UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE Domen ŠTAMIC RAZMNOŽEVANJE ČEŠNJE (Prunus avium L.) V IN VITRO POGOJIH. DIPLOMSKO DELO Maribor, 2018
UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE AGRONOMIJA OKRASNE RASTLINE, ZELENJAVA IN POLJŠČINE Domen ŠTAMIC RAZMNOŽEVANJE ČEŠNJE (Prunus avium L.) V IN VITRO POGOJIH. DIPLOMSKO DELO Maribor, 2018
POPRAVKI:
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. III Komisijo za zagovor in oceno diplomskega dela sestavljajo: Predsednik: red. prof. dr. Anton IVANČIČ Mentorica: izr. prof. dr. Metka ŠIŠKO Član: red. prof. dr. Stanislav TOJNKO Lektorica: Maja HAJDINJAK, dipl. slov. (UN) in dipl. prim. slov. jez. (UN) Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Datum zagovora:
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. III Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih UDK: 634.23:631.533.1(043.2)=163.6 V letu 2016 smo na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru opravili poskus, pri katerem smo proučevali vpliv različnih načinov sterilizacije na brste dveh sort češenj. Za sterilizacijo smo uporabljali razkuževalni sredstvi DICA in natrijev hipoklorit. Kasneje smo sterilne in vitalne poganjke namnoževali na gojišču MS z dodanim citokininom (BAP) in avksinom (NAA). Ko smo namnožili dovolj poganjkov, smo preučevali gojišče za koreninjenje. Kontrolno gojišče je vsebovalo 0,0 mg/l IBA, gojišče G1 je vsebovalo 0,3 mg/l IBA in gojišče G2 je vsebovalo 1,0 mg/l IBA. Pri gojiščih G1 in G2 smo polovico poganjkov dali za 6 dni v temo. Po določenem času smo vrednotili število nastalih korenin. Najbolje se je izkazalo gojišče G2, ki je bilo izpostavljeno temi, kjer je bil uspeh koreninjenja 100 %, na gojišču G2, ki je bilo na svetlem, je bil uspeh koreninjenja 90 %. Na gojišču G1, ki je bilo na svetlem in temnem, je bil uspeh koreninjenja 60 %. Kontrolno gojišče je imelo 50 % uspeh koreninjenja. Največ korenin (povprečno 5,7 korenin na rastlino) so tvorili poganjki na gojišču G2, katere smo 6 dni tretirali s temo. Rastline, katere so razvile lepe korenine, smo na koncu aklimatizirali. Ključne besede: koreninjenje / in vitro / češnja / tkivne kulture / mikropropagacija OP: Ⅵ, 37 s., 7 pregl., 3 graf., 9 slik, 26 ref. In vitro propagation of sweet cherries (Prunus avium L.) In the year 2016, we carried out an experiment at the Faculty of Agriculture and Life Sciences of Maribor, in which we studied the effects of different types of sterilisation methods on buds of two cherry cultivars. Two disinfectants were used for sterilisation DICA and sodium hypochlorite. Sterile and vital shoots were reproduced on a MS medium, where cytokinin BAP and auxin NAA were added. When we had enough reproduced shoots, we studied three types of rooting mediums. The control medium had 0.0 mg/l IBA, the medium G1 had 0.3 mg/l IBA and the medium G2 had 1 mg/l IBA. Half of the shoots, which were placed in medium G1 and G2, were treated with a dark treatment for six days. After a period, we determined the number of roots per plant. The best medium was the G2, which was exposed to darkness, in which the rooting was 100 %. In medium G2, which was exposed to light, the rooting was 90 %. The rooting in medium G1, which was treated with both, darkness and light, was 60 %. The rooting on control medium was 50 %. Most roots (on average 5.7 roots per plant) were grown by plants, which were grown in G2 medium, which was treated with six days of darkness. The plants that grew the best roots, were acclimatized. Key words: rooting / in vitro / cherry / tissue culture / micropropagation NO: Ⅵ, 37 P., 7 Tab., 3 Graph., 9 Pic., 26 Ref.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. III Kazalo vsebine 1 UVOD... 1 1.1 Namen in cilj diplomskega dela... 2 2 PREGLED OBJAV... 3 2.1 Izvor in botanična klasifikacija češnje (Prunus avium L.)... 3 2.2 Splošni opis in gojenje... 5 2.3 Razmnoževanje in vitro... 7 2.3.1 Mikropropagacija... 8 2.3.2 Sterilizacija rastlinskega materiala... 10 2.3.3 Namnoževanje rastlinskega materiala... 11 2.3.4 Koreninjenje poganjkov... 12 2.3.5 Aklimatizacija rastlin... 13 2.4 Opis akcesije češnje, vključene v raziskavo... 14 3 MATERIALI IN METODE DELA... 15 3.1 Priprava rastlinskega materiala... 15 3.2 Priprava indukcijskega gojišča... 16 3.3 Sterilizacija brstov... 17 3.4 Sterilizacija brstov češnje v letu 2017... 19 3.5 Inokulacija brstov... 19 3.6 Namnoževanje poganjkov češnje... 20 3.7 Koreninjenje poganjkov češnje... 23 3.8 Aklimatizacija rastlinic... 24 3.9 Statistična obdelava podatkov... 25 4 REZULTATI Z RAZPRAVO... 26
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. IV 4.1 Uspeh sterilizacije... 26 4.2 Uspeh namnoževanja... 27 4.3 Uspeh koreninjenja... 28 4.4 Uspeh aklimatizacije... 31 5 SKLEPI... 33 6 VIRI... 35
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. V Kazalo preglednic Preglednica 1: Sestava indukcijskega gojišča.... 16 Preglednica 2: Sestava gojišča MS z vitamini (Murashige in Skoog 1962).... 17 Preglednica 3: Gojišče za namnoževanje z osnovo McCown WPM 1.... 21 Preglednica 4: Sestava gojišča McCown Woody Plant Medium (Lloyd in McCown 1980).... 22 Preglednica 5: Gojišče za namnoževanje z osnovo MS medij z vitamini.... 23 Preglednica 6: Sestava gojišč za koreninjenje.... 24 Preglednica 7: Vpliv preučevanih dejavnikov (fotoperiode in avksina IBA) na število korenin na rastlino.... 30 Kazalo grafikonov Grafikon 1: Odstotek preživelih, okuženih in propadlih brstov lokalnega genotipa češnje s tretjo sterilizacijo (10 min DICA).... 27 Grafikon 2: Delež ukoreninjenih poganjkov pri različnih obravnavanjih.... 29 Grafikon 3: Primerjava rastlin, ki so rasle na gojišču z avksinom, med rastlinami na kontrolnem gojišču.... 31 Kazalo slik Slika 1: Regija izvora češnje in višnje (Kappel in sod 2012).... 4 Slika 2: Enoletni poganjek z brsti.... 15 Slika 3: Neolupljeni (levo) in olupljeni (desno) brsti.... 15 Slika 4: Okuženi češnjevi brsti.... 19 Slika 5: Brst prestavljen v steklen kozarec.... 20
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. VI Slika 6: Namnoženi poganjek pred razrezom (levo) in po razdelitvi na posamezne poganjke (desno).... 28 Slika 7: Primerjava ukoreninjenih poganjkov. Od leve proti desni si sledijo: kontrola, G1S, G1T, G2S, G2T.... 29 Slika 8: Uspešno aklimatizirane rastline, ki so se ukoreninjale na gojišču G1S.... 32 Slika 9: Uspešno aklimatizirane rastline, ki so se ukoreninjale na gojišču G2T (zgoraj) in na kontrolnem gojišču (spodaj).... 32
