UNIVERZA V LJUBLJANI

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE Ana MARENTIČ ANALIZA GENETSKE VARIABILNOSTI GENA HBB PRI DRUŽINSKI ERITROCITOZI MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja Ljubljana, 2019

2 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE Ana MARENTIČ ANALIZA GENETSKE VARIABILNOSTI GENA HBB PRI DRUŽINSKI ERITROCITOZI MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja ANALYSIS OF GENETIC VARIABILITY OF HBB GENE IN FAMILIAL ERYTHROCYTOSIS M. SC. THESIS Master Study Programmes Ljubljana, 2019

3 II Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Biotehnologija. Delo je bilo opravljeno v Medicinskem centru za molekularno biologijo na Inštitutu za biokemijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani in na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Študijska komisija je za mentorico magistrskega dela imenovala izr. prof. dr. Natašo Debeljak in za somentorico prof. dr. Tanjo Kunej. Komisija za oceno in zagovor: Predsednica: prof. dr. Mojca NARAT Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Članica: izr. prof. dr. Nataša DEBELJAK Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biokemijo Članica: prof. dr. Tanja KUNEJ Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Članica: prof. dr. Maja ČEMAŽAR Onkološki inštitut Ljubljana, Oddelek za eksperimentalno onkologijo Datum zagovora:

4 III KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2 DK UDK 606: : (043.2) KG AV SA družinska eritrocitoza, gen HBB, različica hemoglobina, visoka afiniteta hemoglobina do kisika, različica gena MARENTIČ, Ana, dipl. mikrobiol. (UN) DEBELJAK, Nataša (mentorica), KUNEJ, Tanja (somentorica) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA LI 2019 IN TD OP IJ JI AI Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje Biotehnologija ANALIZA GENETSKE VARIABILNOSTI GENA HBB PRI DRUŽINSKI ERITROCITOZI Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) XII, 60, [6] str., 13 pregl., 17 sl., 5 pril., 152 vir. sl sl/en Eritrocitoza je stanje povišane koncentracije eritrocitov v krvi, kar se odraža s povišanim hemoglobinom in hematokritom. Dedno obliko te bolezni imenujemo družinska eritrocitoza (DE). Bolezen delimo na primarno obliko z okvaro v kostnem mozgu in sekundarno obliko, pri kateri je razlog za eritrocitozo izven kostnega mozga. Gen HBB nosi zapis za podenoto beta hemoglobina, ki v eritrocitih veže kisik. Različice hemoglobina lahko povzročijo sekundarno obliko DE. Glavni namen raziskave je bil karakterizacija gena HBB v povezavi z DE in vzpostavitev metode za določanje nukleotidnega zaporedja pri bolnikih. S pregledom literature in podatkovnih zbirk smo določili različice in regije gena povezane z DE. Kodirajoče regije gena, vključno z deli sosednjih regij, smo pomnožili z metodo PCR ter s sekvenciranjem po Sangerju določili nukleotidno zaporedje pri bolnikih iz dveh družin s sumom na DE in pri zdravi kontroli. Pri vseh bolnikih in pri zdravi osebi smo odkrili tri različice gena, eno v kodirajoči regiji in dve v intronski regiji, ki jih v literaturi ne povezujejo z DE. Za zamenjavo nukleotida v kodirajoči regiji bi bile potrebne nadaljne analize o vplivu na funkcijo proteina. Uspešno smo razvili protokol za diagnostično metodo odkrivanja različic gena HBB pri bolnikih z DE.

5 IV ND Du2 KEY WORDS DOCUMENTATION DC UDC 606: : (043.2) CX AU AA familial erythrocytosis, HBB gene, hemoglobin variant, high oxygen affinity hemoglobin, gene variant MARENTIČ, Ana DEBELJAK, Nataša (supervisor), KUNEJ, Tanja (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB PY 2019 TI DT NO LA AL AB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Biotechnology ANALYSIS OF GENETIC VARIABILITY OF HBB GENE IN FAMILIAL ERYTHROCYTOSIS M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) XII, 60, [6] p., 13 tab., 17 fig., 5 ann., 152 ref. sl sl/en Erythrocytosis is a state of elevated levels of erythrocytes, hemoglobin and hematocrit. The inherited type of this disorder is called familial erythrocytosis (FE). Erythrocytosis can be divided into two major types primary where there is a defect intrinsic to the erithroid cells in bone marrow, and secondary where there is a defect outside of the bone marrow. There are many genes involved in this disease, including HBB, which encodes information for a beta hemoglobin subunit. Hemoglobin is an oxygen transport protein in erythrocytes and can cause secondary FE. Main goal of the present study was to characterise the HBB gene in association to FE and to develop a diagnostic method for detection of sequence variants of HBB in patients suspected to have FE. HBB sequence variants and regions associated with FE were determined by literature and databases review. The coding regions of the gene and their flanking sequences were amplified using the PCR method and Sanger sequencing was used for determination of the nucleotide sequence of patients from two families with FE and a healthy control. Three polymorphisms were found in all patients and in a healthy family member, one in the coding region and two in the intronic region, none of which were previously associated with FE. Further analysis should be performed to determine the effect of the sequence variant found in the coding region. We have successfully established the protocol for diagnostic sequencing of the HBB gene in patients with FE.

6 V KAZALO VSEBINE Str. KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... III KEY WORDS DOCUMENTATION... IV KAZALO VSEBINE...V KAZALO PREGLEDNIC... VIII KAZALO SLIK... IX KAZALO PRILOG...X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI.. XI 1 UVOD OPREDELITEV PROBLEMA NAMEN IN CILJI NALOGE HIPOTEZE PREGLED OBJAV ERITROCITI IN ERITROCITOZA Eritropoeza HEMOGLOBIN Nepravilnosti hemoglobina Hemoglobini z visoko afiniteto do kisika Talasemije Anemija srpastih eritrocitov KLASIFIKACIJA ERITROCITOZ Primarna eritrocitoza Sekundarna eritrocitoza Idiopatska eritrocitoza DIAGNOSTIKA ERITROCITOZ Določanje nukleotidnega zaporedja DNA Ostale preiskave Diagnostika v Sloveniji OBVLADOVANJE ERITROCITOZE MATERIAL IN METODE MATERIAL... 12

7 VI Pripomočki in oprema Reagenti in kompleti METODE Bioinformacijska analiza gena HBB Podatkovni zbirki Ensembl in dbsnp Zbirka UniProt Zbirki in HbVar in LOVD Bibliografska zbirka PubMed Vzorci DNA za vpeljavo genetskega testa in vzorci DNA bolnikov Izbor začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje regij gena HBB Izvedba reakcije PCR Optimizacija pomnožitve eksonov Analiza produktov PCR z agarozno gelsko elektroforezo Analiza produktov PCR s poliakrilamidno elektroforezo Analiza agaroznih in poliakrilamidnih gelov Čiščenje produktov PCR Priprava vzorcev za sekvenciranje Pregled sekvenčnih datotek REZULTATI BIOINFORMACIJSKA ANALIZA GENA HBB Različice gena HBB povezane z družinsko eritrocitozo Umestitev različic v zaporedje gena OPTIMIZACIJA POMNOŽEVANJA EKSONOV GENA HBB Optimizacija pomnoževanja regije eksona Optimizacija pomnoževanja regije eksona Optimizacija pomnoževanja regije eksona POMNOŽEVANJE REGIJ GENA HBB PRI BOLNIKIH SEKVENČNA ANALIZA GENA HBB PRI BOLNIKIH RAZPRAVA GEN HBB IN RAZLIČICE HEMOGLOBINA Podatkovna zbirka HbVar... 40

8 VII 5.2 VZPOSTAVITEV DIAGNOSTIČNE METODE IN SEKVENČNA ANALIZA IZZIVI NA PODROČJU DE SKLEPI POVZETEK VIRI ZAHVALA PRILOGE

9 VIII KAZALO PREGLEDNIC Str. Preglednica 1: Klasifikacija družinske eritrocitoze....8 Preglednica 2: Začetni oligonukleotidi za pomnožitev regij gena HBB Preglednica 3: Koncentracije in količine komponent reakcije PCR Preglednica 4: Začetni pogoji reakcije PCR Preglednica 5: Sestava pufra TBE Preglednica 6: Sestava poliakrilamidnega gela Preglednica 7: Vezavna mesta produkta gena HBB Preglednica 8: Različice hemoglobina in gena HBB v povezavi z družinsko eritrocitozo.. 24 Preglednica 9: Končni pogoji pomnoževanja regije eksona 1 gena HBB Preglednica 10: Končni pogoji pomnoževanja regije eksona 2 gena HBB Preglednica 11: Končni pogoji pomnoževanja regije eksona 3 gena HBB Preglednica 12: Različice gena HBB pri sekvenčni analizi bolnikov Preglednica 13: Pregled genotipov različic gena HBB pri preiskovanih osebah

10 IX KAZALO SLIK Slika 1: Uravnavanje nastajanja eritropoetina...4 Slika 2: Shematski prikaz hemoglobina...5 Slika 3: Razdelitev eritrocitoz...7 Slika 4: Saturacijska krivulja hemoglobina Slika 5: Shematski prikaz poteka dela Slika 6: Družinski drevesi družin vključenih v raziskavo Slika 7: Kariogram človeškega genoma Slika 8: Shematski prikaz gena HBB Slika 9: Prikaz gena HBB z različicami povezanimi z družinsko eritrocitozo Slika 10: Preverjanje učinkovitosti pufrov v kompletu za PCR KAPA HiFi HotStart Slika 11: Prikaz optimizacije pomnoževanja eksona 1 gena HBB Slika 12: Prikaz optimizacije pomnoževanja eksona 2 gena HBB Slika 13: Prikaz optimizacije pomnoževanja eksona 3 gena HBB Slika 14: Pomnožene regije gena HBB pri bolnikih in zdravi osebi Slika 15: Pomnoženi odseki gena HBB pri treh osebah z redčeno DNA Slika 16: Elektroferogrami sekvenčne analize bolnikov in zdrave osebe Slika 17: Prikaz lege identificiranih različic gena HBB pri preiskovanih osebah na referenčnem zaporedju gena Str.

11 X KAZALO PRILOG PRILOGA A Prispevek na 13. simpoziju CFGBC Taste of genomics (2018) 1. plakat PRILOGA B Prispevek na 13. simpoziju CFGBC Taste of genomics (2018) 2. plakat PRILOGA C Prispevek na 8. kongresu Slovenskega genetskega društva (2018) PRILOGA D Prispevek v Zbirki seminarjev pri predmetu Genomika (2017/18) PRILOGA E Okrajšave aminokislin

12 XI OKRAJŠAVE IN SIMBOLI 2,3-BPG APS BPGM CO CO2 DE DNA dntp 2,3-bisfosfoglicerat amonijev persulfat bisfosfoglicerat mutaza ogljikov monoksid ogljikov dioksid družinska eritrocitoza deoksiribonukleinska kislina deoksinukleotid trifosfat ECYT1 družinska eritrocitoza tipa 1 ECYT2 družinska eritrocitoza tipa 2 ECYT3 družinska eritrocitoza tipa 3 ECYT4 družinska eritrocitoza tipa 4 ECYT5 družinska eritrocitoza tipa 5 ECYT6 družinska eritrocitoza tipa 6 ECYT7 družinska eritrocitoza tipa 7 ECYT8 družinska eritrocitoza tipa 8 EGLN1 egl devet homolog 1 (prolil hidroksilaza) EPAS1 endotelijski protein z domeno PAS 1 EPO EPOR EtBr GATA H + HbA HBA1 HBA2 HBB eritropoetin eritropoetinski receptor etidijev bromid transkripcijski dejavniki, ki se vežejo na zaporedje GATA proton hemoglobin A podenota alfa 1 hemoglobina podenota alfa 2 hemoglobina podenota beta hemoglobina

13 XII HbF HbS HbSS HGVS hemoglobin F hemoglobin S (heterozigot) hemoglobin S (homozigot) združenje za variabilnost genoma človeka (ang. Human Genome Variation Society) JAK2 janus kinaza 2 NGS O2 PCR PV STAT5 TBE Tm TEMED UTR VHL ZO sekvenciranje naslednje generacije (ang. next generation sequencing) kisik verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction) policitemija vera pretvornik signala in aktivator prepisovanja 5 (ang. signal transducer and activator of transcription 5) pufer tris/borat/edta talilna temperatura začetnih oligonukleotidov tetrametiletilendiamin neprevedena regija gena (ang. untranslated region) tumorski supresor von Hippel-Lindau začetni oligonukleotid

14 1 1 UVOD 1.1 OPREDELITEV PROBLEMA Eritrocitoza je krvna motnja, za katero je značilno povišano število eritrocitov v krvi. Vzroki zanjo so zelo različni, od pridobljenih do prirojenih. Eritrociti so najštevilčnejše celice v krvi, zato vplivajo na viskoznost krvi (McMullin, 2008). Povečana viskoznost lahko vodi do tromboemboličnih zapletov, zato je pomembno, da se motnja pravočasno odkrije (Keohane in sod., 2013; Bento, 2018). Pri dedni obliki bolezni, ki ji pravimo prirojena oz. družinska eritrocitoza (DE), so vzroki za nastanek bolezni zelo heterogeni. Poznanih je več genov, katerih različice povzročajo prekomerno nastajanje eritrocitov. Ti geni so udeleženi v zaznavanje in transport kisika ter zorenje eritrocitov eritropoezo (McMullin, 2016). Med njimi je tudi gen HBB, ki nosi zapis za sintezo podenote beta hemoglobina, ta pa je pomemben za prenos kisika po krvi. Različice gena HBB lahko povzročijo preveliko afiniteto hemoglobina do kisika, zato se kisik težje sprosti v tkivo. Posledično pride do hipoksije in do kompenzatorne povečane sinteze eritrocitov (Thom in sod, 2013). Odkritje vzroka DE pri bolnikih je zaradi heterogenosti ozadja otežena. Potrebno je sekvenciranje do sedaj povezanih genov z DE. Najbolj pogosti geni, udeleženi v razvoju DE so EPOR, VHL, EGLN1 EPAS1, EPO, HBB, HBA in BPGM (McMullin, 2016). Kljub sekvenciranju vseh omenjenih genov, pri večini bolnikov vzrok DE še vedno ni odkrit. To pomeni, da je potrebno odkriti še dodatne gene povezane z razvojem DE (Bento in sod., 2013). V Sloveniji v klinični praksi še ni vzpostavljeno genetsko testiranje za DE. Sekvencira se le gen JAK2, ki povzroča pridobljeno obliko eritrocitoze. Za bolnike z eritrocitozo, ki so JAK2 negativni, pri nas še ni dodatnega genetskega diagnostičnega testa (Mlakar, 2008). Težava je tudi v obvladovanju bolezni oz. zdravljenju, saj zaradi heterogenosti vzrokov in težavne opredelitve bolezni ni smernic za zdravljenje DE. 1.2 NAMEN IN CILJI NALOGE Namen magistrske naloge je bil pregled do sedaj opisanih različic gena HBB v povezavi z DE v podatkovnih zbirkah. Želeli smo opredeliti domene in vezavna mesta produkta gena HBB, katerih spremembe vodijo do DE. Naš cilj je bil vzpostavitev diagnostičnega testa za bolnike z DE v Sloveniji, s katerim bi preverili prisotnost različic gena HBB. V raziskavo smo vključili dve družini s sumom na DE, pri katerih smo z novo vzpostavljenim testom preverili prisotnost variant HBB.

15 2 Potek laboratorijskega dela magistrske naloge je potekal v sodelovanju s Specializiranim hematološkim laboratorijem Kliničnega oddelka za hematologijo, UKC Ljubljana. Nalogo je odobrila Komisija RS za medicinsko etiko (KME 115/07/15). 1.3 HIPOTEZE Različice gena HBB, ki povzročajo DE, se nahajajo na delih gena, ki so ključni za vezavo in sprostitev kisika s hemoglobina. Pri bolnikih iz dveh družin, vključenih v raziskavo, so prisotne različice gena HBB, ki jih ni pri zdravi kontroli.

16 3 2 PREGLED OBJAV 2.1 ERITROCITI IN ERITROCITOZA V povprečju človek vsako sekundo proizvede dva milijona rdečih krvnih celic - eritrocitov v procesu, ki ga imenujemo eritropoeza (Zivot in sod., 2018). Eritrociti vsebujejo transportni protein hemoglobin, ki omogoča preskrbo tkiv s kisikom. Zrele rdeče krvne celice ne vsebujejo jedra in večine organelov. S tem je kar največ prostora namenjeno hemoglobinu. Nastajanje eritrocitov je natančno uravnano, sicer lahko pride do anemije ali, nasprotno, do eritrocitoze (Bento, 2018). Eritrocitoza je opredeljena kot stanje povišanega števila eritrocitov v krvi, kar se odraža v povišani koncentraciji hemoglobina in vrednosti hematokrita. Hematokrit je delež krvi, ki ga predstavljajo eritrociti. Po definiciji je masa eritrocitov pri eritrocitozi za 25 % večja od predvidene glede na spol in telesno maso bolnika (Pearson in sod., 1995). Diagnoza se lahko postavi, če ima bolnik povišano število eritrocitov oz. hematokrita in hemoglobina vsaj dva meseca. Mejna vrednost hematokrita je > 0,52 za moške in > 0,48 za ženske, ter mejna vrednost hemoglobina >185 g/l za moške in >165 g/l za ženske (McMullin in sod., 2005; Bento, 2018). Mnogi bolniki z eritrocitozo nimajo simptomov in motnjo odkrijejo slučajno ob analizi krvne slike. Nekateri bolniki imajo nespecifične simptome kot so utrujenost, vrtoglavica ali glavobol, ki se lahko pojavijo zaradi hiperviskoznosti krvi. Pri vrsti pridobljene eritrocitoze, ki ji pravimo prava policitemija oz. policitemija vera (PV), se lahko pojavi srbečica, zlasti po izpostavljanju kože vodi (ang.»aquagenic pruritus«) (Lee in Arcasoy, 2015) Eritropoeza Eritropoeza je proces nastajanja novih eritrocitov. Gre za večstopenjski proces od multipotentne hematopoetske matične celice v kostnem mozgu do zrelega eritrocita v krvi (Orkin, 2000). Proces mora biti natančno uravnavan, sicer pride do previsoke ali prenizke koncentracije eritrocitov v krvi (Slika 1). Glavni regulator eritropoeze je hormon eritropoetin (EPO), ki nastaja pretežno v ledvicah. Od tu preko krvi pride do tarčnih celic, to so eritroidne matične celice v kostnem mozgu (Broxemeyer, 2013). Glavna funkcija EPO je uravnavanje dostave kisika perifernim tkivom. Transkripcijo EPO pozitivno uravnavajo transkripcijski faktorji, ki se aktivirajo ob hipoksiji (HIF), medtem ko vezavni proteini GATA negativno uravnavajo transkripcijo EPO (Bunn, 2013).

