UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ EKOLOGIJE IN BIODIVERZITETE David ŠKUFCA SPREMLJANJE POKAZATELJEV FIZIOLOŠKEGA STANJA VODNIH OSLIČKO

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ EKOLOGIJE IN BIODIVERZITETE David ŠKUFCA SPREMLJANJE POKAZATELJEV FIZIOLOŠKEGA STANJA VODNIH OSLIČKOV IZ JAMSKEGA IN POVRŠINSKEGA OKOLJA MAGISTRSKO DELO Magistrski študij 2. stopnja Ljubljana, 2016

2 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ EKOLOGIJE IN BIODIVERZITETE David ŠKUFCA SPREMLJANJE POKAZATELJEV FIZIOLOŠKEGA STANJA VODNIH OSLIČKOV IZ JAMSKEGA IN POVRŠINSKEGA OKOLJA MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja MONITORING OF PHYSIOLOGICAL STATE BIOMARKERS OF WATER LICE FROM CAVE AND SURFACE WATER ENVIRONMENTS M. SC. THESIS Master Study Programmes Ljubljana, 2016

3 »There is a single light of science, and to brighten it anywhere is to brighten it everywhere.«isaac Asimov

4 Magistrsko delo je zaključek univerzitetnega študija 2. bolonjske stopnje Ekologija in biodiverziteta na Oddelku za biologijo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Opravljeno je bilo na Katedri za zoologijo na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete. Senat Oddelka za biologijo je na predlog Komisije za študij 1. in 2. stopnje, dne odobril temo magistrskega dela in za mentorja imenoval doc. dr. Primoža Zidarja, za somentorico doc. dr. Anito Jemec, za predsednico komisije doc. dr. Simono Prevorčnik ter za recenzentko prof. dr. Kristino Sepčić. Komisija za zagovor: Predsednik: Član: Član: Član: doc. dr. Simona PREVORČNIK Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo doc. dr. Primož ZIDAR Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo doc. dr. Anita JEMEC Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo prof. dr. Kristina SEPČIĆ Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Datum zagovora: Podpisani izjavljam, da je magistrsko delo rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je elektronski izvod identičen tiskanemu. Na univerzo neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno prenašam pravici shranitve avtorskega dela v elektronski obliki in reproduciranja ter pravico omogočanja javnega dostopa do avtorskega dela na svetovnem spletu preko Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. David Škufca II

5 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ŠD Du2 DK UDK 574.5(043.2) KG Asellus aquaticus/vodni osliček/biomarker/monitoring/jama/površinski vodotok AV ŠKUFCA, David, diplomiran biolog (UN) SA ZIDAR, Primož (mentor)/jemec, Anita (somentorica)/sepčić, Kristina (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij ekologije in biodiverzitete LI 2016 IN SPREMLJANJE POKAZATELJEV FIZIOLOŠKEGA STANJA VODNIH OSLIČKOV IZ JAMSKEGA IN POVRŠINSKEGA OKOLJA TD Magistrsko delo (Magistrski študij 2. stopnja) OP XI, 74 str., 6 pregl., 25 sl., 6 pril., 139 vir. IJ sl JI sl/en AI Vodni osliček, Asellus aquaticus (L.), je splošno razširjena vrsta enakonožnega raka. Najdemo ga v različnih površinskih sladkovodnih habitatih, kot tudi v podzemnih vodah. Želeli smo ugotoviti vpliv sezonsko vezanih okoljskih dejavnikov na biomarkerje pri A. aquaticus in ugotoviti ali obstajajo razlike v biomarkerjih med površinskimi in jamskimi populacijami. Želeli smo tudi podati smernice za razumevanje bazalnih vrednosti biomarkerjev vodnih osličkov in njihovo potencialno uporabo v biomonitoringu. Merili smo encimsko aktivnost dveh encimov (acetilholinesteraze in glutation-s-transferaze) ter količino treh založnih snovi (lipidov, ogljikovih hidratov in proteinov). Vrednosti biomarkerjev in količina založnih snovi so se med letnimi časi razlikovale. Encimske aktivnosti so bile načeloma višje poleti. Sezonsko se spreminjajo številne razmere v okolju živali; predvsem temperatura vode je bila močno sezonsko pogojena. Vrednosti encimskih biomarkerjev jamskih živali so bile nižje in stabilnejše. Prav tako so bile pri njih sezonske razlike v količinah založnih snovi manjše. Domnevamo, da je vzrok večja stabilnost temperature in ostalih okoljskih razmer v Planinski jami, v primerjavi s površjem. Jamske populacije A. aquaticus bi bile zaradi stabilnejših okoljskih razmer po našem mnenju sicer primernejše za nadaljnje ekološke in ekotoksikološke študije kot površinske, vendar pa ni znan vpliv izlova na te populacije. Potrebno bo še veliko raziskav vplivov okolja na biomarkerje, da bo možna njihova uporaba v naravovarstvene namene. III

6 KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) DN Du2 DC UDC 574.5(043.2) CX Asellus aquaticus/water lice/biomarker/monitoring/cave/surface stream AU ŠKUFCA, David AA ZIDAR, Primož (supervisor)/jemec, Anita (co-advisor)/sepčić, Kristina (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Master Study Programmes in Ecology in Biodiversity PY 2016 TI MONITORING OF PHYSIOLOGICAL STATE BIOMARKERS OF WATER LICE FROM CAVE AND SURFACE WATER ENVIRONMENTS DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO XI, 74 p., 6 tab., 25 fig., 6 ann., 139 ref. IJ sl JI sl/en AI Asellus aquaticus, or water lice, is an ubiquitous isopod crustacean. It can be found in various surface freshwater habitats, as well as in underground water. Our aim was to determine the influence of seasonal environmental factors on biomarkers of water lice, as well as to establish whether there are differences between surface and underground populations. We also wanted to give guidelines to the understanding of basal values of biomarkers in water lice and their potential use in biomonitoring. We measured the enzyme activity of two enzymes (acetylcholinesterase and glutathione- S-transferase), as well as the quantity of energy reserves (lipids, carbohydrates and proteins). There were seasonal differences in the biomarker values that we measured. Enzyme activities tended to be higher in summer and we noticed seasonal differences in energy reserves. Many environmental conditions change during the year especially temperature had a high seasonal variability. Enzyme activity was lower and more stable in the underground animals. The amount of energy reserves was likewise more stable. We assume that the reason was the more stable temperature as well as other environmental conditions in Planinska jama, compared to surface locations. Underground populations could be more suitable for future ecological and ecotoxicological studies than surface ones, due to the more stable environment. Still, a lot of biomarker research and environmental influences on them must be completed, before they can be used for the protection of our environment. IV

7 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... III KEY WORDS DOCUMENTATION... IV KAZALO VSEBINE... V KAZALO PREGLEDNIC... VIII KAZALO SLIK... IX KAZALO PRILOG... XI 1 UVOD OPREDELITEV PROBLEMA NAMEN RAZISKOVANJA DELOVNE HIPOTEZE PREGLED OBJAV VRSTA ASELLUS AQUATICUS PRIMERJAVA PODZEMNIH IN POVRŠINSKIH ŽIVALI Razlike med prilagoditvami podzemnih in površinskih rakov BIOMARKERJI KOT POKAZATELJI FIZIOLOŠKEGA STANJA Opredelitev biomarkerjev Uporabnost biomarkerjev v biomonitoringu PROUČEVANI BIOMARKERJI Aktivnost AChE Aktivnost GST Založne snovi VPLIV OKOLJSKIH DEJAVNIKOV NA BIOMARKERJE Vplivi na aktivnost AChE Vplivi na aktivnost GST Vplivi na količino založnih snovi MATERIAL IN METODE LOKACIJE Opis lokacij Opis vzorčenja V

8 3.2 LABORATORIJSKO DELO Priprava živali za meritve Priprava supernatanta za merjenje encimske aktivnosti in vsebnosti proteinov Priprava kalij fosfatnega pufra (K-P pufer) Priprava homogenata Priprava supernatanta Določanje aktivnosti AChE Ellmanov reagent Raztopina ATChCl (1M) Meritev aktivnosti AChE Določanje aktivnosti GST Priprava raztopine 1-kloro-2,4-dinitrobenzena (CDNB) Priprava raztopine reduciranega glutationa (GSH) Meritev aktivnosti GST Določanje količine proteinov Priprava standardov Meritev količine proteinov Priprava homogenata za določanje količine lipidov in količine ogljikovih hidratov Določanje količine lipidov Priprava standardov Meritev količine lipidov Določanje količine ogljikovih hidratov Priprava standardov Meritev količine ogljikovih hidratov ANALIZA PODATKOV Kvantifikacija meritev biomarkerjev Kvantifikacija aktivnosti AChE Kvantifikacija aktivnosti GST Kvantifikacija količine proteinov Kvantifikacija količine lipidov VI

9 Kvantifikacija količine ogljikovih hidratov Statistična obdelava podatkov Grafikoni REZULTATI FIZIKALNI IN KEMIJSKI PARAMETRI VODE SPOLNA SESTAVA VZORČENIH ŽIVALI SVEŽA MASA ŽIVALI AKTIVNOST AChE AKTIVNOST GST KOLIČINA LIPIDOV KOLIČINA OGLJIKOVIH HIDRATOV KOLIČINA PROTEINOV RAZPRAVA FIZIKALNI IN KEMIJSKI PARAMETRI VODE SPOLNA SESTAVA VZORČENIH ŽIVALI SVEŽA MASA ŽIVALI AKTIVNOST AChE AKTIVNOST GST KOLIČINA LIPIDOV KOLIČINA OGLJIKOVIH HIDRATOV KOLIČINA PROTEINOV ENCIMSKA AKTIVNOST IN ZALOŽNE SNOVI KOT BIOMARKERJI SKLEPI POVZETEK VIRI ZAHVALA PRILOGE VII

10 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Fizikalni in kemijski parametri vode v času vzorčenja na različnih lokacijah Preglednica 2: Pregled vrednosti aktivnosti AChE izbranih vrst rakov iz literature Preglednica 3: Pregled vrednosti aktivnosti GST izbranih vrst rakov iz literature Preglednica 4: Pregled vrednosti količine lipidov izbranih vrst rakov iz literature Preglednica 5: Pregled vrednosti količine ogljikovih hidratov izbranih vrst rakov iz literature Preglednica 6: Pregled vrednosti količine proteinov izbranih vrst rakov iz literature.. 55 VIII

11 KAZALO SLIK Slika 1: Odrasli vodni osliček površinske podvrste Asellus aquaticus aquaticus in jamske podvrste A. a. cavernicolus Slika 2: Zemljevid lokacij vzorčenja vodnega oslička Slika 3: Slika 4: Slika 5: Slika 6: Lokacija vzorčenja vodnega oslička v reki Pivki, 150 m JV od vhoda v Postojnsko jamo Vhod v Planinsko jamo, iz katere teče Unica in lokacija vzorčenja Asellus aquaticus cavernicolus v Planinski jami Lokacija vzorčenja vodnega oslička v strugi Unice, 850 m SZ od Jakovice na Planinskem polju Lokacija vzorčenja vodnega oslička v močvirnatem gozdu 100 m SZ od Oddelka za biologijo v Ljubljani Slika 7: Spolna sestava vodnih osličkov glede na letni čas in lokacijo vzorčenja Slika 8: Slika 9: Slika 10: Slika 11: Slika 12: Slika 13: Slika 14: Slika 15: Grafikoni kvartilov sveže mase vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase Grafikoni kvartilov sveže mase vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije Grafikoni kvartilov sveže mase samcev in samic vodnih osličkov v poletnem in jesenskem obdobju, za vzorčene lokacije Grafikoni kvartilov aktivnosti AChE vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih Grafikoni kvartilov aktivnosti AChE vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije Grafikoni kvartilov aktivnosti AChE samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju Grafikoni kvartilov aktivnosti GST vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih Grafikoni kvartilov aktivnosti GST vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije IX

12 Slika 16: Slika 17: Slika 18: Slika 19: Slika 20: Slika 21: Slika 22: Slika 23: Slika 24: Slika 25: Grafikoni kvartilov aktivnosti GST samcev in samic vodnih za vzorčene lokacije, osličkov v poletnem in jesenskem obdobju Grafikoni kvartilov količine lipidov vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih Grafikoni kvartilov količine lipidov vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije Grafikoni kvartilov količine lipidov samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju Grafikoni kvartilov količine ogljikovih hidratov vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih Grafikoni kvartilov količine ogljikovih hidratov vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije Grafikoni kvartilov količine ogljikovih hidratov samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju Grafikoni kvartilov količine proteinov vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih Grafikoni kvartilov količine proteinov vodnih osličkov za v treh letnih časih, vzorčene lokacije Grafikoni kvartilov količine proteinov samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju X

