Milena Kitić

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MILENA KITIĆ MAGISTRSKA NALOGA MAGISTRSKI ŠTUDIJ INDUSTRIJSKA FARMACIJA Ljubljana, 2018

2 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MILENA KITIĆ ANALIZA TOPIRAMATA IN NJEGOVIH PRESNOVKOV S TEKOČINSKO KROMATOGRAFIJO SKLOPLJENO Z MASNO SPEKTROMETRIJO V PLAZEMSKIH VZORCIH BOLNIKOV Z EPILEPSIJO ANALYSIS OF TOPIRAMAT AND ITS METABOLITES BY LIQUID CROMATOGRAPHY COUPELD WITH MASS SPECTROMETRY IN PLASMA SAMPLES OF PATIENTS WITH EPILEPSY INDUSTRIJSKA FARMACIJA Ljubljana, 2018

3 Magistrsko nalogo sem opravljala na Katedri za biofarmacijo in farmakokinetiko na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Roberta Roškarja, mag. farm. ZAHVALA Za ves trud, čas in za strokovno vodenje skozi proces priprave magistrske naloge se iskreno zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Robertu Roškarju. Hvala mojim staršem in sestri za vse vzpodbudne besede in dejanja, ki so me spremljale na poti do zaključka študija. Zahvalila bi se tudi asist. dr. Mitji Pišlarju za pomoč pri statističnem vrednotenju rezultatov. IZJAVA Izjavljam, da sem magistrsko nalogo opravila samostojno pod mentorstvom izr. prof. dr. Roberta Roškarja, mag. farm., Ljubljana 2018 Komisija za zagovor: Predsednik komisije: prof. dr. dr. h. c. Stanko Srčič Mentor: izr. prof. dr. Robert Roškar Član komisije: doc. dr. Matej Sova

4 Kazalo vsebine Kazalo slik... II Kazalo preglednic... II Povzetek... IV Abstract... V Seznam okrajšav... VI 1. UVOD Epilepsija Zdravljenje epilepsije Mehanizem delovanja protiepileptičnih učinkovin Predstavniki protiepileptičnih učinkovin Topiramat Zdravljenje epilepsije Farmakokinetika topiramata Interakcije z drugimi zdravili Terapevtsko spremljanje učinkovin Analitika topiramata NAMEN DELA MATERIALI IN METODE MATERIALI Biološki material Standardi Reagenti in topila Aparature in laboratorijski pripomočki Analitski sistem LC-MS/MS Priprava raztopin Priprava osnovne raztopine standarda TPM (OST) Raztopine standardov presnovkov (M1, M2, M3, M4) Osnovna raztopina internega standarda (IS) Raztopina internega standarda za redčenje (ISr) Delovna raztopina za pripravo kalibracijskih in kontrolnih vzorcev (DR I ) Delovna raztopina za pripravo kalibracijskih in kontrolnih vzorcev (DR II ) Priprava plazemskih vzorcev Analiza plazemskih vzorcev I

5 Statistična obdelava rezultatov REZULTATI IN RAZPRAVA Analizna metoda Interpretacija rezultatov analize realnih vzorcev Primerjava koncentracij topiramata in presnovkov glede na čas odmerjanja Primerjava koncentracij presnovkov in TPM glede na dnevni odmerek Primerjava koncentracij presnovkov in topiramata glede na odmerek karbamazepina SKLEP LITERATURA Kazalo slik Slika 1: Mehanizem povečane aktivnosti GABA, povzeto po (3)... 3 Slika 2: Zaviranje natrijevega kanala, povzeto po (3) Slika 3: Zmanjšanje delovanja T-Ca 2+ kanalov, povzeto po (3)... 4 Slika 4: Mehanizem delovanja antagonistov glutamata, povzeto po (3) Slika 5: Strukturna shema topiramata in njegovih glavnih presnovkov, povzeto po (16).. 11 Slika 6: Prikaz odstotka bolnikov glede na dnevni odmerek TPM Slika 7: Primerjava koncentracij TPM in njegovih presnovkov glede na dnevni odmerek zdravila v ravnotežnem stanju Kazalo preglednic Preglednica I: Pregled osnovnih karakteristik prve generacije AED (7,8,9)... 6 Preglednica II: Pregled osnovnih karakteristik druge generacije AED (7,10) Preglednica III: Pregled osnovnih karakteristik tretje generacije AED (1,7,11,12,13,14).. 8 Preglednica IV: Prikaz interakcij med različnimi AED s TPM (17, 18) Preglednica V: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR I ) brez dodanega ISr.. 21 Preglednica VI: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR I ) z dodanim ISr (c=2,5 mg/l) Preglednica VII: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR II ) brez dodanega ISr II

6 Preglednica VIII: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR II ) z dodanim ISr (c=2,5 mg/l) Preglednica IX: Preverjanje analizne metode s kalibracijskimi in kontrolnimi raztopinami DR I Preglednica X: Preverjanje analizne metode s kalibracijskimi in kontrolnimi raztopinami DR II v razširjenem koncentracijskem območju za presnovka M1 in M Preglednica XI: Pregled povprečnih vrednosti koncentracij TPM in presnovkov vseh bolnikov pred in po aplikaciji dnevnega odmerka zdravilne učinkovine Preglednica XII: Pregled povprečnih vrednosti koncentracij TPM in presnovkov bolnikov, katerih smo imeli na voljo vzorec plazme pred in po aplikaciji odmerka TPM. 31 Preglednica XIII: Statistični prikaz odvisnosti koncentracij TPM in njegovih presnovkov (absolutna in normirana vrednost na koncentracijo TPM) od časa odvzema vzorca v ravnotežnem stanju pri vseh bolnikih Preglednica XIV: Povprečne vrednosti koncentracij TPM in njegovih presnovkov glede na dnevni odmerek Preglednica XV: Povprečne koncentracije TPM in njegovih presnovkov glede na izbrani dnevni odmerek v ravnotežnem stanju Preglednica XVI: Statistični prikaz odvisnosti koncentracij TPM in njegovih presnovkov v ravnotežnem stanju od dnevnega odmerka TPM Preglednica XVII: Statistični prikaz odvisnosti normiranih vrednosti presnovkov glede na TPM v ravnotežnem stanju pri soterapiji s CBZ III

7 Povzetek Topiramat (TPM) je protiepileptična učinkovina 2. generacije, namenjena za zdravljenje epilepsije samostojno ali v kombinaciji z drugimi zdravili. Uporablja se tudi za zdravljenje migrene pri odraslih ter napadih povezanih z Lennox Gastautovim sindrom pri otrocih. Presnova TPM, kljub njegovi pogosti uporabi, še ni čisto razjasnjena. V ta namen je bila predhodno razvita zelo občutljiva (meja določitve presnovkov do 0,001 mg/l) in validirana analizna metoda na sistemu LC-MS/MS. Ta metoda nam je omogočila analizo realnih plazemskih vzorcev 66 bolnikov na rednem zdravljenju epilepsije s TPM ter ovrednotenje koncentracij TPM in njegovih petih presnovkov. Metodo smo pred izvedbo analiz preverili z ustreznimi vzorci ter jo prilagodili in nadgradili. Osrednji namen magistrske naloge je bil potrditi hipotezo smotrnosti oziroma predstaviti pomembnost terapevtskega spremljanja koncentracije zdravilne učinkovine TPM, pri čemer smo ovrednotiti vpliv časa vzorčenja, vpliv dnevnega odmerka TPM in vpliv soterapije s karbamazepinom (CBZ) na plazemske koncentracije TPM in njegovih presnovkov. Iz izmerjenih koncentracij plazemskih vzorcev v ravnotežnem stanju je razvidno, da gre za veliko variabilnost v koncentraciji TPM in njegovih presnovkov pri bolnikih, ki so prejemali dnevne odmerke TPM od 50 do 1200 mg. Čeprav je viden trend med višjimi dnevnimi odmerki TPM in višjo koncentracijo analitov, je korelacija dokaj slaba. Tudi pri primerjavi bolnikov, ki so prejemali enak dnevni odmerek, je variabilnost precejšna, saj so se izmerjene koncentracije analitov razlikovale tudi do 10-krat. Kljub temu odmerek TPM značilno vpliva na koncentracijo TPM in njegove presnovke, čas odvzema pa značilno vpliva le na plazemsko koncentracijo TPM. TPM se v največji meri presnovi v 2,3-desizopropiliden TPM (100-krat višja koncentracija kot ostali), sledijo pa 10-hidroksi TPM ter ostali trije presnovki (v istem velikostnem razredu). Pri souporabi višjih odmerkov CBZ ( mg/dan) je bilo ugotovljeno, da soterapija značilno vpliva na plazemsko koncentracijo TPM, saj se s povečevanjem odmerka CBZ koncentracija TPM znižuje. Višji odmerki CBZ tudi značilno povišajo normirano vrednost dveh presnovkov, pri čemer je vpliv izrazitejši pri presnovku 2,3-desizopropiliden TPM. Na osnovi zbranih in ovrednotenih podatkov lahko potrdimo hipotezo, da je terapevtsko spremljanje koncentracije TPM potrebno za varno in učinkovito zdravljenje epilepsije. Ključne besede: TDM, topiramat, presnovki, epilepsija, LC-MS/MS, plazma IV