17 4 Slika 1: Uravnavanje nastajanja EPO (Bunn, 2013). V stanju hipoksije transkripcijski faktorji HIF aktivirajo prepisovanje gena EPO, kar poveča nastajanje novih eritrocitov. V stanju normoksije je kisika dovolj, zato se eritropoeza upočasni z znižanjem izražanja EPO. Eritropoetin se veže na eritropoetinski receptor (EPOR) na tarčnih celicah in povzroči njihovo diferenciacijo do zrelih celic. Glavni mehanizem za to je aktivacija proteina JAK2, ki nato fosforilira in aktivira protein STAT5. Ta deluje kot transkripcijski faktor in aktivira prepisovanje genov, ki so odgovorni za proliferacijo in diferenciacijo matične celice (Grebien in sod., 2008). Signalna pot JAK/STAT aktivira tudi kinaze PI3K in MAPK, ki prav tako vplivajo na prepisovanje genov odgovornih za razvoj zrelih eritrocitov iz matičnih celic v kostnem mozgu (Zhang in sod., 2014). Rezultat je povišano število zrelih eritrocitov v krvi in s tem povečana kapaciteta krvi za prenos kisika do tkiv (Bunn, 2013). Bolniki z visokoafinitetnim hemoglobinom zaradi spremembe v podenoti beta oz. eritrocitozo tipa 6 (ECYT6; glej poglavje Klasifikacija eritrocitoz) imajo povišano koncentracijo EPO v krvi zaradi kronične hipoksije v tkivih, čeprav je eritrocitov v krvi dovolj. To privede do neprestane transkripcije gena EPO in previsoke koncentracije eritrocitov v krvi. 2.2 HEMOGLOBIN Hemoglobin je transportni protein v eritrocitih, ki je sestavljen iz dveh podenot α in dveh podenot β (Slika 2). Takšno obliko imenujemo hemoglobin A (HbA) in je pri odrasli osebi prisotna v 98 % celotnega hemoglobina. Preostali delež hemoglobina predstavljata obliki HbF, ki ima namesto podenot β podenote ɣ, in HbA2, kjer so podenote δ. Vsaka od podenot hemoglobina ima vezano prostetično skupino hem, ki vsebuje železo. Glavni

18 5 nalogi hemoglobina sta prenos kisika (O2) od pljuč do perifernih tkiv ter prenos ogljikovega dioksida (CO2) od tkiv do pljuč (Thom in sod., 2013). Slika 2: Shematski prikaz tridimenzionalne strukture hemoglobina. Tetramer sestavljajo dve podenoti α (modro) in dve podenoti β (rdeče). Na vsako izmed podenot je vezana prostetična skupina hem (Michalski in Loew, 2016). Polipeptidne podenote α in β kmalu po sintezi vežejo hem, ki stabilizira zvijanje podenote v sedem oz. osem heliksov α, ki tvorijo globularno strukturo. Vsaka podenota veže nase O2 in druge ligande prek železa v hemu. To mesto je v hidrofobnem žepu hemoglobina in je evolucijsko ohranjeno. V molekuli hemoglobina se vsaka od podenot α poveže s podenoto β in se na ta način tvorita dva dimera, ki se nato med seboj povežeta. Pomembni sta dve stičišči: α1β1, ki je med podenotama, ki tvorita dimer, ter α1β2, ki je med dimeroma (Thom in sod., 2013) Nepravilnosti hemoglobina V grobem lahko bolezni povezane s hemoglobinom razdelimo v dve skupini. V eno štejemo motnje, ki nastanejo zaradi strukturnih sprememb hemoglobina, ki jim pravimo hemoglobinopatije, medtem ko v drugo prištevamo tiste, pri katerih je sinteza ene od podenot hemoglobina močno zmanjšana. Te motnje se imenujejo talasemije (Forget in Bunn, 2013; Greene in sod., 2015) Hemoglobini z visoko afiniteto do kisika Različice hemoglobina z visoko afiniteto do kisika vzpodbudijo eritropoezo (Hebbel in sod., 1978). To je lahko posledica zamenjave ene od aminokislin hemoglobina s takšno, ki bolj stabilizira stanje z visoko afiniteto (stanje R) v primerjavi s stanjem z nizko afiniteto (stanje T). Sprememba afinitete hemoglobina do kisika s prehodom iz stanja R v stanje T je pomembna za pravilen privzem in sprostitev kisika s hemoglobina (Forget in Bunn, 2013). Previsoka afiniteta hemolgobina je lahko tudi posledica različice, ki onemogoča interakcije

19 6 z regulatorji sproščanja kisika s hemoglobina kot so protoni (H + ) in 2,3-bisfosfoglicerat (2,3-BPG). Tranzicija iz stanja R v stanje T je odvisna od pravilne konformacije stičišča α1β2, zato so različice v tem stičišču pogosto odgovorne za hemoglobin z visoko afiniteto do kisika. Višja afiniteta do kisika onemogoči sprostitev kisika v perifernih tkivih, kar telo zazna kot hipoksijo in pospeši eritropoezo. Terminalni konci podenot hemoglobina so udeleženi v stabilizacijo interakcije α1β2, ki stabilizira nizkoafinitetno stanje T. Številne substitucije v teh regijah so zato tudi odgovorne za visokoafinitetne različice hemoglobina. Poleg tega zadnji histidin v podenoti beta pomembno vpliva na Bohrov efekt. Bohrov efekt se imenuje proces privzema ogljikovega dioksida v eritrocite iz perifernih tkiv, ki se metabolizira do ogljikove kisline in protona H +. H + pospešujejo sprostitev kisika s hemoglobina (Thom in sod., 2013). 2,3-bisfosfoglicerat je alosterični regulator hemoglobina in deluje tako, da z vezavo na hemoglobin zniža njegovo afiniteto do kisika. Če pride do spremembe strukture proteina na vezavnem mestu za 2,3-BPG, se ta ne veže oz. se veže v manjši meri in tako ne pride do ustreznega znižanja afinitete do kisika (Thom in sod., 2013). V tkivih se zato kisik ne sprosti s hemoglobina, kar vodi v prekomerno nastajanje novih eritrocitov. Prvi opisan visokoafinitetni hemoglobin v povezavi z DE je bil Hb Chesapeake, od takrat do danes je opisanih že več kot 100 različic hemoglobina z visoko afiniteto do kisika. Večina jih vsebuje spremembo na podenoti β, ki jo kodira gen HBB. DE zaradi takšnega spremenjenega hemoglobina se deduje dominantno, z le nekaj opisanimi primeri de novo (Bento, 2018). Večina do sedaj opisanih primerov ima torej spremembo na eni od treh omenjenih ključnih regij za funkcijo hemoglobina: α1β2 stičišče med dimeroma terminalni konec C podenote β vezavno mesto za 2,3-BPG Bolniki z DE tipa 6 (ECYT6), ki je posledica visokoafinitetnega hemoglobina zaradi različice podenote beta hemoglobina, so večinoma asimptomatski, lahko pa pride do tromboemboličnih zapletov zaradi hiperviskoznosti krvi (Bento, 2018) Talasemije Talasemije so skupina dednih nepravilnosti hemoglobina, pri katerih je sinteza hemoglobina močno zmanjšana, ali pa hemoglobin sploh ne nastaja. Glede na okvaro podenote ločimo talasemije α in talasemije β. Bolniki imajo različne simptome, nekateri so asimptomatski, nekateri imajo hude anemije, ki zahtevajo transfuzije krvi do konca življenja. Lahko pride tudi do zapletov v različnih organskih sistemih. Na stotine različic gena HBB je že bilo povezanih s talasemijo β. Različice gena so prisotne tako na

20 7 kodirajočih kot na nekodirajočih regijah. Resnost bolezni je odvisna od presežka ene od podenot, saj samostojne podenote povzročajo propadanje eritrocitov hemolizo (Nienhuis in Nathan, 2012; Martin in Thompson, 2013) Anemija srpastih eritrocitov Varianta gena HBB je odgovorna tudi za bolezen srpastih eritrocitov. Različica enega nukleotida povzroči zamenjavo glutaminske kisline na šestem mestu z valinom (Ingram, 1956). Tak hemoglobin imenujemo HbS. Najhujša in najpogostejša oblika te bolezni, HbSS, nastane pri podedovani različici gena HBB obeh staršev. Tudi pri nekaterih heterozigotih lahko pride do prekomerne količine eritrocitov srpaste oblike (Ware in sod., 2017). Posledica HbS je nepravilno zvitje podenote β, kar povzroči polimerizacijo molekul hemoglobina med procesom deoksigenacije. Pri tem se oblika eritrocita spremeni iz bikonkavne v podolgovato srpasto (Acquaye in sod., 1988). Srpasti eritrociti povzročajo okluzije kapilar in arteriol ter kronično hemolizo. Zapleti lahko vodijo do kapi, poškodb organov, pljučne hipertenzije in prezgodnje smrti (Powars in sod., 2005). 2.3 KLASIFIKACIJA ERITROCITOZ Vzroki za eritrocitozo so zelo heterogeni, zato je tudi klasifikacija kompleksna. V glavnem ločimo primarno in sekundarno eritrocitozo, in nato vsako še na pridobljeno in dedno obliko (Slika 3). Slika 3: Razdelitev eritrocitoz (Lee in Arcasoy, 2015; Bento, 2018)

21 8 Družinska eritrocitoza je lahko posledica primarne ali sekundarne oblike eritrocitoze. Klasifikacija DE (Preglednica 1) zaenkrat zajema osem tipov (ECYT1 ECYT8) bolezni glede na gen, ki jo povzroča. Gen HBB povzroča eritrocitozo tipa 6 (ECYT6). Preglednica 1: Klasifikacija DE. Tip DE (oznaka OMIM) Številka OMIM Gen ECYT EPOR ECYT VHL ECYT EGLN1 ECYT EPAS1 ECYT EPO ECYT HBB ECYT HBA1, HBA2 ECYT BPGM Primarna eritrocitoza Pri primarni eritrocitozi gre za nepravilnosti v matičnih in prekurzorskih eritroidnih celicah v kostnem mozgu, kar vodi do prekomernega nastajanja eritrocitov (Bento, 2018). Lahko gre za pridobljeno ali prirojeno obliko. Pridobljeno obliko, pravo policitemijo, povzroči različica gena JAK2 v eritroidnih izvornih celicah. To povzroči neprestano aktivacijo eritropoetinske signalne poti in posledično neprestano proizvodnjo novih eritrocitov. V 98 % primerov PV gre za spremembo V617F v 14. eksonu gena JAK2 ali za spremembo na 12. eksonu tega gena. (Baxter in sod., 2005; Scott in sod., 2007). Prirojena oblika primarne eritrocitoze je posledica različic gena za eritropoetinski receptor EPOR (Slika 3 in Preglednica 1). Za primarno eritrocitozo je značilna nizka raven serumskega EPO Sekundarna eritrocitoza Do sekundarne eritrocitoze pride zaradi nepravilnosti, izven kostnega mozga, ki povzroči hipoksijo in posledično kompenzatorno povečano nastajanje EPO. Lahko gre za fiziološki odziv na hipoksijo al pa za bolezensko stanje (Bento, 2018). Tudi pri tej vrsti gre lahko za pridobljeno ali prirojeno obliko eritrocitoze. Bolj pogoste so pridobljene oblike, kot so odziv na visoko nadmorsko višino, pljučno ali srčno bolezen ter kajenje. Vzrok so lahko tudi bolezen ledvic, endokrini tumorji in uporaba eksogenih androgenih hormonov (Lee in Arcasoy, 2015). Vzrok za prirojeno obliko so lahko nepravilnosti, ki povzročijo hipoksijo, na primer različice hemoglobina, ki imajo visoko afiniteto do kisika zaradi spremembe genov za podenote hemoglobina HBB ali HBA. Drugi geni, katerih različice lahko povzročijo sekundarno DE so VHL, EGLN1, EPAS1, EPO in BPGM (Preglednica 1).

22 9 Različice omenjenih genov so identificirane le v % primerih bolnikov z DE, zato je verjetno, da so udeleženi še drugi geni (Bento, 2018). Za sekundarno eritrocitozo je značilna povišana koncentracija EPO (Patnaik in Tefferi, 2009) Idiopatska eritrocitoza Identifikacija vzroka eritrocitoze je zaradi heterogenosti bolezni velikokrat težavna. Izraz idiopatska eritrocitoza se uporablja v primeru, ko ima bolnik povišano koncentracijo eritrocitov, vendar vzroka za prekomerno eritropoezo ni možno odkriti (Pearson in Wetherley-Mein, 1979). Nekatere bolezni, ki vodijo do eritrocitoze, so lahko šele v začetni fazi in jih je zato težje odkriti (npr. začetna faza ledvične ali srčne bolezni). Težava je tudi v nezmožnosti odkrivanja vseh prirojenih oblik z diagnostičnim testom (Pearson in Messinezy, 2001). Zaradi nepojasnjenega vzroka bolezni je takim bolnikom težko predpisati ustrezno zdravljenje (Bento, 2018). Približno 70 % primerov DE ostaja nejasnega vzroka. Bento in sod. (2013) so v svojo raziskavo vključili 70 bolnikov z izključenimi pridobljenimi vzroki eritrocitoze. Le pri petindvajsetih so našli različice genov, ki so povezane z eritrocitozo. Na podlagi tega podatka lahko sklepamo, da je odgovornih še veliko genov, ki jih še nismo odkrili, katerih polimorfizmi lahko povzročijo prekomerno produkcijo eritrocitov. 2.4 DIAGNOSTIKA ERITROCITOZ Ko je eritrocitoza pri bolniku potrjena, je pomembno določiti vzrok. Prvi korak pri identifikaciji vzroka je izključitev bolezni, za katere je znano, da lahko povzročijo povišano število eritrocitov (srčna, pljučna bolezen). Če se ne odkrije očitnega vzroka, je stanje lahko prirojeno. Naslednji korak je merjenje koncentracije EPO v serumu. Če je raven EPO nizka, gre za primarno eritrocitozo, zato so potrebne nadaljne preiskave za ugotavljanje, ali gre za PV ali prirojeno obliko bolezni. Visoka ali stanju neprimerno normalna raven EPO v serumu nakazuje sekundarno obliko eritrocitoze (McMullin, 2012). V tem primeru je potrebno raziskati morebitne nepravilnosti v genih, ki so udeleženi v poti zaznavanja kisika, prenosa kisika ali sami eritropoezi Določanje nukleotidnega zaporedja DNA Tako v primeru primarne kot sekundarne eritrocitoze, je pri dedni obliki potrebno identificirati morebitne različice genov, ki so udeleženi v pot zaznavanja kisika, prenos kisika in eritropoezo, za katere vemo, da povzročajo DE. Zlati standard identifikacije različic je sekvenciranje po Sangerju, čeprav to metodo izpodrivajo nove hitrejše metode sekvenciranja, ki jim s skupnim izrazom pravimo sekvenciranje naslednje generacije (NGS). Metode NGS so zahtevnejše za izvedbo in dražje, so pa precej hitrejše in

23 10 omogočajo sekvenciranje več genov hkrati. Metoda sekvenciranja po Sangerju je bolj zanesljiva, zato se morebitne ugotovljene spremembe genov, ugotovljene z NGS, potrdijo še z metodo po Sangerju (Camps in sod., 2016) Ostale preiskave Prva preiskava, ki lahko nakaže na prisotnost spremenjenega hemoglobina je merjenje vrednosti p50. To je parcialni tlak kisika, pri katerem je hemoglobin 50 % nasičen s kisikom (Patnaik in Tefferi, 2009; Rumi in sod., 2009). Pri eritrocitozi je ta vrednost manjša od fiziološke, saj je hemoglobin zaradi visoke afinitete do kisika nasičen že ob manjših parcialnih tlakih kisika (Slika 4). Slika 4: Saturacijska krivulja hemoglobina (Kayton in sod., 2018). Za hemoglobine z visoko afiniteto do kisika je značilna rdeča črtkana krivulja. Iz krivulje lahko odčitamo vrednost p50. Če vrednost p50 nakazuje na visokoafinitetni hemoglobin, se lahko različica hemoglobina na nivoju proteina določi z metodama HPLC in s kapilarno elektroforezo. Določitev prav vseh tipov hemoglobina ni sposobna nobena od teh metod (Mangin, 2017). Rezultate je potrebno interpretirati glede na bolnikovo etnično pripadnost in klinično sliko. Omenjeni metodi tudi ne omogočata razlikovanja hemoglobinov z nevtralno zamenjavo aminokisline (Bain in sod., 2010). Na ravni nukleotida je tako edina zanesljiva analiza sekvenciranje genov HBA in HBB, ki tvorita podenote hemoglobina.

24 Diagnostika v Sloveniji V Sloveniji se rutinsko izvaja le genetsko testiranje za potrditev oz. izključitev PV. V UKC Maribor testirajo prisotnost V617F v genu JAK2, v UKC Ljubljana pa poleg tega preverjajo tudi prisotnost polimorfizmov na 12. eksonu JAK2. Testiranje temelji na pomnoževanju gena z metodo PCR in sekvenciranju DNA z metodo po Sangerju. Bolniki, ki so negativni na PV imajo sum na DE in se jih pri nas ne obravnava dalje. V fazi prenosa v kliniko so genetski testi za gene VHL, EPO, EPOR in EPAS1, ki temeljijo na sekvenciranju po Sangerju (Mencin, 2017; Prijatelj, 2018; Vočanec, 2018; Kristan, 2018). V bližnji prihodnosti bo diagnostika tudi v Sloveniji bolj enostavna in hitrejša z uporabo NGS. 2.5 OBVLADOVANJE ERITROCITOZE Družinska eritrocitoza je zelo redko stanje, za katerega ni pravih smernic za zdravljenje oz. obvladovanje. Bolezen ima heterogeno klinično sliko, zato so tudi priporočila zelo neenotna. Za preprečevanje strdkov pri PV priporočajo nizke doze aspirina, zato bi lahko bil aspirin koristen tudi pri bolnikih z DE. Naslednja možnost zdravljenja je venesekcija, s katero znižajo vrednost hematokrita in s tem viskoznost krvi. Na ta način zmanjšajo tveganje za tromboembolične dogodke, vendar je pomembno presoditi, pri katerih bolnikih je ta metoda smiselna. Pri nekaterih tipih DE, ki jih povzročajo geni, ki so udeleženi v pot zaznavanja kisika in transport kisika, je zaradi fizoloških sprememb povišan hematokrit potreben za normalno preskrbo tkiv s kisikom. V teh primerih bi z venesekcijo naredili več škode kot koristi (McMullin, 2016). Venesekcijo zato priporočajo pri bolnikih z izrazitimi simptomi kot so vrtoglavica in zasoplost. Prav tako je smiselno ta način obvladovanja stanja izvajati pri bolnikih, ki so v preteklosti že imeli težave s krvnimi strdki (McMullin, 2012).

