Microsoft Word - Opticne lastnosti rozmarinolistne vrbe

Transkripcija

1 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA URŠA MALOVRH OPTIČNE LASTNOSTI LISTOV ROŽMARINOLISTNE VRBE DIPLOMSKO DELO LJUBLJANA, 2016

2 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijski program: biologija kemija URŠA MALOVRH Mentorica: prof. dr. Alenka Gaberščik OPTIČNE LASTNOSTI LISTOV ROŽMARINOLISTNE VRBE DIPLOMSKO DELO OPTICAL PROPERTIES OF Salix rosmarinifolia L. LEAVES GRADUATION THESIS Ljubljana, 2016

3 ZAHVALA Zahvala gre prof. dr. Alenki Gaberščik, ki me je s svojim strokovnim znanjem, razpoložljivostjo ter srčnim pristopom usmerjala pri nastajanju diplomskega dela. Zahvaljujem se tudi mladi raziskovalki, univ. dipl. biol. Katji Klančnik in Draganu Abramu, ki sta me vodila pri eksperimentalnem delu in statistični obdelavi podatkov. Največja zahvala gre staršema, ki sta mi omogočila študij, me vzpodbujala in podpirala v slabih in dobrih trenutkih šolanja ter sestrama, ki sta mi vedno stali ob strani. Hvala! Za pomoč pri lektoriranju ter prevajanju v angleški jezik bi se posebej zahvalila svojemu fantu. Tine, hvala za vzpodbudo, objeme in ker si preprosto verjel vame. Prav tako hvala tebi, teta Andreja, za vse pogovore, optimizem in vso pozitivno energijo, ki si jo delila z menoj. I

4 POVZETEK Preučevala sem vpliv anatomije in biokemijskih lastnosti listov na njihove optične lastnosti pri vrsti Salix rosmarinifolia L. Ugotovila sem, da se povečana reflektanca listov kaže na spodnji povrhnjici, kar je posledica različne zgradbe lista in vsebnosti pigmentov. Pri anatomiji lista sem ugotovila, da je delež stebričastega tkiva večji, gobastega pa manjši. Gobasto tkivo je pomembnejše pri prehajanju svetlobe skozi liste, saj omogoča boljši odboj svetlobe. Zaradi bližine gobastega tkiva spodnji povrhnjici v primerjavi s stebričastim tkivom je zato odboj svetlobe spodnje povrhnjice večji. Pokazalo se je, da na optične lastnosti vpliva tudi gostota trihomov. Na spodnji povrhnjici je zaradi večje gostote trihomov zmanjšan odboj svetlobe. Vloga trihomov pa ni le v odboju svetlobe, temveč so ključnega pomena tudi pri zadrževanju toplote (NIR infrardeče sevanje). Listnih rež zaradi prevelikih odstopanj meritev nisem vključila v raziskavo. Klorofil a kot ključen fotosintezni pigment velja za najpomembnejšega med klorofili, vloga preostalih pigmentov (klorofil b, karotenoidi, antociani in UV-absorbirajoče snovi) pa je predvsem zaščita listnega tkiva pred vplivi okolja. Ključne besede: optične lastnosti, Salix rosmarinifolia L., reflektanca, fotosintezni pigmenti, klorofil a, gobasto tkivo, stebričasto tkivo, trihomi II

5 ABSTRACT I was studying the influence of anatomy and biochemical properties of leaves on their optical properties in the Salix rosmarinifolia species. I found out that increased reflectance is apparent on the abaxial (lower) epidermis, which is caused by different leaf structure and pigment content. Concerning the leaf anatomy, I found out that palisade mesophyll share is larger than that of spongy mesophyll. However, spongy mesophyll enables better light reflection and is thus more important as far as light passing through leaves is concerned. Due to the spongy mesophyll's proximity to the abaxial epidermis as compared to the palisade mesophyll, abaxial epidermis reflects more light. It was indicated that trichome density also influences optical properties. Due to considerable trichome density, light reflection is reduced on the abaxial epidermis. However, trichomes' role is not only light reflection, as they are also of key importance for warmth preservation (NIR infrared radiation). I did not include stomata in my research, since measurement deviations were too high. As a key photosynthesis pigment, chlorophyll a is considered to be the most important of all chlorophyll structures, whereas other pigment roles (chlorophlyll b, carotenoids, anthocyanins and UV-absorbing substances) are primarily in protecting leaf tissue from environmental risks. Keywords: optical properties, Salix rosmarinifolia, reflectance, photosynthesis pigment, chlorophyll a, spongy mesophyll, palisade mesophyll, trichomes III

6 KAZALO VSEBINE POVZETEK... II ABSTRACT... III KAZALO VSEBINE... IV KAZALO SLIK... VI KAZALO GRAFOV... VII 1. UVOD CILJI HIPOTEZI PREGLED OBJAV ZNAČILNOSTI RODU SALIX (VRBE) Preučevana vrsta LISTI Zgradba lista List in svetloba Povezava zgradbe lista in fotosinteze Trihomi ASIMILACIJSKA BARVILA Klorofil Karotenoidi Antociani UV-absorbirajoče snovi Optične lastnosti listov rožmarinolistne vrbe Transmitanca ali presevnost Reflektanca ali odbojnost Absorbanca ali absorpcija Povezava transmitance, reflektance in absorbance MATERIALI IN METODE ANALIZE IN MERITVE NA LISTIH Optične lastnosti Anatomske in morfološke meritve Biokemijske analize IV

7 3.2 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV REZULTATI OPTIČNE LASTNOSTI Transmitanca Reflektanca ANATOMSKA IN MORFOLOŠKA ZGRADBA LISTOV BIOKEMIJSKE ANALIZE Klorofili in karotenoidi Antociani UV-absorbirajoče snovi SPECIFIČNA LISTNA POVRŠINA (SLA) IN VSEBNOST VODE POVEZAVA LISTNE ANATOMIJE Z BIOKEMIJSKO SESTAVO IN SPEKTRI RAZPRAVA TRANSMITANCA in REFLEKTANCA LISTNA ANATOMIJA IN MORFOLOGIJA BIOKEMIJSKE LASTNOSTI SKLEP VIRI IN LITERATURA V