8 Abstract Topiramate (TPM) is a second-generation antiepileptic drug designed to treat epilepsy that can be prescribe alone or in combination with other medications. It is also used to treat migraine in adults and seizures associated with Lennox-Gastaut syndrome in children. Despite its frequent use, the metabolism of TPM has not yet been fully elucidated. To this end, a very sensitive and validated LC-MS/MS analytical method (quantification of metabolites down to mg/l) was previously developed. This method enabled us to analyse the real plasma samples from 66 patients undergoing regular treatment for epilepsy with TPM and to evaluate the concentrations of TPM and its five metabolites. Before the analysis was carried out, the method was tested and adjusted and upgraded accordingly. The main purpose of the Master's thesis was to evaluate the importance of therapeutic monitoring of TPM. This required evaluating the effect of the sampling time, the effect of the daily dose of TPM and the effect of combined therapy with carbamazepine (CBZ) on plasma concentrations of TPM and its metabolites. The measured plasma sample concentrations in the steady state showed that there is a high variability in the concentration of TPM and its metabolites in patients receiving daily doses of TPM from 50 to 1200 mg. Although a trend can be observed between higher daily doses of TPM and a higher concentration of analytes, the correlation is rather poor. Similarly, when comparing patients who receive the same daily dose, the variability was significant, as the measured concentrations of the analytes varied up to 10-fold. Nevertheless, the dose of TPM has a significant effect on the concentration of TPM and its metabolites, while the sampling time only has a significant effect on plasma TPM concentration. TPM is mostly metabolized to 2,3-desizopropylidene TPM (ca. 100-fold higher concentration compared to other metabolites), followed by 10-hydroxy TPM and the other three metabolites (in the same size class). As for the use of TPM in conjunction with higher doses of CBZ ( mg/day), combined therapy has proven to have a significant effect on plasma TPM concentration, as the concentration of TPM decreases with the increase in the CBZ dose. Higher doses of CBZ also significantly increase the standardized value of two metabolites, with the effect being more pronounced for 2,3-desizopropylidene TPM. Based on the data collected and evaluated, we can confirm the hypothesis that therapeutic monitoring of TPM is essential for the safe and effective treatment of epilepsy. Key words: TDM, topiramate, metabolites, epilepsy, LC-MS/MS, plasma V

9 Seznam okrajšav AED protiepileptična učinkovina (ang. Antiepileptic drug) CBZ karbamazepin DR delovna raztopina DR Qc delovna raztopina kontrolnih vzorcev DR Qcl delovna raztopina kontrolnih vzorcev nizke (low) koncentracije DR Qcm delovna raztopina kontrolnih vzorcev srednje (medium) koncentracije DR Qch delovna raztopina kontrolnih vzorcev visoke (high) koncentracije GABA γ-aminobutanojska kislina HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (ang. High-Performance Liquid Chromatography) IS interni standard (topiramat d 12 ) ISr redčena raztopina internega standarda LC-MS/MS tekočinska kromatografija sklopljena s tandemsko masno spektrometrijo (ang. Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry) M1 presnovek topiramata - 2,3-desizopropiliden topiramat M2 presnovek topiramata - 4,5-desizopropiliden topiramat M3 presnovek topiramata 10-hidroksi-topiramat M4 presnovek topiramata - 9 hidroksi-topiramat RSD relativni standardni odklon (ang. Relative Standard Deviation) SD standardni odklon (ang. Standard Deviation) TDM terapevtsko spremljanje koncentracije učinkovin (ang. Therapeutic Drug Monitoring) TPM topiramat VI

10 1. UVOD 1.1 Epilepsija Epilepsija je relativno pogosta nevronska bolezen, ki se kaže kot motnja z zelo raznolikimi simptomi. Nastane zaradi pretirane vzdraženosti in sinhronizacije aktivnosti nekaterih delov možganov oziroma možganskih celic. Napadi se lahko kažejo na zelo različne načine. Povzročajo motnje v miselnih funkcijah, motnje v zavesti, gibanju in zaznavanju. Razvrstitev epilepsije je odvisna od več dejavnikov kot so vrsta napada, sprememb v elektroencefalografiji, lokacije in vzroka napada ter bolnikove starosti. Ločimo dva tipa epileptičnih napadov, katera razdelimo še na podtipe (1): 1. Generalizirani epileptični napadi (primarni napadi), kjer se nenormalno delovanje možganov začne hkrati v obeh polovicah velikih možganov; zavest je pogosto motena, a ni mogoče prepoznati nobene strukturne nepravilnosti. Med generalizirane epileptične napade uvrščamo naslednje podskupine: tonično-klonični napadi (grand mal); bolnik izgubi zavest, telo postane togo in se nato začne ritmično tresti. Ob tem lahko pride do uhajanja urina ali blata. absenca (petit mal); nenadne izgube zavesti, ki lahko trajajo do nekaj sekund, kar je težko opaziti. Pojavljajo se večinoma pri otrocih, pri katerih se zdi kot da sanjarijo. atonični napad; največkrat se pojavijo pri otrocih. Ti se nenadoma zgrudijo, ko tonus v mišicah nenadoma popusti. epileptični status (status epilepticus); napadi si sledijo hitro in potekajo brez povrnitve zavesti, kar lahko povzroči smrt. 2. Delni ali parcialni epileptični napad (sekundarna epilepsija), kjer nenormalno delovanje možganov ostane na omejenem področju možganov. Vzrok je strukturna nepravilnost in se včasih nadaljujejo v generaliziran napad. Poznamo dve vrsti parcialnih epileptičnih napadov. To sta: enostavni napadi; bolniki imajo nenavadne občutke, v nekaterih delih telesa se lahko pojavi nehotno gibanje in mravljinci, a ne izgubijo zavest. 1

11 kompleksni napadi; bolniki poleg nenavadnih občutkov izgubijo tudi zavest. Med napadom ali po njem se oseba nehoteno giblje, izvaja določene gibe, kot so na primer hoja v krogu, žvečenje in zapenjanje gumbov, katerih se kasneje ne spominja (1,2) Zdravljenje epilepsije Približno 1% svetovne populacije se sooča z epilepsijo, katero zdravimo s protiepileptičnimi učinkovinami (AED, ang. AntiEpileptic Drug). Zdravljenje se začne z nizkimi odmerki, katere povečujemo, dokler epileptični napadi niso pod nadzorom. Pri tretjini oseb z epilepsijo, ki se zdravijo na takšen način, se napadi ne pojavljajo več, pri drugi tretjini pa je napadov bistveno manj. Pri bolnikih, kjer je epilepsija popolnoma pod nadzorom, lahko sčasoma zdravljenje tudi opustimo. V tem primeru mora biti počasno in postopno ukinjanje zdravil, saj bi se drugače zaradi hitrega znižanja koncentracije zdravilne učinkovine napadi lahko ponovili. V primeru, da z zdravili ne dosežemo primernega izboljšanja in najdemo lokacije od koder izvirajo napadi, lahko uporabimo kirurško zdravljenje (1) Mehanizem delovanja protiepileptičnih učinkovin Poznamo štiri glavne mehanizme delovanja protiepileptičnih učinkovin, in sicer povečanje koncentracije ali aktivnosti γ-aminobutanojske kisline (GABA), zaviranje delovanja natrijevih in kalcijevih kanalov ter zaviranje delovanja glutamata (3). povečanje GABA aktivnosti GABA se v telesu sintetizira z dekarboksilacijo glutamata z encimom dekarboksilaze glutaminske kisline in ima dva tipa receptorjev, A in B. Nekateri AED ireverzibilno zavirajo encim GABA-transaminazo v astrocitih, ki so odgovorni za inaktivacijo GABA-e (npr. vigabatrin ) (Slika 1), medtem ko drugi delujejo tako, da zavirajo ponovni privzem GABA-e v glialnih celicah, ter tako povečajo njegovo ekstracelularno koncentracijo (npr. tiagabin). Fenobarbiturati in benzodiazepini delujejo na GABA A receptorje tako, da povečajo odpiranje kloridnih kanalov, kar povzroči povečanje depolarizacijo celice in težje doseganje aktivnega potenciala celice (3). 2

12 Slika 1: Mehanizem povečane aktivnosti GABA, povzeto po (3). zaviranje natrijevih kanalov Vsak natrijev (Na + ) kanal ima tri različna dinamična stanja: mirujoče stanje; kjer kanal dovoljuje prehod Na + ionov v celico aktivno stanje; kjer kanal dovoljuje povečan dotok Na + ionov v celico neaktivno stanje; ni prehoda Na + ionov v celico V aktivnem stanju Na + ioni prehajajo skozi kanal v celico. Ko se aktivacija oziroma stimulacija konča, določen delež natrijevih kanalov postane neaktivnih. Veliko število AED (npr. karbamazepin, fenitoin) vpliva na membransko vzbujenost natrijevih kanalčkov, kateri so pomembni pri ustvarjanju akcijskega potenciala. AED blokirajo dele, ki oddajajo pulze z večjo frekvenco, obenem se blokirajo tudi deli kanala, ki oddajajo nizke frekvence in tako zmanjšajo možnost nastajanja akcijskega potencial natrijevih kanalov (Slika 2) (3). 3

13 Slika 2: Zaviranje natrijevega kanala, povzeto po (3). zaviranje kalcijevih kanalov V človeških možganih poznamo tri vrste podenot kalcijevih (Ca 2+ ) kanalov, ki jih označujemo kot L, N in T- Ca 2+ kanali. So majhni in hitro postanejo neaktivni, delujejo kot»mirovniki«za normalno možgansko aktivnost. To se še posebej nanaša na talamus. Princip delovanja AED temelji na zaviranju delovanja T- Ca 2+ kanalov (npr. zonisamid) na živčne končiče, kar ima za posledico zmanjšanje sproščanja živčnih prenašalcev in s tem zaviranje epileptičnih krčev (Slika 3) (3). Slika 3: Zmanjšanje delovanja T-Ca 2+ kanalov, povzeto po (3). antagonisti glutamatnih receptorjev 4

