem ko smo sprektrofotometer umerili na slepi vzorec. Rezultate smo predstavili grafično; izračunali smo delež inhibicije, narisali graf in določili inhibitorno masno koncentracijo (IC 5 ) fenolnih spojin; masno koncentracijo FS, potrebnih za 5 % inhibicijo prostega radikala. 3.2.3 naliza sposobnosti redukcije Sposobnost redukcije smo določali v skladu s postopkom, ki so ga opisali Juntachote in sodelavci (26). Princip metode temelji na sposobnosti fenolnih spojin da reducirajo Fe 3+ v Fe 2+, le-ti tvorijo obarvan kompleks z reagentom kalijevim heksacianoferatom (II), ki ga zasledujemo z merjenjem absorbance pri valovni dolžini 74 nm (Roginsky in Lissi, 25). Pripravili smo 6 epruvet in v vsako pipetirali po 2,5 ml 5 mm fosfatnega pufra s ph 6,8. Zatem smo v epruveto, namenjeno slepemu vzorcu pipetirali,5 ml 96 % etanola, v ostale pa,4,,3,,, ml 96 % etanola, zadnja epruveta je vsebovala nerazredčen ekstrakt. Vse epruvete smo premešali na vrtinčniku MS3 Basic (IK, Nemčija). Nakar smo dodali točno toliko ekstrakta v vsako epruveto (razen slepega vzorca), da je bil volumen ekstrakta in 96 % etanola v posamezni epruveti,5 ml ter s tem pridobili vzorce različnih koncentracij. Zopet smo vse premešali na vrtinčniku. Potem smo v vsako epruveto dodali po 2,5 ml raztopine % kalijevega heksacianoferata(ii), premešali in dodali po 2,5 ml raztopine 2 % triklorocetne kisline ter spet dobro premešali. Iz vsake epruvete smo pipetirali dvakrat po,8 ml raztopine v mikrocentrifugirke in centrifugirali v Eppendorfovi mini centrifugi 545C 5 min pri 3 obratih/min. Po centrifugiranju smo v posamezno epruveto zbrali iz dveh mikrocentrifugirk 2,5 ml ustreznega supernatanta. Supernatant smo razredčili z 2,5 ml destilirane vode, premešali, dodali ml % raztopine železovega triklorida, premešali in ovili z aluminijasto folijo. Ob dodatku železovega triklorida smo vklopili uro in po 25 minutah izmerili absorbanco na spektrofotometru HP 8453 pri 74 nm proti slepemu vzorcu. Postopek smo ponovili dvakrat ali trikrat za posamezni ekstrakt. Višja absorbanca reakcijske mešanice kaže na večjo sposobnost redukcije (Juntachote in sod., 26).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 2 4 REZULTTI Z RZPRVO V poskus smo vključili 32 vzorcev. V preglednici 4 je prikazano oštevilčenje etanolnih ekstraktov fenolnih spojin iz listov in storžkov dveh sort hmelja različnega geografskega porekla nabranih v letih 28 in 2. Preglednica 4: Oštevilčenje ekstraktov fenolnih spojin iz listov in storžkov dveh kultivarjev hmelja iz štirih držav. Država Leto Sorta Listi Storžki 28 Slovenija 2 28 vstrija 2 28 Nemčija 2 28 Češka 2 *na - vzorec ni bil analiziran urora L S Magnum L2 S2 urora L3 S3 Magnum L4 S4 urora L5 S5 Magnum L6 S6 urora L7 S7 Magnum L8 S8 urora L9-*na S9 Magnum L S urora L S Magnum L2 S2 urora L3 S3 Magnum L4 S4 urora L5 S5 Magnum L6 S6 Pridobljene etanolne ekstrakte smo uporabili za določanje skupnih fenolnih spojin in antioksidativne aktivnosti. V preglednici 5 so zbrane vrednosti povprečne masne koncentracije skupnih fenolnih spojin v ekstraktih listov in storžkov dveh kultivarjev hmelja različnega geografskega porekla iz let 28 in 2, ki so rezultat dela N. Lazić in so še neobjavljeni. Masna koncentracija fenolnih spojin je večja v storžkih in se giblje med približno,7 in,7 mg/ml. V listih je masna koncentracija fenolnih spojin občutno manjša, od okoli do,4 mg/ml, torej je v storžkih vsaj 2,5-krat večja količina fenolnih spojin kot v listih. Krofta in sod. (28) so v ekstraktih suhih storžkov češkega porekla različnih sort iz let 25 in 26 določali FS. Njihove vrednosti se gibljejo med, in mg/ml. Ugotovili so, da se nekoliko fenolnih spojin izgubi med sušenjem, saj so v ekstraktih svežih storžkov določili rahlo višjo vrednost (Krofta in sod., 28).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 22 Preglednica 5: Povprečna masna koncentracija skupnih fenolnih spojin v ekstraktih listov in storžkov dveh kultivarjev hmelja. Listi Storžki Povprečna masna koncentracija fenolnih spojin (mg/ml) L S L S 5 ±,,959 ±,25 L2 S2 37 ±,27,54 ±,6 L3 S3,43 ±,,35 ±, L4 S4 57 ±,3,322 ±,58 L5 S5 6 ±,3,798 ±,27 L6 S6,328 ±,,738 ±,5 L7 S7,379 ±,,734 ±,27 L8 S8,43 ±,,449 ±,26 L9 S9 *na,7 ±,49 L S 6 ±,8,878 ±,66 L S 65 ±,8,482 ±,37 L2 S2,3 ±,3,558 ±,6 L3 S3 2 ±,4,89 ±,8 L4 S4 23 ±,3,857 ±,7 L5 S5,99 ±,,26 ±,8 L6 S6,353 ±,,464 ±,25 *na - vzorec ni bil analiziran 4. NTIOKSIDTIVN UČINKOVITOST Z DPPH TESTOM ntioksidanti, kot so fenolne spojine, lahko delujejo na več načinov in sicer s prostimi radikali tvorijo stabilne komplekse, s kovinskimi ioni pa kelate ter kot reducenti preprečujejo ali zmanjšujejo pojav žarkosti živil in druge oksidativne spremembe lastnosti živil (Vidrih in Kač, 2). Z DPPH testom smo ugotavljali koliko fenolnih spojin povzroči 5 % inhibicijo radikalov DPPH. V preglednicah od 6 do 3 so zbrani podatki in rezultati analize antioksidativne učinkovitosti z DPPH testom. Pri DPPH testu smo zasledovali zmanjševanje absorbance raztopine zaradi prisotnosti antioksidantov in s tem manjše koncentracije radikalov DPPH. Pripravili smo kontrolni vzorec, štiri razredčitve etanolnega ekstrakta hmelja in za vsako razredčitev po tri paralelke. Za vsako posamezno paralelko smo izmerili absorbanco in nato izračunali povprečje absorbanc treh paralelk. Sposobnost lovljenja prostih radikalov smo izrazili kot delež inhibicije prostega DPPH radikala (%):