8 KAZALO SLIK Slika 1: Cvetoč grm rožmarinolistne vrbe (levo) Slika 2: Listi rožmarinolistne vrbe (desno)... 3 Slika 3: Prečni prerez lista z označenimi deli... 3 Slika 4: Spekter elektromagnetnega sevanja... 4 Slika 5: Zgradba kloroplasta... 6 Slika 6: Molekula klorofila a... 7 Slika 7: Absorpcijski spekter klorofila prikazuje dva absorpcijska vrhova, kjer je absorpcija spojine najmočnejša (v rdečem pri 650 nm in modrovijoličnem pri 450 nm)... 8 Slika 8: Primeri karotenoidov... 9 Slika 9: Osnovna struktura antocianov in vezani radikali... 9 Slika 10: Primeri antocianov Slika 11: Barvni odtenki cvetov in plodov Slika 12: Ekstrakcija barvil Slika 13: Prečni prerez lista VI

9 KAZALO GRAFOV Graf 1: Presevni spekter zgornje (črna) in spodnje (modra) povrhnjice. 17 Graf 2: Odbojni spekter zgornje (rdeča) in spodnje (modra) povrhnjice. 17 Graf 3:Vsebnost klorofilov a in b in karotenoidov na površino (mg/cm 2 ). 19 Graf 4: Vsebnost klorofilov a in b in karotenoidov na suho maso (mg/g). 20 Graf 5: Relativna vsebnost antocianov na površino (cm 2 ). 20 Graf 6: Relativna vsebnost antocianov na suho maso (mg). 21 Graf 7: Vsebnost UV-absorbirajočih snovi; UV-A in UV-B na površino (relativna enota/cm 2 ). 21 Graf 8: Vsebnost UV-absorbirajočih snovi; UV-A in UV-B na suho maso (relativna enota/mg). 22 VII

10 KAZALO TABEL Tabela 1: Podane so povprečne vrednosti + SD, n = 10, pri biokemijski analizi lista na suho maso. 18 Tabela 2: Podane so povprečne vrednosti + SD, n = 10, pri biokemijski analizi lista na suho maso. Največji odklon pri vsebnosti pigmentov se kaže pri antocianih. 19 Tabela 3: Prikazana specifična listna površina (cm 2 /g) in masa (g) po 24-urnem sušenju pri 105 C. 22 Tabela 4: Parametri, ki statistično vplivajo na optične lastnosti (reflektanco spodnje povrhnjice) in so razloženi z deležem variance. Klorofil ima največji delež vpliva (42 %) na optične lastnosti, najmanjši delež pa gobasto tkivo (15 %). 23 VIII

11 1. UVOD Rast in razvoj listov sta pogojena s sončnim sevanjem. Listi so primarno fotosintezni organi. V času razvoja listov svetloba zelo pripomore k izražanju anatomskih in biokemijskih karakteristik, ki so pomembne za fiziološke funkcije listov. Možnost prodiranja in prestrezanja svetlobe v nižje predele krošenj je odvisna predvsem od razporeditve listov v zgornjih delih krošenj in debel/stebel rastlin. Listi so lahko orientirani horizontalno ali vertikalno (Ustin, Jacquemoud, & Govaerts, 2001). Pri prehajanju svetlobe skozi liste govorimo o UV sevanju, ki je škodljivo. Pomembno vlogo v stratosferi, ki sega km nad površino Zemlje, igra ozonska plast, ki zadrži večji del UV sevanja. Nastane s preoblikovanjem molekule kisika (O 2 ), nastalega pri procesu fotosinteze, v molekulo ozona (O 3 ). Plast tako v stratosferi zadrži najbolj energetsko in škodljivo UV-C in tudi UV-B sevanje (Yoshimura, Zhu, Wu, & Ma, 2010). 1.1 CILJI Cilja moje diplomske naloge sta raziskati optične in biokemijske lastnosti listov rožmarinolistne vrbe (Salix rosmarinifolia L.) in ugotoviti, kakšen je vpliv biokemijskih lastnosti (vsebnost klorofilov, karotenoidov, antocianov in UV-absorbirajočih snovi) na odbojnost in presevnost lista. 1.2 HIPOTEZI 1. Predvidevamo, da vsebnost barvil v listih vpliva na optične lastnosti listov rožmarinolistne vrbe. 2. Predvidevamo, da na optične lastnosti (odbojnost in presevnost) vpliva tudi zgradba listov (razmerje med gobastim in stebričastim tkivom). 1

12 2. PREGLED OBJAV 2.1. ZNAČILNOSTI RODU SALIX (VRBE) Vrbe uvrščamo med najstarejše cvetnice na Zemlji in naj bi se razširile pred več kot 130 milijoni let. Veljajo tudi za pionirske vrste, saj so po času poledenitev ponovno kolonizirale površje, ki je zaradi poledenitve ostalo neporaslo. Vrba (Salix spp.) je rastlina, ki spada v družino vrbovk (Salicaceae). Rastišča vrb so predvsem gozdni robovi, močvirnati travniki in obrežja voda. Danes je znanih 100 vrst vrb, med njimi so najbolj znane bela vrba (Salix alba), alpska vrba (Salix alpina) in vrba žalujka (Salix babylonica). Med najbolj znanimi je tudi pionirska vrsta, imenovana iva (Salix caprea). Značilnosti vrb so hitro kaljivo in lahko seme, kar je prednost za hiter raznos semen na večje razdalje, hitra rast v zgodnji dobi in dobra prilagodljivost na ekstremne razmere in vrste tal (Kotar & Brus, 1999). Iz latinskega imena vrbe (Salix) izvira poimenovanje salicilne kisline, ki deluje protivnetno in nastane v prebavilih s pretvorbo salicina in njegovih derivatov, ki jih vsebujejo vse vrste vrb. V času Egipčanov naj bi salicitatne pripravke pridobivali iz mirte, Hipokrat pa je v 4. stoletju pred našim štetjem za zniževanje temperature ter za lajšanje porodnih bolečin uporabljal lubje vrbe. Tudi danes je lubje uporabno za pripravo čajev za lajšanje omenjenih težave in simptomov gripe (Farmedica) Preučevana vrsta Salix rosmarinifolia L. (rožmarinolistna vrba) je evrazijska vrsta vrbe, razširjena v Srednji in Vzhodni Evropi, natančneje od kolinskega do montanskega pasu. V Sloveniji je razširjena od nižine do montanskega pasu, kjer jo najdemo na vlažnih travnikih in mokriščih. Pojavlja se tudi na vlažnih travnikih ob potokih Kozmanjka in Raščica ter okoli vasi Logarji in na območju Cerkniškega jezera. Cveti od aprila do maja. Na mokrotnih travnikih se pojavlja skupaj z modro stožko (Dolinar & Vreš, 2012). 2

