IN VITRO RAZMNOŽEVANJE ŽAJBLJA (Salvia officinalis L.)

UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE Dalia BENCIK IN VITRO RAZMNOŽEVANJE ŽAJBLJA (Salvia officinalis L.) DIPLOMSKO DELO Maribor, 2016

UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE AGRONOMIJA, POLJŠČINE, ZELENJAVA, OKRASNE RASTLINE Dalia BENCIK IN VITRO RAZMNOŽEVANJE ŽAJBLJA (Salvia officinalis L.) DIPLOMSKO DELO Maribor, 2016

POPRAVKI:

III Komisija za zagovor in oceno diplomskega dela: Predsednik komisije: doc. dr. Andrej ŠUŠEK Mentorica: izr. prof. dr. Metka ŠIŠKO Član komisije: red. prof. dr. Anton IVANČIČ Lektura: prof. Alneja Gašpar Horvat Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Datum zagovora: 22. april 2016

IV In vitro razmnoževanje žajblja (Salvia officinalis L.) UDK: 635.7:582.949:631.532:631.52(043.2)=163.6 V letih 2012 2014 smo v in vitro razmerah s tehniko tkivnih kultur razmnoževali žajbelj (Salvia officinalis L.). V poskus smo vključili izsečke S. officinalis kot izhodiščni material za gojenje v in vitro razmerah ter jih dali na indukcijsko gojišče. Rastlinski material smo z uporabo petih različnih metod sterilizacije predhodno površinsko sterilizirali. Najbolj uspešna je bila sterilizacija pri 15 minutnem obravnavanju s 50% etanolom in DICO. Druga naloga raziskave je bila najti čim bolj primerno gojišče za uspešno razmnoževanje žajblja. Pripravili smo tri različna gojišča G1, G2 in G3, ki so se med seboj razlikovala po vsebnosti rastnih regulatorjev. Največ poganjkov smo namnožili na gojišču G2, ki je vsebovalo BAP v koncentraciji 1 mg/l in IAA v koncentraciji 0,5 mg/l. Tretji del raziskave pa je bil povezan s koreninjenjem. Uporabili smo dve različni gojišči, K1 in K2. Število ukoreninjenih rastlin pri K1 je predstavljalo 82 %, pri K2 pa 79 % vseh rastlin. Na obeh gojiščih smo dobili dobre rezultate. V zaključnem delu raziskave smo rastline aklimatizirali v mini rastlinjakih. Po enem mesecu opazovanja smo prišli do zaključka, da so bile rastline uspešno aklimatizirane. Ključne besede: mikropropagacija / in vitro / tkivne kulture / žajbelj / Salvia officinalis L. OP: VI, 31 s., 6 preg., 3 graf., 8 slik, 29 ref. In vitro propagation of the common sage (Salvia officinalis L.) Between 2012 and 2014 we applied the in vitro tissue culture technique to reproduce common sage (Salvia officinalis L.). The experiment involved ordinary cuts/fragments of S. officinalis as starting material for the in vitro cultivation, which was placed on the induction culture medium. The surface of the involved plant material was pre-sterilized using five different approaches. The most successful sterilization involved 50% ethanol and DICA (sodium dichloroisocyanurat) and lasted 15 min. The second task of the experiment was to find the most appropriate medium for sage reproduction. We prepared three different culture media: G1, G2 and G3, each with a different content of growth regulators. Most of the shoots were multiplied in the culture medium G2 that contained BAP (benylamino purine) in concentration of 0.5 mg/l. The aim of the third task was determine the best medium for rooting. We used two different culture media: K1 and K2. The number of rooted plants in the K1 culture medium represents 82% and in K2 79% of all plants. We got good results on both K1 and K2. The last task was the acclimatisation of plantlets in a miniature greenhouse. After a month of observations, we came to the conclusion that the majority of plants were successfully acclimatised. Key words: micropropagation / in vitro / tissue culture / common sage / Salvia officinalis L. NO: VI, 31 P., 6 Tab., 3 Graph., 8 Pic., 29 Ref.

V Kazalo vsebine 1 UVOD... 1 2 PREGLED OBJAV... 3 2.1 Taksonomska in botanična klasifikacija... 3 2.2 Splošno o žajblju... 3 2.3 Podnebne razmere... 5 2.4 Pridelovanje žajblja... 5 2.5 Mikropropagacija... 6 2.5.1 Izsečki matične rastline... 6 2.5.2 Sterilizacija... 7 2.5.3 Sestava gojišča... 7 2.5.4 Razmnoževanje poganjkov... 8 2.5.5 Koreninjenje... 9 2.5.6 Aklimatizacija... 10 3 MATERIAL IN METODE... 11 3.1 Rastlinski material... 11 3.2 Priprava in sestava gojišč... 12 3.3 Sterilizacija rastlinskega materiala in indukcija kulture... 15 3.4 Iniciacija kulture... 18 3.5 Subkultiviranje poganjkov... 19 3.6 Koreninjenje... 20 3.7 Aklimatizacija... 21 4 REZULTATI Z RAZPRAVO... 22 4.1 Sterilizacija rastlinkega materiala... 22 4.2 Število poganjkov na 3 različnih gojiščih... 23 4.3 Koreninjenje... 25 4.4 Aklimatizacija... 27 5 SKLEPI... 27 6 VIRI... 29

