(Moderne) tehnike in metode v mikrobni ekologiji 1
Metode v mikrobni ekologiji: 1. molekularna biologija 2. fiziologija 3. molekularna biologija in fiziologija 4. analiza in statistika 5. modeliranje 6.... 2
Definiraj pojem - moderne? SIR (Anderson in Domsch, 1989; 1993)- Substrate Induced Respiration - Substratno inducirana respiracija PCR (Khorana et al.,1971; Mullis et al., 1983) Polymerase Chain Reaction verižna reakcija s polimerazo D/TGGE (1989, Muyzer et al., 1993) Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis denaturacijska / temperaturna gradientna gelska elektroforeza T-RFLP(Liu et al., 1995) Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Real-Time PCR (1995) PCR v realnem času, Microarrays - Mikročipi (1995), Real-Time T-RFLP (2005) CLPP community level physiological profiling - Kratkotrajno metabolno profiliranje združb (Degens et al., 1999; 2001) SIGR (Colores et al., 1996) - substrate induced growth response - substratno induciran rastni odziv MicroResp (Chapman et al., 2003) - microtitre-plate based respiration system mikrotitrski sistem za spremljanje respiracije 3
Pa je modernost vse, kar je pomembno? Prag detekcije? Velikostni razred napak? Ločljivost? Interference? Kaj želite z neko metodo pokazati? Kaj lahko z neko metodo sploh raziščete? Ali je vaša metoda prava za reševanje zastavljenega problema? Ali je zgolj,,modna? Vir novih informacij. 4
Osnovna vprašanja: Kakšna je raznolikost mikrobne združbe v vzorcu? raznolikost Kako je raznolikost mikrobne združbe odvisna od parametrov okolja? Kako je raznolikost mikrobne združbe povezana s funkcijo? Kako je funkcija mikrobne združbe odvisna od parametrov okolja? Kakšna je funkcija mikrobne združbe v vzorcu? funkcija Zanima nas kakšna je: Stabilnost ekosistema (strukture in funkcije)? Prožnost -,,Resilience kako hitro se ekosistem vrne v izhodiščno stanje po motnji? Upornost -,,Resistance kako dolgo se ekosistem upira motnji? Velikost, raznolikost in aktivnost posameznih funkcionalnih skupin? 5
Pestrost, raznolikost -,,diversity : Makroekologi definirajo bioraznolikost z vrstami in jo razlikujejo v treh prostorskih območjih: α (znotraj izbranega mesta), ß (med izbranimi mesti), γ (čez celotno območje). Raznolikost znotraj enega prostorskega območja je definirana v skladu s tremi dolgo poznanimi parametri: - bogatost vrst (,,species richness ) število vrst na obravnavanem področju - enakomernost vrst (,,species eveness or equitability ) relativna zastopanost vrste - sestava vrst (,,species composition ) opis dejanskih vrst ali OTE (operacijskih taksonomskih enot v molekularni ekologiji) prisotnih v vzorcu. 6
Funkcija: Možnost spremljanja preko 500 encimskih reakcij v ekosistemu Ugotavljanje limitnih faktorjev v ekosistemu Mapiranje odziva mikrobnih združb na parametre okolja (razpon): temperatura, voda, ph, tekstura, gostota, parcialni tlaki plinov (kisik, ogljikov dioksid, metan, vodik), osvetljenost, koncentracije substratov, produktov, inhibitorjev, elektronskih akceptorjev in donorjev, stresni dejavniki, V max, K m quorum sensing in razgradnja signalov Ugotavljanje rastnih pogojev mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah 7
Sklopi obravnavanih tehnik v mikrobni ekologiji: 1. molekularna biologija 2. fiziologija 3. molekularna biologija in fiziologija 4. analiza in statistika 8
1. Tehnike molekularne biologije Število vseh metod Frekvenca uporabe metode 9
Resolucija metod Družina Rod Vrsta Podvrsta Sev Sekvenciranje DNA Sekvenciranje genov za 16S rrna ARDRA DNA-DNA reasociacija ITS-PCR RFLP PFGE LFRFA Multilocis Izocyme Whole cell protein profiling AFLP RAPD rep-pcr ARDRA Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ITS- PCR ali ARISA= intergenic spacer PCR ali Amplified Ribosomal Intergenic Spacer Analysis RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism PFGE Pulse Field Gel Electrophoresis LFRFA - Low-Frequency Restriction Fragment Analysis AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA rep-pcr repetitive sequence -PCR 10
Skupine metod: i.dna-dna disociacija, reasociacija in hibridizacija ii.pcr: RFLP restriction fragment length polymorphism ARISA amplified ribosomal intergenic spacer analysis rep-pcr: REP-PCR Repetitive Extragenic Palindomic -PCR, BOX-PCR palindromski box elementi v genomu ERIC-PCR - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR SSCP single stranded conformation polymorphism DGGE/TGGE T-RFLP analiza pojavljanja vzorcev kloniranje in sekvenciranje analiza sekvenc 11
Skupine metod: iii.metagenomika iv.direktna rekonstrukcija genomov iz okolja v. mikrobne in metabolne mreže 12