25 12 3 MATERIAL IN METODE Potek magistrske naloge smo opravili v dveh sklopih. Najprej smo izvedli bioinformacijsko analizo gena in temeljit pregled literature, kar nam je omogočilo nadaljevanje s praktičnim delom v laboratoriju, kjer smo razvili protokol za pomnoževanje izbranih regij gena HBB z metodo PCR in sekvencirali pomnoženo DNA oseb, vključenih v raziskavo, z metodo po Sangerju (Slika 5). Slika 5: Shematski prikaz poteka dela. Prvi del je bil izveden z uporabo podatkovnih zbirk in orodij, drugi del pa je potekal v laboratoriju. 3.1 MATERIAL Pripomočki in oprema Mikrocentrifugirke Centrifugirke Avtoklav Avtomatske pipete Nastavki za avtomatske pipete Merilni valji Erlenmajerica Parafilm Skalpel Stojala za mikrocentrifugirke in centrifugirke

26 13 Digestorij Centrifuga (Eppendorf) Tehtnica (Kern) Mikrovalovna pečica (Sharp) Hladilnik (Gorenje) Zamrzovalnik (Gorenje) Komplet za agarozno gelsko elektroforezo (Bio-Rad) Komplet za poliakrilamido gelsko elektroforezo (Bio-Rad) Vir napetosti za elektroforezo (Pharmacia) Aparat za PCR Simpli Amp (Applied Biosystems) Naprava za analizo gela ImageQuant LAS-4000 (Fujitsu Life Sciences) Reagenti in kompleti Komplet za PCR KAPA HiFi HotStart PCR Kit (Kapa Biosystems) Voda brez RNaz (Roth) Agaroza (Genaxxon bioscience) Pufer TBE (10x, 1x) (Sigma) Etidijev bromid (EtBr) (10 mg/ml) Nanašalni pufer za elektroforezo (6x) (Thermo Fischer Scientific) Standard velikosti DNA (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Thermo Scientific) Poliakrilamid (40 %) (Roth) TEMED (Sigma) APS (10 %) (Merck) Komplet za čiščenje produktov PCR QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) Začetni oligonukleotidi (ZO) (Integrated DNA technologies, IDT) 3.2 METODE Bioinformacijska analiza gena HBB Za analizo gena smo uporabili več spletnih orodij. Namen je bil določiti osnovne lastnosti gena kot so lokacija v genomu, dolžina, število eksonov in intronov, prav tako pa določitev vseh različic gena, ki so do sedaj opisane v literaturi kot vzrok DE. Različicam smo

27 14 poiskali identifikacijske številke in pripisali vir, v katerem je bila različica prvič opisana v povezavi z eritrocitozo Podatkovni zbirki Ensembl in dbsnp Ensembl (izdaja 94) (Zerbino in sod., 2018.) je genomski brskalnik in vsebuje informacije o genomih večih organizmov, posameznih genih in različicah nukleotidnega zaporedja. S pomočjo tega orodja smo pridobili osnovne podatke o strukturi gena kot so število in dolžina eksonov ter intronov. Z njim smo tudi preverili lokacije naleganja ZO, ki smo jih uporabili nadalje v raziskavi za pomnoževanje posameznih področij gena HBB. S pomočjo Ensembla smo prav tako umestili različice gena HBB, identificirane v literaturi, na nukleotidno zaporedje gena in jim pripisali identifikacijsko številko. Orodje Ensembl je med drugim povezano z zbirko dbsnp (Day, 2010), kjer smo identifikacijske številke pridobili in preverili pravilen zapis različic z nomenklaturo HGVS (den Dunnen, 2017). S pomočjo dbsnp smo tudi preverili pojavnost različic gena HBB, ki smo jih identificirali pri bolnikih Zbirka UniProt V zbirki UniProt (The UniProt Consortium, 2018) smo preverili lego vezavnih mest produkta gena HBB. Vezavna mesta smo umestili na nukleotidno zaporedje gena Zbirki in HbVar in LOVD HbVar (Giardine in sod., 2014) je podatkovna zbirka, v kateri so zbrane različice humanih hemoglobinov in različice genov, ki povzročajo talasemije. V zbirki smo poiskali vse hemoglobine z visoko afiniteto do kisika in rezultate primerjali z različicami v literaturi. Zbirka LOVD (Fokkema in sod., 2011) vsebuje vse različice gena HBB in je povezana s HbVar, vendar ni dovolj pregledna, saj vsebuje tudi informacije o različicah gena v povezavi z ostalimi hematološkimi boleznimi. Preverili smo ujemanje informacij v obeh zbirkah Bibliografska zbirka PubMed S pomočjo zbirke PubMed smo zbirali literaturo, v kateri so opisane do sedaj odkrite različice gena HBB v povezavi s prirojeno obliko eritrocitoze. Uporabili smo naslednje ključne besede v različnih kombinacijah:»erythrocytosis«,»hbb«,»familial«,»congenital«,»hemoglobin«,»polycythemia«,»variant«in pregledali dobljene zadetke. Na ta način določenim variantam gena smo nato poiskali identifikacijske številke s pomočjo orodja Ensembl in zbirk dbsnp ter HbVar. Preverili smo tudi seznam vseh hemoglobinov

28 15 z visoko afiniteto do kisika v zbirki HbVar in nato v zbirki PubMed preverili, ali te različice hemoglobina povzročijo eritrocitozo. Vse identificirane različice povezane z DE smo umestili na nukleotidno zaporedje gena HBB Vzorci DNA za vpeljavo genetskega testa in vzorci DNA bolnikov Vzorce DNA za vpeljavo diagnostične metode kot tudi DNA izbranih bolnikov smo pridobili s Hematološke klinike, UKC Ljubljana. Vsi vzorci DNA so bili izolirani iz celic krvi bolnikov s kompletom QIAquick isolation kit (Qiagen). V raziskavo smo vključili vzorce petih oseb iz dveh družin s sumom na DE vključno z zdravim sorodnikom (Slika 6). Izbrani bolniki imajo povišano število eritrocitov, povišan hemoglobin in hematokrit ter so negativni za PV. Izbor bolnikov je opisan v raziskovalni nalogi (Kopitar in sod., 2017). Vsaka od oseb, vključenih v raziskavo, je označena s črkovno-številsko kodo (Slika 6). Slika 6: Družinski drevesi družin vključenih v raziskavo. Poleg štirih bolnikov smo v raziskavo vključili tudi zdravo osebo iz ene od družin (Kopitar in sod., 2017) Izbor začetnih oligonukleotidov za pomnoževanje regij gena HBB Z analizo gena smo ugotovili, katere regije so vključene v razvoj bolezni in jih je zato potrebno sekvencirati za določitev zamenjav nukleotidov povezanih z DE. Pregledali smo dostopne informacije v literaturi, katere začetne oligonukleotide (ZO) so raziskovalci že uporabljali za pomnoževanje eksonov gena HBB. Našli smo ZO, ki so jih uporabili Bento in sod. (2015). Za vsak gen, povezan z DE, so zapisali uporabljene ZO in dolžine produktov. Te ZO smo analizirali, saj smo želeli, da izpolnjujejo naslednje pogoje:

29 16 produkt pomnoževanja zajame celoten posamezen ekson gena HBB poleg eksona zajame posamezen produkt pomnoževanja tudi vsaj osem nukleotidov sosednje intronske regije oz. regije UTR (pri tem smo upoštevali tudi dodatnih dvajset nukleotidov, ki jih pri branju zaporedja po sekvenciranju po Sangerju ne moremo zanesljivo določiti) dolžina produktov ni daljša od 500 bp za namen zanesljivega branja nukleotidnega zaporedja z metodo po Sangerju temperatura prileganja ZO (Tm) se v paru ZO ne razlikuje za več kot 2 C. Omenjeni ZO, ki smo jih našli v literaturi, niso ustrezali vsem navedenim pogojem. Kot je razvidno iz Preglednice 2 je dolžina produkta regije eksona 3 daljša od 500 bp. Prav tako se temperature prileganja ZO v vseh treh parih razlikujejo za več kot 2 C. Vseeno smo navedene ZO uporabili, saj smo želeli čim bolj poenoten diagnostični protokol, kot ga uporabljajo v tujini (Bento in sod., 2015). Modificirali smo le ZO, ki smo ga poimenovali HBB-int2F-1, saj se zadnji trije nukleotidi niso ujemali z referenčno sekvenco gena HBB, zato smo jih spremenili v prilegajoče nukleotide (Preglednica 2). ZO proizvajalca Integrated DNA Technologies so prispeli v liofilizirani obliki, zato smo jih pred uporabo po navodilih proizvajalca raztopili v vodi primerni za molekularno-biološke namene do koncentracije 100 mm, kar je bila založna raztopina ZO. Za namen rekcije PCR smo založno razopino redčili do koncentracije 5 µm. Iste ZO smo uporabili tudi za nadaljno analizo določanja nukleotidnega zaporedja po Sangerju. Preglednica 2: Začetni oligonukleotidi (ZO) za pomnožitev regij gena HBB (Bento in sod., 2015). Poimenovanje ZO Zaporedje (smer 5' 3') Pomnožena regija Dolžina ZO (bp) Tm ( C) HBB-5upF-1 GAGCCAAGGACAGGTACGG ekson HBB-ex2R-1 CAAAGGACTCAAAGAACCTC HBB-int1F-1 AGACTCTTGGGTTTCTGA ekson HBB-int2R-1 CATTCGTCTGTTTCCCATTCTA HBB-int2F-1 CAATGTATCATGCCTCTTTGCA ekson HBB-3dwR-1 GCAGCCTCACCTTCTTTCATGG Dolžina produkta (bp) Izvedba reakcije PCR Uporabili smo komplet reagentov KAPA HiFi Hot Start proizvajalca KAPA Biosystems. Reagente smo hranili v zamrzovalniku pri - 20 C. Polimerazo DNA smo imeli na ledu

30 17 tudi med pripravo reakcijske mešanice (angl.»mastermix«). Volumen ene reakcije v mikrocentrifugirki je bil 25 µl. Preglednica 3: Koncentracije in količine komponent reakcije PCR. DNA Pufer Smiselni Protismiselni Polimeraza dntp Fidelity ZO ZO DNA H2O Začetna koncentracija / 5x 5 mm 5 µm 5 µm 1 U/µL / Končna koncentracija / 1x 0,3 mm 0,3 µm 0,3 µm 0,5 U / Volumen na reakcijo 1 µl 5 µl 1,5 µl 1,5 µl 1,5 µl 0,5 µl 14 µl Pogoje pomnoževanja v aparaturi PCR smo spreminjali in prilagajali sprotnim rezultatom. Želeli smo čim bolj specifično pomnožene regije gena, zato smo spreminjali temperaturo prileganja ZO, čas podaljševanja in število ciklov (Preglednica 4). Preglednica 4: Začetni pogoji reakcije PCR. Z zvezdico so označeni pogoji, ki smo jih tekom optimiziranja pomnoževanja spreminjali in se razlikujejo pri posameznih končnih pogojih za določeno regijo gena. Korak T ( C) Čas Število ciklov Začetna denaturacija 95 5 min 1 Denaturacija s Prileganje ZO 54* 15 s 30* Podaljševanje s* Končno podaljševanje 72 1 min Optimizacija pomnožitve eksonov Reakcijo pomnoževanja regij gena HBB smo začeli pri pogojih, ki jih predlaga proizvajalec kompleta (Preglednica 4). Nato smo glede na specifičnost pomnoževanja spreminjali temperaturo prileganja ZO, čas podaljševanja in število ciklov. Z orodjem OligoAnalyzer smo preverili, kakšna je predvidena temperatura prileganja ZO (Tm). Ker so se temperature prileganja pri vseh parih ZO precej razlikovale (Preglednica 2), smo podatke o temperaturah prileganja ZO primerjali z referenco Bento in sod. (2015). Glede na prej omenjene informacije smo za temperaturo prileganja ZO izbrali 54 C pri vseh treh regijah. Na začetku smo pri tej temperaturi tudi preverili učinkovitost obeh pufrov, ki sta v kompletu. Pufer»GC rich«je namenjen pomnoževanju regij, ki so bogate z baznimi pari GC (več kot 70 %), pufer Fidelity pa omogoča boljšo zanesljivost encima polimeraze DNA. Naš cilj je bil pomnožitev posamezne regije gena HBB določene s pari ZO brez nespecifičnih pomnožkov, ki bi motili nadaljnje določanje nukleotidnega zaporedja po Sangerju Analiza produktov PCR z agarozno gelsko elektroforezo Po vsaki reakciji PCR smo produkte analizirali z gelsko elektroforezo. Najprej smo produkte analizirali na agarozni gelski elektroforezi in nato, če smo z analizo gela potrdili specifičnost pomnoževanja, smo analizo ponovili še na poliakrilamidni gelski elektroforezi

31 18 z boljšo občutljivostjo. V nekaterih primerih je bil na agarozni gelski elektroforezi viden le en specifičen odsek DNA brez ozadja, vendar se je na poliakrilamidnem gelu isti produkt PCR izkazal kot nečist. Agarozni gel je bolj enostaven za pripravo in za analizo, zato smo produkte, za katere nismo bili prepričani, da so čisti, raje najprej analizirali s to metodo in šele nato na poliakrilamidnem gelu. Za analizo smo pripravljali 1,5 % agarozne gele, kar je ustrezna zamreženost za analizo dolžin DNA odsekov vseh treh regij eksonov. Posamezen gel smo pripravili tako, da smo v 250-mililitrsko erlenmajerico zatehtali 1,13 g agaroze in dodali 75 ml 1x pufra TBE. 1x pufer TBE smo pripravili iz založne raztopine 10x TBE (Preglednica 5) tako, da smo skupaj zmešali 100 ml 10x TBE in 900 ml destilirane vode. Založna raztopina pufra je bila predhodno avtoklavirana. Vsebino erlenmajerice smo premešali in segrevali v mikrovalovni pečici dokler ni tekočina postala povsem bistra. Vmes smo večkrat premešali. Ko je bila agaroza povsem raztopljena, smo dodali toliko destilirane vode, kolikor je je med segrevanjem izhlapelo. Počakali smo nekaj minut, da se je raztopina nekoliko ohladila in nato v digestoriju dodali 4 µl EtBr. Vsebino erlenmajerice smo prelili v stojalo za gel in dodali glavniček z ustreznim številom žepkov. Po približno 30 minutah je gel strjen in pripravljen za uporabo. Skupaj s stojalom smo ga prestavili v posodo za elektroforezo in ga prekrili z 1x pufrom TBE tako, da je bil gel popolnoma prekrit. Preglednica 5: Sestava pufra TBE (10x). Reagent Borova kislina Tris EDTA Destilirana voda Količina 55 g 108 g 11,85 g Do 1000 ml V žepke agaroznega gela smo nanašali po 12 µl vzorca 10 µl produkta PCR in 2 µl nanašalnega pufra. Vedno smo poleg produktov PCR v en žepek dodali še velikostni standard (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Thermo Scientific) in sicer 1 µl velikostnega standarda, 2 µl nanašalnega pufra in 3 µl vode. Elektroforezo smo najprej izvajali pri napetosti 90 V in po nekaj minutah, ko je DNA vstopila v gel, pri napetosti 105 V. Ločevanje je potekalo približno 45 min Analiza produktov PCR s poliakrilamidno elektroforezo Ko smo z agarozno gelsko elektroforezo ugotovili, da imamo čiste produkte PCR, smo lete preverili še s poliakrilamidno gelsko elektroforezo. Poliakrilamidni gel omogoča ločbo molekul DNA, ki se v dolžini razlikujejo le za nekaj baznih parov in tako omogoča boljšo ločljivost in občutljivost od agaroznega gela. Uporabili smo komplet za poliakrilamidno

32 19 gelsko elektroforezo proizvajalca BioRad. Najprej smo uporabljali 12 % gel, vendar smo kasneje začeli pripravljati 6 % gele za namen hitrejše in boljše ločbe. Preden smo pripravili gel, smo sestavili stekelca v stojalo za vlivanje gela. Uporabili smo distančno in krovno stekelce. Z vodo smo preverili, če sta stekelci ustrezno nameščeni tako, da stojalo ne pušča. Če pripravljeno stojalo ni puščalo vode, smo jo odlili in začeli s pripravo poliakrilamidnega gela. Za pripravo 6 % gela smo v centrifugirki odmerili vodo, 10x pufer TBE, 40 % akrilamid, TEMED in APS. Sestavine in količine so navedene v Preglednici 6. TEMED in APS sta sestavini, ki omogočata polimeriziranje akrilamida, zato smo ju vedno dodali na koncu in po njunem dodatku gel takoj vlili v pripravljeno stojalo. Centrifugirko smo po dodatku vseh sestavin premešali in nato z avtomatsko pipeto vsebino prelili v stojalo med pripravljena stekelca. Pri tem smo pazili, da se niso tvorili mehurčki, ki bi kasneje motili ločbo DNA. Po vlitju gela smo med stekelca vstavili še glavniček z žepki. Po približno 20 minutah je gel strjen in pripravljen za uporabo. Poliakrilamid in TEMED smo hranili v hladilniku pri 4 C, APS v zamrzovalniku pri 20 C ter vodo in 10x pufer TBE pri sobni temperaturi. Preglednica 6: Sestava poliakrilamidnega gela. Navedene so količine za pripravo enega 6 % gela. Reagent Količina Voda 11,25 ml 40 % poliakrilamid 2,25 ml 10x TBE 1,5 ml TEMED 15 µl APS 150 µl Stekla z gelom smo postavili v nosilec ter nosilec v posodo za elektroforezo. Nato smo odstranili glavniček in žepke očistili z avtomatsko pipeto. Vzorce za nanos v žepke smo si pripravili na parafilmu in sicer smo 10 µl produkta PCR dodali 2 µl nanašalnega pufra in vsebino nanesli v žepek. V en žepek smo vedno tudi nanesli velikostni standard in sicer 1 µl, ki smo mu dodali 2 µl nanašalnega pufra in 3 µl vode. Ko smo analizirali produkte PCR bolnikov, smo želeli za eletroforezo porabiti čim manj DNA, zato smo v žepke nanesli po 5 µl produkta PCR in 1 µl nanašalnega pufra. Posodo za elektroforezo smo povezali z virom napetosti in pustili, da elektroforeza teče 60 min pri napetosti 80 V oz. dokler barvilo v nanašalnem pufru ni doseglo spodnjega roba gela. Ko smo zaustavili elektroforezo, smo odstranili stekelca iz nosilca v posodi za elektroforezo in ju ločili, da smo prišli do gela. Gel smo postavili v plastično posodico in ga prelili z raztopino EtBr s koncentracijo 1 µg/ml. Posodico smo postavili na stresalnik za 15 min, da se je gel enakomerno obarval. Nato smo raztopino EtBr odlili in gel prelili z destilirano vodo in počakali še 15 min, da se je gel razbarval, nato smo rezultate dokumentirali.

