Diplomsko delo SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ ENCIMA TRANSGLUTAMINAZE Junij, 2017 Špela Lesičar

Diplomsko delo SINTEZA ZAMREŽENIH ENCIMSKIH SKUPKOV IZ ENCIMA TRANSGLUTAMINAZE Junij, 2017 Špela Lesičar

Špela Lesičar Sinteza zamreženih encimskih skupkov iz encima transglutaminaze Diplomsko delo Maribor, 2017

Sinteza zamreženih encimskih skupkov iz encima transglutaminaze Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje Študent: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Komentor: Špela Lesičar univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska tehnologija diplomirani/a inženir/ka kemijske tehnologije (UN) red. prof. dr. Maja Leitgeb asist. Katja Vasić, univ. dipl. inž. kem. tehnol. Maribor, 2017

Kazalo Kazalo... I Izjava... III Zahvala... V Povzetek... VI Abstract... VII Seznam tabel... VIII Seznam slik... IX Uporabljeni simboli in krajšave... XI 1 Uvod in opis problema... 1 2 Teoretični del... 2 2.1 Encim transglutaminaza... 2 2.2 Uporaba encimov v biokatalizi... 3 2.3 Imobilizacija encimov... 3 2.3.1 Imobilizacija z nosilcem... 4 2.3.2 Ujetje ali enkapsulacija v organski ali anorganski polimer... 5 2.3.3 Zamreženje encima... 5 2.4 Priprava CLEAs... 5 2.4.1 Obarjanje... 6 2.4.2 Zamreženje... 6 2.5 Lastnosti CLEAs... 6 2.6 Glutaraldehid... 7 3 Eksperimentalni del... 8 3.1 Materiali... 8 3.2 Laboratorijski pribor in aparature... 9 3.3 Eksperimentalne metode... 10 3.3.1 Priprava CLEAs iz encima transglutaminaze... 10 3.4 Analizne metode... 15 3.4.1 Bradfordov test za določevanje koncentracije proteinov... 15 3.4.2 Aktivnostni test... 16 4 Rezultati in diskusija... 19 4.1 Obarjanje encima TGM v izbranih obarjalnih reagentih... 19 4.2 Izbira optimalnega obarjalnega reagenta in njegove koncentracije... 21 4.3 Obarjanje in resuspendiranje v pufru TRIS... 23 4.4 Sinteza CLEAs iz transglutaminaze... 24 4.4.1 Optimiranje koncentracije dodanega glutaraldehida... 25 4.5 Spiranje s pufrom PBS... 27 4.6 Dodatek ogrodnega proteina BSA in optimiranje dodanega NaBH3CN... 28 4.7 Spreminjanje koncentracije TGM... 29 4.8 Dodatek ogrodnega proteina EA namesto BSA in izbira optimalne koncentracije. 30 4.9 Spreminjanje koncentracije TGM z dodatkom 100 mg/ml EA... 31 4.10 Sinteza CLEAs z dodatkom PEHA (pentaetilenheksamina)... 32 4.11 Preizkus stabilnosti CLEAs iz transglutaminaze ob večkratni uporabi... 33 5 Zaključek... 34 6 Literatura... 35 I

7 Priloge... 36 7.1 Umeritvene krivulje pri Bradfordovem testu... 36 8 Življenjepis... 40 II

Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: Vir: Science Direct (http://www.sciencedirect.com/) Gesla: Število referenc Transglutaminase IN immobilization 802 Immobilization IN CLEAs 610 Transglutaminaze IN CLEAs 0 Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid, COBIB.SI) Gesla: Število referenc Enzyme IN immobilizaton 73 Immobilization IN CLEAs 7 Transglutaminase IN CLEAs 0 Skupno število pregledanih člankov: 35 Skupno število pregledanih knjig: 5 Maribor, junij 2017 Špela Lesičar III

IV

Zahvala Zahvaljujem se svoji mentorici, red. prof. dr. Maji Leitgeb, za vso potrpežljivost in pomoč pri usmerjanju in izdelavi diplomskega dela. Prav tako se zahvaljujem somentorici univ. dipl. inž. kem. teh. Katji Vasić za pomoč in nasvete pri izvajanju eksperimentalnega dela. Še posebej se zahvaljujem svoji družini, ki mi je stala ob strani ves čas mojega študija in me spodbujala ter vsem prijateljem, ki so mi pomagali in mi dajali motivacijo ob vsaki oviri, ki sem jo srečala na svoji študijski poti. V

Povzetek Namen diplomske naloge je bila uspešna sinteza zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) iz encima transglutaminaze. Pri tem smo želeli doseči čim višjo učinkovitost imobilizacije in preostalo aktivnost encima transglutaminaze. Sinteza je zajemala postopek obarjanja encima v izbranem obarjalnem reagentu in zamreženja encima z mrežnim povezovalcem glutaraldehidom (GA). Da bi dosegli čim boljše rezultate smo morali izbrati ustrezen obarjalni reagent ter njegovo količino. Optimirali smo parametre pri zamreženju, kot so koncentracija dodanega mrežnega povezovalca, koncentracija dodanega natrijevega cianoborohidrida (NaBH3CN), koncentracija ogrodnih proteinov govejega serumskega albumina (BSA) in jajčnega albumina (EA) ter koncentracija transglutaminaze. Iz rezultatov smo ugotovili, da je 2-propanol najbolj ustrezen obarjalni reagent za sintezo CLEAs iz transglutaminaze. Optimalni volumski procent obarjalnega reagenta je bil 92,4 % (v/v), kar znaša 1215 μl. Za optimalne rezultate smo uporabili raztopino encima s koncentracijo 150 mg/ml s 100 mg/ml EA. Encimske molekule smo zamrežili z 2 % (v/v) GA ob 3 urnem mešanju. Za boljšo stabilnost encima smo dodali 200 μl 0,1 M NaBH3CN. Ugotovili smo, da lahko tako imobilizirano transglutaminazo kot katalizator reakcije uporabimo trikrat z aktivnostjo encima nad 100 % preden se deaktivira. Ključne besede: transglutaminaza, imobilizacija, zamreženi encimski skupki, glutaraldehid, mrežni povezovalec UDK: 543.645.4:544.478.3(043.2) VI

Immobilization of transglutaminase as crosslinked enzyme aggregates (CLEAs) Abstract The purpose of this diploma thesis was a successful synthesis of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) from enzyme transglutaminase. The aim was to achieve the maximum possible efficiency of immobilization and the highest remaining activity of transglutaminase. Synthesis of CLEAs consisted of precipitation of the enzyme in chosen precipitant and crosslinking of the enzyme with cross-linking reagent glutaraldehyde (GA). The best precipitant and its optimal volume for synthesis of CLEAs was selected in order to achieve the highest results and we optimized various parameters in process of crosslinking such as concentration of GA and sodium cyanoborohydride (NaBH3CN), concentracion of stabilization proteins bovine serum albumine (BSA) and egg albumin (EA) and concentration of enzyme transglutaminase. The results of diploma thesis shows that the optimal precipitant for synthesis of CLEAs from transglutaminase is 2-propanol with volume percent of 92,4 % (v/v), so the volume of percipitant is 1215 μl. 150 mg/ml of enzyme transglutaminase with 100 mg/ml of EA was used for 3 hours long process of cross-linking with 2% (v/v) GA. We added 200 μl NaBH3CN for stabilization of the enzyme. We also realized that we can reuse the immobilized transglutaminase three times before its activity falls under 100% and the enzyme deactivates. Key words: transglutaminase, immobilization, cross-linked enzyme aggregates, glutaraldehyde, cross-linking agent UDK: 543.645.4:544.478.3(043.2) VII

