3

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO IRENA ŽUŽEK (roj. MLAKAR) MAGISTRSKA NALOGA Magistrski študijski program laboratorijska biomedicina LJUBLJANA, 2016

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO IRENA ŽUŽEK (roj. MLAKAR) VPELJAVA AVTOMATIZIRANEGA MERJENJA INDEKSA HEMOLIZE NA BIOKEMIJSKEM ANALIZATORJU INTRODUCTION OF AUTOMATED MEASURING OF HEMOLYSIS INDEX ON THE BIOCHEMICAL ANALYZER MAGISTRSKA NALOGA Magistrski študij laboratorijske biomedicine Ljubljana, 2016

Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Milana Skitka, spec. med. biok. in somentorstvom Petre Šepec, univ. dipl. kem., spec. med. biokem.. Praktičen del naloge sem v celoti opravila na Oddelku za laboratorijsko medicino Splošne bolnišnice Celje. Zahvala Iskreno se zahvaljujem mentorju, izr. prof. dr. Milanu Skitku, spec. med. biok., ki mi je omogočil opravljati magistrsko nalogo. Za strokovno pomoč in nasvete pri izdelavi diplomske naloge se najlepše zahvaljujem Petri Šepec, univ. dipl. kem., spec. med. biokem.. Posebna zahvala pa velja moji družini, ki mi je omogočila študij in me vsa leta moralno podpirala. Izjava Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom izr. prof. dr. Milana Skitka, spec. med. biok. in somentorstvom Petre Šepec, univ. dipl. kem., spec. med. biokem.. Ljubljana, 2016 Predsednik komisije: izr. prof. dr. Tomaž Vovk Članica komisije: asist. dr. Urša Pečar Fonović

KAZALO POVZETEK I ABSTRACT II KAZALO SLIK IV KAZALO PREGLEDNIC IV SEZNAM OKRAJŠAV VII 1. UVOD 1 1.1. HEMOLIZA 3 1.1.1. OPREDELITEV HEMOLIZE 3 1.1.2. VRSTE HEMOLIZ 4 1.1.2.1. IN-VIVO HEMOLIZA 4 1.1.2.2. IN-VITRO HEMOLIZA 5 1.1.3. MEHANIZMI MOTENJ PRI HEMOLIZI 6 1.1.4. PREPREČEVANJE HEMOLIZE V VZORCIH 7 1.1.5. RAVNANJE S HEMOLIZIRANIMI VZORCI 7 1.2. AVTOMATSKO MERJENJE INDEKSA NA BIOKEMIJSKIH APARATIH 8 1.2.1. ABSORPCIJSKA SPEKTROSKOPIJA 8 1.2.1.1. UV IN VIS SPEKTROSKOPIJA 9 1.2.1.2. BEER-LAMBERTOV ZAKON 9 1.2.1.3. SPEKTROFOTOMETER 10 1.2.2. SERUMSKI INDEKS 11 2. NAMEN DELA 13 3. MATERIALI IN METODE 14 3.1. VZORCI 14 3.2. PREDHODNO IZVEDEN POSTOPEK 14 3.2.1. CENTRIFUGIRANJE VZORCEV 14 3.3. PRIMERJAVA MED VIZUALNO OCENJENO HEMOLIZO IN IZMERJENIM INDEKSOM-H 15 3.3.1. VIZUALNO OCENJEVANJE VZORCEV 15 3.3.2. MERJENJE INDEKSA-H 16 3.3.2.1. VREDNOTENJE INDEKSA-H 16 3.3.3. STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV VIZUALNE OCENE HEMOLIZE IN IZMERJENEGA INDEKSA-H 17 3.4. VPLIV STOPNJE HEMOLIZE NA BIOKEMIJSKE PARAMETRE 18 3.4.1. POSTOPEK MERJENJENJA INDEKSA-H IN OSNOVNIH BIOKEMIJSKIH PARAMETROV 18 3.4.2. VPLIV HEMOLIZE NA BIOKEMIJSKE PREISKAVE 19 3.4.3. STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV 20 4. REZULTATI 23

4.1. REZULTATI PRIMERJAV MED VIZUALNO OCENJENIMI VZORCI IN IZMERJENIMI VREDNOSTMI INDEKSA- H 23 4.2. REZULTATI VREDNOTENJA BIOKEMIJSKIH PREISKAV 25 4.2.1. KREATIN KINAZA 25 4.2.2. ASPARTAT AMINOTRANSFERAZA 26 4.2.3. ALANIN AMINOTRASFERAZA 27 4.2.4. GAMA GLUTAMIL TRANSFERAZA 28 4.2.5. ALKALNA FOSFATAZA 29 4.2.6. KALCIJ 30 4.2.7. SEČNINA 31 4.2.8. KREATININ 32 4.2.9. URATI 33 4.2.10. CELOKUPNI BILIRUBIN 34 4.2.11. DIREKTNI BILIRUBIN 35 4.2.12. ALBUMIN 36 4.2.13. C-REAKTIVNI PROTEIN 37 4.2.14. KALIJ 38 4.2.15. NATRIJ 39 4.2.16. KLORIDI 40 5. RAZPRAVA 41 5.1. PRIMERJAVA MED VIZUALNO OCENJENIMI VZORCI IN IZMERJENIMI VREDNOSTMI INDEKSA-H 41 5.2. VREDNOTENJE BIOKEMIJSKIH PREISKAV 42 5.2.1. KREATIN KINAZA 42 5.2.2. ASPARTAT AMINOTRANSFERAZA 43 5.2.3. ALANIN AMINOTRASFERAZA 43 5.2.4. GAMA GLUTAMIL TRANSFERAZA 44 5.2.5. ALKALNA FOSFATAZA 44 5.2.6. KALCIJ 44 5.2.7. SEČNINA 45 5.2.8. KREATININ 45 5.2.9. URATI 45 5.2.10. CELOKUPNI BILIRUBIN 46 5.2.11. DIREKTNI BILIRUBIN 46 5.2.12. ALBUMIN 47 5.2.13. C-REAKTIVNI PROTEIN 47 5.2.14. KALIJ 47 5.2.15. NATRIJ 48 5.2.16. KLORIDI 48 6. SKLEP 49 7. LITERATURA 51 8. PRILOGA 53