33 Analiza agaroznih in poliakrilamidnih gelov Tako agarozne kot poliakrilamidne gele smo dokumentirali z aparaturo ImageQuant LAS pod svetlobo UV. S pripadajočim programom na računalniku smo zajeli slike Čiščenje produktov PCR Produkte PCR bolnikov smo za namen sekvenciranja po Sangerju očistili preostalih ZO in dntp. Uporabili smo komplet QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) za čiščenje produktov PCR. Komplet vsebuje kolono za vezavo DNA z zbirno epruveto, pufer za vezavo DNA (PB), pufer za spiranje (PE) in elucijski pufer (EB). Za elucijo smo namesto pufra uporabili vodo brez RNaz. Najprej smo izvedli testno čiščenje pomnožene DNA na vzorcih, ki smo jih pridobili za vpeljavo metode za pomnoževanje odsekov gena HBB. S tem smo želeli preveriti učinkovitost kompleta za čiščenje DNA. Šele nato smo očistili tudi vse produkte PCR bolnikov, ki smo jih nadalje uporabili za sekvenčno analizo. Produktu PCR bolnikov, kolikor ga je preostalo po analizi z elektroforezo (20 µl), smo dodali petkratno količino (100 µl) pufra PB in vzorec prenesli v kolono z zbirno epruveto. Centrifugirali smo 1 min pri centrifugalni sili g. V zbirni epruveti se je nabrala tekočina, ki smo jo zavrgli in nato v kolono dodali 0,75 ml pufra PE. Kolono smo postavili v isto zbirno epruveto in ponovno centrifugirali 1 min pri enakih obratih. Odstranili smo zbrano tekočino in za temeljitejše čiščenje ponovili proces centrifugiranja še enkrat za 1 min pri g. Sledila je elucija, zato smo zbirno epruveto zavrgli, kolono postavili v sterilno mikrocentrifugirko in dodali 30 µl vode brez RNaz. Pri tem smo pazili, da smo vodo dodali na sredino membrane kolone za popolno elucijo očiščene DNA. Po 1 min smo spet centrifugirali pri enakih pogojih kot v prejšnjih korakih. Pridobili smo približno 28 µl očiščene DNA Priprava vzorcev za sekvenciranje Očiščene vzorce DNA bolnikov smo poslali na sekvenciranje podjetju Eurofins Genomics v Nemčijo. Vzorce DNA smo za sekvenciranje pripravili tako, da smo v sterilno mikrocentrifugirko dali 5 µl očiščene pomnožene DNA z ocenjeno koncentracijo 10 ng/µl in 5 µl smiselnega oz. protismiselnega ZO s koncentracijo 5 µm. Na vsako mikrocentrifugirko smo nalepili kodo, s katero smo lahko sledili rezultatom sekvenciranja. Za vsak ekson pri vsakem bolniku smo želeli branje sekvence v obeh smereh, zato smo na sekvenciranje poslali vzorce tako s smiselnim ZO kot s protismiselnim ZO. Skupaj smo tako poslali sekvencirati 30 vzorcev pomnožene DNA bolnikov: po trije pomnoženi eksoni

34 21 gena HBB petih vzorcev izbranih oseb (Slika 6), izbrane tri regije smo brali v smiselni in protismiselni smeri Pregled sekvenčnih datotek Rezultate sekvenciranja smo pridobili v oblikah datotek ab1, pdf za elektroferogarme, in seq za golo sekvenčno zaporedje. Za odpiranje datotek oblike ab1 smo uporabili računalniški program Chromas, ki je prosto dostopen, Adobe reader smo uporabili za datoteke pdf. Programa smo primerjali med seboj in za pregled elektroferogram raje uporabili Chromas, ki omogoča bolj enostavno iskanje določenega nukleotida v sekvenci. Za preverjanje ujemanja regij z referenčnim zaporedjem smo uporabili orodje BLAST. Primerjali smo dobljena nukleotidna zaporedja vzorcev bolnikov z referenčnim zaporedjem gena HBB NG_ Za to smo uporabili datoteke seq, ki imajo že odrezane konce s slabo kvaliteto branja. S programom Chromas smo tudi natančno preverili vse datoteke za morebitne heterozigotne zamenjave nukleotidov.

35 22 4 REZULTATI 4.1 BIOINFORMACIJSKA ANALIZA GENA HBB Gen HBB nosi informacijo za podenoto beta hemoglobina, ki spada v družino globinov. Gen se nahaja na 11. kromosomu na ročici p (Slika 7) ter vsebuje tri eksone in dva introna (Slika 8). Slika 7: Kariogram človeškega genoma. Gen HBB (označen z rdečo puščico) se nahaja na lokaciji 11p15.4 (Ensembl; Zerbino in sod., 2018) Slika 8: Shematski prikaz gena HBB. Z rdečo barvo sta označeni regiji UTR, modra barva označuje eksone in črta predstavlja introne (povzeto po Ensembl). S pomočjo zbirke UniProt smo določili vezavna mesta proteina HBB, da smo kasneje lažje umestili določene različice gena HBB (Preglednica 7). Preglednica 7: Vezavna mesta produkta gena HBB. Lega vezavnih mest je prikazana na Slika 9 (povzeto po UniProt). Ligand Vezavno mesto (zaporedna aminokislina) 2,3-BPG 2, 3, 83, 144 železo (Fe) 64, 93

36 Različice gena HBB povezane z družinsko eritrocitozo S pomočjo zbirk PubMed in HbVar ter orodja Ensembl smo zbrali vse opisane različice gena HBB, ki so povezane z DE. Do sedaj je v zbirki LOVD opisanih 911 različic gena HBB, od tega jih je glede na objave v literaturi in zbirko HbVar z DE povezanih 91. Na ravni proteina je znanih 83 različic hemoglobina, ki so povezane z DE. Veliko različic je bilo odkritih pred mnogimi leti, ko genetika še ni bila razvita. Spremembe so takrat ugotavljali na ravni proteinov z elektroforezo. Različice hemoglobina, ki so po dogovoru imenovane po geografskih mestih odkritja, potujejo drugače kot fiziološki hemoglobin. Spremembe so na ta način identificirane le na ravni aminokisline. S pomočjo zbirke HbVar in orodja Ensembl smo tem različicam hemoglobinov poiskali tudi odgovarjajočo spremembo nukleotidnega zaporedja in identifikacijsko številko (Preglednica 8).

37 24 Preglednica 8: Različice hemoglobina in gena HBB v povezavi z DE. Z boleznijo je povezanih 83 variant hemoglobina, različice so bile v literaturi objavljene v časovnem obdobju od junija 1967 do novembra Okrajšave aminokislin v preglednici so navedene v Prilogi E. Različica hemoglobina Zamenjava nukleotida Zamenjava aminokisline Številka rs Ekson Vir Hb Baden c.55g>a p.v19m rs Lee in Harrison, 2017 Hb Olympia c.61g>a p.v21m rs Stamatoyannopoulos in sod., 1968 Hb Trollhättan c.62t>a p.v21e rs Landin in sod., 1994 Hb Palmerston North c.70g>t p.v24f rs Brennan in sod., 1982 Hb Strasbourg c.71t>a p.v24d rs Bissé in sod., 1998 Hb Zoeterwoude c.71t>c p.v24a rs Harteveld in sod., 2005 Hb Grange-Blanche c.83c>t p.a28v rs Baklouti in sod., 1987 Hb Badalona c.94c>g p.l32v rs Junca in sod., 2002 Hb Brie Comte Robert c.109c>g p.p37a rs Wajcman in sod., 1999 Hb La Coruña c.116c>t p.t39i rs Ropero in sod., 2006 Hb Nantes c.103g>c p.v35l rs Wajcman in sod., 2003 Hb Pitie-Salpetriere c.103g>t pv35f rs Blouquit in sod., 1980 Hb Linköping c.109c>a p.p37t rs Berlin in sod., 1987 Hb North Chicago c.109c>t p.p37s rs Rahbar in sod., 1985 Hb Vila Real c.110c>a p.p37h rs Bento in sod., 2000 Hb Sunnybrook c.110c>g p.p37r rs Ali in sod., 1988 Hb Hinwil c.116c>a p.t39n rs Frischknecht in sod., 1996 Hb Hyden c.119a>c p.q40p rs Kolagatla in sod., 2018 Hb Poissy Hb Brisbane/Great Lakes c.169g>c in c.259g>c p.g57r in p.a87p rs in rs Lacombe in sod., 1985 c.206t>a p.l69h rs Brennan in sod., 1981; Rahbar in sod., 1981 Hb Headington c.219t>a p.s73r rs Rochette in sod., 1994 se nadaljuje

38 25 nadaljevanje Preglednice 8 Različica hemoglobina Zamenjava nukleotida Zamenjava aminokisline Številka rs Ekson Vir Hb Tsurumai c.247a>c p.k83q rs Ohba in sod., 1996 Hb Gambara c.247a>g p.k83e rs Ivaldi in sod., 1997 Hb Rahere c.248a>c p.k83t rs Lorkin in sod, 1975 Hb Helsinki c.248a>t p.k83m rs Ikkala in sod., 1976 Hb Providence c.249g>y p.k83n rs Bardakjian in sod., 1985 Hb Seoul c.259g>a p.a87t rs Shin in sod., 2016 Hb Nebraska c.259g>a in 260C>T p.a87i rs in rs Hoyer in sod., 2011 Hb Olomouc c.260c>a p.a87d rs Indrak in sod., 1987 Hb Vanderbilt c.268a>c p.s90r rs Paniker in sod., 1978 Hb Créteil c.269g>a p.s90n rs Poyart in sod., 1978 Hb Villaverde c.269g>c p.s90t rs Wajcman in sod., 1993 Hb Pierre-Bénite c.273g>c ali c.273g>t p.e91d rs Baklouti in sod., 1988 Hb Bunbury c.283g>a p.d95n rs Walker in sod., 2007 Hb Barcelona c.283g>c p.d95h rs Wajcman in sod., 1982 Hb Geldrop St. Anna c.283g>t p.d95y rs Harteveld in sod., 2005 Hb Regina c.289c>g p.l97v rs Devaraj in sod., 1985 Hb Santa Clara c.292c>a p.h98n rs Hoyer in sod., 2003 Hb Wood c.293a>t p.h98l rs Taketa in sod., 1975 Hb Malmö c.294c>a ali c.294c>g p.h98q rs Boyer in sod., 1972 Hb Kempsey c.298g>a p.d100n rs Reed in sod., 1968 Hb Ypsilanti c.298g>t p.d100y rs Glynn in sod., 1968 se nadaljuje

39 26 nadaljevanje Preglednice 8 Različica hemoglobina Zamenjava nukleotida Zamenjava aminokisline Številka rs Ekson Vir Hb Radcliffe c.299a>c p.d100a rs Weatherall in sod., 1977 Hb Hotel-Dieu c.299a>g p.d100g rs Blouquit in sod., 1981 Hb Chemilly c.299a>t p.d100v rs Rochette in sod., 1984 Hb Coimbra c.300t>a ali c.300t>g p.d100e rs Tamagnini in sod., 1991 Hb New Mexico c.302c>g p.p101r rs Moo-Penn in sod., 1985 Hb Brigham c.302c>t p.p101l rs Lokich in sod., 1973 Hb British Columbia c.304g>a p.e102k rs Jones in sod., 1976 Hb Alberta c.305a>g p.e102g rs Mant in sod., 1977 Hb Potomac c.306g>c ali c.306g>t p.e102d rs Rubin in sod., 1978 Hb Yakima c.298g>c p.d100h rs Novy in sod., 1967 Hb Saint Nazaire c.310t>a p.f104i rs Wajcman in sod., 1993 Hb Heathrow c.310t>c ali c.312c>g p.f104l rs ali rs Whitein sod., 1973; Shin in sod., 2017 Hb Sparta c.310t>g p.f104v rs Hoyer in sod., 2003 Hb Sherwood Forest c.314g>c p.r105t rs Ryrie in sod., 1977 Hb South Milwaukee c.316c>t p.l106f rs Honig in sod., 1990 Hb Little Rock c.432c>a ali c.432c>g p.h144q rs Bare in sod., 1974 Hb San Diego c.328g>a p.v110m rs Nute in sod., 1974 Hb Vexin c.350a>t p.h117l rs Wajcman in sod., 2003 Hb Ty Gard c.374c>a p.p125q rs Bursaux in sod., 1978 Hb Saint-Jacques c.421g>a p.a141t rs Rochette in sod., 1984 Hb Aurillac c.424c>g p.l142v rs Boursier in sod., 2013 se nadaljuje

40 27 nadaljevanje Preglednice 8 Različica hemoglobina Zamenjava Zamenjava nukleotida aminokisline Številka rs Ekson Vir Hb Kochi c.424c>g in p.l142v in c.433a>t p.145k-y-h 0 rs in rs Miyazaki in sod., 2005 Hb Ohio c.428c>a p.a143d rs Moo-Penn in sod., 1980 Hb Waterland c.428c>t p.a143v rs van Zwieten in sod., 2014 Hb Syracuse c.431a>c p.h144p rs Jensen in sod., 1975 Hb Abruzzo c.431a>g p.h144r rs Mosca in sod., 1993 Hb Johnstown c.328g>c ali c.328g>t p.v110l rs Jones in sod., 1990; Agarwal in sod., 2007 Hb Cambridge MA c.433 A>T p.k145 -> 0 rs Oliveira in sod., 2010 Hb San Cataldo c.434a>c p.k145t / 3 Vinciguerra in sod., 2016 / c.412g>a p.v138m rs Jang in sod., 2014 Hb Andrew- Minneapolis c.435g>c p.k145n rs Zak in sod., 1974 Hb Osler/Fort Gordon c.436t>a p.y146n rs Kleckner in sod., 1975 Hb Bethesda c.436t>c p.y146h rs Schmidt in sod., 1976 Hb Nancy c.436t>g p.y146d rs Préhu in sod., 1998 Hb Rainier c.437a>g p.y146c rs Stamatoyannopoulos in sod., 1971 Hb McKees Rocks c.438t>a p.146 Y-H 0 rs Winslow in sod., 1976 Hb Hiroshima c.439c>g p.h147d rs Hamilton in sod., 1969 Hb Hallamshire/Hb Bologna-St.Orsola c.439c>t p.h147y rs Leach in sod., 1996; Ivaldi in sod., 1999 Hb York c.440a>c p.h147p rs Misgeld in sod., 2001 Hb Cowtown c.440a>t p.h147l rs Schneider in sod., 1979 Hb Kodaira II c.441c>g p.h147q rs So in sod., 2002

41 28 Glede na zbrane podatke je razvidno, da so različice gena povezane z DE prisotne na vseh treh eksonih gena. Na podlagi tega smo se odločili, da je za potrditev ECYT6 pri bolnikih potrebno sekvenciranje vseh treh eksonov Umestitev različic v zaporedje gena Različice nukleotidnega zaporedja gena iz Preglednice 8 smo prikazali na referenčnem zaporedju (Slika 9). Ker so vse zbrane različice na kodirajočih regijah gena, so na shemi prikazani eksoni brez intronov. Na isti shemi smo prikazali vezavna mesta produkta gena HBB in vse nukleotide, katerih zamenjave so povezane z DE. Na ta način smo znane različice umestili v različna pomembna področja gena. V nekaterih primerih je na istem nukleotidu znanih več različic, ki kodirajo različne aminokisline, zato je rumeno obarvanih nukleotidov le 57, medtem ko je variant hemoglobina 83 oziroma 91 različic gena HBB. (Preglednica 8). Slika 9: Prikaz gena HBB z različicami, povezanimi z DE. Prikazano je kodirajoče področje gena z ustreznim aminokislinskim zaporedjem. Nukleotidno zaporedje eksona 1 in 3 je za boljšo preglednost označeno s črnimi črkami in zaporedje eksona 2 z modrimi črkami.