i. DNA-DNA disociacija, reasociacija in hibridizacija - Disociacija celokupne DNA določanje deleža GC populacije, deleža GC genoma izolata - Reasociacija celokupne DNA - določanje števila ekvivalentov genomov E.coli v ekološkem vzorcu - Reasociacija DNA dveh genomov dolčanje vrstnih odnosov med izolati - Mikročipi identifikacija izolatov, spremljanje sprememb v odkriviljivosti tarčnih DNA, RNA v vzorcih okolja - FISH Fluorescentna In Situ Hibridizacija Hiperkromni efekt? 13
- Disociacija celokupne DNA in delež GC populacije ali genoma seva L. Øvreås, F.L. Daae,V. Torsvik,F. Rodrıg. 2003. Microb. Ecol. 46:291-301 14
-Reasociacija celokupne DNA ali DNA dveh sevov ugotavljanje števila ekvivalentov genomov E.coli v ekološkem vzorcu ugotavljanje medvrstnih odnosov med sevi Naravna tla 4000-8000 različnih genomov Onesnažena tla 350-1500 različnih genomov E.coli Goveji timus Mikrobna združba L. Øvreås, F.L. Daae,V. Torsvik,F. Rodrıg. 2003. Microb. Ecol. 46:291-301 E.coli 32% 22% 37% M.luteus +E.coli Torsvik V, Goksoyr J, Daae FL. 1990. Appl Environ Microbiol. 56:782-7. 15
Disociacija / Reasociacija celokupne DNA ali DNA dveh sevov Prednosti: - uporaba celokupne DNA - enostavna in poceni oprema spektrofotometer Pomanjkljivosti: - Slabša resolucija od drugih molekularnih tehnik - Slabša ponovljivost velik vpliv majhnih sprememb v temperaturi in ionov v sledeh na diasociacijsko/reasociacijsko kinetiko 16
-Mikročipi fragmenti genomske DNA PCR produkti oligonukleotidi natisnjeni na 2D, 3D gelski nosilec Cho and Tiedje, 2001, Appl. Envir. Microbiol., 67: 3677-3682. Uporaba: 1. identifikacija izolatov, 2. spremljanje sprememb v odkriviljivosti tarčnih DNA in RNA v čistih kulturah in vzorcih iz okolja. 17
Prednosti mikročipov: -Idealno orodje prihodnosti!!! -Veliko informacij pridobimo z enim samim eksperimentom -Možnih veliko število ponovitev v kratkem času -Velika ponovljivost v strogo definiranih pogojih Slabosti: osnovne predpostavke pri gradnji mikročipov: (i) Kar vemo, je vse kar potrebujemo. (ii) Primarna sekvenca nukleinskih kislin določa obnašanje sond na površju mikročipa (iii) Zadovoljiva mera testiranja in validiranja nam omogoča izbor sond s popolnim načinom obnašanja na površju čipa (iv) Validacijski eksperimenti in izbrane sonde se bodo obnašale enako idealno pri analizi drugih vzorcev in okolij. 18
Druge pomanjkljivosti pri izgradnji mikročipov: Pomanjkanje kultiviranih divjih sevov. Mišljenje, da mikroorganizmi iz zbirk sevov in sekvence iz baz podatkov, predstavljajo dobršen in povsem zadovoljiv delež v naravi prisotnih organizmov. Mišljenje, da a priori razumevanje tarč dovoljuje tehnikam razvozlavanje signala na čipu v natančen profil mikrobne združbe ali profil ekspresije genov. Kakšen je termodinamski vpliv površja na stabilnost dvoverižnih DNA in specifičnost hibridizacij? Kaj se sploh dogaja na površju mikročipa? Tehnične težave pri označevanju fragmentov DNA, Omejitve pri difuziji označenih fragmentov DNA na površino mikročipa Omejitve pri zaznavanju signalov na čipu Omejitve pri analizi dobljenih signalov kdaj je signal pozitiven in kdaj ne 19
-FISH- fluorescentna in situ hibridizacija Prednosti: Detekcija celic,,v njihovem okolju s specifičnimi sondami omogoča taksonomsko uvrstitev (gen za 16S rrna, reca, gyrb), Omogoča štetje različnih taksonomskih skupin hkrati Analiza večjega števila vzorcev je možna Detekcija in kvantifikacija aktivnih celic s sondami za 16S rrna čeprav količina 16S rrna slaba mera za aktivnost mikroorganizmov r in K strategija mikrobov Slabosti: Sekundarne strukture tarčnih genov otežkočajo hibridizacijo Potrebne so sekundarne sonde, ki olajšajo hibridizacijo na neugodna mesta Specifičnost sond omejena s podatkovnimi bazami pomožne sonde Neenaka permeabilnost celic Ločevanje signala od ozadja 20
ii. PCR: prednosti in pomanjkljivosti - omogoča pomnoževanje tarčnih genov iz ozadja - napake polimeraze - napake naleganja začetnih oligonukleotidov - inhibitorne snovi v vzorcih - ojačevalci pomnoževanja - sekundarne strukture DNA tarčnih genov po denaturaciji - učinkovitost pomnoževanja spreminjanje razmerij med PCR produkti -,,primer-dimer produkti - kimerne sekvence - različne sestave reakcij so potrebne za pomnoževanje iz različnih vzorcev primerljivost dobljenih rezultatov? 21
Metode, ki temeljijo na PCR: Tipizacijske Tehnike (T.T.) Analiza T.T. Sekvenčne tehnike RFLP restriction fragment length polymorphism ARISA amplified ribosomal intergenic spacer analysis rep-pcr:rep-pcr Repetitive Extragenic Palindomic -PCR, BOX-PCR palindromski box elementi v genomu ERIC-PCR - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR SSCP single stranded conformation polymorphism DGGE/TGGE T-RFLP analiza tipizacij v mikrobnih združbah kloniranje in sekvenciranje analiza sekvenc in knjižnic Kvantifikacija Real-Time PCR, c-pcr - kompetitivni PCR 22