Seznam tabel Tabela 4-1: Opis suspenzije in ocena uspešnosti obarjanja transglutaminaze v izbranih obarjalnih reagentih... 19 Tabela 4-2: Aktivnosti encima in učinkovitost imobilizacije pri preizkusu večkratne uporabe CLEAs iz transglutaminaze v reakciji... 33 VIII

Seznam slik Slika 2-1: Reakcije, ki jih katalizira transglutaminaza: reakcija prenosa acilnega dela, zamreženje med glutaminskim in lizinskim preostankom proteinov in deamidacija [13]... 2 Slika 2-2: Imobilizacijske metode: A - ujetje encima, B - enkapsulacija encima, C - imobilizacija z nosilcem, D - zamreženje encima [11]... 4 Slika 2-3: Molekula GA [14]... 7 Slika 3-1: Prikaz nastalega peleta pri sintezi CLEAs iz transglutaminaze... 11 Slika 3-2: Prikaz obarvanja vzorcev pri določevanju prisotnosti proteinov z Bradfordovim testom... 16 Slika 3-3: Shema, ki nam prikazuje princip določanja aktivnostnega testa za encim transglutaminazo z določenimi pogoji... 16 Slika 3-4: Prikaz obarvanosti raztopine pri določevanju aktivnosti z aktivnostnim testom... 18 Slika 4-1: Prikaz rezultatov obarjanja encima: a-uspešno obarjanje (motnost), b-neuspešno obarjanje (dve fazi), c-neuspešno obarjanje (bistra tekočina brez oborine), d-oborina pri uspešnih obarjalnih reagentih... 20 Slika 4-2: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) po obarjanju v različnih obarjalnih reagentih... 20 Slika 4-3: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM pri obarjanju z 10 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 25 % povečanjem volumna (dietil eter, n-heksan, 1-butanol, amonijev sulfat)... 21 Slika 4-4: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) pri obarjanju z 35 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 50 % povečanjem volumna (1-butanol, dimetil eter, amonijev sulfat, n-heksan)... 22 Slika 4-5: Preostanek proteinov in preostala aktivnost encima (100 mg/ml) pri obarjanju z 75 % povečanjem volumna obarjalnega reagenta... 22 Slika 4-6: Resuspendiranje oborine encima (100 mg/ml) v pufru TRIS... 23 Slika 4-7: CLEAs iz encima transglutaminaze (100 mg/ml) z dodatkom 1,027 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN... 24 Slika 4-8: CLEAs iz transglutaminaze (100 mg/ml) z dodatkom 1,521 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN... 25 Slika 4-9: CLEAs iz TGM (100 mg/ml) z dodatkom 2,015 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN... 26 Slika 4-10: CLEAs iz TGM (100 mg/ml) z dodatkom 2,28 % (v/v) GA in 100 μl 0,1 M NaBH3CN... 26 Slika 4-11: Spiranje CLEAs iz transglutaminaze s pufrom PBS... 27 Slika 4-12: Primerjava učinkovitosti imobilizacije po 1. in 2. spiranju ter preostale aktivnosti CLEAs iz TGM (100 mg/ml). Obarjanje encima TGM z dodatkom BSA in brez dodanega BSA v obarjalnem reagentu 2-propanolu... 28 Slika 4-13: CLEAs iz transglutaminaze (100 mg/ml) obarjene v 2-propanolu z dodatkom 50 mg/ml BSA, zamrežene z 2,015 % (v/v) GA in dodanimi različnimi volumni 0,1M NaBH3CN... 29 IX

Slika 4-14: Primerjava sinteze CLEAs iz raztopine encima TGM različnih koncentracij obarjene v 2- propanolu z dodanim BSA (50 mg/ml)... 29 Slika 4-15: Primerjava sinteze CLEAs z 2,015 % (v/v) GA iz transglutaminaze (100 mg/ml) obarjene v 2-propanolu z različnimi koncentracijami dodanega BSA in EA in dodatkom 200 μl 0,1 M NaBH3CN... 31 Slika 4-16: Primerjava sinteze CLEAs iz encima TGM različnih koncentracij obarjenega v 2- propanolu z dodatkom 100 mg/ml EA in zamreženega z 2,015 % (v/v) GA ter dodanim 200 μl 0,1 M NaBH3CN... 31 Slika 4-17: Sinteza CLEAs iz transglutaminaze (250 mg/ml) oborjene v 2-propanolu z 100 mg/ml EA in 200 μl M PEHA z 2,015 % (v/v) GA in dodatkom 200 μl 0,1M NaBH3CN.... 32 Slika 4-18: Večkratno merjenje aktivnosti CLEAs iz transglutaminaze... 33 Slika 7-1: Prva umeritvena krivulja za Bradfordov test... 36 Slika 7-2: Druga umeritvena krivulja za Bradfordov test... 36 Slika 7-3: Tretja umeritvena krivulja za Bradfordov test... 37 Slika 7-4: Četrta umeritvena krivulja za Bradfordov test... 37 Slika 7-5: Peta umeritvena krivulja za Bradfordov test... 38 Slika 7-6: Šesta umeritvena krivulja za Bradfordov test... 38 Slika 7-7: Sedma umeritvena krivulja za Bradfordov test... 39 X

Uporabljeni simboli in krajšave Simboli A M V c absorbanca (nm) molarnost (mol/l) volumen (ml, μl) množinska koncentracija (mol/l) Grški simboli φ volumski delež (% (v/v)) masna koncentracija (g/l) Krajšave BSA CBZ CLEAs CLECs CLEs EA GA NaBH3CN PBS PEHA TCA TGM TRIS goveji serumski albumin karboksibenzil zamreženi encimski skupki zamrežen kristaliziran encim zamrežen raztopljen encim jajčni albumin glutaraldehid natrijev cianoborohidrid fosfatni pufer pentaetilenheksamin trikloroocetna kislina transglutaminaza tris(hidroksimetil)aminometan pufer XI

XII

1 Uvod in opis problema Encimi so trajnostni biokatalizatorji, ki jih najdemo v naravi. So proteini, pridobivajo pa se iz obnovljivih virov. So biokompatibilni in biorazgradljivi. Uporabljajo se v biokatalitičnih reakcijah, kjer pospešijo hitrost reakcije. Encimske reakcije so zaželene, saj se lahko izvajajo pod milimi pogoji v vodi. Encimi so visoko selektivni, zato ni potrebe po zaščiti in aktivaciji funkcionalnih skupin, s čimer se izognemo odvečnim odpadnim snovem in naredimo proces bolj ekonomičen in energijsko učinkovit. [1] Sami encimi imajo slabo delovno stabilnost, poleg tega pa jih je težko reciklirati in ponovno uporabiti, saj so raztopljeni v vodi. To odpravimo z imobilizacijo encima. Poznamo tri tipe imobilizacije: vezava na inertno snov, ki ji pravimo nosilec, ujetje ali enkapsulacija ter imobilizacija brez nosilca z zamreženjem encima. Z imobilizacijo preprečimo kontaminacijo produkta, omogočimo lažje upravljanje z encimom, povečamo stabilnost in katalitično produktivnost encima ter omogočimo kontinuirni proces. [2] V diplomskem delu je zajeta imobilizacija in zamreženje encima transglutaminaze. Encim smo imobilizirali z zamreženjem v encimske skupke oziroma agregate, ki se drugače imenujejo CLEAs. Imobilizacija brez nosilcev zajema obarjanje z dodajanjem organskih topil v vodi in zamreženje z bifunkcionalnim reagentom. Pomemben je čas obarjanja in količina bifunkcionalnega reagenta, za katerega ponavadi uporabljamo glutaraldehid, saj je poceni in na voljo v komercialnih količinah. [3] Ta metoda imobilizacije v prvem koraku združuje postopek obarjanja in čiščenja encima, zato ne potrebujemo predhodnega postopka čiščenja, ki je drag in časovno zamuden. Poleg tega se izognemo stroškom nosilca ter povečamo operacijsko in shranjevalno stabilnost encima. Encim je enostavno ločiti od produkta in pripraviti na ponovno uporabo z centrifugiranjem ali filtriranjem. [4], [5] Namen diplomske naloge je bila uspešna sinteza CLEAs iz transglutaminaze, ki bi izboljšala stabilnost in katalitično aktivnost encima. Potrebno je bilo najti ustrezen obarjalni reagent in optimirati parametre za dosego čim večje učinkovitosti imobilizacije in preostale aktivnosti transglutaminaze. Delo zajema teoretične osnove biokatalize, imobilizacije encimov, ter priprave CLEAs iz transglutaminaze. Opisani so postopki eksperimentalnih metod, ki smo jih pri raziskovanju uporabili. Na koncu so predstavljeni rezultati in diskusija raziskovalnega dela. 1