13 Slika 1: Cvetoč grm rožmarinolistne vrbe (levo) ( ), Slika 2: Listi rožmarinolistne vrbe (desno) ( ) 2.2. LISTI Zgradba lista Listi so kot kompleksne strukture zelo različni, kar je posledica različnih okoljskih vplivov. Med te vplive prištevamo tudi svetlobo. Usodo svetlobe v listih ugotavljamo z merjenjem reflektance, absorbance in transmitance listov (Klančnik in sodelavci, 2014a). Slika 3: Prečni prerez lista z označenimi deli ( ) Prva plast posameznega lista je zgornja povrhnjica, ki varuje sredico lista pred zunanjimi vplivi. Naslednja plast je stebričasto tkivo, v katerem so podolgovate zeleno obarvane 3

14 celice, saj se tu nahaja klorofil, ki je pomemben za proces fotosinteze. Sledi še gobasto tkivo, kjer je več medceličnih prostorov s plini. Ti se izmenjujejo preko spodnje povrhnjice, skozi listne reže. V rastlinskih listih se nahajajo tudi nekateri biominerali (Ca, Mg, Si), katerih funkcija je odvisna od njihove strukture, koncentracije, lokacije in kemičnih lastnosti. Zmožnost biomineralov je, da lahko vplivajo na vodno in energijsko bilanco, med drugim pa tudi povečujejo odpornost listov pred patogeni in herbivori (Klančnik in sodelavci, 2014). Za zaščito pred UV sevanjem imajo listi poleg voskov in dlakastih struktur lahko tudi debelo in voskasto kutikulo, ki poskrbi za regulacijo vode in posledično zmanjša evaporacijo iz tkiva (Vignolini, Moyroud, Glover, & Steiner, 2013) List in svetloba Svetlobo delimo na več delov: UV svetloba, vidna svetloba ( nm), za katero je značilna visoka absorpcija fotosinteznih pigmentov, ki se nahajajo v zelenih listih rastlin in infrardeča svetloba ( nm), kjer poteka absorpcija na suhih snoveh. Če pride do sipanja svetlobe, je to pogojeno z vsebnostjo zraka v listih, ki določa nivo transmitance in reflektance; tako dobimo srednje infrardeče območje ( nm). Gre za območje značilno močne absorpcije, primarno zaradi vode v svežih listih in sekundarno zaradi uvelih listov (Jacquemoud & Ustin, 2001). Slika 4: Spekter elektromagnetnega sevanja ( &tbm=isch&sa=x&ved=0ahukewi6isqb58dmahue_ywkhdikbeyq_auibigb#imgdii=qx7r mggexqq9am%3a%3bqx7rmggexqq9am%3a%3bvartxc9t3jmvom%3a&imgrc=qx7rm ggexqq9am%3a, ) 4

15 Absorpcija je odvisna od kota vpadnih žarkov. Pri popoldanskem in dopoldanskem soncu absorpcija sončnih žarkov v pokončno usmerjenih listih naraste, med drugim pa se poveča tudi delež difuzne svetlobe v horizontalno usmerjene liste. Na nivoju posameznega lista pa je učinkovitost fotosinteze pri difuzni svetlobi v primerjavi z direktno svetlobo manjša (Gorton, Brodersen, Wiliams, & Vogelmann, 2010). Študije so pokazale, da sta orientacija in struktura lista povezani s tem, koliko svetlobe bo prestrežene in kakšna bo vezava ogljika v procesu fotosinteze (Ustin, Jacquemoud, & Govaerts, 2001). Orientacija listov pri rastlinah je lahko horizontalna ali vertikalna, pri razvoju pa se glede na funkcijo listov spreminjajo tudi biokemijske in anatomske lastnosti (Gorton, Brodersen, Wiliams, & Vogelmann, 2010) Povezava zgradbe lista in fotosinteze Primarna vloga listov je proces fotosinteze, pri katerem rastlina prestreza sočno svetlobo, ki jo mora za svoje potrebe najprej pretvoriti v kemično energijo (Vignolini, Moyroud, Glover, & Steiner, 2013). Svetloba, ki se odbija od listov, določa njihovo barvo. Fotosinteza je odvisna od absorpcije svetlobne energije v listih z barvili. Med najpomembnejšimi barvili je klorofil, vendar se v listu nahajajo še druga barvila (antociani, karotenoidi, UV-absorbirajoče snovi) (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015). Prisotnost nefotosinteznih barvil, med katera prištevamo antociane in flavonoide, znotraj celic lahko povzroči redukcijo določene mere svetlobe za fotosintezo (Olascoaga, in drugi, 2014). Rastlinsko tkivo je zgrajeno iz več celic, ki imajo svoje morfološke in biokemijske značilnosti, oblika epidermalnih celic pa je povezana s svetlobo, saj od površine lista razpršena svetloba določa izgled tkiva (Vignolini, Moyroud, Glover, & Steiner, 2013). Sevanje, ki ga list sprejme, je odvisno od zgradbe listne površine in snovi, ki se nahajajo na površini. Od prve plasti, ki prekriva površino lista je odvisno, kako močna bo penetracija fotonov skozi tkivo (Klančnik, Gradinjan (Klančnik, Gradinjan, & Gaberščik, 2014b). Dokazano je bilo, da med zgornjo in spodnjo stranjo lista prihaja do razlik; stebričaste celice naj bi bile namreč pri kolinearnem usmerjanju svetlobe do kloroplastov v listu učinkovitejše od gobastih (Ustin, Jacquemoud, & Govaerts, 2001). 5

16 Lokacija fotosinteznih pigmentov znotraj celic je odvisna od zgradbe organizmov (prokarionti, evkarionti). Pri evkariontih fotosinteza poteka znotraj posebno specializiranih znotrajceličnih organelov, imenovanih kloroplasti. Ti so zgrajeni iz notranjega prostora ali strome in fotosinteznih membranskih struktur tilakoid, ki se združujejo v sklade, imenovane grane. V notranjosti tilakoid so vezani pigmenti. (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015) Slika 5: Zgradba kloroplasta ( ) Trihomi Z uravnavanjem reflektance lahko rastlina prilagodi absorpcijo svetlobe. Pri tem sodelujejo solne usedline in trihomi. Trihomi so nitaste epikutikularne strukture na listni površini. Skupaj z voski sodelujejo pri povečanem deležu odbite svetlobe oz. reflektivne radiacije. (Olascoaga, in drugi, 2014) 2.3. ASIMILACIJSKA BARVILA Klorofil Barvilo klorofil je ključno za proces fotosinteze in se nahaja v rastlini kot klorofil a, b in c. Spada med tetrapirole, ki se nahajajo v citokromih. Molekula klorofila vsebuje magnezijev atom, ki kot kovinski atom predstavlja center tetrapirolnega obroča molekule (Slika 6). Na osnovni tetrapirolni obroč so običajno vezane še substituente, kot so hidrofobne alkoholne 6