42 OPTIMIZACIJA POMNOŽEVANJA EKSONOV GENA HBB Različice gena HBB, povezane z DE, se nahajajo na eksonskih regijah gena, zato smo v analizo vključili vse tri eksone. Optimizacija je potekala na vzorcih DNA, ki smo jih pridobili s Hematološke klinike, UKC Ljubljana. Po optimizaciji postopka za pomnožitev vseh treh eksonov smo uporabili DNA bolnikov in zdrave osebe, ki smo jih prav tako pridobili s Hematološke klinike, za namen sekvenciranja DNA po Sangerju. V prvem koraku optimizacije smo preverili, kateri pufer v kompletu reagentov za PCR je bolj optimalen za pomnoževanje regij gena HBB. Komplet vsebuje pufer»fidelity«in pufer»gc rich«, ki je namenjen pomnoževanju regij, ki imajo velik delež nukleotidov G in C. Čeprav nobena od regij, ki smo jih želeli pomnožiti, nima visoke vsebnosti GC baznih parov, smo se vseeno želeli prepričati o učinkovitosti obeh pufrov (Slika 10). Slika 10: Preverjanje učinkovitosti pufrov v kompletu za PCR KAPA HiFi HotStart. GC pufer»gc rich«, F pufer»fidelity«. Pomnoževanje je bilo v vseh primerih bolj uspešno s pufrom»fidelity«. S puščicami so označene velikosti pomnožkov. V nadaljevanju smo uporabljali le pufer Fidelity, saj je s Slike 10 razvidno, da omogoča bolj specifično pomnoževanje vseh treh eksonov gena HBB. Naslednji korak je bil spreminjanje protokola, ki narekuje pogoje za pomnoževanje DNA v aparaturi za PCR. Pri

43 30 vseh treh regijah, ki smo jih pomnoževali, smo začeli z enakimi pogoji (Preglednica 4). Glede na dobljene rezultate, ki smo jih preverili na agarozni ali poliakrilamidni elektroforezi, smo pogoje spreminjali, dokler nismo dobili popolnoma specifično pomnoženih regij eksonov gena brez nespecifično pomnoženih fragmentov DNA, ki bi lahko motili določanje nukleotidnega zaporedja. Pogoji reakcije PCR, ki smo jih po potrebi spreminjali, so temperatura prileganja ZO, čas podaljševanja in skupno število ciklov denaturacije, prileganja ZO in podaljševanja. Vedno smo spreminjali le po en parameter hkrati Optimizacija pomnoževanja regije eksona 1 Produkt PCR regije eksona 1 gena HBB z izbranimi ZO obsega 461 bp. Pogoji reakcije, ki smo ji spreminjali tekom optimizacije pomnoževanja tega odseka gena, so temperatura prileganja ZO, čas podaljševanja in skupno število ciklov denaturacije, prileganja ZO in podaljševanja. Začeli smo z ugotavljanjem optimalne temperature prileganja ZO, čas podaljševanja smo pustili na 15 s in skupno število ciklov na 30. Začetno temperaturo prileganja ZO smo izbrali glede na lastnosti ZO in glede na priporočila Bento in sod (2015). Začeli smo s temperaturo 54 C in jo nato zaradi nespecifičnih produktov (Slika 11A) višali po 2 C, dokler nismo dobili manj nespecifičnih produktov. Nato smo temperaturo višali le še po 1 C (Slika 11B), dokler ni začela upadati količina našega produkta (Slika 11C). Ker je začela količina želenega produkta upadati, hkrati pa je bilo na poliakrilamidnem gelu še vedno prisotno nespecifično ozadje (Slika 11D), smo poizkusili z nižanjem števila ciklov iz 30 na 25. To je sicer pomagalo, da smo se znebili ozadja, hkrati pa je tudi močno upadla količina želenega produkta PCR. Število ciklov smo zato nazaj povišali na 30 in skrajšali čas podaljševanja s 15 s na 8 s (Slika 11E). S tem smo onemogočili pomnoževanje nespecifičnih produktov, saj so bili daljši od našega želenega produkta. Končni pogoji pomnoževanja so navedeni v Preglednici 9.

44 31 Slika 11: Prikaz optimizacije pomnoževanja eksona 1 gena HBB. Na sliki so označene temperature prileganja ZO. Puščice označujejo velikost DNA 461 bp. A prisotnih je veliko nespecifičnih produktov pomnoževanja, zato je bilo potrebno višanje temperature prileganja ZO. B prisoten je en nespecifičen produkt. C Prisoten je le naš želen produkt, količina začne upadati pri 68 C. D Produkte PCR s slike C smo preverili na poliakrilamidni elektroforezi, kjer so še vedno vidni šibki pasovi nespecifičnih produktov. E Skrajšali smo čas podaljševanja iz 15 s na 8 s, s čimer smo se znebili nespecifičnih pasov na poliakrialmidnem gelu.

45 32 Preglednica 9: Končni pogoji pomnoževanja regije eksona 1 gena HBB. Korak Temperatura ( C) Čas Število ciklov Začetna denaturacija 95 5 min 1 Denaturacija s Prileganje ZO s 30 Podaljševanje 72 8 s Končno podaljševanje 72 1 min Optimizacija pomnoževanja regije eksona 2 Produkt pomnoževanja regije eksona 2 je dolg 401 bp. Začeli smo s pogoji, ki so opisani v Preglednici 4. Začetno temperaturo prileganja ZO smo, tako kot za pomnoževanje ostalih dveh eksonov, izbrali glede na informacije Bento in sod. (2015). Temperaturo prileganja ZO smo višali, zaradi prisotnosti nespecifičnih produktov, najprej po dve stopinji (Slika 12A) in nato po eno stopinjo (Slika 12B). Na agaroznem gelu je bilo videti, da že imamo optimalne pogoje (Slika 12B), a se je nato na poliakrilamidnem gelu, ki ima boljšo ločljivost, izkazalo, da so še vedno prisotni odseki DNA, ki predstavljajo neželene produkte (Slika 12C). Ozadje smo odpravili s krajšanjem časa podaljševanja (Slika 12D). Končni pogoji so navedeni v Preglednici 10. Slika 12: Prikaz optimizacije pomnoževanja eksona 2 gena HBB. Na sliki so označene temperature prileganja ZO. Puščice označujejo velikost DNA 401 bp. A Začetne temperature prileganja ZO niso bile optimalne, saj je prisotnih veliko nespecifičnih fragmentov. B Z višanjem temprerature ZO smo na agaroznem gelu videli le naš produkt. C Pod istimi pogoji kot na sliki B so na poliakrilamidnem gelu vidne lise nad želenim produktom. D Namesto višanja temperature smo skrajšali čas podaljševanja in na poliakrilamidnem gelu dobili čiste produkte.

46 33 Preglednica 10: Končni pogoji pomnoževanja regije eksona 2 gena HBB. Korak Temperatura ( C) Čas Število ciklov Začetna denaturacija 95 5 min 1 Denaturacija s Prileganje ZO 63,5 15 s 30 Podaljševanje 72 7 s Končno podaljševanje 72 1 min Optimizacija pomnoževanja regije eksona 3 Produkt reakcije pomnoževanja 3. eksona je dolg 666 bp. Pri optimizaciji reakcije PCR smo bili uspešni le z višanjem temperature prileganja ZO. Slika 13 prikazuje višanje temperature do 66 C. Že pri 62 C smo na agaroznem gelu videli le eno liso, vendar se je na poliakrilamidnem gelu izkazalo, da so prisotne nečistoče, zato smo temperaturo smo morali še višati do 66 C. V Preglednici 11 so navedeni končni pogoji pomnoževanja. Slika 13: Prikaz optimizacije pomnoževanja eksona 3 gena HBB. Na sliki so označene temperature prileganja ZO. Puščice označujejo velikost DNA 666 bp. A Začetno višanje temperature prileganja ZO. B Na agaroznem gelu so vidni le specifično pomnožene regije. C Produkti s slike B na poliakrilamidnem gelu, kjer je vidna zelo blede lise nespecifično pomnoženega področja. D Na poliakrilamidnem gelu vidimo le naš želen pomnožen produkt PCR. Preglednica 11: Končni pogoji pomnoževanja regije eksona 3 gena HBB. Korak Temperatura ( C) Čas Število ciklov Začetna denaturacija 95 5 min 1 Denaturacija s Prileganje ZO s 30 Podaljševanje s Končno podaljševanje 72 1 min 1

47 POMNOŽEVANJE REGIJ GENA HBB PRI BOLNIKIH S pomočjo vzpostavljenega protokola za pomnožitev regij treh eksonov gena HBB smo z izbranimi pogoji reakcije PCR (Preglednica 9, Preglednica 10 in Preglednica 11) pomnožili DNA oseb iz dveh družin. Osebe vključene v raziskavo so negativne na PV in imajo sum na DE, saj imajo povišano število eritrocitov ter povišan hemoglobin ter hematokrit. Pomnožili smo tudi vzorec DNA zdravega družinskega člana (Slika 6). Pri vzorcih treh bolnikov smo z vpostavljenim protokolom za reakcijo PCR poleg želenih produktov pomnožili še nespecifične produkte (Slika 14 vzorci 1, 2 in 5). Ozadje je predvsem vidno pri pomnoževanju eksona 1 in eksona 2. Pri teh treh vzorcih je koncentracija DNA zelo visoka, kar se vidi po močni obarvanosti žepkov na poliakrilamidnem gelu (Slika 14). Slika 14: Pomnožene regije gena HBB pri bolnikih in zdravi osebi na poliakrilamidnem gelu. Puščice označujejo velikost posameznih pomnoženih regij. Pri vzorcih 1, 2 in 5 so pri eksonu 1 in eksonu 2 prisotni nespecifično pomnoženi produkti, zato je bilo potrebno redčenje DNA. Legenda: 1 oseba AAA2-P1M, 2 oseba AAA1-P1M, 3 oseba AAB1-N1M, 4 AAB1-P1F, 5 oseba AAB2-P2M, NK negativna kontrola (Slika 6). Predvidevali smo, da je vzrok za nespecifično ozadje previsoka koncentracija DNA oseb, ki smo jo uporabili za reakcijo PCR. DNA smo nato redčili 5x in ponovili reakcijo PCR. Tokrat so bili rezultati uspešni (Slika 15). Dobljene pomnožene regije gena HBB bolnikov in zdrave osebe smo nato očistili ZO in dntp-jev ter uporabili za sekvenciranje po Sangerju.

48 35 Slika 15: Pomnoženi odseki gena HBB pri treh osebah z redčeno DNA na poliakrilamidnem gelu. Puščice označujejo velikost posameznih pomnoženih regij. Legenda: 1 oseba AAA2-P1M, 2 oseba AAA1-P1M, 5 oseba AAB2-P2M, NK negativna kontrola 4.4 SEKVENČNA ANALIZA GENA HBB PRI BOLNIKIH Nukleotidno zaporedje izbranih pomnoženih regij gena HBB vzorcev je bilo določeno z metodo sekvenciranja DNA po Sangerju. Rezultate smo pridobili v elektronski obliki v različnih formatih datotek. Za ugotavljanje razlik preiskovanih vzorcev z referenčnim zaporedjem HBB smo uporabili datoteke oblike seq, ki vsebujejo črkovno nukleotidno zaporedje z že odstranjenimi začetnimi in končnimi deli sekvenc s slabo zanesljivostjo branja. Z orodjem BLAST smo pridobljena nukleotidna zaporedja primerjali z referenčnim zaporedjem NG_ Pregledali smo tudi vse elektroferograme oblike ab1 z računalniškim programom Chromas za morebitne heterozigote. Pri analizi sekvenc gena HBB oseb iz družin z DE smo pri vseh petih osebah našli tri različice gena HBB (Slika 16, Preglednica 12). Vse tri različice so v literaturi opisane kot neškodljive (benigne). Zamenjava nukleotida c.9t>c je v kodirajoči regiji v prvem eksonu, ostali dve, c g>c in c , sta v drugem intronu. Poimenovanje različic je v skladu z nomenklaturo HGVS glede na referenčno zaporedje HBB NM_

49 36 Slika 16: Elektroferogrami sekvenčne analize bolnikov in zdrave osebe. Pri vseh osebah smo našli enake različice: c.9t>c, c g>c in c c>t.

50 37 Preglednica 12: Različice gena HBB pri sekvenčni analizi bolnikov. Zamenjava nukleotida Regija gena Številka rs Posledica c.9t>c Ekson 1 rs Enakosmiselna zamenjava c g>c Intron 2 rs Intronska različica c c>t Intron 2 rs Intronska različica Vse določene zamenjave nukleotidov so navedene v orodju Ensembl in imajo svoje številke rs ter niso patogene. V Preglednici 13 so navedeni genotipi analiziranih različic gena. Polimorfizem c.9t>c je sicer na zelo pomembnem mestu v genu, saj je pripadajoča aminokislina vezavno mesto za 2,3-BPG, vendar gre v tem primeru za enakosmiselno (sinonimno) zamenjavo nukleotida, kar pomeni, da ne pride do zamenjave aminokisline. Na Sliki 17 so prikazane lege različic, ki smo jih našli pri preiskovanih vzorcih. Preglednica 13: Pregled genotipov različic gena HBB pri preiskovancih. Zamenjava nukleotida Genotip preiskovancev AAA1-P1M AAA2-P1M AAB1-N1M AAB1-P1F AAB2-P2M c.9t>c CC CC CT CC CT c g>c CC CC CG CC CG c c>t TT TT TC TT TC

51 38 Slika 17: Prikaz lege identificiranih različic gena HBB pri preiskovanih osebah na referenčnem zaporedju gena. Rdeče črke označujejo regije UTR, modre črke eksone in sive črke označujejo introne. V rumenih okvirčkih so označene lege različic.

52 39 5 RAZPRAVA 5.1 GEN HBB IN RAZLIČICE HEMOGLOBINA V literaturi je opisanih več kot 100 različic hemoglobina, ki povzročijo visoko afiniteto hemoglobina do kisika (Bento, 2018; HbVar). Največ teh različic se nahaja na genu HBB, manjši delež pa na genu HBA, ki nosi zapis za podenoto alfa hemoglobina (Bento in sod., 2013; HbVar). Hemoglobini s previsoko afiniteto do kisika lahko povzročijo eritrocitozo, saj se kisik ne sprosti v dovoljšnji meri v tkiva, kar vodi v kronično hipoksijo. Zaradi hipoksije je produkcija EPO ves čas povišana, kar povzroči previsoko koncentracijo eritrocitov v krvi (McMullin, 2008). Cilj naloge je bila opredelitev regij in domen gena HBB ter vezavnih mest produkta gena. S pomočjo informacij, ki smo jih pridobili v spletnem genomskem brskalniku Ensembl smo narisali shemo gena in s pomočjo podatkovne zbirke proteinov Uniprot določili vezavna mesta podenote beta hemoglobina. Vsem dobljenim informacijam smo na isto sliko dodali še nukleotide, katerih različice so povezane z DE (Slika 9). Na ta način smo prikazali prekrivanje pomembnih regij gena z nukleotidi, ki vodijo v DE. Predvidevali smo, da je najbolj pomembna regija gena HBB v kontekstu eritrocitoz vezavno mesto za 2,3-BPG. Ta molekula z vezavo na hemoglobin povzroči zmanjšanje afinitete do kisika in posledično sprostitev kisika s hemoglobina. Če je v tej regiji gena HBB prisotna zamenjava nukleotida, je lahko posledica nezmožnost vezave 2,3-BPG na hemoglobin in s tem previsoka afiniteta hemoglobina do kisika. Ugotovili smo, da sta od štirih aminokislin, ki so udeležene v vezavna mesta molekule 2,3-BPG, dve povezani z DE (Slika 9). Druga in tretja aminokislina podenote beta hemoglobina, ki sta vezavno mesto za 2,3-BPG, nista povezani z DE. Verjetno je, da te regije niso tako pomembne oz. se v veliki večini 2,3- BPG veže na ostali dve vezavni mesti, kar zadošča za normalno funkcijo hemoglobina. Hipoteza je lahko tudi ravno nasprotna: zamenjave nukleotidov na teh mestih so letalne že v zgodnjem razvoju in jih zato pri ljudeh ni moč zaznati. Naslednje pomembno vezavno mesto gena HBB je mesto, kjer se na hemoglobin veže železo. Tudi tu smo pričakovali večino nukleotidov povezanih z DE, vendar na teh dveh mestih ni genetskih variant, v literaturi povezanih z DE (Slika 9). Kisik se prek železa veže na hemoglobin, zato so vezavna mesta za železo ključnega pomena za funkcijo hemoglobina. V tem primeru prav tako predpostavljamo, da zamenjave nukleotidov na teh mestih niso združljive z življenjem. Glede na pregled literature (Thom in sod., 2013) smo ugotovili, da je za optimalno afiniteto do kisika odgovornih več regij hemoglobina. Ključnega pomena so med drugim terminalni konci C podenot hemoglobina, saj so udeleženi v stičišče podenot α1β2. To območje je pomembno za prehod hemoglobina iz stanja R v stanje T, ki omogoča sprostitev kisika s hemoglobina. Vsi nukleotidi terminalnega konca C HBB so povezani z

53 40 DE. V tej regiji gena je še posebej pomembno območje, ki kodira zadnjo aminokislino histidin. Ta pomembno vpliva na Bohrov efekt z vezavo na asparagin na 95. mestu (Perutz in sod., 1984.). Tudi na asparaginu na 95. mestu so znane zamenjave nukleotidov, ki vodijo do DE. V stičišče α1β2 je prav tako udeleženih več aminokislin na različnih predelih gena. Na teh mestih je znanih več visokoafinitetnih različic hemoglobina. Našli smo tudi različice hemoglobina, katerih zamenjave nukleotidov niso na omenjenih regijah. Hemoglobin je tetramer, ki je v veliki meri odvisen od alosteričnih dejavnikov in kooperativnosti podenot. Vsaka sprememba aminokislinskega zaporedja lahko prispeva k zmanjšani kooperativnosti in posledično spremenjenim lastnostim hemoglobina. Spremenjene lastnosti so tako lahko tudi previsoka afiniteta do kisika (Thom in sod., 2013). Glede na shematski prikaz različic je razvidno, da se različice nahajajo po celotni kodirajoči regiji gena HBB. Za identifikacijo različic tega gena pri bolnikih z DE je tako potrebno sekvenciranje vseh treh eksonov. Poudariti moramo, da smo izpostavili le različice hemoglobina, ki so povezane z DE. Hemoglobin je pomemben protein in je povezan še z mnogimi drugimi hematološkimi boleznimi. V genu HBB je skoraj vsak nukleotid povezan s katero od teh bolezni Podatkovna zbirka HbVar Za pridobivanje podatkov o variantah hemoglobina smo med drugim uporabili zbirko HbVar. V iskalni niz lahko vpišemo ime različice hemoglobina in pridobimo podatke o zamenjavi nukleotida in klinični sliki. Zbirka vsebuje tudi že zbrane variante hemoglobina po sklopih, med njimi je tudi seznam vseh visokoafinitetnih različic hemoglobina. Ker smo se iskanja različic najprej lotili s pregledom literature z iskanjem prek PubMed, smo s pomočjo zbirke HbVar zajeli večino spregledanih različic. Zanimalo nas je, ali je vse različice opisane v HbVar, možno najti tudi prek zbirke PubMed, in obratno, ali so vse objave v literaturi zabeležene tudi v zbirki HbVar. Ugotovili smo, da v zbirki HbVar ni navedena različica Hb Seoul, ki so jo identificirali Shin in sod. (2016). Jang in sod. (2014) so opisali različico c.412g>a; p.v138m, ki je prav tako ni v HbVar. Osemintridesetim bolnikom z eritrocitozo so sekvencirali šest genov povezanih z DE (HBB, HBA2, VHL, EGLN1, EPAS1 in EPOR). Pri enem bolniku so našli omenjeno zamenjavo nukleotida in ni navedena v zbirki HbVar. V literaturi več objav omenja različico Hb Heathrow z zamenjavo nukleotida c.312t>c, ki je zabeležena v HbVar. V eni od objav smo našli zamenjavo nukleotida c.310t>c, ki privede do enake zamenjave aminokisline kot v primeru c.312t>c, vendar sprememba c.310t>c ni navedena v HbVar. Med pregledovanjem vseh različic visokoafinitetnih hemoglobinov v zbirki HbVar smo naleteli tudi na varianti Hb Vancleave (c.431a>t) in