14 Glutamat in sorodne ekscitatorne aminokisline aktivirajo tako ionotropne (NMDA (Nmetil-D-aspartat), AMPA (α-amino-3-hidroksi-5-metilsoksazol-4-propionska kislina) in kainatno mesto), kot metabotropne (sklopljeni G-protein v treh skupinah z osmimi podskupinami (mglu1-8)) receptorje (33). NMDA receptor je eden od najbolj okarakteriziranih. Da le ta doseže svojo uporabnost se morajo nanj poleg glutamata vezati še glicin in poliaminski modulatorji (33), kar prikazuje Slika 4. Z vezavo glutamata receptorji prepuščajo natrijeve in kalcijeve ione v celico, medtem ko kalijevi ioni celico zapuščajo, kar ima za posledico ustvarjanje dražljajev. AED, ki modificirajo te receptorje, so antagonisti glutamata. Odziv le teh se razlikuje glede na mesto vezave (3). Topiramat deluje kot antagonist na vezavnem mestu za glutamat. Slika 4: Mehanizem delovanja antagonistov glutamata, povzeto po (3) Predstavniki protiepileptičnih učinkovin Na tržišču so tri generacije zdravil, ki so namenjena zdravljenju epilepsije. Le te se med seboj razlikujejo po učinkovitosti, farmakokinetiki, neželenih učinkih, interakcijah med zdravili ter ceni. Protiepileptična zdravila 1. generacije 5

15 Glavni predstavniki prve generacije AED so fenobarbital, valprojska kislina, fenitoin in karbamazepin (CBZ). Mehanizmi delovanja na molekularnem nivoju niso popolnoma znani, saj delujejo na več tarč. Na povečanje nivoja GABA v možganih ali sinapsah delujeta valprojska kislina in fenobarbital, fenitoin delujejo kot zaviralec funkcije natrijevih kanalov, na selektivno potenciranje posredovanega odziva GABA A delujeta klonazepam in fenobarbital (Preglednica I). Slabost predstavnikov prve generacije se kaže v ozkem terapevtskem območju in v interindividualni ter intraindividualni variabilnosti. Variabilna farmakokinetika je rezultat genetskih faktorjev, starosti, fiziološkega stanja in interakcij med zdravili. Najpogostejši neželeni učinki so aplastična anemija, hepatotoksičnost, vrtoglavica, ataksija, kožni izpuščaji (5,6). Preglednica I: Pregled osnovnih karakteristik prve generacije AED (7,8,9). Protiepileptična učinkovina Tip epileptičnega napada Mehanizem delovanja Pogosti neželeni učinki KARBAMAZEPIN terapija za delne napade in primarne in sekundarne tonično-klonične zaviranje Na+ kanalov bipolarne motnje, nevralgije generalizirane napade FENOBARBITAL za vse ostale vrste epilepsije razen abscence povečanje delovanja GABA v možganih oziroma vrtoglavica, ataksija, zmedenost sinapsah FENITOIN zdravljenje kloničnih napadov ter za zdravljenje zaviranje Na + kanalov glavobol, zmedenost napadov med in po operaciji VALPROJSKA KISLINA za vse vrste epilepsije pri vseh starostih ter za zdravljenje migrene in bipolarne motnje zaviranje Ca + kanalov bipolarna motnja, migrenski glavoboli 6

16 Protiepileptična zdravila 2. generacije Razvoj 2. generacije je imel poudarek na zdravljenju epilepsije v pediatriji in spremljanju učinkovitosti in farmakoloških parametrov med njihovo uporabo. Na splošno gledano je druga generacija AED bolj ugodna glede farmakokinetike. Zdravila te generacije imajo manj neželenih učinkov, boljšo toleranco in širše terapevtsko območje kot prva generacija (5). Predstavniki»nove generacije protiepileptičnih učinkovin«so topiramat, felbamat, gabapentin, vigabatrin, tiagabin, pregabalin, levetiracetam, okskarbazepin, zonisamid in lamotrigin. Mehanizem delovanja je podoben kot pri prvi generaciji AED (Preglednica II). Preglednica II: Pregled osnovnih karakteristik druge generacije AED (7,10). Protiepileptična učinkovina Tip epileptičnega napada Mehanizem delovanja Pogosti neželeni učinki FELBAMAT delni napadi Pozitivno moduliranje GABA receptorjev in hepatotoksičnost in aplastična anemija nekopetitivni antagonist NMDA receptorjev GABAPENTIN delni napadi z/brez možnosti Pozitivno moduliranje GABA receptorjev ataksija, zaspanost in vrtoglavica prehoda v generaliziran napad VIGABATRIN delni napadi zaviralec GABA aminotransferaze poškodba vidnega polja (GABA-AT) TIAGABIN delni napadi z/brez možnosti prehoda v Zaviralec GABA prenašalca GAT1 omotičnost, utrujenost, zaspanost, čustvena labilnost generaliziran napad LEVETIRACETAM delni in generalizirani (tonično-klonični) napadi ni znan glavobol, omotica, utrujenost, oslabljen spomin 7

17 ZONISAMID delni napadi pri zaviranje Ca 2+ -T možnost nastanka bolnikih starejših kanalov ledvičnih kamnov od 16 let LAMOTRIGIN delni in zaviranje Na + kanalov ataksija in poškodba generalizirani vida (tonično-klonični) napadi TOPIRAMAT generalizirani Antagonist na motnja vida, ataksija, (klonično-tonični) glutamatnem receptorju, motnja koncentracije, napadi in delni Na + in Ca 2+ ionov, vrtoglavica, utrujenost napadi povečanje GABA aktivnosti Protiepileptična zdravila 3. generacije Prednost tretje generacije AED (Preglednica III) glede na predhodni dve generaciji so linearna farmakokinetika, hitra absorpcija in nizek do zmeren potencial za interakcije z drugimi učinkovinami. Namen spremljanja tretje generacije AED je ugotoviti njihov vpliv delovanja pri nosečnicah in bolnikih z jetrno in/ali ledvično okvaro, možne toksičnosti in neželenih učinkov. Nekateri predstavniki tretje generacije AED so lakozamid, retigabin, rufinamid ter brivaracetam (5,6). Preglednica III: Pregled osnovnih karakteristik tretje generacije AED (1,7,11,12,13,14). Protiepileptična učinkovina Tip epileptičnega napada Mehanizem delovanja Pogosti neželeni učinki LAKOZAMID dodatna terapija za delne napade z/brez možnosti prehoda v generaliziran napad za bolnike od 16. Selektivno poveča počasno inaktivacijo napetostno omotica, glavobol, dvojni vid in slabost leta starosti naprej odvisnih Na + kanalčkov RETIGABIN dodatna terapija za delne napade z/brez možnosti odpiranje K + kanalov nespečnost, omotica in 8

18 prehoda v generaliziran utrujenost napad za bolnike od 18. leta starosti naprej RUFINAMID zdravljenje napadov Selektivno poveča bruhanje, povezanih z Lennox- počasno vrtoglavica, Gastaut sindromom inaktivacijo glavobol in bolnikov od 4. leta napetostno utrujenost naprej odvisnih Na + kanalčkov BRIVARACETAM delni napadi z/brez vezava na protein omotica, možnosti prehoda v sinaptičnega depresija, generaliziran napad vezikla 2A anksioznost, (SV2A) nespečnost in utrujenost 1.3. Topiramat Topiramat (TPM, 2,3:4,5-Bis-O-(1-metiletiliden)-β-D-fruktopirano sulfamat) je monosaharid substituiran s sulfamatom in spada v drugo generacijo AED za zdravljenje epilepsije. Je v obliki belega, kristaliničnega praha, grenkega okusa. TPM je bil razvit v Janssen Pharmaceuticals Inc. ki je član Johnson & Johnson Pharmaceutical v Združenih državah Amerike, kjer je bil tudi prvič odobren s strani FDA (Food and Drug Administration) za zdravljenje epilepsije Zdravljenje epilepsije S TPM zdravimo generalizirane (klonično-tonične) napade in delne napade, ki bodisi preidejo ali pa tudi ne v generaliziran napad. Terapija poteka pri različnih dnevnih odmerkih ( mg TPM na dan), kateri so navadno prilagojeni starosti bolnika. Zdravljenje je namenjeno tako za odrasle, kot za otroke nad šestim letom starosti. TPM se je kasneje začel uporabljati še za zdravljenje migrene, za zmanjševanje telesne mase in v terapiji napadov povezanih z Lennox-Gastaut sindromom (7). Deluje po mehanizmu 9

19 zaviranja ionskih (Na + in Ca 2+) ) kanalov, kot antagonist na glutamatnih receptorjih in kot učinkovina, ki povečuje delovanje GABA (3). Topiramat se pri zdravljenju epilepsije uporablja samostojno ali v kombinaciji z drugimi AED, kot so na primer karbamazepin, valproat in fenitoin Farmakokinetika topiramata Farmakokinetični profil TPM združuje večino lastnosti, ki so želene pri protiepileptičnih učinkovinah. Absorpcija TPM je hitra in biološka uporabnost je visoka ( 80%) ter neodvisna od vnosa hrane (7). Maksimalno plazemsko koncentracijo doseže v 2-4 urah po aplikaciji (9). Volumen porazdelitve je 0,6-1,0 L/kg, vezava na serumske proteine je približno 15% (3). Kinetika odstranjevanja je linearna, prav tako je linearna povezava med vzdrževano koncentracijo učinkovine v plazmi in ravnotežnem stanjem (3). Največ TPM se izloči skozi ledvica v nespremenjeni oblik. Ledvični očistek znaša ml/min. Za TPM lahko rečemo, da ima dolg razpolovni čas (19-23h), linearno farmakokinetiko, se bistveno ne veže na serumske proteine. Glede presnove topiramata literatura navaja, da se ga pri zdravih prostovoljcih v jetrih presnovi manj kot 30% (9). Pri bolnikih, kateri so na dodatni terapiji z drugimi AED, ki so induktorji encimskega sistema CYP450 (karbamazepin, fenitoin in fenobarbital), se obseg jetrnega metabolizma lahko poveča za 40-50% (3). Po drugi strani pa zaviralci presnovnih encimom zmanjšajo obseg presnove TPM (npr. valprojska kislina, propranolol) in s tem povečajo njegovo koncentracijo v plazmi. Glavni presnovki TPM 2,3-desizopropiliden TPM (M1), 4,5-desizopropiliden TPM (M2), 10-OH TPM (M3) in 9-OH TPM (M4) (Slika 5), katere so izolirali iz plazme, urina in blata, nastanejo s hidroksilacijo in hidrolizo (9,16). Le tretjina izoliranih presnovkov, ki so ohranili osnovno strukturo TPM, so v poskusih pokazali le majhen protiepileptični učinek, ostali pa nobenega. Tako presnovki TPM, kot tudi nespremenjena oblika učinkovine se izločijo skozi ledvica. Kljub splošnemu poznavanju presnovnih poti TPM, je še zmeraj premalo informacij o kvantitativnem vrednotenju vsebnosti presnovnih profilov TPM (16). 10