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 1 1 UVOD Češnja je sadno drevo, ki nas spomladi razveseli z lepimi belimi cvetovi. Lepa ni le na vrtu in v sadovnjakih, temveč tudi na gozdnih robovih, saj tam pred olistanjem gozda med prvimi zacveti divja češnja. Ker divja češnja zacveti zgodaj, je pomembna zlasti čebelam, saj je to njihova prva paša. Mesec dni po cvetenju (začetek maja) nas češnja začne razveseljevati z rdečimi plodovi, katerih sezona lahko traja do konca junija. Slovenija ima bogato tradicijo pridelovanja češenj. Češnje lahko gojimo po vsej Sloveniji, glavnino pa pridelajo na območju Goriškega (Vipavska dolina in Goriška brda) in slovenske Istre (Usenik in sod. 1998). Tako kot ostale sadne rastline se lahko češnje razmnožujejo generativno s semenom (spolno razmnoževanje) in vegetativno (nespolno razmnoževanje). Generativno razmnoževanje je edini način za pridobivanje F1 rastlin (potomci so hibridi) oziroma za proizvodnjo podlag. Vegetativno se razmnožujejo z izdelavo potaknjencev, s cepljenjem in z mikropropagacijo. Na ta način vzgojimo rastlino, ki je identična matični rastlini (Stanković 1981).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 2 1.1 Namen in cilj diplomskega dela Namen diplomskega dela je poiskati uspešen način sterilizacije brstov češnje. Sterilizacija je bistvenega pomena pri uspehu mikropropagacije, saj se pod luskolisti brstov nahaja veliko spor gliv. Cilj diplomskega dela je ugotoviti najprimernejši postopek sterilizacije brstov. Kasneje želimo ugotoviti, katera sestava gojišča za namnoževanje je najučinkovitejša, saj želimo dobiti čim več poganjkov za postopek koreninjenja, pri katerem bomo prav tako ugotavljali najprimernejšo sestavo gojišča. Po uspešnem koreninjenju bomo rastline aklimatizirali in opazovali njihov napredek. V diplomskem delu smo preverjali naslednji dve hipotezi: Hipoteza 1: Koncentracija avksina IBA v gojišču vpliva na koreninjenje poganjkov. Hipoteza 2: Tretiranje izsečkov s temo pozitivno vpliva na koreninjenje poganjkov.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 3 2 PREGLED OBJAV 2.1 Izvor in botanična klasifikacija češnje (Prunus avium L.) Kraljestvo: Plantae rastline Podkraljestvo: Tracheobionta Deblo: Spermatophyta semenke Poddeblo: Magnoliophyta kritosemenke Razred: Magnoliopsida dvokaličnice Podrazred: Rosidae Red: Rosales šipkovci Družina: Rosaceae rožnice Poddružina: Prunoideae koščičasto-plodne rožnice Rod: Prunus L. Podrod: Cerasus Pers. Vrsta: P. avium L. Rod Prunus sestavlja okoli 200 vrst, kamor so vključene vse ekonomsko pomembne sadne vrste pod imenom koščičasto sadje: breskve, češnje, mandljevec, marelice, slive. V ta rod je prav tako vključenih veliko okrasnih vrst rastlin in rastlin, ki se vzgajajo oziroma uporabljajo za kurjavo in v medicinske namene (Potter 2011). Češnja se uvršča v podrod Cerasus, katerega del so tudi njej sorodne vrste: prava ali navadna češnja (Prunus avium L.), višnja (P. cerasus L.), evropska pritlikava češnja (P. fruticosa Pall.), japonska češnja (P. serrulata Lindl.) in rešeljika (P. mahaleb L.) (Ivančič 2002). Češnja je avtohtona na območju Male Azije med Črnim morjem in Kaspijskim jezerom. V Evropo se je razširila pred naselitvijo človeka. Kultiviranje se je verjetno začelo že v antični
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 4 Grčiji in kasneje v antičnem Rimu. Češnja raste na zmernih območjih severne in južne poloble (Lim 2012). Češnja je od nekdaj razširjena po Evropi. O tem pričajo zapisi Teofrasata iz okoli tristo let pred našim štetjem. V prvem stoletju našega štetja je češnjo v svojih delih opisal rimski pisec Pinij. Oba sta v svojih delih pisala o češnjah kot o gojenih sadnih rastlinah. Raziskovalci pišejo, da je bila češnja znana kot prehranski sadež že 4000 do 5000 let pred našim štetjem. Še bolj cenjen pa je bil les, saj so ga uporabljali v stavbarstvu (Smole 2000). Slika 1: Regija izvora češnje in višnje (Kappel in sod 2012). Sorte češenj se med seboj razlikujejo predvsem po morfoloških lastnostih, produktivnosti in prilagojenosti na določeno okolje. Pri češnjah obstajajo zelo velike razlike glede na ekološko prilagojenost in zato se sorte pogosto delijo v ekološke skupine ali ekotipe (npr. mediteranske, zahodnoevropske in srednjeevropske sortne skupine češenj) (Ivančič 2002).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 5 2.2 Splošni opis in gojenje Češnja je srednje visoko do visoko večletno listopadno drevo s pokončno-piramidalno krošnjo, ki lahko v višino zraste od 5 do 25 metrov. Lubje na deblu je temno rjavkasto-črno (Lim 2012). Višino debla določa sadjar in je poljubno visoko. V naravi je pri češnji deblo visoko, saj je rast v prvih letih bujna. V nasadih ne želimo visokih dreves, zato vzgajamo nižja drevesa. Krošnja pri teh drevesih se začne pri 50 do 60 cm od tal. Takim drevesom pravimo nizkodebelna. Kadar vzgajamo posamična drevesa v večjih drevesnih oblikah, jim v tem primeru pustimo večje deblo; od 1,2 do 1,5 metra. Takim drevesom pravimo visokodebelna. Brsti se po funkciji razlikujejo in se na drevesu morfološko jasno razlikujejo. Rodni brst je širši okroglast in večji, medtem ko je lesni oziroma listni brst ozek in na vrhu zašiljen, tako da se na videz lepo razlikujeta (Smole 2000). Mlade veje so zelene in s časom postajajo sivkasto-rjave. Listi so izmenično nameščeni po poganjku, po obliki ločimo eliptične, eliptično razširjene in suličaste liste, ki so od 3 do 13 cm dolgi in od 2 do 6 cm široki. Zgornja stran lista je zelena in gladka, spodnja pa bledo zelena, listni rob je dvojno nazobčan. Cvetovi so združeni v sedečih kobulih po 2 do 5 skupaj. Cvetovi zrastejo iz brstov, ki so nameščeni na kratkih poganjkih, imenovanih majske kitice. Cvetni brsti se odpirajo približno istočasno kot listni brsti. Cvetovi so bele barve, dvospolni, dišeči, s premerom od 1,5 do 3 cm in na 2 do 6 cm dolgih pecljih. Imajo 5-števno cvetno odevalo, po en pestič in mnogo prašnikov. Plodovi so svežega videza, živo rdeče do bordo-vijoličasto črnega odtenka, včasih tudi zlato rumene barve, v premeru so lahko široki od 1,5 do 2,5 cm (Lim 2012). Češnja potrebuje relativno dolgo zimsko mirovanje in mora biti izpostavljena temperaturi nižji od 7 C od 1100 do 1300 ur, odvisno od sorte. To obdobje mirovanja zagotavlja njeno odpornost proti zimskemu mrazu, čeprav ekstremni mrazovi, ki se pojavljajo v nezaščitenem okolju, lahko povzročajo škodo na cvetnih brstih, deblu in vejah. Češnja ni občutljiva glede klime, uspeva v zmerno hladni do nekoliko toplejši klimi. Najdemo jo lahko do nadmorske višine 1400 metrov in daleč na severu (Švedska). Pomembno je samo, da se ne pojavljajo pogosti in močnejši mrazovi. Cvetni brsti zdržijo v zimskem mirovanju temperaturo do -25