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 23 pri čemer je k57 absorbanca kontrolne raztopine pri 57 nm in v57 absorbanca vzorca pri 57 nm. Iz dobljenih rezultatov smo narisali graf Δ 57 / k57 v odvisnosti od razredčitve vzorca. S pomočjo linearne regresije smo iz enačbe premice izračunali razredčitev ekstrakta (R), ki je potrebna za 5 % inhibicijo radikalov DPPH po formuli:

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 24 Preglednica 6: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L, S in L3, S3) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k5 7 (%) IC 5 (mg/ml) L S L 3 S3 L/ L/2 S/ S/2 L3/ L3/2 S3/ S3/2,3534,23 7,5,4759,23 53,5 2,6338,23 4, 3,75987,23 25,7,395,247 68,8,5,5288,247 49,9 2,63585,247 37,9 3,7743,247 24,5 689,57 75,9 2,4957,57 55,6 3,67495,57 39,5 4,7669,57 3,3,3643,43 7,6 2,57684,43 44,6 3,68568,43 34,2 4,78674,43 24,4 5 5832,99467 74, 8,5469,99467 45,5,62575,99467 37, 2,742,99467 29,2 5 92,98574 7,4 8,5999,98574 48,3,65329,98574 33,7 2,7729,98574 28,2 666,99467 73,8 3,3765,99467 62,7 5,57879,99467 4,8 7,6859,99467 3, 364,653 77,8 3,466,653 6,9 5,62686,653 4,2 7,74547,653 3,,9 7,37,47,53,53,3,32 3 ±,5,42 ±,7,53 ±,,3 ±,

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 25 Preglednica 7: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L2, S2 in L4, S4) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k57 (%) IC 5 (mg/ml) L2 S2 L4 S4 L2/ L2/2 S2/ S2/2 L4/ L4/2 S4/ S4/2 234,5 8,6 2,4562,5 6,4 3,62386,5 45,8 4,787,5 32,,345,485 67,6 2,6382,485 39, 3,77625,485 26, 4,8449,485 9,4,34347,537 67,4 2,62,537 43, 3,73835,537 29,9 4,87,537 23,,33365,25 67,3 2,59994,25 4,2 3,7329,25 28,2 4,78663,25 22,9 3,4396,386 6, 5,663,386 36,4 8,84284,386 8,8,98,386 2,3 3,4298,576 64,3 5,6357,576 45, 8,84757,576 26,8,928,576 9,8 25 79,674 73,9 3,37643,674 64,7 4,44278,674 58,5 45,6797,674 43, 25 48,77 77,5 3,33768,77 68,6 4,45663,77 57,6 45,5958,77 44,7,92 8,57,58,68,54,25,3, ±,26,57 ±,,6 ±,,27 ±,4