VI Kazalo slik Slika 1: Žajbelj (Salvia officinalis) (Foto: Bencik 2012)... 4 Slika 2: Izvorni rastlinski material (Foto: Bencik 2012)... 11 Slika 3: Priprava na sterilizacijo (Foto: Bencik, 2012)... 17 Slika 4: Indukcija vršičkov žajblja (Foto: Ivanuš, 2013)... 18 Slika 5: Žajbelj 45 dni po sterilizaciji (Foto: Ivanuš 2014)... 19 Slika 6: Razvoj korenin pri žajblju (Foto: Ivanuš 2014)... 20 Slika 7: Aklimatizirane rastline žajblja (Foto: Ivanuš 2014)... 21 Slika 8: Aklimatizirane rastline žajblja po 1 mesecu (Foto: Ivanuš 2014)... 27 Kazalo preglednic Preglednica 1: Sestava gojišča MS z vitamini (Murashige in Skoog 1962)... 13 Preglednica 2: Sestava gojišča za indukcijo, razmnoževanje in koreninjenje... 14 Preglednica 3: Pet različnih metod sterilizacije žajblja za indukcijo kulture... 17 Preglednica 4: Spremljanje uspešnosti razkuževanja žajblja... 22 Preglednica 5: Razraščanje na treh različnih gojiščih... 24 Preglednica 6: Koreninjenje... 25 Kazalo grafikonov Grafikon 1: Odstotek preživelih izsečkov žajblja po sterilizaciji... 23 Grafikon 2: Število namnoženih poganjkov na 3 različnih gojiščih... 24 Grafikon 3: Odstotek ukoreninjenih rastlin žajblja na različnih gojiščih v časovnem obdobju 9 tednov... 26

1 1 UVOD Žajbelj izvira iz obal Sredozemlja, Balkana in Male Azije, kjer raste na apnenčastih pobočjih do nadmorske višine 1000 metrov in je izrazito mediteranska rastlina. Iz Sredozemlja so ga prenesli v Evropo, kjer danes raste v vrtovih in prosto v naravi (Rode 2001). Največji proizvajalci žajblja v Evropi so Grčija, Španija, Italija, Bolgarija in Madžarska (Čok 2007). Listi pri žajblju so v nasprotju z izrazitim pecljem suličaste oblike, celotna rastlina pa je prekrita z majhnimi belimi dlačicami. Cvetovi so vretenčasto nameščeni na steblo. Po cvetenju se razvijejo še okrogla črna semena rastline (Rode 2001). Žajbelj so cenili že v antiki. Verjeli so, da pomaga pri kačjih pikih, varuje pred zlemi duhovi in podaljšuje življenje (Ceres 1984). Dweck (2000) pravi, da je žajbelj v zgodovini rastlin prvi opisal grški mislec in botanik Teofrast. Žajbelj je zelo cenjena rastlina z veliko zdravilnimi učinkovinami, ki so jo uporabljali že v starem veku. Rastlina se največkrat uporablja v farmacevtski industriji, predvsem njeni listi, ki jih lahko uporabljamo sveže ali posušene. Ima tudi visoko vsebnost eteričnih olj; listi žajblja vsebujejo od 1,5 do 2,5 ml eteričnega olja na 100 g (Rode 2001). Rastlina ima izrazito grenak okus in se uporablja kot začimba za različne vrste mesa, rib, perutnine in juh. Cvetove rastline lahko uporabimo tudi za garniranje, iz svežih ali posušenih listov žajblja pa pripravimo čaj, ki pomaga pri vnetem in bolečem grlu (Greiner in Weber 2008). Žajbljev čaj je odlično sredstvo proti vnetjem ustne in žrelne votline ter želodčnim in črevesnim težavam. Iz listov lahko pripravimo tudi digestiv (na osnovi žganja), žajbljevi listi, prevreti s karameliziranim mlekom pa pomagajo pri prehladu s kašljem (Pearl 2011).

2 Namen diplomskega dela je bil razviti optimalno metodo za razmnoževanje, rast in razvoj žajblja (S. officinalis) v in vitro razmerah. Uporabili smo različne postopke sterilizacije, da bi ugotovili, kateri način bi omogočil indukcijo največjega števila zdravih in sterilnih izsečkov za nadaljnjo mikropropagacijo. Ugotoviti smo želeli, kako različna sestava gojišč za razmnoževanje in ukoreninjenje vpliva na uspešno razraščanje in koreninjenje žajblja. Osnovni cilj naloge pa je bil vzpostaviti sistem mikropropagacije, ki bi omogočil hitrejše razmnoževanje žajblja. Z uporabo tehnike tkivnih kultur in z različnimi načini sterilizacije smo poskušali vzgojiti čim večje število vitalnih poganjkov, ki bi jih lahko po uspešni aklimatizaciji prestavili v naravno okolje.

3 2 PREGLED OBJAV 2.1 Taksonomska in botanična klasifikacija Žajbelj (Salvia officinalis L.) spada v kraljestvo rastlin (Plantae), podkraljestvo vaskularnih rastlin (Tracheobionta), deblo semenk (Spermatophyta), poddeblo kritosemenk (Magnoliophyta), razred dvokaličnic (Magnolipsida), podrazred Asteridae, red ustnatičevcev (Lamiales), družino ustnatic (Lamiaceae), rod kadulj (Salvia) in vrsto navadne kadulje (S. officinalis) (Martinčič in sod. 2000). Rod žajblja vključuje približno 900 različnih vrst s tremi glavnimi središči distribucije: Srednja in Južna Amerika, Osrednja Azija in Sredozemlje. Ta rod zajema enoletnice, dvoletnice in trajnice (Torke 2000). Za rod Salvia je značilno, da sta v cvetovih samo dva prašnika, ki sta oblikovana tako, da sta prilagojena za opraševanje velikih žuželk (Werker in sod. 2007). Za žajbelj je značilna zelo velika genotipska in fenotipska variabilnost. Poleg običajnih genotipov poznamo še celo vrsto okrasnih genotipov in sort s škrlatnimi ali pisanimi listi (Squire 2008). 2.2 Splošno o žajblju Pri nas je žajbelj znan kot prezimno trden zimzelen grmiček, ki v višino in širino meri od 45 do 60 cm (Squire 2008). Rastlina potrebuje pozimi zaščito s severne strani in več sonca, zato je ni priporočljivo vzgajati doma na vrtu ali na okenski polici (Saupe 1992). Koreninski sistem žajblja je dobro razvit in razvejan s sposobnostjo prodiranja v kamenje (Forenbacher 1990).