20 Slika 5: Strukturna shema topiramata in njegovih glavnih presnovkov, povzeto po (16) Interakcije z drugimi zdravili Topiramat se pri zdravljenju epilepsije uporablja samostojno ali v kombinaciji z drugimi AED. Interakcije z drugimi AED so povzete v Preglednici IV. Preglednica IV: Prikaz interakcij med različnimi AED s TPM (17, 18). Sočasno uporabljeni AED Koncentracija AED Koncentracija TPM Fenitoin * Karbamazepin Valproat Lamotrigin Fenobarbital NP * =plazemske koncentracije se v redkih primerih povečajo; =ni učinka na plazemsko koncentracijo ( 15%); =plazemske koncentracije padajo; NP =ni preskušano Interakcije z nekaterimi drugimi učinkovinami so prikazane v nadaljevanju. 11

21 Digoksin: v primeru dodatka ali ukinitve TPM pri zdravljenju z digoksinom je potrebno skrbno nadzorovati serumske koncentracije digoksina. Pri sočasnem zdravljenju s TPM se le ta lahko zmanjša za 12% (17). Zaviralci osrednjega živčnega sistema: sočasno uživanje TPM in alkohola ali katerega drugega zaviralca osrednjega živčnega sistema ni priporočljivo, kljub temu, da niso bile izvedene dodatne študije (17). Peroralna kontracepcijska sredstva: bolnice, ki jemljejo peroralna kontracepcijska sredstva v kombinaciji s TPM, morajo upoštevati verjetnost zmanjšanja učinkovitosti kontracepcijskega sredstva. To velja še posebej za bolnice, ki jemljejo kontraceptiv, kateri vsebuje estrogen (17). Litij: pri zdravih prostovoljcih so opazili zmanjšanje sistemske izpostavljenosti litiju (za 18 %) med sočasno uporabo s TPM v odmerkih 200 mg/dan. Pri bolnikih z bipolarno motnjo zdravljenje s TPM v odmerkih 200 mg/dan ni vplivalo na farmakokinetiko litija, vendar so opazili povečanje sistemske izpostavljenosti (za 26 %) pri jemanju TPM v odmerkih do 600 mg/dan. Pri sočasni uporabi litija s TPM je torej treba spremljati koncentracije litija (18). Propranolol: pri sočasni uporabi propranolola (80 mg na 12 h) se je pokazal vpliv na povečanje tako maksimalne koncentracije TPM (za 16%) kot tudi površine pod krivuljo TPM za 17% (17). 1.4 Terapevtsko spremljanje učinkovin Terapevtsko spremljanje koncentracije učinkovin (TDM, ang. Therapeutic Drug Monitoring) je orodje s pomočjo katerega v zdravstvenih ustanovah določajo učinkovito in varno zdravljenje bolezni pri posameznih bolnikih, s tem, da preprečijo morebitne interakcije med zdravili, predoziranje in neželene učinke. Namen TDM je pridobivanje informacij s področja demografskih, kliničnih in farmakogenetskih raziskav, oziroma sledenju farmakokinetike in farmakodinamike učinkovine (5). Pri terapevtskem spremljanju učinkovine je pomembno definirati referenčno območje in individualno terapevtsko koncentracijo, saj lahko zaradi prisotnosti individualnih nihanj, nekateri bolniki dosežejo terapevtski učinek zdravila znotraj definiranega območja, spet pri drugih lahko nastopi toksičen učinek (6, 12). 12

22 Referenčno območje je koncentracija učinkovin v serumu ali plazmi, specificirana kot spodnja meja pod katero je doseganje terapevtskega učinka majhno in zgornja meja nad katero lahko dosežemo toksičen učinek (12). Individualno terapevtsko koncentracijo definiramo kot koncentracijo, ki pri posamezniku povzroči najboljši klinični odziv, kar pomeni odsotnost epileptičnih napadov brez prisotnosti neželenih oziroma toksičnih učinkov (12). TDM je smiselno izvajati za učinkovine, ki izkazujejo naslednje lastnosti: ozko referenčno koncentracijsko območje nelinearen odnos med odmerkom in plazemsko koncentracijo nepredvidljivost zaradi interindividualne variabilnosti v farmakokinetiki variabilnost v famakokinetiki zaradi interakcij z drugimi zdravili znan odnos med terapevtskim/toksičnim učinkom in plazemsko koncentracijo zdravila TDM je manj primeren za zdravila s širokim referenčnim koncentracijskim območjem, predvidljivo farmakokinetiko in ireverzibilnim mehanizmom delovanja (6). Izvajanje TDM v epilepsiji je zelo zahtevno zaradi same narave bolezni in občasnih epileptičnih napadov. Ocenjevanje učinkovitosti protiepileptičnih učinkovin predstavlja velik izziv, saj zelo težko ovrednotimo odziv bolnika na terapijo in ločimo znake toksičnosti od kliničnih simptomov bolezni (20). TDM se primarno izvaja za prvo generacijo protiepileptičnih učinkovin, saj je zanje značilno ozko terapevtsko okno, visoki delež vezave na plazemske proteine in variabilna farmakokinetika. Fenitoin je bil med prvimi predstavniki, za katere je bilo nujno potrebno izvajati TDM, sledila pa je valprojska kislina. Tudi karbamazepin in primidon sta učinkovini, pri katerih se izvaja TDM. Iz ostalih dveh generacij protiepileptičnih učinkovin je, kljub bolj ugodnemu farmakokinetičnemu profilu, širšemu terapevtskemu oknu oz. manjši možnost za interakcije z drugimi zdravili, nekaj kandidatov za spremljanje TDM: lamotrigin, okskarbazepin, zonisamid, tiagabin in tudi topiramat (5, 20). Čeprav ne obstajajo kontrolirane naključne študije, ki bi jasno potrdile pozitiven vpliv TDM na klinični izid, izkušnje iz definiranih raziskav in klinične prakse jasno kažejo, da je TDM omenjenih protiepileptičnih učinkovin lahko zelo uporabno, če se izvaja na ustrezen način (20). 13

23 Pri TDM se uporablja širok spekter analiznih metod za vrednotenje, tako koncentracij učinkovine, kot tudi aktivnih in neaktivnih presnovkov. Kvantitativno TDM ovrednotimo z uporabo tako komercialno dostopnih testov (testi na osnovi imunoloških metod), kot z analiznimi metodami razvitimi v laboratoriju (5). V ta namen se uporabljajo kromatografske tehnike, kot na primer tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC, ang. High Performance Liquid Chromatography), plinska kromatografija sklopljena z masnim spektrometrom (GC-MS, ang. Gas Chromatography-Mass Spectrometry), tekočinska kromatografija sklopljena z masnim spektrometrom (LC-MS, ang. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) (21). 1.5 Analitika topiramata Analitika TPM predstavlja poseben izziv zaradi njegove strukture. Ker gre za derivat monosaharida fruktoze, nima v strukturi kromofov. Zaradi tega ni mogoča analitika z najbolj razširjeno analizno tehniko HPLC z UV detekcijo. Dodatno pa je zaradi termolabilnosti manj primeren za vrednotenje z GC tehnikami (22). Zato je analizo s HPLC metodami mogoča le po predhodni derivatizaciji z ustreznimi reagenti, kar pa oteži in podaljša postopek priprave vzorca. Za rutinsko merjenje TPM v bioloških vzorcih se zelo redko uporabljajo GC metode, pogosteje pa imunološke metode. Kot metoda izbora za vrednotenje TPM se zaradi težavne analitike uporabljajo LC-MS/MS metode, v zadnjem času pa tudi HPLC metode po predhodni derivatizaciji TPM z derivatizacijskim reagentom, ki omogoča fluorescenčno ali UV detekcijo (23). Obširen pregled analiznih metod je predstavljen drugje (9, 23), v nadaljevanju pa le nekatere reprezentativne. Nekatere bioanalizne metode za terapevtsko spremljanje koncentracij TPM: - tekočinska kromatografija sklopljena z masnim spektrometrom (24, 25, 26) - tekočinska kromatografija visoke ločljivosti s fluorescenčno detekcijo po predkolonski derivatizaciji z uporabo derivatizacijskega reagenta 4-kloro-7-nitrobenzofurazana (22, 27) - tekočinska kromatografija visoke ločljivosti z UV detekcijo po predhodni predkolonski derivatizaciji (28) - plinska kromatografija z detektorjem z dušikovim fosforjem (29) - fluorescentno-polarizacijska imunološka metoda (30) 14