Tipizacijske tehnike PCR / RFLP restriction fragment length polymorphism - fragmente z restrikcijsko endonukleazo razrezanega produkta PCR se ločuje z gelsko elektroforezo. - omogoča hitra in enostavno, vendar grobo tipizacijo skupne mikrobne združbe. - je presejalna metoda za analize velikih knjižnic različnih genov pred sekvenciranjem, - omogoča združevanje klonov v operacijske taksonomske enote (OTE), to je skupine z enakim restrikcijskim vzorcem RFLP profili klonov Groba tipizacija združb opaziš razliko? 23
Prednosti RFLP: - hitra, enostavna, poceni metoda za primarne analize združb in klonov - ponovljiva -omogoča nadaljne analize podatkov Nabiralčeva krivulja, rarefakcija, različni indeksi raznolikosti, simulacije vzorčenja knjižnic Slabosti: - slaba ločljivost pri analizi združb po restrikciji ni možno ugotoviti, kateri fragment pripada kateremu pomnožku - potrebno ugotoviti, katera restrikcijska endonukleaza loči različne pomnožke v OTE, ki korelirajo s filogenetsko razvrstitvijo - Veliko dela za analize velikega števila klonov - Z uporabo velikega števila restrikcijskih endonukleaz za analize klonov se približujemo ločljivosti sekvenčne analize razmislek, če ni vendar smotrneje direktno sekvencirati klone brez predhodne RFLP analize 24
Nabiralčeva krivulja Skupine OTE Obdelovana tla Naravna tla Število pregledanih klonov Ocena števila OTE z estimatorjem Chao1 Število ocenjenih OTE Obdelovana tla Naravna tla Število vzorčenih klonov Stres et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70 25
Tipizacijske tehnike PCR / ARISA amplified ribosomal intergenic spacer analysis Razdalje med geni za 16S in 23s rrna se razlikujejo med vrstami Omogoča tipizacijo mikrobnih združb na vrstnem nivoju Prednosti: Boljša ločljivost od RFLP gena za 16S rrna Možno uporabiti fluorescenčno označene začetne oligonukleotide kar ob uporabi sekvenatorja omogoča profiliranje mikrobnih združb v velikem številu vzorcev Slabosti: Ločljivost in uporabnost omejuje majhno število sekvenc medgenskih regij in genov za 23S rrna selektivnost in specifičnost začetnih oligonukleotidov Uporabno zgolj kot tipizacijska tehnika profiliranja mikrobnih združb (težavna identifikacija organizmov iz njihovih ARISA profilov) 26
Primer ločevanja fluorescentnih pomnožkov ARISA gelu ali na sekvenatorju in združevanje po podobnosti profilov Fluorescenca (relat. fluores. enote Velikost fragmenta (bp) % podobnosti 27
Tipizacijske tehnike rep-pcr: REP, BOX, ERIC-PCR Tarča so repetitivni elementi v genomih mikroorganizmov Sorodni genomi imajo podobno razporeditev elementov Po pomnoževanju ločujemo različno velike produkte z gelsko elektroforezo % podobnosti profili pomnožkov 28
rep-pcr: Prednosti: - Enostavna tehnika - Visoka ločljivost- na nivoju sevov - Velika ponovljivost - Omogoča enostavno sledenje evolucije genoma v laboratorijskih razmerah Slabosti: - uporabnik določa pogoje pomnoževanja in ločevanja ter tako posledično vpliva na rezultate, kar zmanjšuje primerljivost med ločenimi analizami - Veliko dela pri analizah velikega števila sevov - Neprimerna za analizo združb, ker je mikrobna DNA iz okolja fragmentirana (4-8 Mb v genomih, 10 Kb po izolaciji) 29
Tipizacijske tehnike PCR / SSCP single stranded conformation polymorphism Po denaturaciji pomnožka PCR se vsaka stran DNA zvije v lastno sekundarno strukturo glede na sestavo sekvence. Različne sekundarne strukture potujejo z različno hitrodtjo v akrilamidnem gelu. 30
SSCP single stranded conformation polymorphism Prednosti: - Enostavna - Možna uporaba fluorescečno označenih oligonukleotidov in ločevanja na sekvenatorju Slabosti: - precejšnja variabilnost metode pri analizi velikega števila vzorcev, saj je ločljivost odvisna od: -vsakokratne sestave gela varabilnost med geli - hitrosti, s katero uporabnih po denaturaciji ohladi vzorec DNA - časa ohlajevanja, - temperature hladilnega medija 31
Tipizacijske tehnike Vzorci iz okolja A B C PCR / DGGE/TGGE - Ločevanje na osnovi denaturacije in tvorbe sekundarnih struktur pomnožkov v gradientu kemičnega denaturanta ali temperature - GC-spona na enem od začetnih oligonukleotidov onemogoča popolen razplet dvoverižne DNA - Izrezovanje posameznih pomnožkov in sekvenciranje fragmentov - Identifikacija pripadnosti klonov ali izolatov posameznim fragmentom v profilu združbe 32
PCR / DGGE/TGGE Prednosti - ponovljiva analiza velikega števila vzorcev ob uporabi eksternih markerjev na gelih, ki omogočajo normalizacijo potovanja fragmentov med geli - Omogoča primerjavo potovanja izbranih fragmentov s celotno združbo - Pregled klonov in ločevanje v skupine OTE Slabosti - dolgotrajna priprava gelov in njihovega barvanja - dolgotrajno ločevanje na gelih (do 20h) - Potrebno optimiziranje najboljših pogojev ločevanja (% in gradient denaturanta ali temperature) - Razlike v ločevanju fragmentov zaradi minimalnih razlik v sestavi gelov in robnih pogojev (čas priprave gela, izsuševanje, zunanja temperaturna nihanja) - Nekateri geni se ne ločujejo dobro - Kvaliteta rezultatov je odvisna od kvalitete barvanja in zajemanja slike gela 33