2 Teoretični del 2.1 Encim transglutaminaza Transglutaminaza oziroma protein glutamin γ-glutamiltransferaza je encim, ki ga najdemo v živalskih in rastlinskih tkivih, v mikroorganizmih ter v telesnih tekočinah, kjer sodeluje pri raznih bioloških procesih, kot so strjevanje krvi in celjenje ran. [6] V preteklosti so encim lahko pridobivali le iz jeter morskega prašička, kar pomeni, da so bile njegove zaloge omejene. Pridobili so lahko le majhne količine encima, zato je bila njegova cena primerljivo višja. K visoki ceni pa je prispeval tudi dolg in drag postopek čiščenja encima. [7] Z razvojem novih tehnik, raziskavami na področju encimov kot biokatalizatorjev in vse večjimi potrebami po tem encimu v industriji, so kasneje začeli iskati nove načine pridobivanja transglutaminaze z biotehnološkimi metodami iz mikroorganizmov. Najpogostejše metode so razne fermentacije, na primer potopljena fermentacija ali fermentacija v trdnem stanju. [7], [8] Pregledali so več tisoč različnih mikroorganizmov in s pomočjo hidroksamatnega testa ugotavljali, kateri sevi so sposobni proizvajati transglutaminazo. Izkazalo se je, da so mikroorganizmi visoko produktivni glede transglutaminaze. Za proizvajanje transglutaminaze je najbolj uporaben sev Streptomyces sp., ki se lahko za proizvodnjo transglutaminaze uporablja tudi na industrijski ravni. [7] Transglutaminaza katalizira tvorbo kovalentne vezi med amino skupino lizinskega preostanka in karboksamidno skupino glutaminskega preostanka, na katerega so vezani peptidi ali proteini. Reakcija poteče tako, da karboksamidna skupina glutaminskega preostanka v proteinih, peptidih ali različnih primarnih amidih donira acilno skupino primarnim amino skupinam lizinskega preostanka. Rezultat reakcije je lizinska verižna vez oziroma izopeptidna vez, ki povzroči zamreženje in polimerizacijo proteinskih molekul, s čimer pozitivno spremenimo funkcionalnost proteina. [6][7][8] Slika 2-1: Reakcije, ki jih katalizira transglutaminaza: reakcija prenosa acilnega dela, zamreženje med glutaminskim in lizinskim preostankom proteinov in deamidacija [13] 2

Na delovanje transglutaminaze kot biokatalizatorja vplivajo temperatura, ph in čas shranjevanja encima. [6] Uporablja se v različnih industrijskih panogah, kot so: Prehrambena industrija, kjer se uporablja predvsem kot sredstvo za zamreženje pri proizvodnji mesnih izdelkov (vezivo v mesu), poleg tega pa pripomore k boljšim funkcionalnim lastnostim prehrambenih izdelkov, kot so tekstura, stabilnost in shranjevanje. [6] Tekstilna industrija, kjer se uporablja pri proizvodnji volnenih oblačil, in sicer ohranja barvo in njihov izgled ter jo zaščiti pred poškodbami zaradi uporabe različnih kemikalij in encimov v pralnih sredstvih v gospodinjstvu. Prepreči tudi krčenje oblačil med pranjem. [8] Farmacevtska industrija Proizvodnja biosenzorjev [7] Proizvodnja raznih gelov [6] 2.2 Uporaba encimov v biokatalizi Biokataliza je kemična pretvorba organskih snovi z uporabo encimov kot biokatalizatorjev, ki pospešijo kemijsko reakcijo. V zadnjih desetletjih je bilo veliko pozornosti namenjeno razvoju v biokatalizi, saj imajo biokatalizirane sinteze v primerjavi s klasičnimi organskimi sintezami številne prednosti. Biokatalizirana reakcija poteka v enostavnih reaktorjih pod milimi pogoji (sobna temperatura, atmosferski tlak, fiziološki ph), zato so reakcije energijsko bolj učinkovite. Za topilo pa se v večini primerov lahko uporablja voda. [2], [4] Uporaba encimov v biokemijskih reakcijah je predvsem zmanjšala količino odpadnih snovi ter omejila uporabo nevarnih in strupenih snovi. Poleg tega je selektivnost encimov omogočila boljšo kontrolo nad produkti reakcije, ti pa so tudi bolj čisti. Ker pa so prosti encimi manj stabilni pri delovanju in shranjevanju zaradi njihove občutljive tridimenzionalne strukture, poleg tega pa je encim, ki je raztopljen v vodi po reakciji težko reciklirati in ponovno uporabiti, je prišla v ospredje imobilizacija encima. [4] 2.3 Imobilizacija encimov Z imobilizacijo izboljšamo operacijsko in shranjevalno stabilnost ter povečamo življenjsko dobo encima. Encim je po imobilizaciji bolj odporen proti denaturaciji zaradi organskih topil, povišane temperature in avtolize. [4] Željeno je, da se encim po končani reakciji da reciklirati in ponovno uporabiti, saj s tem zmanjšamo stroške procesa in odpadne snovi pri reakciji. Imobilizacija encima povzroči, da se encim ne raztopi v reakcijski mešanici, kar nam omogoča lažje ločevanje encima od produktov reakcije z filtracijo ali centrifugiranjem, poleg tega pa recikliran encim obdrži svojo aktivnost in stabilnost. [4], [9] Tri različne imobilizacijske metode prikazuje slika Slika 2-2. To so imobilizacija z nosilcem, ujetje ali enkapsulacija in imobilizacija brez nosilca. 3

Slika 2-2: Imobilizacijske metode: A - ujetje encima, B - enkapsulacija encima, C - imobilizacija z nosilcem, D - zamreženje encima [11] 2.3.1 Imobilizacija z nosilcem Razvila se je v drugi polovici 21. stoletja. Nosilec pozitivno spremeni lastnosti encima tako, da mu da bolj togo strukturo, ki preprečuje razvitje encima pri povišanih temperaturah ali uporabi organskih topil. Nosilci so lahko naravni ali sintetični. Kljub temu, da vezava encima na nosilec poveča njegovo stabilnost in omogoča ponovno uporabo encima, ta postopek imobilizacije ni najboljša izbira, saj nosilec poveča nekatalitično maso encima za kar 90 99%, kar povzroči zmanjšanje aktivnosti in produktivnosti. Aktivnost imobiliziranega encima se lahko zmanjša kar za 50% aktivnosti prostega encima. Encimi vezani na nosilec so tudi bolj nagnjeni k spiranju v vodi. Poleg tega pa so povečani tudi stroški procesa, saj so nekateri nosilci precej dragi. [9], [10] Encim je lahko na nosilec vezan na več načinov. Adsorpcija Vezava encima na nosilec z adsorpcijo je enostavna in poceni metoda, ki ne spremeni kemične sestave encima. Ker pa so vezi med encimom in ustreznim nosilcem šibke, se encim v vodnih medijih lahko spere z nosilca. [11] Ionska vezava na nosilec Je enostavna metoda, kjer se encimi vežejo na polisaharidne biopolimere tako, da polimeri aktivirajo svoje funkcionalne skupine za ionsko interakcijo. Vezava je lahko dvosmerna, zaradi česar je encim lažje reciklirati in ponovno uporabiti. Težava je v spiranju encima z nosilca. [11] Kovalentna vezava na nosilec Vezi, ki se tvorijo med encimom in ustreznim nosilcem so močne in stabilne, zato se pri takšni vezavi encim ne spere s površine nosilca. Če se encim deaktivira, ni možna ponovna uporaba encima in nosilca. [1] 4