24 Obstaja veliko število bioanaliznih metod za terapevtsko spremljanje koncentracij TPM. Vendar sta bili do pred kratkim razvili le dve metodi LC-MS/MS za ugotavljanje TPM in njegovih glavnih presnovkov v bioloških vzorcih (31, 32). Metodi sta primerni za spremljanje omenjenih analitov v urinu, kjer so koncentracije teh analitov bistveno večje kot v plazmi. Analiza TPM in njegovih presnovkov v plazmi, pa zaradi slabše občutljivosti (ustrezno so zaznali so le glavni presnovek in TPM) in pomanjkljivega ovrednotenja obeh metod, ne daje dovolj verodostojnih rezultatov (31, 32). Šele v zadnjem času je bila razvita in ustrezno validirana analizna metoda, ki je sposobna kvantitativno ovrednotiti vse štiri glavne presnovke v vzorcih plazme. Dodatno pa so identificirali in kvantitativno ovrednotili še dodatni presnovek TPM (9, 16). 15

25 2. NAMEN DELA Terapevtsko spremljanje protiepileptičnih učinkovin je zaželeno ali v nekaterih primerih celo potrebno zaradi ozkega terapevtskega okna in variabilnosti v njihovi farmakokinetiki. Ena izmed učinkovin namenjena zdravljenju epilepsije je topiramat. Le-ta se uporablja v monoterapiji ali dvojni terapiji z drugim AED, kot je na primer karbamazepin. Za terapevtsko spremljanje topiramata so v strokovni javnosti mnenja deljena. Namen magistrske naloge bo kvantitativno ovrednotiti prisotnost TPM in njegovih presnovkov v plazmi bolnikov z epilepsijo, ker opredelitev presnovnih poti za TPM do danes še ni razjasnjena in hkrati tudi ni ustreznih kvantitativnih podatkov o njegovih presnovkov. Na ta način želimo prispevati argumente k odločanju o upravičenosti uporabe terapevtskega spremljanja za to protiepileptično učinkovino. Plazemske vzorce bolnikov bomo analizirali z LC-MS/MS metodo, ki je bila razvita na Fakulteti za farmacijo in validirana po FDA smernicah za bioanalizne metode ter po priporočilih Matuszewskega (9). Dejansko gre za prvo analizno metodo, ki je dovolj občutljiva za kvantitativno opredelitev presnovkov (2,3-desizopropiliden topiramat, 4,5- desizopropiliden topiramat, 10-hidroksi-topiramat in 9-hidroksi-topiramat) v plazmi, kar nam bo zagotovilo izvedbo študije vrednotenja presnove topiramata. V študijo bo vključenih 66 bolnikov, kateri so prejemali redno terapijo TPM v različnih dnevnih odmerkih ( mg na dan). Vzorci plazme bolnikov so bili pridobljenih iz dveh odvzemov krvi - pred in po aplikaciji odmerka TPM. Glede na to, da so nekateri bolniki prejemali dvojno terapijo (TPM in karbamazepin), bomo tudi primerjali, ali ima karbamazepin vpliv na plazemsko koncentracijo in presnovo TPM. Kot rezultat študije bomo podali primerjavo koncentracijskih vrednosti TPM in njegovih presnovkov pri različnih dnevnih odmerkih TPM in različnem času vzorčenja ter vpliv soterapije karbamazepina. Rezultate analize bodo tudi statistično ovrednotili s ciljem potrditi hipotezo, da je terapevtsko spremljanje pri bolnikih z epilepsijo, ki se zdravijo s TPM, smotrno in upravičeno. 16

26 3. MATERIALI IN METODE 3.1 MATERIALI Biološki material Prazno plazmo smo pridobili na Zavodu za transfuzijsko medicino v Ljubljani na Šlajmerjevi ulici 6. Plazmo smo shranjevali v zamrzovalniku pri temperaturi -20 C in jo pred uporabo odtajali na sobni temperaturi. Preden smo plazmo pipetirali, smo jo predhodno dobro premešali in tako zagotovili homogeno vzorčenje. Uporabo človeške plazme za uporabo v razvojne namene je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (št.77/1/07). Realne vzorce plazme bolnikov na stalnem zdravljenju s TPM smo uporabili za vrednotenje koncentracije TPM in njegovih presnovkov. Vzorci so bili do analize shranjeni v zamrzovalniku pri -80 C. Pred uporabo smo jih odtajali na sobni temperaturi. Vzorce smo pridobili iz klinične študije, katero je odobrila Komisija Republike Slovenije za medicinsko etiko (št.25p/04/12) Standardi -Topiramat (TPM): 2,3:4,5-bis-(O)-(1-metiletiliden)-β-D-fruktopiranoza-1-sulfamat; MM=339,4 g/mol (Santa Cruz, Biotechnology, Inc.; Heidelberg, Nemčija) -Topiramat -d 12 (IS): 3:4,5-bis-(O)-(1-metiletiliden)-β-D-fruktopiranoza-d12-1-sulfamat; MM=351,44 g/mol (Santa Cruz, Biotechnology, Inc.; Heidelberg, Nemčija) -4,5-desizopropiliden topiramat (M2): 4,5-O-(1-metiletiliden)-β-D-fruktopiranoza-1- sulfamat; MM=299,30 g/mol (Santa Cruz, Biotechnology, Inc.; Heidelberg, Nemčija) -10-hidroksi-topiramat (M3) : 2,3-O-(2-R-hidroksi1-metiletiliden)-β-D-fruktopiranoza-1- sulfamat; MM=355,36 g/mol (Santa Cruz, Biotechnology, Inc.; Heidelberg, Nemčija) -9-hidroksi-topiramat (M4) : 2,3-O-(2-S-hidroksi1-metiletiliden)-β-D-fruktopiranoza-1- sulfamat; MM=355,36 g/mol (Santa Cruz, Biotechnology, Inc.; Heidelberg, Nemčija) -2,3-desizopropiliden topiramat (M1): 2,3-O-(1-metiletiliden)-β-D-fruktopiranoza-1- sulfamat; MM=299,30 g/mol. Standard presnovka M1 je bil pripravljen v laboratoriju na 17

27 Fakulteti za farmacijo, z izolacijo iz urina bolnika, ki je bil na stalni terapiji s TPM. Postopek je potekal v treh stopnjah. Najprej je bilo izvedeno čiščenje in koncentriranje vzorca, čemur je sledila izolacija M1 frakcije. V zadnji stopnji je bila potrjena čistost M1 z LC-MS/MS analizo (9) Reagenti in topila Pri delu smo uporabili naslednje reagente, plin in topila: - Metanol HPLC grade ( 99,9%), CH 3 OH ChromasolV Sigma Aldrich, (Steinheim, Nemčija) - Metanol LC-MS grade ( 99,9%), CH 3 OH ChromasolV Sigma Aldrich, (Steinheim, Nemčija) - za uporabo na sistemu LC-MS/MS - Etilacetat, C 4 H 8 O 2, Reag. Ph. Eur. (PanReac, Barcelona, Španija) - Dietil eter, C 4 H 10 O, Emsure ACS, ISO, Reag. Ph. Eur. (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) - Ultra čista voda pridobljena z aparatom Milli- Q Adventage A10 Ultrapure Water Purification system (Millipore, Belford, ZDA) - Stisnjen dušik- N 2 (Messer, Ruše, Slovenija) Aparature in laboratorijski pripomočki Pri delu smo uporabili naslednje aparature in laboratorijske pripomočke: - Tehtnica XP 105 (Mettler Toledo, Schwerzenbach, Švica) - Centrifuga Eppendorf, tip 5415R, Eppendorf research (Hamburg, Nemčija) - Zamrzovalnik MDF-U50V (T= -80 C), Sanyo Electric Biomedical (Osaka, Japonska) - Hladilnik (T=2-8 C) z zamrzovalnikom (T= -20 C) Gorenje (Velenje, Slovenija) - Mešalnik Vibromix10, Tehtnica (Železniki, Slovenija) - Koncentrator in evaporator Turbovap LV, Caliper Life Sciences (Hopkinton-M, ZDA) - Polavtomatske pipete 2-20 µl, µl, µl, Eppendorf (Hamburg, Nemčija) - Mikrocentrifugirke velikosti 1,5 ml, Eppendorf (Hamburg, Nemčija) - Stekleni inventar: merilne bučke, stekleni zamaški za merilne bučke, steklene pipete, čaše, merilni valji, HPLC viale in inserti za viale 18

28 - Ostali inventar: lateks rokavice, nastavki za polavtomatske pipete, spatule, podstavki za HPLC viale in mikrocentrifugirke, parafinski film Parafilm M, plastične kapalke, pokrovčki za viale in majhne kovinske vzmeti - Digestorij Analitski sistem LC-MS/MS Agilent 1290 Infinity UHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, ZDA) vsebuje razplinjevalec, binarno črpalko, avtomatski vzorčevalnik, termostat za kolono, UV- VIS detektor (DAD, ang. Diode array detector) Agilent 6460 Triple Quadropole LC-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, ZDA) z Jetstream ESI ionskim izvorom Programska oprema: MassHunter Workstation Software Kolona: Kinetex C18, 50 2,1mm, 2,6µm (Phenomenex, Torrance, ZDA) Predkolona: Luna C18 4 2mm (Phenomenex, Torrance, ZDA) 3.2 Priprava raztopin Priprava osnovne raztopine standarda TPM (OST) Osnovno raztopino standarda TPM s koncentracijo 1 mg/ml smo pripravili tako, da smo na analitski tehtnici natehtali 1,28 mg TPM, ga kvantitativno prenesli v 2 ml mikrocentrifugirko in raztopili v 1280 µl MeOH. Pripravljeno raztopino smo shranjevali zavito s parafilmom v zamrzovalniku pri -20 C. Za pripravo standardne raztopine TPM s koncentracijo 25 mg/l smo v 5 ml merilno bučko odpipetirali 125 µl osnovne raztopine standarda TPM, redčili z MeOH do oznake in dobro premešali. Pokrov bučke smo ovili s parafilmom ter jo shranjevali v hladilniku pri temperaturi 4 C Raztopine standardov presnovkov (M1, M2, M3, M4) Viale z 1 mg posameznih presnovkov so bile nabavljene pri dobavitelju. V vsako izmed njih je bilo že predhodno dodano 1000 µl MeOH. Viale s pripravljenimi osnovnimi 19