13 KAZALO PRILOG PRILOGA A: Preglednica A1: Preglednica A2: Preglednica A3: Preglednica A4: Preglednica A5: Preglednica A6: Osnovne statistike izmerjenih parametrov Osnovne statistike za svežo maso vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase. Osnovne statistike za aktivnost AChE vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase. Osnovne statistike za aktivnost GST vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase. Osnovne statistike za količino lipidov vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase. Osnovne statistike za količino ogljikovih hidratov vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase. Osnovne statistike za količino proteinov vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase. XI

14 1 UVOD 1.1 OPREDELITEV PROBLEMA Vodni osliček, Asellus aquaticus (Linnaeus, 1758), je po Evraziji razširjena evrieka vrsta enakonožnega raka (Sket, 1994). Je pomemben člen v prehranskih verigah je detritivor in herbivor (Graca in sod., 1994; Marcus in sod. 1978), hkrati pa je plen za druge živali (Rask in Hiisivuori, 1985; Cockrell, 1984; MacNeil in sod. 2002). Vodni osliček je pogosto modelni organizem v raziskavah v vodni ekologiji (Hasu in sod., 2008), ekotoksikologiji (Migliore in sod., 1990; Bouskill in sod., 2006; Lukančič in sod., 2010; Bloor in sod., 2005, De Lange in sod., 2006) ter evolucijski in razvojni biologiji (Protas in Jeffery, 2012; Stahl in sod., 2015). Predstavlja tudi potencialen modelni organizem za biomonitoring površinskega in jamskega vodnega okolja. Eden izmed pokazateljev fizioloških sprememb v živali so spremembe na nivoju celice, med katere sodijo tudi t.i. biokemijski biomarkerji (Van Gestel in Van Brummelen, 1996). Meritve nekaterih biomarkerjev imajo potencial za hitrejše zaznavanje prisotnosti onesnažil v okolju in oceno njihove nevarnosti kot običajne meritve količine posameznih snovi v vodi (Handy in sod., 2003). Proučevanje biomarkerjev v organizmih se uveljavlja kot občutljivo orodje za zaznavanje onesnaženja v okolju s spremljanjem encimskih aktivnosti (Domingues in sod., 2010; Ferreira in sod., 2015; Carvalho in sod., 2013; Handy in sod., 2003) ali količine založnih snovi (Donker, 1992; Ribeiro in sod., 2001, Schill in Köhler, 2004; Smolders in sod., 2004; Durou in sod., 2005). Raziskave kažejo, da je za načrtovanje poskusa in pravilno interpretacijo izmerjenih vrednosti biomarkerjev ključnega pomena zelo dobro poznavanje bazalnih vrednosti merjenih biomarkerjev (Jemec in sod., 2010; Ferreira in sod., 2010). Organizmi prebivajo v okolju, ki se stalno spreminja, zato morajo svoje fiziološke procese delno prilagoditi razmeram v okolju, da ohranjajo homeostazo. Na encimske biomarkerje lahko tako vplivajo: velikost živali (Xuereb in sod., 2009a), slanost vode (Cailleaud in sod., 2006), temperatura (Cailleaud in sod., 2006; Menezes in sod., 2006; Robillard in sod., 2003; Vidal in sod., 2002), vrednost ph (Robillard in sod., 2003) in medij (Vidal in sod., 2002; Printes in Callaghan, 2003). Na količino založnih snovi lahko vplivajo: količina in izvor hrane (Hervant in sod., 1997; Charron in sod., 2014), letni čas (Sroda in Cossu-Leguille, 2011; Gismondi in sod., 2012), temperatura (Issartel in sod., 2005; Sroda in Cossu-Leguille, 2011; Gismondi in sod., 2012), spol (Sroda in Cossu-Leguille, 2011; Gismondi in sod., 2012), parjenje (Plaistow in sod., 2003; Sparkes in sod., 1996; Jormalainen in sod.; 2001) in količina kisika (Hervant in sod., 1996, 1999). Vpliv na vrednost biomarkerjev imajo tudi številna onesnažila (Ferreira in sod., 2015; O'Neill in sod., 2004; Xuereb in sod., 2009b; Domingues in sod., 2010; Carvalho in sod., 2013; Dierickx, 1984; Gowland in sod., 2002; Ribeiro in sod., 2001; Stanek in sod., 2006; 1

15 Verslycke in sod., 2004; De Coen in Janssen, 1997), vendar ugotavljanje njihovega vpliva ni namen te naloge. Vodni osliček sicer predstavlja potencialni modelni organizem za biomonitoring, vendar pa zanj še ni znana naravna dinamika vrednosti biomarkerjev, ki so odvisni od okoljskih in endogenih vplivov. Raziskave naravne dinamike biomarkerjev bi pripomogle k presoji primernosti A. aquaticus in meritev njegovih biomarkerjev za uporabo v biomonitoringu. 1.2 NAMEN RAZISKOVANJA Magistrsko delo je nastalo z namenom proučevanja sezonske dinamike biomarkerjev pri vodnem osličku, A. aquaticus in primerjave biomarkerjev treh različnih podvrst iz jamskih in površinskih lokacij. Merili smo aktivnost dveh encimov (acetilholinesteraze in glutation- S-transferaze) ter merili količino treh založnih snovi (lipidov, ogljikovih hidratov in proteinov). Želeli smo ugotoviti vpliv sezonsko vezanih okoljskih dejavnikov na biomarkerje pri A. aquaticus in ugotoviti ali obstajajo razlike med biomarkerji površinskih in jamskih populacij. Končni cilj naloge je podati smernice za razumevanje bazalnih vrednosti biomarkerjev vodnih osličkov in njihovo potencialno uporabo v biomonitoringu. 1.3 DELOVNE HIPOTEZE H1: Vrednosti encimskih aktivnosti se razlikujejo med generacijami osebkov, ki so bile nabrane v različnih letnih časih, a na isti lokaciji. H2: Količina založnih snovi se razlikuje med generacijami osebkov, ki so bile nabrane v različnih letnih časih, a na isti lokaciji. H3: Vrednosti encimskih aktivnosti se pri jamski podvrsti razlikujejo od površinskih podvrst v okviru istega letnega časa. H4: Količina založnih snovi se pri jamski podvrsti razlikuje od površinskih podvrst v okviru istega letnega časa. 2

16 2 PREGLED OBJAV V nalogi smo proučevali vrednosti izbranih biomarkerjev pri vodnih osličkih, Asellus aquaticus, ki smo jih vzorčili na 4 lokacijah v treh letnih časih. V nadaljevanju bomo predstavili značilnosti proučevanega organizma, opisali glavne razlike med površinskimi in jamskimi živalmi, podali definicijo biomarkerja ter opisali biomarkerje, ki smo jih merili v nalogi ter možne vplive okoljskih dejavnikov nanje. 2.1 VRSTA ASELLUS AQUATICUS Vodni osliček, Asellus aquaticus (Linnaeus, 1758) (Crustacea: Isopoda: Asellota: Asellidae), je evritopa, evritermna in ekspanzivna vrsta. Najdemo ga tako v različnih površinskih sladkovodnih habitatih, kot tudi v podzemnih vodah (Henry in sod., 1996). Gruner (1965) navaja, da je A. aquaticus razširjen v: Norveški, Švedski, Finski, Danski, Veliki Britaniji, Nizozemski, Belgiji, Franciji, Nemčiji, Švici, Avstriji, Italiji, Poljski, Češki, Slovaški, Madžarski, Romuniji, Sloveniji, Hrvaški, Bosni in Hercegovini, Srbiji, Črni Gori, Makedoniji, Albaniji, Grčiji, Turčiji, Iranu, območju Kavkaza in celotnem evropskem delu nekdanje Sovjetske zveze. Vrsta je prisotna na večini ozemlja nekdanje Jugoslavije, pri čemer je na tem področju znanih več podvrst (Sket, 1994). V našem delu obravnavamo tri podvrste: A. aquaticus aquaticus (Slika 1, levo), ki je najbolj razširjena podvrsta, A. a. carniolicus Sket, 1965, najbolj pleziomorfno podvrsto, ki živi na kraških poljih v JZ Sloveniji in A. a cavernicolus Racovitza, 1925 (Slika 1, desno), najbolj troglomorfno podvrsto, ki je znana iz podzemnih delov reke Pivke in Ljubljanice (Prevorčnik in sod., 2004). Slika 1: Odrasli vodni osliček površinske podvrste Asellus aquaticus aquaticus (levo, na listu črne jelše) in jamske podvrste A. a. cavernicolus (desno). Foto: Ž. Fišer. Vodni oslički pred kopulacijo tvorijo t.i. prekopule, kar pomeni, da samec drži samico z nogami in jo prenaša pod seboj, dokler ona ne levi zadnje polovice telesa. Šele tedaj jo samec lahko oplodi, samica pa odloži oplojena jajca v valilnik (Ridley in Thompson, 1979). Letno 3

17 dinamiko razmnoževanja vodnih osličkov na Ljubljanskem barju opisujeta Štrus in Blejec (1983). Navajata, da razmnoževanje vodnih osličkov traja od marca do oktobra, z dvema vrhuncema: prvim maja ali junija in drugim avgusta ali septembra. V našem podnebju imajo površinski A. aquaticus verjetno tri generacije: spomladansko (ki je prezimila od prejšnje jeseni), poletno (potomci spomladanske) in jesensko (potomci poletne generacije). Slednja je generacija, ki prezimi do naslednje pomladi (Štrus in Blejec, 1983; Steel, 1961). Ker razmnoževanje poteka od začetka pomladi do jeseni, se poletna in jesenska generacija med seboj mešata (Štrus in Blejec, 1983), generacija, ki je prezimila od lanskega leta pa do začetka poletja pogine (Steel, 1961). Na severu Evrope se vodni oslički parijo le dva meseca v letu (Andersson, 1969), na jugu Evrope, kjer mile zime ne predstavljajo ovire za razmnoževanje, se lahko razmnožujejo tudi pozimi (Migliore in sod., 1982). Štrus in Blejec (1983) navajata, da so samice največje v zimskih in zgodnjih pomladnih mesecih. Tudi Steel (1961) ter Ridley in Thompson (1979) poročajo, da so vodni oslički največji od decembra do aprila, od konca pomladi naprej pa so živali manjše od 9 mm. Za jamske populacije podatkov o razmnoževanju in generativnem času ni. Več avtorjev navaja, da površinske populacije regulirajo razmnoževanje glede na fotoperiodo in temperaturo vode (Štrus in Blejec, 1983; Økland, 1978; Andersson, 1969). A. aquaticus živi v počasnejših nižinskih vodotokih in stoječih vodah, prisoten je tako v čistejših vodah kot tudi v okolju z višjo stopnjo saprobnosti in večjo količino hranil v vodi (Parvulescu, 2009). V slednjem se pojavlja v večjem številu, vendar so osebki manjši, kot v čistih vodah (Tolba in Holdich, 1981). Odmrlo rastlinje v vodnih telesih, ki je primarna hrana vodnega oslička (Graca in sod., 1994; Prus, 1971), je ponavadi obrastla z mikroorganizmi, ki prispevajo k prehranski vrednosti detrita, tako z lastno biomaso, kot z deloma»prebavljeno«organsko snovjo, na kateri živijo (Cummins, 1979). Prehranjuje se tudi z zelenimi rastlinami in algami (Marcus in sod. 1978). A. aquaticus je pomemben plen za mnoge ribe (Rask in Hiisivuori, 1985) in predatorske nevretenčarje (Cockrell, 1984; MacNeil in sod. 2002). A. aquaticus je izjemno odporen na hipoksijo, saj tolerira količine raztopljenega O2 do 1,5 mg/l in uspešno živi v vodah s koncentracijo O2 5,8 mg/l. (Holland, 1976). Glede na ekološko nišo je drobilec, kar pomeni, da se prehranjuje z detritom oz. grobimi delci organske snovi. Z oddaljevanjem od izvira in z zviševanjem biokemične porabe kisika (BPK) se razmerje med rodom Asellus in drugimi drobilci (npr. postranicami iz rodu Gammarus) zvišuje, saj je prvi odporen na organsko onesnaženje in nižje količine kisika za razliko od postranic, ki zasedajo podobno ekološko nišo (MacNeil, 2002). Slednje plenijo vodnega oslička (predvsem juvenilne osebke), kar delno razloži nižje razmerje med rodovoma v čistejših vodah (MacNeil, 2002). Toleranca na koncentracijo NH3 se pri vrsti spreminja glede na letni čas vzorčenja osebkov ter je obratno sorazmerna s temperaturo vode. Lahko je 5-krat (v zimskem času) do 15-krat (v poletnem času) višja od vrst iz rodu Gammarus (Dehedin, 2013). A. aquaticus je odporen tudi na termični stres; z zviševanjem temperature se količina porabe O2 ne poveča (Dehedin, 2013). Možno je, da NH3 moti vnos 4