2.3.2 Ujetje ali enkapsulacija v organski ali anorganski polimer Encim ujamemo v polimerno mrežo (organska ali anorganska) ali v membransko napravo (votla vlakna, mikrokapsule). S tem ga zaščitimo pred direktnim stikom z zunanjim okoljem. Težava te metode je v omejitvah prenosa snovi in možnosti ujetja le male količine encima naenkrat. [1], [11] Razlika med vezavo encima na nosilec in ujetjem oziroma enkapsulacijo je v tem, da se v prvem primeru encim lahko veže na vnaprej narejen nosilec na zunanjo ali notranjo površino, v drugem primeru pa se polimerna mreža sintetizira v prisotnosti encima. Encim se veže le na notranjo površino mreže. [2] 2.3.3 Zamreženje encima Novejša metoda imobilizacije je zamreženje encima. Poznamo več različnih postopkov, ki se razlikujejo po dejanju pred samim zamreženjem. 2.3.3.1 Zamrežen raztopljen encim - CLEs Začetki segajo v leto 1960, ko so vodno raztopino encima združili z vodno raztopino mrežnega povezovalca glutaraldehida. Dobili so zamrežen raztopljen encim ali CLEs. Povečala se je stabilnost encima. Slabosti se kažejo v občutljivosti strukture tako imobiliziranega encima na pogoje delovanja (temperatura, ph, razmerje med encimom in mrežnim povezovalcem) in zmanjšanju aktivnosti CLEs glede na prosti encim. Encim je tudi težje ločiti od produkta in pripraviti za ponovno uporabo, ker je raztopljen v vodi. Tako zamrežen encim je želatinast in zato težaven za uporabo. Zaradi vseh težav, ki so se pojavile pri tej metodi je bila v nadaljnjih letih imobilizacija z nosilcem najboljša metoda.[4], [9] 2.3.3.2 Zamrežen kristaliziran encim CLECs Metodo so razvili v 90-tih letih. Postopek je analogen pripravi delcev CLEs, le da se pred postopkom zamreženja encim kristalizira. S tem se ohrani večja aktivnost glede na prosti encim, povečana pa je tudi operacijska stabilnost v primerjavi z CLEs. S postopkom kristalizacije je možna kontrola velikosti delcev, kar omogoči večjo produktivnost biokatalizatorja. Da encim kristaliziramo pa potrebujemo visoko čistost encima, kar poveča stroške, prav tako je postopek kristalizacije v laboratoriju zamuden. [9], [10] 2.3.3.3 Zamreženi encimski skupki - CLEAs Sinteza zamreženih encimskih skupkov oziroma CLEAs je eden izmed novejših načinov imobilizacije brez nosilca. Lastnosti so podobne kot pri CLECs, le da je priprava encima pred zamreženjem lažja in postopek je cenejši. [10] 2.4 Priprava CLEAs Priprava CLEAs sestoji iz dveh postopkov. Prvi je združevanje encimskih molekul v skupke oziroma agregate z obarjanjem iz vodnega pufra, sledi pa mu zamreženje encima v skupke oz. agregate z ustreznim mrežnim povezovalcem. Tako se tvorijo netopni skupki, ki ohranijo strukturo prostega encima in posledično svojo katalitično aktivnost. [4] 5

2.4.1 Obarjanje Če raztopini encima dodamo soli, organska topila ali neionske polimere, poteče proces obarjanja. Pri obarjanju je pomembno, da izberemo ustrezni obarjalni reagent, saj je od tega odvisno, kako se bo obnašal encim kot katalizator. Pri obarjanju se topne molekule encima v raztopini združijo, oborijo in tvorijo agregate oziroma skupke, povezane z nekovalentnimi vezmi. Ti agregati pri tem obdržijo enako strukturo kot jo ima encim pred obarjanjem. Skupki so nestabilni in se lahko ponovno raztopijo v vodi. Obarjanje je ena izmed pogostih tehnik čiščenja proteinov, zato za tvorbo CLEA ne potrebujemo popolnoma očiščenega encima. Lahko bi uporabili tudi surov encimski ekstrakt. S tem se izognemo dragemu in zamudnemu čiščenju encima v laboratoriju. [4], [9] 2.4.2 Zamreženje Obarjanju sledi zamreženje encimskih skupkov z ustreznim mrežnim povezovalcem. S tem nastanejo netopni skupki encima, ki se jim ohrani prvotna struktura in katalitična aktivnost. [4] Pomembni parametri zamreženja so: - Čas zamreženja, ki narekuje, kako dolgo se encim obarja. Čas obarjanja pred zamreženjem vpliva na aktivnost in mikrostrukturo encima. [11] - Izbira ustreznega mrežnega povezovalca za katerega najpogosteje izberemo glutaraldehid, saj je poceni in na voljo v komercialnih količinah. Pomembna je tudi koncentracija mrežnega povezovalca. Če ga dodamo premalo pride do nižje stabilnosti, ker so molekule encima preveč prožne. V obratnem primeru so encimske molekule preveč toge in pride do znižanja aktivnosti. Potrebno je določiti optimalno koncentracijo mrežnega povezovalca. [10] Reakcija zamreženja poteče med prostimi amino skupinami lizinskega preostanka na površini dveh bližnjih encimskih molekul in med polimeri ali oligomeri glutaraldehida, ki nastanejo z aldolno kondenzacijo. [4] 2.5 Lastnosti CLEAs Ker encim imobiliziramo brez nosilca, ne pride do zmanjšanja aktivnosti katalizatorja zaradi nekatalitične mase, izognemo pa se tudi stroškom samega nosilca. Katalitična aktivnost CLEAs je v nekaterih primerih celo višja kot aktivnost prostega encima. Temu pojavu pravimo hiperaktivacija. Pojavi se zaradi boljše dostopnosti posameznih encimskih molekul, ki so bolj urejeno razporejene, kot pri prostem encimu. [1], [5] CLEAs imajo izboljšano shranjevalno in delovno stabilnost v nasprotju z prostim encimom, torej so bolj odporni na toplotno denaturacijo, organska topila in avtolizo. Spiranja v vodnem mediju skoraj ni. Zanje je značilna visoka katalitična produktivnost (kg produkta/kg encima), ker je encim enostavno ločiti od produkta in ga ponovno uporabiti v procesu. S to metodo lahko koimobiliziramo dva ali več encimov v tako imenovane»kombi CLEAs«. Tako imobilizirani encimi lahko katalizirajo več biotransformacij hkrati ali v kaskadnem procesu. [5] 6