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 6 C. Ko se pričnejo fiziološki procesi, prenese temperaturo od -12 do -10 C. Odprti cvetovi prenesejo temperaturo do -1,2 C tako kot ostale sadne vrste. Uspeva tam, kjer letno pade okoli 500 milimetrov padavin, ki so dobro razporejene skozi leto (Stanković 1981). Veliko bolezni in škodljivcev napada češnjo, vendar pridelovalce cenovno največ stane zaščita proti glivičnim boleznim. Ena izmed pomembnejših svetovnih bolezni je listna luknjičavost koščičarjev (Stigmina carpophila). V Evropi je pomembna bolezen za zatiranje cvetna monilija (Monilinia laxa) (Iezzoni 2008). Drugi gospodarsko pomembni bolezni, ki napadata češnje, sta češnjeva listna pegavost (Blumeriella jaapii) in bakterijski rak koščičarjev (Pseudomonas syringae) (Celar in Caf 2016). Pomembnejši škodljivci češenj so črna češnjeva uš (Myzus cerasi), češnjeva grizlica (Caliroa limacina) in češnjeva muha (Rhagoletis cerasi). Veliko škode na plodovih napravijo ptiči (Smole 2000). Zrele češnje so odlične za uživanje sveže in rahlo ohlajene. Plodovi se lahko zamrznejo, vložijo, posušijo oz. iz njih napravijo žganje. Vložene, zamrznjene in sušene češnje so odlična sestavina v številnih receptih sadne solate, pite, pudingi, torte, palačinke, sladoled, piškoti itd. Odlične so tudi za uživanje iz kozarca oziroma iz zamrzovalnika. Smola, ki izteka iz ran na deblu, je aromatična in se lahko žveči namesto žvečilnega gumija (Lim 2012). Češnjevi peclji imajo zdravilno vrednost. V ljudskem zdravilstvu se češnjevi peclji posušijo, iz njih pa pripravljajo čaj, ki naj bi zdravil vnetje sečil, pomagal naj bi v boju proti ledvičnim kamnom ter blažil diarejo (Bodi Eko 2015). Češnjeva semena imajo uporabno vrednost; semena se očistijo, posušijo in se nasujejo v večji žepek iz blaga. Ta žepek se nato pogreje na radiatorju oziroma v mikrovalovni pečici in se lahko uporablja namesto termoforja. Svetovna pridelava češenj se giblje okoli 2,5 milijona ton. V letu 2016 je na prvem mestu po pridelavi Turčija s 600.000 tonami, sledijo ji Združene države Amerike z 290.000 tonami in nato Iran z 220.000 tonami. V Sloveniji se je v letu 2016 pridelalo 4079 ton češenj (FAO 2016).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 7 2.3 Razmnoževanje in vitro Tehnika, pri kateri gojimo rastline, organe, tkiva ali posamezne celice na definiranih trdih ali tekočih hranilnih podlagah ali gojiščih v laboratorijskih sterilnih razmerah, imenujemo rastlinska tkivna kultura. Del rastline, ki ga vcepimo v kulturo, imenujemo izseček (Ravnikar 1996). Da lahko rastline in vitro razmnožujemo, nam omogoča totipotentnost rastlin, saj se lahko iz ene rastlinske celice razvije nova rastlina. Prvi, ki je gojil izolirane rastlinske celice, je bil Haberlandt (1902). Izolirane rastlinske celice je gojil na preprostem gojišču. Niso bile sposobne razmnoževanja, vendar so pridobivale na volumnu. Temu so sledili še številni drugi poskusi, ki so vodili do uspešnih postopkov in vitro gojenja rastlinskih vrst. Prva masovna produkcija kloniranih rastlin z uporabo mikropropagacije je bila v 80. letih prejšnjega stoletja (Vižintin 2014). Tehnika in vitro je posebej primerna pri rastlinah, ki se in vivo s težavo vegetativno razmnožujejo. V hortikulturi so pomembnejše mikropropagirane vrste, na primer iz rodu Anthurium, Begonia, Cyclamen, Ficus, Petunia in drugih (Vižintin 2014). Omogočanje dela v sterilnih razmerah nam zagotavlja laboratorij za rastlinske tkivne kulture. Uporabljamo lahko opremo, ki je del vsakega laboratorija, in opremo, ki je specifična za izvedbo posamezne vrste dela. V takšnem laboratoriju je potrebna komora za aseptično delo laminarij, komora za gojitev rastlinskega materiala, naprava za sterilizacijo opreme avtoklav, deionizator vode in druga oprema (ph meter, dozator gojišča, mikroskop, mikrovalovna pečica, sterilizator orodja, hladilnik in drugo) (Bohanec 1992).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 8 2.3.1 Mikropropagacija Mikropropagacija je način razmnoževanja rastlin pod sterilnimi in kontroliranimi pogoji. Ti pogoji vključujejo primerno temperaturo, vlago, razmerje med svetlobo in temo ter primerno založenostjo gojišč s hranili. Pri mikropropagaciji lahko dobimo veliko število novih rastlin v zelo kratkem času (Akin-Idowu in sod. 2009). Pri tkivnih kulturah poznamo dve glavni poti regeneracije brstov: po poti iz apikalnih in aksilarnih meristemov ter po poti iz adventivnih meristemov (nastanejo lahko neposredno iz inokuliranega tkiva oz. vmesna faza je lahko kalus) (Bohanec 1992). Mikropropagacija ponuja številne prednosti, ki niso možne pri običajnem razmnoževanju rastlin: Hitro namnoževanje rastlin, ki so si genetsko enake (kloni). Iz vsakega izsečka lahko dobimo tisoče novih rastlin v zelo kratkem času. Razmnoževanje rastlin, pri katerih je problem pomanjkanje semena oziroma opraševalcev, ki so pomembni za nastanek semena. Obnavljanje cele rastline iz rastlinskih celic, ki so bile gensko prilagojene. Pridelavo rastlin v sterilnih pogojih, ki imajo zmanjšano možnost prenašanja bolezni, škodljivcev in patogenov. Pridelavo rastlin iz semen, ki imajo majhno možnost kalitve in rasti (orhideje in muholovke). "Očiščenje" rastlin virusov in drugih okužb in hitro razmnoževanje rastlin, imenovanih "čisti material", za potrebe hortikulture in kmetijstva (Akin-Idowu in sod. 2009). Pri procesu mikropropagacije si faze sledijo v naslednjem vrstnem redu: Faza 0: Priprava materialnih rastlin Faza 1: Iniciacija kulture Faza 2: Razmnoževanje poganjkov