18 O2 v organizem, kar je pri višjih temperaturah bolj problematično, saj se zmanjša količina raztopljenega kisika (Dehedin, 2013). Vrste iz rodu Gammarus imajo različno porabo O2 glede na temperaturo, A. aquaticus pa vedno nižjo porabo O2 od njih (Dehedin, 2013). Vodni oslički so pomemben člen v prehranskih spletih, zato so tudi pomembni modelni organizmi za raziskave v vodni ekologiji (Hasu in sod., 2008), ekotoksikologiji (Migliore in sod., 1990; Bouskill in sod., 2006; Lukančič in sod., 2010; Bloor in sod., 2005; De Lange in sod., 2008) ter evolucijski in razvojni biologiji (Protas in Jeffery, 2012; Stahl in sod., 2015). 2.2 PRIMERJAVA PODZEMNIH IN POVRŠINSKIH ŽIVALI Podzemne populacije A. aquaticus lahko najdemo v Sloveniji, Italiji in Romuniji (Verovnik in sod., 2009). Med površinskimi in podzemnimi populacijami je več morfoloških razlik: podzemne živali so pogosto večje, nekatere okončine so daljše, imajo manj ali nič pigmenta v telesu in očeh ter manjše ali nerazvite oči (Turk in sod., 1996; Prevorčnik in sod., 2004). Lattinger-Penko (1979) poroča, da je podzemni A. a. cavernicolus iz Postojnsko-planinskega jamskega sistema po trajanju levitve in času med levitvami, dolžini kopulacije in številu potomcev, bolj podoben površinskemu A. a. aquaticus, kot nekaterim podzemnim vrstam enakonožnih rakov (Proasellus cavaticus, Caecosphaeroma burgundum, Angeliera phreaticola) Razlike med prilagoditvami podzemnih in površinskih rakov Razmere v jamah se od površinskih pogosto razlikujejo po pomanjkanju hrane in njenem nerednem alohtonem vnosu ter daljših obdobjih hipoksije (Hervant in sod., 1997; Mathieu in Hervant, 2004). Več avtorjev navaja, da imajo podzemni raki nižjo stopnjo metabolizma kot njim sorodne površinske vrste (delo na Gammarus fossarum, Gammarus troglophilus, Gammarus acherondytes, Niphargus stygius in Niphargus rhenorhodanensis) (Hervant in sod., 1997; Simčič in sod., 2005; Simčič in Brancelj, 2007; Wilhelm in sod., 2006). Po drugi strani pa Culver in Poulson (1971) poročata, da se stopnja metabolizma treh ekotipov Gammarus minus (enega jamskega in dveh površinskih) ne razlikuje od stopnje metabolizma dveh ekotipov sorodnega rodu Stygonectes (jamskega in površinskega), ker ni bilo razlik v količini hrane med površinskimi in jamskimi habitati. Hervant in sod. (1997) so primerjali odzive treh podzemnih vrst rakov (N. rhenorhodanensis, N. virei in Stenasellus virei) in dveh površinskih vrst rakov (G. fossarum in A. aquaticus) na stradanje. Površinski vrsti sta se odzvali s periodo hiperaktivnosti (kar ustreza iskanju hrane), ki ji je sledil upad aktivnosti, medtem ko so podzemne vrste aktivnost zmanjševale postopoma, respiracijo in porabo kisika so znižale bistveno bolj od površinskih vrst. Prav tako so podzemne vrste preživele brez hrane skoraj trikrat dlje in so nov vir hrane hitreje izkoristile od površinskih vrst. O podobni strategiji za premostitev pomanjkanja hrane poročajo tudi pri človeški ribici (Proteus anguinus) (Hervant in sod., 2001). 5

19 Podzemni raki, ki so morfološko podobni površinskim, imajo lahko med stradanjem drugačno dinamiko izrabe založnih snovi kot površinske vrste. Hervant in Renault (2002) poročata, da so se površinski A. aquaticus na stradanje odzvali z velikim upadom vseh treh vrst založnih snovi (lipidov, ogljikovih hidratov, proteinov). Medtem so se osebki podzemne vrste enakonožnega raka S. virei odzvali v treh fazah, med katerimi so pretežno porabljali različne založne snovi: fosfageno-glucidno fazo (v večji meri poraba arginin fosfata in glikogena), lipidno fazo (v večji meri poraba lipidov) in nazadnje proteo-lipidno fazo (v večji meri poraba proteinov in lipidov). Po ponovnem hranjenju so podzemni raki mnogo hitreje nadomestili založne snovi, izgubljene med stradanjem, kot površinski. 6

20 2.3 BIOMARKERJI KOT POKAZATELJI FIZIOLOŠKEGA STANJA Opredelitev biomarkerjev Pojem biomarker Van Gestel in Van Brummelen (1996) definirata glede na nivo biološke organizacije. Biomarker opisujeta kot katerikoli biološki odziv na onesnažilo, ki ga izmerimo na ravni nižji od osebka. Označuje torej parameter, ki ga izmerimo v osebku in nakazuje odstopanje od bazalnega stanja, vendar izključuje parametre na nivoju organizma (kot npr. umrljivost, aktivnost, prehranjevanje). Tako omejujeta pojem biomarker na biokemične, fiziološke, histološke in morfološke parametre in izločata vedenjske indikatorje Uporabnost biomarkerjev v biomonitoringu Malo več kot pred desetletjem so Handy in sod. (2003) predlagali, da lahko meritev biomarkerjev nadomesti neposredno meritev onesnaževal in, da je biomarker ustrezen kazalec izpostavljenosti in učinka, kadar koncentracija onesnaževala v okolju sorazmerno vpliva na odziv biomarkerja. Več avtorjev je meritvi biomarkerjev pripisovala velik potencial kot orodju za zaznavanje onesnaženja preko meritve encimskih aktivnosti (Ferreira in sod., 2015; Carvalho in sod., 2013; Handy in sod., 2003) ali količine založnih snovi (Donker, 1992; Ribeiro in sod., 2001, Schill in Köhler, 2004; Smolders in sod., 2004; Durou in sod., 2005). Handy in sod. (2003) so navedli tudi štiri razloge, zaradi katerih je uporaba biomarkerjev boljša od meritve količine posameznih onesnaževal v okolju: i. Biomarkerji naj bi nakazovali prisotnost biološko aktivne substance, ii. Uporaba biomarkerjev naj bi pokazala prisotnost onesnaževal, na katere se sprva ni sumilo, iii. Odzivi biomarkerjev naj bi trajali dalj časa po izpostavitvi. Tako lahko zaznamo izpostavljenost tudi, če kemični monitoring nek dogodek zgreši, iv. Analize biomarkerjev naj bi bile v mnogih primerih cenejše in lažje kot širok spekter kemičnih analiz. Kljub začetnim obetom uporabe biomarkerjev in številnim raziskavam, se ti ne uporabljajo pogosto v oceni tveganja za okolje (angl. environmental risk assessment) in za reguliranje izpustov (Handy in sod., 2003; Jemec in sod., 2010). Po mnenju Jemec in sod. (2010) bi bili biomarkerji najprimernejši predvsem za študij vplivov učinkov na organizme in ne pri rutinski oceni tveganja. Zaradi nepoznavanja dinamike biomarkerjev v naravi (Jemec in sod., 2010), nejasnih zvez med odmerki onesnažil in vrednostmi biomarkerjev ter neznane povezave s fitnesom živali (Forbes in sod., 2006), biomarkerji zaenkrat niso uporabni za ekstrapolacijo učinkov iz osebkov na populacije, združbe ali ekosisteme (Van Gestel in Van Brummelen, 1996). Kljub temu pa obstajajo študije, ki se ukvarjajo s povezavami med vrednostmi biomarkerjev in 7

21 nekaterimi histopatološkimi spremembami (Jemec in sod., 2012) ter spremembami na nivoju populacij (De Coen in Janssen, 2003; Durou in sod., 2007; Koop in sod., 2008). 2.4 PROUČEVANI BIOMARKERJI V nadaljevanju predstavljamo biomarkerje, ki smo jih v tem delu proučevali: aktivnost acetilholinesteraze (AChE), aktivnost glutation-s-transferaze (GST) in založne snovi (lipidi, ogljikovi hidrati, proteini) Aktivnost AChE Acetilholinesteraza je encim, ki je odgovoren za pravilen prenos živčnih signalov. Akcijski potencial na presinaptičnem nevronu povzroči odprtje Ca 2+ kanalov, zaradi česar pride do eksocitoze živčnega prenašalca (v tem primeru acetilholina). Ta difundira čez sinaptično špranjo in se veže na receptorje na postsinaptičnem nevronu. Vezava povzroči razliko v prevodnosti membrane za ione, kar lahko povzroči akcijski potencial na naslednjem nevronu. Da se lahko prenese nov signal je potrebna odstranitev acetilholina, ki ga acetilholinesteraza s hidrolizo odstrani iz sinaptične špranje med nevronoma (Purves in sod., 2004). V nevretenčarjih je vloga AChE manj jasna. Raki imajo inhibitorne in ekscitatorne motorične nevrone, ki uporabljajo druge živčne prenašalce, acetilholin pa je živčni prenašalec predvsem v aferentnih živčnih vlaknih (Fulton in Key, 2001). Med aktivnostjo AChE in lokomotorno aktivnostjo živali je direktna povezava znana pri rakih (Xuereb in sod., 2009b, Engenheiro in sod., 2005) in šesteronožcih (Jensen in sod., 1997). Poleg tega ima AChE v različnih nevretenčarjih vrsto drugih vlog (Karczmar, 2010), vendar v rakih te zaenkrat niso opisane. Raziskave kažejo, da ima AChE vlogo pri oploditvi jajčnih celic morskih ježkov (Angelini in sod., 2004), pri razvoju in regeneraciji tkiva lovk hobotnic Octopus vulgaris (Fossati in sod., 2015) in pri reprodukciji, razvoju zarodka in rasti potomcev hrošča Tribolium castaneum (Lu in sod., 2012). Znano je, da aktivnost AChE zavirajo nekateri insekticidi, kar povzroči nepravilno delovanje živčnega sistema. Reakcija je ireverzibilna za mnoge pesticide in tudi po daljšem času, ko se pesticid izloči iz telesa živali, je možno zaznati nižjo aktivnost AChE (Hyne in Maher, 2003; Domingues in sod., 2010). Zaradi njenega indikatorskega potenciala za ugotavljanje onesnaženosti okolja, aktivnost AChE proučujejo kot pokazatelj vpliva organofosfatnih in karbamatnih pesticidov na organizme (Hyne in Maher, 2003; Fulton in Key, 2001; Day in sod., 1990; Carvalho, 2013; Domingues in sod., 2010) Aktivnost GST Glutation S-transferaze so skupina encimov, ki katalizirajo konjugacijo organskih molekul z reaktivnim elektrofilnim centrom s tiolno skupino tripeptida glutationa. Reakcija povzroči, da se reaktivna lipofilna molekula spremeni v vodotopen in nereaktiven metabolit, ki ga 8