17 molekule. Zaradi njih se molekula klorofila lahko veže z lipidi in hidrofobnimi proteini fotosintetske membrane (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015). Slika 6: Molekula klorofila a (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015) Klorofil je barvilo zelene barve, ki velja za najbolj razširjeno barvilo na Zemlji. Je ključnega pomena za proces fotosinteze, kjer je njegova naloga absorpcija sončne svetlobe. Zaradi visoke absorpcije svetlobe je klorofil hkrati tudi nevaren in označen kot celični fototoksin. Nevarnost klorofila je največja v času močnih svetlobnih razmer. Absorbirana energija se tedaj prenese na molekulo kisika, ki nastane v procesu fotosinteze, ta pa se pretvori v kisikove reaktivne oblike (angl. ROS). Slednje na celicah povzročijo veliko škodo in vodijo v celično smrt (Hörtensteiner & Kräutler, 2011). 7

18 Slika 7: Absorpcijski spekter klorofila prikazuje dva absorpcijska vrhova, kjer je absorpcija spojine najmočnejša (v rdečem pri 650 nm in modrovijoličnem pri 450 nm) (Vrtačnik & Boh). Večina rastlin vsebuje klorofila a in b. Klorofil a se kot zeleno barvilo nahaja v višjih rastlinah, v večini alg in tudi v cianobakterijah. Njegova zelena barva je posledica boljše absorpcije rdeče in modre svetlobe, pri tem pa odbija določeno valovno dolžino, ki jo ljudje zaznamo kot zeleno barvo. Absorpcijski spekter klorofila a nam lahko pokaže, da je absorpcija rdeče svetlobe (maksimalna valovna dolžina pri 680 nm) in modre svetlobe (maksimum valovne dolžine 430 nm) največja. Rastline imajo več različnih klorofilov zato, da lahko porabijo energijo iz več različnih valovnih dolžin. Vsa absorbirana svetloba (rdeča in modra) se porablja kot energija, ki jo organizem potrebuje za preživetje (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015) Karotenoidi Karotenoidi so v lipidih topni pigmenti rumene, oranžne in rdeče barve, ki se nahajajo v kloroplastih in kromoplastih, natančneje v njihovih membranah. Pigmente vsebujejo tudi določeni cvetovi rastlin in plodovi. Prištevamo jih med tetraterpene, derivate izoprena, ki se sintetizirajo v rastlinah ter tudi v nekaterih nefotosinteznih bakterijah, kvasovkah in plesnih. Karotenoide sestavlja osnovna veriga iz ogljikovih atomov, med katerimi so prisotne enojne in dvojne vezi, na atome ogljika pa so ciklično in aciklično vezane substituente (Stahl & Sies, 2005). Njihova funkcija je zaščita rastlin pred fotooksidativnim stresom, značilnost pa absorpcija svetlobe v modrem delu spektra (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015). 8

19 Slika 8: Primeri karotenoidov ( ) Antociani Antociani so v vodi topna barvila, ki so škrlatno rdeče, rožnate, vijolične in modre barve in se nahajajo v sadju in cvetovih rastlin. Uvrščamo jih med glikozide antocianidinov, ki imajo prisotno alkoholno skupino, na katero je vezan sladkor. Slika 9: Osnovna struktura antocianov in vezani radikali ( ) 9

20 Med najpogostejšimi v naravi so pelargonidin, cianidin, delfinidin, petunidin, peonidin in malvidin (Gril, 2015). Nahajajo se tudi v rdeče obarvanih listih v jesenskem času. Na obarvanje antocianov med drugim vpliva razporeditev in število hidroksilnih (-OH) skupin v molekuli in razporeditev dvojnih in trojnih vezi v molekuli (Vrtačnik & Boh). Slika 10: Primeri antocianov (file:///d:/pedago%c5%a1ka%20fakulteta/diploma/slikovno%20gradivo/batic_p_b_ag-uni- Botanika-Vakuola_in_vodni_rezim pdf, ) Zaradi široke palete barv so antociani med ljudmi vzbudili veliko zanimanje. Kot neškodljiva barvila so zelo pomembni v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji, vendar je zaradi relativne nestabilnosti in majhnega odstotka pridobljenih barvil pri ekstrakciji njihova uporaba zelo omejena (Castañeda-Ovando, Pacheco-Hernández, Páez- Hernández, Rodríguez, & Galán-Vidal, 2009). Različne barve, ki jih določajo pigmenti, so vidne le živalim, ki imajo specifične fotoreceptorje. Nekatere živali imajo tudi omejeno zaznavanje konca rdečega spektra. Med take prištevamo čebele, saj ne vidijo rdeče barve. Imajo razvite receptorje za zaznavanje zelene barve, rdečo pa absorbirajo. Zato modri cvetovi čebele privabljajo bolj, kot rdeči (Glover & Martin, 2012). 10

21 Slika 11: Barvni odtenki cvetov in plodov ( ) UV-absorbirajoče snovi Med UV-absorbirajoče snovi prištevamo flavonoide in ostale fenilpropanoidne derivate, ki se akumulirajo v mezofilu listov kot antioksidanti za preprečevanje poškodb zaradi oksidativnega stresa in visokega fotosintetično aktivnega sevanja (angl. PAR) (Barnes, Flint, Ryel, Tobler, & Barkley, 2015). Regija UV sevanja je razdeljena na segmente; UV- A: nm, UV-B: nm in UV-C: nm. Energija oz. moč sevanja je pogojena z valovno dolžino, zato imajo kratkovalovne dolžine večjo energijo, kot dolgovalovne (Yoshimura, Zhu, Wu, & Ma, 2010) Optične lastnosti listov rožmarinolistne vrbe V sredini zadnjega stoletja je zanimanje za fotosintezo in optične lastnosti listov zelo naraslo. Raziskave so bile usmerjene v optične lastnosti (hemisferična odbojnost in prepustnost svetlobe) v povezavi z biokemijskimi (klorofil, voda, suha snov) in anatomskimi značilnostmi. Kot primere sprememb optičnih lastnosti bi lahko navedli stres zaradi okoljskih sprememb (npr. vpliv insektov, zmanjšana koncentracija dušika), vrsto rastline ter razvojno ali mikroklimatsko razporeditev listov. Slednje privedejo do znižanja vsebnosti klorofila v listih in posledično vplivajo tudi na optične lastnosti; zvišujeta se odbojnost in presevnost. 11