4 Velika količina korenin zelo čvrsto veže zemljo, zato je žajbelj koristen pri preprečevanju erozije (Čok 2007). Steblo je štirioglato, klobučevinasto in dlakavo (Greiner in Weber 2008). Spodnji del stebla je olesenel in rjave barve. Listi so suličaste oblike, dolgi do 7 cm z izrazitim pecljem. Na obeh ploskvah imajo izražene listne reže (Rode 2001). Na začetku so listi zeleni z manjšimi dlačicami, pozneje pa postanejo sivi (Grilc 2013). Žajbelj je enodomna, entomofilna, kserotermna, heliofilna vrsta z zelo izraženo kseromorfologijo (Forenbacher 1990). Cvetovi so dvoustnati vijoličasto-modri in včasih povsem prekrijejo zgornje liste (Sguire 2008). Nameščeni so v vretencih, v katerih se sočasno nahaja 6 do 10 cvetov (Willfort 1997) dolgih od 2 do 4 cm. Plodovi so oreškastokroglaste oblike, dolgi od 2 do 3 mm in temno rjave barve (Forenbacher 1990). Slika 1: Žajbelj (Salvia officinalis) (Foto: Bencik 2012)

5 2.3 Podnebne razmere Žajbelj je značilen za lege z revno vegetacijo, najdemo ga predvsem na območju Sredozemlja. Pri nas raste v suhih in kamnitih legah, na submediteranskem območju (Wagner 1997) in uspeva do nadmorske višine 1000 m. Rastlina potrebuje veliko svetlobe, vendar pozimi vzdrži tudi na temperaturi do -15 ºC. Optimalni rastni pogoji žajblja so med 5 in 26 ºC. Za kalitev semen in cvetenje potrebuje veliko sonca in toplote (Čok 2007). 2.4 Pridelovanje žajblja Žajbelj ostaja na njivi 4 do 5 let (Čok 2007). Rode (2006) trdi, da ga lahko razmnožujemo ga s semeni, potaknjenci in tudi z delitvijo korenin. Setev se izvaja neposredno v zemljo v mesecu aprilu, za kar potrebujemo 10 15 kg semen/ha posajenih na razmaku 40 60 cm. Nasade je treba nenehno varovati pred plevelom, priporočljivo je ročno ali strojno okopavanje 2 3 krat na leto (Wagner 1997). Spravilo rastline poteka v fazi polnega cvetenja v mesecu juniju, juliju ali avgustu. Pokosimo jo ročno ali strojno, najboljše zjutraj (Čok 2007). V prvem letu pridelave je pridelek suhega zelišča 20 dt/ha, v drugem in tretjem pa 50 t/ha ali več (Wagner 1997). Največji proizvajalci žajblja za farmacevtske potrebe so Avstrija, Češka, Nemčija, Madžarska, Nizozemska, Poljska, Portugalska, Romunija, Rusija in Švica (Dweck 2000).

6 2.5 Mikropropagacija Mikropropagacija je tehnika tkivnih kultur, ki omogoča hitro razmnoževanje rastlin (Bohanec 1992). Chandler in Haque (1987) menita, da je ta metoda uporabna za hitro razmnoževanje rastlin, pri katerem vzamemo kot izsečke apikalne merisisteme. Za razliko od drugih postopkov razmnoževanja mikropropagacija omogoča vegetativno razmnoževanje vseh vrst rastlin ter ohranjanje rastlinskih vrst v vegetativni fazi, ki bi načeloma v naravi hitro zaključile svoj razvoj. Tako je končni izdelek mikropropagacije ukoreninjena sadika, ki je popolnoma enaka prvotni sadiki (Bohanec in sod. 2004). Mikropropagacija poteka v več fazah. V prvi fazi poteka odbira in priprava matičnih rastlin, v drugi fazi sledi vzpostavitev sterilne kulture, tretja faza pa je faza multiplikacije, v kateri razmnožujemo rastline do želenega števila. V četrti fazi skrbimo za rast poganjkov in ukoreninjenje, na koncu pa sledi še faza aklimatizacije, torej prenos rastlin v naravne razmere ter skrb za njihovo prilagoditev (Raspor 1996). 2.5.1 Izsečki matične rastline Izsečke matične rastline jemljemo iz različnih tkiv in organov. Izbiramo jih tako, da dobimo čim bolj sterilen delček rastline, ki zajema del meristemskega tkiva. Velja, da so najbolj aktivna mlada tkiva, torej najmanj zreli embriji, nato apikalni merisistemi in merisistemi v stranskih brstih. Kar pa zadeva sterilnost, so najbolj sterilna semena, notranji deli rastlin in brsti znotraj glavic (Bohanec 1992).

7 2.5.2 Sterilizacija Rastlinski material je lahko okužen z bakterijami ali glivicami, površinsko ali notranje. Temu so prilagojeni tudi ukrepi sterilizacije. Za sterilizacijo tkiv se največkrat uporablja natrijev hipoklorit v kombinaciji z detergentom (Tween 20 ali Tween 80), ki je dodan za boljšo omočljivost. Možna je tudi uporaba kalcijevega hipoklorita in živosrebrovega klorida. Na učinkovitost sterilizacije vplivata koncentracija in čas tretiranja (Bohanec 1992). Sterilnost gojišča mora biti zmeraj zagotovljena, saj bi se drugače gojišče, ki je polno sladkorja, zelo hitro okužilo z bakterijami ali plesnimi, kar bi privedlo do popolnega uničenja rastlinskega tkiva (Bohanec in sod. 2004). Priporoča se, da izsečke za nekaj sekund potopimo v 70% alkohol, ki odpravi zračne mehurčke (Bohanec 1992). Oana-Maria in sod. (2010) pri mikropropagaciji žajblja (S. officinalis) priporočajo 12 minutno sterilizacijo z 0,1% (wt/vol) živosrebrovim kloridom, Tween-om 80 in trikratno izpiranje s sterilno vodo za doseganje večjega števila sterilnih poganjkov. Pri sterilizaciji ni potrebna 100% učinkovitost, pomembno je, da se doseže ponovljiv začetek kulture, kar pomeni, da je naš izseček živ in neokužen. (Debergh 1986). 2.5.3 Sestava gojišča Gojišča tkivnih kultur na splošno vsebujejo nekaj ali vse od naslednjih naštetih komponent: makroelemente, mikroelemente, vitamine, aminokisline za gojenje anter ali protoplastov, regulatorje rasti, ogljikove hidrate in snovi za strjevanje (Abobkar in sod. 2012). Po Murashige in Skoogu (1962) so v gojiščih uporabljeni makroelementi, ki se dodajajo gojišču v koncentraciji nad 0,5 mm/l in mikroelementi v koncentraciji pod 0,5 mm/l.