Tipizacijske tehnike PCR / T-RFLP -Predstavlja kompromis med filogenetsko resolucijo in analizo velikega števila vzorcev. -Algoritmi omogočajo identifikacijo posameznih pikov v profilih iz podatkovnih baz sekvenc tudi že za nekatere funkcionalne gene. - V tem trenutku najbolj uporabljana tipizacijska metoda v mikrobni ekologiji (bakterije, arheje in glive, protozoji) 34
Shema T-RFLP Izolacija skupne mikrobne DNA PCR s fluorescentno označenimi oligonukleotidi Restrikcija Fluorescenca Odkrivanje fluorescentno označenih fragmentov Ločevanje fragmentov na sekvenatorju http://rdp8.cme.msu.edu/html/t-rflp_jul02.html 35
A Profili Primer profilov T-RFLP različnih vzorcev Puščici označujeta: A: mesta pojavljanja signala neodstranjenih začetnih oligonukleotidov in produktov,,primerdimer B: nerazrezanih Pomnožkov PCR B 36
PCR / T-RFLP Prednosti: - Visoka ločljivost - Ponovljivost analiza na sekvenatorjih - Standardizirane kapilare in polnila manjša variabilnost med analizami - Analiza velikega števila vzorcev - Uporaba internih standardov možnost normalizacije vsake proge glede na standard primerljivost med posameznimi analizami - Dobro poznavanje delovanja tehnike, njenih slabosti in omejitev 37
PCR / T-RFLP Pomanjkljivosti: - potrebno je odstraniti signal začetnih oligonukleotidov pri pripravi ali pri analizi - nepopoln razrez z endonukleazo vsi fragmenti niso zajeti v analizi - fantomski piki posledica enoverižne nepopolno pomnožene DNA - zamik T-RFLP (,,T-RFLP drift ): - Je razlika med dejansko in ugotovljeno velikostjo fragmenta - Je posledica razlik v potovanju enako dolgih fragmentov zaradi deleža purinov - Je posledica razlik v potovanju fragmentov in standardov zaradi razlik v fluorokromih (standard in vzorec sta označena z različnima fluorokromoma) - nujna je korelacija med empirično določeno velikostjo fragmenta ter velikostjo fragmenta določeno iz sekvence, če želimo iz profilov identificirati organizme, ki naj bi jim posamezni fragmenti pripadali 38
Primer ugotavljanja zamika T-RFLP in definiranja korekcije Na sekvenatorju določena velikost fragmenta se od prave dolžine razlikuje za Zamik T-RF (bp) Prava dolžina fragmenta T-RF (bp) 39
Zamik T-RFLP in definiranje korekcije 40
PCR / Analiza vzorcev tipizacijskih tehnik Normalizacija glede na interni / eksterni standard Odstranjevanje ozadja Prepoznavanje pikov od ozadja Binarne matrike prisotnosti / odsotnosti pomnožkov Denzitometrična analiza slike- relativna zastopanost posameznega pomnožka v združbi glede na celokupno fluorescenco oziroma gostoto fragmentov Izračun dendrogramov podobnosti vzorcev, PCA, FA,...: Statistica, SPSS, BioNumerics,... 41
Primer dendrogramov podobnosti profilov T-RFLP 42
Pomanjkljivosti skupine tipizacijskih tehnik na osnovi PCR: - Vse napake pridobljene pri pomnoževanju v PCR - En mikroorganizem več različnih pomnožkov - Pomnožki iz več mikroogranizmov se ločujejo enako - Zaznavanje dominantnih skupin (ki predstavljajo več kot 1-5% združbe) - Zaznavanje odvisno od specifičnost začetnih oligonukleotidov - Kompromis med filogenetsko ločljivostjo in analizo številnih vzorcev. 43
PCR / Kloniranje in sekvenciranje Prednosti: - Nudi najvišjo stopnjo resolucije. - Težavna za analize velikega števila vzorcev. - Omogoča statistične analize podobnosti sekvenc in modeliranje Pomanjkljivosti: - Vse napake pridobljene pri pomnoževanju v PCR - V vektor spravimo le del pomnožkov -Vključevanje v vektor ni neselektiven proces (ni nujno naključen) - Transformacija celic s konstruktom je lahko različno uspešna za posamezne knjižnice - Pri majhnem številu kolonij izbor transformant ni nujno naključen Analiza klonov z RFLP definicija skupin OTU in grupiranje klonov z DGGE povezava med klonom in fragmentom na gelu s T-RFLP povezava med sekvenco klona/izolata in pikom elektroferograma 44
Analiza in statistika knjižnic klonov - Zaradi velikega števila sekvenc je nujna uporaba statističnih in matematičnih pristopov za ugotavljanje statistične signifikantnosti ugotovitev (npr. s programi kot so Arlequin, EstimateS, DOTUR, Libshuff, S-Libshuff) - Uporaba parametrični in neparametričnih estimatorjev raznolikosti, s katerimi z uporabo modelov ocenjujemo končno raznolikost sekvenc v vzorcih. Obnovi poznavanje razlike med homologijo in podobnostjo sekvenc! 45
- Parametrični estimatorji merilo količine informacije (entropije) v sistemu in so tudi merilo za težavnost napovedi identitete naslednje posamezne z vzorčenjem pridobljene OTE - Neparametrični estimatorji izvirajo iz označi izpusti ponovno ujemi statistike (ang. mark - release - recapture), ki jo uporabljajo za ocenjevanje velikosti živalskih populacij. Neparametrični estimatorji ugotavljajo delež vrste ali OTE, ki je bila opažena že prej, s tistimi, ki so opažene prvikrat. V zelo raznoliki združbi bo verjetnost, da bi opisali isto vrsto dvakrat, zelo nizka in večina vrst bo imela le po enega predstavnika v vzorcu. 46