22 organizem zlahka izloči (Clark, 1989). Encimi v skupini so specifični za različne vrste molekul: alkil- in arilhalide, karboksilate, sufatne in fosfatne estre, epokside, organske nitrate, tiocianate in hidroperokside (Habig in sod. 1974; Clark, 1989). Druga pomembna vloga je antioksidativna. Encimi GST na glutation vežejo tudi hidroperoksidaze in citotoksične aldehide, ki nastanejo tekom lipidne peroksidacije, tj. oksidacije membranskih lipidov (Halliwell in Gutteridge, 2015; Wallace in sod., 1997). Encimi GST so prisotni v večini organizmov, v bakterijah, rastlinah, glivah in živalih. Glede na taksonomski položaj organizma je nemogoče določiti, kakšna bo aktivnost GST, saj se vrednosti med taksoni zelo razlikujejo. Zelo se razlikujejo tudi odzivi različnih organizmov na posamezna onesnaževala. V živalih se encimi GST pojavljajo v večjih količinah v genitalijah, v tkivih, ki so izpostavljena okoljskim vplivom (škrgah, črevesju, kutikuli, izločevalnih organih) in v tkivih, ki so analogna vretenčarskim jetrom (maščobno telo žuželk, hepatopankreas mehkužcev in rakov) (Clark, 1989). Aktivnost GST proučujejo v ekotoksikoloških študijah zaradi biomarkerskega potenciala za ugotavljanje onesnaženja okolja, saj povišana aktivnost GST nakazuje procese razstrupljevanja (Jemec in sod., 2007) Založne snovi Lipidi, ogljikovi hidrati in proteini so snovi, ki jih živi organizmi proizvajajo za različne namene. V magistrskem delu smo se osredotočili predvsem na njihovo funkcijo kot založne snovi, saj lahko raki vse tri tipe snovi uporabljajo kot založne snovi (Sanchez-Paz in sod., 2006). Lipidi so nepolarne organske molekule, ki jih iz organizmov lahko ekstrahiramo z organskimi topili. Maščobe, olja, voski, v maščobah topni vitamini, steroli in fosfolipidi celičnih membran so nekateri primeri lipidov. Živalske maščobe in rastlinska olja so najpogostejši lipidi. Kemično jih opredelimo kot trigliceride. Živali uporabljajo lipide kot dolgoročne založne snovi, ker so manj oksidirani od ogljikovih hidratov in preskrbijo žival s 6-krat več energije kot enaka količina hidriranega glikogena (McMurry, 2016). Ogljikovi hidrati zajemajo spojine, ki so polihidroksialdehidi in polihidroksiketoni. Ločujemo jih na enostavne in kompleksne, glede na to ali gre za posamezne molekule ali polimere. Organizmi jih uporabljajo npr. kot gradnike celic in DNK ter za pridobivanje energije in založne snovi. Primeri založnih snovi v živih organizmih vključujejo glukozo, fruktozo, škrob in glikogen. Ogljikovi hidrati živalim predstavljajo vir energije in založno snov, ki jo lahko hitreje mobilizirajo kot maščobe (McMurry, 2016). Proteini so polimeri aminokislin, ki so v verige povezane s peptidnimi vezmi. Pojavljajo se v vseh organizmih in opravljajo zelo različne biološke funkcije, kljub temu pa je njihova osnovna struktura zelo podobna. V grobem lahko delimo proteine na globularne in fibrilarne. 9

23 Fibrilarni proteini so čvrsti in večinoma v vodi netopni (npr. keratin v laseh in nohtih, fibroin v svili), medtem ko so mnogi globularni proteini v vodi topni (npr. mioglobin, okoli encimov v človeškem telesu) (McMurry, 2016). 2.5 VPLIV OKOLJSKIH DEJAVNIKOV NA BIOMARKERJE Več avtorjev poroča, da je za uspešno uporabo biomarkerjev za zaznavanje onesnažil potrebno poznavanje okoljskih dejavnikov na biomarkerje in naravno dinamiko biomarkerjev (Jemec in sod., 2010; Xuereb in sod., 2009a; Handy in sod., 2003; Domingues in sod., 2010; Van Gestel in Van Brummelen, 1996). Samo tako so biomarkerji lahko zanesljivi pokazatelji stanja v naravi. Na biomarkerje, ki jih obravnavamo v magistrskem delu, lahko vplivajo številni okoljski dejavniki (letni čas, temperatura, razvojni stadij živali, spol, razpoložljivost hrane, snovi v okolju, itd.) (Jemec in sod., 2010). Samo s poznavanjem teh vplivov lahko zanesljivo ocenimo kaj je v danem času in okolju»bazalna«vrednost biomarkerjev, ki jih proučujemo Vplivi na aktivnost AChE Na aktivnost AChE lahko vpliva več okoljskih dejavnikov, zato je razumevanje teh ključno za tolmačenje vpliva pesticidov na organizme in okolje. Številne raziskave zato obravnavajo vpliv različnih okoljskih dejavnikov. Encimska aktivnost se med taksoni lahko močno razlikuje. Berra in sod. (2004) so merili aktivnost AChE in GST različnih nevretenčarjev iz rek Taro in Ticino. Njihove meritve kažejo, da se znotraj sezone med taksoni aktivnosti AChE razlikujejo, poleg tega pa poročajo tudi o sezonskih nihanjih, ki se med taksoni in encimoma razlikujejo. Olsen in sod. (2001) poročajo o veliki variabilnosti tudi znotraj vrste pri ličinkah dvokrilca Chironomus riparius. Živalim, vzorčenim iz različnih lokacij, so izmerili značilno različne aktivnosti AChE, čeprav so bile lokacije neonesnažene in niso zaznali povezave z izmerjenimi fizikalnokemijskimi parametri. Pri nekaterih vrstah lahko na aktivnost AChE vpliva tudi velikost oz. razvojno stanje osebkov v raziskavi (Domingues in sod., 2010). Manjšim, juvenilnim osebkom Gammarus fossarum so izmerili značilno višjo aktivnost kot odraslim (Xuereb in sod., 2009a). Ribeiro in sod. (1999) pa nasprotno poročajo, da imajo juvenilni osebki enakonožnega raka Porcelio dilatatus značilno nižjo aktivnost od odraslih. V morski školjki Macoma balthica aktivnost AChE korelira z maso noge (Leinio in sod., 2005). Tako Xuereb in sod. (2009a) kot tudi Ribeiro in sod. (1999) in Forget in sod. (2003), niso ugotovili vpliva spola na aktivnost AChE (delo na G. fossarum, P. dilatatus in Tigriopus brevicornis). 10

24 V mnogih primerih je povišanje temperature v okolju povezano z letnim časom, zato navajamo podatke o vplivu letnega časa in temperature skupaj. Pri vrsti Eurytemora affinis, ceponožcu ki živi v estuarijih, je imela temperatura vode v manjši meri vpliv na aktivnost AChE (Cailleaud in sod., 2006). Menezes in sod. (2006) pri kozici Crangon crangon poročajo o značilnem vplivu temperature na aktivnost AChE, ki je bila pri 9 ºC nižja, kot pri višjih temperaturah. Pri vrsti sladkovodne školjke Anodonta cygnea je nihanje aktivnosti AChE povezano z nihanjem temperature (Robillard in sod., 2003), podobno pa velja tudi za sladkovodno školjko Corbicula fluminea, kjer je nižja temperatura povzročila nižjo aktivnost propionilholinesteraze (Vidal in sod., 2002). Xuereb in sod. (2009a) vpliva temperature ali sezone na aktivnost AChE pri G. fossarum niso ugotovili. Medtem ko Cailleaud in sod. (2006) ugotavljajo vpliv slanosti pri E. affinis, ga Menezes in sod. (2006) pri C. crangon niso opazili. Robillard in sod. (2003) navajajo vpliv nihanja ph pri A. cygnea. Vidal in sod. (2002) poročajo, da je padec aktivnosti propionilholinesteraze pri C. fluminea povzročila odsotnost peska v substratu. Poleg abiotskih dejavnikov študije poročajo o tem, da na AChE vplivajo tudi onesnaževala. O'Neill in sod. (2004) poročajo o upadu aktivnosti holinesteraz v A. aquaticus na lokacijah dolvodno od pritoka odpadnih vod iz čistilne naprave. G. fossarum, izpostavljeni klorpirifosu in metomilu, so imeli nižjo aktivnost AChE, kar je povzročilo zmanjšanje njihovega hranjenja ter premikanja, čeprav ti dve snovi inhibirata AChE na različen način (Xuereb in sod., 2009b). Podobno poročajo Jensen in sod. (1997), ki so hrošče Pterostichus cupreus izpostavili insekticidu dimetoatu; po izpostavljenosti se jim je znižala aktivnost AChE, s čimer je koreliralo zmanjšanje lokomotorne aktivnosti. Stanek in sod. (2003) poročajo o nižjih aktivnostih AChE pri izopodnih rakih Porcellionides pruinosus, ki so bili izpostavljeni diazinonu. Vendar onesnažila ne vplivajo na vse živali enako Jemec in sod. (2007) navajajo, da izpostavljenost diazinonu, Cr 6+ in Cd 2+ ne povzroči znižanja aktivnosti AChE v D. magna. Day in sod. (1990) so testirali vpliv pesticidov azinfosmetila, fenitrotiona in klorpirifosa. Različne vrste vodnih nevretenčarjev so se razlikovale v odzivu na pesticide. Na prva dva pesticida se živali večinoma niso odzvale z zmanjšanjem aktivnosti AChE, z izjemo postranice Hyalella azteca, kateri je po 24-urni izpostavitvi aktivnost padla za 55%. Odziv na klorpirifos je bilo % zmanjšanje pri vrbnici Claassenia sp., vendar pri koncentracijah, ki so bile že blizu letalnim. Izsledki njihovih raziskav so bili, da uporabljeni pesticidi niso toksični pri običajno uporabljenih koncentracijah ali, da se aktivnost AChE ne zmanjša pri subletalnih koncentracijah pesticidov. Na aktivnost AChE lahko vpliva vrsta okoljskih dejavnikov, a kaže, da so ti vplivi lahko zelo vrstno specifični. 11

25 2.5.2 Vplivi na aktivnost GST Tudi encimi GST so podvrženi različnim okoljskim dejavnikom, razumevanje katerih je ključnega pomena za pravilno interpretacijo izmerjenih vrednosti GST v organizmih. Aktivnost GST je neposredno povezana z metabolno aktivnostjo organizma, ker reaktivne kisikove spojine (angl. reactive oxygen species, ROS) nastajajo kot stranski produkt v elektronski transportni verigi v mitohondrijih. Tako višja temperatura ali pa višja količina kisika povzroči nastanek več ROS, zaradi česar lahko pričakujemo višjo aktivnost GST (Lushchak, 2011). Zgoraj omenjeni Berra in sod. (2004) so tudi za aktivnost GST ugotovili razlike med taksoni znotraj sezone. Dierickx (1984) navaja aktivnosti GST za 20 vrst vodnih nevretenčarjev v različnih razvojnih fazah, med njimi tudi za odrasle A. aquaticus. Navaja tudi do 6-kratne razlike v encimskih aktivnostih med taksoni. Olsen in sod. (2001) poročajo o variabilnosti znotraj vrste pri larvah Chironomus riparius tudi za GST. Živalim, vzorčenim na različnih lokacijah, so izmerili značilno različne aktivnosti GST, kljub temu da so bile lokacije neonesnažene in niso zaznali povezave z izmerjenimi fizikalno-kemijskimi parametri. Med vrstami postranic Pallasea cancelloides, Eulimnogammarus verrucosus in Gammarus lacustris so bile majhne razlike v aktivnosti GST, značilne razlike glede na velikostni razred živali pa ni bilo (Timofeyev, 2006). Berra in sod. (2004) navajajo sezonska nihanja, ki se med različnimi taksoni nevretenčarjev razlikujejo. Cailleaud in sod. (2006) pri zgoraj omenjenem ceponožcu E. affinis poročajo o majhnem vplivu temperature ter o vplivu slanosti na aktivnost GST. Užitna klapavica, Mytilus galloprovincialis, kaže sezonsko nihanje aktivnosti GST, vendar ta ni statistično značilna zaradi velike variance (Bocchetti in sod., 2006). Menezes in sod. (2006) ne poročajo o značilnih učinkih temperature na aktivnost GST pri kozici C. crangon. Cailleaud in sod. (2006) za ceponožnega raka vrste E. affinis, ki živi v estuarijih, poročajo o vplivu slanosti. Menezes in sod. (2006) pa ne navajajo vpliva slanosti ali transporta živali na aktivnost GST pri kozici C. crangon. Pri morski školjki Mytilus edulis na aktivnost GST vpliva predvsem Secchi-jeva globina, pri M. balthica pa predvsem nasičenost vode na dnu s kisikom, na biomarkerje obeh vrst pa verjetno vpliva tudi variabilnost temperature in razpoložljivost hrane (Leinio in Lehtonen, 2005). Vpliv na aktivnost GST imajo lahko tudi onesnažila, vendar je ta odvisen od vrste snovi in njene koncentracije. Testi inhibicije z različnimi ksenobiotiki kažejo na različno kapaciteto kemikalij za inhibicijo GST (od največje do najmanjše kapacitete za inhibicijo: o-kloranil > kinoni > klorofenoksialkilne kisline) (Dierickx, 1984). Jemec in sod. (2008) poročajo, da nanodelci titanovega dioksida zmanjšajo aktivnost GST v enakonožnem raku P. scaber, vendar niso odkrili jasnega odnosa med odmerkom in odzivom. Drobne in sod. (2008) poročajo, da v določenih koncentracijah imidakloprid inducira aktivnost GST pri juvenilnih 12