29 raztopinami presnovkov (c=1 mg/ml) ovite s parafilmom smo shranjevali v zamrzovalniku pri -20 C. Iz osnovnih raztopin presnovkov M1, M2, M3 in M4 (c=1 mg/ml) smo pripravili raztopine s koncentracijo 25 mg/l po naslednjem postopku. V primerno označene 5 ml merilne bučke smo v vsako posebej odpipetirali 125 µl posamezne raztopine presnovka in redčili do oznake z MeOH. Vsebino bučke smo dobro premešali ter pokrov bučke ovili s parafilmom. Raztopine smo shranjevali v hladilniku pri temperaturi 4 C Osnovna raztopina internega standarda (IS) Osnovna raztopina IS (topiramat-d 12 ) je bila že predhodno pripravljena, in sicer so v vialo z 2,5 mg IS dodali 2,5 ml metanola (c=1 mg/ml). 125 µl te raztopine smo prenesli v 25 ml merilno bučko in dopolnili z MeOH do oznake ter dobro premešali (c=5 mg/l). Pokrov bučke smo zatesnili s parafilmom in jo shranjevali v hladilniku pri temperaturi 4 C Raztopina internega standarda za redčenje (ISr) Osnovno raztopino IS s koncentracijo 1 mg/ml smo uporabili za pripravo ISr. V 5 ml merilno bučko smo odpipetirali 125 µl osnovne raztopine internega standarda in dodali MeOH do oznake (c=25 mg/l), 500 µl tako pripravljene raztopine smo odpipetirali v 5 ml merilno bučko in dopolnili z MeOH do oznake (c=2,5 mg/l). Bučke smo dobro premešali ter pokrov ovili s parafilmom. Raztopine smo shranjevali v hladilniku pri 4 C. Raztopino internega standarda s koncentracijo 2,5 mg/l smo redčili petkrat v metanolu in dodali 25 µl te raztopine pri pripravi realnih (plazemskih) ter kalibracijskih in kontrolnih vzorcev Delovna raztopina za pripravo kalibracijskih in kontrolnih vzorcev (DR I ) Raztopine za umeritveno premico smo pripravili iz raztopin standarda TPM, presnovkov M1-M4 in IS navedenih v poglavju 3.2 Priprava raztopin. Postopek priprave je potekal tako, da smo v 1,5 ml mikrocentrifugirke odpipetirali 125 µl raztopine TPM (1 mg/ml), 20

30 25 µl M2, M3 in M4 s koncentracijo 25 mg/l ter 625 µl M1 (25mg/L) in dodali 175 µl MeOH (DR 1, Preglednica V). Preglednica V: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR I ) brez dodanega ISr. Vzorec TPM M1 M2, M3, M4 Priprava DR I ,6 0, µl TPM µl M µl M2-M µl MeOH DR I 2 62,5 7,81 0, µl DR1+125 µl MeOH DR I 3 31,3 3,91 0, µl DR1+300 µl MeOH DR I 4 6,25 0,781 0, µl DR1+950 µl MeOH DR I 5 3,13 0,391 0, µl DR4+125 µl MeOH DR I 6 1,25 0,156 0, µl DR4+400 µl MeOH DR I -Qch 75,0 9,36 0, µl DR µl MeOH DR I -Qcm 25,0 3,12 0, µl DR µl MeOH DR I -Qcl 5,00 0,625 0, µl DR µl MeOH Osnovno delovno raztopino (DR I 1) smo redčili in dobili kalibracijske in kontrolne raztopine brez dodanega ISr (Preglednica V). V 200 µl tako pripravljene raztopine smo dodali 50 µl IS (c=2,5 mg/ml) (Preglednica VI) in slednje raztopine uporabili za pripravo kalibracijskih in kontrolnih vzorcev, kar je opisano v poglavju Priprava plazemskih vzorcev. Kontrolne vzorce smo pripravili v treh paralelkah. Preglednica VI: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR I ) z dodanim ISr (c=2,5 mg/l). Vzorec TPM M1 M2, M3, M4 Priprava DR I 1 IS ,5 0, µl DR1+50 µl ISr DR I 2 IS 50,0 6,25 0, µl DR2+50 µl ISr DR I 3 IS 25,0 3,13 0, µl DR3+50 µl ISr 21

31 DR I 4 IS 5,00 0,625 0, µl DR4+50 µl ISr DR I 5 IS 2,50 0,313 0, µl DR5+50 µl ISr DR I 6 IS 1,00 0,125 0, µl DR6+50 µl ISr DR IS -Qch 60,0 7,50 0, µl DR-Qch + 50 µl MeOH DR IS -Qcm 20,0 2,50 0, µl DR-Qcm + 50 µl MeOH DR IS -Qcl 4,00 0,500 0, µl DR-Qcl + 50 µl MeOH Delovna raztopina za pripravo kalibracijskih in kontrolnih vzorcev (DR II ) Pri analizi realnih vzorcev smo opazili, da je v nekaterih primerih koncentracija M1 in M3 večja kot območje umeritvene premice. Odločili smo se za pripravo nove umeritvene premice s širšim koncentracijskim območjem obeh omenjenih presnovkov. Delovno raztopino (DR II 1) smo pripravili tako, da smo v mikrocentrifugirko odpipetiramo 125 µl raztopine TPM (1 mg/ml), 25 µl M2 in M4 (25 mg/l), 50 µl M3 (25 mg/l) ter 775 µl M1 (80 mg/l) (DR II 1, Preglednica VII). Preglednica VII: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR II ) brez dodanega ISr. Vzorec TPM M1 M3 M2, M4 Priprava DR II ,5 1,25 0, µl TPM+25 µl M2+25 µl M4 +50 µl M µl M1 / DR II 2 93,8 46,9 0,938 0, µl DR II 1+60 µl MeOH DR II 3 62,5 31,3 0,625 0, µl DR II µl MeOH DR II 4 31,3 15,6 0,313 0, µl DR II µl MeOH DR II 5 15,6 7,81 0,156 0, µl DR II µl MeOH DR II 6 6,25 3,13 0,063 0, µl DR II µl MeOH DR II 7 3,13 1,56 0,031 0, µl DR II µl MeOH DR II 8 1,25 0,63 0,013 0, µl DR II µl MeOH DR II -Qch 75 37,5 0,750 0, µl DR II µl MeOH DR II -Qcm 25 12,5 0,250 0, µl DR II µl MeOH 22

32 DR II -Qcl 5,00 2,50 0,050 0, µl DR II µl MeOH Osnovno delovno raztopino (DR II 1) smo redčili in dobili kalibracijske in kontrolne raztopine brez dodanega ISr (Preglednica VII). V 200 µl tako pripravljene raztopine smo dodali 50 µl IS (c=2,5 mg/ml) (Preglednica VIII) in slednje raztopine uporabili za pripravo kalibracijskih in kontrolnih vzorcev, kar je opisano v poglavju Priprava plazemskih vzorcev. Kontrolne vzorce smo pripravili v treh paralelkah. Preglednica VIII: Priprava kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR II ) z dodanim ISr (c=2,5 mg/l). Vzorec TPM M1 M3 M2, M4 Priprava DR II 1 IS 100,0 50,0 1,00 0, µl DR1+50 µl ISr DR II 2 IS 75,0 37,5 0,750 0, µl DR2+50 µl ISr DR II 3 IS 50,0 25,0 0,500 0, µl DR3+50 µl ISr DR II 4 IS 25,0 12,5 0,250 0, µl DR4+50 µl ISr DR II 5 IS 12,5 6,25 0,125 0, µl DR5+50 µl ISr DR II 6 IS 5,00 2,50 0,050 0, µl DR6+50 µl ISr DR II 7 IS 2,50 1,25 0,025 0, µl DR7+50 µl ISr DR II 8 IS 1,00 0,500 0,010 0, µl DR8+50 µl ISr DR IS -Qch 60,0 30,0 0,600 0, µl DR II -Qch µl MeOH DR IS -Qcm 20,0 10,0 0,200 0, µl DRII-Qchm + 50 µl MeOH DR IS -Qcl 4,00 2,00 0,040 0, µl DRII-Qchl + 50 µl MeOH Priprava plazemskih vzorcev Priprava plazemskih vzorcev: - Slepi vzorec V 100 µl plazme smo dodali 25 µl MeOH in nadaljevali s postopek opisanim v nadaljevanju. - Kalibracijski in kontrolni vzorci 23