2.6 Glutaraldehid Glutaraldehid je brezbarvna organska spojina ostrega vonja in oljnatega videza. Topen je v vodi, alkoholih in organskih topilih. Na sliki Slika 2-3 je prikazana formula tega dialdehida z petimi ogljikovimi atomi. Slika 2-3: Molekula GA [14] Njegova najpogostejša funkcija je kot mrežni povezovalec za zamreženje proteinov, saj je enostaven za uporabo, zelo reaktiven, dostopen v komercialnih količinah in cenovno ugodnejši od drugih aldehidnih mrežnih povezovalcev. Poleg imobilizacije encimov ima tudi druge uporabne funkcije v encimskih reakcijah, imunokemijskih raziskavah, pri afinitetni kromatografiji in izdelavi biosenzorjev. [15] Slabost glutaraldehida kot mrežnega povezovalca se kaže le v primeru nekaterih encimov, kjer glutaraldehid reagira z ostanki aminske skupine in s tem povzroči znižanje aktivnosti encima. V tem primeru je potrebno izbrati druge alternative, ki bolje ustrezajo določenemu encimu. [3] Najpogostejša načina vezave GA sta tvorba intermolekularno zamrežene tridimenzionalne mreže in vezava na nosilec, kot so najlon ali zamreženi proteini (BSA, želatina in razni polimeri z aminsko funkcionalno skupino). [16] Molekula GA prodre v protein in reagira z ostanki amino skupin na njegovi površini, ki so pomembne za aktivnost encima. Pomembno je razmerje med proteinom in mrežnim povezovalcem, saj premajhne koncentracije GA pomenijo nezadostno zamreženje, saj vse amino skupine ne zreagirajo, molekula je zato preveč prožna in nestabilna proti izpiranju v vodi. V obratnem primeru previsoka koncentracija GA povzroči popolno izgubo prožnosti zamreženega encima in posledično njegove aktivnosti.[4], [5] 7

3 Eksperimentalni del 3.1 Materiali Pri delu smo uporabili naslednje materiale: Transglutaminaza, BDF Natural Ingredients 1-propanol, Merck n-heksan, Merck 2-propanol, Sigma-Aldrich Dimetil eter, Sigma-Aldrich Metanol, Carlo Erba reagents Aceton, Carlo Erba reagents Acetonitril, Sigma-Aldrich Amonijev sulfat, Fluka Chemika Etanol, Sigma-Aldrich 1-butanol, Merck Trizma Base, Sigma Aldrich CBZ Glutaminilglicin (CBZ Gln Gly), Zedira Hidroksilamin hidroklorid (H3NO) Sigma - Aldrich Glutation, Sigma-Aldrich Kalcijev klorid dihidrat (CaCl2 x 2H2O), Chemika L - Glutaminska kislina γ monohidroksamat, Sigma - Aldrich Coomassie Brilliant Blue G250, Merck Trikloroocetna kislina (TCA), Sigma - Aldrich Železov triklorid heksahidrat (FeCl3 x 10H2O), Merck Klorovodikova kislina (HCl), Merck Natrijev hidroksid (NaOH), Merck Fosforna kislina (H3PO4), Merck Deionizirana voda Goveji serumski albumin (BSA), Sigma Aldrich Jajčni albumin (EA), Sigma Aldrich Glutaraldehid (GA), Sigma Aldrich Natrijev cianoborohidrid (NaBH3CN), Merck Pentaetilenheksamin (PEHA), Sigma Aldrich 8

3.2 Laboratorijski pribor in aparature Steklene bučke (50 ml, 100 ml) z zamaški Steklene čaše (20 ml - 100 ml) Merilni valji (5 ml, 10 ml) Lopatica za tehtanje Steklena palčka Steklene shranjevalne posode z zamaški (50 ml, 100 ml) Mikrocentrifugirke (1,5 ml, 2 ml) Centrifugirke (50 ml) Stojalo za centrifugirke in mikrocentrifugirke Spatula Puhalka Kapalke Magnet Lijak Grelnik Pipete z nastavki (0,1 ml - 5 ml) Tehtnica, Sartorius (Nemčija) Magnetno mešalo z grelnikom, Rotamix (Slovenija) Centrifuga, Eppendorf Centrifuge 5804R (Nemčija) ph meter, Hanna Instruments (Madžarska) Stresalnik, Heidolph Unimax 1010 (Nemčija) UV-VIS Spektrofotometer, Varian Cary 50 Probe Vorteks, Mikro+Polo (Slovenija) 9

3.3 Eksperimentalne metode 3.3.1 Priprava CLEAs iz encima transglutaminaze Postopek sinteze sestoji iz dveh korakov: - Obarjanje encima v vodnem pufru - Zamreženje encimskih molekul 3.3.1.1 Obarjanje transglutaminaze Najprej smo izbrali deset obarjalnih reagentov, ki bi bili dobri kandidati za obarjanje encima TGM: 1-propanol 2-propanol Aceton n-heksan Etanol Amonijev sulfat Acetonitril Metanol Dimetil eter 1-butanol Pripravili smo raztopino encima transglutaminaze v vodi s koncentracijo 100 mg/ml. Raztopino encima smo obarjali v obarjalnem reagentu v volumskem razmerju 1:9. V centrifugirke smo odpipetirali 900 μl posameznega reagenta in počasi po kapljicah s pipeto dodali 100 μl raztopine encima. Centrifugirko smo na stresalniku mešali 40 minut na sobni temperaturi. Vzorce smo centrifugirali 10 minut pri 11000 rpm/min, nato smo pazljivo odpipetirali supernatant. Supernatantu smo z Bradfordovo metodo za določevanje proteinov določili koncentracijo proteinov in z testom aktivnosti določili aktivnost encima. Aktivnost encima smo določili tudi v oborini. Za izračune smo potrebovali tudi vsebnost proteinov in aktivnost raztopine prostega encima. Na podlagi opažanj in rezultatov smo izločili neustrezne obarjalne reagente. Postopek obarjanja smo ponovili z različnimi volumni obarjalnega reagenta. Volumen regentov smo povečali za 10 %, 25 %, 35 % in 50 % začetnega volumna. Odvzetemu supernatantu smo z Bradfordovo metodo določili koncentracijo proteinov. Aktivnost smo določili tako supernatantu kot tudi nastali oborini. Glede na dobljene rezultate smo se določili za optimalno količino obarjalnega reagenta. 3.3.1.2 Resuspendiranje oborine v pufru Ponovili smo postopek obarjanja z optimalnim volumnom obarjalnega reagenta kot je opisano v poglavju 3.3.1.1, le da smo po odpipetiranju supernatanta nastalo oborino resuspendirali v pufru, da bi dokazali, da obarjanje oziroma agregacija ne denaturira proteina. Po centrifugiranju in odvzemu supernatanta smo na oborino odpipetirali 900 μl pufra TRIS in zmešali na vorteksu, da se je oborina raztopila. Raztopini in supernatantu smo določili aktivnost encima in vsebnost proteinov. 10

Postopek resuspendiranja smo ponovili še s 75% večjim volumnom obarjalnega reagenta od začetnega in primerjali rezultate. 3.3.1.3 Zamreženje oz. tvorba zamreženih encimskih skupkov (CLEAs) CLEAs nastanejo s postopkom obarjanja, ki mu sledi zamreženje z bifunkcionalnim reagentom glutaraldehidom. Najprej smo po postopku, opisanem v poglavju 3.3.1.1 obarjali encim TGM s koncentracijo 100 mg/ml v optimalni količini obarjalnega reagenta, ki smo ga predhodno določili. Uporabili smo naslednje obarjalne reagente: - Aceton - Etanol - 1-propanol - 2-propanol - Acetonitril - Metanol - 1- butanol K obarjalnemu reagentu z volumnom 1215 μl smo dodali 100 μl raztopine encima in konstantno mešali 40 minut na stresalniku. Oborjeni suspenziji smo dodali 1% (v/v) GA in konstantno mešali 3 ure na sobni temperaturi. Sledil je dodatek 100 μl 0,1M NaBH3CN in mešanje še nadaljnjih 40 minut. Po pretečenem času smo vzorec centrifugirali 5 minut pri 11000 rpm/minuto. Odvzeli smo supernatant. Nastali pelet kaže slika Slika 3-1. Določili smo aktivnost encima v supernatantu in na nastalem peletu ter vsebnost proteinov v supernatantu. Slika 3-1: Prikaz nastalega peleta pri sintezi CLEAs iz transglutaminaze 11