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 9 Faza 3: Podaljševanje poganjkov in koreninjenje Faza 4: Aklimatizacija (Bohanec 1992) Pri mikropropagaciji so lahko težavne različne faze pri različnih rastlinah, na koncu pa je potrebno obvladati prav vse (Bohanec 1992). V našem primeru je bila najtežja faza iniciacije kulture. Preden začnemo s postopkom mikropropagacije, je treba pozornost nameniti selekciji rastline. Rastlina mora biti vrstno in sortno značilna in brez simptomov bolezni (George in Debergh 2008). V in vitro razmerah lahko razmnožujemo praprotnice, golosemenke in kritosemenke. Najbolj raziskano je gojenje rastlin iz družine Solanaceae (razhudnikovke). Ena prvih vzpostavljenih kultur so bile korenine paradižnika, tobak pa je bil modelna rastlina v in vitro pogojih. Lesnate rastline, predvsem iglavce, je težje gojiti, ker so problemi s periodno rastjo in s pomlajevanjem. Prav tako je enokaličnice težje gojiti od dvokaličnic (Ravnikar 1996). Tkivo, ki ga pridobimo iz rastline, se imenuje izseček. Zaradi totipotentnosti se izseček lahko odvzame iz katerega koli dela rastline. Najbolj pogosto uporabljeni izsečki v tkivnih kulturah so meristemi, kot so končni brst, stranski brsti in rastni vršiček korenin. Ta tkiva imajo visoko raven delitve celic (Akin-Idowu in sod. 2009). Prvi postopek mikropropagacije je odbira primernega tkiva ter predhodno ali naknadno razkuževanje. Rastlinski material je lahko okužen z glivami in bakterijami, zunanje in notranje, in temu so tudi prilagojeni ukrepi za razkuževanje (Bohanec 1992). Druga faza je namnoževanje poganjkov. To je faza, ko izseček zraste in začne oblikovati nove poganjke. Če nastane čim večje število poganjkov v čim krajšem času, je postopek uspešen. V tej fazi običajno gojiščem dodamo citokinine, avksine pa izpustimo (Bohanec 1992).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 10 Koreninjenje poganjkov je tretja in zelo pomembna faza katerega koli in vitro razmnoževanja. Za koreninjenje je potreben poseben medij, na katerem bodo iz poganjkov zrasle korenine (George in Debergh 2008). V nekaterih primerih rastline same od sebe poženejo korenine na gojišču za namnoževanje. V drugem primeru pa obstajajo rastline, ki jih je težko koreniniti. To velja zlasti za lesnate rastline, tudi sadno drevje in okrasne rastline. Zadnja faza mikropropagacije je aklimatizacija. V tej fazi poganjke, ki so rasli v sterilnih pogojih, navajamo na zunanje okolje (Bohanec 1992). Znanje mikropropagacije številnih lesnatih rastlin je zelo razširjeno. To prav tako velja za vrste rodu Prunus, kjer pa nekateri koraki mikropropagacije niso dovolj uspešni (Osterc in sod. 2004). Yang (1994, cit. po Osterc in sod. 2004) navaja, da so največji problemi pri koreninjenju poganjkov. 2.3.2 Sterilizacija rastlinskega materiala V osnovi so v tkivnih kulturah možni štirje viri okužb: rastlina (notranja in zunanja), gojišče (nepravilno razkuženo gojišče), zrak in delavci (površno delo). Najbolj pomembna od teh je rastlina; rastlinski material bi moral biti razkužen, preden se inokulira na gojišče. Preden se lotimo sterilizacije, moramo odstraniti vse odmrle dele in morebitno zemljo. Nato se izsečki spirajo s čisto vodo, brste po možnosti tudi olupimo. Po opravljenih zgoraj naštetih postopkih lahko pričnemo s sterilizacijo, in sicer izsečke namočimo v 70-odstotni alkohol za eno minuto (96-odstotni alkohol je premočan in jih izsuši), da odstranimo zračne mehurčke (Pierik 1997). Natrijev hipoklorit (NaClO) v kombinaciji z detergentom (Tween 20 ali 80) za boljšo omočljivost se največ uporablja za sterilizacijo tkiv. Poleg tega se uporabljata še kalcijev hipoklorit in živosrebrov klorit, manj običajno se uporabljajo vodikov peroksid, srebrov nitrat in bromova raztopina. Med razkuževanjem je treba tekočino mešati ročno oziroma s pomočjo magnetnega mešala. Na uspešnost razkuževanja vplivata koncentracija in čas tretiranja. Dejansko je treba za vsak primer posebej preučiti uspešno kombinacijo (Bohanec 1992).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 11 Dikloroizocianurna kislina (DICA), s kemijsko formulo C3Cl2N3NaO3, je v obliki belega prahu in se uporablja kot vir prostega klora. Večinoma se uporablja za razkuževanje bazenov in v prehrambeni industriji. V nekaterih primerih se uporablja za dezinfekcijo pitne vode (WHO 2008). Hammat in Grant (1996) navajata, da je bil uspeh sterilizacije več kot 90-odstoten z uporabo 0,8-odstotne raztopine natrijevega hipoklorita. Za sterilizacijo so uporabljali divjo sorto češnje. 2.3.3 Namnoževanje rastlinskega materiala Druga faza mikropropagacije je namnoževanje poganjkov. To je faza, ko izseček začne oblikovati nove poganjke. Če nastane čim večje število poganjkov v čim krajšem času, je postopek uspešen. V tej fazi gojiščem dodajamo citokinine, avksine pa izpustimo oziroma jih dodamo v manjših koncentracijah (Bohanec 1992). Pri mikropropagaciji lahko v zelo kratkem času dobimo veliko število poganjkov. Večkrat, ko poganjke prestavimo na novo gojišče, več poganjkov dobimo. Pri tem moramo odstranjevati kalus (George in Debergh 2008). Pogost in nezaželen pojav pri mikropropagaciji, ki lahko nastopi že po inokulaciji, je vitrifikacija. Značilnost tega pojava je, da poganjki postanejo "steklasti" in prosojni, tkiva so polna vode in nabrekla. Na vitrifikacijo so nekatere rastline bolj in druge manj občutljive. Hitrost rasti in stopnja vitrifikacije sta v korelaciji; večji odmerki hormonov (citokinini) zvišujejo vitrifikacijo, medtem ko sta pri manjši koncentraciji hormona rast in razraščanje upočasnjena (Bohanec 1992). Durkovič (2006) navaja, da so največ aksilarnih poganjkov dobili ob kombinaciji 0,5 mg/l BAP in 0,05 mg/l thidiazuron. Tančeva Cmarić in Kajba (2016) navajata, da so ob