22 Transmitanca ali presevnost Presevnost nam pove, kolikšen delež svetlobe, ki pade na določeno površino objekta, prehaja skozenj (Wolley, 1971). Transmitanco ali presevnost merimo v območju valovnih dolžin nm (Yoshimura, Zhu, Wu, & Ma, 2010) Reflektanca ali odbojnost Z njo določamo delež odbite svetlobe, ki pade na površino objekta (Wolley, 1971). Merimo jo v enakem območju, kot transmitanco ( nm). Jakost reflektance lahko določimo tudi z opazovanjem s prostim očesom. Pri tem smo osredotočeni predvsem na barvo listov. Svetlozelena barva pove, da ima list visoko reflektanco ali odbojnost, temnozelena pa, da je reflektanca ali odbojnost majhna, vendar se jakost reflektance od vrste do vrste razlikuje (Yoshimura, Zhu, Wu, & Ma, 2010) Absorbanca ali absorpcija Za razumevanje določenih procesov med drugim tudi fotosinteze in njenih odzivov na svetlobo ima velik pomen absorpcija. Na podlagi absorpcije lahko namreč izračunamo energetsko bilanco listov in primarno produkcijo rastlin (Gorton, Brodersen, Wiliams, & Vogelmann, 2010). Pri absorpciji večjega dela UV sevanja v epidermis rastlin to sevanje prehaja vse do mezofila. Do absorpcije prihaja zaradi pigmentov; klorofila a in b (Yoshimura, Zhu, Wu, & Ma, 2010) Povezava transmitance, reflektance in absorbance Obstoječa povezava med transmitanco (ρ), reflektanco (τ) in absorbanco (α) je zapisana v naslednji formuli (Yoshimura, Zhu, Wu, & Ma, 2010): ρ(λ) + τ(λ) + α(λ) = 1 12

23 3. MATERIALI IN METODE 3.1 ANALIZE IN MERITVE NA LISTIH Optične lastnosti Merjenje spektra odbojnosti (reflektance) in presevnosti (transmitance) sem opravila na 10 vitalnih listih različnih rastlin. Pri meritvi sem uporabila spektrofotometer (Jaz Modular Optical Sensing Suite; Ocean Optics, Inc., Dunedin, USA), ki sem ga z optičnim kablom (QP600-1-SR-BX; Ocean Optics, Inc.) povezala na računalnik, s katerega sem v programu SpectraSuite odčitavala meritve. Na spektrofotometer sem povezala še integracijsko sfero (ISP-30-6-R; Ocean Optics, Inc.), pod katero sem pri merjenju položila vzorec. Pred meritvami je bilo potrebno spektrofotometer še umeriti, kar sem naredila z belo referenčno ploščico. Kalibracija inštrumenta je bila na 100 % odbojnosti, nato pa sem meritev opravila še v temi. Meritve transmitance in reflektance sem opravila na istih delih listov in se pri tem izognila listnim žilam Anatomske in morfološke meritve Zgradba lista Na območju, kjer sem predhodno merila optične lastnosti (reflektanco, transmitanco in absorbanco), sem naredila preparate prečnih prerezov 10 svežih listov. Preparate sem izdelala tako, da sem vzela svež list, ga vstavila v stiroporni blok in z britvico odrezala tanke rezine tkiva, ki sem jih nato položila na objektno stekelce, nanj kanila kapljico glicerola in vzorec prekrila s krovnim stekelcem. Posamezna listna tkiva sem opazovala pod mikroskopom CX41 pri 100-kratni povečavi in sliko preko digitalne kamere XC30 prenesla na računalnik ter jo obdelala s programom CellSens (Olympus, Hamburg, Germany). Na vsakem opazovanem preparatu sem na petih mestih izmerila naslednje parametre: - debelino lista - debelino kutikule - debelino spodnje in zgornje povrhnjice - debelino stebričastega in gobastega tkiva 13

24 Število in velikost trihomov Spodnjo in zgornjo povrhnjico lista sem premazala s tanko plastjo prozornega laka in počakala, da se posuši. Nato sem z lističi lepilnega traka prelepila premazane liste. Previdno sem odstranila lepilni trak in ga prilepila na objektno stekelce ter tako izdelan preparat opazovala pod mikroskopom CX41 na 100-kratni povečavi, sliko preko digitalne kamere XC30 prenesla na računalnik in jo obdelala s programom CellSens (Olympus, Hamburg, Germany). Ker so bili pri preučevani vrsti trihomi vidni, sem na petih vidnih poljih analizirala tudi njihovo dolžino (µm) in gostoto na cm Specifična listna površina (SLA) in vsebnost vode Za določanje tega parametra sem potrebovala 10 sveže nabranih listov, iz katerih sem izrezala krožce. Izmerila sem njihovo površino, jih stehtala in dala sušit. Po 24 urah sušenja pri temperaturi 105 C sem vzorce ponovno stehtala in jim s tem določila suho maso ter izračunala specifično listno površino (SLA), ki je količnik med površino vzorca in njegovo suho maso [cm 2 mg -1 ] Biokemijske analize Klorofili in karotenoidi Vsebnost obeh tipov barvil sem določala po metodi Lichtenthaler in Buschman (2001a, 2001b). Vzorce listov 10 rastlin sem strla v terilnici, jih ekstrahirala v 5 ml acetona (100 % (v/v)) in ekstrakte prelila v predhodno oštevilčene cetrifugirke za klorofil ter jih pri 4 C štiri minute centrifugirala na 4000 rpm. Na koncu sem odčitala prostornine ekstraktov in ekstinkcije izmerila z VIS spektrofotometrom pri valovnih dolžinah 470, 645 in 662 nm. Vsebnost klorofilov (Kl a in Kl b) in karotenoidov (Kar) sem izrazila na površino vzorca in na suho maso (Formula 1). Formula 1 Kl a [mg g -1 ss] = c a * V/ss = (11.24 E E 645 ) * V/ss Kl b [mg g -1 ss] = c b * V/ss = (20.24 E E 662 ) * V/ss Kar [mg g -1 ss] = (1000 E c b ) * V/ss/214 14