8 Najpogosteje uporabljeni vitamini v tkivnih kulturah so: tiamin (B1), nikotinska kislina in piridoksin (B6). Tiamin je nujno potreben za celično rast rastline in se največkrat uporablja v koncentarcijah 0,1 10 mg/l. Nikotinska kislina in piridoksin nimata bistvenega pomena za tkivno rast, vendar se kljub temu dodajata v gojišča. Nikotinska kislina se dodaja v koncentracijskem območju 0,1 5 mg/l, piridoksin pa v območju 0,1 10 mg/l (Abobkar in sod. 2012). V tkivnih kulturah se najpogosteje uporabljajo rastni regulatorji treh skupin: avksini, citokinini in giberilini. Avksini in citokinini se običajno uporabljajo za spodbujanje in rast celic, poganjkov in korenin. Giberelini se dodajajo mediju za inhibicijo ali stimulacijo rasti kalusa (Abobkar in sod. 2012). Poznamo pa tudi zaviralce rasti: abscizinska kislina in etilen. Abscizinska kislina zavira rast in razvoj rastline, pospešuje staranje in odpadanje listov. Od ogljikovih hidratov se največkrat uporablja saharoza v koncentraciji 10 150 g/l, ki med avtoklaviranjem razpade na glukozo in fruktozo. Med ogljikove hidrate prištevamo tudi myo-inositol, ki je vključen v več procesov sinteze in ga lahko prištevamo tudi med vitamine (Bohanec 1992). Za strjevanje gojišč se uporablja agar, ki je sestavljen iz 70 % agaroze in 30 % agropektina. Dodajamo ga v koncentraciji 6 10 g/l (Bohanec 1992). 2.5.4 Razmnoževanje poganjkov»rast poganjkov uravnavajo rastni hormoni, ki so sestavni deli gojišča«, pravijo Bohanec in sod. (2004). Citokinin in avksin sta najpomembnejša rastlinska hormona, ki uravnavata razvoj poganjkov (Hartmann in sod. 2002). Različne študije govorijo o tem, da se NAA, IBA, IAA, 2,4-D in drugi avksini uporabljajo za indukcijo pri tvorbi korenin. Dodatek avksinov v majhnih količinah je potreben za rast novih poganjkov in izogibanje nastajanja kalusa.

9 Echeverrigaray in sod. (2010) so preučevali vpliv sestave gojišča in rastnih regulatorjev na uspešnost mikropropagacije Salvia guaranitica Benth. v tkivni kulturi. Najboljšo namnožitev so dosegli Murashige in Skoog (MS) pri gojišču z dodatkom avksina IAA v koncentraciji 2,85 µm. 2.5.5 Koreninjenje Novo nastale poganjke postavimo na gojišča za koreninjenje. Nekatera med njimi vsebujejo dodane avksine, druga pa so brez dodanih rastnih regulatorjev. Koncentracija bazalnih soli se doda v polovični koncentraciji (Hartmann in sod. 2002). Ko poganjke prestavimo na gojišče za koreninjenje se lahko zgodi, da rastlina ne požene korenin, pojavi pa se kalus. Kalus lahko povzroči propad rastline. Tudi velikost poganjkov je odločilnega pomena, kajti premajhni poganjki v večini primerov ne koreninijo, preveliki pa radi propadejo (Bohanec 1992). Echeverrigaray in sod. (2010) so pri pri S. Guaranitica po 15 dneh na gojišču brez dodanih rastnih regulatorjev zabeležili dobro rast korenin, in sicer je bilo koreninjenje 100%. Avtorji hkrati navajajo, da je za večino vrst rodu Salvia za koreninjenje potrebno v gojišče dodati avksine, ki povečajo tako število kakor tudi dolžino korenin. Boldura in sod. (2010) so pri S. officinalis z dodano IBA v koncentraciji 4,92 µm v gojišču za koreninjenje v dveh tednih dosegli 97% uspešnost koreninjenja ter zaznali znatno povečanje števila korenin v primerjavi z gojiščem brez dodanih rastnih regulatorjev.

10 2.5.6 Aklimatizacija Aklimatizacijo lahko definiramo kot proces, pri katerem se organizmi prilagajajo drugačnim okoljskim spremembam. Ko imajo poganjki rastlin že dovolj velike korenine, se jih premesti v območje primerno za nadaljnjo rast (Torres 1957). Osnovni pogoj uspeha aklimatizacije je, da so in vitro rastline pred aklimatizacijo dovolj velike in vitalne. Pomembni so tudi drugi dejavniki, kot so primeren substrat, ustrezne razmere, vlaga, temperatura, svetloba in kroženje zraka, brez večjih nihanj v obdobju aklimatizacij (Lesar in sod. 2012).

11 3 MATERIAL IN METODE Poskus smo opravili v laboratoriju Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede, kjer smo v in vitro razmerah vegetativno razmnožili žajbelj. 3.1 Rastlinski material Rastlinski material smo si zagotovili v letu 2012, ko smo na domačem vrtu pobrali cele rastline žajblja, jih dali v stekleno posodo z vodo in jih odnesli v laboratorij za rastlinske tkivne kulture Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede. Iz rastlin smo izrezali apikalne in aksilarne merisisteme in tako pripravljene izsečke površinsko sterilizirali ter jih prestavili na indukcijsko gojišče (Slika 2). Slika 2: Izvorni rastlinski material (Foto: Bencik 2012)

12 3.2 Priprava in sestava gojišč Gojišča za mikropropagacijo žajblja smo pripravili tako, da smo zatehtali MS z vitamini (Duchefa, Nizozemska), myo-inositol (Duchefa, Nizozemska) in saharozo (Duchefa, Nizozemska) (Preglednica 1). V plastično čašo smo nalili prečiščeno vodo, dodali magnet ter čašo postavili na magnetno mešalo. V vodo smo dodali ustrezno natehtane količine in jih raztopili v vodi. Gojišče smo prelili v litrsko bučko, ki smo jo dopolnili s prečiščeno vodo do oznake. Nato smo gojišča ponovno zlili v čašo, dodali magnet in s pomočjo ph-metra umerili ph gojišča na ustrezno vrednost (ph 5,8). Za zvišanje ph-vrednosti smo uporabili NaOH, za njeno znižanje pa HCl. Po umerjanju ph-vrednosti smo dodali strjevalec gojišč (agar) v koncentraciji 7 g/l. Hormone in vitamine smo pripravili kot založne raztopine in pred umerjanjem ph-vrednosti odpipetirali ustrezen volumen.