33 V 100 µl plazme smo dodali 25 µl raztopine kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR I ) z dodanim ISr (Preglednica VI) oz. raztopine kalibracijskih in kontrolnih raztopin (DR II ) z dodanim ISr (Preglednica VIII) in nadaljevali s postopkom opisanim v nadaljevanju. - Realni vzorci V 100 µl plazme smo dodali 25 µl ISr (c=0,5 mg/ml) in nadaljevali s postopkom opisanim v nadaljevanju. Prikaz korakov postopka priprave in obdelave plazemskih vzorcev po predhodno razviti in validirani analizni metodi (9): - V 100 µl plazme smo odpipetirali 25 µl ISr (ali kalibracijskih in kontrolnih vzorcev) - Mešali smo 30 sekund na Votrex mešalniku - Dodali smo 875 µl topila (dietil eter: etilacetat = 5:95, v/v) - Mešali smo 60 sekund na Vortex mešalniku - Centrifugirali smo 10 minut pri rcf (relativna centrifugalna sila, ang. Relative Centrifugal Force) µl supernatanta smo prenesli s pipeto v mikrocentrifugirko - Sušenje pri 45 C smo izvedli pod N 2 v Turbovap LV koncentratorju - Suhi ostanek smo raztopili v 125 µl metanola - Mešali smo 30 sekund na Votrex mešalniku - Raztopino smo prenesli v vialo z insertom ter jo analizirali z LC-MS/MS Analiza plazemskih vzorcev Kromatografska ločba je bila izvedena na instrumentu Agilent 1290 Infinity UHPLC. Ustrezna ločba je bila dosežena z uporabo kolone Kinetex C18, dolžine in premera 50 2,1 mm ter velikostjo delcev stacionarne faze 2,6 µm. Kromatografski pogoji: Mobilna faza A; MilliQ voda Mobilna faza B; MeOH Pretok mobilne faze; 0,5 ml/min Temperatura kolone; 50 C Temperatura vzorčevalnika; 10 C 24

34 Volumen injiciranja; 0,5 µl Za detekcijo smo uporabljali masni analizator Agilent 6460 s trojnim kvadrupolnim analizatorjem in JetStream ionskim izvorom. Nastavitve masnega analizatorja: - Vir ionizacije; ESI v negativni ionizaciji - Sušilni plin; 320 C; 6 L/min - Jetstream plin; 320 C; 11 L/min - Nebulizacijski plin; 30 psi - Delta EMV: 200 V - Napetost na šobi: 2000 V - Napetost na kapilari; 2500 V - Širina masne ločljivosti; 2,5 (M1, M2, M3, M4), 0,7 (TPM) - Razdelilni čas; 50 ms - Nastavitve MRM prehodov: TPM 338,1-77,8; CE: 29eV; FR: 134V 338,1-95,8; CE: 17eV; FR: 134V M1 298,1-77,8; CE: 37eV; FR: 144V 298,1-95,8; CE: 13eV; FR: 144V M2 298,1-77,8; CE: 21eV; FR: 134V 298,1-95,8; CE: 21eV; FR: 134V M3 354,1-77,8; CE: 37eV; FR: 164V 354,1-95,8; CE: 13eV; FR: 164V M4 354,1-77,8; CE: 29eV; FR: 154V 354,1-95,8; CE: 21eV; FR: 154V TPM-d 12 (IS) 338,1-77,8; CE: 29eV; FR: 134V CE-kolizijska energija; FR-fragmentor; podčrtane vrednosti predstavljajo MRM za kvantitativno vrednotenje Statistična obdelava rezultatov Numerične vrednosti pridobljene pri sami analizi smo ovrednotiti tudi s statistiko, zato smo za predstavitev rezultatov uporabili statistično metodo linearne regresije v programu R ter Excel, kjer smo izračunali povprečne vrednosti, standardni odklon (SD) in relativni standardni odklon (RSD). Za lažjo interpretacijo statističnih rezultatov smo predhodno navedli tabelirane vrednosti dnevnih odmerkov učinkovine TPM in CBZ, kot tudi povprečne koncentracije učinkovin in presnovkov glede na dnevni odmerek in čas 25

35 odmerjanja. Pri presnovkih smo navedli še povprečne relativne oziroma normirane vrednosti koncentracij glede na TPM, katere smo ravno tako statistično ovrednotili. 26

36 4. REZULTATI IN RAZPRAVA Cilj magistrske naloge je bil predstaviti smotrnost TDM za zdravilno učinkovino TPM. V ta namen smo uporabili plazemske vzorce 66 bolnikov, kateri so bili na rednem zdravljenju epilepsije. Da bi potrdili smiselnost uporabe TDM, smo preverili vpliv časa odmerjanja in odmerek zdravilne učinkovine ter vpliv soterapije pri enajstih bolnikih s karbamazepinom. Dobljene rezultate, z namenom, da bi ugotoviti ali je TDM potreben, smo predstavili v preglednicah in grafih. Dodatno smo pomembne rezultate tudi statistično ovrednotili. V študiji smo se osredotočili tudi na presnovke TPM. Tako smo za sočasno vrednotenje TPM in njegovih presnovkov uporabili predhodno razvito in validirano LC-MS/MS analizno metodo. Metodo smo pred izvedbo analiz preverili s kalibracijskimi in kontrolnimi vzorci in smo jo po analizi prvih realnih vzorcev prilagodili in nadgradili Analizna metoda Za vrednotenje vsebnosti topiramata in njegovih presnovkov (M1 - M5) smo uporabili LC- MS/MS analizno metodo, ki je bila predstavljena (razvita in validirana) v magistrski nalogi, katere avtor je Luka Rebek (9). Pred pričetkom izvajanja analiz smo preverili točnost, ponovljivost in linearnost metode z kalibracijskimi in kontrolnimi vzorci ( Delovne raztopine za pripravo umeritvene premice (DR I ). Rezultati analize so potrdili ustrezno točnost, ponovljivost in linearnost (Preglednica IX), saj so bili vsi ovrednoteni parametri znotraj postavljenih kriterijev sprejemljivosti po FDA smernicah za validacijo bioanaliznih metod za vse analite na vseh treh koncentracijskih nivojih (R 2 0,99; RSD<15%; točnost: 100±15%). Preglednica IX: Preverjanje analizne metode s kalibracijskimi in kontrolnimi raztopinami DR I. M1 M2 M3 M4 TPM Qcl RSD(%) 7,69 3,92 4,45 1,71 0,89 točnost(%) 105,01 104,98 100,79 100,78 93,25 Qcm RSD(%) 1,91 1,84 2,23 1,93 1,80 točnost(%) 98,51 93,85 99,77 98,98 110,77 Qch RSD(%) 1,28 3,37 1,20 2,70 1,36 točnost(%) 99,17 97,25 103,18 102,99 103,49 R 2 0,9967 0,9973 0,9976 0,9959 0,

37 Pri analizi vzorcev bolnikov na rednem zdravljenju epilepsije, smo ugotovili, da je koncentracijsko območje metode za M1 in M3 neustrezno, saj je koncentracija navedenih presnovkov v nekaterih realnih vzorcih presegala zgornjo vrednost postavljenega območja. Zato smo v nadaljevanju koncentracijsko območje za oba analita razširili z namenom zagotovili, da bodo izmerjene koncentracije analitov znotraj koncentracijskega območja analizne metode ( Delovne raztopine za pripravo umeritvene premice (DR II )). Rezultati preverjanja metode v širšem območju so potrdili primernost uporabljene metode, saj so bili vsi vrednoteni parametri znotraj postavljenih kriterijev sprejemljivosti (Preglednica X) in celo še boljši kot pri prvotnem preverjanju metode (Preglednica IX). Na podlagi dobljenih rezultatov lahko potrdimo, da je analizna metoda tudi v širšem koncentracijskem območju (za M1 in M3) linearna, ponovljiva in točna. Preglednica X: Preverjanje analizne metode s kalibracijskimi in kontrolnimi raztopinami DR II v razširjenem koncentracijskem območju za presnovka M1 in M3. M1 M2 M3 M4 TPM Qcl RSD(%) 1,90 9,31 3,58 3,92 1,26 točnost(%) 101,42 95,68 96,82 98,62 91,02 Qcm RSD(%) 1,19 5,45 2,89 3,89 1,96 točnost(%) 100,41 97,01 101,42 100,21 95,90 Qch RSD(%) 3,01 6,17 2,71 2,52 1,82 točnost(%) 102,44 109,06 105,06 102,98 103,33 R 2 0,9995 0,9985 0,9993 0,9997 0,9985 Po uspešnem preverjanju analizne metode smo pomerili vsebnost TPM in njegovih presnovkov v skupno 91 plazemskih vzorcih. V vseh vzorcih smo uspešno kvantitativno ovrednotili vsebnost TPM in njegovih glavnih presnovkov, saj so bili vsi analiti nad mejo določitve metode (Priloga 1). Prav tako smo uspešno zaznali in ovrednotili prisotnost presnovka M5, kateri naj bi bil izomer M3 in M4 (9). Njegova strukturna formula je trenutno še neznana, zato standarda M5 še ni na voljo. Za kvantitativno opredelitev M5 smo koncentracije izračunali oziroma ocenili iz umeritvene premice za M4, saj sta oba izomera in so bili njuni odzivi v vzorcih tudi dokaj primerljivi. 28