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 26 Preglednica 8: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L5, S5 in L7, S7) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k57 (%) IC 5 (mg/ml) L5 S5 L7 S7 L5/ L5/2 S5/ S5/2 L7/ L7/2 S7/ S7/2,8833,33 8,8 3,5248,33 49,3 5,75,33 27,4 8,8824,33 4,6,97,688 82, 3,5775,688 5,6 5,74353,688 3,4 8,86694,688 8,9 5 9336,95 73,,5739,95 52,6 2,7375,95 33, 3,8567,95 22, 5 888,447 72,4,52658,447 49,6 2,73949,447 29,2 3,8446,447 9,6 3,9875,366 8,8 5,4943,366 52,3 8,65456,366 36,9,7458,366 28,6 3 39,38 79,4 5,47745,38 54, 8,69399,38 33,,893,38 22, 25 442,3366 79,3 4,35465,3366 65,7 55,45397,3366 56, 7,533,3366 48,4 25 253,7 79,8 4,36975,7 63, 55,564,7 44, 7,5777,7 42,3,74,69,59,62,59,62,27,3,7 ±,4,6 ±,2,6 ±,2,29 ±,3

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 27 Preglednica 9: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L6, S6 in L8, S8) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k57 (%) IC 5 (mg/ml) L6 S6 L8 S8 L6/ L6/2 S6/ S6/2 L8/ L8/2 S8/ S8/2 3,35536,859 67,3 5,5933,859 45,4 8,7974,859 27,2,858,859 2, 3,38684,792 64,2 5,64946,792 39,8 8,849,792 24,5,92,792 6,5 3 3672,346 79, 8,5647,346 54,5 5,7397,346 34,8 3,88886,346 2,7 3 2575,835 79,2 8,5358,835 52,6 5,6892,835 37,2 3,8369,835 22,8 3 88,74 8,3 5,4995,74 57,3 8,74449,74 36,4,8337,74 29, 3,8,3 84, 5,44426,3 6,7 8,73386,3 35,,849,3 25, 3,3666,93 7,5 4,4347,93 6,2 5,59856,93 46, 6,664,93 4,5 3,3497,85 68,7 4,522,85 54,4 5,5929,85 47, 6,6726,85 39,9,67,73,57,58,62,62,29,3,7 ±,4,57 ±,,62 ±,,3 ±,

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 28 Preglednica : Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L9, S9 in L, S) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k57 (%) IC 5 (mg/ml) L9 na* 5 724,727 74,6 S9/,378,727 65,5 2,6428,727 4, S9 3,75238,727 29,9 5 8849,24 73,8 S9/2,35637,24 67,7 2,6733,24 44,9 3,73465,24 33,4 577,973 76,6 L/ 2,4848,973 56, 3,6668,973 39,7 L 5,8377,973 23,7 5694,248 74,9 L/ 2,5486,248 49,8 2 3,688,248 33,6 5,8649,248 5,6 2 597,727 76,5 S/ 3,3555,727 66,9 4,45463,727 57,6 S 45,6434,727 42,7 2 377,248 76,9 S/ 3,3774,248 63,2 2 4,4564,248 55,5 45,5685,248 44,5 na*- vzorec ni bil analiziran,2,22,,3,36,35,2 ±,,7 ±,9,35 ±,

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 29 Preglednica : Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L, S in L2, S2) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k57 (%) IC 5 (mg/ml) L S L2 S2 L/ L/2 S/ S/2 L2/ L2/2 S2/ S2/2,49233,937 55, 2,776,937 29, 3,84583,937 22,7 4,93288,937 4,7,478,592 55,5 2,7837,592 26, 3,968,592 5, 4,9765,592 8,3 5 9365,363 7,7,545,363 5,4 2,7398,363 28,7 3,82936,363 2, 5,3535,74 64,9,5875,74 4,7 2,78324,74 22,3 3,862,74 4,4 3,3445,267 66,5 4,56386,267 45, 5,64393,267 37,3 8,82448,267 9,7 3,42839,662 59,8 4,5838,662 45,6 5,7756,662 33,6 8,8346,662 2,7 25 7992,98 74,3 4,42499,98 6, 55,6947,98 43,2 7,6324,98 42, 25 6727,42 74,3 4,3992,42 6,7 55,6234,42 4,2 7,62845,42 39,6 22 3,73,94,76,8,29,29 7 ±,6,83 ±,4,78 ±,3,29 ±,

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 3 Preglednica 2: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L3, S3 in L5, S5) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k57 (%) IC 5 (mg/ml) L3 S3 L3/ L3/2 S3/ S3/2 5434,452 75,7,5,4277,452 59,7 2,66347,452 36,5 5,86353,452 7,4 5863,347 75,,5,4497,347 57,4 2,56628,347 45,3 5,8362,347 9,6 5 93,629 8,4847,629 6,6 2,65974,629 37,9 3,78449,629 26,2 5 3879,69 77,7,45263,69 57,7 2,674,69 37,2 3,76966,69 28,,99,9,48,5,95 ±,6,49 ±,2 L/ L5 na* L/2 S5 S5/ S5/2 na*- vzorec ni bil analiziran 2,3528,97 72, 3,47554,97 56,4 4,5843,97 46,7 5,6846,97 37,6 2,3254,48 7,8 3,4886,48 56,2 4,58479,48 47,5 5,6749,48 39,8,34,32,33 ±,