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 12 koncentraciji 0,5 mg/l BAP dobili v povprečju 2 do 3 nove aksilarne poganjke, brez kalusa na osnovi in brez znakov vitrifikacije. Koncentracija 1,0 mg/l BAP je bila dokazano najbolj učinkovita. Internodiji na poganjkih so bili normalne velikosti, listi so bili normalnih velikosti, barva listov je bila naravno zelena z malo razvitega kalusa ob osnovi. Ob koncentraciji 1,5 mg/l BAP je bila raven namnoževanja poganjkov najvišja, vendar je bila kakovost poganjkov slaba. Ob koncentraciji 2 mg/l BAP je bilo število namnoženih poganjkov najnižje, ob osnovi poganjka je bilo povišano nastajanje kalusa. 2.3.4 Koreninjenje poganjkov Poznamo dva načina koreninjenja poganjkov: koreninjenje in vitro in koreninjenje in vivo (koreninjenje v substratu) (Bohanec 1992). Večina virov mikropropagacije opisuje koreninjenje in vitro, čeprav se sedaj povečuje zanimanje za koreninjenje in vivo, posebej za komercialno rabo. Koreninjenje in vivo ima veliko prednosti. Najbolj pomembna je ta, da je lažje v substrat podtakniti "potaknjenec" kot pa že koreninjeno rastlino. Drugi razlogi koreninjena in vivo, ki so boljši od koreninjenja in vitro, so: koreninski sistem, ki se je razvil in vitro, mogoče ni funkcionalen, možnosti, da bodo in vitro vzgojene korenine poškodovane med presajanjem, so velike, kasneje se lahko pojavijo koreninske in stebelne bolezni, za rastline, ki se težje koreninijo, je lažje vzpostaviti pogoje koreninjenja in vivo kot in vitro (Debergh in Read 1991). Odločilna je tudi velikost poganjkov, ki jih koreninimo; ne le za fazo koreninjenja, temveč tudi za fazo aklimatizacije. Med posameznimi rastlinami so velike razlike; premajhni poganjki velikokrat ne koreninijo, preveliki pa lahko kasneje propadejo. Po mnenju nekaterih raziskovalcev in vitro nastale korenine slabo delujejo zaradi nerazvitih koreninskih laskov in kasneje delno odmrejo. Za koreninjenje uporabljamo gojišča z znižano koncentracijo saharoze in agarja (da jih lažje izvlečemo), znižano koncentracijo makro- in mikroelementov, brez hormonov oziroma samo z avksini (IBA > IAA > NAA) (Bohanec 1992).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 13 Tančeva Cmarić in Kajba (2016) navajata, da so ob uporabi avksinov IBA in IAA imeli 90- odstotni uspeh koreninjenja. Rastline so razvile od 3 do 7 koreninic. Quambusch in sod. (2017) so razmnoževali češnje v in vitro pogojih z uporabo fotoperiode (svetlo/temno) in navajajo, da so rastline, ki so od začetka bile za 4 dni postavljene v temo, pognale večje število korenin. Pri sorti 'Achilleus', ki je bila inokulirana na gojišče z 0,44 mg/l IBA, je bil uspeh koreninjenja v povprečju višji za 65 %, na kontrolnem gojišču je bil uspeh koreninjenja v povprečju višji za 84 %. 2.3.5 Aklimatizacija rastlin Zadnja faza mikropropagacije je aklimatizacija rastlin. V tej fazi rastline, ki so rasle v sterilnih razmerah, ponovno navajamo na zunanje, nekontrolirano okolje. Pri rastlinah, ki niso razvile epikutikularnega voska, je posebej težavno, ker jim listne reže ne delujejo in imajo slab koreninski sistem. Uspeh aklimatizacije je odvisen od: vpliva predhodnih laboratorijskih postopkov in od dejavnikov v procesu aklimatizacije. V predhodnih postopkih izbira gojišča, na katerem smo gojili rastline oziroma jih koreninili, najbolj vpliva na potek aklimatizacije. Substrat prav tako vpliva na uspeh aklimatizacije. Substrata ne avtoklaviramo, saj lahko pri tem nastanejo škodljive snovi, poleg tega je sterilen substrat bolj dovzeten za okužbo z glivicami. Substrati so lahko pripravljeni iz različnih "sestavin", to so mešanica šote, komposta, peska in drugih "sestavin". Vsaka rastlina ima različne zahteve po hranilih. Nekatere rastline v fazi mikropropagacije propadejo, druge pa potrebujejo dodatek tekočih gnojil za uspešno rast (Bohanec 1992). Tančeva Cmarić in Kajba (2016) navajata, da je bil uspeh aklimatizacije divje češnje 70 do 90-odstoten in da je aklimatizacija odvisna od sorte. Puster (2011) navaja, da je bil uspeh aklimatizacije podlage češnje sorte 'Gisela 5' v mini rastlinjaku 11,5-odstoten. Večino rastlin je uničila gniloba zaradi vlage, ki se je kopičila v mini rastlinjaku. V meglilni komori v rastlinjaku so uspešno aklimatizirali 36,4 % rastlin.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 14 2.4 Opis akcesije češnje, vključene v raziskavo Češnja, ki smo jo vključili v raziskavo, je lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah. Gre za akcesijo, ki se hrani v Slovenski rastlinski genski banki koščičarjev, za katero skrbi Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru. To je lokalni genotip, ki je prisoten na več mestih v okolici Brežic. Originalno staro drevo najverjetneje izvira iz področja okoli Sromelj (Sromlje naselje, ki je oddaljeno približno 15 kilometrov severno od Brežic). Drevo, s katerega so bili vzeti poganjki, je bilo precepljeno iz približno 50 let starega drevesa. Češnja ima srednjo dolžino vegetacijskega obdobja. Za razliko od nekaterih drugih sort češenj, ki imajo izrazito srčasto obliko plodov, so ti srednje debeli, z razširjeno-ovalnim spodnjim delom. Plodovi dozorijo med 25. majem in 5. junijem. Pecelj je v primerjavi z novejšimi sortami razmeroma dolg. Rastline so verjetno visoko avtokompatibilne, saj imajo tudi osamljena drevesa bolj ali manj normalno rodnost. Veje so normalno razprostranjene (Ivančič, ustni vir).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 15 3 MATERIALI IN METODE DELA 3.1 Priprava rastlinskega materiala Poskus smo zastavili v laboratoriju za rastlinske tkivne kulture na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru. V letu 2016 smo v sadovnjaku genske banke fakultete nabrali enoletne poganjke dveh sort češenj, in sicer sorte 'Georgia' in lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah. V laboratoriju smo iz poganjkov s skalpelom previdno odstranili brste. Z brstov smo odstranili luskoliste, saj se pod njimi nahaja veliko spor gliv, ki so vir okužb. Olupljene brste smo ločene po sortah dali namakat v vodo. Slika 2: Enoletni poganjek z brsti. Slika 3: Neolupljeni (levo) in olupljeni (desno) brsti.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 16 3.2 Priprava indukcijskega gojišča Indukcijsko gojišče smo pripravili tako, da smo vse sestavine stehtali (navedene so v Preglednici 1) in jih presipali v čašo z bidestilirano vodo. Osnova gojišča je bil MS z vitamini (Murashige in Skoog 1962) (Preglednica 2). Čaša je bila postavljena na teflonsko magnetno mešalo, s katerim smo vse sestavine premešali, razen agarja, ki smo ga dodali na koncu. Ko so bile sestavine raztopljene, smo vsebino čaše prelili v merilno bučko in določili končni volumen. Raztopino smo nato prelili nazaj v čašo in med mešanjem in dodajanjem 1M NaOH in 1M HCl umerili ph vrednost. Pripravljeno gojišče smo prelili v steklenice, mu dodali agar in ga avtoklavirali 15 minut pri temperaturi 121 C in pritisku 1,1 bara. Po končanem postopku avtoklaviranja smo gojišče ponovno utekočinili v mikrovalovni pečici in ga razlili v sterilne petrijevke 90 mm 15 mm. V petrijevkah smo ga pustili, da se je ohladil in strdil. Preglednica 1: Sestava indukcijskega gojišča. Sestavina MS medij z vitamini Saharoza Agar Količina 4,4 g/l 30 g/l 7 g/l ph 5,8
