Microsoft Word - P03928SL_D34987 EU IVD IFU NSCLC SK006 _Rev 03.doc

Transkripcija

1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK testov za uporabo z barvalnikom Autostainer Link 48 Predvidena uporaba Za diagnostično uporabo in vitro. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je kvalitativni imunohistokemični test z uporabo protitelesa Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3, namenjen uporabi pri zaznavanju proteina PD-L1 v tkivu nedrobnoceličnega raka pljuč (NSCLC), fiksiranem v formalin in vklopljenem v parafin (FFPE), z uporabo vizualizacijskega sistema EnVision FLEX v barvalniku Autostainer Link 48. Izražanje proteina PD-L1 je določeno z uporabo ocene TPS (Tumor Proportion Score), ki predstavlja odstotek vitalnih tumorskih celic, ki kažejo delno ali popolno obarvanje membrane. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx se uporablja kot pripomoček pri prepoznavanju pacientov z nedrobnoceličnim rakom pljuč za zdravljenje z zdravilom KEYTRUDA (pembrolizumab). Povzetek in razlaga Vezava ligandov PD-1, PD-L1 in PD-L2, na receptor PD-1 v T-celicah, zavira proliferacijo T-celic in nastajanje citokina. V nekaterih tumorjih se pojavi povišanje ligandov PD-1 in signalizacija prek te poti lahko pripomore k zaviranju aktivnih T-celic z imunskim nadzorom tumorjev. KEYTRUDA je humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže z receptorjem PD-1 in blokira njegovo interakcijo s PD-L1 in PD-L2, s čimer sprosti zaviranje imunskega odziva, ki se posreduje po poti PD-1, vključno s protitumorskim imunskim odzivom. Pri modelih tumorja v singenskih miših je blokiranje aktivnosti PD-1 povzročilo zmanjšano rast tumorja (1). Načela postopka PD-L1 IHC 22C3 pharmdx vsebuje optimirane reagente in protokol za izvedbo postopka imunohistokemičnega barvanja vzorcev FFPE z uporabo barvalnika Autostainer Link 48. Po inkubaciji s primarnim monoklonskim protitelesom proti PD-L1 ali negativnim kontrolnim reagentom (NCR) se vzorci inkubirajo s povezovalnim protitelesom, značilnim za gostiteljske vrste primarnega protitelesa, nato pa se inkubirajo z vnaprej pripravljenim vizualizacijskim reagentom, sestavljenim iz molekul sekundarnega protitelesa in molekul hrenove peroksidaze, sklopljenih z ogrodjem iz dekstranskega polimera. Encimska pretvorba naknadno dodanega kromogena povzroči obarjanje vidnega reakcijskega produkta na mestu antigena. Barva kromogene reakcije je spremenjena z reagentom za ojačitev kromogena. Vzorec se nato lahko nasprotno obarva in pokrije s krovnimi stekelci. Rezultati se interpretirajo s svetlobnim mikroskopom. Priložen material Vsak komplet vključuje 19,5 ml primarnega protitelesa PD-L1 (koncentracija proteinov približno 3 µg/ml) in vsebuje reagente, potrebne za izvedbo 50 testov v do 15 posameznih postopkih. Spodaj naveden material zadošča za 50 testov (50 preparatov, inkubiranih s primarnim protitelesom proti PD-L1, in 50 preparatov, inkubiranih z ustreznim negativnim kontrolnim reagentom, skupaj 100 preparatov). Število testov temelji na uporabi µl vsakega reagenta na preparat razen DAB+ in raztopine za razkrivanje cilja. Komplet vsebuje material za največ 15 posameznih postopkov barvanja. Količina Opis 1 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Pufrska raztopina, ki vsebuje vodikov peroksid, detergent in natrijev azid s koncentracijo 0,015 mol/l. 1 19,5 ml Primarno protitelo: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoclonal mouse (IgG 1 ) anti-pd-l1 v pufrski raztopini s stabilizacijskim proteinom in natrijevim azidom s koncentracijo 0,015 mol/l ml Negativni kontrolni reagent NEGATIVNI KONTROLNI Monoklonsko mišje kontrolno protitelo IgG v pufrski raztopini s stabilizacijskim proteinom in natrijevim azidom s koncentracijo 0,015 mol/l. 1 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Kunčje sekundarno protitelo proti mišjim imunoglobulinom v pufrski raztopini s stabilizacijskim proteinom in natrijevim azidom s koncentracijo 0,015 mol/l. 1 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dekstran, sklopljen z molekulami peroksidaze in molekulami kozjih sekundarnih protiteles proti kunčjim in mišjim imunoglobulinom v pufrski raztopini s stabilizacijskim proteinom in protimikrobno učinkovino. P03928SL_03/SK / str. 1/14

2 15 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufrska raztopina, ki vsebuje vodikov peroksid in protimikrobno učinkovino. 1 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin tetrahidroklorid v organskem topilu. 1 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Bakrov sulfat v vodi ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Pufrska raztopina, ph 6,1, ki vsebuje detergent in protimikrobno učinkovino. 15 preparatov Kontrolni preparati PD-L1 IHC 22C3 pharmdx CONTROL SLIDES Vsak preparat vsebuje rezine dveh peletiranih celičnih linij, fiksiranih v formalin in vklopljenih v parafin: NCI-H226* z zmernim izražanjem proteina PD-L1 in MCF-7 z negativnim izražanjem proteina PD-L1. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negativno NCI-H226: PD-L1-pozitivno *Dr. AF Gazdar in dr. JD Minna z ameriškega Nacionalnega zdravstvenega inštituta (NIH) sta zaslužna za razvoj celične linije NCI-H226 (številka ATCC: CRL-5826 ) (2). Opomba: vsi vključeni reagenti so posebej formulirani za uporabo s tem kompletom. Da bi test deloval v skladu z navodili, uporaba nadomestnih izdelkov ni dovoljena, razen EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x (koda K8005). PD-L1IHC 22C3 pharmdx je prilagojen za uporabo z barvalnikom Autostainer Link 48. Za dodatne informacije glejte uporabniške priročnike za barvalnik Autostainer Link 48 in instrument PT Link. Potrebni material, ki ni priložen PT Link Pre-treatment Module (koda PT100/PT101) Autostainer Link 48 (koda AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (koda K8007) Hematoxylin (koda K8008) Destilirana ali deionizirana voda (voda reagentske kakovosti) Časovnik Pozitivna in negativna tkiva, ki se uporabljajo kot kontrole procesa (glejte poglavje Nadzor kakovosti) Objektna stekelca: Dako FLEX IHC Microscope Slides (koda K8020) ali objektna stekelca z nabojem Fisherbrand Superfrost Plus Krovna stekelca Medij za trajno pripravo preparata in pomožni reagenti, potrebni za krovna stekelca Svetlobni mikroskop (4 40-kratna povečava z objektivom) Previdnostni ukrepi 1. Za diagnostično uporabo in vitro. 2. Za profesionalno uporabo. 3. Izdelek vsebuje natrijev azid (NaN3), kemikalijo, ki je v čisti obliki zelo toksična. Čeprav niso klasificirane kot nevarne, lahko NaN3 v koncentracijah v izdelku reagira s svinčenimi in bakrenimi cevmi, pri čemer se tvorijo zelo eksplozivni kovinski azidi. Pred odstranjevanjem sperite z obilico vode, da preprečite nalaganje kovinskih azidov v ceveh (3). 4. Primarno protitelo, negativni kontrolni reagent, povezovalec in vizualizacijski reagent vsebujejo snovi živalskega izvora. 5. Pred fiksacijo vzorcev in po njej je treba z vzorci in vsemi snovmi, ki so jim bile izpostavljene, ravnati enako kot pri delu s snovmi, ki prenašajo okužbe, zato jih je treba zavreči v skladu z ustreznimi previdnostnimi ukrepi (4). 6. Če se inkubacijski časi, temperature ali metode razlikujejo od priporočenih, lahko pride do nepravilnih rezultatov. 7. Reagenti so optimalno razredčeni. Če jih dodatno razredčite, lahko pride do izgube obarvanja antigena. 8. Če so vizualizacijski reagent, kromogen Liquid DAB+ ter pripravljena raztopina substrata in kromogena DAB+ izpostavljeni prekomerni osvetlitvi, jim lahko to škodi. Delov sistema ne puščajte na močni svetlobi, kot je neposredna sončna svetloba, niti v takih pogojih z njimi ne izvajajte barvanja. 9. Ostanki parafina lahko povzročijo lažno negativne rezultate. 10. Uporaba volumnov reagenta, ki se razlikujejo od priporočenih, lahko povzroči izgubo vidne imunoreaktivnosti PD-L Rezultati majhne raziskave so pokazali podoben dinamični razpon izražanja PD-L1 pri parih vzorcev primarnega in metastatskega nedrobnoceličnega raka pljuč. Možno je, da obstajajo razlike v izražanju PD-L1 pri primarnih tumorjih v primerjavi z metastatskimi mesti pri istem pacientu. 12. Za velike tkivne rezine bo morda treba uporabiti µl reagenta. P03928SL_03/SK / str. 2/14

3 13. Osebam, mlajšim od 18 let, ni dovoljeno delati s tem izdelkom. Uporabnike je treba skrbno poučiti o ustreznih postopkih dela z izdelkom, njegovih nevarnih lastnostih in potrebnih varnostnih ukrepih. Za dodatne informacije glejte varnostni list. 14. Nosite primerno osebno zaščitno opremo, da preprečite stik z očmi in kožo. 15. Neuporabljeno raztopino je treba zavreči skladno z lokalnimi, nacionalnimi in zveznimi predpisi. 16. Za strokovne uporabnike je na voljo varnostni list po naročilu. Nevarno Kromogen DAB+: 1 5-% bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraamonijev tetraklorid H350 Lahko povzroči raka. H341 Sum povzročitve genetskih okvar. P201 Pred uporabo pridobiti posebna navodila. P202 Ne uporabljajte, dokler se ne seznanite z vsemi varnostnimi ukrepi. P280 Nositi zaščitne rokavice. Nositi zaščito za oči ali obraz. Nositi zaščitno obleko. P308 + P313 PRI izpostavljenosti ali sumu izpostavljenosti: poiščite zdravniško pomoč. P405 Hraniti zaklenjeno. P501 Odstraniti vsebino ali posodo v skladu z vsemi lokalnimi, regionalnimi, državnimi in mednarodnimi predpisi. Opozorilo EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5-odstotna citronska kislina H319 Povzroča resno draženje oči. H411 Strupeno za vodne organizme, z dolgotrajnimi učinki. P280 Nositi zaščito za oči ali obraz. P273 Preprečiti sproščanje v okolje. P264 Po uporabi temeljito umiti roke. P305 + P351 + P338 PRI STIKU Z OČMI: previdno izpirati z vodo nekaj minut. Odstranite kontaktne leče, če jih imate in če to lahko storite brez težav. Nadaljujte z izpiranjem. P337 + P313 Če draženje oči ne preneha: poiščite zdravniško pomoč. P501 Odstraniti vsebino ali posodo v skladu z vsemi lokalnimi, regionalnimi, državnimi in mednarodnimi predpisi. Shranjevanje Vse dele kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, vključno s kontrolnimi preparati, shranjujte v temi in pri temperaturi 2 8 C, ko jih ne uporabljate v barvalniku Autostainer Link 48. Kompleta ne uporabljajte po pretečenem roku uporabe, natisnjenem na zunanji strani škatle kompleta. Če se reagenti shranjujejo pri pogojih, ki so drugačni od navedenih v teh priloženih navodilih, mora pogoje potrditi uporabnik sam. Ni očitnih znakov za nestabilnost tega izdelka, zato je treba skupaj z vzorci pacientov opravljati tudi pozitivne in negativne kontrole. Priprava vzorca Z vzorci je treba ravnati tako, da se ohrani tkivo za imunohistokemično barvanje. Za vse vzorce se uporabijo standardni načini obdelave tkiv. Rezine, vklopljene v parafin Za uporabo so primerna tkiva, ki so fiksirana v formalin in vklopljena v parafin. Drugi fiksativi niso odobreni in lahko povzročijo nepravilne rezultate. Priporoča se čas fiksacije ur v 10-odstotnem nevtralno puferiranem formalinu (NBF), raziskava z omejenimi vzorci pa je pokazala, da časi fiksacije