POVZETEK Hemoliza vzorca, ki nastane med odvzemom ali po odvzemu vzorca, je ena najpogostejših napak v predanalitski fazi. Hemolizirani vzorci so velikokrat neprimerni za analizo zaradi različnih vplivov hemolize na laboratorijske preiskave. Določenih preiskav v hemoliziranih vzorcih ne moremo opraviti. Sodobni laboratorijski analizatorji omogočajo avtomatsko določanje indeksa hemolize (indeks-h). Analizator spektrofotometrično izmeri prosti hemoglobin v serumu ali plazmi skupaj z biokemijskimi parametri. Rezultate za prisotni hemoglobin poda kvalitativno ali semikvantitativno. Namen magistrske naloge je bil uvesti avtomatsko določanje indeksa-h na analizatorju Cobas c501 proizvajalca Roche Diagnostics. Merjenjem indeksa-h bi na Oddelku za laboratorijsko medicino zamenjalo dosedanjo vizualno oceno hemolize. V ta namen so trije laboratorijski delavci ocenili stopnjo hemolize 160. serumskim vzorcem, ki so bili hemolizirani. Skladnost stopnje zaznave hemolize med posameznim laboratorijskim delavcem in izmerjenim indeksom-h ugotavljali s koeficientom kappa (κ) po Cohenu. Poleg tega smo želeli ugotoviti dejanski vpliv različne stopnje hemolize, v hemoliziranih in nehemoliziranih vzorcih preiskovancev, na 16 biokemijskih parametrov. S tem smo si postavili svoje kriterije o vplivu hemolize na izbrane preiskave. Ugotovili smo, da je povprečna vrednost koeficienta Kappa med posameznim laboratorijskim delavcem in izmerjenim indeksom-h 0,366 (95% Cl = 0,255-0,476), kar pomeni, da je ujemanje zmerno. Ujemanje vizualne zaznave hemolize proti avtomatski določitvi indeksa-h med 0,30 in 0,40 g/l je komaj 51%, med rahlo hemolizo in hemolizo (0,61 do 0,90 g/l) pa je ujemanje samo 5-21%. Pri mejnem območju med hemolizo in močno hemolizo (2,01 in 2,50 g/l) pa je bilo ujemanje 33%. Ugotovili smo, da rahla hemoliza vpliva na kalij, aspartat aminotransferazo in direktni bilirubin, hemoliza pa na kreatin kinazo. Močna hemoliza vpliva na vrednosti alanin aminotransferaze, natrij, kloride in alkalno fosfatazo. Ne glede na stopnjo hemolize lahko podamo rezultate za: gama glutamil transferazo, kalcij, sečnino, kreatinin, C-reaktivni protein, urate in celokupni bilirubin. Na podlagi dobljenih rezultatov smo prišli do zaključka, da bi bila na Oddelku za laboratorijsko medicino Splošne bolnišnice Celje uvedba rutinskega avtomatskega merjenja indeksa-h zelo smiselna. I

ABSTRACT Sample haemolysis of a sample that occurs during or after sample collection is one of the most common mistakes in the pre-analytic phase. Haemolyzed samples are often unsuitable for analysis because of the different influences of haemolysis on laboratory tests. Certain tests cannot be performed with haemolysed samples. Modern laboratory analyzers enable the automatic determination of haemolysis index (Hindex). An analyzer spectrophotometrically measures the level of free haemoglobin in the serum or plasma, and the biochemical parameters. The results for haemoglobin are given qualitatively or semi-quantitatively. The purpose of this master thesis was to implement the automated estimation of H-index on analyser Cobas c501 by Roche Diagnostics. In our Department for Laboratory Medicine we want to replace the hitherto visual assessment of haemolysis with the automatic measurement of H-index. Therefore three laboratory workers assessed the level of haemolysis in 160 hemolysed serum samples. The congruence of the hemolysis detection level between each laboratory worker and measured H-index was analyzed with Cohen's kappa coefficient (κ). Furthermore we wanted to estimate the actual influence of various stages of haemolysis in haemolysed and non-haemolysed samples of test subjects on 16 biochemical parameters. That is how we determined our criteria for the influence of haemolysis on selected tests. We established that the average value of the kappa coefficient between each laboratory worker and measured H-index is 0,366 (95% Cl = 0,255-0,476). That means that congruence is moderate. The congruence of visual assessment of haemolysis and automated determining of H-index between 0,30 and 0,40 g/l is only 51%, between the midl haemolysis and moderate haemolysis (0,61 to 0,90 g/l) congruency is merely 5-21%. On the threshold area between moderate haemolysis and sever haemolysis (2,01 and 2,50 g/l) the congruence was 33%. We discovered that midl haemolysis influences potassium, aspartate aminotransferase and direct bilirubin, while moderate haemolysis influences creatine kinase. Severe haemolysis influences values of alanine aminotransferase, sodium, chlorides and alkaline phosphatase. Regardless of the stage of haemolysis we can determine results for: gamma glutamyl transferase, calcium, urea, creatinin, c-reactive protein, uric acids and total bilirubin. II

Base on the results we have come to the conclusion that the introduction of routine automated measurement of H-index would be very reasonable in the Department oflaboratory Medicine of Celje General Hospital. III

KAZALO SLIK Slika 1: Delež napak v posameznih fazah laboratorijskega procesa... 2 Slika 2: Stopnje naraščanja hemolize v serumu... 3 Slika 3: Razlika v intenziteti prepuščene svetlobe... 9 Slika 4: Shema enožarkovnega fotometra... 11 Slika 5: Shema dvožarkovnega fotometra... 11 Slika 6: Stopnja hemolize v serumu glede na koncentracijo sproščenega hemoglobina v serumu... 15 Slika 7: Delež hemoliz na Oddelku za laboratorijsko medicino za leto 2014... 23 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica I: Ocena hemolize glede na izmerjen indeks-h... 16 Preglednica II: Vrednosti in interpretacija koeficienta kappa (κ)... 17 Preglednica III: Vpliv hemolize v serumu na rezultate testov... 19 Preglednica IV: Meje indeksa-h na vrednosti biokemijskih preiskav v serumu, s strani proizvajalca analizatorja COBAS c501 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija)... 20 Preglednica V: Dopustno odstopanje izmerjenih parametrov med hemoliziranimi in nehemoliziranimi vzorci... 21 Preglednica VI: Koeficient Kappa (κ) s 95% intervalom zaupanja (Cl) za tri laboratorijske delavce... 23 Preglednica VII: Povprečnega ujemanja vizualne zaznave hemolize pri različnih vrednostih indeksa-h... 24 Preglednica VIII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov CK pri različnih stopnjah hemolize... 25 Preglednica IX: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov AST pri različnih stopnjah hemolize... 26 Preglednica X: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov ALT pri različnih stopnjah hemolize... 27 Preglednica XI: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov γ-gt pri različnih stopnjah hemolize... 28 Preglednica XII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov AF pri različnih stopnjah hemolize... 29 Preglednica XIII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov Ca pri različnih stopnjah hemolize... 30 Preglednica XIV: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov sečnine pri različnih stopnjah hemolize... 31 IV

Preglednica XV: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov kreatinina pri različnih stopnjah hemolize... 32 Preglednica XVI: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov uratov pri različnih stopnjah hemolize... 33 Preglednica XVII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov C-BIL pri različnih stopnjah hemolize... 34 Preglednica XVIII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov D-BIL pri različnih stopnjah hemolize... 35 Preglednica XIX: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov albuminov, pri različnih stopnjah hemolize... 36 Preglednica XX: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov CRP pri različnih stopnjah hemolize... 37 Preglednica XXI: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov K pri različnih stopnjah hemolize... 38 Preglednica XXII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov Na pri različnih stopnjah hemolize... 39 Preglednica XXIII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov Cl pri različnih stopnjah hemolize... 40 Preglednica XXIV: Primerjava med mejami vpliva indeksa-h na vrednosti biokemijskih preiskav v serumu s strani proizvajalca analizatorja COBAS c501, starimi postavljenimi kriteriji in na novo postavljenimi kriteriji na Oddelku za laboratorijsko medicino SBC... 50 KAZALO GRAFOV Graf 1: Ujemanja vizualne zaznave različne stopnje hemolize z izmerjenim indeksom-h 24 Graf 2: Odstopanje CK hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 25 Graf 3: Odstopanje AST hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 26 Graf 4: Odstopanje ALT hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 27 Graf 5: Odstopanje γ-gt hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 28 Graf 6: Odstopanje AF hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 29 Graf 7: Odstopanje Ca hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 30 Graf 8: Odstopanje sečnine hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 31 V