Število opaženih OTE Nabiralčeva krivulja (,,Accumulation / Collector s curve ) Definicija OTE: če je homologija dveh sekvenc večja od teh arbitrarno (taksonomija!!) definiranih mej, potem pripadata isti OTE Za vsako novo sekvenco ugotovimo, ali spada v že prej opaženo OTE ali ne Število pregledanih sekvenc Schloss and Handelsman, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 1501-1506 47
,,Rarefaction : ponavljano vzorčenje nabiralčeve krivulje povprečna nabiralčeva krivulja - če se 95% intervali zaupanja ne prekrivajo, je razlika statistično pomembna Število opaženih OTE Hughes et al. 2001, Appl. Envir. Microbiol. 67: 4399-4406. Število pregledanih sekvenc ali klonov 48
Osnovni indeksi raznolikosti, ki jih lahko izračunamo iz definiranih OTE klonov ali sekvenc knjižnic: Shannon-ov: H = -Σ(p i )(log 2 p i ), kjer je p delež edinstvenega RFLP profila ali sekvence glede na vsoto vseh različnih profilov ali sekvenc v knjižnici (Magurran, 1988). Enakomernost: E = H / H max and H max = log 2 (S). Pokritost knjižnice (C) kot mera zajete raznolikosti (Good, 1958): C= 1-n / N, kjer je n število enkrat samkrat odkritih klonov ali sekvenc v knjižnici in N je skupno število pregledanih klonov ali sekvenc. Povprečna taksonomska oddaljenost (D mean ) med vsemi pari sekvenc. D mean = 2 Σ d(i,j) / S (S + 1), kjer je d(i,j)= (1-homologija DNA med sekvencama klonov i in j) in S je skupno število uporabljenih klonov. 49
Statistične analize knjižnic - Kdaj pregledati še več klonov? - Primerjava velikih skupin sekvenc med sabo v eni številki indeksi raznolikosti - Primerjave knjižnic med sabo - ugotavljanje signifikantnosti razlik med knjižnicami sekvenc - Primer: 50
Iz porazdelitve klonov/sekvenc v OTE, z neparametričnim estimatorjem Chao1 ocenite končno število različnih OTE v vaših vzorcih in izračunate pripadajoče 95% intervale zaupanja Število ocenjenih OTE Hughes et al. 2001, Appl. Envir. Microbiol. 67: 4399-4406. Število pregledanih sekvenc ali klonov 51
Prikaz povprečnih vrednosti 95% intervalov zaupanja Chao1 estimatorja s prejšnje strani in najboljši fit (negativna exponencialna funkcija) nanje ponazarjata, koliko klonov bi bilo potrebno pregledati, da bi zaznali statistično signifikantne razlike med knjižnicama Razpon 95% intervalov zaupanja Hughes et al. 2001, Appl. Envir. Microbiol. 67: 4399-4406. Število pregledanih sekvenc ali klonov 52
Real-Time PCR PCR v realnem času trije osnovni pristopi: 1. Taq Man sonda 2. Syber Green I interkalacija v dvoverižno DNA denaturacija naleganje sonde 3. Hairpin loop škorpijonska sonda podaljševanje Polimeraza pri podaljševanju s svojo eksonukleazno aktivnostjo razgradi sondo in loči fluorokrom od požiralca njegove svetlobe - fluorescenca 53
DNA izolirana iz okolja: inhibitorji pomnoževanje DNA razpiranje vijačnic v času kratkih ciklov - specifičnost - fluorescenca odkloni Ct -učinkovitost pomnoževanja - disociacijske krivulje specifičnost pomnoževanja C T1 C T2 C T3 54
Real Time PCR: 16S rrna gospodinjski geni funkcionalni geni Število kopij gena na genom in kdaj so razlike signifikantne? 55
iii. Metagenomika 56
Metagenomika: - Izolacija DNA iz okolja - Fragmentacija v fragmente velikosti ~40.000 bp-150.000 bp - Kloniranje v BAC bacterial artificial chromosomes - Hibridizacija posameznih klonov in lociranje genov za16s rrna - Analiza navzgor in navzdol lociranih genov 57
Metagenomika: Prednosti: - Neodvisna od PCR - Povezava filogenije z raznolikostjo strukturnih genov velika funkcionalna raznolikost v populaciji fragmentov z identičnimi geni za 16S rrna nivo sevov - Ekspresija genov na fragmentih v gostitelju identifikacija novih genov, identifikacija funkcije neznanih genov v sekvenciranih genomih - Uporaba mikročipov ali pretočne citometrije omogoča hitro sortiranje klonov z BAC po skupinah sekvenc - Velik potencial za odkrivanje novih genov in aktivnih spojin Slabosti: - drag in kompleksen pristop, ki ga uporabljajo velike raziskovalne skupine, - podobne težave (z naključnostjo), kot pri kloniranju, 58
iv. Direktna rekonstrukcija genomov iz okolja - Še korak naprej od metagenomike. - Klonirani fragmenti so velikosti ~3000 bp so podvrženi sekvenciranju do 10x pokritosti. - Rekonstrukcija genomov iz okoljske DNA. - Potreben je hkraten razvoj bioinformatike, statistike in računalništva 59