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 3 Preglednica 3: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L4, S4 in L6, S6) Vzorec Redčitev k57 Δ 57 / k57 (%) IC 5 (mg/ml) L4 S4 L6 S6 L4/ L4/2 S4/ S4/2 L6/ L6/2 S6/ S6/2 336,69 76,8 2,52675,69 47,7 3,743,69 3,4 5,8856,69 2,5 48,227 76,5 2,5563,227 45,6 3,7569,227 3, 5,84737,227 7, 5 854,69 7,7,42227,69 58, 2,66422,69 34, 3,7975,69 2,4 5 8335,94 72,2,433,94 6,4 2,6447,94 36,8 3,7492,94 26,5,65,295 84,4 3 3455,295 77,2 5,578,295 5,7 8,7264,295 3,7,787,67 83,2 3 4553,67 75,9 5,49885,67 5,9 8,6943,67 3,7 3 727,295 73,7 45,462,295 55,2 6,58392,295 43,3 7,6466,295 37,2 3 9252,67 7,2 45,4795,67 52,8 6,53539,67 47,3 7,642,67 36,8,,,6,54 57 65,27,28, ±,,57 ±,4 6 ±,6,27 ±,

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 32 V preglednici 4 so zbrani rezultati DPPH testa urejeni po velikosti od najbolj do najmanj učinkovitega antioksidanta. Preglednica 4: Rezultati DPPH testa listov (L) in storžkov (S) hmelja urejeni po antioksidativni učinkovitosti od najbolj do najmanj učinkovitega antioksidanta Vzorec S9,2 ±, S4,27 ±,4 S6,27 ±, S7,29 ±,3 S2,29 ±, S8,3 ±, S3,3 ±, S5,33 ±, S,35 ±, S,42 ±,7 S3,49 ±,2 L3,53 ±, S2,57 ±, S6,57 ±, S4,57 ±,4 S5,6 ±,2 L7,6 ±,2 L4,6 ±, L8,62 ±, L6,7 ±,4 L5,7 ±,4 L2,78 ±,3 S,83 ±,4 L3,95 ±,6 L4, ±, L,7 ±,9 L2, ±,26 L 3 ±,5 L 7 ±,6 L6 6 ±,6 L5 na* L9 na* na*- vzorec ni bil analiziran

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 33 LISTI 28 5,5 IC 5 (mg/ml), urora Magnum,5 SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK Slika : Vrednost IC 5 za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28 STORŽKI 28 IC 5 (mg/ml),9,8,7,6,5,4,3,2, SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK urora Magnum Slika : Vrednost IC 5 za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28 Kot najboljši antioksidanti iz leta 28 (slika ) in izmed vseh analiziranih ekstraktov so se izkazali storžki sorte urora nemškega porekla (S9), saj so porabili najmanj FS za dosego enakega rezultata kot ostali ekstrakti; t.j. 5 % inhibicijo DPPH radikala, in sicer,2 mg/ml. Največjo koncentracijo FS, potrebnih za 5 % inhibicijo DPPH radikala pa so potrebovali listi nemškega porekla, sorte Magnum (L) in to kar 7 mg/ml (slika ).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 34 LISTI 2,3 5 IC 5 (mg/ml),5, urora Magnum,5 SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK Slika 2: Vrednost IC 5 za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2 STORŽKI 2,35,3,25 IC 5 (mg/ml),2,5,,5 urora Magnum SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK Slika 3: Vrednost IC 5 za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2 Najboljša ekstrakta iz leta 2 in s tem tudi antioksidativno najbolj učinkovita sta bila ekstrakta storžkov iz Češke (S6) in Slovenije (S4) sorte Magnum (slika 3). Pri obema je inhibitorna koncentracija (IC 5 ) znašala,27 mg/ml. Ekstrakt listov češkega porekla sorte Magnum je za 5 % inhibicijo DPPH radikala porabil 6 mg/ml fenolnih spojin in se izkazal za antioksidativno najmanj učinkovitega (slika 2). V literaturi lahko najdemo znanstvene objave na temo antioksidativne učinkovitosti hmelja in hmeljnih proizvodov, pomembnih predvsem za pivovarstvo. vtorji večinoma navajajo rezultate na podlagi raziskav hmelja na različnih stopnjah hmeljenja pri procesu proizvodnje piva ali pa primerjajo vsebnost fenolnih spojin v ekstraktih svežega in posušenega hmelja, izgubo fenolnih spojin med shranjevanjem, skladiščenjem, briketiranjem... Raziskave, kjer bi pridobili ekstrakte in jih tudi analizirali na enak način