Graf 9: Odstopanje kreatinina hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 32 Graf 10: Odstopanje uratov hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 33 Graf 11: Odstopanje C-BIL hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 34 Graf 12: Odstopanje D-BIL hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 35 Graf 13: Odstopanje albuminov hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 36 Graf 14: Odstopanje CRP hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 37 Graf 15: Odstopanje K hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 38 Graf 16: Odstopanje Na hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 39 Graf 17: Odstopanje Cl hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%)... 40 VI

SEZNAM OKRAJŠAV AF alkalna fosfataza ALT alanin aminotransferaza AST aspartat aminotransferaza Ca kalcij (ion) C-BIL celokupni bilirubin CK kreatin kinaze CK-MB izoencim kreatin kinaze mišično-možganskega tipa (ang. M- muscle, B-brain) Cl kloridi (ioni) CRP C-reaktivni protein D-BIL direktni bilirubin EDTA etilendiamintetraocetna kislina H hemoliza indeks-h indeks hemolize indeks-hil indeks hemolize, ikteričnosti in lipemije indeks-i indeks ikteričnosti indeks-l indeks lipemije K kalij (ion) LDH laktat dehidrogenaza MH močna hemoliza Na natrij (ion) NaCl natrijev klorid RH rahla hemoliza SBC Splošna bolnišnica Celje UV ultravijolično valovanje VIS vidno valovanje γ-gt gama glutamil transferaza VII

1. UVOD Vsak laboratorij, ki preiskuje vzorce biološkega materiala, pridobljenega iz človeškega telesa in druge materiale, ki so v pomoč kliniku, je medicinski laboratorij. Namen medicinskega laboratorija je pridobiti podatke za postavitev diagnoze, zdravljenje, preprečevanje bolezni ali oceno zdravstvenega stanja preiskovanca (1). Celoten laboratorijski proces je sestavljen iz treh glavnih faz (slika 1): Predanalitska faza laboratorijskega procesa vključuje: pripravo preiskovanca na odvzem biološkega materiala, odvzem, ustrezno pripravo tega materiala ter transport do laboratorija, sprejem in kontrola biološkega materiala v laboratoriju. Poteka tako v laboratoriju kot tudi izven njega, zato je v tej fazi največji delež napak v laboratorijskem procesu (2,3). Analitska faza laboratorijskega procesa vključuje analizo biološkega materiala in kontrolo rezultatov. Najpomembnejši del analitske faze je izvajanje notranje in zunanje kontrole kakovosti na sistemih. Zaradi tehnološkega napredka (avtomatizacije) je v tej fazi dosežena visoka stopnja točnosti in natančnosti (2,3) Poanalitska faza laboratorijskega procesa vključuje izdelavo laboratorijskega izvida z zapisi o preiskavah, poročanje, razumevanje in interpretacijo laboratorijskih rezultatov. Ta faza prav tako vključuje shranjevanje biološkega materiala po analizi in arhiviranje rezultatov (2). 1

Delež napak v posameznih fazah laboratorijskega procesa Poanalitska faza 19% Analitska faza 13% Predanaliska faza 68% Slika 1: Delež napak v posameznih fazah laboratorijskega procesa (3) Večina napak v laboratorijskem procesu izhaja iz predanalitske faze. Zaradi tega je ključnega pomena dobro poznavanje možnih vzrokov za napake in uvedba ustreznih ukrepov za zmanjševanje napak. Le tako se dosega kakovost laboratorijske diagnostike in kakovost oskrbe bolnikov (4). Velik vpliv v predanalitski fazi imajo fiziološki in metodološki dejavniki, ki niso povezani z bolnikovo boleznijo. Ti dejavniki vplivajo na rezultate laboratorijskih preiskav (5,6). Biološki dejavniki o Na dolgotrajne biološke dejavnike vpliva: starost, genetski dejavniki (dedne bolezni, spol), razvade (alkohol, kajenje ), ekološki dejavniki (vpliv okolja, način prehrane), ciklične spremembe (letni čas, biološki ritem). Na dolgotrajne biološke učinke ne moremo vplivati, upoštevati pa jih moramo pri interpretaciji laboratorijskih preiskav (5,6). o Na kratkotrajne biološke dejavnike vpliva: hrana, fizični napor, stres, položaj telesa pri odvzemu, čas odvzema S standardizacijo predanalitskih postopkov lahko znatno zmanjšamo vpliv kratkotrajnih bioloških dejavnikov (priprava bolnika, odvzem in ravnanje z biološkim materialom) (5,6). 2

Metodološki dejavniki (napake) se nanašajo na posamezne stopnje kliničnih preiskav: napake pri naročilu, odvzemu, transportu, pripravi ali shranjevanju biološkega materiala (5,6). Velik vpliv na analizo vzorcev v predanalitski fazi imajo hemoliza, lipemija in bilirubin, od katerih je hemoliza najpogostejša in ima velik vpliv na analizo vzorcev. Hemoliziran vzorec ni primeren za analizo nekaterih preiskav. Stopnjo hemolize v laboratoriju ocenjujemo vizualno, lahko pa tudi avtomatsko na biokemijskih analizatorjih. Vizualni pregled vzorca je subjektiven in nestandardiziran postopek, ki lahko potencira vir napak. Sodobni biokemijski analizatorji omogočajo določanje hemoglobina v vzorcu. (4). 1.1. HEMOLIZA 1.1.1. OPREDELITEV HEMOLIZE Hemoliza je sproščanje sestavin krvnih celic v plazmo ali serum zaradi poškodovane ali okvarjene membrane eritrocitov, levkocitov in trombocitov. Rdečo obarvanost seruma ali plazme povzroči prosti hemoglobin, kar je vidno po centrifugiranju. Hemolizo v centrifugiranih vzorcih navadno vizualno opazimo, kadar je koncentracija hemoglobina večja od 0,3 g/l (5,7), kar pomeni, da se je v vzorcu s koncentracijo hemoglobina 140 g/l sprostilo približno 0,2 % sestavine krvnih celic v plazmo ali serum (8). Vizualno opredelimo hemolizo kot: rahla (rožnato-rdečo obarvanost), srednja (rdečo obarvanost) ali močna hemoliza (močno rdečo obarvanost) (5,7). Slika 2 prikazuje stopnje naraščanja hemolize v vzorcu. Slika 2: Stopnje naraščanja hemolize v serumu 3