26 osebkih P. scaber in jo inhibira pri odraslih. V navadni rakovici, Carcinus maenas izpostavljenost pesticidu cipermetrinu inducira povišanje aktivnosti GST, ki pade na bazalno raven po 36 urah (Gowland in sod., 2002). Jemec in sod. (2007) pri D. magna, izpostavljeni diazinonu ter ionom Cr 6+ in Cd 2+, niso zaznali učinka na aktivnost GST. Na aktivnost GST vplivajo številni okoljski dejavniki, katerih vpliv je v večini primerov odvisen od vrste. Na splošno kaže, da ima lahko vpliv temperatura, vendar lahko vplivajo tudi drugi naravni in antropogeni okoljski dejavniki Vplivi na količino založnih snovi Poraba energetskih sredstev organizma je dinamičen fiziološki proces, ki je odvisen od vrste (Sanchez-Paz, 2006), okoljskih pogojev (Verslycke in sod., 2002; Ribeiro in sod., 2001) in življenjskega cikla organizma (Nogueira in sod., 2004). Po hipotezi metabolic cost izpostavljenost okoljskemu stresu povzroči spremembe v metabolizmu, ki povzročijo večjo porabo založnih snovi. Manjša količina založnih snovi se lahko odraža v manjši rasti organizma in manjšem številu potomcev (Calow in Sibly, 1990; de Coen in Janssen, 1997). Razmnoževanje in rast sta odvisna od prehranskih razmer in se med stradanjem živali lahko ustavita (Nogueira in sod., 2004). Razlike med laboratorijskimi in poskusi v naravi kažejo, da je količina založnih snovi v živali pogojena z okoljskimi dejavniki v večji meri kot z onesnaževali (Smolders in sod., 2004). Meritve založnih snovi so tako lahko biomarker fitnesa živali, vendar zelo nespecifičen, saj lahko stres povzroča veliko dejavnikov (De Coen in Janssen, 1997). Postranice vrste Gammarus roeseli imajo najvišjo vsebnost lipidov in proteinov pozimi in najmanjšo poleti (Sroda in Cossu-Leguille, 2011). Tudi Gismondi in sod. (2012) za vrsto G. roeseli ugotavljajo enak trend za lipide in glikogen najvišje nivoje založnih snovi so izmerili jeseni in pozimi ter najnižji nivo spomladi in poleti. Sezonsko variabilnost razlagajo z razpoložljivostjo hrane ter razmnoževanjem v povezavi s temperaturo jeseni imajo postranice največ hrane zaradi odpadanja listov, spomladi in poleti pa mobilizirajo založne snovi za razmnoževanje (Gismondi in sod., 2012; Sroda in Cossu-Leguille, 2011). Dutra in sod. (2007) so proučevali sezonsko variabilnost založnih snovi pri dveh simpatričnih vrstah postranic v Braziliji, Hyalella pleoacuta in H. castroi. Njihove meritve kažejo, da količina založnih snovi v teh dveh vrstah prav tako niha glede na okoljske dejavnike kot so temperatura vode, količina kisika in razpoložljivost hrane. Med vrstama so bile prisotne razlike v založnih snoveh, razlikoval se je tudi vzorec sezonskega nihanja, ki je verjetno povezan z ekološko nišo vrste. Tako Sroda in Cossu-Leguille (2011) kot tudi Gismondi in sod. (2012) in Dutra in sod. (2007) ugotavljajo, da imajo samice postranic višjo količino založnih snovi kot samci. Charron in sod. (2014) navajajo vpliv spola in življenjskega cikla na količino založnih snovi pri G. fossarum. Poročajo, da je pri samcih količina vseh treh založnih snovi (lipidov, ogljikovih 13

27 hidratov, proteinov) stabilnejša, kot pri samicah. Pri slednjih niha glede na cikel levitve, največ založnih snovi pa nakopičijo pred levitvijo oz. potencialno oploditvijo. Razmnoževanje ima vpliv na količino založnih snovi, saj je lahko energetsko potratno. Plaistow in sod. (2003) za postranico Gammarus pulex poročajo, da je količina založnih snovi (lipidov in glikogena) v samcih odvisna od tega ali so v prekopuli ali sami. Samci v prekopuli so namreč imeli značilno višje količine lipidov in glikogena, kot samci, ki niso bili v prekopuli. Razliko razlagajo z domnevo, da samci z manj založnimi snovmi ne morejo trošiti energije za prenašanje samice. Možno je, da imajo nekateri samci nižjo količino založnih snovi, ker so jih potrošili med predhodnim razmnoževanjem. Sparkes in sod. (1996) so primerjali količino založnih snovi (glikogena in lipidov) samcev enakonožnih rakov vrste Lirceus fontinalis pred parjenjem in takoj po parjenju. Poročajo, da so imeli samci tik po parjenju nižjo količino glikogena od samcev, ki se niso parili. Ugotovili so tudi, da je nižja raven glikogena verjetno posledica stradanja med prekopulo. Jormalainen in sod. (2001) navajajo, da imajo samice enakonožnega raka Idotea baltica, ki se upirajo samcu pri zgodnjem tvorjenju prekopule, nižjo količino glikogena in proizvedejo manjša jajca kot samice, ki niso v prekopuli prezgodaj. Dutra in sod. (2007) poročajo, da postranici H. pleoacuta in H. castroi porabljajo založne snovi glede na cikel razmnoževanja; v reproduktivni sezoni samice porabijo energijo za skrb za zarod in samci za reproduktivno vedenje. Tako Sroda in Cossu-Leguille (2011) kot tudi Gismondi in sod. (2012) in Dutra in sod. (2007) navajajo vpliv razmnoževanja na količino založnih snovi v živali. Domnevno živali, ki so izpostavljene onesnaženemu okolju, porabijo veliko energije za izogibanje onesnaževalom, za izločanje in/ali razstrupljanje onesnaževala ali za popravilo patoloških učinkov, namesto da bi jo vlagale v rast in razmnoževanje (Forbes in Calow, 1996). Ribeiro in sod. (2001) poročajo, da imajo enakonožni raki Porcellio dilatatus, izpostavljeni parationu, nižjo količino lipidov, glikogena in proteinov, medtem ko imajo živali izpostavljene endosulfanu nižje količine lipidov in glikogena, vendar enako količino proteinov. Enakonožni raki Porcellio scaber, izpostavljeni dianizonu, so imeli nižjo količino proteinov, medtem ko količina lipidov in glikogena ni padla (Stanek in sod., 2006). Ob izpostavljenosti kozic vrečark Neomysis integer pesticidu klorpirifos, se jim zniža količina založnih snovi (Verslycke in sod., 2004). Izpostavljenost vodne bolhe Daphnia magna subletalnim koncentracijam stupenih snovi lindana in živosrebrovega klorida rezultira v nižjih količinah založnih snovi (De Coen in Janssen, 1997). Količina založnih snovi v živalih lahko niha glede na letni čas (ki vpliva na količino hrane, temperaturo), endogene dejavnike (spol, levitev, razmnoževanje) ali človeške dejavnike (onesnažila). Vplivi se lahko razlikujejo glede na proučevano vrsto. 14

28 3 MATERIAL IN METODE V tem poglavju opisujemo lokacije, na katerih smo vzorčili vodne osličke, način vzorčenja, postopke, ki smo jih uporabljali v laboratoriju in obdelavo pridobljenih podatkov. 3.1 LOKACIJE Rake za kvantifikacijo encimske aktivnosti in založnih snovi smo vzorčili na štirih lokacijah. Tri lokacije na Notranjskem smo izbrali zaradi kraškega značaja pokrajine, kjer je habitat tako površinskih populacij kot podzemne podvrste vodnega oslička, A. aquaticus cavernicolus (Prevorčnik in sod., 2004). Nahajajo se vzdolž reke Pivke, ki ponikne v Postojnsko jamo in skozi podzemne sifone priteče v Planinsko jamo, v kateri je njeno sotočje z Rakom. Naprej tečeta podzemno kot Unica, po izviru na vhodu Planinske jame pa površinsko po Planinskem polju. Četrta lokacija se nahaja v močvirju na robu Ljubljane in služi kot referenčna lokacija. Prikaz lokacij je viden na Sliki 2. Slika 2: Zemljevid lokacij vzorčenja vodnega oslička. Na shematskem zemljevidu Slovenije je označena Ljubljana in pravokotnik, ki označuje povečan digitalni model reliefa od Postojne do Jakovice (prirejeno po Atlasu voda, ARSO). 15

29 3.1.1 Opis lokacij Prva lokacija (Slika 3) je površinski odsek reke Pivke v Postojni, približno 150 m JV od vhoda Postojnske jame, ob parku (GK koordinate; Y , X ). Desna stran struge, kjer smo vzorčili, je urejena s zidanim kamnitim zidom s stopnicami. Na bregu raste več vrst dreves, med njimi vrbe (Salix sp.) in javori (Acer sp.). Vodni tok na tej lokaciji je bil v času vzorčenja počasen, velikega nihanja vodne gladine nismo opazili. Vodne osličke smo vzorčili predvsem desno od stopnic, ki so vidne na Sliki 3, kjer je bilo na dnu največ organskega materiala. Slika 3: Lokacija vzorčenja vodnega oslička v reki Pivki, 150 m JV od vhoda v Postojnsko jamo. Foto: D. Škufca. 16

30 Druga lokacija se nahaja v Pivškem rokavu v Planinski jami (Slika 4) (GK koordinate vhoda Planinske jame: Y , X ). Vzorčili smo v kraku podzemeljske Pivke, napolnjenem z vodo, kjer je vodni tok le ob višjem vodostaju. Med našim vzorčenjem toka na tem mestu nismo opazili, vendar je bila voda vedno prisotna. Dno je bilo kamnito in peščeno, grobega organskega materiala je bilo malo. Slika 4: Vhod v Planinsko jamo, iz katere teče Unica (zgoraj, Foto: D. Škufca.) in lokacija vzorčenja Asellus aquaticus cavernicolus v Planinski jami (spodaj, Foto: P. Zidar.). 17

31 Tretja lokacija (Slika 5) je bila v površinski Unici, približno 850 m SZ od Jakovice (GK koordinate: Y , X ). Struga reke ni regulirana, vodostaj močno sezonsko niha. V pomladnem času je bil prisoten vodni tok, poleti pa so ostali le večji in manjši bazeni vode. Jeseni je bil vodostaj nekoliko višji kot poleti. Struga je gosto porasla z vodnim rastlinjem, na bregovih rastejo grmičevje in vrbe (Salix sp.). Slika 5: Lokacija vzorčenja vodnega oslička v strugi Unice, 850 m SZ od Jakovice na Planinskem polju. Foto: D. Škufca. 18

32 Četrta lokacija (Slika 6) je bila v močvirnatem gozdu poleg Oddelka za biologijo v Ljubljani (GK koordinate: Y , X ). Spomladi in jeseni je bila tu stoječa voda, poleti pa je močvirje presahnilo. Po dnu je bila velika količina odmrlega organskega materiala bližnje vegetacije. Večina dreves so črne jelše (Alnus glutinosa), ki v vegetacijski sezoni zasenčijo vodo s svojimi krošnjami. Poleg tega v vodi rastejo šopi helofitov. Slika 6: Lokacija vzorčenja vodnega oslička v močvirnatem gozdu 100 m SZ od Oddelka za biologijo v Ljubljani Opis vzorčenja Živali smo vzorčili v treh letnih časih (v oklepajih datumi vzorčenja): spomladi ( ), poleti ( in ) in jeseni ( in ). Pri vsakem vzorčenju smo na vsaki lokaciji povzorčili po osebkov, odvisno od njihove številčnosti. Vodne osličke smo vzorčili s selektivnim vzorčenjem z vodno mrežo in sicer tako, da smo z njo v vodi zamahovali v obliki osmic (oz. znaka za neskončnost). Pri zamahovanju smo pazili, da je bilo ustje mrežice vedno pravokotno na dno ter da je bila ravnina ustja vedno pravokotna na smer gibanja. Prav tako smo bili pozorni, da nismo zamahovali premočno ali prenežno in po gladini, pri čemer se dna nismo dotikali, saj bi s tem zajeli preveč mulja. Na posameznem mestu smo naredili 3 5 zamahov, potem smo se premaknili na naslednje 19