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 17 Preglednica 2: Sestava gojišča MS z vitamini (Murashige in Skoog 1962). Sestavina Količina mg/l Makroelementi CaCl 2 332,02 KH 2PO 4 170,00 KNO 3 1900,00 MgSO 4 180,54 NH 4NO 3 1650,00 Mikroelementi CoCl 2 6H 2O 0,025 CuSO 4 5H 2O 0,025 FeNaEDTA 36,70 H 3BO 3 6,20 KI 0,83 MnSO 4 H 2O 16,90 Na 2MoO 4 2H 2O 0,25 ZnSO 4 7H 2O 8,60 Vitamini Glicin 2,00 Myo-Inositol 100,00 Nikotinska kislina 0,50 Piridoksin 0,50 Tiamin 0,10 3.3 Sterilizacija brstov Sterilizacijo brstov smo nekajkrat ponavljali, saj je bila večkrat neuspešna; brsti so propadli oziroma so še vedno bili okuženi. Pred sterilizacijo smo si morali pripraviti raztopine razkužilnih sredstev. Uporabili smo dikloroizocianurno kislino (DICA) in natrijev hipoklorit. Za pripravo dikloroizocianurne kisline (DICA) smo stehtali 4,15 g DICA in jo zmešali v 250 ml sterilne vode. Natrijev hipoklorit smo uporabljali v 10 % in 1 %
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 18 koncentraciji. Vsakemu razkužilnemu sredstvu smo dodali 6 kapljic detergenta 'Tween' za boljšo omočljivost. Pred sterilizacijo smo brste mešali (40 sekund oz. 1 minuto) v 70-odstotnem etanolu. Pri mešanju smo si pomagali z magnetnim mešalom. Sterilizacije so se med sabo razlikovale po času, razkužilnemu sredstvu in koncentraciji (NaClO; 1 % in 10 %). Prvi dve sterilizaciji smo opravljali z zaprtimi brsti, v tretjo sterilizacijo smo vključili odprte in dva zaprta brsta. V četrto sterilizacijo smo vključili odprte brste. Prvo sterilizacijo smo opravljali 29. 3. 2016: 1. način: 40 sekund 70 % EtOH + 20 min DICA (češnja 'Georgia') 2. način: 40 sekund 70 % EtOH + 20 min 10 % NaClO (češnja lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah) Drugo sterilizacijo smo opravljali 12. 4. 2016: 1. način: 1 min 70 % EtOH + 7 min DICA (češnja 'Georgia') 2. način: 1 min 70 % EtOH + 9 min 1 % NaClO (češnja lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah) Tretjo sterilizacijo smo opravljali 20. 4. 2016: 1. način: 1 min 70 % EtOH + 10 min DICA (obe sorti češenj) Četrto sterilizacijo smo opravljali 9. 5. 2016: 1. način: 1 min 70 % EtOH + 10 min DICA (češnja lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah)
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 19 3.4 Sterilizacija brstov češnje v letu 2017 Spomladi leta 2017 smo ponovno opravljali sterilizacijo češnje, in sicer sorto 'Regina x Lapins'. 21. 3. 2017 smo v sadovnjaku Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede v Mariboru nabrali enoletne poganjke z brsti. Brste smo sterilizirali samo z enim načinom, in sicer 1 min 70 % EtOH + 7 min DICA. Izsečke smo inokulirali na indukcijsko gojišče. Po določenem času je večina izsečkov propadla oziroma so bili okuženi. Nekaj izsečkov je ostalo vitalnih, vendar so po določenem času tudi ti propadli. Sklepali smo, da na uspešnost sterilizacije vpliva tudi genotip, ki ga steriliziramo. Slika 4: Okuženi češnjevi brsti. 3.5 Inokulacija brstov Razkužene brste smo po sterilizaciji inokulirali na ohlajeno in strjeno indukcijsko gojišče, ki smo ga predhodno nalili v petrijevke. V petrijevke, velikosti 90 mm 15 mm, smo dali po 5 brstov. Brste smo inokulirali s pomočjo pincet, ki smo jih sproti razkuževali v električnem visokotemperaturnem grelcu pri temperaturi 250. Petrijevko smo pokrili s
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 20 pokrovom in jih zavarovali s parafilmom. Parafilm preprečuje vdor škodljivih mikroorganizmov v petrijevko in izhlapevanje vode iz petrijevke. Na pokrov petrijevke smo napisali način sterilizacije, sorto češnje in datum. Tako sterilizacija kot inokulacija brstov sta potekali pod aseptičnimi pogoji v brezprašni komori (laminarij). Brste smo nato opazovali na vsake tri dni in rezultate vpisovali v tabelo. Kar je bilo zdravih brstov, smo prestavili na sveže gojišče, kar je bilo okuženih oziroma propadlih brstov, smo zavrgli. Ko so bili brsti preveliki za v petrijevke, smo jih prestavili na sveže gojišče v steklene kozarce. Brste smo gojili v rastni komori pri temperaturi 22 in fotoperiodi 16/8 ur (svetloba/tema). Slika 5: Brst prestavljen v steklen kozarec. 3.6 Namnoževanje poganjkov češnje Poganjke, ki so ostali vitalni, smo dali na gojišče za namnoževanje (Preglednica 3). Za osnovo smo vzeli gojišče McCown woody plant medium (Lloyd G in McCown 1980) (Preglednica 4). Ker so bile rastline vitrificirane, smo v gojišču kasneje zmanjšali koncentracijo citokininov, ker lahko prevelika koncentracija le-teh povzroča vitrifikacijo.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 21 Sestavine smo stehtali in jih raztopili v bidestilirani vodi. Čaša je bila postavljena na magnetno mešalo, ki je bilo v pomoč pri topljenju sestavin. Za sestavine, ki smo jih dodali v majhnih količinah, smo si najprej pripravili založne raztopine, ki smo jih kasneje odpipetirali. V merilni bučki smo določili končni volumen gojišča. Raztopino smo nato ponovno prelili v čašo, kateri smo med mešanjem in dodajanjem 1 M NaOH in 1 M HCl raztopine umerili ph. Tako pripravljenemu gojišču smo dodali agar, ga premešali in v mikrovalovni pečici segrevali tako dolgo, da je gojišče dvakrat zavrelo. Gojišče smo nato s pomočjo dozatorja nalili v steklene kozarčke (70 ml). Zaprte kozarčke smo dali avtoklavirati za 15 minut pri temperaturi 121 C. Ko je bil postopek avtoklaviranja končan, smo kozarčke zložili na pult, da se ohladijo in da se gojišče strdi. V strjeno in ohlajeno gojišče smo inokulirali poganjke. Ko se je poganjek razrasel, smo ga razdelili in poganjke inokulirali na sveže gojišče. Preglednica 3: Gojišče za namnoževanje z osnovo McCown WPM 1. Sestavina Količina McCown WPM 1 2,358 g/l 2,358 g/l 2,358 g/l Saharoza 20 g/l 20 g/l 20 g/l Myo-Inositol 100 mg/l 100 mg/l 100 mg/l BAP 2 0 mg/l 1 mg/l 0,2 mg/l NAA 3 0 mg/l 0,01 mg/l 0,01 mg/l Nikotinska kislina 0 mg/l 1 mg/l 1 mg/l Piridoksin 0 mg/l 1 mg/l 1 mg/l Tiamin 0 mg/l 1 mg/l 2 mg/l Agar 8 g/l 8 g/l 8 mg/l ph 5,8 5,8 5,8 1 Woody plant medium (medij za lesnate rastline) 2 6-benzilaminopurin (citokinin) 3 1-naphthalene acetic acid (avksin)