Število vseh hemoliziranih vzorcev, prejetih v klinični medicinski laboratorij, se ocenjuje na 2-3%. Od tega jih največji delež prihaja iz urgentnih oddelkov (53%), sledijo jim pediatrija (16%) in enota za intenzivno nego (17%) (8). 1.1.2. VRSTE HEMOLIZ Ločimo in-vivo hemolizo, ki jo povzročajo razni biološki dejavniki, in in-vitro hemolizo, ki nastane pri samem odvzemu vzorca ali po njem. Mnoga bolezenska stanja lahko vodijo v in-vivo hemolizo. V nujnih primerih je zato za zdravnika ključnega pomena, da ločimo med in-vivo in in-vitro hemolizo (5, 8). 1.1.2.1. IN-VIVO HEMOLIZA Kadar pride do razpada eritrocitov v krvnem obtoku, govorimo o in-vivo hemolizi ali intravaskularni hemolizi. (8). Vzrokov za razpad eritrocitov v krvnem obtoku je lahko veliko (znanih je več kot 50): o avtoimunski hemolitični sindrom, o transfuzijske reakcije, o dedne bolezni (hemoglobinopatija), o droge, o različne infekcije (malarija) (7, 9). Da gre za in-vivo hemolizo, lahko včasih v praksi posumimo, kadar je tudi naslednji odvzeti vzorec hemoliziran. V tem primeru je pomembno, da vzorca ne zavrnemo, ampak se posvetujemo z zdravnikom (5). 3,2% hemoliziranih vzorcev je hemoliziranih zaradi in-vivo hemolize (9). 4

NEKATERE ZNAČILNOSTI IN-VIVO HEMOLIZE o Povišana vrednost hemoglobina v plazmi ali serumu in s tem rdeče obarvanje vzorca. o Zvišanje retikulocitov (iz njih dozorijo eritrociti), je pogost pojav pri hemolitični anemiji, vendar zelo nespecifičen. Povečana proizvodnja eritrocitov je lahko povezana s krvavitvijo ali z odzivom kostnega mozga na pomanjkanje vitamina B12, železa ali folatov. Koncentracija retikulocitov je lahko tudi normalna ali znižana zaradi močnega delovanja kostnega mozga (8). o Zvišana vrednost laktat dehidrogenaze (LDH) je običajna za hemolizo, vendar ni diagnostično specifična. LDH se sprošča tudi v različnih neoplastičnih in ishemičnih motnjah (8). o Pogosto je povišana koncentracija nekonjugiranega bilirubina, ki pa je lahko prav tako posledica Gilbertovega sindroma. Kadar je prisotna hemolitična anemija, je koncentracija indirektnega bilirubina običajno manj kot 70 µmol/l. Kadar pa so vrednosti bilirubina višje, je večja verjetnost jetrnih okvar (8). o Zmanjšana je koncentracija serumskega proteina haptoglobina, ki nase veže prosti hemoglobin in je občutljivi označevalec intravaskularne hemolize (8). Za najboljšo diagnostiko in razlikovanje in-vivo od in-vitro hemolize je torej pomembna zmanjšana koncentracija haptoglobina in morebitno zvišanje koncentracije LDH ter s tem posredno zvišanje bilirubina in / ali retikulocitov (8). 1.1.2.2. IN-VITRO HEMOLIZA Do in-vitro hemolize lahko pride med odvzemom (pogosteje) vzorca ali po njem. Vzrokov za nastanek hemolize je lahko več: o Vzroki pri preiskovancu: težaven odvzem (majhne ali krhke žile). o Vzroki pri osebju, ki odvzemajo kri: premajhne ali prevelike igle, predolgo trajanje podveze, prenos alkohola iz vboda na koži v krvni vzorec, prevelike koncentracije dodatkov v epruveti (EDTA lahko povzroči pokanje membrane eritrocitov). o Ravnanje z vzorci: pretirano tresenje ali mešanje krvi. 5

o Transport: izpostavljenost pretirani visoki ali nizki temperaturi. o Priprava vzorca: centrifugiranje pri previsokih obratih, prepozna ločitev seruma. o Shranjevanje vzorca: pogoji hranjenja (temperatura, čas hranjenja vzorca) (7, 10). Zaradi patološkega izvora je hemoliza in vitro klinično pomembnejša (9). ZNAČILNOSTI IN-VITRO HEMOLIZE o Povišana vrednost hemoglobina v plazmi ali serumu in s tem rdeče obarvanje vzorca. Zvišane vrednosti kalijevih ionov, LDH in aspartat aminotransferaze (AST). Vrednosti haptoglobina in retikulocitov ostajata v mejah referenčnih vrednosti (7, 9, 10). 1.1.3. MEHANIZMI MOTENJ PRI HEMOLIZI Hemoliza in-vivo ali in-vitro lahko povzroči navidezno znižanje ali zvišanje rezultatov. K temu prispevajo različni mehanizmi: Sproščanje znotrajceličnih vsebin o Sestavine eritrocitov, ki uhajajo v plazmo ali serum povzročijo višjo koncentracijo merjenega analita (npr.: K, LDH, AST, ALT) (11). o Znotrajcelična tekočina eritrocitov kontaminira serum ali plazmo, kar lahko povzroči znižanje koncentracije tistih analitov, ki so v celicah v nižjih koncentracijah (npr.:na, Cl, glukoza) (2,11). Spektralna interferenca o Optične motnje so lahko posledica barvnega učinka hemoglobina. Hemoglobin lahko vpliva na spektrofotometrično merjenje predvsem pri valovnih dolžinah 415, 540 in 570 nm, kjer ima visoke absorpcijske vrhove (npr.: gama glutamil transferaza (γ-gt, AF)) (2,11). 6

Kemijska interferenca o Adenilat kinaza sproščena iz eritrocitov lahko povzroči povečanje kreatin kinaze (CK) in izoencim kreatin kinaze mišično-možganskega tipa (CK- MB). Vpliv je možno zmanjšati z dodatkom inhibitorjev adenozin monofosfat (11, 12). o S psevdoperoksidazno aktivnostjo sproščen hemoglobin zavira nastanek diazo kompleksa. Tako lahko pri metodi Jendrassik-Groff izmerimo lažno znižano vrednost bilirubina (5). 1.1.4. PREPREČEVANJE HEMOLIZE V VZORCIH Ker ponoven odvzem vzorcev vedno ni možen, hemolizo in-vitro lahko v večini primerov preprečimo z upoštevanjem predanalitskih faz. Ta pa obsega pripravo bolnika, odvzem vzorca in nadaljnjo obdelavo vzorca do analize (7). 1.1.5. RAVNANJE S HEMOLIZIRANIMI VZORCI Vsak laboratorij mora imeti jasna navodila, kako ravnati s hemoliziranimi vzorci. Kadar je v vzorcu prisotna hemoliza, se glede na merila odločimo ali: hemoliza ne vpliva na samo analizo, zato rezultat podamo brez komentarjev, rahla hemoliza vpliva na analizo, vendar v takšni meri, da rezultat še lahko izdamo in poleg rezultata dodamo oznako»rahla hemoliza«, hemoliza tako močno vpliva na analizo, da moramo vzorec zavrniti in zahtevamo nov vzorec (13). 7