38 4.2. Interpretacija rezultatov analize realnih vzorcev V magistrski nalogi smo ugotavljali smiselnost izvajanja terapevtskega spremljanja zdravilne učinkovine TPM in njegovih presnovkov. V ta namen smo analizirali plazemske vzorce 66 bolnikov in primerjali rezultate vsebnosti učinkovine in njenih presnovkov pri različnih časih odvzema vzorca (pred in po odmerjanju zdravilne učinkovine) pri posameznem bolniku in tudi v celotni skupini bolnikov. Prav tako smo primerjali kako različni dnevni odmerki TPM vplivajo na plazemske koncentracije TPM in njegovih presnovkov. Pri bolnikih, kateri so bili na zdravljenju z dvojno terapijo (TPM in CBZ), smo lahko ovrednotili, kako CBZ vpliva v različnih dnevnih odmerkih, tako na koncentracijo TPM kot na koncentracijo presnovkov. Pomerjene koncentracije TPM in njegovih presnovkov v plazemskih vzorcih bolnikov so zbrane v Prilogi 1, v nadaljevanju pa so predstavljene prej omenjene primerjave Primerjava koncentracij topiramata in presnovkov glede na čas odmerjanja Najprej smo primerjali ugotovljene koncentracije zdravilne učinkovine in nastalih presnovkov v ravnotežnem stanju (pred aplikacijo zdravila) in 2-4 ure po aplikaciji TPM. V Preglednici XI so prikazane vrednosti povprečnih koncentracij TPM in presnovkov bolnikov, katerim je bila odvzeta kri bodisi pred ali po aplikaciji zdravilne učinkovine. V Preglednici XII pa za bolnike, katerih smo imeli na voljo vzorec plazme obeh odvzemov. V vseh navedenih primerih je razvidno, da je koncentracija TPM v ravnotežnem stanju nižja kot koncentracija TPM po aplikaciji zdravilne učinkovine. Takšen rezultat je tudi pričakovan, saj se od prvega do ponovnega odvzema plazemskega vzorca, bolnikom dalo zdravilo in je zato TPM v tem času že prišel v krvni obtok. Pri presnovkih pa te ugotovitve ne moremo potrditi, saj njihove koncentracije pred in po aplikaciji zdravila ne kažejo značilnega trenda. Še posebej pri analizi bolnikov, za katere smo imeli podatke od obeh odvzemov (Preglednica XII), so razlike zelo majhne. V tem primeru imamo namreč na voljo iste bolnike in možnost neposredne primerjave. Razlog za takšen rezultat je posledica časovno zamaknjenega procesa presnove, saj TPM doseže maksimalno plazemsko koncentracijo dokaj pozno - šele nekje do 3,4 ure po aplikaciji zdravila (9). Drugi odvzem vzorca pa je bil za večino bolnikov ravno v tem časovnem intervalu (2-4 ure). To je tudi eden od razlogov, da smo v nadaljevanju pri analizi podatkov uporabljali plazemske 29

39 koncentracije pred aplikacijo zdravila, torej v ravnotežnem stanju, kjer se izognemo dodatnemu vplivu dejanskega časa drugega odvzema vzorca. V obeh preglednicah so navedene tudi normirane vrednosti koncentracije presnovkov glede na koncentracijo TPM v posameznem vzorcu. Ti podatki nam prikažejo sliko obsega presnove. Rezultati kažejo, da se TPM v največjem deležu pretvori v presnovek M1, ki ga je za približno 100-krat več kot ostalih presnovkov. Ostali presnovki so v zelo ozkem območju, v povprečju so razlike izražene do štirikratnik koncentracije (Preglednici XI in XII), sledijo pa si v naslednjem vrstnem redu od najvišje proti najnižji: M3, M2, M5 in M4. Presnovka M1 je v vzorcih v povprečju za več kot polovico koncentracije TPM (gledano na ravnotežno stanje), v posameznih vzorcih pa tudi presega koncentracijo TPM (Priloga 1). Zato tudi ne preseneča, da so v objavljeni literaturi našli le M1 presnovek v plazmi bolnikov z epilepsijo (25). Preglednica XI: Pregled povprečnih vrednosti koncentracij TPM in presnovkov vseh bolnikov pred in po aplikaciji dnevnega odmerka zdravilne učinkovine. Plazemske koncentracije vseh bolnikov bodisi pred ali po aplikaciji TPM Pred aplikacijo TPM (SS) Normirane vrednosti (SS) na TPM M1 M2 M3 M4 M5 TPM M1 M2 M3 M4 M5 (%) (%) (%) (%) (%) Pov. konc. 2,766 0,021 0,033 0,005 0,013 3,936 Pov. konc. 0,776 0,007 0,009 0,002 0,004 SD 2,498 0,018 0,035 0,004 0,012 2,339 SD 0,547 0,008 0,006 0,001 0,003 RSD, % 90,31 81,99 106,24 71,35 87,66 59,42 RSD, % 70,55 122,26 68,20 63,16 78,75 Po aplikaciji TPM Normirane vrednosti na TPM M1 M2 M3 M4 M5 TPM M1 M2 M3 M4 M5 (%) (%) (%) (%) (%) Pov. konc. 2,250 0,011 0,016 0,002 0,006 5,213 Pov. konc. 0,432 0,003 0,003 0,001 0,001 SD 1,797 0,014 0,029 0,004 0,010 2,445 SD 0,185 0,004 0,005 0,001 0,002 RSD, % 79,89 133,5 181,05 161,33 172,30 46,90 RSD, % 42,74 152,66 152,36 163,10 163,75 SS ravnotežno stanje 30

40 Preglednica XII: Pregled povprečnih vrednosti koncentracij TPM in presnovkov bolnikov, katerih smo imeli na voljo vzorec plazme pred in po aplikaciji odmerka TPM. Plazemske koncentracije bolnikov (pred/po) aplikaciji TPM Pred aplikacijo TPM (SS) Normirane vrednosti (SS) na TPM M1 M2 M3 M4 M5 TPM M1 M2 M3 M4 M5 (%) (%) (%) (%) (%) Pov. konc. 1,879 0,016 0,020 0,004 0,009 4,019 Pov. konc. 0,547 0,005 0,006 0,001 0,003 SD 1,586 0,013 0,014 0,003 0,008 2,360 SD 0,500 0,004 0,004 0,001 0,002 RSD, % 84,43 79,57 73,52 69,59 91,39 58,72 RSD, % 91,52 91,33 72,63 66,35 90,42 Po aplikaciji TPM Normirane vrednosti na TPM M1 M2 M3 M4 M5 TPM M1 (%) M2 (%) M3 (%) M4 (%) M5 (%) Pov. konc. 2,201 0,015 0,023 0,004 0,008 5,452 Pov. konc. 0,392 0,003 0,004 0,001 0,002 SD 2,525 0,015 0,021 0,003 0,006 3,399 SD 0,296 0,003 0,003 0,000 0,001 RSD, % 114,72 94,78 92,08 73,72 76,75 62,35 RSD, % 75,39 98,60 61,85 50,82 66,89 SS ravnotežno stanje Analizo podatkov smo nadgradili z uporabo statistične metode, saj smo želeli ugotoviti ali prihaja do značilnih razlik v koncentraciji TPM in njegovih presnovkov pri primerjavi omenjenih parametrov. Statistično podprti rezultati študije so navedeni v Preglednici XIII, kjer smo na osnovi podatkov izračunali P vrednost, ki predstavlja stopnjo značilnosti v višini 0,05. To pomeni, če pri primerjavi parametrov (npr. čas odvzema vzorca) dobimo vrednost P manj kot 0,05, gre za značilno razliko. Preglednica XIII: Statistični prikaz odvisnosti koncentracij TPM in njegovih presnovkov (absolutna in normirana vrednost na koncentracijo TPM) od časa odvzema vzorca v ravnotežnem stanju pri vseh bolnikih. P Čas P vrednost Čas vrednost normirano normirano TPM 4,57x10-4 / / 31

41 M1 / / / / M2 / / / / M3 / / / / M4 / / 4,60x10-2 M5 / / / / Parameter ima značilen vpliv (α = 0,05); / - P vrednost je > 0,05 Pri pregledu rezultatov pridemo do naslednjih ugotovitev: na koncentracijo TPM značilno vpliva čas odvzema, dejavnik je izrazit na normirano vrednost M4 čas odmerjanja vpliva, a ne pomembno, saj je P vrednost blizu mejne vrednosti 0,05 Rezultati statistične obravnave so potrdili predhodne ugotovitve, da čas odvzema vzorca značilno vpliva le na koncentracijo TPM. Tega zaključka ne spremeni niti dejstvo, da so bolniki prejemali zelo različne dnevne odmerke TPM, kar je opisano v poglavju Primerjava koncentracij presnovkov in TPM glede na dnevni odmerek. Glede na splošno prakso na področju farmakokinetike in naše ugotovitve smo v nadaljevanju primerjali rezultate le za vzorce bolnikov v ravnotežnem stanju (pred aplikacijo zdravila) Primerjava koncentracij presnovkov in TPM glede na dnevni odmerek V okviru te klinične študije so bolniki prejemali različne odmerke TPM (Slika 6). Na voljo smo imeli plazemske vzorce 66 bolnikov, pri katerih je večina prejemala odmerek med 100 in 400 mg na dan. Največji odstotek bolnikov je prejemalo dnevni odmerek 200, 300 in 400 mg učinkovine na dan. 32

42 Slika 6: Prikaz odstotka bolnikov glede na dnevni odmerek TPM. V poglavju Primerjava koncentracij topiramata in presnovkov glede na čas odmerjanja smo pregledali rezultate celotne populacije vzorcev in ugotovili, da je v povprečju v plazemskih vzorcih največ TPM, približno polovico manj je presnovka M1, ostali presnovki pa so prisotni v značilno nižjih koncentracijah (približno 100-krat). Pri tem moramo upoštevati, da so bolniki prejemali različne dnevne odmerke. Zato smo v nadaljevanju bolnike razvrstili v razrede glede na dnevne odmerke zdravila in primerjali koncentracije analitov (Preglednice XIV). Preglednica XIV: Povprečne vrednosti koncentracij TPM in njegovih presnovkov glede na dnevni odmerek. ODMEREK Število M1 M2 M3 M4 M5 TPM (mg) bolnikov ,084 0,009 0,012 0,003 0,006 1, ,561 0,012 0,016 0,003 0,007 2, ,971 0,031 0,023 0,004 0,009 3, ,942 0,027 0,052 0,007 0,022 5, ,786 0,016 0,030 0,006 0,013 5, ,774 0,026 0,042 0,007 0,021 5, ,121 0,042 0,117 0,012 0,032 9,798 33