25 Opomba: Za izračun vsebnosti klorofilov in karotenoidov na površino vzorca, suho maso (ss) v formuli zamenjamo s površino (P [mg cm -2 ]). c a,b koncentracija klorofila a oz. klorofila b V volumen ekstrakta [ml] ss suha masa vzorca [g] E ekstinkcija pri izbrani valovni dolžini Antociani Za določanje vsebnosti antocianov uporabljamo metodo Drumm and Mohr (1978). V terilnici sem strla vzorce 10 rastlin in jih ekstrahirala v 5 ml ekstrakcijskega medija (metanol : HCl (37 %) = 99 : 1 (v/v)), ekstrakte prelila v centrifugirke in centrifugirala (4000 rpm, 4 C, 4 minute) ter nato odčitala prostornine ekstraktov. Vse vzorce sem za 24 ur postavila v temo na 3 5 C. Po določenem času sem z VIS spektrofotometrom izmerila ekstinkcije pri 510 nm in vsebnost antocianov (Ant) izrazila v relativnih enotah na površino in na suho maso (Formula 2). Formula 2 Ant (relativna enota) = E 530 * V* ss; E 530 * V * P -1 E530 ekstinkcija pri valovni dolžini 530 nm V prostornina ekstrakta [ml] ss suha masa [g] oz. P površina vzorca [cm -2 ] UV-absorbirajoče snovi Določanje vsebnosti UV-B in UV-A absorbirajoče snovi je potekalo z metodo po Caldwellu (1968). Sveže vzorce sem strla v terilnici in jim dodala 5 ml ekstrakcijskega medija (metanol : destilirana voda : HCl (37 %) = 79 : 20 : 1 (v/v)). Po ekstrakciji sem vzorce 20 minut inkubirala v temi. Vzorce sem nato centrifugirala (4000 rpm, 10 C, 10 minut) in odčitala prostornine ekstraktov. S spektofotometerom (UV/VIS) sem določila ekstinkcije na intervalu nm ter pri tem uporabila»kvarčne«kivete, ki prepuščajo UV. 15

26 Slika 12: Ekstrakcija barvil (vir: lastna fotografija) Vsebnost UV absorbirajočih snovi sem izračunala kot integral ekstinkcijskih vrednosti v intervalu nm (UV-B) in nm (UV-A) in jih izrazila v relativnih enotah na suho maso in površino vzorca (Formula 3). Formula 3 UV abs (relativna enota) = I * V -1 * ss -1 ; I * V -1 * P -1 I integral ekstinkcijskih vrednosti v intervalu nm (UV-B abs) ter nm (UV-A abs) V prostornina ekstrakta [ml] ss suha masa [g] oz. P površina vzorca [cm -2 ] * Integral ekstinkcijskih vrednosti je seštevek vseh dobljenih vrednosti v določenem intervalu. 3.2 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV Pridobljene podatke analiz sem v programu Microsoft Excel 2007 uredila v tabele in preračunala povprečne vrednosti za posamezne parametre. Pri oblikovanju grafov sem si pomagala s programom Past, ki je namenjen znanstveni obdelavi podatkov. Pri biokemijskih analizah sem uporabila Studentov dvosmerni t-test, ki je namenjen za iskanju statistično značilnih razlik med vzorci. T-test sem opravila v Microsoft Excelu 2007 in razlike izrazila pri p < Redundančno analizo sem izvedla v programu CANOCO for Windows. 16

27 4. REZULTATI 4.1 OPTIČNE LASTNOSTI Transmitanca Graf 1: Presevni spekter zgornje (črna) in spodnje (modra) povrhnjice. Prikazane so povprečne vrednosti (n = 10). Razlike v presevnosti med povrhnjicama se kažejo pri valovnih dolžinah nad 700 nm Reflektanca Graf 2: Odbojni spekter zgornje (rdeča) in spodnje (modra) povrhnjice. Prikazane so povprečne vrednosti (n = 10). Razlike v odbojnosti med povrhnjicama se kažejo pri valovnih dolžinah nad 700 nm. 17

28 4.2. ANATOMSKA IN MORFOLOŠKA ZGRADBA LISTOV Slika 13: Prečni prerez lista: (1) debelina zgornje kutikule, (2) debelina zgornje povrhnjice, (3) debelina stebričastega tkiva, (4) debelina gobastega tkiva, (5) debelina spodnje povrhnjice, (6) debelina spodnje kutikule. DEL LISTA Povprečje (µm) + standardna deviacija Spodnja kutikula (µm) 4,79 + 0,85 Spodnja povrhnjica (µm) 15,95 + 3,73 Gobasto tkivo (µm) 53, ,38 Stebričasto tkivo (µm) 77,53 + 8,06 Zgornja povrhnjica (µm) 8,63 + 2,13 Zgornja kutikula (µm) 9,06 + 2,82 Debelina lista (µm) 171, ,92 Tabela 1: Podane so povprečne vrednosti + SD, n = 10, pri biokemijski analizi lista na suho maso 18

29 4.3 BIOKEMIJSKE ANALIZE Biokemijske analize Povprečje + standardna deviacija Klorofil a (mg/g ss) 2,91 + 0,68 Klorofil b (mg/g ss) 1,31 + 0,,001 Karotenoidi (mg/g ss) 0,99 + 0,23 Antociani (relativna enota/mg) 66, ,54 UV-A (relativna enota/ ss (mg)) 2,55 + 0,63 UV-B (relativna enota/ ss (mg)) 3,53 + 0,86 Tabela 2: Podane so povprečne vrednosti + SD, n=10, pri biokemijski analizi lista na suho maso. Največji odklon pri vsebnosti pigmentov se kaže pri antocianih Klorofili in karotenoidi Graf 3:Vsebnost klorofilov a in b in karotenoidov na površino (mg/cm 2 ). Prikazani podatki v modrih "škatlah" ponazarjajo polovico podatkov, neizstopajoče podatke pa prikazujejo črni ročaji (n = 10). 19

30 Graf 4: Vsebnost klorofilov a in b in karotenoidov na suho maso (mg/g). Prikazani podatki v modrih "škatlah" ponazarjajo polovico podatkov, neizstopajoče podatke pa prikazujejo črni ročaji (n = 10) Antociani Graf 5: Relativna vsebnost antocianov na površino (cm 2 ). Prikazani podatki v modri "škatli" ponazarjajo polovico podatkov, neizstopajoče podatke pa prikazujejo črni ročaji (n = 10). 20