1.2. AVTOMATSKO MERJENJE INDEKSA NA BIOKEMIJSKIH APARATIH Sodobni laboratorijski analizatorji omogočajo avtomatsko določanje indeksa hemolize (indeks-h). Analizator spektrofotometrično izmeri prosti hemoglobin v serumu ali plazmi skupaj z biokemijskimi parametri. Rezultate za prisotni hemoglobin poda kvalitativno ali semikvantitativno. Avtomatsko merjenje je priporočljivo saj lahko določi rahlo hemolizirane vzorce, poleg tega pa se izognemo subjektivnemu ocenjevanju posameznika (7, 8). V splošnem poteka merjenje indeksa-h tako, da se vzorcu doda reagent (NaCl ali destilirana voda) in pri določeni valovni dolžini izmeri absorbanco prisotnega hemoglobina. Nato se izračuna in poda vrednost indeksa-h. Avtomatizirano merjenje indeksa hemolize je koristno iz več razlogov: objektivnost, povečana stopnja produktivnosti, zmanjšanje napak, večja ponovljivost, odkrivanje rahlo hemoliziranih vzorcev (hemoglobin v razponu med 0,3 g/l in 0,6 g/l) (7, 13). Običajno se uporablja semikvantitativno spektrofotometrično merjenje motečih snovi (7, 13). 1.2.1. ABSORPCIJSKA SPEKTROSKOPIJA Za kvantitativno določanje koncentracij različnih organskih in anorganskih spojin v raztopinah se pogosto uporablja spektroskopijo v vidnem in ultravijoličnem delu spektra (UV-VIS). Najpogosteje se uporablja fotometrijo za kvantitativno določanje koncentracije absorbirajočih zvrsti (14). 8

1.2.1.1. UV IN VIS SPEKTROSKOPIJA O ultravijolični (UV) spektroskopiji govorimo, kadar merimo absorpcijo svetlobe v področju valovne dolžine med 190 335 nm. O vizualni spektroskopiji (VIS) pa, kadar merimo absorpcijo snovi v področju vidnega svetlobnega spektra (335-800 nm). Merimo lahko transmisijo (T) ali absorbanco (A) (14). Po presvetlitvi raztopine določene snovi z monokromatsko svetlobo intenzitete I o (jakost vpadne svetlobe), bo imela prepuščena svetloba manjšo intenziteto I (jakost prepuščene svetlobe) (Slika 3) (14). topilo vzorec s koncentracijo c I 0 I I 0 I Slika 3: Razlika v intenziteti prepuščene svetlobe Transmitanca (T) (prepustnost) je razmerje med intenziteto prepuščene in vpadne svetlobe in nam pove odstotek prepuščene svetlobe (15): Absorbanca (A) je desetiški logaritem razmerja intenzitete vpadle svetlobe in intenzitete neabsorbirane (prepuščene) svetlobe (15): A= log 10 T T = I/I o dolžina optične poti 1.2.1.2. BEER-LAMBERTOV ZAKON S fotometrom merimo absorbanco vzorca (navadno raztopine). Beer-Lambertov zakon opisuje zvezo med absorbanco in koncentracijo snovi v kiveti (14, 15): A=ε c l 9

A.absorbanca c...koncentracija snovi [mol L -1 ] l dolžina optične poti svetlobnega žarka [cm] ε molarno ekstinkcijski koeficient [L mol -1 cm -1 ] (značilen za določeno snov) Absorpcijski spekter je zveza med uporabljeno valovno dolžino in absorbanco. Absorpcijski spektri so za posamezne molekule različni. Valovna dolžina absorbirane svetlobe je odvisna od funkcionalnih skupin ali razporeditve atomov v vzorcu. Za identifikacijo posamezne snovi zato uporabljamo absorpcijski spekter (15). 1.2.1.3. SPEKTROFOTOMETER Spektrofotometri so inštrumenti za merjenje absorbance oz. prepustnosti. Delujejo na več načinov, kljub temu pa so vsi sestavljeni iz: Svetlobnega vira: navadno devterijeva žarnica za UV del spektra in volframova žarnica za vidni del spektra. Monokromator za izbiro določene valovne dolžine (prizme, uklonske mrežice, filtri). Kiveta z vzorcem, kjer se del svetlobe absorbira. Fotopomnoževalka, ki izmeri intenziteto prepuščene svetlobe in prevede optični signal v ustrezno električno napetost. Zaslon, na katerem se odčita absorpcija ali transmitanca (14). Poznamo enožarkovni (Slika 4) ali dvožarkovni spektrofotometer (Slika 5). Žarek se pri dvožarkovnem spektrofotometru razcepi na dva enaka žarka, ki hkrati presvetlita kiveto z vzorcem in referenčno raztopino (slepi vzorec). S tem se izognemo prispevku absorpcije, ki ni odvisen od koncentracije snovi. Vrednosti referenčnega vzorca pri enožarkovnih analizatorjih naknadno odštejemo (15). 10

Slika 4: Shema enožarkovnega fotometra Slika 5: Shema dvožarkovnega fotometra 1.2.2. SERUMSKI INDEKS Interference v vzorcu (hemoliza, ikteričnost in lipemija) so lahko podane kot serumski indeks (indeks-hil). To so izračunane meritve absorbanc, ki nam povedo semikvantitativno količino hemoglobina, bilirubina ali lipemičnih delcev v vzorcu, ki jih analiziramo (16). PRINCIP MERJENJA INDEKSA HEMOLIZE, IKTERIČNOSTI IN LIPEMIJE (HIL) NA ANALIZATORJU COBAS C501 Analizator vzorec avtomatsko redči z 0,9 % NaCl in nato izmeri absorbanco pri treh parih valovne dolžine: Za merjenje lipemije (indeks-l) izmeri absorbanco pri valovnih dolžinah 700/660 nm, saj v tem območju ni vpliva hemolize in bilirubina. Hemolizo (indeks-h) izmeri pri valovnih dolžinah 600/570 nm (korekcija je narejena za absorpcijo zaradi lipemije). 11

Ikteričnost (indeks-i) izmeri pri valovnih dolžinah 505/480 nm (korekcija je narejena za absorpcijo zaradi lipemije in hemolize) (16, 17). Izmerjene absorbance nato analizator avtomatsko pomnoži s: Faktorji, ki so odvisni od redčenja in želenih enot (konvencionalnih ali SI enot). Izberemo vedno tiste enote, v katerih želimo podati rezultate testov. Faktorji, ki zmanjšajo motenje prekrivanja spektrov (17) IZRAČUN INDEKSA HIL: L = 1 C (Abs1) H = 1 (Abs2 B Abs1) A I = 1 (Abs3 E Abs2 F Abs1) D L,H,I serumski indeks za lipemijo, hemolizo, ikteričnost C,A,D..faktor za spremembo absorbance (x10 4 ) v serum indeks Abs 1 bikromatska absorbanca odčitana pri 700 in 660nm za lipemijo Abs 2 bikromatska absorbanca odčitana pri 600 in 570nm za hemolizo Abs 3 bikromatska absorbanca odčitana pri 505 in 480nm za lipemijo B..korekcija merjenega hemoglobina Abs 2 za lipemijo E,F korekcija merjenega bilirubina Abs za lipemijo in hemoglobin (17) OMEJITEV INDEKSOV-HIL Ni standardizacije. Vrednosti med analizatorji niso primerljive. Različno podajanje rezultatov (kvalitativna ali semikvantitativna ocena). Ni primerno za diagnozo, ampak je zgolj informacija o kvaliteti vzorca (10). 12