13 Preglednica 1: Sestava gojišča MS z vitamini (Murashige in Skoog 1962) Makroelementi mg/l CaCl2 332,02 KH2PO4 170 KNO3 1900,00 MgSO4 180,54 NH4NO3 1650,00 Mikroelementi CoCl2 x 6H20 0,025 CuSO4 x 5H2O 0,025 FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,20 Kl 0,83 MnSO4 x H20 16,90 Na2MoO4 x 2H2O 0,25 ZnSO4 x 7H20 8,60 Vitamini Glicin 2,00 Myo-Inositol 100,00 Nikotinska kislina 0,50 Piridoksin HCl 0,50 Tiamin 0,10

14 Vsebino smo dobro premešali in jo za 10 min postavili v mikrovalovno pečico. Med segrevanjem smo vsebino vsako minuto premešali. Ko je raztopina zavrela in je bil ves agar raztopljen, smo gojišče s pomočjo dozatorja gojišča napolnili v steklene posodice (60 ml v vsako) jih zaprli s pokrovom in jih avtoklavirali. Za razraščanje smo pripravili 3 različna gojišča (G1, G2 in G3), ki so se razlikovala po vsebnosti rastnih regulatorjev BAP in IAA (Preglednica 2). Pri pripravi gojišč za koreninjenje smo sestavili 2 različni gojišči (K1 in K2), ki sta se razlikovali po vsebnosti avksinov IAA in IBA (Preglednica 2). Preglednica 2: Sestava gojišča za indukcijo, razmnoževanje in koreninjenje Sestavine Indukcijsko gojišče Gojišče za razmnoževanje Gojišče za koreninjenje G1 G2 G3 K1 K2 Ms z vitamini 4,4 g/l 4,4 g/l 4,4 g/l 4,4 g/l 4,4 g/l 4,4 g/l Saharoza 30 g/l 20 g/l 20 g/l 20 g/l 20 g/l 20 g/l IBA / / / / / 1 mg/l BAP / / 1 mg/l / / / IAA / / 0,5 mg/l 0,5 mg/l 1 mg/l / Kinetin / / / 1 mg/l / / Myo-Inositol 100 mg/l 100 mg/l 100 mg/l 100 mg/l / / Agar 7 g/l 7 g/l 7 g/l 7 g/l 7 g/l 7 g/l ph 5,8 5,7 5,7 5,7 5,7 5,7

15 3.3 Sterilizacija rastlinskega materiala in indukcija kulture Sterilizacija žajblja je potekala v 5 obravnavanjih (Preglednica 3), pri katerih smo pred začetkom sterilizacije matičnim rastlinam odstranili 20 izsečkov (Slika 3). Izsečke smo površinsko sterilizirali v 5 obravnavanjih: 1. obravnavanje: Pri prvem obravnavanju smo v sterilni erlenmajerici pripravili 250 ml dikloroizocianurne kisline DICA (koncentracije 4,15 g/l) ter dodali nekaj kapljic Tweena 20. Nato smo izsečke (20 izsečkov) razrezali na kartonasti podlagi in jih stresli v erlenmajerico ter jih 40 sekund spirali s 70% etanolom. Izsečke smo nato precedili s sterilno cedilko, jih prenesli v erlenmajerico z DICO, dodali magnet in 10 minut mešali na magnetnem mešalu. Po preteklem času smo izsečke precedili, jih prenesli v svežo sterilno erlenmajerico in jih 3x sprali s prečiščeno in sterilno vodo ter jih prestavili na indukcijsko gojišče. 2. obravnavanje: Pri drugem obravnavanju smo v sterilni erlenmajerici pripravili 250 ml DICE (koncentracije 4,15 g/l) ter dodali nekaj kapljic Tweena 20. Nato smo izsečke (30 izsečkov) razrezali na kartonski podlagi in jih stresli v erlenmajerico jih 40 sekund spirali s 50% etanolom. Izsečke smo nato precedili s sterilno cedilko, jih prenesli v erlenmajerico z DICO, dodali magnet in jih 10 minut mešali na magnetnem mešalu. Po preteklem času smo izsečke precedili, jih prenesli v svežo sterilno erlenmajerico in jih 3x sprali s prečiščeno in sterilno vodo ter prestavili na indukcijsko gojišče.

16 3. obravnavanje: Pri tretjem obravnavanju smo v sterilni erlenmajerici pripravili 250 ml DICE (koncentracije 4,15 g/l) ter dodali nekaj kapljic Tweena 20. Nato smo izsečke (30 izsečkov) razrezali na kartonasti podlagi, jih stresli v erlenmajerico ter jih 40 sekund spirali s 50% etanolom. Izsečke smo nato precedili s sterilno cedilko, jih prenesli v erlenmajerico z DICO, dodali magnet in jih 15 minut mešali na magnetnem mešalu. Po preteklem času smo izsečke precedili, jih prenesli v svežo sterilno erlenmajerico in jih 3x sprali s prečiščeno in sterilno vodo ter prestavili na indukcijsko gojišče. 4. obravnavanje: Pri četrtem obravnavanju smo v sterilni erlenmajerici pripravili 250 ml DICE (koncentracije 4,15 g/l) in dodali nekaj kapljic Tweena 20. Nato smo izsečke (20 izsečkov) razrezali na kartonasti podlagi in jih stresli v erlenmajerico ter jih 40 sekund spirali s 70% etanolom. Izsečke smo nato precedili s sterilno cedilko, jih prenesli v erlenmajerico z DICO, dodali magnet in jih 15 minut mešali na magnetnem mešalu. Po preteklem času smo izsečke precedili, jih prenesli v svežo sterilno erlenmajerico in jih 3x sprali s prečiščeno in sterilno vodo ter prestavili na indukcijsko gojišče. 5. obravnavanje: Pri petem obravnavanju smo v sterilni erlenmajerici pripravili 250 ml 15% natrijevega hipoklorida (NaClO), nato pa izsečke (21 izsečkov) razrezali na kartonasti podlagi, jih stresli v erlenmajerico in jih 40 sekund spirali s 70% etanolom. Izsečke smo nato precedili s sterilno cedilko, jih prenesli v erlenmajerico z NaClO, dodali magnet in jih 20 minut mešali na magnetnem mešalu. Po preteklem času smo izsečke precedili, jih prenesli v svežo sterilno erlenmajerico in jih 3x sprali s prečiščeno in sterilno vodo ter prestavili na indukcijsko gojišče.