33 mesto. Vzorčili smo tudi tam, kjer so bile v vodi rastline, saj se tudi na njih zadržujejo živali. Vzorec smo nato očistili rastlinskega materiala in mulja. Mrežo smo pomočili v vodo, v njej z delov rastlin sprali živali in potem rastline zavrgli. Mulj smo sprali s potegi mrežice po vodni gladini. Vzorec smo nato skoncentrirali na dnu mrežice (z roko mečemo vodo in spiramo vzorec na dno ali pa mrežo tapkamo po gladini vode). Dno mrežice smo zgrabili z roko in jo izvihali v banjico z vodo, kjer smo vzorec dodatno očistili ter iz vzorca s pinceto, kapalko ali žličko pobrali odrasle primerne živali. Ob ugodnih razmerah, tj. čisti vodi s šibkim tokom ali brez toka, smo živali lovili tudi direktno s kapalko ali plastično žličko. Zelo majhne živali (manj kot cca. 3 mm) in ovigere samice smo spustili nazaj v vodo in jih nismo zajeli v raziskavah. Izbrane vodne osličke smo prestavili v banjico s čisto pitno vodo iz plastenke z nevtralnim ph, kjer smo z njih nežno sprali morebitne delce. Osebke smo nato prestavili v banjico s papirnatimi brisačami, kjer smo vsakega nežno osušili. To smo storili tako, da smo ga položili med dve plasti papirnatih brisač in nežno pritisnili ob osebku, nikoli direktno nanj, da ga ne bi poškodovali. Tako je papirnata brisača posesala preostanek vode, ki bi sicer motil meritve sveže mase osebkov. Osušene osebke smo posamič prestavili v plastično mikrocentrifugirko s pokrovčkom in jo postavili v suhi led, ki sublimira pri temperaturi - 78,5 C. S tem smo žival usmrtili in preprečili nadaljnje celične procese, ki bi vplivali na merjene biomarkerje. Živali smo shranili na suhem ledu do prihoda na Oddelek za biologijo, kjer smo jih do obdelave shranili v zmrzovalniku pri -20 C. Pred tem smo na posameznih lokacijah ob vsakem vzorčenju z multimetrom izmerili osnovne fizikalne in kemijske parametre kvalitete vode (temperaturo, ph, koncentracijo kisika in nasičenost s kisikom, prevodnost). Na vsaki lokaciji smo prav tako vzeli vzorec vode za meritve vsebnosti skupne organske snovi (angl. total organic carbon; TOC). Vzorec vode je bil sestavljen iz treh podvzorcev po 0,5 l. Vzorce vode smo vzeli pred vzorčenjem z vodno mrežo, saj bi sicer na lokacijah brez toka ali s šibkim tokom v vodni stolpec dvignili mulj in organske delce, ki bi motili meritve. Vodo smo zajeli v plastenke z gladine tako, da ni prišlo do tvorjenja mehurčkov. Plastenke smo zaprli pod gladino vode, da v njih ni bilo zraka. Plastenke smo hranili v hladilni torbi s suhim ledom. Po prihodu na Oddelek za biologijo smo plastenke z vodnim vzorcem zamrznili in do obdelave hranili pri -20 C. 20

34 3.2 LABORATORIJSKO DELO Meritve izbranih biomarkerjev smo izvedli na Oddelku za biologijo. Meritve parametrov vodnih vzorcev so bile izvedene na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Priprava živali za meritve Osebke smo pred obdelavo odtajali. Med postopkom priprave vzorcev so bili osebki shranjeni na ledu, da bi preprečili razkroj. Najprej smo izmerili njihovo svežo maso na tehtnici Sartorius MC 210 P. Osebkom iz poletnega in jesenskega vzorčevalnega obdobja smo določili tudi spol. To smo storili glede na obliko I. in II. para pleopodov, s pregledom vsakega osebka pod stereolupo. Na posamezen dan laboratorijskega dela smo v postopkih, opisanih v prihodnjih podpoglavjih, obdelali po 20 osebkov, po 5 s posamezne lokacije. S tem smo preprečili vpliv morebitnih napak znotraj posameznega dneva laboratorijskega dela na vse osebke iz posamezne lokacije. Za vsako vzorčevalno obdobje smo na lokacijo uporabili po 15 osebkov za meritve aktivnosti AChE in GST ter meritve vsebnosti proteinov in po 15 osebkov za meritve vsebnosti lipidov in ogljikovih hidratov. Meritve sveže mase smo tako izvedli na po 30 osebkih iz posamezne lokacije na vzorčevalno obdobje Priprava supernatanta za merjenje encimske aktivnosti in vsebnosti proteinov Priprava kalij fosfatnega pufra (K-P pufer) K-P pufer smo pripravili z mešanjem 50 mm raztopin K2HPO4 (Sigma) in KH2PO4 (Sigma). Med mešanjem smo merili ph in bazi (raztopini K2HPO4) dodajali kislino (raztopino KH2PO4), dokler nismo dosegli ph 7. Pufer smo prefiltrirali (filter z velikostjo por 200 µm) in shranili v hladilniku do uporabe. Pred uporabo smo dodali detergent Triton (Sigma), in sicer v koncentraciji 0.5% v/v Priprava homogenata Odtajane osebke (N = 20) smo homogenizirali v steklenih epruvetah z homogenizatorjem ULTRA-TURRAX IKA T10 basic v 800 μl 50 mm K-P pufra (ph 7), ki je vseboval 0.5% v/v detergenta Triton (Sigma). Homogenizirali smo 40 sekund na 5. stopnji jakosti, tako da smo epruveto rahlo premikali navzgor in navzdol, vendar je bila konica homogenizatorja vedno potopljena. Med homogenizacijo je bila steklena epruveta potopljena v ledeno kopel, da smo preprečili segrevanje homogenata. Med posameznimi vzorci smo homogenizator dobro sprali z deionizirano vodo (dh2o) in ga obrisali. Po koncu homogeniziranja smo homogenizator dvakrat sprali z dh2o in zatem še s 40% etanolom (EtOH). 21

35 Priprava supernatanta Homogenat smo prenesli v mikrocentrifugirke in ga 15 min centrifugirali na g pri 4 C. Dobljeni supernatant smo odpipetirali in ga uporabili kot vzorec za meritve aktivnosti AChE in GST ter meritve vsebnosti proteinov. Tako smo dobili podatek za vse tri parametre iz posameznega osebka. Vsi trije parametri so bili izmerjeni na isti dan. Supernatant smo do uporabe hranili na ledu Določanje aktivnosti AChE Aktivnost AChE smo določili po metodi Ellman in sod. (1961), prilagojeni za mikrotitrske plošče (Jemec in sod., 2007). Pri tej metodi smo za substrat uporabili acetiltioholinklorid (ATChCl, Sigma), ki so ga encimi acetilholinesteraze v homogenatu hidrolizirali v tioholin in acetat. Za obarvanje smo uporabili Ellmanov reagent, ki je raztopina 5,5-ditiobis-2- nitrobenzoata in natrijevega hidrogenkarbonata. Ta je reagiral s tioholinom, s čimer je nastal anion 5-tio-2-nitro-benzojske kisline, ki je rumene barve. Reakcija je dovolj hitra, da ni omejujoč faktor pri merjenju encimske aktivnosti, prav tako reagenti v uporabljenih koncentracijah ne inhibirajo encimske hidrolize (Ellman in sod., 1961) Ellmanov reagent Za pripravo 1 L Ellmanovega reagenta smo odtehtali 91 mg 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoata (Sigma) in 37.5 mg natrijevega hidrogenkarbonata (Sigma), dodali 100 ml 250 mm K-P pufra in dolili dh2o do oznake 1 l ter raztopili kemikalije z stresanjem. Ellmanov reagent smo do uporabe shranili v stekleni posodi, oviti v aluminijevo folijo (zaradi zaščite pred svetlobo), v hladilniku Raztopina ATChCl (1M) Pripravili smo 1 M raztopino acetiltioholinklorida (ATChCl) tako, da smo v 1 ml sterilizirane bideionizirane H2O raztopili mg ATChCl. Po 25 μl raztopine smo odpipetirali v posamezne mikrocentrifugirke in jih zamrznili. Tako smo imeli na razpolago odmerke za enkratno uporabo Meritev aktivnosti AChE Pripravili smo Ellmanov reagent in substrat; zmešali smo 10 ml Ellmanovega reagenta in 20 μl 1M ATChCl ter mešanico prestavili v banjico za multikanalno pipeto, ki smo jo do uporabe pokrili z aluminijasto folijo. Delali smo po naslednjem zaporedju: 50 μl vzorca smo v treh paralelkah nanesli na mikrotitrsko ploščo, dodali 50 μl K-P pufra in 100 μl Ellmanovega reagenta z ATChCl. Pomagali smo si z multikanalno pipeto, saj se z zadnjim korakom prične reakcija med encimom in substratom. Po dodatku Ellmanovega reagenta z ATChCl smo takoj pričeli z meritvijo na čitalcu mikrotitrskih plošč Anthos Zenyth Za 22

36 slepi poskus je bil namesto homogenata uporabljen K-P pufer z 0.5% v/v Triton detergenta (Sigma). Absorbanco smo merili 5 minut pri valovni dolžini 405 nm, v 30 sekundnih intervalih Določanje aktivnosti GST Aktivnost GST smo določili po metodi Habig in sod. (1974), prilagojeni za mikrotitrske plošče. Za substrat smo uporabili 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB), katerega so izoencimi GST konjugirali z reduciranim glutationom v dinitrofenil-tioeter. CDNB smo uporabili kot substrat, ker ga Habig in sod. (1974) navajajo kot aromatski substrat, ki ga konjugirajo vsi encimi, ki so jih testirali, četudi so imeli različni encimi GST različno afiniteto do njega Priprava raztopine 1-kloro-2,4-dinitrobenzena (CDNB) Zatehtali smo 10 mg kristalov 1-kloro-2,4-dinitrobenzena (Sigma) in jih raztopili v 1 ml 96% EtOH. Da se je ves CDNB raztopil, smo raztopimo vsaj 1 minuto stresali. Zatem smo raztopino 12.5-krat razredčili z dh2o, da smo dobili 50 mm raztopino CDNB. Sveža raztopina je bila vsakič pripravljena tik pred poskusom Priprava raztopine reduciranega glutationa (GSH) Natehtali smo 12.3 mg GSH (Sigma) v 1 ml K-P pufra in nato z K-P pufrom razredčili 10- krat, da smo dobili 50 mm raztopino GSH. Sveža raztopina je bila vsakič pripravljena tik pred poskusom Meritev aktivnosti GST Delali smo po naslednjem zaporedju: 50 μl vzorca smo v treh paralelkah nanesli na mikrotitrsko ploščo, dodali 50 μl K-P pufra, 50 μl raztopine CDNB in 50 μl raztopine GSH. Pomagali smo si z multikanalno pipeto, saj se z zadnjim korakom prične reakcija med encimom in substratom. Po dodatku raztopine GSH smo takoj pričeli z meritvijo na čitalcu mikrotitrskih plošč Anthos Zenyth Za slepi poskus je bil namesto homogenata uporabljen K-P pufer z 0.5% v/v Triton detergenta. Absorbanco smo merili 3 minute pri valovni dolžini 340 nm v 30-sekundnih intervalih Določanje količine proteinov Supernatant, ki smo ga uporabili tudi za kvantifikacijo encimske aktivnosti, smo uporabili tudi za kvantifikacijo vsebnosti proteinov. Uporabili smo metodo z reagenti BCA Protein Assay (Pierce). Količino proteinov v supernatantu smo določili z umeritveno krivuljo, ki smo jo preračunali iz absorpcije standardov z znano koncentracijo proteinov. 23