2. NAMEN DELA Namen dela je bil: 1. Ugotoviti primerljivost vizualnega pregleda serumskih vzorcev z avtomatskim določanjem indeksa-h na analizatorju Cobas c501 proizvajalca Roche Diagnostics. 2. Ugotoviti dejanski vpliv različne stopnje hemolize v vzorcih na 16. biokemijskih parametrov: kreatin kinazo (CK), aspartat aminotransferazo (AST), alanin aminotransferazo (ALT), gama glutamil transferazo (γ-gt), alkalna fosfatazo (AF), kalcij (Ca), sečnino, kreatinin, urate, celokupni bilirubin (C-BIL), direktni bilirubin (D-BIL), albumine, C-reaktivni protein (CRP), kalij (K), natrij (Na) in kloridi (Cl). S tem bomo ugotovili ali se že postavljeni kriteriji v laboratoriju Splošne bolnišnice Celje (SBC) skladajo s postavljenimi mejami proizvajalca Roche Diagnostics za analizator Cobas c501, glede na izmerjeni indeks-h. Proizvajalec Roche Diagnostics ima postavljen 10% kriterij odstopanja za vse biokemijske parametre. Glede na rezultate bomo postavili nove kriterije glede vpliva Indeksa-H na vsak posamezen analit. 3. Ugotoviti ali je smiselna uvedba rutinskega avtomatskega merjenja indeksa-h na Oddelku za laboratorijsko medicino SBC. S tem bi zamenjali dosedanjo vizualno oceno hemolize in zmanjšali vir potencialnih napak, ki nastajajo zaradi vizualnega pregleda vzorcev. 13

3. MATERIALI IN METODE 3.1. VZORCI Kot biološki vzorec smo uporabili vensko kri, odvzeto v epruveto brez antikoagulanta. Kri je bila odvzeta po standardiziranih priporočilih za odvzem krvi. Vsi vzorci so bili odvzeti v Splošni bolnišnici Celje (SBC). Vizualna ocena vzorcev Za primerjavo med vizualno ocenjeno hemolizo in izmerjenim indeksom-h v serumu smo zbrali 160 serumskih vzorcev, ki so bili hemolizirani in so ostali po opravljeni rutinski analizi. Naključno smo izbrali tri laboratorijske delavce in jih prosili, da ocenijo stopnjo hemolize. Vpliv hemolize na izbrane biokemijske parametre V drugi del naloge smo vključili vzorce 130-ih preiskovancev iz ambulante Internistične prve pomoči (IPP). Vzorce, ki so bili hemolizirani, smo vizualno ocenili z eno od stopenj hemolize. Naročnika vedno obvestimo, ko ugotovimo hemolizo vzorca. V kolikor smo v roku 60 minut prejeli nov vzorec in le-ta ni bil hemoliziran, smo opravili analizo obeh vzorcev. Določili smo indeks-h v obeh vzorcih in na podlagi izmerjenih vrednosti ugotovili odstopanje med hemoliziranim in nehemoliziranim vzorcem. 3.2. PREDHODNO IZVEDEN POSTOPEK 3.2.1. CENTRIFUGIRANJE VZORCEV Vzorce smo za uspešno analizo krvi najprej primerno pripravili. Po odvzemu in končanem procesu koagulacije (30 45 minut) smo kri centrifugirali. Med centrifugiranjem se je krvni serum ločil od krvnih celic. Tako dobljeni krvni serum smo nato takoj odlili v označeno plastično epruveto za enkratno uporabo z zamaškom. 14

Aparature in pribor za centrifugiranje Centrifuga Centric 350 (Tehtnica, Železniki, Slovenija) polavtomatske pipete (50-500 µl) (Eppendorf, Hamburg, Nemčija) nastavki za pipete (Eppendorf, Hamburg, Nemčija) plastične epruvete z zamaški Pogoji centrifugiranja 3500 obratov v minuti oziroma 2020 x g 6 minut 3.3. PRIMERJAVA MED VIZUALNO OCENJENO HEMOLIZO IN IZMERJENIM INDEKSOM-H 3.3.1. VIZUALNO OCENJEVANJE VZORCEV Na Oddelku za laboratorijsko medicino SBC imamo opredeljene kriterije za vizualno oceno hemolize. Vzorce so vizualno pregledali in ocenili trije laboratorijski delavci. Opredelili smo jo kot: rahla hemoliza, hemoliza ali močna hemoliza, glede na obarvanost seruma zaradi sproščenega hemoglobina. 0,0 g/l 0,3 g/l 0,6 g/l 1,0 g/l 2,2 g/l 4,2 g/l Ni hemolize Rahla hemoliza Hemoliza Močna hemoliza Slika 6: Stopnja hemolize v serumu glede na koncentracijo sproščenega hemoglobina v serumu 15

3.3.2. MERJENJE INDEKSA-H Material za analizo indeksa-h s črtno kodo označene epruvete z vzorci analizator COBAS c501 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) aplikacija Serum Index Gen.2 (SI2) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) 0,9 % NaCl (Roche Diagnostics, Mannheim GmbH, Nemčija) Serume, ki smo jih predhodno pripravili, smo analizirali na analizatorju COBAS c501 firme Roche Diagnostics. Analizirali smo jih s pomočjo aplikacije Serum Index Gen.2 (SI2), ki omogoča meritev indeksa-hil. 3.3.2.1. VREDNOTENJE INDEKSA-H Izmerjene vrednosti indeksa-h v serumu smo opredelili kot: rahlo hemolizo, hemolizo ali močno hemolizo, glede na izmerjene koncentracije sproščenega hemoglobina v serumu (preglednica I). Preglednica I: Ocena hemolize glede na izmerjen indeks-h (8) Izmerjena hemoliza [g/l] Ocena hemolize glede na izmerjen indeks-h 0,00 0,29 N 0,30 0,60 RH 0,61 2,00 H > 2,01 MH (Legenda: N - ni hemolize; RH - rahla hemoliza; H - hemoliza; MH - močna hemoliza) 16