narisali graf voljo za analizo) in iz povprečnih absorbanc za posamezen vzorec supernatanta ekstrakta Pripravili smo 3 vzorcev (listov urora nemškega porekla iz leta 28 nismo imeli na mešanici (μg). reakcijski v spojin fenolnih koncentracija masna začetna pa γfsz (μg/ml), mešanici reakcijski v spojin fenolnih koncentracija masna končna γfsk je čemer pri...(8) ml ml/48 *2,5 Vsup * γfsz Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 35 kot mi, ter objava rezultatov kot vrednost IC 5 v literaturnih podatkih ni na voljo. Pa vendarle so antioksidativno učinkovitost z radikalom BTS določali Kowalczyk in sod. (23). Primerjali so antioksidativno učinkovitost ekstraktov storžkov in peletov hmelja sorte Magnum in Marynka poljskega porekla v različnih ekstrakcijskih topilih: etanolu, metanolu in vodi. Ugotovili so, da je najboljše topilo etanol, saj so v etanolnih ekstraktih določili največ ekstrahiranih FS ter najmanjšo vrednost IC 5 v preiskovanih vzorcih, in sicer med,58 in 2,7 mg/ml, kar je veliko več v primerjavi z našimi rezultati. Kot boljši lovilec prostih radikalov se je izkazal kultivar Marynka, kar pojasnjujejo z dejstvom, da ima večjo vsebnost fenolnih spojin (Kowalczyk in sod., 23). vtorji objavljajo rezultate DPPH testa, vendar je težava, ker ni poenotenega dogovora o izražanju rezultatov, zato prihaja do neprimerljivih rezultatov med raziskavami. Temu bi se lahko izognili, če bi obstajal dogovor o enotnem izražanju rezultatov. Našemu eksperimentu podobno raziskavo so izvedli Krofta in sod. (28). Raziskovali so antioksidativno učinkovitost hmelja in hmeljnih proizvodov z DPPH testom. Med preiskovanimi vzorci sta bili tudi sorti hmelja Magnum iz Nemčije in urora iz Slovenije. ntioksidativno učinkovitost so izrazili v procentih kot relativni padec koncentracije DPPH. Vrednosti so variirale med 4 in 6 %. Ugotovili se tudi, da je antioksidativna učinkovitost hmelja iz različnih let približno enaka. Med sortami je najvišjo antioksidativno učinkovitost izkazala sorta nemškega porekla Spalter Select (Krofta in sod., 28). 4.2 NLIZ SPOSOBNOSTI REDUKCIJE S t. i. FRP testom (Ferric Reducing ntioxidant Power) smo hoteli ugotoviti kako dobri reducenti so preiskovani ekstrakti. Podatki in rezultati meritev so zbrani v preglednicah od 5 do 2. Po analizi vseh ekstraktov smo izmerjene absorbance vnesli v program Microsoft Office Excel in najprej izračunali maso fenolnih spojin v začetni reakcijski mešanici. Za analizo smo odvzeli samo 2,5 ml supernatanta po centrifugiranju in zato izračunali končno masno koncentracijo FS v reakcijski mešanici (γfsk) na naslednji način: γfs k

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 36 Kot najboljši reducenti so se izkazali listi sorte urora češkega porekla iz leta 2 (L5) z vrednostjo naklona premice 6 ml/μg. Fenolne spojine iz tega ekstrakta imajo sposobnost reducirati 6 ml/μg železovih ionov v 25 minutah. Najslabšo sposobnost redukcije med listi imajo listi slovenskega porekla iz leta 28 sorte Magnum (L2), ki so v 25 minutah reducirali,87 ml/μg železovih ionov. V splošnem so se kot boljši reducenti izkazali listi iz leta 2, prednjači sorta urora, po geografskem poreklu pa Češka, sledi ji vstrija. Najboljši reducenti med storžki so storžki iz leta 2 sorte urora češkega porekla (S5). Ekstrakt le-teh je v 25 minutah izkazal sposobnost redukcije ml/μg železovih ionov. Ekstrakt storžkov sorte Magnum nemškega porekla (S) iz leta 28 je v 25 minutah reduciral le,69 ml/μg železovih ionov in se s tem izkazal kot najslabši reducent med vsemi vzorci.

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 37 Preglednica 5: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L, S in L3, S3) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L S L3 S3 L/ L/2 S/ S/2 L3/ L3/2 S3/ S3/2,3245 2,3938,426 3584 2 42,7876 2,22852,33396 3 64,84 3,34278,4388 4 85,5752 4,4574,539 5 6,969 5,573,458 2,5239,24 4494 2 43,478 2,2427,34346 3 64,577 3,363,44455 4 86,956 4,4845,599 5 7,695 5,658,5234 3 28,2878,46973 844 6 56,43756 2,93946,3963 9 84,65634 4,498,5376 2 2,875 5,8789,575 5 4,939 7,34864,4767 3 29,29449,52575 793 6 58,58898 3,55,398 9 87,88347 4,57726,4857 2 7,78 6,32,5983 5 46,4725 7,62877,5 43,736 2,27675 8824 2 87,4272 4,5535,5595 3 3,48 6,8325,7372 4 74,8544 9,7,954 5 28,568,38375,5473 42,2934 2,2278 8774 2 84,5868 4,4556,54324 3 26,882 6,6834,82995 4 69,736 8,83,733 5 2,467,39 5623 3 47329 2,9757,4755 6 8,54658 4,953,6698 9 2,899 6,2927,79972 2 6,932 8,3927,9994 5 2,3665,48784 365 3 4,7325 2,246,4982 6 8,464 4,24292,57889 9 22,962 6,36438,7253 2 62,9282 8,48584,88 5 23,663,673,98 ±,4,82 ±,22,883 ±,26,893 ±,69