37 Priprava standardov Za pripravo standardov smo uporabili založno raztopino govejega serumskega albumina (BSA, Sigma). Iz založne raztopine z 200 mg/ml BSA smo z redčenjem z dh2o pripravili standarde z 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25, in 0 mg/ml BSA. Absorbanco standardov smo, enako kot tisto od vzorcev, izmerili v treh paralelkah Meritev količine proteinov V treh paralelkah smo 20 μl supernatanta nanesli na mikrotitrsko ploščo in dodali 200 μl mešanice reagentov A in B Pierce BCA Protein Assay (Pierce). Reagent A in B sta bila zmešana v razmerju 50:1, glede na navodila proizvajalca. Mikrotitrska plošča z vzorci je bila inkubirana 30 minut na 37 C. Za slepi poskus je bila uporabljena dh2o. Absorbanco smo izmerili pri 562 nm valovne dolžine na čitalcu mikrotitrskih plošč BioTek CYTATION Priprava homogenata za določanje količine lipidov in količine ogljikovih hidratov Za določanje količine lipidov in količine ogljikovih hidratov smo osebke (N = 20) homogenizirali z ULTRA-TURRAX IKA T10 basic v 800 μl dh2o v steklenih epruvetah. Homogenizirali smo 40 sekund na 5. stopnji jakosti, tako da smo epruveto rahlo premikali navzgor in navzdol, vendar je bila konica homogenizatorja vedno potopljena. Med homogenizacijo je bila steklena epruveta potopljena v ledeno kopel, da smo preprečili segrevanje homogenata. Med posameznimi vzorci smo homogenizator dobro sprali z dh2o in ga obrisali. Po koncu homogeniziranja smo homogenizator dvakrat sprali z dh2o in zatem še s 40% EtOH. Homogenat, ki smo ga s tem dobili, smo uporabili za določanje količine lipidov in količine ogljikovih hidratov v osebkih. Tako smo za posamezen osebek dobili podatek o količini lipidov in ogljikovih hidratov. Homogenat smo za oba poskusa uporabili v roku treh dni in je bil med poskusoma shranjen na -20 C Določanje količine lipidov Lipide smo iz osebkov ekstrahirali po metodi Bligh in Dyer (1959), meritev pa smo izvedli po metodi Ferreira in sod. (2010). Količino lipidov smo določali glede na umeritveno krivuljo standardov z znanimi koncentracijami lipidov Priprava standardov Za pripravo standardov smo uporabili glicerol tripalmitat (Sigma) v prahu, ki smo ga raztopili v kloroformu. Najprej smo pripravili založno raztopino z 3.2 mg/ml glicerol tripalmitata, iz katere smo pripravili standarde z 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 in 0 mg/ml glicerol tripalmitata v kloroformu. 24

38 Meritev količine lipidov 300 μl homogenata smo dodali 500 μl kloroforma (Merck) in 500 μl metanola (Merck). Suspenzijo smo stresali 1.5 minute, nato smo dodali 250 μl dh2o in ponovno stresali 1.5 minute. Mešanico smo centrifugirali 10 minut pri 1000 g in odpipetirali 100 μl kloroformove faze z ekstrahiranimi lipidi v stekleno epruveto, dodali 500 μl H2SO4 (Merck) ter 15 minut inkubirali na 200 C. Zatem smo epruvete preložili v stojalo, počakali da so se ohladile in dodali 500 μl dh2o. Po stresanju in ponovni ohladitvi smo po 200 μl odpipetirali na mikrotitrsko ploščo. Enak postopek smo izvedli za standarde in slepe poskuse. Za slep poskus smo namesto homogenata uporabili enako količino dh2o. Absorbanco smo izmerili pri 375 nm Določanje količine ogljikovih hidratov Količino ogljikovih hidratov smo določili po metodi Albalasmeh in sod. (2013), po kateri merimo absorbcijo furfurala (in njegovih derivatov), ki je stranski produkt hidrolize ogljikovih hidratov s koncentrirano žvepleno kislino. Temelji na metodi, ki so jo razvili DuBois in sod. (1956), le da so ti dodali fenol, ki je razvil barvo v reakciji s furfuralom. Z uporabo novejše metode smo sicer merili absorbanco v UV spektru, vendar smo se s tem izognili zdravstvenemu tveganju povezanim z uporabo fenola, hkrati pa je priprava vzorca za meritev hitrejša Priprava standardov Za pripravo standardov smo uporabili glukozo v prahu (Merck), ki smo jo raztopili v dh2o. Najprej smo pripravili založno raztopino z 1 mg/ml glukoze, iz katere smo pripravili standarde z 0.5, 0.25, 0.125, , , in 0 mg/ml glukoze Meritev količine ogljikovih hidratov 300 μl homogenata smo dodali 100 μl 15% trikloroocetne kisline (Sigma), stresali in inkubirali 10 min na -20 C. Mešanico smo centrifugirali 10 minut na 1000 g in supernatant uporabili v nadaljevanju postopka. Vzeli smo 300 μl supernatanta in ga dvakrat razredčili s dh2o. V nadaljevanju smo delali v treh paralelkah. 150 μl vzorca smo odpipetirali v epruveto za razklop in v sredino vzorca na hitro dodali 450 μl H2SO4. Mešanico smo stresali in ohladili. Enak postopek smo izvedli za standarde in slepe poskuse. Za slepi poskus smo namesto homogenata uporabili enako količino dh2o. Na mikrotitrsko ploščo smo napipetirali po 200 μl in izmerili absorbanco pri 315 nm valovne dolžine. Za pripravo standardov je bila pripravljena raztopina glukoze v dh2o. Absorbanco smo izmerili pri 315 nm. 25

39 3.3 ANALIZA PODATKOV V nadaljevanju opisujemo postopke, s katerimi smo kvantificirali meritve biomarkerjev in podatke statistično obdelali Kvantifikacija meritev biomarkerjev Kvantifikacija aktivnosti AChE Za izračun aktivnosti AChE smo izračunali razliko v absorbanci med 4. in 3. minuto merjenja, ko je bila kinetika encimske reakcija linearna. Razliko v koncentraciji smo izračunali glede na Lambert-Beerov zakon, ki pravi, da je absorbanca premo sorazmerna s koncentracijo snovi v raztopini, dolžino optične poti in ekstinkcijskim koeficientom. Slednji za anion 5-tio-2-nitro-benzojske kisline pri svetlobi z valovno dolžino 412 nm znaša cm -1 M -1 (Ellman in sod., 1961). Encimsko aktivnost smo izrazili kot specifično aktivnost encima (v nmol produkta na mg proteina v vzorcu na minuto) Kvantifikacija aktivnosti GST Za izračun aktivnosti GST smo izračunali razliko v absorbanci med 90. in 150. sekundo merjenja, ko je bila kinetika encimske reakcija linearna. Razliko v koncentraciji smo izračunali glede na Lambert-Beerov zakon, ki pravi, da je absorbanca premo sorazmerna s koncentracijo snovi v raztopini, dolžino optične poti in ekstinkcijskim koeficientom. Slednji za dinitrofenil-tioeter pri svetlobi z valovno dolžino 340 nm znaša 9600 cm -1 M -1 (Habig in sod., 1961). Encimsko aktivnost smo izrazili kot specifično aktivnost encima (v nmol produkta na mg proteina v vzorcu na minuto) Kvantifikacija količine proteinov Iz izmerjenih standardov smo izračunali enačbo umeritvene krivulje. Iz dobljene enačbe smo nato preračunali količino proteinov v supernatantu. Količino proteinov smo uporabili za izražanje specifične aktivnosti encimov, prav tako smo izrazili njihovo vsebnost na svežo maso osebkov Kvantifikacija količine lipidov Iz izmerjenih standardov smo izračunali enačbo umeritvene krivulje. Iz dobljene enačbe smo nato preračunali količino lipidov v homogenatu. Količino lipidov smo izrazili na svežo maso osebkov. 26

40 Kvantifikacija količine ogljikovih hidratov Iz izmerjenih standardov smo izračunali enačbo umeritvene krivulje. Iz dobljene enačbe smo nato preračunali količino ogljikovih hidratov v homogenatu. Količino ogljikovih hidratov smo izrazili na svežo maso osebkov Statistična obdelava podatkov Podatke smo statistično obdelali v programskem okolju R, verzija 3.1.2, (R Core Team, 2015) uporabili smo program R Studio (RStudio Team, 2015). Poleg temeljnih funkcij smo uporabili tudi pakete, ki so našteti spodaj. Ker podatki tudi po transformaciji niso ustrezali zahtevam parametričnih testov (predvsem normalni porazdelitvi podatkov in homogenosti variance skupin), smo se odločili za uporabo neparametričnih testov. Razlike med skupinami smo testirali s Kruskal-Wallisovim testom vsote rangov. Za testiranje le dveh skupin smo uporabili Mann Whitneyev test. Naknadne (post hoc) analize smo izvedli z Dunnovim testom multiplih primerjav, ki uporablja vsote rangov (Dunn, 1964), iz paketa»dunn.test«(dinno, 2016). Za statistično značilne razlike med skupinami podatkov smo označili tiste, katerih vrednost p je bila manjša od 0.05 (p < 0.05). Izbrana stopnja značilnosti je bila 5% (α = 0.05). Med obdelavo podatkov smo uporabili tudi naslednje pakete za R:»ggplot2«(Wickham, 2009),»plyr«(Wickham, 2011),»data.table«(Dowle in sod., 2015),»doBy«(Hojsgaard in Halekoh, 2015),»rJava«(Urbanek, 2016),»xlsx«(Dragulescu, 2014) in»hmisc«(harrell in sod., 2016) Grafikoni Grafikone smo izdelali s paketom»ggplot2«za R (Wickham, 2009). Za prikaz večine podatkov smo uporabili grafikon kvartilov (imenovani tudi»škatla z brki«ali angleško»box-and-whisker plot«). Spodnji in zgornji rob škatle pri tem tipu grafikona prikazujeta prvi in tretji kvartil, vodoravna odebeljena črta v škatli pa mediano (drugi kvartil). Navpične črte, ki se iztegujejo iz škatle (t.i. brki) zajemajo najnižjo oz. najvišjo vrednost, ki je še vedno znotraj 1.5 kvartilnega razmika spodnjega oz. zgornjega kvartila. Točke, ki jih brki ali škatla ne zajemajo, so osamelci in so prikazani s piko ( ). Tak tip grafikona kvartilov je znan tudi kot»tukey boxplot«(field in sod., 2012). 27

41 4 REZULTATI V nadaljevanju predstavljamo podatke, zbrane med terenskim in laboratorijskim delom na vodnih osličkih. Opisali bomo rezultate meritev fizikalnih in kemijskih parametrov vode, analizo vodnih vzorcev, števila in spolne sestave vzorčenih živali, njihovo svežo maso in vrednosti merjenih biomarkerjev: aktivnost AChE in GST ter količine založnih snovi lipidov, ogljikovih hidratov in proteinov. 4.1 FIZIKALNI IN KEMIJSKI PARAMETRI VODE V Preglednici 1 so prikazani rezultati merjenja fizikalnih in kemijskih parametrov vode, ki smo jih izmerili ob vzorčenju osebkov. Najvišjo temperaturo vode smo izmerili v Unici pri Jakovici (v Jakovici naprej v besedilu). Največji razliki v temperaturi vode sta bili v Jakovici in v Pivki v Postojni (v Postojni naprej v besedilu) ( T= 20.7 C). Najmanjše temperaturne razlike smo opazili v Pivki v Planinski jami (v Planinski jami naprej v besedilu). Za lokaliteto v Ljubljani imamo podatke le za pomlad in jesen, saj je poleti močvirje presahnilo. Koncentracija kisika v vodi je sicer nihala glede na lokacijo in čas vzorčenja, a najnižje vrednosti smo opazili v močvirju v Ljubljani, višje pa spomladi na ostalih treh lokacijah. Največji nasičenosti s O2 smo izmerili poleti v Jakovici in predvsem v Postojni, kjer je nasičenost znašala 137%. V Planinski jami je bil trend obraten, poleti je nasičenost s kisikom padla. Na splošno smo opazili najnižjo nasičenost s O2 v močvirju v Ljubljani. ph vode se je v času našega vzorčenja gibal med 7.25 in Poleti smo opazili, da je prišlo do rahlega dviga ph vrednosti. Vrednosti ph v Ljubljani so bile najnižje. Najvišjo vrednost smo izmerili poleti v Postojni (ph 8.48), sicer pa ph na lokacijah ni presegal vrednosti 8. Prevodnost vode se je gibala med 310 µs in 500 µs, a nismo ugotovili enotnega vzorca nihanja. V Postojni je prevodnost poleti narasla, medtem ko je na drugih dveh lokacijah padla. Na ostalih treh lokacijah smo najvišje vrednosti prevodnosti izmerili spomladi. Najvišje vrednosti celokupnega organskega ogljika (TOC) smo izmerili v vodah iz pomladnega vzorčenja. 28