3.3.1.4 Spiranje s pufrom PBS Nastale zamrežene skupke encima smo dvakrat spirali s fosfatnim pufrom z NaCl (PBS), da smo ugotovili, kako so CLEAs stabilni proti spiranju s pufrom. Pripravili smo 0,1 M raztopino pufra PBS. Ponovili smo postopek sinteze CLEAs iz poglavja 3.3.1.3, le da smo po centrifugiranju odvzeli supernatant in na pelet odpipetirali 900 μl pufra. Vzorec smo ponovno centrifugirali 5 minut na 11000 rpm/minuto. Postopek smo ponovili dvakrat. Določili smo preostanek proteinov in aktivnost encima v supernatantih po vsakem spiranju, ter aktivnost encima na peletu po drugem spiranju. Iz rezultatov smo razbrali koliko encima se spere iz zamreženih agregatov po dveh spiranjih in izbrali obarjalni reagent, ki je najbolj stabilen proti spiranju. 3.3.1.5 Optimiranje parametrov za izboljšanje lastnosti CLEAs Da bi dosegli čimvečjo aktivnost in učinkovitost imobilizacije imobilizirane TGM smo optimirali naslednje parametre: Optimiranje koncentracije glutaraldehida Koncentracija dodanega mrežnega povezovalca je zelo pomembna, saj prevelika koncentracija pomeni zmanjšanje stabilnosti, premajhna koncentracija pa zmanjšanje aktivnosti CLEAs. Postopek sinteze CLEAs iz poglavja 3.3.1.3 smo ponovili s povečanjem volumskega procenta glutaraldehida na 1,521 % (v/v), 2,015 % (v/v) in 2,280 % (v/v). Ostali parametri so ostali enaki. Z dobljenimi rezultati smo določili optimalno količino glutaraldehida. Dodajanje ogrodnega proteina BSA (goveji serumski albumin) BSA je ogrodni protein, ki omogoča zamreženje encimskih skupkov v primeru, ko je koncentracija encima nizka ali pa je aktivnost encima občutljiva na visoko koncentracijo glutaraldehida. Dodatek BSA poveča stabilnost encima, kar posledično poveča tudi aktivnost imobiliziranega encima. [12] Pripravili smo raztopino encima (100 mg/ml) in raztopino BSA (50 mg/ml). V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 100 μl TGM in 100 μl BSA ter kontinuirno mešali 40 minut. S tako pripravljenim encimom smo ponovili postopek sinteze CLEAs, kot je opisano v poglavju 3.3.1.3. Optimiranje koncentracije natrijevega cianoborohidrida (NaBH3CN) Dodatek NaBH3CN zagotovi, da se kovalentna vez med molekulami encima in mrežnim povezovalcem ne prekine s hidrolizo. [5] Ponovili smo postopek sinteze CLEAs iz poglavja 3.3.1.3 z različnimi volumni 0,1 M NaBH3CN (100 μl, 150 μl, 200 μl, 250 μl) in izbrali optimalno količino. Povečevanje koncentracije TGM Postopek iz poglavja 3.3.1.3 smo ponovili z raztopinami encima z različnimi koncentracijami (100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml) in na podlagi rezultatov nadaljevali delo s koncentracijo 100 mg/ml. 12

Dodajanje ogrodnega proteina EA (jajčni albumin) BSA smo zamenjali z EA, ki prav tako kot BSA stabilizira encim in mu posledično poveča aktivnost. Pripravili smo raztopino EA s koncentracijo 50 mg/ml in raztopino encima s koncentracijo 100 mg/ml. V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 100 μl EA in 100 μl encima ter konstantno mešali 40 minut. S tako pripravljenim encimom smo ponovili postopek sinteze CLEAs iz poglavja 3.3.1.3. Optimiranje koncentracije ogrodnih proteinov Raztopini encima (100 mg/ml) smo dodali različne koncentracije BSA in EA: - 50 mg/ml BSA - 100 mg/ml BSA - 25 mg/ml EA - 50 mg/ml EA - 100 mg/ml EA - 150 mg/ml EA Kombinacije: - 50 mg/ml BSA + 25mg/ml EA - 50 mg/ml BSA + 50 mg/ml EA - 50 mg/ml BSA + 100 mg/ml EA Iz rezultatov smo razbrali, kateri ogrodni protein je najbolj ustrezen in katera koncentracija tega proteina daje najboljše rezultate. Optimiranje koncentracije encima TGM Spreminjali smo koncentracijo raztopine encima TGM z dodatkom optimalne koncentracije ogrodnega proteina EA (100 mg/ml). Pripravili smo vzorce: - 50 mg/ml TGM + 100 mg/ml EA - 100 mg/ml TGM + 100 mg/ml EA - 150 mg/ml TGM + 100 mg/ml EA - 200 mg/ml TGM + 100 mg/ml EA - 250 mg/ml TGM + 100 mg/ml EA Izbrali smo kombinacijo encima TGM in EA z najboljšimi rezultati. Dodatek pentaetilenheksamina (PEHA) Dodatek PEHA v postopku sinteze CLEAs poveča število prostih amino skupin, ki se nahajajo na zunanji površini encima, kar omogoča popolnejše zamreženje. Tako imobiliziran encim je zato stabilnejši in bolj odporen proti spiranju v vodnem mediju. [5] Po postopku iz poglavja 3.3.1.3 smo ponovili postopek sinteze CLEAs, le da smo v začetno mešanico 100 μl encima (250 mg/ml) in 100 μl EA (100 mg/ml) dodali 200 μl 0,1 M PEHA. 13

3.3.1.6 Ponovna uporaba encima Na koncu smo naredili preizkus uporabnosti imobilizirane transglutaminaze za večkratno uporabo v šaržnem procesu. Želeli smo ugotoviti, kolikokrat lahko encim ponovno uporabimo kot katalizator reakcije, da še obdrži visoko aktivnost. Po postopku, ki smo ga opisali v poglavju 3.3.1.3, smo sintetizirali CLEAs. Po končanem postopku sinteze z dvakratnim spiranjem smo peletu določili aktivnost encima, odvzetim supernatantom po vsakem spiranju pa aktivnost encima in vsebnost proteinov. Pelet smo nato zopet sprali s pufrom PBS in ponovili meritve na peletu in v supernatantu. Postopek smo ponavljali tako dolgo, da je bilo opaziti padec v aktivnosti encima na peletu. Iz rezultatov smo razbrali, kolikokrat je smiselno tako imobiliziran encim ponovno uporabiti v procesu. 14