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 22 Preglednica 4: Sestava gojišča McCown Woody Plant Medium (Lloyd in McCown 1980). Sestavina Količina mg/l Makroelementi CaCl 2 72,50 Ca(NO 3)2 4H 2O 471,26 KH 2PO 4 170,00 K 2SO 4 990,00 MgSO 4 180,54 NH 4NO 3 400,00 Mikroelemeti CuSO 4 5H 2O 0,25 FeNaEDTA 36,70 H 3BO 3 6,20 MnSO 4 H 2O 22,30 Na 2MoO 4 2H 2O 0,25 ZnSO 4 7H 2O 8,60 Ker so poganjki bili vitrificirani in se niso hoteli razraščati, smo pripravili novo gojišče z osnovo MS medij z vitamini, brez založnih raztopin in z zmanjšano količino agarja. Sestavine gojišča s količinami so navedene v Preglednici 5. Gojišče smo pripravili po enakem postopku, kot je opisan zgoraj. Na tem gojišču so se poganjki hitro razraščali in smo v zelo kratkem času prišli do želenega števila poganjkov.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 23 Preglednica 5: Gojišče za namnoževanje z osnovo MS medij z vitamini. Sestavina MS medij z vitamini Saharoza Myo-Inositol BAP 1 NAA 2 Agar Količina 4,4 g/l 20 g/l 100 mg/l 0,5 mg/l 0,01 mg/l 7 g/l 1 6-benzilaminopurin (citokinin) 2 1-naphthalene acetic acid (avksin) ph 5,8 3.7 Koreninjenje poganjkov češnje Ko smo dobili ustrezno število poganjkov, smo pripravili gojišče za koreninjenje. Gojišče za koreninjenje je vsebovalo zmanjšano količino MS medija z vitamini in agarja in je bilo brez citokininov. Agarja smo dodali manj zato, da se ob aklimatizaciji rastlin gojišče lažje loči od korenin in da se korenine lažje razraščajo v gojišču. Citokininov nismo dodali zato, ker preprečujejo rast korenin. V gojišče smo dodali avksin IBA (indol-3-maslena kislina) za koreninjenje v različnih koncentracijah. Pripravili smo tri gojišča, in sicer kontrolno gojišče (K), ki ni vsebovalo avksina, gojišče G1, ki je vsebovalo 0,3 mg/l avksina, in gojišče G2 z 1 mg/l avksina. Gojišča smo pripravili z istim postopkom kot gojišča za namnoževanje. Poganjke smo na kontrolno gojišče inokulirali 25. 1. 2018. Inokulirali smo 30 poganjkov. Na G1 gojišče smo poganjke inokulirali 30. 1. 2018. Inokulirali smo 60 poganjkov: 30 poganjkov smo dali direktno v rastno komoro, medtem ko smo 30 poganjkov dali na pladenj in jih zavili z aluminijasto folijo tako, da so bili v temi. V temi smo jih pustili 6 dni. Po šestih dneh smo pladenj odkrili. Na G2 gojišče smo poganjke inokulirali 1. 2. 2018. S poganjki na
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 24 gojišču G2 smo napravili isto kot s poganjki na gojišču G1. V Preglednici 6 so navedene sestavine in količina sestavin v gojišču. Preglednica 6: Sestava gojišč za koreninjenje. Sestavine Kontrola G1 G2 MS medij z vitamini 2,2 g/l 2,2 g/l 2,2 g/l Myo-Inositol 100 mg/l 100 mg/l 100 mg/l Saharoza 20 g/l 20 g/l 20 g/l 1 IBA 0,0 mg/l 0,3 mg/l 1 mg/l Agar 6 g/l 6 g/l 6 g/l ph 5,8 5,8 5,8 1 indol-3-maslena kislina 3.8 Aklimatizacija rastlinic 21. 3. 2018 smo vrednotili nastanek korenin na treh različnih gojiščih, in sicer po petinpetdesetih dneh pri kontrolnem gojišču, po petdesetih dneh pri gojiščih G1S in G1T in po oseminštiridesetih dneh pri gojiščih G2S in G2T. Pri rastlinah smo vrednotili nastanek korenin, nastanek kalusa ob bazi poganjka, nastanek kalusa, iz katerega izraščajo korenine, poganjke brez kalusa in brez korenin ter okužene in propadle. Rastline z lepimi koreninami smo dali aklimatizirat. Rastline smo previdno izpulili iz gojišča in temeljito, s pomočjo spiranja pod curkom mlačne vode, povsem odstranili ostanke gojišča iz korenin. Pri odstranjevanju gojišča smo ravnali previdno, saj so imele rastlinice krhke korenine. Rastlinice smo posadili v fini substrat v mini rastlinjake, jih zalili, popršili, označili in pokrili. Rastline smo med aklimatizacijo zalivali in pršili. Po določenem času, ko so rastline zrasle, smo jih presadili v lončke, lončke smo vseeno pustili v mini rastlinjakih, da so rastline imele dovolj zračne vlage. 16. 5. 2018 smo prešteli uspešno aklimatizirane sadike in jih odnesli v rastlinjak Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede Maribor.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 25 3.9 Statistična obdelava podatkov Dobljene podatke smo analizirali s statističnim programom Statgraphic Centurion XV.II. S programom smo analizirali podatke, ki smo jih dobili pri koreninjenju. Za določitev statistično značilnih razlik med količino avksina in med fotoperiodo smo uporabili funkciji Multifactor ANOVA in One-Way ANOVA. Za ugotavljanje razlik med srednjimi vrednostmi smo uporabili Multiple Range Test (Tukey HSD α=0,05). Naredili smo dvofaktorski poskus, kjer smo analizirali vpliv dveh dejavnikov: količino avksina in fotoperiodo. Preverili smo, ali obstajajo med preučevanimi dejavniki interakcije. V poskus smo vključili 2 koncentraciji avksina v gojišču in fotoperiodo svetlo/temno, torej skupaj 4 obravnavanja. Kontrolno gojišče smo imeli za primerjavo.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 26 4 REZULTATI Z RAZPRAVO 4.1 Uspeh sterilizacije Sterilizacijo smo opravljali štirikrat. V prvo sterilizacijo (20 min DICA in 20 min natrijev hipoklorit) smo vključili 42 brstov češnje sorte 'Georgia' in 41 brstov češnje lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah. Pri prvi sterilizaciji so bili vsi brsti okuženi ali propadli (ožgani). V drugo sterilizacijo (7 min DICA in 9 min natrijev hipoklorit) smo vključili 21 brstov češnje sorte 'Georgia' in 28 brstov češnje lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah. Tudi pri tem načinu sterilizacije so bili vsi brsti okuženi ali propadli. V tretjo sterilizacijo (10 min DICA) smo vključili 21 odprtih in 2 zaprta brsta češnje sorte 'Georgia', ki so po določenem času bili vsi okuženi ali propadli in 35 odprtih brstov češnje lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah. Pri tem genotipu je ostalo 7 brstov vitalnih, ostali so bili vsi okuženi ali propadli. V četrto sterilizacijo (10 min DICA) smo vključili 17 brstov češnje lokalni genotip iz vasi Črnc pri Brežicah. Pri tej sterilizaciji so bili vsi brsti okuženi ali propadli. Okužbe so večinoma bile glivične. Kot uspešen se je torej izkazal samo en način sterilizacije, in to samo pri enem genotipu. Grafikon 1 prikazuje razmerje med preživelimi (7 brstov 20 %), okuženimi (24 brstov 68,6 %) in propadlimi (4 brsti 11,4 %) brsti tretje sterilizacije pri lokalnem genotipu češnje iz vasi Črnc.