ur v 10-odstotnem nevtralno puferiranem formalinu niso sistematično spremenili zaznavanja PD-L1. Časi fiksacije, ki znašajo največ 3 ure, lahko povzročijo spremenljivo zaznavanje PD-L1. Vzorce je treba razdeliti na debeline 3 ali 4 mm, fiksirati v formalin ter dehidrirati in prečistiti v nizih alkoholov in ksilena, čemur sledi infiltracija s stopljenim parafinom. Temperatura parafina ne sme presegati 60 C. Tkivni bloki FFPE, ki so stari 5 let ali več, lahko povzročijo izgubo imunoreaktivnosti PD-L1. Vzorci tkiva morajo biti razrezani na debelino približno 4 5 µm. Po rezanju je treba tkiva naložiti na objektna stekelca Fisherbrand Superfrost Plus ali objektna stekelca Dako FLEX IHC (koda K8020) in nato za 1 uro postaviti v pečico pri temperaturi 58 ± 2 ºC. Da se ohrani antigenost, je treba tkivne rezine, ko so naložene na objektna stekelca, hraniti v temi pri temperaturi 2 8 C (prednostno) ali na sobni temperaturi do 25 C in obarvati v roku 6 mesecev od rezanja. Temperatura za shranjevanje preparatov in ravnanje z njimi ne sme na nobeni točki po naložitvi na stekelce preseči 25 C, da se zagotovita celovitost in antigenost tkiva. Uporaba kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmdx na dekalciniranih tkivih ni odobrena in se ne priporoča. Priprava reagenta Pred barvanjem je treba pripraviti naslednje reagente: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x Pripravite zadostno količino raztopine Target Retrieval Solution, Low ph, 1x tako, da razredčite raztopino Target Retrieval Solution, Low ph, 50x v razmerju 1:50 z destilirano ali deionizirano vodo (vodo reagentske kakovosti); ph raztopine Target Retrieval Solution 1x mora biti 6,1 ± 0,2. Raztopina Target Retrieval Solution 1x s ph-jem pod 5,9 lahko povzroči nepravilne rezultate. Z eno 30-mililitrsko stekleničko raztopine Target Retrieval Solution, Low ph, 50x, razredčeno v razmerju 1:50, je mogoče pripraviti 1,5 L reagenta 1x, kar zadostuje za en poln rezervoar PT Link, v katerem je mogoče obdelati do 24 preparatov. Raztopino Target Retrieval Solution 1x zavrzite po treh uporabah, uporabna pa je največ do 5 dni po razredčenju. Po potrebi je na voljo dodatna raztopina EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x (koda K8005). P03928SL_03/SK / str. 3/14

4 EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Pripravite zadostno količino pralnega pufra tako, da razredčite raztopino Wash Buffer 20x v razmerju 1:20 z destilirano ali deionizirano vodo (vodo reagentske kakovosti) za korake pranja. Neporabljeno raztopino 1x lahko shranjujete pri temperaturi 2 8 ºC najdlje en mesec. Če je pufer moten na pogled, ga zavrzite. Za dodatne informacije glejte uporabniški priročnik za barvalnik Autostainer Link 48. EnVision FLEX Wash Buffer, 20x je na voljo kot koda K8007. Raztopina substrata in kromogena DAB+ To raztopino je treba pred uporabo temeljito premešati. V raztopini se lahko pojavi oborina, kar pa ne vpliva na kakovost barvanja. Če želite pripraviti raztopino substrata in kromogena DAB+, dodajte 1 kapljico kromogena Liquid DAB+ na ml substratnega pufra DAB+ in premešajte. Pripravljena raztopina substrata in kromogena je stabilna 5 dni, če je shranjena v temi pri temperaturi 2 8 º C. Pomembne opombe: Če uporabite celotno stekleničko substratnega pufra DAB+, dodajte 9 kapljic kromogena DAB+. Čeprav je na nalepki navedena količina 7,2 ml, je to uporabni volumen, ki ne vključuje»mrtvega volumna«v steklenički. Barva kromogena Liquid DAB+ v steklenički lahko niha od prozorne do sivkino-rjave. To ne vpliva na delovanje tega izdelka. Razredčite v skladu z zgornjimi smernicami. Če substratnemu pufru DAB+ dodate preveč kromogena Liquid DAB+, pride do poslabšanja pozitivnega signala. Postopek barvanja s sistemom Autostainer Link 48 Opombe k postopkom Pred uporabo naj uporabnik pazljivo prebere ta navodila in se seznani z vsemi sestavnimi deli ter instrumenti (glejte Previdnostni ukrepi). Pred imunohistokemičnim barvanjem je treba vse reagente uravnati na sobno temperaturo (20 25 ºC). Podobno je treba tudi vse inkubacije opravljati na sobni temperaturi. Tkivne rezine se med barvanjem ne smejo posušiti. Posušene tkivne rezine lahko prikažejo povečano nespecifično obarvanje. Vsi potrebni koraki in inkubacijski časi za barvanje so že programirani v programski opremi Dako Link. Za dodatne informacije o protokolih programiranja ter nalaganju preparatov in reagentov glejte uporabniške priročnike za barvalnik Autostainer Link 48 in instrument PT Link. Opomba: reagenti in navodila, ki jih vključuje ta sistem, zagotavljajo optimalno delovanje samo, če uporabljate priporočene reagente in materiale. Dodatno redčenje reagentov ali spreminjanje inkubacijskih časov lahko povzroči nepravilne ali neskladne rezultate. Protokol barvanja Med možnostmi v spustnem meniju programske opreme Dako Link izberite protokol barvanja PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Vsi potrebni koraki in inkubacijski časi za barvanje so že programirani v barvalniku Autostainer Link 48. Če v strežniku ni ustreznih protokolov PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, se za pridobitev protokolov obrnite na najbližjega predstavnika tehnične službe. 