31 Graf 6: Relativna vsebnost antocianov na suho maso (mg). Prikazani podatki v modri "škatli" ponazarjajo polovico podatkov, neizstopajoče podatke pa prikazujejo črni ročaji (n = 10) UV-absorbirajoče snovi Graf 7: Vsebnost UV-absorbirajočih snovi; UV-A in UV-B na površino (relativna enota/cm 2 ). Prikazani podatki v modrih "škatlah" ponazarjajo polovico podatkov, neizstopajoče podatke pa prikazujejo črni ročaji (n = 10). 21

32 Graf 8: Vsebnost UV-absorbirajočih snovi; UV-A in UV-B na suho maso (relativna enota/mg). Prikazani podatki v modrih "škatlah" ponazarjajo polovico podatkov, neizstopajoče podatke pa prikazujejo črni ročaji (n = 10). 4.4 SPECIFIČNA LISTNA POVRŠINA (SLA) IN VSEBNOST VODE površina (cm 2 ) suha masa (g) specifična listna površna (cm 2 /g) 2,8 0, ,5 1,6 0, ,1 1,6 0, ,9 2,8 0, ,1 2,0 0, ,7 1,7 0, ,2 2,0 0, ,6 1,4 0, ,9 1,2 0, ,00 1,8 0, ,6 Tabela 3: Prikazana specifična listna površina (cm 2 /g) in masa (g) po 24-urnem sušenju pri 105 C. 22

33 4.5. POVEZAVA LISTNE ANATOMIJE Z BIOKEMIJSKO SESTAVO IN SPEKTRI Iz redundančne analize izvemo, kakšen je vpliv merjenih parametrov na variabilnost spektrov. Vpliv parametrov pa se je pokazal pri reflektanci spodnje povrhnjice (Tabela 4). Iz redudančnega diagrama je razvidno, da je količina trihomov obratno sorazmerna z reflektanco vidne svetlobe. To pomeni, da z večanjem števila trihomov odboj vidne svetlobe upada. Poleg tega se pozitivni vpliv trihomov kaže pri odboju UV sevanja in negativni vpliv na odboj NIR (infrardeče sevanje). Gobasto tkivo ima pozitivni učinek na vidno svetlobo, saj količina tkiva poveča odboj vidne svetlobe. Klorofil pa je obratno sorazmeren z UV sevanjem. Parameter Delež razložene variance (%) P klorofil 42 0,002 trihomi 25 0,006 gobasto tkivo 15 0,023 Tabela 4: Parametri, ki statistično vplivajo na optične lastnosti (reflektanco spodnje povrhnjice) in so razloženi z deležem variance. Klorofil ima največji delež vpliva (42 %) na optične lastnosti, najmanjši delež pa gobasto tkivo (15 %). 23

34 Diagram 1: Ordinacijski diagram redundančne analize za prikaz različnih statističnih parametrov spodnje povrhnjice pri reflektanci (n = 10). Klorofil a vpliva na odboj svetlobe na spodnji povrhnjici listov, količina trihomov je premo sorazmerna z UV svetlobo in obratno sorazmerna z NIR (infrardečim sevanjem). 5. RAZPRAVA 5.1 TRANSMITANCA IN REFLEKTANCA Pri meritvah transmitance sem ugotovila razlike med prehajanjem svetlobe skozi zgornjo oziroma spodnjo stranjo listov od valovne dolžine 700 nm dalje (območje NIR) (Graf 1). Pri transmitanci zgornje in spodnje povrhnjice tako prihaja do statističnih razlik (p > 0,05). Pri reflektanci smo dobili večji delež odbite svetlobe s spodnje povrhnjice listov, kar je verjetno posledica prisotnosti trihomov (Olascoaga, in drugi, 2014). Vzrok za to razmeroma majhno transmitanco je verjetno vsebnost koncentracije klorofila (a in b) ter vsebnost kartenoidov v listih rastline (Klančnik & Gaberščik, 2015). Spekter presevne in odbite svetlobe, opravljen na zelenem listu vrste Celtis sinensis dokazuje, da je v območju 24

35 UV-A, UV-B in UV-C sevanja značilno, da ima zeleni list zelo nizko reflektanco (5 %) in ničelno transmitanco, absorpcija pa naj bi bila kar 95 % (Yoshimura, Zhu, Wu, & Ma, 2010). V območju NIR (preko 700 nm) sta tako transmitanca kot reflektanca visoki, absorbanca pa nizka. Naraščanje tako reflektance kot transmitance in zmanjšanje absorpcije na intervalu valovne dolžine nm je lahko posledica stresa pri rastlini (Carter & Knapp, 2001). Učinkovitost absorpcije je pri vertikalno orientiranih listih (kot so listi pri vrbi) nižja, kot pri horizontalno orientiranih (Ustin, Jacquemoud, & Govaerts, 2001). 5.2 LISTNA ANATOMIJA IN MORFOLOGIJA Ugotovila sem, da je spodnja kutikula 4,79 (µm) + 0,85 tanjša od zgornje kutikule 9,06 (µm) + 2,82. Vrsta Salix rosmarinifolia velja za sončno rastlino, zato je tudi debelina zgornje kutikule listov debelejša, saj je njen namen ohranjati vodne razmere v listih in preprečiti njihovo izsušitev. Povprečna debelina spodnje in zgornje povrhnjice je bila enaka, 9,06 (µm) + 2,82. Listi so imeli večji delež stebričastega tkiva 77,53 (µm) + 8,06 in manjši delež gobastega tkiva 53,78 (µm) + 14,38. Večji delež gobastega tkiva se je nahajal predvsem na spodnjem delu listov. Dokazano je bilo, da so stebričaste celice pri usmerjanju svetlobe do kloroplastov v listu učinkovitejše od gobastih (Ustin, Jacquemoud, & Govaerts, 2001). Trihomi so se pojavljali bolj na spodnji povrhnjici in so vplivali predvsem na odboj svetlobe na spodnji strani listov. Vidno so vplivali tudi na zmanjševanje odboja vidne svetlobe ter imeli povečan vpliv na odboj UV-absorbirajočih snovi. Listne reže so se pojavljale na spodnji povrhnjici, vendar jih zaradi prevelikih odstopanj pri raziskavi nisem upoštevala. 5.3 BIOKEMIJSKE LASTNOSTI Pri biokemijski analizi pigmentov sem ugotovila, da je koncentracija klorofila a 2,91 (mg/g ss) + 0,68 večja od koncentracije klorofila b 1,31 (mg/g ss) + 0,001. Večja vsebnost klorofila a v primerjavi s klorofilom b je posledica pokončno postavljenih listov. Svetloba 25