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 27 11% 20% 69% Preživeli Okuženi Propadli Grafikon 1: Odstotek preživelih, okuženih in propadlih brstov lokalnega genotipa češnje s tretjo sterilizacijo (10 min DICA). Kljub nizkemu odstotku preživelih in vitalnih brstov smo bili z rezultatom zadovoljni, saj smo uspeli vzpostaviti sterilno kulturo, ki je osnova za nadaljnje delo in razmnoževanje. 4.2 Uspeh namnoževanja Z namnoževanjem smo pričeli 4. 7. 2016. Na začetku smo za osnovo v gojišču uporabljali McCownov Woody Plant Medium (medij za lesnate rastline) z dodanimi založnimi raztopinami in citokininom (Preglednica 4). Kasneje smo vsebnost citokinina in agarja zmanjšali, saj so bili poganjki vitrificirani in se niso namnoževali. V nadaljevanju poskusa smo za osnovo v gojišču vzeli MS medij z vitamini (Preglednica 2), kateremu smo prav tako dodali citokinin BAP v koncentraciji 0,5 mg/l. Na novem gojišču se vitrifikacija ni več pojavljala, pojavljati pa so se začeli novi poganjki. V roku petih mesecev smo iz desetih poganjkov dobili preko 120 novih poganjkov. V povprečju smo iz enega poganjka dobili 4 do 6 novih aksilarnih poganjkov, v nekaterih primerih pa tudi preko 10 novih aksilarnih poganjkov.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 28 Slika 6: Namnoženi poganjek pred razrezom (levo) in po razdelitvi na posamezne poganjke (desno). 4.3 Uspeh koreninjenja V poskus smo vključili dva preučevana dejavnika, in sicer količina avksina IBA v gojišču in vpliv tretiranja s temo. Vključili smo 150 poganjkov češenj. 30 smo jih vrednotili na kontrolnem gojišču, 60 smo jih vrednotili na gojišču z manjšo vsebnostjo avksina (0,3 mg/l IBA), in sicer 30, ki so bili na svetlem, in 30, ki so bili v temi, 60 pa smo jih vrednotili na gojišču z večjo vsebnostjo avksina (1 mg/l IBA) in sicer 30, ki so bili na svetlem, in 30, ki so bili v temi. Po določenem času (kontrola 55 dni, G1 50 dni in G2 48 dni) smo vrednotili nastale korenine. Pri poganjkih, ki so bili inokulirani na gojišče G2T (1 mg/l IBA), je bil uspeh koreninjenja 100-odstoten. Pri poganjkih, ki so bili na gojišču G2S, je bil uspeh koreninjenja 90-odstoten. Poganjki na gojišču G1 (0,3 mg/l IBA) so koreninili 60-odstotno, pri čemer ni bilo razlike med tistimi na svetlobi in tistimi, ki smo jih izpostavili temi. Uspeh koreninjenja na kontrolnem gojišču (0,0 mg/l IBA) je bil 50-odstoten. Podatki so prikazani v Grafikonu 2.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 29 Slika 7: Primerjava ukoreninjenih poganjkov. Od leve proti desni si sledijo: kontrola, G1S, G1T, G2S, G2T. 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% Kontrola G1 Svetlo G1 Temno G2 Svetlo G2 Temno Grafikon 2: Delež ukoreninjenih poganjkov pri različnih obravnavanjih. Analiza variance je pokazala statistično značilne razlike pri številu korenin med preučevanima dejavnikoma (tema in dodan avksin). Rastlinam, ki smo jih izpostavili temi, je statistično značilno zraslo več korenin kot tistim na svetlem. Prav tako je količina avksina v gojišču statistično vplivala na število korenin (Preglednica 7).
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 30 Preglednica 7: Vpliv preučevanih dejavnikov (fotoperiode in avksina IBA) na število korenin na rastlino. Vir variabilnosti Število korenin (P-vrednost) Fotoperioda (F) 0,0024** Avksin (A) 0,0000** F A 0,0053** Dejavnik Srednja vrednost (korenine/rastl.) ± SEM Fotoperioda Svetlo Temno 2,53333 ± 0,302033b 3,71667 ± 0,369066a Avksin 0,3 mg/l IBA 1,61667 ± 0,21796b 1 mg/l IBA 4,63333 ± 0,33863a ** statistično značilen vpliv (P<0,01) a-b srednje vrednosti, znotraj preučevanega dejavnika, označene z različnimi črkami, se med seboj statistično značilno razlikujejo (Tukey HSD α=0,05) Grafikon 3 predstavlja primerjavo rastlin na gojišču z avksinom, ki so rasle na svetlobi in temi in med rastlinami, ki so rasle na kontrolnem gojišču. Iz grafikona lahko razberemo, da so rastline, ki so bile na gojišču G2 in za 6 dni postavljene v temo, statistično značilno pognale več korenin na rastlino (povprečno 5,7 korenin na rastlino). Prav tako so veliko korenin pognale rastline, ki so bile na istem gojišču, vendar ves čas na svetlobi (povprečno 3,5 korenin na rastlino). Med rastlinami, ki so rasle na gojišču G1 in so bile za 6 dni izpostavljene temi, oziroma tistimi, ki so bile ves čas na svetlobi, ni bilo statistično značilnih razlik (povprečno 1,5 korenine na rastlino).
Število korenin na rastlino Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 31 7 6 5 Kontrola 24 h svetlobe G1, G2 24 h svetlobe G1, G2 0 h svetlobe (6 dni) a 4 b 3 2 1 c c 0 0,0 mg/l IBA 0,3 mg/l IBA 0,3 mg/l IBA 1 mg/l IBA 1 mg/l IBA Grafikon 3: Primerjava rastlin, ki so rasle na gojišču z avksinom, med rastlinami na kontrolnem gojišču. a-b-c: stolpci, ki so označeni z istimi črkami, nimajo med sabo statistično značilnih razlik. 4.4 Uspeh aklimatizacije Poganjke z dobro razvitimi koreninami smo 21. 3. 2018 presadili v substrat in začeli z aklimatizacijo. Rastline smo najprej posadili v mini rastlinjake, kasneje, ko so rastline zrasle, smo jih posadili v lončke. Iz kontrolnega gojišča smo posadili 7 rastlin, iz gojišča G1S smo posadili 10 rastlin, iz gojišča G1T smo posadili 8 rastlin. Iz gojišča G2S smo posadili 12 rastlin in iz gojišča G2T smo prav tako posadili 12 rastlin. 16. 5. 2018 smo vrednotili rezultate. Pri kontrolnem gojišču sta se ohranili 2 rastlini (uspeh je bil 29-odstoten), pri gojišču G1S so se ohranile 3 rastline (uspeh je bil 30-odstoten) in pri gojišču G2T so se ohranile 3 rastline (uspeh je bil 25-odstoten). Pri ostalih obravnavanjih je bil uspeh aklimatizacije 0-odstoten. Uspelo nam je aklimatizirati 8 rastlin od skupno 49, kar predstavlja 16 %.
Štamic D. Razmnoževanje češnje (Prunus avium L.) v in vitro pogojih. 32 Slika 8: Uspešno aklimatizirane rastline, ki so se ukoreninjale na gojišču G1S. Slika 9: Uspešno aklimatizirane rastline, ki so se ukoreninjale na gojišču G2T (zgoraj) in na kontrolnem gojišču (spodaj).