17 Slika 3: Priprava na sterilizacijo (Foto: Bencik 2012). Preglednica 3: Pet različnih metod sterilizacije žajblja za indukcijo kulture Obravnavanja Način razkuževanja 1 70% etanol 40 sek, 10 min DICA + Tween 20, 3x spiranje s H 2O 2 50% etanol 40 sek, 10 min DICA + Tween 20, 3x spiranje s H 2O 3 50% etanol 40 sek, 15 min DICA + Tween 20, 3x spiranje s H 2O 4 70% etanol 20 sek, 15 min DICA + Tween 20, 3x spiranje s H 2O 5 70% etanol 40 sek, 20 min 15 % NaClO, 3x spiranje s H 2O

18 3.4 Iniciacija kulture Razkužene izsečke smo inokulirali na sterilno indukcijsko gojišče v epruvetah. V vsako epruveto smo dali en izseček in ga označili z datumom ter imenom rastline (Slika 4). Uporabljeno orodje smo sproti sterilizirali v namiznem sterilizatorju, izsečke pa opazovali vsak dan. Slika 4: Indukcija vršičkov žajblja (Foto: Ivanuš 2013)

19 3.5 Subkultiviranje poganjkov Uspešno sterilizirane in vitalne poganjke smo prestavili na gojišče za razmnoževanje, mlade poganjke pa vsake 3 tedne premestili na novo gojišče za regeneracijo in razmnoževanje (Slika 5). Vsak 3., 4. in 6. teden smo opravljali bonitiranje. Zbirali smo podatke o številu propadlih in namnoženih rastlin, zbrane podatke pa uredili tabelarično in grafično (Preglednica 5). Poganjke, ki so se okužili, smo zavrgli ali ponovno sterilizirali na novo gojišče. V vsako gojišče (G1, G2 in G3) smo nastavili 31 poganjkov (Preglednica 5). Slika 5: Žajbelj 45 dni po sterilizaciji (Foto: Ivanuš, 2014).

20 3.6 Koreninjenje Novo nastale poganjke, ki smo jih razmnožili, smo prestavili na dve različni gojišči za koreninjenje (K1 in K2). Obe gojišči sta se razlikovali po vsebnosti avksina; gojišče za koreninjenje K1 je vsebovalo 1mg/l IAA (indol ocetne kisline), gojišče K2 pa 1 mg/l IBA (indol maslene kisline) avksina. Spremljanje števila korenin in pojav kalusa smo izvedli štirikrat, po 1 tednu, 2 tednih ter 6 in 9 tednih (Preglednica 6, Slika 6). Na vsako gojišče smo postavili 28 rastlin (Preglednica 6). Slika 6: Razvoj korenin pri žajblju (Foto: Ivanuš 2014).

21 3.7 Aklimatizacija Pri aklimatizaciji rastline, ki je rasla v heterotrofnih razmerah, rastlino ponovno navajamo na avtotrofni način rasti. Rastline, ki so se lepo ukoreninile, smo previdno vzeli iz posodic z gojiščem in korenine sprali pod mlačno tekočo vodo, nato pa jih posadili v lončke (Slika 7). Za sajenje smo uporabili substrat Fruhstorfer Erde Tipa N s ph-vrednostjo 5,7 6,3. Substrat je vseboval perlit, vulkansko glino, delce lubja ter belo srednje razgrajeno šoto. V substratu je bilo zaslediti tudi hranila v sledovih: 258 386 mg/ l N, 229 343 mg/l P2O5 in 351 527 mg/l K2O. Rastline smo nato dali v miniaturne rastlinjake in jih mesec dni aklimatizirali (Slika 7). Slika 7: Aklimatizirane rastline žajblja (Foto: Ivanuš 2014).

22 4 REZULTATI Z RAZPRAVO 4.1 Sterilizacija rastlinskega materiala Imeli smo 5 obravnavanj sterilizacije, ki smo jih med seboj primerjali (Preglednica 4, Grafikon 1). Najuspešnejšo sterilizacijo smo dosegli pri 3. obravnavanju, kjer smo pri 15 minutnem razkuževanju z DICO uspešno sterilizirali 21 od 30 izsečkov. Uspeh sterilizacije je bil pri tem obravnavanju 70%. Najslabšo sterilizacijo pa smo dosegli pri 5. obravnavanju, kjer smo dobili 0 % preživelih in 21 propadlih rastlin od skupaj 21 rastlin. Pri prvem obravnavanju smo sterilizirali 1 od 20 izsečkov (Preglednica 4). Z izredno majhnim številom preživelih rastlin smo dokazali, da 10 minutno razkuževanje s 70% etanolom ni primerno za sterilizacijo. Pri drugem in četrtem obravnavanju smo zabeležili 9 odmrlih izsečkov (Preglednica 4), kar dokazuje, da tudi to obravnavanje ni primerno za sterilizacijo. Preglednica 4: Spremljanje uspešnosti razkuževanja žajblja Obr. Način razkuževanja Št. izsečkov Št. preživelih Št. okuženih Št. odmrlih % preživelih 1 40 s 70% etanol + 10 min DICA 20 1 16 5 5 2 40 s 50% etanol + 10 min DICA 30 9 14 9 30 3 40 s 50% etanol + 15 min DICA 30 21 6 7 70 4 40 s 70% etanol + 15 min DICA 20 5 7 9 25 5 40 s 70% etanol + 20 min 15% NaClO 21 0 1 38 0