3.4 Analizne metode Uporabili smo dve analizni metodi. Z Bradfordovim testom smo določili vsebnost proteinov v vzorcu, aktivnost pa smo določili z aktivnostnim testom za transglutaminazo. 3.4.1 Bradfordov test za določevanje koncentracije proteinov Brafordov test nam pove koncentracijo proteinov v vzorcu na osnovi kompleksa, ki se tvori med barvo v Bradfordovem reagentu in proteini v vzorcu. Ta kompleks povzroči spremembo absorbance pri valovni dolžini 595 nm. Bradfordov reagent smo pripravili tako, da smo 100 mg Coomassie Brilliant Blue raztopili v 100 ml fosforne kisline z 85 % (v/v) in 50 ml 95 % etanola. Mešanico smo razredčili z deionizirano vodo do skupnega volumna 1 l. Reagent smo umerili z ogrodnim proteinom BSA. Zatehtali smo 10 mg BSA in ga zmešali z 1 ml deionizirane vode, da smo dobili koncentracijo 10 mg/ml. Z redčenjem smo nato pripravili več raztopin BSA v koncentracijskem območju med 0 mg/ml in 1 mg/ml: 0,0 mg/ml (samo deionizirana voda) 0,2 mg/ml (20 μl 10 mg/ml BSA z 980 μl deionizirane vode) 0,4 mg/ml (40 μl 10 mg/ml BSA z 960 μl deionizirane vode) 0,6 mg/ml (60 μl 10 mg/ml BSA z 940 μl deionizirane vode) 0,8 mg/ml (80 μl 10 mg/ml BSA z 920 μl deionizirane vode) 1,0 mg/ml (100 μl 10 mg/ml BSA z 900 μl deionizirane vode) Pripravljenim vzorcem smo izmerili vsebnost proteinov po sledečem postopku: 1. Odpipetirali smo 1 ml pripravljenega Bradfordovega reagenta v mikrocentrifugirke. 2. Dodali smo 20 μl vzorca. 3. Mešanico smo zvorteksirali in inkubirali na sobni temperaturi 15 minut. 4. S spektrofotometrom smo izmerili absorbanco pri 595 nm. Skonstruirali smo ustrezno umeritveno krivuljo absorbance pri 595 nm v odvisnosti od koncentracije BSA in z linearno interpolacijo določili premico, ki poteka skozi eksperimentalne točke. Odvzetim supernatantom pri sintezi CLEA smo vsebnost proteinov pomerili po identičnem postopku kot vzorcem za pripravo umeritvene krivulje. V postopku smo 20 μl vzorca zamenjali z 20 μl deionizirane vode, da smo dobili slepi vzorec. Prisotnost proteinov je povzročila spremembo barve raztopine kot kaže slika Slika 3-2. Levo je vzorec s prostim encimom, desno pa slepi vzorec. 15

Slika 3-2: Prikaz obarvanja vzorcev pri določevanju prisotnosti proteinov z Bradfordovim testom 3.4.1.1 Izračun učinkovitosti imobilizacije Iz vrednosti absorbanc, ki smo jih izmerili vzorcem pri Bradfordovem testu, smo določili učinkovitost imobilizacije, s katero ugotovimo, koliko encima se je uspelo zamrežiti v encimske skupke. Enačba, s katero izračunamo učinkovitost imobilizacije, je prikazana spodaj: c c ci i s % 100 (3.1) Kjer je: cs koncentracija encima v supernatantu (mg/ml) ci koncentracija prostega encima (mg/ml) ρ učinkovitost imobilizacije (%) 3.4.2 Aktivnostni test Akitvnost smo določali glede na to, koliko encima transglutaminaze katalizira nastanek 1 μmola CBZ - glutaminske kisline γ monohidroksamata iz CBZ - glutaminilglicina in hidroksilamina na minuto pri 37 C, kot je prikazano na sliki Slika 3-3. Slika 3-3: Shema, ki nam prikazuje princip določanja aktivnostnega testa za encim transglutaminazo z določenimi pogoji 16

Najprej smo pripravili reagente: Reagent A smo pripravili tako, da smo 1 M pufer TRIS raztopili v 50 ml deionizirane vode. Pri 37 C smo umerili raztopino na ph vrednost 6,0 z ocetno kislino. Za reagent B smo uporabili CBZ glutaminilglicin (CBZ-Gln-Gly) v trdnem stanju Reagent C je bilo potrebno pripraviti sveže vsak dan. Naredili smo raztopino 0,2 M hidroksilamina in 0,02 M glutationa v 10 ml deionizirane vode. Reagent D smo pripravili tako, da smo 1 M kalcijev klorid raztopili v 1 ml deionizirane vode. Za reagent E smo 0,01 M glutaminsko kislino γ monohidroksamat raztopili v 10 ml deionizirane vode. Reagent F smo pripravili z 12 % (v/v) trikloroocetne kisline (TCA) v deionizirani vodi v 100 ml bučki. Reagent G smo pripravili tako, da smo železov triklorid raztopili v 100 ml reagenta H, ki ga je sestavljalo 100 ml 0,1 M klorovodikove kisline z deionizirano vodo. Reagent I je bila raztopina encima, ki smo jo pripravili vsak dan sproti. Koncentracijo te raztopine smo spreminjali v območju od 50 mg/ml do 250 mg/ml. Za izvedbo aktivnostnega testa smo iz pripravljenih reagentov zmešali reakcijski koktejl. Zatehtali smo 120 mg reagenta B, mu dodali 5 ml svežega reagenta C in 2 ml reagenta A in mešali ob rahlem segrevanju na grelniku z magnetnim mešalom. Med mešanjem smo dodali še 50 μl reagenta D. Raztopino smo z 1 M NaOH umerili na ph 6,00 pri 37 C. Nato smo dodali deionizirano vodo do skupnega volumna 10 ml. Vzorcem smo aktivnost merili po naslednjem postopku. V mikrocentrifugirko smo odpipetirali 200 μl reakcijskega koktejla in segreli na 37 C. Dodali smo 30 μl raztopine encima, zvorteksirali in 10 minut inkubirali pri 37 C. Po pretečenem času smo dodali 500 μl reagenta F in 500 μl reagenta G. Slepo probo smo pripravili tako, da smo s pipeto v mikrocentrifugirko odpipetirali 200 μl reakcijskega koktejla, 500 μl reagenta F, 30 μl vzorca in 500 μl reagenta G. Med vsakim dodajanjem smo zmešali na vorteksu. Za standard smo v mikrocentrifugirko odpipetirali 100 μl reagenta E, 500 μl reagenta F in 500 μl reagenta G. Zmešali smo na vorteksu. Slepa proba za standard pa je bila pripravljena tako, da smo skupaj zmešali 100 μl deionizirane vode, 500 μl reagenta F in 500 μl reagenta G. Vse pripravljene raztopine smo centrifugirali 5 minut pri 11000 rpm/min. S spektrofotometrom smo raztopinam izmerili absorbanco pri 525 nm. Večja kot je bila izmerjena aktivnost bolj oranžno se je obarvala raztopina. Raztopine z nizko aktivnostjo so ostale rumene barve kot vidimo na sliki Slika 3-4. 17

Slika 3-4: Prikaz obarvanosti raztopine pri določevanju aktivnosti z aktivnostnim testom 3.4.2.1 Izračun preostanka aktivnosti Aktivnost smo izračunali z enačbo: U/ml encima = A A 0 A A 1,1 10 1, 23 st st0 Kjer so: Av absorbanca vzorca (pri 525 nm) A0 absorbanca slepe probe (pri 525 nm) Ast absorbanca standardne raztopine (pri 525 nm) Ast0 absorbanca slepe probe za standard (pri 525 nm) 1,1 volumen standardne raztopine (ml) 10 reakcijski čas (min) 1,23 volumen barvne mešanice (ml) Preostalo aktivnost smo izračunali po spodnji enačbi: v (3.2) aktivnost CLEAs A% 100 (3.3) aktivnost prostega encima 18