1. korak: Postopek deparafinizacije, rehidracije in razkrivanja cilja (3-v-1) Podrobnosti najdete v uporabniškem priročniku instrumenta PT Link. Nastavite predogrevanje in ohlajanje v instrumentu PT Link (koda PT100/PT101) na 65 C. Nastavite ogrevanje na 97 C za 20 minut. Napolnite rezervoarje PT Link z 1,5 L delovne raztopine Target Retrieval Solution, Low ph, 1x na rezervoar, da se prekrijejo tkivne rezine. Predgrejte raztopino za razkrivanje cilja na 65 ºC. Potopite okvirje Autostainer z naloženimi tkivnimi rezinami FFPE v predogreto raztopino za razkrivanje cilja, Low ph, (delovna raztopina 1x) v rezervoarju PT Link. Inkubirajte 20 minut pri temperaturi 97 ºC. Ko je inkubacija za razkrivanje cilja končana in temperatura pade na 65 C, odstranite vse okvirje s preparati Autostainer iz rezervoarja PT Link in takoj postavite okvir s preparati Autostainer v rezervoar (npr. PT Link Rinse Station, koda PT109) z razredčenim pralnim pufrom (koda K8007) na sobni temperaturi. Preparate 5 minut inkubirajte v razredčenem pralnem pufru na sobni temperaturi. 2. korak: Postopek barvanja Po postopku deparafinizacije, rehidracije in razkrivanja cilja (3-v-1) postavite okvirje s preparati Autostainer v barvalnik Autostainer Link 48. Instrument izvede proces barvanja z nanosom ustreznega reagenta, spremljanjem inkubacijskega časa in spiranjem preparatov med reagenti. Časi reagentov so že programirani v programski opremi Dako Link. 3. korak: Nasprotno barvanje Preparate nasprotno barvajte 5 minut s hematoksilinom (Link) (koda K8008). Inkubacijski čas za hematoksilin je že programiran v protokolu. 4. korak: Priprava preparata Potreben je brezvodni medij za trajno pripravo preparata. Opomba: obarvani preparati lahko nekoliko obledijo, na kar vpliva več dejavnikov, med drugim tudi nasprotno barvanje, materiali in metode za pripravo ter pogoji shranjevanja preparatov. Da preparati ne bi preveč obledeli, jih shranjujte v temnem prostoru pri sobni temperaturi (20 25 ºC). Nadzor kakovosti Kakovost reagentov v kompletu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je preverjena z imunohistokemijo in uporabo zgoraj opisanih postopkov razkrivanja cilja ter barvanja. Odstopanja od priporočenih postopkov za fiksacijo, obdelavo in vklopitev tkiva v uporabnikovem laboratoriju lahko povzročijo znatno variabilnost rezultatov. Vsako barvanje mora vključevati nadzor kakovosti. Kontrole kakovosti so navedene v tabeli 1 in vključujejo: vzorec tkiva pacienta, obarvan s hematoksilinom in eozinom (H&E); pozitivna in negativna kontrolna tkiva, ki jih zagotovi laboratorij; in kontrolni preparat s kontrolno celično linijo, ki ga zagotovi Dako (5). V ZDA preberite smernice za nadzor kakovosti akreditacijskega programa za imunohistokemijo Združenja ameriških patologov (CAP); za dodatne informacije glejte tudi CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (5, 6, 7). P03928SL_03/SK / str. 4/14

5 Preverjanje testa Pred prvo uporabo sistema barvanja v diagnostičnem postopku mora uporabnik preveriti delovanje testa tako, da ga preizkusi na nizu tkiv, ki jih zagotovi laboratorij, z znanimi značilnostmi delovanja IHC, ki predstavljajo znana pozitivna in negativna tkiva. Glejte postopke za nadzor kakovosti, ki so opisani v razdelku o nadzoru kakovosti zgoraj. Te postopke za nadzor kakovosti je treba ponoviti za vsako novo serijo protitelesa ali v primeru spremenjenih parametrov testa. Možnosti odpravljanja morebitnih težav, vzroki zanje in priporočeni ukrepi so navedeni v tabeli 10. Interpretacija ocene NSCLC Vse vitalne tumorske celice na celotnem preparatu je treba ovrednotiti in vključiti v ocenjevanje PD-L1. Vzorec je primeren za ovrednotenje PD-L1, če je v obarvanem preparatu PD-L1 prisotnih najmanj 100 vitalnih tumorskih celic. Za uspešno ocenjevanje obarvanih vzorcev PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je ključnega pomena, da se ocenjujejo ustrezne celice, da je prepoznana prava celična lokalizacija in da je intenzivnost obarvanja pravilno interpretirana. Preparat mora oceniti patolog z uporabo svetlobnega mikroskopa. Za vrednotenje imunohistokemičnega barvanja in ocenjevanje je primeren objektiv z kratno povečavo. V oceno je treba vključiti vsakršno zaznavno obarvanje membrane tumorskih celic. Ocenite delno ali popolno obarvanje celične membrane ( 1+), ki se zaznavno razlikuje od citoplazemskega obarvanja. Citoplazemsko obarvanje je nespecifično obarvanje in se izključi iz ocenjevanja intenzivnosti obarvanja. Normalne celice in imune celice, povezane s tumorjem, npr. infiltrirajoči limfociti ali makrofagi, ne smejo biti vključene v oceno za določitev PD-L1-pozitivnosti. Pri vzorcih tumorja, obarvanih z negativnim kontrolnim reagentom, mora specifično obarvanje znašati 0, obarvanje ozadja pa 1+. Ocena TPS (Tumor Proportion Score) je odstotek vitalnih tumorskih celic, ki kažejo delno ali popolno obarvanje membrane ( 1+). Vzorec je PD-L1-pozitiven, če najmanj 1 % (TPS) vitalnih tumorskih celic kaže obarvanje membrane ne glede na intenzivnost (tj. 1+). Pri vsakem barvanju je preparate treba pregledati v vrstnem redu, navedenem v tabeli 1, da se določi veljavnost barvanja in omogoči ocenjevanje obarvanja vzorčnega tkiva. Za dodatna navodila glejte priročnik za interpretacijo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Dodatna priporočila za interpretacijo obarvanjapd-l1 IHC 22C3 pharmdx 1. Za preverjanje obarvanja celične membrane uporabite kratno povečavo z objektivom. 2. Tudi različni neciljni elementi, kot so imunske celice, povezane s tumorjem (npr. makrofagi), in stroma, se lahko obarvajo pozitivno za PD-L1, ampak ne smejo biti vključeni v oceno Tabela 1. priporočeni vrstni red ocenjevanja preparatov Vzorci Utemeljitev Zahteve 1. H&E (zagotovi laboratorij) Najprej se ovrednoti obarvanje vzorca tkiva s hematoksilinom in eozinom (H&E), da se določi histologija tkiva in kakovost konzerviranja. Test PD-L1 IHC 22C3 pharmdx in barvanje H&E je treba izvesti na zaporednih rezinah iz istega parafinskega bloka vzorca. Vzorec je primeren za ovrednotenje PD-L1, če je prisotnih najmanj 100 vitalnih tumorskih celic. Vzorci tkiva morajo biti neokrnjeni, dobro ohranjeni in morajo potrditi vrsto tumorja. 