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 38 Preglednica 6: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Slovenija iz let 28 in 2 (L2, S2 in L4, S4) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L2 S2 L4 S4 L2/ L2/2 S2/ S2/2 L4/ L4/2 S4/ S4/2 698 25,6357,3359 3344 2 5,274 2,6739,32943 3 76,97 4,558,47228 4 2,5428 5,3477,59998 5 28,785 6,67596,492 2,7637,3353 35 2 43,5274 2,2675 8346 3 65,29 3,458,397 4 87,548 4,534,49533 5 8,885 5,66763 372 3 3,7477,65353 4256 6 63,49542 3,375,3725 9 95,2433 4,9658,47952 2 26,998 6,64,59579 5 58,7386 8,26763,33 3 3,4822,63965 4232 6 62,96244 3,27929,35532 9 94,44366 4,9894,4627 2 25,9249 6,55859,55668 5 57,46 8,9823,465 25,924,357 9257 2 5,8428 2,75,438 3 77,7642 4,522,5883 4 3,6856 5,429,7468 5 29,67 6,7536 792 25,568,3329 86 2 5,26 2,66258,3827 3 76,6824 3,99388,5525 4 2,2432 5,3257,787 5 27,84 6,65646 743 3 38,4767 2,92,3988 6 76,83534 4,84,5372 9 5,253 6,276,69932 2 53,677 8,368,842 5 92,884,46 2885 3 4,87938 2,293,3772 6 8,75876 4,25827,5977 9 22,638 6,3874,668 2 63,575 8,5654,7575 5 24,3969,64567,873 ±,9,73 ±,32,53 ±,3,85 ±,54

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 39 Preglednica 7: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L5, S5 in L7, S7) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L5 S5 L7 S7 L5/ L5/2 S5/ S5/2 L7/ L7/2 S7/ S7/2,7567 26,276,3655,33742 2 52,4352 2,73,462485 3 78,6528 4,965,63225 4 4,874 5,462,768325 5 3,88 6,8275,45855 25,8428,34598 68345 2 5,6856 2,6996,394995 3 77,5284 4,3794,536685 4 3,372 5,38392,6599 5 29,24 6,7299,665 3 24,537,2766,95785 6 49,74 2,5522 6975 9 73,5 3,8288,3528 2 98,48 5,424,4333 5 22,585 6,383,236 3 23,3676,267,9454 6 46,7252 2,4334 6725 9 7,8228 3,652,34722 2 93,4434 4,86683,4383 5 6,838 6,8353 39 38,44,97992,44856 2 76,288 3,95983,62765 3 4,432 5,93975,854595 4 52,576 7,9967,57 5 9,72 9,89958 6665 37,8634,9725,5337 2 75,7268 3,944,58945 3 3,592 5,966,9978 4 5,4536 7,8882,82 5 89,37 9,8626,35287 3 52,58268 2,73868,5693 6 5,6536 5,47736,78495 9 57,7484 8,264,949775 2 2,3372,95473,4655 5 262,934 3,6934,34295 3 5,43776 2,6795,664 6 2,87552 5,358,8875 9 54,3328 8,375,9942 2 25,754,762,75 5 257,888 3,39525,6 ±,97,7 ±,4,88 ±,29,9 ±,32

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 4 Preglednica 8: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla vstrija iz let 28 in 2 (L6, S6 in L8, S8) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L6 S6 L8 S8 L6/ L6/2 S6/ S6/2 L8/ L8/2 S8/ S8/2,7645 33,4282,745,35856 2 66,8564 3,482,5369 3 846 5,2236,72725 4 33,728 6,9642,87658 5 67,4 8,7526,849 32,67,67536,378585 2 64,334 3,3573,55745 3 96,5 5,269,74885 4 28,668 6,746,899475 5 6,835 8,37682,85555 6 43,62432 2,272 72485 9 65,43648 3,485,357365 2 87,24864 4,5442,442 5 9,68 5,6825,56774 2 45,444 7,57367 535 6 44,8868 2,33782 93645 9 67,32927 3,5673,39234 2 89,77236 4,67564,48245 5 2,2545 5,84455,6432 2 49,626 7,79274 2875 4,458 2,5655,45292 2 82,86 4,33,57927 3 24,274 6,46966,7937 35 44,923 7,54793,9955 4 65,6232 8,6262 4933 4,254 2,4865,535 2 82,582 4,2973,636445 3 23,7623 6,44595,782855 35 44,38935 7,5228,224 4 65,64 8,5946 6373 3 42,9939 2,23486,4975 6 85,8878 4,46973,69625 9 28,7287 6,7459,8729 2 7,63756 8,93946,9475 5 24,54695,7432 888 3 44,238 2,2979,4958 6 88,476 4,58358,629465 9 32,74 6,87537,822 2 76,952 9,676,94565 5 22,9,45895,45 ±,53,788 ±,29,33 ±,62,923 ±,62