4 Rezultati in diskusija 4.1 Obarjanje encima TGM v izbranih obarjalnih reagentih Encim TGM smo obarjali tako, da smo 100 μl raztopine encima po kapljicah dodajali k 900 μl obarjalnega reagenta. Suspenzijo smo centrifugirali, da smo ločili nastalo oborino od supernatanta. Uspešnost obarjanja smo že pred centrifugiranjem lahko določili z opazovanjem motnosti nastale suspenzije. Bela motnost je pomenila uspešno obarjanje, bistra tekočina brez oborine pa neuspešno obarjanje. V treh vzorcih sta se pojavili dve fazi, kar smo ocenili kot neuspešno obarjanje. Po centrifugiranju smo pri vzorcih z uspešno obarjenim encimom opazili belo oborino. Motna suspenzija je bila vidna pri acetonu, 1-propanolu, 2-propanolu, acetonitrilu, metanolu in etanolu. V primeru amonijevega sulfata ni bilo opaziti motnosti. Dve fazi sta se pojavili pri n-heksanu, 1-butanolu in dimetil etru. Pri zadnjih dveh smo opazili mehurček. Rezultati obarjanja TGM so prikazani v tabeli Tabela 4-1 in na sliki Slika 4-1. Tabela 4-1: Opis suspenzije in ocena uspešnosti obarjanja transglutaminaze v izbranih obarjalnih reagentih OBARJALNI REAGENT OPIS SUSPENZIJE OCENA OBARJANJA aceton motna suspenzija uspešno etanol motna suspenzija uspešno 1-propanol motna suspenzija uspešno 2-propanol motna suspenzija uspešno acetonitril motna suspenzija uspešno metanol motna suspenzija uspešno 1-butanol dve fazi, mehurček neuspešno dimetil eter dve fazi, mehurček neuspešno n-heksan dve fazi neuspešno amonijev sulfat bistra tekočina neuspešno 19

preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] Slika 4-1: Prikaz rezultatov obarjanja encima: a-uspešno obarjanje (motnost), b-neuspešno obarjanje (dve fazi), c-neuspešno obarjanje (bistra tekočina brez oborine), d-oborina pri uspešnih obarjalnih reagentih Uspešno oborjenim vzorcem smo s spektrofotometrom določili aktivnost encima in preostanek proteinov. Izračunali smo, koliko proteinov je ostalo v oborini in koliko se je spralo v supernatant, ter kako obarjanje vpliva na aktivnost encima. Iz slike Slika 4-2 lahko povzamemo, da so se aktivnosti oborjenega encima gibale med 100 % in 300 %. Izjema je oborjen encim v obarjalnem reagentu acetonu, kjer je bila aktivnost le 10 %. Najvišjo aktivnost encima smo zasledili pri obarjanju v 1-propanolu, in sicer 282,62 %. V supernatantih se je aktivnost encima gibala od 0 % do 1,3 %, kar pomeni, da je nekaj encima ostalo neobarjenega. Na grafu vidimo, da je v oborini pri večini vzorcev ostalo okoli 90 % proteinov. Izjema je acetonitril, kjer je preostalo 68 % proteinov. 100 80 60 40 20 0 500 400 300 200 100 0 preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-2: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) po obarjanju v različnih obarjalnih reagentih 20

preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] 4.2 Izbira optimalnega obarjalnega reagenta in njegove koncentracije Da bi se prepričali o neustreznosti obarjalnih reagentov, kjer je bilo obarjanje ocenjeno kot neuspešno, smo povečali koncentracijo obarjalnega reagenta. V primeru amonijevega sulfata, n-heksana, 1-butanola in dimetil etra smo povečali volumen obarjalnega reagenta za 25 %, tako da je končni volumen reagenta znašal 1125 μl. Obarjanje smo ocenili kot neuspešno. Uspešnim obarjalnim reagentom smo želeli izboljšati aktivnost, zato smo povečali volumen reagenta za 10 %, tako da je končni volumen obarjalnega reagenta znašal 990 μl. Iz slike Slika 4-3 vidimo, da so se s povečanjem koncentracije obarjalnega reagenta povečale tudi aktivnosti encima, ki so sedaj med 250 % in 350 %. Najvišjo aktivnost zasledimo pri obarjanju encima v obarjalnem reagentu 2-propanolu s 351,64 %, najnižjo pa še vedno v reagentu acetonu, in sicer okoli 1 %. V supernatantih smo še vedno zasledili aktivnost encima do 10 %. Procent preostalih proteinov v oborini se je pri obarjanju v reagentih acetonu, etanolu, acetonitrilu in metanolu povečal malo nad 90 %, pri 1-propanolu in 2-propanolu pa je ostal približno enak. 100 80 60 40 500 400 300 200 preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] 20 0 100 0 preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-3: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM pri obarjanju z 10 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 25 % povečanjem volumna (dietil eter, n-heksan, 1-butanol, amonijev sulfat) Obarjalnim reagentom z neuspešnim obarjanjem encima smo povečali volumen za 50 %, tako da je končni volumen obarjalnega reagenta znašal 1350 μl, obarjalnim reagentom z uspešnim obarjanjem encima pa za 35 %, da smo dosegli končni volumen 1215 μl. Pri obarjanju encima v reagentu 1-butanolu smo opazili motnost suspenzije, zato smo ocenili obarjanje kot uspešno. Pri obarjanju encima v dimetil etru, n-heksanu in amonijevem sulfatu nismo opazili sprememb. Iz slike Slika 4-4 vidimo, da so se aktivnosti encima gibale med 250 % in 450 %. Najvišjo aktivnost encima smo dosegli v primeru obarjanja v 1-propanolu, in sicer 430 %. Aktivnost oborjenega encima v 2-propanolu se je znižala za 50 %. Najnižjo aktivnost encima je še vedno bilo opaziti pri obarjanju v acetonu, in sicer 10 %. Obarjanje encima v 1-butanolu je doseglo 350 % aktivnost. Aktivnosti encima v supernatantih so bile skoraj 0 %. Odstotki preostanka proteinov v oborini so se še vedno gibali okoli 90 %, le v primeru obarjanja v 1-butanolu je bila vrednost nižja, in sicer 68 %. 21

preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] preostanek proteinov [%] preostala aktivnost [%] 100 80 60 40 500 400 300 200 preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] 20 0 100 0 preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-4: Preostanek proteinov in preostala aktivnost TGM (100 mg/ml) pri obarjanju z 35 % povečanjem volumna (aceton, etanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitril, metanol) in 50 % povečanjem volumna (1-butanol, dimetil eter, amonijev sulfat, n-heksan) Volumen obarjalnega reagenta smo povečali še za 75 % do končnega volumna 1575 μl pri obarjalnih reagentih z uspešnim obarjanjem encima in za 50 % do volumna 1350 μl pri obarjalnih reagentih z neuspešnim obarjanjem encima. V Dimetil etru, n-heksanu in amonijevem sulfatu se encim še vedno ni oboril. Iz slike Slika 4-5 je razvidno, da so aktivnosti encima padle pod 320 %. Najvišjo aktivnost ima encim, oborjen v 1-propanolu z 314,8 %, najnižjo pa v acetonu in sicer 4,89 %. V vseh primerih je padla aktivnost encima za 50 % ali več. Preostanek proteinov je znašal okoli 90 %, le pri obarjanju v 1-butanolu se je povišal na 80,36 %. 100 80 60 40 20 0 500 400 300 200 100 0 preostanek proteinov na oborini [%] preostala aktivnost v oborini [%] preostala aktivnost v supernatantu [%] Slika 4-5: Preostanek proteinov in preostala aktivnost encima (100 mg/ml) pri obarjanju z 75 % povečanjem volumna obarjalnega reagenta 22