Direktna rekonstrukcija genomov iz okolja Prednosti: -Neodvisna od PCR - Identifikacija genov, promotorjev, regulatornih faktorjev,... - Identifikacija rastnih potreb za izolacijo v čisti kulturi. - Identifikacija funkcije neznanih genov z njihovo komplementacijo in ekspresijo v gostitelju biotehnološki in medicinski pomen. - Osnova za identifikacijo metabolne mreže znotraj celic neznanih in nekultiviranih mikroorganizmov - rekonstrukcija celih genomov in njihovih metabolnih poti -Ekspresija genov na fragmentih v gostitelju identifikacija novih genov, identifikacija funkcije neznanih genov v sekvenciranih genomih -Študij evolucije genomov sorodnih organizmov in klonalnosti populacij 60
Direktna rekonstrukcija genomov iz okolja Slabosti: - Kompleksen, zahteven (tehnično in analitsko) in drag pristop - Težav pri kloniranju fragmentov v vektor niste izključili - Vseh fragmentov DNA niste klonirali - Vseh fragmentov niste sekvencirali z dovoljšnjo pokritostjo - Velikega števila genomov ni moč zapreti zaradi repetitivnih elementov in insercijskih sekvenc, ki onemogočajo nedvoumno povezovanje posameznih sekvenc v celoto 61
vi. Metabolne in mikrobne mreže - funkcionalna genomika - Trenutno je dostopnih več kot 250 mikrobnih genomov. - Molekularni podatki o genih, proteinih in metabolnih poteh nam omogočajo raziskovanje obnašanja celic. - Iz sekvenc skušamo rekonstruirati metabolne procese in genetske mreže znotraj organizma: kvalitativno (kateri geni so vpleteni) kvantitativno (regulacija, kinetika reakcij) 62
- Za izdelavo samostojnega računalniškega metabolnega modela posameznega mikroorganizma se uporablja modeliranje in simulacije na osnovi eksperimentalnih podatkov: * ekspresije genov v čistih kulturah (mikročipi, Real Time PCR), * poteka encimskih reakcij, * fizikalno kemijski parametriov okolja in odzivov organizmov nanje. - Povezovanje posameznih metabolnih modelov v mikrobne mreže in ugotavljanje odnosov med organizmi služi razumevanju delovanja združb in njihovih odzivov na dejavnike okolja in druge stresne faktorje. 63
FIZIOLOGIJA 64
Trenutno poznavanje bakterijske taksonomije: - Več kot 40% bakterijskih skupin nima kultiviranega predstavnika - Nekatere skupine so dominantne v okolju in predstavljajo lahko 50% ali več mikrobne biomase - Popolno nepoznavanje fiziologije teh mikroorganizmov in njihove vloge v okolju - Potreba po izolaciji mikroorganizmov iz teh skupin v čiste kulture 65
Funkcionalna zasičenost mikrobnih združb,,functional redundancy : Filogenetsko nesorodni bakterijski izolati rastejo na istem gojišču! Primer: hitrost rasti bakterijskih populacij -v visokogorju dominirajo hitrorastoče populacije Povprečno število CFU (% končnega števila) M ean plate count (% ) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 visokogorje 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 Čas inkubacije Incubation time (h) (h) travnik Čas inkubacije (tedni) Izolati, sevi različnih vrst se pojavijo po različnih časih inkubacije 66
Ocena števila možnih funkcij (procesov) v tleh: Porazdelitev genov v E.coli : Transporterji 500 Regulatorji 500 RNA 115 Struktura 200 Faktorji 25 Encimi 1300 Neznani 1800 (predvidevanje, da kodira encime ~1200 encimov 1300+1200 = 2500 genov ~5000 tipov genomov na g tal (DNA-DNA reasociacija) 2500 genov / organizem * 5000 tipov organizmov = 1.25 * 10 7 genov na g tal za delovanje ekosistema Če je potrebnih 10 genov / funkcijo Če je potrebnih 50 genov / funkcijo Če je potrebnih 100 genov / funkcijo 1.25 * 10 6 2.5 * 10 5 možnih edinstvenih 1.25 * 10 5 procesov g tal 67
Vsak organizem opravlja neko določeno število funkcij. V okolje je veliko različnih organizmov (npr.: 10 8 / g tal, od tega 5000 različnih tipov genomov). Če nekateri izginejo iz ekosistema, obstaja velika verjetnost, da jih drugi funkcionalno nadomestijo. Degenerativnost in kompleksnost zagotavljata združbam stabilnost in s tem obstojnost ekosistemov. Združbe morajo biti degenerativni in kompleksni sistemi. 68
1. Fiziologija združb: - Ugotavljanje limitnih faktorjev v ekosistemu: Odziv aktivnosti združbe na komplementacijo okolja (npr.: denitrifikacija - vir ogljika, vir dušikovih oksidov, oboje, ph>6, anoksični pogoji, - Možnost spremljanja preko 500 encimskih reakcij v ekosistemu: substratno inducirana respiracija, mineralizacija C in N, dehidrogenazna aktivnost, hitinazna aktivnost, nitrifikacijska in denitrifikacijska potencialna aktivnost,... 2. Mapiranje odziva mikrobnih združb na parametre okolja (razpon): temperatura, voda, ph, tekstura, gostota,... parcialni tlaki plinov (kisik, ogljikov dioksid, metan, vodik,...), osvetljenost, c(substrat-i), c(produkt-i), c(inhibitor-ji), c(elektr. akceptorjev),.. stresni dejavniki, V max, K m... quorum sensing in razgradnja signalov,... 3. Ugotavljanje rastnih pogojev, izolacija in karakterizacija mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah 69