54 41 Hb Gavle (c.311t>a). Našli nismo niti ene objave, ki bi potrjevala obstoj teh različic, še manj pa povezave z DE, zato ju nismo vključili v Preglednico 8. Različica Hb San Cataldo, c.434a>c (Vinciguerra in sod., 2016), je zabeležena v zbirki HbVar na seznamu visokoafinitetnih različic hemoglobina, nima pa številke rs oz. je na tem nukleotidu v brskalniku Ensembl navedena le zamenjava c.434a>t, ki vodi v Hb Barbizon in ni povezan z DE. Težave pri pridobivanju podatkov znanih polimorfizmov, povezanih z DE, nam je predstavljala neenotna terminologija, ki se uporablja za opis bolezni. Nekateri uporabljajo izraz kongenitalna eritrocitoza, kar nakazuje, da gre za eritrocitozo, ki je prisotna vse življenje. Izraz sicer ni sopomenka izrazu družinska eritrocitoza, saj kongenitalna eritrocitoza ni nujno dedna oblika. Naslednji sinonim, ki se pogosto uporablja v zvezi z eritrocitozo je policitemija. Izraz se predvsem uporablja za opis pridobljene primarne oblike eritrocitoze - policitemija vera, izraz pa je tudi precej razširjen kot sinonim za splošen izraz za eritrocitozo. Zasledili smo tudi pojem eritremija, ki je tudi sopomenka za eritrocitozo, vendar se skoraj ne uporablja več. Naslednjo težavo nam je predstavljalo dejstvo, da je različic hemoglobina ogromno in se pojavljajo pri različnih hematoloških boleznih. V večini objav je tako v naslovu in izvlečku opisana različica hemoglobina in njene lastnosti, šele ob pregledu celotnega članka pa ugotovimo, da so jo odkrili pri bolniku s povišanim hematokritom in več družinskih članih in jo zato povezujejo z dedno obliko eritrocitoze. S temeljitim pregledom literature smo torej določili vse do sedaj znane različice gena HBB, ki povzročajo DE. Našli smo pomanjkljivosti v zbirki HbVar, ki smo jih ugotovili s pregledom objav v povezavi z DE. Na tem področju manjka podatkovna zbirka, ki bi vsebovala vse različice vseh genov, ki so povezane z eritrocitozo. Približek take zbirke je spletna stran ki nas sedaj preusmeri do zbirke LOVD (Fokkema in sod., 2011), kjer različice posameznega gena niso urejene v kategorije. Ugotovili smo, da je zbirka LOVD povezana s HbVar, torej vsebuje identične informacije, vendar ni tako pregledna kot HbVar, saj ne nudi toliko možnosti filtriranja različic. Naš pregled literature in različnih zbirk je zaradi navedenih razlogov velikega pomena. 5.2 VZPOSTAVITEV DIAGNOSTIČNE METODE IN SEKVENČNA ANALIZA Z identifikacijo regij, ki jih je potrebno sekvencirati, smo začeli iskati primerne pare ZO za reakcijo PCR. Pomnoževanje DNA je potrebno za nadaljnje sekvenciranje po Sangerju. Želeli smo čimbolj specifično pomnožiti regije eksonov gena, saj bi pomnožene nespecifične regije motile branje sekvenc. Ker smo želeli čim bolj poenoten protokol z že vzpostavljenimi v tujini, smo se odločili, da poizkusimo z ZO, ki so jih navedli Bento in sod. (2015). Z veliko prilagoditvami protokola za izvedbo reakcije PCR smo uspeli določiti

55 42 optimalne pogoje za pomnožitev vseh treh eksonov (Preglednica 9, Preglednica 10 in Preglednica 11). Nespecifično pomnoženi fragmenti DNA so lahko posledica ZO, ki se ne prilagajo le na želeno regijo, ampak še na druge, zato je pomembno najprej preveriti specifičnost ZO (Chuang in sod., 2013). Z višanjem temperature zaostrimo pogoje prileganja ZO na matrično DNA in onemogočimo prileganje ZO na ostale regije, na katere se ZO prilega z manjšo afiniteto. Poleg optimalnega prileganja ZO je pomembna tudi zanesljivost polimeraze DNA. Del kompleta, ki smo ga uporabili, je encim s 3' 5' eksonukleazno aktivnostjo, kar omogoča zelo dobro natančnost pomnoževanja. Encim je tudi zaščiten s protitelesom, ki polimerazo drži v neaktivnem stanju do prvega koraka v reakciji PCR. S tem je onemogočeno nespecifično pomnoževanje med samo pripravo reakcijske mešanice. DNA bolnikov in zdrave osebe smo pomnožili po vzpostavljenem protokolu. Pri treh osebah je bila koncentracija DNA previsoka, zato smo jo morali redčiti (Slika 15). Protokol je namenjen za uporabo v klinični praksi, kjer rutinsko ne merijo koncentracije DNA. Z upoštevanjem tega smo protokol vzpostavili brez merjenja DNA, ki smo jo dobili za vpeljavo metode. Želeli smo, da je reakcija PCR uspešna tudi pri različnih koncentracijah DNA. Vseeno je bila koncentracija DNA treh oseb previsoka, kar se vidi na po žepkih na poliakrilamidnem gelu, kjer vidimo temne lise (Slika 14). Po navodilih proizvajalca kompleta je optimalna količina genomske DNA za uporabo v reakciji PCR ng. Večje količine lahko povzročijo pomnožitev neželenih regij. Sekvenčna analiza bolnikov in zdrave osebe je razkrila, da so pri vseh osebah prisotne tri zamenjave nukleotidov v primerjavi z referenčnim zaporedjem NG_ Ker so različice prisotne tudi pri zdravi osebi, ne moremo potrditi, da so povezane z DE. Zamenjava nukleotida c.9t>c je še posebej zanimiva, saj gre za enakosmiselno zamenjavo, torej sprememba nukleotida zaradi degeneriranosti genetskega koda ne privede do zamenjave aminokisline. Kar je pritegnilo našo pozornost, je lokacija te enakosmiselne različice nahaja se namreč na vezavnem mestu za 2,3-BPG. Kot je bilo že prej omenjeno je ta regija izjemno pomembna za pravilno afiniteto hemoglobina do kisika. Zamenjava nukleotida na tem mestu bi lahko povzročila spremembe v strukturi proteina, čeprav ne pride do zamenjave aminokisline (Chamary in sod., 2006). V preteklosti je bila pozornost pri iskanju vzrokov genetskih bolezni usmerjena v drugačnosmiselne zamenjave nukleotidov, v zadnjem času pa se vse več pozornosti posveča tudi enakosmiselnim različicam (Sauna in Kimchi-Sarfaty, 2011). Te so včasih imenovali»tihe mutacije«zaradi centralne dogme molekularne biologije, ki pravi, da je struktura proteina določena le z aminokislinskim zaporedjem (Anfinsen, 1973). V večini genomov, ki so bili do sedaj sekvencirani, so kodoni za iste aminokisline zastopani v različnih deležih (ang.»codon bias«). Danes vemo, da je ta fenomen ključnega pomena za ekspresijo genov na ravni procesiranja mrna kot tudi na ravni translacije in zvijanja proteina (Plotkin in Kudla, 2011). Enakosmiselne zamenjave nukleotidov lahko zato povzročijo nepravilno

56 43 izrezovanje intronov (Cartegni in sod., 2002) ali vplivajo lahko na stabilnost mrna in s tem na ekspresijo proteina in njegovo aktivnost (Nackley in sod., 2006). Z enakosmiselnimi variantami je povezanih veliko bolezni kot so makularna degeneracija (Narendra in sod., 2009), astma (Kim in sod., 2010) in osteoporoza (Vidal in sod., 2009), seznam bolezni pa se bo po vsej verjetnosti še znatno povečal, saj so ta odkritja relativno nova. Zaradi omenjenih mehanizmov, s katerimi lahko tudi enakosmiselne zamenjave nukleotidov prispevaju k razvoju bolezni, bi lahko bila omenjena različica c.9t>c predmet nadaljnih analiz. Preverili smo pogostost alelov te različice v evropski populaciji. Alel T ima pogostost 0,18 ter alel C 0,82. Precej visoka frekvenca alela C nakazuje na neškodljivost omenjene različice, saj so patogene različice, razen redkih izjem, v populaciji redke (MacArthur in sod., 2014; Kobayashi in sod., 2017). Za določitev posledic te različice bi bile potrebne nadaljne funkcijske analize. Ostali dve identificirani zamenjavi nukleotidov, c g>c in c c>t, se nahajata v 2. intronu. Ker sta v nekodirajoči regiji gena, nimata vpliva na primarno strukturo proteina. V podatkovni zbirki Ensembl sta navedeni kot neškodljivi. Tudi ti dve različici sta zelo pogosti, saj je pogostost referenčnega alela v evropski populaciji pri c g>c le 0,17 in pri c c>t 0,18. Navedena dejstva nakazujejo na neškodljivost teh dveh različic gena. 5.3 IZZIVI NA PODROČJU DE Do sedaj je bilo odkritih že več genov in njihovih variant, ki povzročajo DE, vendar je vzrok pri večini bolnikov še vedno neznanka. V prihodnosti bo potrebnih še mnogo študij, da bi odkrili še preostale gene, ki so udeleženi v DE. Diagnostika s sekvenciranjem DNA po Sangerju je zamudna metoda, vse bolj pa se uveljavlja NGS. Ta metoda je sicer manj natančna, vendar omogoča hitrejše rezultate in analizo več vzorcev in sekvenciranje več genov hkrati. Na ta način se bo z vse večjo dostopnostjo te metode hitreje našlo in potrdilo ostale kandidatne gene, ki povzročajo DE. Camps in sod. (2016) so z uporabo NGS sekvencirali eksonske regije 21 genov udeleženih v eritropoezo, zaznavanje in transport kisika. Analizirali so DNA 125 bolnikov in odkrili 51 variant genov, od tega jih je bilo deset že povezanih z DE, 22 jih je bilo na novo odkritih tako v že znanih kot tudi v novih kandidatnih genih GFI1B, KDM6A in BHLHE41. Vse različice so potrdili z metodo sekvenciranja po Sangerju. Odkritje novih genov in njihovih različic bo v prihodnosti pripomoglo ne samo k hitrejši diagnozi, ampak tudi k razvoju smernic za zdravljenje različnih podtipov eritrocitoze.

57 44 6 SKLEPI Družinska eritrocitoza (DE) je zelo redka krvna motnja s heterogenim genetskim ozadjem, kar otežuje diagnostiko. Znano je, da so vzrok za DE lahko odgovorne različice genov, ki so udeleženi v eritropoezo, zaznavanje in prenos kisika po krvi. Gen HBB je udeležen v prenos kisika po krvi, saj kodira zapis za eno od podenot hemoglobina, in povzroča enega od tipov DE ECYT6. V raziskavi smo preverjali dve hipotezi: Različice HBB se nahajajo na delih gena, ki so ključni za vezavo in sprostitev kisika s hemoglobina. To hipotezo smo potrdili, saj smo pripravili shematski pregled vseh različic, udeleženih v DE in na isti sliki označili pomembne regije gena. Razvidno je, da je večina različic prisotna na delih zaporedja, ki so pomembni za afiniteto hemoglobina do kisika. Te regije so terminalni konec C, vezavna mesta za 2,3-BPG in stičišče α1β2. Pri bolnikih iz dveh družin, vključenih v raziskavo, so prisotne različice gena HBB, ki jih ni pri zdravi kontroli. Hipotezo smo delno potrdili, saj smo pri vseh preiskovanih vzorcih DNA identificirali tri različice gena HBB: c.9t>c, c g>c in c c>t. Identificirane variante gena so prisotne tudi pri zdravi osebi in najverjetneje niso vzročne za DE. V Sloveniji bo naslednji izziv pri DE vzpostavitev diagnostičnega testiranja za vse gene udeležene pri DE z metodo NGS in prenos testiranja v klinično prakso. V svetovnem merilu je metoda NGS vse bolj v razmahu, seveda pa je metoda sekvenciranja po Sangerju še vedno ključnega pomena za potrjevanje vseh na novo ugotovljenih različic z NGS. Potrebno bo še veliko raziskav, ki bodo potrdile obstoj še drugih variant genov povezanih z DE, ki jih še ne poznamo.

58 45 7 POVZETEK Družinska eritrocitoza (DE) je dedna oblika krvne motnje, za katero je značilno prekomerno nastajanje rdečih krvnih celic, eritrocitov. Večina bolnikov je asimptomatskih; pri njih se motnja odkrije slučajno ob obisku pri zdravniku zaradi drugih težav. Stanje povišane koncentracije eritrocitov v krvi je problematično, saj lahko pride do tromboemboličnih zapletov tvorba strdkov in zamašitev žile. Do eritrocitoze lahko pride zaradi različnih razlogov, kar otežuje diagnostiko vzroka. Eritrocitoze v splošnem delimo na primarne in sekundarne, vsako od teh kategorij pa še nadalje delimo v pridobljene in prirojene (dedne) oblike eritrocitoze. Za primarno eritrocitozo je značilna motnja v kostnem mozgu, kjer eritrociti nastajajo. Pridobljeno obliko te bolezni imenujemo prava policitemija oz. policitemija vera (PV), kjer gre za somatsko spremembo gena JAK2. Prirojena oblika primarne eritrocitoze je posledica različice gena za eritropoetinski receptor (EPOR). Eritropoetin (EPO) je hormon, ki pospešuje proces nastajanja eritrocitov; eritropoezo. Za primarno eritrocitozo je značilno, da je koncentracija EPO normalna oz. relativno nizka glede na koncentracijo eritrocitov v krvi. Pri sekundarni eritrocitozi gre za motnjo izven kostnega mozga. Pridobljena oblika je lahko posledica fiziološkega stanja prilagoditve na visoko nadmorsko višino, bolezni ali jemanja zdravil. Prirojeno obliko sekundarne eritrocitoze povzroči različica enega od genov, ki so udeleženi v zaznavanje in prenos kisika po krvi in eritropoezo (HBB, HBA1, HBA2, VHL, EGLN1, EPAS1, BPGM in EPO). Gen HBB povzroča družinsko eritrocitozo tipa 6 oz. ECYT6. Namen magistrske naloge je bil pregled različic gena HBB povezanih z DE tipa ECYT6 in vzpostavitev diagnostične metode za detekcijo variant gena HBB pri bolnikih z DE v Sloveniji. V ta namen smo v literaturi poiskali do sedaj znane različice gena HBB, ki so povezane z DE. Iskali smo s pomočjo genomskega brskalnika Ensembl in podatkovnih zbirk PubMed ter HbVar. Zbrane različice smo shematsko prikazali na nukleotidnem zaporedju gena. S tem smo določili, katere regije gena je potrebno sekvencirati, da bi preverili prisotnost različic hemoglobina pri bolnikih. Ker so različice razporejene po celotnem kodirajočem zaporedju gena HBB, je bilo potrebno sekvenciranje vseh treh eksonov gena. Ker smo pripravljali protokol za sekvenciranje po Sangerju, je bil naš naslednji korak priprava postopka za pomnožitev vseh treh eksonov gena z metodo PCR. V literaturi smo našli primerne začetne oligonukleotide (ZO) za vse tri eksone. Za vsak ekson posebej smo optimirali postopek pomnoževanja tako, da se je pomnožil samo želen odsek gena, saj bi nespecifični pomnožki lahko motili potek sekvenciranja. Prisotnost nespecifičnega pomnoževanja smo tekom postopka optimiranja preverjali z agarozno in poliakrilamidno gelsko elektroforezo. Z izpopolnjenim protokolom za reakcijo PCR za vse tri eksone smo lahko pomnožili DNA bolnikov z DE. V raziskavo smo vključili dve družini. Vključena je bila tudi zdrava oseba iz ene od družin. Reakcija PCR je bila uspešna za dve osebi, pri treh osebah pa so bile na poliakrilamidni elektroforezi vidne nespecifične lise. Predvidevali smo, da je bila koncentracija izolirane DNA previsoka. Z redčenjem

59 46 DNA smo uspeli dobiti popolnoma specifične produkte, primerne za sekvenciranje po Sangerju. Pred sekvenciranjem smo jih še očistili preostalih prostih nukleotidov in ZO. Sekvenciranje je bilo izvedeno s smiselnim in protismiselnim ZO. Rezultate sekvenciranja smo analizirali: najprej smo preverili ujemanje zaporedij v obeh smereh branja, nato smo s spletnim orodjem preverili ujemanje zaporedij z referenčnim zaporedjem gena HBB. Pri vseh petih osebah, tudi pri zdravi osebi, smo odkrili tri polimorfizme: c.9t>c, c g>c in c c>t. Prvi je v kodirajoči regiji v prvem eksonu, druga dva pa v drugem intronu. Zamenjava nukleotida c.9t>c je v pomembni regiji, saj je na vezavnem mestu za molekulo 2,3-bisfosfoglicerat (2,3-BPG), ki je ključnega pomena za optimalno afiniteto hemoglobina do kisika. Če ima hemoglobin preveliko afiniteto do kisika, se kisik ne sprosti v periferna tkiva v dovoljšnji meri, kar telo zazna kot hipoksijo. Hipoksija je glavni regulator eritropoeze, kar povzroči kronično prekomerno nastajanje eritrocitov. Ostala dva določena polimorfizma sta v nekodirajoči regiji gena in v literaturi nista opisana kot patogena. Pri teh dveh družinah gre verjetno za spremembo katerega drugega gena, ki je povezan z DE. Vzpostavili smo protokol za molekularno-genetski diagnostični test določanja različic gena HBB pri bolnikih s sumom na DE v Sloveniji. Naslednji korak bo prenos protokola v klinično prakso in vzpostavitev postopkov za sekvenciranje ostalih genov, ki so povezani z DE. Predvidevamo, da obstaja še mnogo genov udeleženih v DE, ki jih še ne poznamo in ostajajo izziv za prihodnje raziskave na tem področju. Z vse bolj dostopno metodo NGS bo tako odkrivanje novih genov kot diagnosticiranje bolnikov potekalo hitreje in bolj enostavno.