3.3.3. STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV VIZUALNE OCENE HEMOLIZE IN IZMERJENEGA INDEKSA-H Skladnost stopnje zaznave hemolize med posameznim laboratorijskim delavcem in izmerjenim indeksom-h ugotavljali s koeficientom Kappa (κ) po Cohenu. Le te ga se uporablja za skladnost opisnih podatkov. Pri testu se postavi hipoteza, da se testa ne ujemata, ki se nato potrdi ali ovrže. Kot rezultat dobimo κ, ki predstavlja dobro ali slabo ujemanje metod. Koeficient Kappa se podaja v vrednosti od 0 do 1, kjer je 0 popolno neujemanje in 1 popolno ujemanje (preglednica II) (19). Uporabili smo 95% interval zaupanja. po p κ = 1 p e e p o dejansko razmerje ujemanja P e pričakovano naključno ujemanje Preglednica II: Vrednosti in interpretacija koeficienta kappa (κ) (19) Vrednost koeficienta kappa (κ) Ujemanje < 0,20 Slabo 0,21-0,40 Zmerno 0,41-0,60 Dobro 0,61-0,80 Odlično 0,81-1,00 Popolno Statistično smo vzorce obdelali s programom MedCalc 11.3.8. Ocenjevali smo odstotek ujemanja vizualne zaznave hemolize pri različnih vrednostih indeksa-h. Kriterij: % odstopanja vizualne zaznave od izmerjene vrednosti indeksa-h število ugodnih dogodkov Razlika R (%) = 100 število vseh dogodkov Statistično smo vzorce obdelali s programom Microsoft Office Excel 2007. 17

3.4. VPLIV STOPNJE HEMOLIZE NA BIOKEMIJSKE PARAMETRE 3.4.1. POSTOPEK MERJENJENJA INDEKSA-H IN OSNOVNIH BIOKEMIJSKIH PARAMETROV Material za analizo indeksa-h in osnovnih biokemijskih parametrov s črtno kodo označene epruvete z vzorci analizator COBAS c501 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) aplikacija Serum Index Gen.2 (SI2) (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) 0,9% NaCl (Roche Diagnostics, Mannheim GmbH, Nemčija) Reagenti biokemijskih parametrov: CK, AST, ALT, γ-gt, AF, Ca, sečnina, kreatinin, urati, celokupni bilirubin, direktni bilirubin, albumin, CRP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) ISE interni standard, ISE referenčna raztopina, ISE diluent Gen 2 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) Postopek Serume, ki smo jih predhodno pripravili, smo analizirali na analizatorju COBAS c501 firme Roche Diagnostics. Analizirali smo jih s pomočjo Serum Index Gen.2 (SI2) aplikacije, ki omogoča meritev indeksa-hil. Na analizatorju smo za vzorce nastavili meritev indeksa-hil in 16 biokemijskih parametrov: CK, AST, ALT, γ-gt, AF, Ca, sečnina, kreatinin, urati, celokupni bilirubin, direktni bilirubin, albumin, CRP, K, Na, Cl. Epruvete smo nato vstavili v nosilec, le-tega pa v analizator. Po vključitvi analizatorja je ves nadaljnji postopek potekal avtomatizirano. Po zaključku analize so se rezultati izpisali na ekranu in samodejno natisnili. 18

3.4.2. VPLIV HEMOLIZE NA BIOKEMIJSKE PREISKAVE Oddelek za laboratorijsko medicino SBC Glede na večletne lastne izkušnje in glede na podatke iz literature (navodila proizvajalca reagentov/aparata Roche) smo na Oddelku za laboratorijsko medicino SBC sestavili preglednico Vpliv hemolize na rezultate testov (preglednica III). Preglednica III: Vpliv hemolize v serumu na rezultate testov stopnja hemolize vpliv na test rahla hemoliza LDH CK-MB Bilirubin direktni hemoliza močna hemoliza Kalij CK AST KF celokupna KF neprostatična Železo Magnezij Etanol AF Natrij Fosfati Baker Proteini Aldolaza Troponin T hs NSE Inzulin Folna kislina 25-OH Vitamin D Acetaminofen DHEA-S Karbamazepin S-EF proteinov SR koagulacijski testi Glukoza-6-P-DH IgE NH 3 Beta-2-mikroglobulin ttg IgA anti-dsdna (Legenda:KF celokupna - celokupna kisla fosfataza; KF neprostatična - neprostatična kisla fosfataza; Troponin T hs visoko občutljiv troponin T; NSE - neuron specifična enolaza; SR- sedimentacija; Glukoza- 6-P-DH - Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza; IgE Iunoglobulin E, NH 3 amoniak; DHEA-S dehidroepiandosteron sulfat; EF elektroforeza; ttg IgA - protitelesa proti tkivni transglutaminazi razreda IgA; anti-dsdna protitelesa proti dvojnovijačni deoksiribonukleinski kislini) Preglednica III navaja vplive različne stopnje hemolize, na rezultate posameznih testov, za katere se ne poda rezultatov. Tako npr. kadar zaznamo rahlo hemolizo in imamo naročen direktni bilirubin, rezultata ne podamo in pri analitu zapišemo komentar: rahla hemoliza. V primeru, da na analit vpliva že rahla hemoliza, je le ta v tabeli podan samo pod rahlo hemolizo, saj je samoumevno, da nanj vpliva tudi hemoliza in močna hemoliza. Na Oddelku za laboratorijsko medicino SBC pri močni hemolizi obvestimo naročnika in zapišemo komentar vzorca: Močno hemoliziran serum, orientacijski izvidi biokemičnih preiskav. 19

Roche Diagnostics Za vsak test so s strani proizvajalca Roche Diagnostics določene meje indeksa-h, ki imajo vpliv na analit (preglednica IV) (23). Preglednica IV: Meje indeksa-h na vrednosti biokemijskih preiskav v serumu, s strani proizvajalca analizatorja COBAS c501 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) analit Zgornja meja indeksa-h [g/l] Ocena hemolize glede na izmerjen Vpliv hemolize na rezultat indeks-h CK 2,00 H AST 0,40 RH ALT 2,00 H γgt 2,00 H AF 2,00 H Ca 10,00 MH SEČNINA 10,00 MH KREATININ 10,00 MH URATI 10,00 MH C-BIL 10,00 MH D-BIL 0,25 RH ALBUMIN 10,00 MH CRP 10,00 MH K 0,90 H Na 10,00 MH Cl 10,00 MH (Legenda: N-ni hemolize; RH - rahla hemoliza; H - hemoliza; MH - močna hemoliza; - lažno zvišani rezultati; - lažno znižani rezultati; - variabilni rezultati; - variabilnost ± 10% začetne koncentracije) 3.4.3. STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV Statistično smo vzorce obdelali s programom Microsoft Excel 2007 in jih grafično prikazali. Izračunali smo odstotek odstopanja izmerjenih parametrov med hemoliziranimi in nehemoliziranimi vzorci. 20

Kriterij: +/- % odstopanja med rezultati Razlika R (%) = a rezultat nehemoliziranega vzorca b rezultat hemoliziranega vzorca a b a 100 Ker proizvajalčev kriterij za vpliv indeksa-h (10%) ni primeren za vse analite, smo si na Oddelku za laboratorijsko medicino postavili svoja dopustna odstopanja. Določili smo jih glede na Slovensko nacionalno shemo za zunanjo oceno kakovosti (SNEQAS) in minimalne kriterije notranje kontrole postavljene na Oddelku za laboratorijsko medicino SBC (Preglednica V). Preglednica V: Dopustno odstopanje izmerjenih parametrov med hemoliziranimi in nehemoliziranimi vzorci analit *SNEQAS (%) Naši postavljeni kriteriji za dopustno odstopanje (%) CK 20 20 AST 20 20 ALT 20 20 γgt 20 20 AF 20 20 Ca 10 10 SEČNINA 15 15 KREATININ 15 15 URATI 10 10 C-BIL 20 20 D-BIL / 20 ALBUMIN 10 10 CRP 20 15 K 6 5 Na 6 3 Cl 6 3 *SNEQAS (Slovenian National External Quality Assessment Scheme (Slovenska nacionalna shema za zunanjo oceno kakovosti)) 21