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 4 Preglednica 9: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L9, S9 in L, S) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L9 na* S9 S9/ S9/2,5898 3 29,648,5896 732 6 58,3286 3,3793,38829 9 87,49224 4,55689,5435 2 6,65632 6,7585,685 5 45,824 7,5948,7945 3 3,2575,6277 54875 6 62,535 3,25539,4476 9 93,75525 4,8839,56755 2 25,7 6,578,85 ±,37,9795 27,72,4996,38335 2 54,424 2,8992 L/,592 3 8,236 4,22988,75555 4 8,2848 5,63983 L,85435 5 35,356 7,4979,86875 26,3,3548,34365 2 52,6 2,7836 L/2,48296 3 78,9 4,6255,598925 4 4,2 5,4673,729665 5 3,5 6,779,3285 3 45,25284 2,35692,5922 6 9,5568 4,7384 S/,7345 9 35,75852 7,776,92447 2 8,36 9,42768 S,7425 5 226,2642,78459 75 3 43,67865 2,27493,5925 6 87,3573 4,54986 S/2,75 9 3,3595 6,82479,8927 2 74,746 9,9972,5525 5 28,39325,37465 na*- vzorec ni bil analiziran,75 ±,7,97 ±,29

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 42 Preglednica 2: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Nemčija iz let 28 in 2 (L, S in L2, S2) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L S L2 S2 L/ L/2 S/ S/2 L2/ L2/2 S2/ S2/2 665 2,645,232 4245 2 42,329 2,2464,35685 3 63,4935 3,3695,495 4 84,658 4,4927,5325 5 5,8225 5,559,3755 2,39,4333 595 2 4,638 2,8666,3335 3 6,957 3,2998,3785 4 876 4,733,5895 5,595 5,2664,446 3 27,7256,44383 2265 6 55,4432 2,88766,336 9 83,6468 4,3349,46985 2,88624 5,77533,496365 5 38,678 7,296,729 3 24,93756,29883,8765 6 49,8752 2,59766 65345 9 74,8268 3,89649,35356 2 99,7524 5,9533,4253 5 24,6878 6,4946 43 3,998,64,369855 2 6,986 3,2282,5725 3 92,9724 4,8423,7982 4 23,9632 6,45642,894535 5 54,954 8,752,595 29,479,582,37 2 58,2958 3,3624,46582 3 87,4437 4,55436,6935 4 6,596 6,7248,73238 5 45,7395 7,596 5995 3 47,925 2,45262,4356 6 94,85 4,9523,573 9 4,2775 7,35785,68979 2 88,36 9,847,88 5 235,4525 2,2639 794 3 46,48 2,4728,484625 6 92,8236 4,83456,634885 9 39,2354 7,2584,869 2 85,6472 9,6693,99985 5 232,59 2,864,945 ±,3,685 ±,24,48 ±,67,765 ±,7

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 43 Preglednica 2: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte urora geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L3, S3 in L5, S5) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L3 S3 L5 S5 L3/ L3/2 S3/ S3/2 L5/ L5/2 S5/ S5/2,4393 2,46,77 5949 2 42,922 2,23543,3483 3 64,383 3,3534,45963 4 85,844 4,4785,55557 5 7,35 5,58857,4243 2,9622,978,375 2 4,9244 2,8356,43466 3 62,8866 3,27534,57278 4 83,8488 4,3673,765 5 4,8 5,4589,4396 3 24,3935,2738 694 6 48,7827 2,5477,37649 9 73,745 3,85,47763 2 97,5654 5,853,57265 5 2,95675 6,359 225 3 24,72855,28795 2448 6 49,457 2,57589,3635 9 74,8565 3,86384,38942 2 98,942 5,578,48268 5 23,64275 6,43973,6662 9,8435,5268 7355 2 9,687,2536,35996 3 29,535,5385,467 4 39,374 2,573,47793 5 49,275 2,5634,93 9,9552,585 668 2 9,94,37,3672 3 29,8656,5555,42454 4 39,828 2,74,4685 5 49,776 2,5925 449 3 38,897,9895,43797 6 76,3794 3,9789,639 9 4,569 5,9674,8597 2 52,7588 7,9569,93753 5 9,9485 9,94523 3973 3 37,4879,9489,494 6 74,83758 3,89779,75946 9 2,25637 5,84669,95266 2 49,6756 7,79558,77 5 87,9395 9,74448,68 ±,77,853 ±,2 55 ±,35,8 ±,3