Odstotki (%) 23 80 70 60 50 40 30 20 1 2 3 4 5 10 0 1 2 3 4 5 Obravnavanja Grafikon 1: Odstotek preživelih izsečkov žajblja po sterilizaciji 4.2 Število poganjkov na 3 različnih gojiščih Pri gojišču G1 kalusa ni bilo zaznati, pri 3 rastlinah se je pojavila vitrifikacija. Nekoliko drugače je bilo pri gojišču G2, kjer je prišlo do pojava kalusa pri vseh rastlinah, vitrifikacijo pa smo zasledili pri 6 rastlinah. Pri gojišču G3 se je od 23 preživelih rastlin kalus pojavil pri 13, vitrifikacija pa je bila opažena pri 4 rastlinah. Trend naraščanja števila poganjkov pri gojišču G1 je po 3 tednih znašal 35, po 4 tednih 53 in po 6 tednih 57 poganjkov. Pri G2 smo po 3 tednih zabeležili 46, po 4 tednih 80 in po 6 tednih 100 poganjkov. Pri G3 je bilo po 3 tednih prisotnih 36, po 4 tednih 36 in po 6 tednih 34 poganjkov (Preglednica 5, Grafikon 2). Gojišče G2 se je izkazalo za najprimernejše, saj je bilo pri rastlinah na tem gojišču zaslediti največje število vitalnih poganjkov.

24 Preglednica 5: Razraščanje na treh različnih gojiščih Gojišče Št. rastlin Št. propadlih Št. namnoženih Št. namnoženih Št. namnoženih Množitveni po 3 tednih po 4 tednih po 6 tednih faktor G1 31 16 35 53 57 1,83 G2 31 0 46 80 100 3,22 G3 31 12 36 36 34 1,09 120 Število poganjkov na 3 različnih gojiščih 100 80 60 40 po 3 tednih po 4 tednih po 6 tednih 20 0 G1 G2 G3 Grafikon 2: Število namnoženih poganjkov na 3 različnih gojiščih

25 4.3 Koreninjenje Pri žajblju s koreninjenjem nismo imeli težav, saj so se korenine začele razvijati že ob koncu subkultiviranja gojišča G1. Kljub temu smo pripravili dve gojišči z dodatkom avksinov za boljšo iniciacijo tvorbe korenin. Pri gojišču K1 po enem tednu še ni bilo razvitih korenin, po dveh tednih so se korenine pojavile pri 39 % rastlin, po štirih tednih pri 68 %, po šestih tednih pri 86 % in po devetih tednih pri 82 % rastlin (Preglednica 6, Grafikon 3). Pri gojišču K2 smo po enem tednu opazili pojav korenin pri 4 % rastlin, po dveh tednih pri 29 %, po štirih tednih pri 54 %, po šestih tednih pri 79 % in po devetih tednih pri 79% rastlin (Preglednica 6, Grafikon 3). Gojišče K1, ki je vsebovalo avskin IAA, se je izkazalo za boljše, saj smo v primerjavi z gojiščem K2 tukaj zabeležili večje število okoreninjenih rastlin. Preglednica 6: Koreninjenje žajblja Obravnavanja Št. rastlin na K1 Št. ukoreninjenih rastlin na K1 Št. rastlin na K2 Št. ukoreninjenih rastlin na K2 po 1 tednu 28 0 (0 %) 28 1 (4 %) po 2 tednih 28 11 (39 %) 28 8 (29 %) po 4 tednih 28 19 (68 %) 28 15 (54 %) po 6 tednih 28 24 (86 %) 28 22(79 %) po 9 tednih 28 23 (82 %) 28 22 (79 %).

po 1 tednu po 2 tednih po 4 tednih po 6 tednih po 9 tednih Odstotek ukoreninjenih rastlin 26 Ukoreninjenost žajblja 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Število ukoreninjenih rastlin pri K1 Število koreninjenih rastlin pri K2 Čas Grafikon 3: Odstotek ukoreninjenih rastlin žajblja na različnih gojiščih v časovnem obdobju 9 tednov

27 4.4 Aklimatizacija 50 rastlin smo 4 tedne aklimatizirali v miniaturnih rastlinjakih (Slika 8). 84 % vseh aklimatiziranih rastlin se je uspešno aklimatiziralo (42 rastlin), 8 rastlin pa je propadlo (16 %). Da bi rastline zavarovali pred izhlapevanjem, smo jih večkrat poškropili z vodo. Zračenje pa so zagotovili miniaturni rastlinjaki, ki so na vrhu pokrova iz prozorne plastike omogočali odpiranje ventilov in dvigovanje pokrova. Slika 8: Aklimatizirane rastline žajblja po 1 mesecu

28 5 SKLEPI Rastline žajblja smo z uporabo tehnike rastlinskih tkivnih kultur uspešno razmnožili v in vitro pogojih. Za iniciacijo kulture se je kot najboljša izkazala sterilizacija po postopku 40 s, 50 % etanola + 15 min DICE, pri čemer smo dobili 70 % sterilnih in vitalnih izsečkov. Pri namnoževanju poganjkov smo dobili najvišji namnožitveni faktor 3,22 pri gojišču G2, ki je vsebovalo citokin BAP v koncentraciji 1mg/l in avksin IAA v koncentraciji 0,5 mg/l. Koreninjenje žajblja v tkivnih kulturah ne predstavlja večjega problema. Z dodanim IAA v koncentraciji 1 mg/l smo po 9 tednih dobili 82 % ukoreninjenih rastlin. Aklimatizacija žajblja v rastni komori je bila uspešna. Propadlo je le 8 od skupaj 50 rastlin, kar predstavlja 84% uspešno aklimatiziranje.