60 47 8 VIRI Acquaye C., Blanchette-Mackie E. J., Reindorf C., Edelstein S., Schechter A. N Electron microscopic studies of the intracellular polymerization of sickle hemoglobin. Blood Cells, 13, 3: Agarwal N., Mojica-Henshaw M. P., Simmons E. D., Hussey D., Ou C. N., Prchal J. T Familial polycythemia caused by a novel mutation in the beta globin gene: essential role of p50 in evaluation of familial polycythemia. International Journal of Medical Sciences, 4, 4: Ali M. A. M., Pinkerton P., Chow S. W. S., Zaetz S. D., Wilson J., Webber B., Hu H., Kutlar F., Huisman T Some rare hemoglobin variants with altered oxygen affinities; Hb Linkoping [β36(c2)pro Thr], Hb Caribbean [β91(f7)leu Ar6], and Hb Sunnybrook [β 36(C2)Pro Arg]. Hemoglobin, 12, 2: Anfinsen C. B Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181, 4096: Bain B. J., Wild B., Stephens A., Phelan L Variant Haemoglobins: A Guide to Identification. 1st ed. Oxford, Wiley: 260 str. Baklouti F., Giraud Y., Francina A., Richard G., Favre-Gilly J., Delaunay J Hemoglobin Pierre-Bénite [β90(f6)glu Asp], a new high affinity variant found in a French family. Hemoglobin, 12, 2: Baklouti F., Giraud Y., Francina A., Richard G., Périer C., Geyssant A., Jaubert J., Brizard C., Delaunay J Hemoglobin Grange-Blanche [β27(b9) Ala Val], a new variant with normal expression and increased affinity for oxygen. FEBS Letters, 223, 1: Bardakjian J., Leclerc, L, Blouquit Y., Oules O., Rafaillat D., Arous N., Bohn B., Poyart C., Rosa J., Galacteros F A new case of hemoglobin Providence (α2β282 (EF6) Lys Asn or Asp) discovered in a French caucasian family. Structural and functional studies. Hemoglobin, 9, 4: Bare G. H., Alben J. O., Bromberg P. A., Jones R. T., Brinhall B., Padilla F Hemoglobin Little Rock (β143 (H21) His Gln). Effects of an amino acid substitution at the 2,3-diphosphoglycerate binding site. The Journal of Biological Chemistry, 249, 3: Baxter E., Scott L., Campbell P., East C., Fourouclas N., Swanton S., Vassiliou G., Bench A., Boyd E., Curtin N., Scott M., Erber W., Green A Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. The Lancet, 365, 9464:

61 48 Bento C Genetic basis of congenital erythrocytosis. International Journal of Laboratory Hematology, 40: Bento C., Almeida H., Maia T. M., Relvas L., Oliveira A. C., Rossi C., Girodon F., Fernandez-Lago C., Aguado-Diaz A., Fraga C., Costa R. M., Araujo A. L., Silva J., Vitoria H., Miguel N., Silveira M. P., Martin-Nunez G., Ribeiro M. L Molecular study of congenital erythrocytosis in 70 unrelated patients revealed a potential causal mutation in less than half of the cases (Where is/are the missing gene(s)?). European Journal of Haematology, 91, 4: Bento C., Cario H., Gardie B., Hermouet S., McMullin M. F., Members of the European Congenital Erythrocytosis Consortium (ECEC), Members of the COST Action MPN&MPNr-EuroNet (WP3) Congenital erythrocytosis and hereditarythrombocytosis. Clinical presentation, diagnosis, treatment and follow-up. A practical guide with clinical cases. COST (European Cooperation in Science and Technology): 207 str. Bento M. C., Ribeiro M. L., Cunha E., Rebelo U., Granjo E., Granado C., Tamagnini G Hb Vila Real [β36(c2)pro His]: a newly discovered high oxygen affinity variant. Hemoglobin, 24, 1: Berlin G., Wranne B., Jeppsson, J. 1987brenna. Hb Linköping (β 36 Pro Thr): A new high oxygen affinity hemoglobin variant found in two families of Finnish origin. European Journal of Haematology, 39, 5: Bissé E., Schlemer E., Lizama M., Huaman-Guillen P., Wieland H., Adam G., Molchanova T., Huisman, T Hb Strasbourg [β23(b5)val ASP]; a high oxygen affinity variant observed in a German family. Hemoglobin, 22, 1: BLAST Bethesda, NCBI-National Center for Biotechnology Information. (april, 2018) Blouquit Y., Braconnier F., Cohen-solal M., Földi J., Arous N., Ankri A., Binet J., Rosa J Hemoglobin Pitie-Salpetriere β34 (B16) Val Phe a new high oxygen affinity variant associated with familial erythrocytosis. Biochimica et Biophysica Acta, 624, 2: Blouquit Y., Braconnier F., Galacteros F., Arous N., Soria J., Zittoun R., Rosa J Hemoglobin Hotel-Dieu β599 ASP GLY (Gl). A new abnormal hemoglobin with high oxygen affinity. Hemoglobin, 5, 1: Boursier G., Trouillier S., Blaizot M. G., Igual H., Schved J. F., Martinez P. A A new high affinity variant Hb Aurillac (β141leu Val). Hemoglobin, 37, 6:

62 49 Boyer S., Charache S., Fairbanks V., Maldonado J., Noyes A., Gayle E Hemoglobin Malmö β-97 (FG-4) Histidine Glutamine: a cause of polycythemia. Journal of Clinical Investigation, 51, 3: Brennan S. O., Wells R. M., Smith H., Carrell R. W Hemoglobin Brisbane: β68 Leu His. A new high oxygen affinity variant. Hemoglobin, 5, 4: Brennan S. O. Williamson D., Whisson M. E. Carrell R. W Hemoglobin Palmerston North β23 (B5) Val Phe - A new variant identified in a patient with polycythemia. Hemoglobin, 6, 6: Broxmeyer, H Erythropoietin: multiple targets, actions, and modifying influences for biological and clinical consideration. The Journal of Experimental Medicine, 210, 2: Bunn, H Erythropoietin. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 3, 3: a011619, doi: /cshperspect.a011619: 20 str. Bursaux E., Blouquit Y., Poyart C., Rosa J Hemoglobin Ty Gard (α A 2β2124 (H2) Pro Gln). A stable high O2 affinity variant at the α1β1 contact. FEBS Letters, 88, 1: Camps C., Petousi N., Bento C., Cario H., Copley R. R., McMullin M. F., van Wijk R., WGS500 Consortium, Ratcliffe P. J., Robbins P. A., Taylor J. C Gene panel sequencing improves the diagnostic work-up of patients with idiopathic erythrocytosis and identifies new mutations. Haematologica, 101, 11: Cartegni L., Chew S. L., Krainer A. R Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nature Reviews. Genetics, 3, 4: Chamary J. V., Parmley J. L., Hurst L. D Hearing silence: non-neutral evolution synonymous sites in mammals. Nature Reviews. Genetics, 7, 2: at Chuang L. Y., Cheng Y. H., Yang C. H Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters, 35, 10: Day I. N., dbsnp in the detail and copy number complexities. Human Mutation, 31, 1: 2-4 den Dunnen J. T Describing sequence variants using hgvs nomenclature. Methods in Molecular Biology, 1492: Devaraj R., Wilson J. B., Huismann T. H. J Hb regina or α2β296(fg3)leu VAL: A high oxygen affinity variant discovered by cation-exchange HPLC. American Journal of Hematology, 19, 2:

63 50 Fokkema I. F., Taschner P. E., Schaafsma G. C., Celli J., Laros J. F., den Dunnen J. T LOVD v.2.0: the next generation in gene variant databases. Human Mutation, 32, 5: Forget B. G., Bunn H. F Classification of the disorders of hemoglobin. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 3, 2: a011684, doi: /cshperspect.a011684: 12 str. Frischknecht H., Ventruto M., Hess D., Hunziker P., Rosatelli M. C., Cao A., Breitenstein U., Fehr J., Tuchschmid P HB Hinwil or beta 38(C4)Thr Asn: a new beta chain variant detected in a Swiss family. Hemoglobin, 20, 1: Giardine B., Borg J., Viennas E., Pavlidis C., Moradkhani K., Joly P., Bartsakoulia M., Riemer C., Miller W., Tzimas G., Wajcman H., Hardison R. C., Patrinos G. P Updates of the HbVar database of human hemoglobin variants and thalassemia mutations. Nucleic Acids Research, 42: D1063-D1069 Glynn K. P., Penner J. A., Smith J. R., Rucknagel D. L Familial erythrocytosis. A description of three families, one with hemoglobin Ypsilanti. Annals of Internal Medicine, 69, 4: Grebien F., Kerenyi M., Kovacic B., Kolbe T., Becker V., Dolznig H., Pfeffer K., Klingmuller U., Muller M., Beug H., Mullner E., Moriggl R Stat5 activation enables erythropoiesis in the absence of EpoR and Jak2. Blood, 111, 9: Greene D. N., Vaughn C. P., Crews B. O., Agarwal A. M Advances in detection of hemoglobinopathies. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry, 439: Hamilton H. B., Iuchi I., Miyaji T., Shibata S Hemoglobin Hiroshima (β 143 histidine aspartic acid): a newly identified fast moving beta chain variant associated with increased oxygen affinity and compensatory erythremia. The Journal of Clinical Investigation, 48, 3: Harteveld C. L., Thelen M. H. M., Rutten J. J. A., Leuverman J., Akkermans N., van Delft P., Arkesteijn S., Giordano P. C Hb Geldrop St. Anna [β94(fg1)asp Tyr]: a new hemoglobin variant observed in a diabetic patient. Hemoglobin, 29, 2: Harteveld C., Groeneveld J., van Dam B., Van Delft P., Akkerman N., Arkesteijn S., Giordano P Hb Zoeterwoude [β23(b5)val Ala)]: a new β-globin variant found in association with erythrocytosis. Hemoglobin, 29, 1: Hebbel R., Eaton J., Kronenberg R., Zanjani E., Moore L., Berger E Human llamas: adaptation to altitude in subjects with high hemoglobin oxygen affinity. Journal of Clinical Investigation, 62, 3:

64 51 Honig G. R., Vida L. N., Latorraca R., Divgi A. B Hb south Milwaukee [β 105 (G7) Leu Phe]: A newly-identified hemoglobin variant with high oxygen affinity. American Journal of Hematology, 34, 3: Hoyer J. D., Weinhold J., Mailhot E., Alter D., McCormick D. J., Snow K., Kubik K. S., Holmes M. W., Fairbanks V. F Three new hemoglobin variants with abnormal oxygen affinity: Hb Saratoga Springs [α40(c5)lys Asn (α1)], Hb Santa Clara [β97(fg4)his Asn], and Hb Sparta [β103(g5)phe Val]. Hemoglobin, 27, 4: Hoyer J., Wendt P., Hogan W., Oliveira J Hb Nebraska [β86(f2)ala Ile (HBB:c.259G>A;260C>T)]: a unique high oxygen affinity hemoglobin variant with a double nucleotide substitution within the same codon. Hemoglobin, 35, 1: Ikkala E., Koskela J., Pikkarainen P., Rahiala E. L., El-Hazmi M. A. F, Nagai K., Lang A., Lehmann H Hb Helsinki: a variant with a high oxygen affinity and a substitution at a 2,3-DPG binding site (β82[ef6] Lys Met). Acta Haematologica, 56, 5: Indrak K., Wiedermann B. F., Batek F., Wilson J. B., Webber B. B., Kutlar A., Huisman T. H. J Hb Olomouc or α2β286(f2)ala Asp, a new high oxygen affinity variant. Hemoglobin, 11, 2: Ingram V A specific chemical difference between the globins of normal human and sickle-cell anaemia hæmoglobin. Nature, 178, 4537: Ivaldi G., David O., Paradossi V., Baffico M., Scimè Degani V., Leone D., Baldi M., Parodi M. I., Bernardi P., Ricco G Hb Bologna-St. Orsola [beta146(hc3)his Tyr]: a new high oxygen affinity variant with halved Bohr effect and highly reduced reactivity towards 2,3-diphosphoglycerate. Hemoglobin, 23, 4: Ivaldi G., Scimè-Degani V., David O., Baffico M., Baldi M., Leone D., Mazzocco M., Leone L., Piga A., Furlan E., Ricco G A new fast-moving variant causing erythrocytosis and mild hemolysis: Hb Gàmbara [β82(ef6)lys Glu]. Hemoglobin, 21, 4: Jang J. H., Seo J. Y., Jang J., Jung C. W., Lee K. O., Kim S. H., Kim H. J Hereditary gene mutations in Korean patients with isolated erythrocytosis. Annals of Hematology, 93, 6: Jensen M., Oski F. A., Nathan D. G., Bunn H. F Hemoglobin Syracuse (α2β2 143(H21)His Pro ), a new high-affinity variant detected by special electrophoretic methods. Observations on the auto-oxidation of normal and variant hemoglobins. The Journal of Clinical Investigation, 55, 3:

65 52 Jones R. T., Brimhall B., Gray G Hemoglobin British Columbia [α2β2101(g3)glu Lys] a new variant with high oxygen affinity. Hemoglobin, 1, 2: Jones R. T., Saiontz H. I., Head C., Shih D. T., Fairbanks V. F Hb Johnstown [β109 (G11) Val Leu]: A new electrophoretically silent variant that causes erythrocytosis. Hemoglobin, 14, 2: Junca J., Villegas A., Ropero P., González F. A., Motos A., Valverde F Characterization of a new hemoglobin variant: Hb Badalona (β31[b13]leu Val). Annals of Hematology, 81, 4: Kayton A., Timoney P., Vargo L., Perez J. A A review of oxygen physiology and appropriate management of oxygen levels in premature neonates. Advances in Neonatal Care, 18, 2: Keohane C., McMullin M. F., Harrison C The diagnosis and management of erythrocytosis. British Medical Journal, 347: f6667, doi: /bmj.f6667: 6 str. Kim J. H., Cheong H. S., Park B. L., Bae J. S., Jung S., Yoon S. H., Park J. S., Jang A. S., Park S. W., Uh S. T., Kim Y. H., Hwang H. K., Park C. S., Shin H. D A new association between polymorphisms of the SLC6A7 gene in the chromosome 5q31-32 region and asthma. Journal of Human Genetics, 55, 6: Kleckner H. B., Wilson J. B., Lindeman J. G., Stevens P. D., Niazi G., Hunter E., Chen C. J., Huisman T. H Hemoglobin Fort Gordon or α2β2145 Tyr Asp, a new highoxygen-affinity hemoglobin variant. Biochimica et Biophysica Acta, 400, 2: Kobayashi Y., Yang S., Nykamp K., Garcia J., Lincoln S. E., Topper S. E Pathogenic variant burden in the ExAC database: an empirical approach to evaluating population data for clinical variant interpretation. Genome Medicine, 9: 13, doi: /s : 14 str. Kolagatla S., Moka N., Bailey S. D Familial polycythemia likely due to novel hemoglobin variant hemoglobin Hyden. Blood, 132: 4925 Kopitar A., Solarovič A., Vermiglio L Genska osnova eritrocitoz v Sloveniji. Raziskovalno poročilo. Ljubljana, Medicinska fakulteta, Študij medicine: 106 str. Kristan A Analiza genetske variabilnosti s hipoksijo induciranih transkripcijskih dejavnikov alfa pri družinski eritrocitozi. Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije: 72 str. Lacombe C., Craescu C., Blouquit Y., Kister J., Poyart C., Delanoe-Garin J., Arous N., Bardakdjian J., Riou J., Rosa J., Schaeffer C., Galacteros F Structural and functional studies of hemoglobin Poissy α2β256 (D7) Gly Arg and 86 (F2) Ala Pro. European Journal of Biochemistry, 153, 3:

66 53 Landin B., Berglund S., Lindoff, B Hb Trollhättan [β20(b2)val Glu] - a new haemoglobin variant with increased oxygen affinity causing erythrocytosis. European Journal of Haematology, 53, 1: Leach M., Greaves M., Porter N., Williamson D., Brown K Haemoglobin Hallamshire (β146 HIS TYR): a new high oxygen affinity haemoglobin responsible for familial erythrocytosis. Clinical and Laboratory Haematology, 18, 4: Lee G., Arcasoy M The clinical and laboratory evaluation of the patient with erythrocytosis. European Journal of Internal Medicine, 26, 5: Lee J., Harrison C Hb Baden: a rare high affinity haemoglobin variant and its management. Journal of Clinical Pathology, 71, 1: Lokich J. J., Moloney W. C., Bunn H. F., Bruckheimer S. M., Ranney H. M Hemoglobin Brigham (α2 A β2 100 Pro Leu ). Hemoglobin variant associated with familial erythrocytosis. Journal of Clinical Investigation, 52, 8: Lorkin P. A., Stephens A. D., Beard M. E. J., Wrigley P. F. M., Adams L., Lehmann H Haemoglobin Rahere (β82 Lys-Thr): A new high affinity haemoglobin associated with decreased 2, 3-diphosphoglycerate binding and relative polycythaemia. British Medical Journal, 4, 5990: MacArthur D. G., Manolio T.A., Dimmock D. P., Rehm H. L., Shendure J., Abecasis G. R., Adams D. R., Altman R. B., Antonarakis S. E., Ashley E. A., Barret J. C., Biesecker L. G., Conrad D. F., Cooper G. M., Cox N. J., Daly M. J., Gerstein M. B., Goldstein D. B., Hirschhorn J. N., Leal S. M., Pennacchio L. A., Stamatoyannopoulos J. A., Sunyaev S. R., Valle D., Voight B. F., Winckler W., Gunter C Guidelines for investigating causality of sequence variants in human disease. Nature, 508, 7497: Mangin O High oxygen affinity hemoglobins. La Revue de Médecine Interne, 38, 2: Mant M. J., Salkie M. L., Cope N., Appling F., Bolch K., Jayalakshmi M., Gravely M., Wilson J. B., Huisman T. H Hb-Alberta or alpha2beta2 (101(G3) Glu replaced by Gly), a new high-oxygen-affinity hemoglobin variant causing erythrocytosis. Hemoglobin, 1, 2: Martin A., Thompson A Thalassemias. Pediatric Clinics of North America, 60, 6: McMullin M. F The classification and diagnosis of erythrocytosis. International Journal of Laboratory Hematology, 30:

67 54 McMullin M. F Diagnosis and management of congenital and idiopathic erythrocytosis. Therapeutic Advances in Hematology, 3, 6: McMullin M. F Congenital erythrocytosis. International Journal of Laboratory Hematology, 38, S1: McMullin M., Bareford D., Campbell P., Green A., Harrison C., Hunt B., Oscier D., Polkey M., Reilly J., Rosenthal E., Ryan K., Pearson T., Wilkins B Guidelines for the diagnosis, investigation and management of polycythaemia/erythrocytosis. British Journal of Haematology, 130, 2: Mencin I Analiza genetske variabilnosti tumor-supresorskega gena VHL pri družinski eritrocitozi. Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije: 43 str. Michalski P. J., Loew L. M Springsalad: A spatial, particle-based biochemical simulation platform with excluded volume. Biophysical Journal, 110, 3: Misgeld E., Gattermann N., Wehmeier A., Weiland C., Peters U., Kohne E Hemoglobinopathy York [beta146 (HC3) His Pro]: first report of a family history. Annals of Hematology, 80, 6: Miyazaki A., Nakanishi T., Shimizu A., Mizobuchi M., Yamada Y., Imai K Hb KOCHI [β141(h19)leu Val (g.1404 C G); (HC1-3)Lys-Tyr-His 0 (g.1413 A T)]: a new variant with increased oxygen affinity. Hemoglobin, 29, 1: 1-10 Mlakar U Smernice za odkrivanje in zdravljenje prave policitemije. Zdravniški vestnik, 77: Moo-Penn W. F., McGuffey J. E., Jue D. L., Johnson, M. H., Schum, T Hemoglobin New Mexico: β100 (G2) Pro Arg. A variant hemoglobin associated with erythrocytosis. Biochimica et Biophysica Acta, 832, 2: Moo-Penn W. F., Schneider R. G., Shih T., Jones R. T., Govindarajan S., Govindarajan P. G., Patchen L. C Hemoglobin Ohio (β142 Ala Asp): a new abnormal hemoglobin with high oxygen affinity and erythrocytosis. Blood, 56, 2: Mosca A., Paleari R., Rubino F. M., Zecca L., De Bellis G., Debernardi S., Baudo F., Cappellini D., Fiorelli G Hb Abruzzo [β 143(H21)His->Arg] identified by mass spectrometry and DNA analysis. Hemoglobin, 17, 3: Nackley A. G., Shabalina S. A., Tchivileva I. E., Satterfield K., Korchynskyi O., Makarov S. S., Maixner W., Diatchenko L Human catechol-omethyltransferase haplotypes modulate protein expression by altering mrna secondary structure. Science, 314, 5807:

68 55 Narendra U., Pauer G. J., Hagstrom S. A Genetic analysis of complement factor H related 5, CFHR5, in patients with age-related macular degeneration. Molecular Vision, 15: Nienhuis A. W., Nathan D. G Pathophysiology and clinical manifestations of the β-thalassemias. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine, 2, 12: a011726, doi: /cshperspect.a Novy M. J., Edwards M. J., Metcalfe J Hemoglobin Yakima: II. High blood oxygen affinity associated with compensatory erythrocytosis and normal hemodynamics. The Journal of Clinical Investigation, 46, 11: Nute P. E., Stamatoyannopoulos G., Hermodson M. A., Roth D Hemoglobinopathic erythrocytosis due to a new electrophoretically silent variant, hemoglobin San Diego (β109 (G11)Val Met). The Journal of Clinical Investigation, 53, 1: Ohba Y., Yamada H., Takamatsu S., Lmai K Hb Tsurumai [β82(ef6)lys Gln]: a new Hb variant with high oxygen affinity and erythrocytosis. Hemoglobin, 20, 2: Oliveira J. L., Swanson K., Wendt P., Caughey T. D., Hoyer J. D Hb Cambridge- MA [β144(hc1)-β146(hc3)lys-tyr-his 0 (HBB c.433 A>T)]: a new high oxygen affinity variant. Hemoglobin, 34, 6: Orkin, S Diversification of haematopoietic stem cells to specific lineages. Nature Reviews Genetics, 1, 1: Paniker N. V., Lin K. T., Krantz S. B., Flexner J. M., Wasserman B. K., Puett D Haemoglobin Vanderbilt (α2β289ser Arg): a new haemoglobin with high oxygen affinity and compensatory erythrocytosis. British Journal of Haematology, 39, 2: Patnaik M. M., Tefferi A The complete evaluation of erythrocytosis: congenital and acquired. Leukemia, 23, 5: Pearson T., Guthrie D., Simpson J., Chinn S., Barosi G., Ferrant A., Lewis S., Najean Y Interpretation of measured red cell mass and plasma volume in adults: Expert panel on radionuclides of the international council for standardization in haematology. British Journal of Haematology, 89, 4: Pearson T., Messinezy M Idiopathic erythrocytosis, diagnosis and clinical management. Pathologie Biologie, 49, 2: Pearson T., Wetherley-Mein G The course and complications of idiopathic erythrocytosis. Clinical and Laboratory Haematology, 1, 3:

69 56 Perutz M. F., Fermi G., Shih T. B Structure of deoxyhemoglobin Cowtown [His HC3(146) beta----leu]: origin of the alkaline Bohr effect and electrostatic interactions in hemoglobin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81, 15: Plotkin J. B., Kudla G Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics, 12, 1: Powars D., Chan L., Hiti A., Ramicone E., Johnson C Outcome of sickle cell anemia: a 4-decade observational study of 1056 patients. Medicine, 84, 6: Poyart C., Bursaux E., Teisseire B., Freminet A., Duvelleroy M., Rosa J Hemoglobin Creteil: oxygen transport by erythrocytes. In-vitro and in-vivo studies in a high oxygen-affinity mutant hemoglobin. Annals of Internal Medicine, 88, 6: Prijatelj T Analiza variabilnosti gena za eritropoetin pri družinski eritrocitozi. Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije: 53 str. Préhu C., Godart C., Vigneron C., Wajcman H Hb Nancy and Hb Osler: two distinct genetic variants with identical clinical and hemoglobin phenotype. Comptes Rendus de l'académie des Sciences - Series III, 321, 5: PubMed Bethesda, NCBI - national Library for Biotechnology Information. (oktober, 2018) Rahbar S., Louis J., Lee T., Asmerom Y Hemoglobin North Chicago (β36 [C2] Proline Serine): a new high affinity hemoglobin. Hemoglobin, 9, 6: Rahbar S., Winkler K., Louis J., Rea C., Blume K., Beutler E Hemoglobin Great Lakes (β 68 [E12] Leucine Histidine): a new high-affinity hemoglobin. Blood, 58, 4: Reed C. S., Hampson R., Gordon S., Jones R. T., Novy M. J., Brimhall B., Edwards M. J., Koler R. D Erythrocytosis secondary to increased oxygen affinity of a mutant hemoglobin, hemoglobin Kempsey. Blood, 31, 5: Rochette J., Barnetson R., Kiger L., Kister J., Littlewood T. J, Webster R., Poyart C., Thein S. L Association of a novel high oxygen affinity haemoglobin variant with δβ thalassaemia. British Journal of Haematology, 86, 1: Rochette J., Poyart C., Varet B., Wajcman H A new hemoglobin variant altering the α1β2contact: Hb Chemilly α2β299(g1)asp Val. FEBS Letters, 166, 1: 8-12 Rochette J., Varet B., Boissel J. P., Clough K., Labie D., Wajcman H., Bohn B., Magne P., Poyart C Structure and function of Hb Saint-Jacques (α2 β2 140 (H18) Ala Thr): a new high-oxygen-affinity variant with altered bisphosphoglycerate binding. Biochimica et Biophysica Acta, 785, 1-2: 14-21

70 57 Ropero P., Fernández-Lago C., Villegas A., Polo M., Mateo M., Mora A., González F Hb La Coruña [β38(c4)thr Ile]: a new hemoglobin variant leading to familial polycythemia. Hemoglobin, 30, 3: Rubin R., Ballas S., Atwater J., Burka E., Adachi K., Asakura T., Schwartz E Hemoglobin Potomac: clinical picture, biosynthesis and stability. Hemoglobin, 2, 5: Rumi E., Passamonti F., Pagano L., Ammirabile M., Arcaini L., Elena C., Flagiello A., Tedesco R., Vercellati C., Marcello A. P., Pietra D., Moratti R., Cazzola M., Lazzarino M Blood p50 evaluation enhances diagnostic definition of isolated erythrocytosis. Journal of Internal Medicine, 265, 2: Ryrie D. R., Plowman D., Lehmann H Haemoglobin Sherwood Forest β104 (G6) Arg Thr. FEBS Letters, 83, 2: Sauna Z. E., Kimchi-Sarfaty, C Understanding the contribution of synonymous mutations to human disease. Nature Reviews Genetics, 12, 10: Schmidt R. M., Jue D. L., Ali M. A., Lyonnais J., Moo-Penn W. F Hemoglobin Bethesda, beta 145 (HC2) Tyr replaced by His, in a Canadian family. American Journal of Clinical Pathology, 66, 2: Schneider R. G., Bremner J. E., Brimhall B., Jones R. T., Shih T. B Hemoglobin Cowtown (beta 146 HC3 His-Leu): a mutant with high oxygen affinity and erythrocytosis. American Journal of Clinical Pathology, 72, 6: Scott L. M., Tong W., Levine R. L., Scott M. A., Beer P. A., Stratton M. R., Futreal P. A., Erber W. N., McMullin M. F., Harrison C. N., Warren A. J., Gilliland D. G., Lodish H. F., Green A. R JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. New England Journal of Medicine, 356, 5: Shin S. Y., Bang S. M., Kim H. J A novel hemoglobin variant associated with congenital erythrocytosis: Hb Seoul [β86(f2)ala Thr] (HBB:c.259G>A). Annals of Clinical and Laboratory Science, 46, 3: Shin S. Y., Kim H. Y., Kim H. J., Kim H. G Hb Heathrow [β103(g5)phe Leu], a first report in an asian patient with erythrocytosis. Yonsei Medical Journal, 58, 3: So C. C., Ma S. K., Law K. M., Chan A. Y., Chan L. C., Wong K. F Hb Kodaira II: a high oxygen affinity variant with a novel mutation in the beta-globin gene and phenotypic identity to Hb Kodaira. Hemoglobin, 26, 2: Stamatoyannopoulos G., Yoshida A., Adamson J., Heinenberg S Hemoglobin Rainier (β 145 Tyrosine Histidine): alkali-resistant hemoglobin with increased oxygen affinity. Science, 159, 3816:

71 58 Stamatoyannopoulos G., Nute P. E., Adamson J. W., Bellingham A. J., Funk D Hemoglobin olympia (20 valine leads to methionine): an electrophoretically silent variant associated with high oxygen affinity and erythrocytosis. The Journal of Clinical Investigation, 52, 2: Taketa F., Huang Y. P., Libnoch J. A., Dessel B. H Hemoglobin wood β97(fg4) His Leu. Biochimica et Biophysica Acta, 400, 2: Tamagnini G., Ribeiro M., Valente V., Ramachandran M., Wilson J., Baysal E., Gu L., Huisman T Hb Coimbra or α2β299(gl)asp Glu, a newly discovered high oxygen affinity variant. Hemoglobin, 15, 6: The UniProt Consortium UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research, 46, 5: 2699 Thom C., Dickson C., Gell D., Weiss M Hemoglobin variants: biochemical properties and clinical correlates. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 3: a011858, doi: /cshperspect.a van Zwieten R., Veldthuis M., Delzenne B., Berghuis J., Groen J., Ait-Ichou F., Clifford E., Harteveld C. L., Stroobants A. K Hemoglobin analyses in the Netherlands reveal more than 80 different variants including six novel ones. Hemoglobin, 38, 1: 1-7 Vidal C., Cachia A., Xuereb-Anastasi A Effects of a synonymous variant in exon 9 of the CD44 gene on pre-mrna splicing in a family with osteoporosis. Bone, 45, 4: Vinciguerra M., Passarello C., Cassarà.2, Leto F., Cannata M., Crivello A., Di Salvo V., Maggio A., Giambona A Hb San Cataldo [β144(hc1)lys Thr; HBB: C.434A > C]: a new hemoglobin variant with increased affinity for oxygen. Hemoglobin, 40, 4: Vočanec D Analiza variabilnosti gena za eritropoetinski receptor pri družinski eritrocitozi. Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije: 35 str. Wajcman H., Bardakdjian-Michau J., Riou J., Préhu C., Kister J., Baudin-Creuza V., Promé D., Richelme-David S., Harousseau J. L., Galactéros F Two new hemoglobin variants with increased oxygen affinity: Hb Nantes [β34(b16)val Leu] and Hb Vexin [β116(g18)his Leu]. Hemoglobin, 27, 3: Wajcman H., Bascompte J., Labie D., Poyart C., Bohn B Structural and functional studies of hemoglobin Barcelona (α2β2 94 Asp (FG1) His). Consequences of altering an important intrachain salt bridge involved in the alkaline Bohr effect. Journal of Molecular Biology, 156, 1:

72 59 Wajcman H., Kister J., M'Rad A., Promé D., Milpied N., Rapp M. J., Harousseau J. L., Riou J., Bardakdjian J., Galacteros F Hb Saint Nazaire (beta 103[G5]Phe Ile): a new example of polycythemia due to a hemoglobin variant with increased oxygen affinity. American Journal of Hematology, 44, 1:16-21 Wajcman H., Kister J., Promé D., Galacteros F., Gilsanz F Hb Villaverde [β 89 (F5) Ser Thr]: the structural modification of an intrasubunit contact is responsible for a high oxygen affinity. Biochimica et Biophysica Acta, 1225, 1: Wajcman H., Riou. J., Promé D., Kister J. Galactéros F Hb Brie Comte Robert [β36(c2)pro Ala]: a new hemoglobin variant with high oxygen affinity and marked hydrophobic properties. Hemoglobin, 23, 3: Walker L., Eng B., McFarlane A., Waye, J. S High oxygen affinity hemoglobin variant in a Canadian family: Hb Bunbury [β94(fg1)asp Asn, GAC AAC]. Hemoglobin, 31, 1: Ware R., de Montalembert M., Tshilolo L., Abboud M Sickle cell disease. The Lancet, 390, 10091: Weatherall D. J., Clegg J. B., Callender S. T., Wells R. M. G., Gale R. E., Huehns E. R., Perutz M. F., Viggiano G., Ho C Haemoglobin Radcliffe (α2β2 99(G1)Ala ): a high oxygen-affinity variant causing familial polycythaemia. British Journal of Haematology, 35, 2: White J. M., Szur L., Gillies I. D., Lorkin P. A., Lehmann H Familial polycythaemia caused by a new haemoglobin variant: Hb Heathrow, beta 103 (G5) phenylalanine leads to leucine. British Medical Journal, 3, 5882: Winslow R. M., Swenberg M. L., Gross E., Chervenick P. A., Buchman R. R., Anderson W. F Hemoglobin McKees Rocks (α2β2 145Tyr Term ). A human "nonsense" mutation leading to a shortened β-chain. The Journal of Clinical Investigation, 57, 3: Zak S. J., Brimhall B., Jones R. T., Kaplan M. E Hemoglobin Andrew- Minneapolis α2 A β2 144 Lys Asn : a new high-oxygen-affinity mutant human hemoglobin. Blood, 44, 4: Zerbino D. R., Achuthan P., Akanni W., Amode M. R., Barrell D., Bhai J., Billis K., Cummins C., Gall A., Girón C. G., Gil L., Gordon L., Haggerty L., Haskell E., Hourlier T., Izuogu O. G., Janacek S. H., Juettemann T., To J. K., Laird M. R., Lavidas I., Liu Z., Loveland J. E., Maurel T., McLaren W., Moore B., Mudge J., Murphy D. N., Newman V., Nuhn M., Ogeh D., Ong C. K., Parker A., Patricio M., Riat H. S., Schuilenburg H., Sheppard D., Sparrow H., Taylor K., Thormann A., Vullo A., Walts B., Zadissa A., Frankish A., Hunt S. E., Kostadima M., Langridge N., Martin F. J., Muffato M., Perry E., Ruffier M., Staines D. M., Trevanion S. J., Aken B.

73 60 L., Cunningham F., Yates A., Flicek P Ensembl Nucleic Acids Research, 46(D1): D754-D761 Zhang Y., Wang L., Dey S., Alnaeeli M., Suresh S., Rogers H., Teng R., Noguchi C. T Erythropoietin action in stress response, tissue maintenance and metabolism. International Journal of Molecular Sciences, 15, 6: Zivot A., Lipton J. M., Narla A., Blanc L Erythropoiesis: insights into pathophysiology and treatments in Molecular Medicine, 24: 11, doi: /s z: 15 str.

74 ZAHVALA Najlepše se zahvaljujem mentorici prof. dr. Nataši Debeljak za vso pomoč in podporo tako pri praktičnem delu v laboratoriju kot tudi pri pisnem delu naloge. Somentorici prof. dr. Tanji Kunej se iskreno zahvaljujem za vse predloge in nasvete pri analizi rezultatov. Hvala za dostopnost in usmeritve pri pisanju naloge. Hvala sošolcem in prijateljem, ki so mi pomagali in me podpirali tekom nastajanja naloge. Ne nazadnje, hvala staršem, ki so mi stali ob strani in omogočili kvaliteten študij.

75 PRILOGA A Prispevek na 13. simpoziju CFGBC Taste of genomics (2018) 1. plakat

76 PRILOGA B Prispevek na 13. simpoziju CFGBC Taste of genomics (2018) 2. plakat

77 PRILOGA C Prispevek na 8. kongresu Slovenskega genetskega društva (2018)