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 44 Preglednica 22: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) sorte Magnum geografskega porekla Češka iz let 28 in 2 (L4, S4 in L6, S6) Vzorec V (ekstrakt) m FSz (μg) γfs k (μg/ml) L4 S4 L6 S6 L4/ L4/2 S4/ S4/2 L6/ L6/2 S6/ S6/2,337 22,5,788 325 2 45, 2,34375,326 3 67,5 3,5563,44236 4 9, 4,6875,546 5 2,5 5,85938 388 22,56,4847 348 2 44,2 2,29694,329 3 66,58 3,4454,43273 4 88,224 4,59388,53666 5 53 5,74234 225 3 25,8443,3459 2448 6 5,68286 2,6982,3635 9 77,52429 4,3772,38942 2 3,36572 5,38363,48268 5 29,275 6,72954 4 3 25,5539,338 28 6 5,278 2,666,3354 9 76,6547 3,9924,39568 2 2,2556 5,3232,48787 5 27,75695 6,654 6957 35,3343,8433,5298 2 7,6686 3,6866,65326 3 6,29 5,5298,82354 4 4,3372 7,363,725 5 76,675 9,264 36 35,34,8386,4998 2 7,628 3,67723,5688 3 5,942 5,5584,77379 4 4,256 7,35446,98224 5 76,57 9,937 586 3 43,39449 2,263,488 6 86,78898 4,5226,6974 9 3,8347 6,7839,86378 2 73,57796 9,452,655 5 26,97245,365 62 3 44,46483 2,3588,4662 6 88,92966 4,6375,64388 9 33,39449 6,94763,8639 2 77,85932 9,2635 5 222,3245,57938,925 ±,37,74 ±,24, ±,54,928 ±,49

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 45 V preglednici 23 so rezultati FRP testa zbrani in urejeni po velikosti od najbolj do najmanj učinkovitega reducenta. Preglednica 23: Rezultati FRP testa listov (L) in storžkov (S) hmelja urejeni po redukcijski sposobnosti od najboljšega do najslabšega reducenta. Vzorec L5 55 ±,35 L,75 ±,7 L3,68 ±,77 S5,8 ±,3 L6, ±,54 L7,88 ±,29 L5,6 ±,97 L4,53 ±,3 L2,48 ±,67 L6,45 ±,53 L8,33 ±,62 L,98 ±,4 S,97 ±,29 L,945 ±,3 S6,928 ±,49 L4,925 ±,37 S8,923 ±,62 S7,9 ±,32 S3,893 ±,69 L3,883 ±,26 L2,873 ±,9 S3,853 ±,2 S9,85 ±,37 S,82 ±,22 S4,85 ±,54 S6,788 ±,29 S2,765 ±,7 S4,74 ±,24 S2,73 ±,32 S5,7 ±,4 S,685 ±,24

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 46 LISTI 28, k (ml/μg),8,6,4 urora Magnum,2, SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK Slika 4: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28 STORŽKI 28 k (ml/μg),9,8,7,6,5,4,3,2,, SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK urora Magnum Slika 5: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 28 Najboljši reducenti med ekstrakti iz leta 28 so bili listi sorte urora češkega porekla (L3) (slika 4). V 25 minutah so reducirali,7 ml/μg železovih ionov. Kot najmanj učinkoviti reducenti so se izkazali storžki sorte Magnum iz Nemčije (S), saj so v 25 minutah reducirali le,69 ml/μg železovih ionov (slika 5). Med storžki iz leta 28 so največjo sposobnost redukcije pokazali storžki sorte urora iz Češke (S3) s sposobnostjo redukcije,85 ml/μg v 25 minutah (slika 5), kar je še vedno manj kot redukcijsko najmanj sposobni listi izmed vseh vzorcev obeh let; to so bili listi slovenskega porekla sorte Magnum (L2) z vrednostjo,87 ml/μg (slika 4).

Bucik V. ntioksidativna učinkovitost listov in storžkov hmelja. 47 LISTI 2 5 k (ml/μg),5, urora Magnum,5 SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK Slika 6: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte listov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2 STORŽKI 2,,8 k (ml/μg),6 urora Magnum,4,2 SLOVENIJ VSTRIJ NEMČIJ ČEŠK Slika 7: Rezultati redukcijskega testa za ekstrakte storžkov hmelja sort urora in Magnum iz leta 2 Najbolj redukcijsko sposoben ekstrakt iz leta 2, ki je v 25 minutah reduciral 6 ml/μg železovih ionov je bil ekstrakt listov sorte urora Češkega porekla (L5) (slika 6). Najmanj učinkovit ekstrakt med listi, je bila sorta urora slovenskega porekla (L3). Reduciral je,88 ml/μg železovih ionov v 25 minutah (slika 6). Med storžki iz leta 2 so bili najboljši reducenti storžki iz Češke sorte urora (S5). V 25 minutah so reducirali ml/μg železovih ionov in s tem obveljali za najboljše reducente med