29 6 VIRI 1. Abobkar IMS, Ahmed ME. 2012. Department of Botany and Microbiology, Faculty of Science, Sebha University, Libya, 2012; 30: par. 37. (elektronski vir). http://www.intechopen.com/books/recent-advances-in-plant-in-vitro-culture/plant-tissueculture-media (2. marec 2015) 2. Bohanec B. 1992. Tehnike rastlinskih tkivnih kultur. Ljubljana, Biotehniška Fakulteta, Oddelek za agronomijo, Center za rastlinsko biotehnologijo in žlahtnenje rastlin: str. 24 53. 3. Bohanec B, Javornik B, Strel B. 2004. Gensko spremenjena hrana. Ljubljana: Ministrstvo za okolje, prostor in energijo: Združenje živilske industrije pri Gospodarski zbornici Slovenije: Biotehniška fakulteta, 2004: str. 11 12. 4. Boldura OMI, Radu F, Popescu S, Borozan A. 2010, Regeneration, Micropropropagation, Callus Culture and Somatic Embryogenesis of Common Sage (Salvia officinalis L.), Bulletin UASVM Horticulture, 67, 2010; 308 par: 313. (elektronski vir) http://journals.usamvcluj.ro/index.php/horticulture/article/view/5732 (10. julij 2013) 5. Ceres E. 1984. The healing power of herbal teas. Wellingborough, Thorsons: str. 128. 6. Chawla HS. 2002. Introduction to plant biotechnology. United States of America, Science publischers: str. 41 43. 7. Čok H. 2007. Žajbelj. Sodobno kmetijstvo. str. 42 44. 8. Debergh PCA. 1987. Recent trends in the applications of tissue culture to ornamentals. New York, Harwood Academic Publishers: str. 1 26. 9. Forenbacher S. 1990. Velebit i njegov biljni svijet. Zagreb, Škotska knjiga, 1990: str. 172.

30 10. FAO/NORWAY symposium on plant tissue culture, technology and utilization. (1984): Micropropagation of selected rootcrops palms, citrus and ornantal species, Norway, 3. 4. julij 1984: str. 70 191. 11. Galle TK. 2002. Zdravilne rastline na Slovenskem. Ljubljana, Mladinska knjiga: str. 310. 12. Greiner K, Weber A. 2008. Zelišča: temeljno delo z več kot 200 portreti priljubljenih zelišč / 1. izd. Ptujska Gora: In obs medicus 2008: str. 162. 13. Grilc M. 2013. Čarobni zeliščni vrt. Ljubljana, Kmečki glas, 2013: str. 124 125. 14. Hartman TH, Krster ED, Davies TF Jr., Geneve LR. 2002. Plant Propagation, principles and practices. New Jersey, Upper Sadlle River: str. 648 650. 15. Lesar H, Hlebec B, Čeranič N, Kastelec D, Luthar Z. 2012, Acclimatization of terrestrial orchid Bletilla striata Rchb.f. (Orchidaceae) propagated under in vitro condition. (elektronski vir). http://ass.bf.uni-lj.si/marec2012/09lesar.pdf (4. februar 2015) 16. Martinčič A, Wraber T, Jogan N, Ravnik V, Podobnik A, Turk B, Vreš B. 1992. Mala flora Slovenije, ključ za določanje praprotnic in semenk. Ljubljana, tehniška založba Slovenije 3: str. 845. 17. Pearl E. The reconection 2011. (elektronski vir) http://www.angelski-portal.si/2011/vilinec-zajbelj-vila-sentjanzevka-in-vila-dusica/ (10. julij 2014) 18. Raspor P. 1996. BIOTEHNOLOGIJA. Osnovna znanja. Ljubljana: BIA, 1996: str. 30. 19. Rode J. 2001. Zeliščni vrt: domača lekarna. Ljubljana, Kmečki glas 2001: str. 205. 20. Rode J, Knapič M. 2006. Namakanje zelišč. Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano, Ljubljana 2006: str. 35. 21. Saupe J. 1992. Naravni zdravnik - zdravje iz zdravilnih rastlin. Ljubljana, Slovenska kjiga, 1992: str. 219.

31 22. Schauenberg P, Paris F. 1990. Guide to medicinal plants. Cambridge, The Luttreworth Press: str. 349. 23. Squire D. 2008. The Herb Garden Specialist. New Holland Publishers (UK), 2008: str. 59. 24. Sinkovič T. 2000. Uvod v botaniko za študente visokošolskega strokovnega študija kmetijstva agronomija in hortikultura. Ljubljana, Oddelek za agronomijo in Biotehniške fakultete, 2000: str. 50. 25. Torke BM. 2000. A Revision of Salvia Sect. Ekmania (Lamiaceae). New York, Brittonia, 2000: str. 256-302. (elektronski vir) https://www.jstor.org/stable/pdf/2666577.pdf?accepttc=true&seq=1#fndtnpage_scan_tab_contents (2. marec 2015) 26. Torres CK. 1957. Tissue culture techniques for horticultural crops. New York, Chapman&Hall, 1957: str. 60. 27. Wagner T. 1997. Pridelovanje zelišč. Maribor, Fakulteta za kmetijstvo, 1997: str. 192 194. 28. Werker E. 1993. Function of essential oil secreting glandular hairs in aromatic plans of Lamiacea a review. Flavour and Fragrance Journal 8(5): 249 255.Wester, P., Classen- Bockhoff, R. (2007): Floral diversity and pollen transfer mechanisms in bird-pollinated Salvia species. Annals of Botany 100(2): str. 401 421. 29. Willfort R. 1997. Zdravilne rastline in njihova uporaba. Maribor, Veliki priročnik, 1997: str. 413.

ZAHVALA Zahvaljujem se moji mentorici, izr. prof. dr. Metki Šiško, za čas, ki mi ga je namenila, ter za pomoč in strokovno svetovanje pri izdelavi moje diplomske naloge. Iskreno se zahvaljujem Anji Ivanuš za vso njeno požrtvovalno pomoč in svetovanje pri delu v laboratoriju. Zahvaljujem se tudi predsedniku komisije doc. dr. Andreju Šušku in članu komisije red. prof. dr. Antonu Ivančiču za pregled in popravke diplomske naloge. Posebna zahvala je namenjena moji mami, ki me je spodbujala in podpirala skozi vsa leta študija ter mojemu partnerju, za njegovo strpnost in vsestransko pomoč.