Pomembno je, da kritično ovrednotimo postavljene kriterije s strani proizvajalca in si izdelamo svoja merila o vplivu motečih snovi za vsak analit posebej. 22

4. REZULTATI Za sprejem naročil se na Oddelku za laboratorijsko medicino SBC uporablja LIS (laboratorijski informacijski sistem). V letu 2014 je bilo v LIS vpisanih 241933 laboratorijskih naročil. Od tega je bilo v serumu ali plazmi vizualno zaznanih in v LIS zabeleženih 3587 hemoliz: 2269 (1,4%) rahlih hemoliz 1188 (0,7%) hemoliz 130 (0,1%) močnih hemoliz (slika 9) Delež hemoliz na oddelku za laboratorijsko medicino za leto 2014 Brez hemolize 97,8% Rahla hemoliza Močna hemoliza 1,4% 0,1% Hemoliza 0,7% Slika 7: Delež hemoliz na Oddelku za laboratorijsko medicino za leto 2014 4.1. REZULTATI PRIMERJAV MED VIZUALNO OCENJENIMI VZORCI IN IZMERJENIMI VREDNOSTMI INDEKSA- H Skladnost stopnje zaznave hemolize med posameznim laboratorijskim delavcem in izmerjenim indeksom-h Preglednica VI: Koeficient Kappa (κ) s 95% intervalom zaupanja (Cl) za tri laboratorijske delavce Laboratorijski delavec 1 Laboratorijski delavec 2 Laboratorijski delavec 3 Povprečje κ (95% Cl) κ (95% Cl) 0,408 (0,292-0,523) 0,344 (0,235-0,452) 0,346 (0,238-0,454) 0,366 (0,255-0,476) 23

Ujemanja vizualne zaznave hemolize pri različnih vrednostih indeksa-h 120,0 100,0 80,0 60,0 % 40,0 20,0 0,0 0,17 0,28 0,29 0,32 0,34 0,36 0,41 0,48 0,51 0,56 0,58 0,60 0,62 0,66 0,70 0,72 0,81 0,84 0,87 0,93 0,98 1,05 1,10 1,16 1,30 1,43 1,51 1,82 1,95 2,37 3,20 3,99 H-indeks [g/l] % ujemanja vizualne zaznave hemolize z izmerjenim H-indeksom Graf 1: Ujemanja vizualne zaznave različne stopnje hemolize z izmerjenim indeksom-h Preglednica VII: Povprečnega ujemanja vizualne zaznave hemolize pri različnih vrednostih indeksa-h Vrednosti indeksa-h (g/l) % ujemanja 0-0,29 94 0,30-0,40 51 0,41-0,50 70 0,51-0,60 74 0,61-0,70 7 0,71-0,80 5 0,81-0,90 21 0,91-1,00 56 1,01-1,10 56 1,11-1,20 67 1,21-1,50 81 1,51-2,00 75 2,01-2,50 33 2,51-5,00 85 24

4.2. REZULTATI VREDNOTENJA BIOKEMIJSKIH PREISKAV 4.2.1. KREATIN KINAZA 250,0 200,0 150,0 % 100,0 50,0 0,0-50,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja H-ideks g/l Graf 2: Odstopanje CK hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica VIII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov CK pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 0 9 5 8 35 61 25

4.2.2. ASPARTAT AMINOTRANSFERAZA 1000,0 800,0 600,0 400,0 % 200,0 0,0-200,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja H-indeks g/l Graf 3: Odstopanje AST hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica IX: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov AST pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 0 5 0 31 88 258 26

4.2.3. ALANIN AMINOTRASFERAZA 300,0 250,0 200,0 150,0 % 100,0 50,0 0,0-50,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -100,0-150,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 4: Odstopanje ALT hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica X: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov ALT pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 7 13 17 17 13 34 27

4.2.4. GAMA GLUTAMIL TRANSFERAZA 80,0 60,0 40,0 % 20,0 0,0-20,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -40,0-60,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 5: Odstopanje γ-gt hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XI: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov γ-gt pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 15 8 14 12 9 6 28

4.2.5. ALKALNA FOSFATAZA 40,0 30,0 20,0 % 10,0 0,0-10,0-20,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -30,0-40,0-50,0-60,0-70,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 6: Odstopanje AF hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov AF pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 4 5 18 11 7 6 29

4.2.6. KALCIJ 20,0 15,0 10,0 5,0 % 0,0-5,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -10,0-15,0-20,0-25,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 7: Odstopanje Ca hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XIII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov Ca pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 2 4 5 6 4 3 30

4.2.7. SEČNINA 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 % 0,0-5,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -10,0-15,0-20,0-25,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 8: Odstopanje sečnine hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XIV: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov sečnine pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 2 2 3 4 3 4 31

4.2.8. KREATININ 50,0 40,0 30,0 % 20,0 10,0 0,0-10,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -20,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 9: Odstopanje kreatinina hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XV: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov kreatinina pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 7 4 3 5 8 9 32

4.2.9. URATI 25,0 20,0 15,0 10,0 % 5,0 0,0-5,0-10,0-15,0-20,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 10: Odstopanje uratov hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) H-indeks g/l Preglednica XVI: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov uratov pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 4 3 3 2 3 5 33

4.2.10. CELOKUPNI BILIRUBIN 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 % 20,0 10,0 0,0-10,0-20,0-30,0-40,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja H-indeks g/l Graf 11: Odstopanje C-BIL hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XVII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov C-BIL pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 11 8 7 11 12 19 34

4.2.11. DIREKTNI BILIRUBIN 40,0 20,0 0,0-20,0 % -40,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -60,0-80,0-100,0-120,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja -% dopustnega odstopanja Graf 12: Odstopanje D-BIL hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XVIII: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov D-BIL pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 45 75 93 0 0 0 35

4.2.12. ALBUMIN 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 % 10,0 5,0 0,0-5,0 0,25 0,49 0,63 0,78 0,89 0,95 1,02 1,13 1,19 1,23 1,26 1,3 1,37 1,39 1,5 1,58 1,69 1,71 2,22 2,5 2,69 2,9 3,28 3,77 5,24 6,17 H-indeks g/l -10,0-15,0 % odstopanja izmerjenih parametrov +% dopustnega odstopanja Graf 13: Odstopanje albuminov hemoliziranih vzorcev, glede na postavljene kriterije dopustnega odstopanja (%) Preglednica XIX: Znižanje oziroma zvišanje rezultatov albuminov, pri različnih stopnjah hemolize Povprečno znižanje rezultatov (%) Povprečno zvišanje rezultatov (%) RH H MH RH H MH 2 4 4 7 5 7 36