1. Profiliranje metabolnih funkcij na nivoju združbe v odvisnosti od različnih faktorjev: BIOLOG: - mikrotitrska plošča s substrati - inokulacija z vodnim ekstraktom (suspenzijo) originalnega vzorca le del združbe - spremljanje porabe substratov preko motnosti in spremembe ph (metabolizem) skozi čas (do 2-3 tedne) inkubacijska tehnika!! Prednosti: - hitro in enostavno metabolno profiliranje velikega števila vzorcev - standardizirani testi - uporaba dostopne tehnologije Slabosti: - inokulum predstavlja le del združbe (ki se lažje loči od matriksa) - inkubacija v suspenziji spremenjeni rastni pogoji - inkubacijska tehnika omogoča prenamnoževanje heterotrofov - zapleteno tolmačenje rezultatov(večkratno odčitavanje med inkubacijo) 70
CLPP: -,,community level physiological profiling mapiranje fiziološkega odgovora združbe s substratno inducirano respiracijo. - plinotesne steklene inkubacijske posode, v katerih inkubiramo vzorce z dodanimi substrati - spremljamo respiracijo z meritvami CO2 na plinskem kromatografu Prednosti: - uporaba celega vzorca pri analizi (ne suspenzije z ekstrahiranimi celicami) - enostavna, poceni (potrebujete klasičen plinski kromatograf) - veliko število substratov identifikacija tistih, ki pokažejo razlike med vzorci Slabosti: - inkubacijska tehnika (4h) - veliko dela pri velikem številu vzorcev - težko opraviti vse analize naenkrat 71
Maksimalna hitrost respiracije (ug CO2-C / g h) Primer metabolnega profiliranja 72
MicroResp miniaturizirana oblika CLPP Mikrotitrska plošča vsebuje indikatorski gel, katerega obarvanost se spreminja v odvisnosti od ph= f(co 2 ). Globoka mikrotitrska plošča vsebuje različne substrate in vzorce tal Pred in po inkubaciji se odčita OD 600 nm detekcijske plošče in iz razlike izračuna odziv na substrat Prednosti: - enake kot pri CLPP - velika hitrost analize Slabosti: - inkubacijska tehnika (4h) - majhni vzorci heterogenost vzorcev lahko moteča 73
2. Mapiranje odziva različnih združb na parametre okolja: Aktivnost sintetiziranih encimov pri različnih temperaturah identifikacija funkcioanlnih razlik med združbami N 2 O emission rates 100 Odziv 1 vzorci log N2O-N / g h 10 1-30 -20-10 0 10 20 30 0,1 0,01 Temperature ( o C) Odziv 2 1 2 3 4 5 6 74
3. Ugotavljanje rastnih pogojev mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah: - Evolucijski algoritmi za razvoj gojišč adaptivni programi s parametri : (i) kemijska sestava gojišč (ii) delež vzgojenih tarčnih organizmov čim več tarčnih organizmov, (iii) raznolikost tarčnih organizmov da medij ni selektiven zgolj za eno skupino Progresivno in kontrolirano izboljševanje gojišč skozi generacije 75
Novejši pristopi pri izolaciji mikroorganizmov: - rastni faktorji: mikronutrienti, vitamini, derivati obveščevalnih molekul (HSL), camp, - čas in pogoji inkubacije 4 mesece, vlažnost, sestava atmosfere, razredčena mineralna gojišča, postopna subkultivacija, - enkapsulacija celic v kapljice gela in gojenje v gradientu nutrientov, ločevanje kapljic z mikrokolonijami s pretočno citometrijo - inkubacija v gelu enkapsuliranih celic v in-situ okoljih, - mikrotitrske plošče z gradienti nutrientov, inkubirane pri različnih definiranih pogojih 76
Zakaj kultivacija? Povezava: gibljivost mikrobov učikovitost predatorjev-> funkcija ekosistema (npr. mineralizacija organskih snovi) Povezava: mobilni genetski elementi prilagodljivost, raznolikost in funkcionalne sposobnosti združb (npr. Rezistence na antibiotike) Povezava: regulacija celic neprestano spreminjajoče se okolje, ki žene odgovor mikrobnih združb na okoljske spremembe 77
Rekonstruirano filogenetsko drevo bakterij. 78
FIZIOLOGIJA IN MOLEKULARNA BIOLOGIJA 79
1. MICA + FISH microautoradiography + FISH 2. SIP stable isotope probing 3. BrdU bromo deoxy uridine 4. Redčitve mikrobnih združb 5. Dolgotrajni ekološki eksperimenti 80
1. MICA + FISH = microautoradiography + FISH =MAR+ FISH Specifičen radioaktivno označen substrat: 14 C, 15 N Kratkotrajna inkubacija (15 min 8h) Aktivne celice privzamejo označen substrat in ga presnovijo v celične komponente Celice postanejo radioaktivno označene Fiksacija celic FISH-> filogenetska uvrstitev celic MICA -> katere in koliko od označenih celic s FISH je aktivnih in je presnovilo določen substrat Iz primerjave dveh slik (FISH in MICA) istega vzorca sklepamo o raznolikosti in funkcionalnosti mikrobnih združb 81
microautoradiography + FISH Prednosti: - hkratna identifikacija filogenetskih odnosov in aktivnosti (odziva na dodan substrat) Slabosti: - inkubacijska tehnika - nujna je definirana analiza slike (intenzitete + signalov) - potrebno je zelo kvalitetno zajemanje podatkov in visok standard mikroskopije - težave FISH - težave MICA bledenje signala 82
2. SIP,,stable isotope probing vgradnja stabilnih izotopov Specifičen s težjim izotopom označen substrat: 13 C Kratkotrajna inkubacija (4-24h) v definiranih pogojih Aktivne celice privzamejo označen substrat in ga presnovijo v celične komponente Aktivne (rastoče) celice vsebujejo proteine, lipide in DNA z vgrajenim težjim izotopom Izolacija DNA S 13 C obogateno DNA ločimo od 12 C DNA z ultracentrifugiranjem v gradientu gostote. Frakcije analiziramo s klasičnimi molekularnimi metodami. 13 C PLFA slabša resolucija od analize DNA. 83