2. Kontrolni preparat s celično linijo (priložen) (zagotovi Dako) Najprej je treba pregledati kontrolni preparat s celičnimi linijami, obarvan s primarnim protitelesom PD-L1 iz PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, da se prepričate, ali vsi reagenti delujejo pravilno. Kontrolni preparat s celično linijo vsebuje pelet PD-L1-pozitivne celične linije in pelet PD-L1- negativne celične linije. Pri vsakem barvanju je treba en kontrolni preparat obarvati s primarnim protitelesom za PD-L1. Merila sprejemljivosti NCI-H226 (PD-L1-pozitivna kontrolna celična linija): Obarvanje celične membrane 70 % celic pri povprečni intenzivnosti obarvanja 2+. Intenzivnost nespecifičnega obarvanja < 1+. Merila sprejemljivosti MCF-7 (PD-L1-negativna kontrolna celična linija): Brez specifičnega obarvanja. Intenzivnost nespecifičnega obarvanja < 1+. Občasno je mogoče opaziti obarvanje nekaj celic v celičnem peletu MCF-7. Uporabljajo se naslednja merila sprejemljivosti: sprejemljiva je prisotnost največ 10 celic z razločnim obarvanjem plazemske membrane ali citoplazemsko obarvanje z intenzivnostjo 1+ znotraj meja celičnega peleta MCF Preparati pozitivnega kontrolnega tkiva (zagotovi laboratorij) Nato se pregleda preparate pozitivnega kontrolnega tkiva, obarvane tako s primarnim protitelesom PD-L1 kot z negativnim kontrolnim reagentom. Ti preparati preverijo, ali sta način fiksacije in proces razkrivanja epitopov učinkovita. Znane pozitivne kontrole tkiva se lahko uporabljajo samo za spremljanje pravilnega delovanja obdelanih tkiv in testnih reagentov, in NE kot pripomoček pri oblikovanju specifične diagnoze vzorcev pacienta. Če katera od kontrolnih celičnih linij ne izpolnjuje teh meril, so vsi rezultati z vzorci pacientov neveljavni. Kontrole morajo biti biopsijski/kirurški vzorci enake vrste tumorja kot vzorec pacienta, ki so v najkrajšem možnem času fiksirani, obdelani in vklopljeni na enak način kot vzorci pacienta. Za interpretacijo rezultatov obarvanja uporabite neokrnjene vzorce, ker se nekrotične ali degenerirane celice pogosto obarvajo nespecifično. Tkiva, izbrana za pozitivne kontrole tkiva, morajo pri barvanju s PD-L1 kazati šibko do zmerno pozitivno obarvanje, tako da lahko zaznajo komaj opazne spremembe občutljivosti testa. Vsako barvanje mora vključevati dva preparata pozitivnega kontrolnega tkiva. Preparat, obarvan s PD-L1: opazna mora biti prisotnost rjavega obarvanja plazemske membrane. Nespecifično obarvanje mora biti 1+. Reagent, obarvan z negativnim kontrolnim reagentom: brez obarvanja membrane. Nespecifično obarvanje mora biti 1+. Če pozitivne kontrole tkiva ne pokažejo ustreznega pozitivnega obarvanja, so rezultati s testnimi vzorci neveljavni. P03928SL_03/SK / str. 5/14

6 4. Preparati negativnega kontrolnega tkiva (zagotovi laboratorij) 5. Preparat tkiva pacienta, obarvan z negativnim kontrolnim reagentom 6. Preparat tkiva pacienta, obarvan s primarnim protitelesom PD-L1 Nato se pregleda preparate negativnega kontrolnega tkiva (ki je znano kot PD-L1-negativno), obarvane tako s primarnim protitelesom PD-L1 kot z negativnim kontrolnim reagentom, da se preveri specifičnost označevanja ciljnega antigena s primarnim protitelesom. Druga možnost je, da se negativni deli pozitivnega kontrolnega tkiva uporabijo kot negativno kontrolno tkivo, vendar mora uporabnik to preveriti. Preglejte vzorce pacientov, obarvane z negativnim kontrolnim reagentom iz PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Negativni kontrolni reagent se uporabi namesto primarnega protitelesa in pomaga pri interpretaciji specifičnega obarvanja na mestu antigena. Na koncu preglejte celoten preparat vzorcev pacienta, ki je obarvan s primarnim protitelesom za PD-L1 iz testa PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Za specifične informacije v zvezi z imunoreaktivnostjo PD-L1 IHC 22C3 pharmdx glejte razdelke Povzetek in razlaga, Omejitve in Značilnosti delovanja. Kontrole morajo biti biopsijski/kirurški vzorci enake vrste tumorja kot vzorec pacienta, ki so v najkrajšem možnem času fiksirani, obdelani in vklopljeni na enak način kot vzorci pacienta. Vsako barvanje mora vključevati dva preparata negativnega kontrolnega tkiva. Preparat, obarvan s PD-L1: brez obarvanja membrane v tumorskih celicah. Nespecifično obarvanje mora biti 1+. Reagent, obarvan z negativnim kontrolnim reagentom: brez obarvanja membrane. Nespecifično obarvanje mora biti 1+. Če se v preparatih negativnega kontrolnega tkiva pojavi specifično obarvanje celične membrane, so rezultati z vzorcem pacienta neveljavni. Odsotnost obarvanja celične membrane potrjuje specifično označevanje ciljnega antigena s primarnim protitelesom. Nespecifično obarvanje mora biti 1+. Intenzivnost pozitivnega obarvanja je treba oceniti v okviru vsega nespecifičnega obarvanja ozadja, ki je bilo pri istem barvanju opaženo v preparatu z negativnim kontrolnim reagentom. Tako kot pri vsakem imunohistokemičnem testu negativen rezultat pomeni, da antigen ni bil zaznan, in ni nujno, da je antigen bil odsoten v testiranih celicah/tkivu. Vse vitalne tumorske celice na celotnem obarvanem preparatu PD-L1 je treba ovrednotiti in vključiti v ocenjevanje PD-L1. Vzorec je primeren za ovrednotenje PD-L1, če je prisotnih najmanj 100 vitalnih tumorskih celic. Splošne omejitve 1. Imunohistokemija je večstopenjski diagnostični proces, ki zahteva strokovno usposabljanje za izbiro ustreznih reagentov, izbiro, fiksacijo in obdelavo tkiv, pripravo imunohistokemičnega preparata in interpretacijo rezultatov obarvanja. 