36 zaradi lege listov prehaja skozi zgornjo in spodnjo povrhnjico, klorofil a v listih pa je ključni pigment za proces fotosinteze. V listih se pojavlja več UV-A-absorbirajočih snovi 2,55 (relativna enota/ss (mg)) + 0,63 kot UV-B-absorbirajočih snovi 3,53 (relativna enota/ss (mg)) + 0,86). Vloga UV-absorbirajočih snovi v epidermisu listov je, da služijo kot filter oz. zaščita pred UV sevanjem (Barnes, Flint, Ryel, Tobler, & Barkley, 2015). V listih je bila vsebnost karotenoidov 0,99 (mg/g ss) + 0,23 in antocianov 66,03 (mg/g ss) + 23,54. V listih ta barvila ravno tako delujejo kot zaščita pred zunanjimi dejavniki (sevanje, transpiracija itd.). (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, & Stahl, 2015) 6. SKLEP Hipoteza 1: Predvidevamo, da vsebnost barvil v listih vpliva na optične lastnosti listov rožmarinolistne vrbe. Redundančna analiza je pokazala, da klorofil a vpliva na odboj svetlobe na spodnji povrhnjici listov. Hipoteza 2: Predvidevamo, da na optične lastnosti (odbojnost in presevnost) vpliva tudi zgradba listov (razmerje med gobastim in stebričastim tkivom). Pri analizi vpliva morfologije in anatomije na optične lastnosti se je izkazalo, da morfologija vpliva le na odboj svetlobe pri spodnji povrhnjici, razlog za to pa je prisotnost gobastega tkiva na spodnji strani lista. Ugotovila sem, da je večji delež gobastega tkiva v primerjavi s stebričastim pomembnejši pri odbojnosti, saj omogoča večji odboj vidne svetlobe. Vplivov morfologije pri odboju z zgornje povrhnjice in pri presevnosti, merjeni na zgornji in spodnji površini ni bilo zaznati. Pomembno vlogo pri odboju ali reflektanci svetlobe igrajo tudi trihomi. Zaradi večje gostote zmanjšujejo odboj vidne svetlobe (jo razpršujejo), negativni vpliv pa imajo na NIR (infrardeče sevanje), saj bo z višanjem števila trihomov list oddal manj toplote. Z UV sevanjem pa so trihomi premo sorazmerni oziroma imajo nanj pozitivni vpliv, saj trihomi z večjo gostoto pršijo UV sevanje. 26

37 7. VIRI IN LITERATURA Barnes, P. W., Flint, S. D., Ryel, R. J., Tobler, M. A., & Barkley, A. E. (2015). Plant Physiology and Biochemistry. Rediscovering leaf optical properties: New insights into plant,93, str Carter, G. A., & Knapp, A. K. (2001). American Journal of Botany. Leaf optical properties in higher plants: linking spectral characteristics to stress and chlorophyll concentration, 88, 4, str Castañeda-Ovando, A., Pacheco-Hernández, M. d., Páez-Hernández, M. E., Rodríguez, J. A., & Galán-Vidal, C. A. (2009). Food Chemistry. Chemical studies of anthocyanins: A review, 113,4:, str Dolinar, B., & Vreš, B. (2012). Hladnikia. Pregled flore Mišje doline in zgornjega porečja Rašice,30, str Farmedica. (brez datuma). Prevzeto iz Enciklopedija rastlin: Glover, B. J., & Martin, C. (2012). Anthocyanins. Current Biology,22,5:, str. R147-R150. Gorton, H., Brodersen, C., Wiliams, W., & Vogelmann, T. (2010). Photochemistry and Photobiology. Measurement of the Optical Properties of Leaves Under Diffuse Light, 86, 5, str Gril, A. (2015). Antociani. Pridobljeno iz Mladi raziskovalci za razvoj Šaleške doline: Hörtensteiner, S., & Kräutler, B. (2011). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. Chlorophyll breakdown in higher plants,1807,8, str Jacquemoud, S., & Ustin, S. L. (2001). Leaf optical properties: A state of the art. Proc. 8th International Symposium Physical Measurements & Signatures in Remote Sensing, Aussois (France), (str. 8-12). CSTARS, Department of Land, Air, and Water Resources, University of California, Davis CA. Kančnik, K., Mikuš-Vogel, K., Kelemen, M., Vavpetič, P., Pelicon, P., Kump, P., in drugi. (2014). Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. Leaf optical properties are affected by the location and type of deposited biominerals,140, str Klančnik, K., Gradinjan, D., & Gaberščik, A. (2014b). Aquatic Botany. Epiphyton alters the quantity and quality of radiation captured by leaves in submerged macrophytes B,120, str

38 Klančnik, K., Pančić, M., & Gaberščik, A. (2014a). Hydrobiologia. Leaf optical properties in amphibious plant species are affected by multiple leaf traits,737, str Kotar, M., & Brus, R. (1999). Naše drevesne vrste. Ljubljana: Slovenska matica. Lee, D. W. (2009). Plant tissue optics: micro- and nanostructures. Proc. SPIE 7401, Biomimetics and Bioinspiration. Madigan, M., Martinko, J., Bender, K., Buckley, D., & Stahl, D. (2015). Brock Biology of Microorganisms. Boston [etc.] : Pearson, cop Olascoaga, B., Juurola, E., Pinho, P., Luke, P., Halonen, L., Nikinmaa, E., in drugi. (2014). Boreal Environment Research;2014 Supplement B. Seasonal variation in the reflectance of photosynthetically,19, 132, str Stahl, W., & Sies, H. (2005). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. Bioactivity and protective effects of natural carotenoids, 170,2, str Ustin, S., Jacquemoud, S., & Govaerts, Y. (2001). Plant, Cell and Enviroment. Simulation of photon transport in a three-dimensional leaf: implication for photosythesis, Volume 24, 10, str Vignolini, S., Moyroud, E., Glover, B., & Steiner, U. (2013). Journal of the royal society Interface. Analysing photonic structures in plants, 10,. Vrtačnik, M. Z., & Boh, B. (brez datuma). Kemija 3, E-učbenik za kemijo v 3. letniku gimnazije. Wolley, J. T. (1971). Plant Physiology. Reflekaance and Tarasmittance of Light of Leaves,47,5, str Yoshimura, H., Zhu, H., Wu, Y., & Ma, R. (2010). Spectral properties of plant leaves pertaining to urban landscape design of broad-spectrum solar ultraviolet radiation reduction. International Journal of Biometeorology, 54, 2:, str