42 Preglednica 1: Fizikalni in kemijski parametri vode v času vzorčenja na različnih lokacijah. Prikazani so temperatura (T), koncentracija kisika O 2, nasičenost s kisikom (O 2 sat), vrednost ph, prevodnost (C) in vrednost celokupnega organskega ogljika (TOC). lokacija datum T [ C] O 2 [mg/l] O 2 sat [%] ph C [µs] TOC [mg/l] Planinska jama Postojna Jakovica Ljubljana / SPOLNA SESTAVA VZORČENIH ŽIVALI Analizirali smo po 30 osebkov A. aquaticus na lokacijo v vsakem letnem času, razen poleti v Ljubljani, ker takrat živali ni bilo mogoče nabrati (Slika 6). Skupno smo tako analizirali 330 živali, od tega je bilo 60 samic, 147 samcev in 123 osebkov neznanega spola. Spomladi spola nismo določali, prav tako zaradi poškodb pri zmrzovanju nismo mogli določiti spola treh osebkov iz poletnega in jesenskega vzorčenja. Najmanj samic smo povzorčili v Planinski jami, skupno 3. Največ samic smo povzorčili v Postojni, sledita Jakovica in Ljubljana. Največ prekopul smo opazili spomladi, malo poleti in nobene jeseni. Ovigerih samic nismo vzorčili, a so bile prav tako najbolj številčne spomladi, poleti in jeseni pa smo jih opazili manj. Slika 7: Spolna sestava vodnih osličkov glede na letni čas in lokacijo vzorčenja. N = število osebkov. 29

43 4.3 SVEŽA MASA ŽIVALI Živali, ki smo jih vzorčili spomladi v Ljubljani, Planinski jami in Jakovici so se med seboj statistično značilno (Dunnov test, p < 0.05) razlikovale po sveži masi (Slika 8). Osebki iz Jakovice so imeli največjo svežo maso v tem vzorčenju in so se statistično značilno razlikovali od osebkov z ostalih treh lokacij. Značilnih razlike med svežo maso osebkov iz Planinske jame in Postojne ni bilo, prav tako ni bilo razlik med svežo maso osebkov iz Postojne in Ljubljane. V poletnem vzorčenju se je statistično značilno (Dunnov test, p < 0.05) razlikovala sveža masa osebkov iz Planinske jame in ostalih dveh lokacij, med katerima ni bilo značilnih razlik. Osebki iz Planinske jame so imeli največjo povprečno svežo maso. Podatkov za Ljubljano v tem obdobju nimamo, saj je močvirje na lokaliteti popolnoma presahnilo. Jeseni so imeli največjo povprečno svežo maso zopet osebki iz Planinske jame, hkrati pa so bile te vrednosti najbolj variabilne. Osebki iz Planinske jame so se statistično značilno (Dunnov test, p < 0.05) razlikovali od ostalih treh lokacij. Živali iz Jakovice so imele drugo največjo svežo maso, ki se je značilno razlikovala od ostalih treh lokacij. Med osebki iz Postojne in Ljubljane ni bilo značilnih razlik v sveži masi. Slika 8: Grafikoni kvartilov sveže mase vodnih osličkov na vzorčenih lokacijah, za tri letne čase. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci, različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05), N=30. 30

44 Sveže mase osebkov iz vsake lokacije so se statistično značilno (Dunnov test, p < 0.05) razlikovale glede na letni čas (Slika 9). Na vseh lokacijah je bila sveža masa osebkov največja spomladi, hkrati pa značilno različna od poletnega in jesenskega vzorčenja. Sveža masa jeseni vzorčenih osebkov iz Jakovice je bila značilno večja od tiste poleti. V Planinski jami in Postojni nismo zabeležili razlik med osebki poletnega in jesenskega vzorčenja. Slika 9: Grafikoni kvartilov sveže mase vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=30. 31

45 Analiza podatkov ločenih po spolu je pokazala le statistično značilno (Dunnov test, p < 0.05) razliko med svežo maso samcev in samic poletnega vzorčenja v Postojni (Slika 10). Poleti je bila v Planinski jami, nasprotno kot na drugih lokacijah, sveža masa samice med največjimi in je presegala maso večine samcev. V večini primerov so bile vrednosti sveže mase samcev nekoliko višje, vendar s statističnimi testi tega nismo mogli potrditi zaradi majhnega števila samic. Slika 10: Grafikoni kvartilov sveže mase samcev in samic vodnih osličkov v poletnem in jesenskem obdobju, za vzorčene lokacije. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=30. 32

46 4.4 AKTIVNOST AChE Če primerjamo rezultate aktivnosti AchE po letnih časih opazimo, da so bile aktivnosti jamskih živali iz Planinske jame statistično značilno nižje (Dunnov test, p < 0.05) od tistih pri površinskih v vseh treh letnih časih. Med površinskimi vodnimi oslički (iz Postojne, Jakovice in Ljubljane) znotraj letnih časov ni bilo značilnih razlik (Slika 11). Slika 11: Grafikoni kvartilov aktivnosti AChE vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 33

47 Jamskim osebkom iz Planinske jame in površinskim iz Postojne se tekom leta vrednosti aktivnosti AChE niso spreminjale statistično značilno (Dunnov test, p < 0.05). Varianca je bila v Postojni poleti večja kot v ostalih dveh obdobjih. Živali iz Jakovice ter Ljubljane so imele značilno nižjo specifično aktivnost AChE v pomladnem vzorčevalnem obdobju v primerjavi s poletnim in jesenskim (Slika 12). Slika 12: Grafikoni kvartilov aktivnosti AChE vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 34

48 Med spoloma vodnih osličkov znotraj lokacije in sezone ni bilo statistično značilnih (Dunnov test, p < 0.05) razlik v specifični aktivnosti AChE (Slika 13). Slika 13: Grafikoni kvartilov aktivnosti AChE samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 35

49 4.5 AKTIVNOST GST Če primerjamo aktivnosti GST med letnimi časi opazimo, da so bile aktivnosti jamskih živali iz Planinske jame statistično značilno nižje (Dunnov test, p < 0.05) od površinskih v vseh treh letnih časih, z izjemo Jakovice spomladi. Poleti med površinskima lokacijama ni bilo značilnih razlik. Jeseni je bila specifična aktivnost GST pri živalih iz Ljubljane višja od tiste pri Postojnskih (Slika 14). Slika 14: Grafikoni kvartilov aktivnosti GST vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 36

50 Pri jamskih osebkih iz Planinske jame so bile vrednosti aktivnosti GST jeseni statistično značilno nižje (Dunnov test, p < 0.05) od pomladnih in poletnih vrednosti. Vrednosti pri živalih iz Postojne so bile poleti značilno višje od jesenskih. V Jakovici so bile poleti aktivnosti GST značilno višje kot jeseni, ko pa so bile značilno višje od tistih spomladi. V Ljubljani ni bilo značilnih razlik med letnimi časi (Slika 15). Varianca poletnih vrednosti iz Postojne in Jakovice je bila višja kot v ostalih obdobjih. Slika 15: Grafikoni kvartilov aktivnosti GST vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 37

51 Znotraj letnega časa in lokacije med spoloma ni bilo značilnih razlik (Dunnov test, p < 0.05) v aktivnosti GST vodnih osličkov (Slika 16). Slika 16: Grafikoni kvartilov aktivnosti GST samcev in samic vodnih za vzorčene lokacije, osličkov v poletnem in jesenskem obdobju. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 38

52 4.6 KOLIČINA LIPIDOV Količina lipidov vodnih osličkov iz Postojne je bila spomladi statistično značilno višja (Dunnov test, p < 0.05) od tistih iz Jakovice in Ljubljane. Pri spomladanskeih vzorcih ni bilo značilnih razlik med osebki iz Planinske jame in ostalih lokacij (Slika 17). V poletnem vzorcu iz Planinske jame je bila količina lipidov statistično značilno nižja (Dunnov test, p < 0.05) od tiste iz vzorca v Jakovici. Značilnih razlik med vzorcem iz Postojne in ostalima lokacijama ni bilo. V jesenskem vzorcu so imeli osebki iz Ljubljane statistično značilno višjo (Dunnov test, p < 0.05) količino lipidov od ostalih lokacij. Živali iz Postojne so imele značilno višjo količino lipidov od tistih iz Planinske jame. Slika 17: Grafikoni kvartilov količine lipidov vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 39

53 Pri vodnih osličkih iz Planinske jame sicer niso bile opazne statistično značilne razlike (Dunnov test, p < 0.05) v količini lipidov med letnimi časi, opazen pa je bil rahel trend padanja. Pri osebkih iz Postojne ni bilo značilnih razlik med letnimi časi. Količina lipidov poletnega vzorca vodnih osličkov v Jakovici je bila značilno višja od ostalih dveh obdobij. Živali iz jesenskega vzorčenja v Ljubljani so imele značilno višjo količino lipidov, kot tiste iz spomladanskega (Slika 18). Slika 18: Grafikoni kvartilov količine lipidov vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 40

54 Znotraj letnega časa in lokacije med spoloma ni bilo statistično značilnih razlik (Dunnov test, p < 0.05) v količini lipidov, vendar pa je bila vsebnost lipidov pri samicah načeloma višja (Slika 19). Slika 19: Grafikoni kvartilov količine lipidov samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 41

55 4.7 KOLIČINA OGLJIKOVIH HIDRATOV Spomladi pri vodnih osličkih med lokacijami ni bilo značilnih razlik (Dunnov test, p < 0.05) v količini ogljikovih hidratov. V poletnem obdobju je bila značilna razlika med osebki iz Planinske jame in Postojne. Jeseni so imeli osebki iz Ljubljane značilno višjo količino ogljikovih hidratov od tistih iz Planinske jame in Jakovice (Slika 20). Slika 20: Grafikoni kvartilov količine ogljikovih hidratov vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 42

56 Količina ogljikovih hidratov je bila pri vodnih osličkih iz Planinske jame jeseni statistično značilno nižja (Dunnov test, p < 0.05), kot v ostalih dveh obdobjih. Pri osebkih iz Postojne nismo opazili značilnih razlik med letnimi časi. Osebki iz Jakovice so imeli jeseni značilno nižjo količino ogljikovih hidratov. Na lokacijah Planinska jama, Postojna in Jakovica smo opazili trend upadanja količine ogljikovih hidratov čez leto, vendar razlike niso bile vedno statistično značilne (Slika 21). Ljubljanski osebki niso kazali značilnih razlik med pomladjo in jesenjo, vendar so bile jesenske vrednosti višje in imele so večjo varianco. Slika 21: Grafikoni kvartilov količine ogljikovih hidratov vodnih osličkov v treh letnih časih, za vzorčene lokacije. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 43

57 V količini ogljikovih hidratov ni bilo statistično značilnih razlik med spoloma (Dunnov test, p < 0.05) v količini ogljikovih hidratov vodnih osličkov znotraj letnega časa in lokacije (Slika 22). Slika 22: Grafikoni kvartilov količine ogljikovih hidratov samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 44

58 4.8 KOLIČINA PROTEINOV Spomladi so imeli vodni oslički iz Planinske jame statistično značilno višjo (Dunnov test, p < 0.05) količino proteinov kot osebki iz ostalih lokacij (Slika 23). Poleti ni bilo statistično značilnih razlik (Dunnov test, p < 0.05) v količini proteinov med lokacijami. Jeseni je bila količina proteinov pri osebkih iz Postojne statistično značilno višja (Dunnov test, p<0.05) kot pri tistih iz Planinske jame in Jakovice, ni pa se značilno razlikovala od tiste pri Ljubljanskih. Slika 23: Grafikoni kvartilov količine proteinov vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v treh letnih časih. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 45

59 Na vseh štirih lokacijah smo opazili višjo količino proteinov v poletnih in jesenskih vzorcih, vendar pa je bila razlika statistično značilna (Dunnov test, p < 0.05) le pri površinskih lokacijah (Slika 24). Slika 24: Grafikoni kvartilov količine proteinov vodnih osličkov za v treh letnih časih, vzorčene lokacije. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 46

60 V količini proteinov pri vodnih osličkih med spoloma ni bilo statistično značilnih razlik (Dunnov test, p < 0.05) znotraj letnega časa in lokacije (Slika 25). Razlika med samicami in samci iz Jakovice v poletnem obdobju je skoraj statistično značilna (p = 0.066). Slika 25: Grafikoni kvartilov količine proteinov samcev in samic vodnih osličkov za vzorčene lokacije, v poletnem in jesenskem obdobju. Škatle kvartili, brki vrednosti znotraj 1,5 medkvartilnega razmika, pike osamelci; različne črke statistično značilne razlike (p < 0.05). N=15. 47