2. Obarvanje tkiva je odvisno od rokovanja s tkivom in obdelave tkiva pred samim barvanjem. Neustrezni postopki fiksacije, zmrzovanja, odtajanja, spiranja, sušenja, segrevanja, rezanja ali onesnaženje z drugimi tkivi ali tekočinami lahko povzročijo deformacije, prestrezanje protitelesa ali lažno negativne rezultate. Neskladni rezultati so lahko posledica neenakih načinov fiksiranja in vklopitve v parafin ali posameznih nepravilnosti v samem tkivu. 3. Prekomerno ali nepopolno nasprotno obarvanje lahko ogrozi pravilno interpretacijo rezultatov. 4. Specialistična interpretacija vsakršnega pozitivnega obarvanja oziroma njegove odsotnosti mora biti ovrednotena v okviru specialistične predstavitve, morfologije in drugih histopatoloških meril. Specialistična interpretacija vsakršnega obarvanja oziroma njegove odsotnosti mora biti podprta z morfološkimi analizami in primernimi kontrolami ter drugimi diagnostičnimi testi. Usposobljen patolog, ki je seznanjen z uporabljenimi protitelesi, reagenti in metodami, je odgovoren za interpretacijo obarvanega preparata. Barvanje se mora izvajati v certificiranem licenčnem laboratoriju pod nadzorstvom patologa, ki je odgovoren za pregledovanje obarvanih preparatov in zagotavljanje ustreznosti pozitivnih in negativnih kontrol. 5. Tkiva oseb, okuženih z virusom hepatitisa B, ki vsebujejo površinske antigene hepatitisa B (HBsAg), lahko kažejo nespecifično obarvanje s hrenovo peroksidazo (7). 6. Reagenti lahko prikažejo nepričakovane reakcije v vrstah tkiv, ki še niso bile testirane. Zaradi biološke variabilnosti izražanja antigena v novotvorbah ali drugih patoloških tkivih ni mogoče popolnoma izločiti niti možnosti nepričakovanih reakcij v testiranih vrstah tkiv. Z dokumentiranimi nepričakovanimi reakcijami se obrnite na tehnično podporo družbe Dako. 7. Zaradi neimunološke vezave proteinov ali reakcijskih produktov substrata se lahko pojavijo lažno pozitivni rezultati. Povzročita jih lahko tudi psevdoperoksidazna aktivnost (eritrociti) in endogena peroksidazna aktivnost (citokrom C) (7). 8. Reagenti in navodila, ki jih vključuje ta sistem, zagotavljajo optimalno delovanje. Dodatno redčenje reagentov ali spreminjanje inkubacijskih časov lahko povzroči nepravilne ali neskladne rezultate. Omejitve, specifične za izdelek 1. Zaradi postopne degradacije antigena v tkivih lahko pride do lažnih negativnih rezultatov. Vzorce je treba obarvati v šestih mesecih od prepariranja tkiv, če so bili shranjeni v temi in pri temperaturi 2 8 C (priporočeno) ali pri sobni temperaturi do 25 C. 2. Za optimalne in obnovljive rezultate je za protein PD-L1 potrebna predobdelava za razkrivanje cilja, če so tkiva rutinsko fiksirana (nevtralno puferiran formalin) in vklopljena v parafin. 3. Ne uporabljajte nadomestnih reagentov iz različnih serij tega izdelka ali iz kompletov drugih proizvajalcev. Edina izjema je raztopina EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph 50x, ki je po potrebi na voljo pod kodo K Obarvane kontrolne celične linije se lahko uporabljajo samo za potrditev barvanja, ne smejo pa se uporabljati za ocenjevanje tkivnih rezinah. 5. Uporaba reagenta PD-L1 IHC 22C3 pharmdx na tkivih z drugimi fiksativi namesto formalina ni odobrena. 6. Uporaba reagenta PD-L1 IHC 22C3 pharmdx na tankoigelnih aspiratih ni odobrena. P03928SL_03/SK / str. 6/14

7 Klinična ocena delovanja Klinična korist testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je bila raziskana z multicentrično, odprto, randomizirano klinično raziskavo, opravljeno za oceno varnosti in učinkovitosti zdravila KEYTRUDA pri pacientih z napredovalim nedrobnoceličnim rakom pljuč (9). S testom v okviru kliničnega preizkušanja (CTA) je bilo potrjeno, da so pacienti PD-L1-pozitivni, po zdravljenju s platinsko kemoterapijo pa se je pri njih pojavilo napredovanje bolezni. Pri pacientih z genomsko tumorsko aberacijo EGFR ali ALK se je napredovanje bolezni pojavilo po terapiji za te aberacije, ki jo je odobril urad FDA, in pred prejemanjem zdravila KEYTRUDA. Pacienti so bili randomizirani (v razmerju 1:1:1) za prejemanje 2 mg/kg (n = 344) ali 10 mg/kg (n = 346) zdravila KEYTRUDA vsake 3 tedne oziroma 75 mg/m 2 docetaksela vsake 3 tedne (n = 343). Ocena stanja tumorja je bila opravljena vsakih 9 tednov. Primarni končni točki sta bili splošno preživetje (OS) in preživetje brez napredovanja bolezni (PFS) glede na kriterije za vrednotenje odzivov pri programu Solid Tumors razl. 1.1 (RECIST 1.1) na osnovi slepe neodvisne presoje s strani radiologov. Na podlagi testa v okviru kliničnega preizkušanja (CTA) je bilo v raziskavo vključenih pacientov z nedrobnoceličnim rakom pljuč. Za oceno klinične koristnosti testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx so bili v ameriškem referenčnem laboratoriju z uporabo testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx retrospektivno testirani arhivirani vzorci klinične raziskave. Od pacientov je bilo s testom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx retrospektivno testirano tumorsko tkivo 529 pacientov. Vzorci 413 pacientov so bili pozitivni za izražanje PD-L1 ( 1 % vitalnih tumorskih celic je kazalo obarvanje