SIP,,stable isotope probing vgradnja stabilnih izotopov Prednosti: -omogoča identifikacijo aktivnih populacij v združbi Slabosti: - pri gradientnem centrifugiranju se označena DNA loči od neoznačene, med obema zgostitvenima conama pa obstaja gradient. Analizirati je potrebno celoten razpon gradienta med neoznačeno in označeno DNA. - Inkubacijska tehnika - Napake metod pri analizi DNA 84
3. BrdU bromo deoksi uridin Uridin Analog timina 85
BrdU ni izotopska metoda Kratkotrajna (~8 h) inkubacija BrdU + specifičen substrat (kontrola, glukoza, aromatske spojine, KNO 3...) Aktivne celice privzamejo BrdU in jo vgradijo v novo DNA Z BrdU obogateno DNA se od ostale loči s protitelesi Frakcije analiziramo s klasičnimi molekularnimi metodami 86
Prednost BrdU: - Lahko se omejimo na skupine, ki specifično odgovarjajo na določene dražljaje iz okolja - enostavnejša in cenejša od SIP in MICA+FISH - Komercialni kiti za ločevanje označenih celic od neoznačenih Slabosti: - inkubacijska tehnika - Napake metod pri analizi DNA 87
Težave teh treh metod: 1. Vzorec inkubiramo s substratom-> selektivna aktivacija celic s substratom 2. Drugačne koncentracije substrata kot v naravnih pogojih- >selektivna aktivacija/inaktivacija celic s substratom 3. Mikroorganizmi lahko ločujejo med različnimi izotopi istega elementa 4. Nekateri ne privzemajo BrdU 88
4. Redčitve in ponovna rast redčenih mikrobnih združb (,,dilution regrowth analysis ) MPN: spremljanje procesa v odvisnosti od redčitve - splošna združba -amonifikacija - nitrifikacija - denitrifikacija - mineralizacija žvepla - sulfatna respiracija -... 89
Priprava redčitev Inokulacija posameznih redčitev v sterilno originalno okolje (z gama žarki sterilizirana tla, filtrirana morska voda) ali laboratorijsko eksperimentalno okolje. Inkubacija - ponovna rast in kolonizacija okolja, eksperimentiranje s pogoji rasti Pregled funkcionalnih karakteristik redčenih in ponovno zraslih združb množica možnih fizioloških meritev (npr. SIR, potencialna denitrifikacijska aktivnost) Pregled raznolikosti mikrobnih združb (bogatost in enakomernost) Inkubacija in rekolonizacija okolja Funkcija: SIR, potencialne aktivnosti talnih encimov,... Raznolikost: T-RFLP, DGGE, kloniranje,... 90
Primer: Pregled funkcionalnih karakteristik redčenih in ponovno zraslih združb B Združba srednje raznolikosti (vsak opravlja več funkcij) Združba z visoko raznolikostjo (vsak opravlja malo ali le eno od funkcij) A Združba z nizko raznolikostjo (vsi znajo vse) C Redčenje združbe Začetna združba 91
A visoka raznolikost: z vsakim redčenjem se izgubi ena ali več majhnih populacij in z njimi njim lastne funkcije. Zelo hitro zmanjševanje funkcionalnega potenciala združbe. Velika občutljivost na stresne dejavnike. B srednja raznolikost: z redčenjem se postopoma izgubljajo posamezne manj zastopane populacije in njim lastne funkcije. Nekatere od teh funkcij lahko še vedno opravljajo tudi druge populacije. C nizka raznolikost: redčenje in ponovna rast v seriji redčitev ne spremenita funkcionalnega (metabolnega) potenciala združbe do popolne razredčitve združbe. Dokler je prisoten en sam predstavnik, je končni rezultat med redčitvami enak. 92
5. Dolgotrajni ekološki eksperimenti Eksperimentalne postaje: polja, reaktorji, akvariji, morske točke, Kontrolirani (npr.: obdelava tal, dodajanje nutrientov, spreminjanje rastlinskega pokrova) Dolgotrajne meritve fizikalnih, kemijskih in bioloških lastnosti okolja -> spremljanje časovne in prostorske variabilnosti procesov Možnost korelacije (mikrobnih in drugih) združb s procesi ekosistema in dejavniki okolja Idealna mesta za vzorčenje reprezentativnih vzorcev 93
Prihodnost: Integriran pristop k raziskovanju mikrobnih združb: FIZIOLOGIJA + MOLEKULARNA BIOLOGIJA Potreben je povdarek na interakcijah fizikalnih, kemijskih in bioloških procesov, da bi lahko razumeli funkcionalne lastnosti, evolucijo in dinamiko ekosistema. Potrebne so številne in različne metode analiz, številna vzorčenja v času in prostoru, ter modeliranje ekoloških dejavnikov - znotraj ene raziskave. Kompleksnost interakcij in skala meritev sta največji oviri na poti k razumevanju povezave med funkcijo in filogenijo združb ter parametri okolja, saj ni vedno mogoče izmeriti kritične komponente okolja, ali pa vsaj ne na pravi skali. Standardizacija metodologij ter statistična analiza rezultatov sta ključni postavki za testiranje hipotez in primerljivost rezultatov. 94
95
Naše razumevanje je dobro, ko lahko pravilno napovemo obnašanje sistema. Danes smo še daleč od tega cilja. Imamo pa bistveno več orodij kot kdaj koli prej. In čas je, da jih začnemo uporabljati pametno z vsemi njihovimi omejitvami. 96