membrane ne glede na intenzivnost), vzorci 94 pacientov pa so bili negativni za izražanje PD-L1 (< 1 % vitalnih tumorskih celic je kazalo obarvanje membrane ne glede na intenzivnost). Med temi 413 pacienti s pozitivno izraženostjo PD-L1 je bila izraženost PD-L1 visoka pri 163 pacientih (obarvanje membrane je bilo opazno pri 50 % vitalnih tumorskih celic ne glede na intenzivnost). Nivo ujemanja med testom v okviru kliničnega preizkušanja (CTA) in PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je prikazan v tabeli 2. Tabela 2: Ujemanje med CTA in PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Stopnje ujemanja CTA proti PD-L1 IHC 22C3 pharmdx PD-L1 Mejna vrednost Odstotek negativnega ujemanja (95 odstotni interval Odstotek pozitivnega ujemanja zaupanja /CI/) TPS 1 % 94,5 % [91,4 96,6 %] 80,0 % [76,9 82,8 %] TPS 50 % 98,3 % [97,1 99,0 %] 73,2 % [67,9 77,9 %] Demografski podatki in druge osnovne lastnosti so bili enakomerno porazdeljeni med vejami zdravljenja, v katere so randomizirani pacienti, ki so bili pozitivni po testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Starostna mediana je bila 63 let (44 % starih 65 ali več). Večina pacientov je bila belih (77 %) in moškega spola (58 %), s stanjem zmogljivosti 0 (29 %) oziroma 1 (71 %) po lestvici ECOG. Oseminsedemdeset odstotkov (78 %) pacientov je bilo bivših ali trenutnih kadilcev. Histologija je bila pri dvaindvajsetih odstotkih (22 %) pacientov skvamozna, pri 69 % pa neskvamozna. Osnovne vrednosti in demografske lastnosti so bile v splošnem kliničnem preizkušanju podobno enakomerno razporejene med vejo, ki je prejemala pembrolizumab, in vejo, ki je prejemala docetaksel. Rezultati učinkovitosti so povzeti v tabeli 3. Pri zdravljenju s KEYTRUDA je bila opazna daljša klinična korist pri pacientih z nedrobnoceličnim rakom pljuč s pozitivno izraženostjo PD-L1 z oceno TPS 1 %, ki je bila povečana pri pacientih z visoko izraženostjo PD-L1, pri katerih je ocena TPS dosegla 50 %, določeno s testom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Stopnja koristnosti je bila primerljiva s koristnostjo splošnega kliničnega preizkušanja. V tabeli 3 so povzete ključne mere učinkovitosti v splošni PD-L1-pozitivni populaciji (TPS 1 %), v podnaboru PD-L1-pozitivnih z visoko izraženostjo (TPS 50 %) znotraj splošnega kliničnega preizkušanja (PD-L1-pozitivni po testu CTA) in populacije, ki je pozitivna po testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Na sliki 1 je prikazana Kaplan- Meierjeva krivulja splošnega preživetja (TPS 1 %, določeno s testom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx). P03928SL_03/SK / str. 7/14

8 Tabela 3: Odziv na KEYTRUDA pri pacientih z NSCLC, ki so že prejemali zdravljenje: Splošno klinično preizkušanje in po testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx pozitivni pacienti: PD-L1 TPS 1 % in TPS 50 % Končna točka TPS 1 % KEYTRUDA 2 mg/kg vsake 3 tedne Klinično PD-L1 IHC preizkušanje 22C3 pharmdx KEYTRUDA 10 mg/kg vsake 3 tedne Klinično PD-L1 IHC preizkušanje 22C3 pharmdx Docetaksel 75 mg/m 2 vsake 3 tedne Klinično PD-L1 IHC preizkušanje 22C3 pharmdx Število pacientov Splošno preživetje Smrti (%) 172 (50 %) 59 (42 %) 156 (45 %) 59 (42 %) 193 (56 %) 67 (51 %) Razmerje ogroženosti* 0,71 (0,58; 0,88) 0,54 (0,37; 0,78) 0,61 (0,49; 0,75) 0,57 (0,39; 0,82) p-vrednost < 0,001 < 0,001 < 0,001 0, Mediana v mesecih 10,4 11,8 12,7 12,0 8,5 7,5 (9,4; 11,9) (9,6; NA) (10,0; 17,3) (8,7; NA) (7,5, 9,8) (6,3, 9,9) Preživetje brez napredovanja bolezni Dogodki (%) 266 (77 %) 97 (63 %) 255 (74 %) 103 (73 %) 257 (75 %) 94 (72 %) Razmerje ogroženosti* 0,88 (0,73; 1,04) 0,68 (0,50; 0,92) 0,79 (0,66; 0,94) 0,79 (0,59; 1,06) p-vrednost 0,068 0, ,005 0, Mediana v mesecih 3,9 4,9 4,0 4,0 4,0 3,8 (3,1, 4,1) (4,1, 6,2) (2,6, 4,3) (2,2, 4,6) (3,1, 4,2) (2,2, 4,2) Stopnja celokupnega odziva ORR % TPS 50 % 18 % (14; 23) 24 % (17; 32) 18 % (15; 23) 20 % (14; 28) 9 % (7; 13) 5 % (2; 11) Število pacientov Splošno preživetje Smrti (%) 58 (42 %) 18 (32 %) 60 (40 %) 19 (32 %) 86 (57 %) 25 (53 %) Razmerje ogroženosti* 0,54 (0,38; 0,77) 0,45 (0,24; 0,84) 0,50 (0,36; 0,70) 0,29 (0,15; 0,56) p-vrednost < 0,001 0,00541 < 0,001 < 0, Mediana v mesecih 14,9 Ni doseženo 17,3 Ni doseženo 8,2 7,2 (10,4; NA) (9,3; NA) (11,8; NA) (8,3; NA) (6,4; 10,7) (4,4; 8,3) Preživetje brez napredovanja bolezni Dogodki (%) 89 (64 %) 33 (59 %) 97 (64 %) 34 (57 %) 118 (78 %) 33 (70 %) Razmerje ogroženosti* 0,58 (0,43; 0,77) 0,47 (0,28; 0,80) 0,59 (0,45; 0,78) 0,41 (0,24; 0,70) p-vrednost < 0,001 0,00221 < 0,001 < 0, Mediana v mesecih 5,2 5,9 5,2 4,8 4,1 3,9 (4,0; 6,5) (4,2; 9,0) (4,1; 8,1) (2,8; NA) (3,6; 4,3) (2,0; 4,3) Stopnja celokupnega odziva ORR % 30 % (23; 39) 37 % (25; 52) 29 % (22; 37) 28 % (18; 41) 8 % (4; 13) 4 % (1; 15) * Razmerje ogroženosti (KEYTRUDA v primerjavi z docetakselom) na podlagi stratificiranega Coxovega modela sorazmernega tveganja Na podlagi stratificiranega testa log rank Ocenjeno z BICR ob uporabi RECIST 1.1 Vsi odzivi so bili delni odzivi Na podlagi pacientov z najboljšim splošnim odzivom, potrjeno s končnim ali delnim odzivom P03928SL_03/SK / str. 8/14

9 Slika 1: Kaplan-Meierjeva krivulja za splošno preživetje glede na veje zdravljenja (TPS 1 % glede na PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, populacija z namenom zdravljenja) Splošno preživetje (%) Docetaksel 75 mg/m2 Q3W MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W n ogroženih Docetaksel 75 mg/m2 Q3W Čas v mesecih MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W Izvedene so bile dodatne analize robustnosti, v katerih so upoštevali potencialni vpliv manjkajočih podatkov o pacientih, ki so bili negativni po testu CTA, vendar pozitivni po testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Pacienti s takimi rezultati testov so vključeni v populacijo z namenom uporabe/namenom diagnosticiranja (ITD) pri PD-L1 IHC 22C3 pharmdx; zaradi negativnega presejalnega testa CTA pa so bili izključeni iz kliničnega preizkušanja. Da bi se upoštevali tudi ti manjkajoči podatki, je bila izvedena občutljivostna analiza za pojasnitev verjetnostnega razpona za razmerje ogroženosti (HR), ocenjenega na podlagi testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx na podpopulacijah TPS 1 % in TPS 50 % v okviru ITD, s čimer se potrdi skladnost z zabeleženo vrednostjo HR na podlagi vpisa s CTA. Rezultati občutljivostne analize HR so pokazali, da so ocene HR odporne na predpostavljeno poslabšanje učinkovitosti zdravljenja v okviru ITD. P03928SL_03/SK / str. 9/14

10 Neklinična ocena delovanja Analitična občutljivost/specifičnost Analitična občutljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je bila preizkušena na 127 edinstvenih primerih vzorcev FFPE nedrobnoceličnega karcinoma pljuč (NSCLC) v stadijih od I do IV z uporabo proizvedene proizvodne serije. Ocena izražanja PD-L1 je prikazala obarvanje v razponu % pozitivnih tumorskih celic z intenzivnostjo obarvanja od 0 do 3. Normalna tkiva: v tabeli 4 je povzeta imunoreaktivnost Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 za priporočeno skupino normalnih tkiv. Obarvanje plazemske membrane je bilo opaženo v imunskih celicah in celicah epitelijskega izvora. Citoplazemsko obarvanje je bilo opaženo v nekaterih vrstah celic, ampak ni bilo zabeleženo kot pozitivno obarvanje. Vsa tkiva so bila fiksirana v formalinu in vklopljena v parafin ter obarvana z reagentom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx v skladu s priloženimi navodili. V testiranih vrstah celic ali tkiv ni bilo opaženih nepričakovanih rezultatov. Opaženo obarvanje je bilo skladno z navedeno literaturo za imunohistokemično izražanje PD-L1 v normalnih tkivih (10, 11). Tabela 4: povzetek reaktivnosti normalnega tkiva z reagentom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Vrsta tkiva (št. testov) Pozitivno obarvanje plazemske membrane: Elementi tkiva Pozitivno citoplazemsko obarvanje: Elementi tkiva Nespecifično obarvanje Dojka (3) 0/3 0/3 0/3 Hipofiza (3) 1/3 anteriorna hipofiza 1/3 anteriorna hipofiza 0/3 1/3 posteriorna hipofiza 1/3 posteriorna hipofiza Jajčnik (3) 0/3 0/3 0/3 Jetra (3) 1/3 makrofagi 0/3 0/3 1/3 hepatociti Kolon (3) 2/3 makrofagi 0/3 0/3 Kostni mozeg (3) 3/3 megakariociti 3/3 megakariociti 0/3 Koža (3) 0/3 0/3 0/3 Ledvice (3) 1/3 tubularni epitelij 0/3 0/3 Mali možgani (3) 0/3 0/3 0/3 Maternica (3) 0/3 0/3 0/3 Maternični vrat (3) 1/3 epitelij 0/3 0/3 Mezotelijske celice (2) 0/2 0/2 0/2 Mišica, skeletna (3) 0/2 0/2 0/2 Mišica, srčna (3) 0/3 0/3 0/3 Moda (3) 0/3 0/3 0/3 Nadledvična žleza (3) 0/3 1/3 medularne celice 0/3 Obščitnice (3) 1/3 žlezni epitelij 0/3 0/3 Pankreas (3) 0/3 0/3 0/3 Pljuča (3) 3/3 alveolarni makrofagi 0/3 0/3 Požiralnik (3) 0/3 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 epitelij 0/2 0/2 Ščitnica (3) 0/3 0/3 0/3 Tanko črevo (3) 0/3 0/3 0/3 Timus (3) 3/3 medularni epitelij 0/3 0/3 Tonzila (3) 3/3 kriptni epitelij 0/3 0/3 2/3 germinalni center (makrofagi) Veliki možgani (3) 0/3 0/3 0/3 Vranica (3) 2/3 makrofagi 0/3 0/3 Želodec (3) 2/3 limfociti 1/3 želodčne žleze 0/3 1/3 želodčne žleze Živci, periferni (3) 0/3 1/3 vezivno tkivo/žile 0/3 Žleza slinavka (3) 0/3 0/3 0/3 Neoplastična tkiva: V tabeli 5 je povzeta imunoreaktivnost Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 za skupino neoplastičnih tkiv. Obarvanje plazemske membrane je bilo opaženo v imunskih celicah in celicah epitelijskega izvora. Citoplazemsko obarvanje je bilo opaženo v nekaterih vrstah celic, ampak ni bilo zabeleženo kot pozitivno obarvanje. Vsa tkiva so bila fiksirana v formalinu in vklopljena v parafin ter obarvana z reagentom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx v skladu s priloženimi navodili. V testiranih vzorcih tumorja ni bilo opaženih nepričakovanih rezultatov. Opaženo obarvanje je bilo skladno z navedeno literaturo za imunohistokemično izražanje PD-L1 v neoplastičnih tkivih (10-13). Tabela 5: povzetek reaktivnosti neoplastičnega tkiva z reagentom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Vrsta tumorja Lokacija PD-L1-pozitivno/skupno št. = 159 Dojka, DCIS 0/2 Dojka, invazivni duktalni 0/7 Dojka, invazivni duktalni, z zasevki v limfnem vozlu 0/1 Glava in vrat, trdo nebo 0/1 Jajčnik 0/1 Jajčnik, endometrioidni 0/1 Jajčnik, mucinozni 0/1 Jajčnik, serozni 0/1 Adenokarcinom Kolon 0/5 Kolon, mucinozni 0/1 Kolon, z zasevki v jetrih 0/1 Maternica, endometrijski 0/3 Maternica, svetlocelični 0/1 P03928SL_03/SK / str. 10/14

11 Vrsta tumorja Lokacija PD-L1-pozitivno/skupno št. = 159 Maternični vrat, endocervikalni 0/1 Pljuča 1/4 Požiralnik 0/1 Prebavila, z zasevki v pljučih 0/1 Prostata 0/5 Rektum 0/4 Slepič 0/1 Ščitnica, folikularni 0/1 Ščitnica, folikularno-papilarni 0/1 Ščitnica, papilarni 0/3 Tanko črevo 0/2 Trebušna slinavka 0/2 Trebušna slinavka, duktalni 0/3 Želodec 0/6 Želodec, mucinozni 0/1 Žleza slinavka/obušesna žleza 0/2 Žolčnik 1/5 Adrenokortikalni karcinom Nadledvična žleza 0/1 Astrocitom Veliki možgani 0/3 Bazalnocelični karcinom Koža 0/1 Drobnocelični karcinom Pljuča 0/1 Embrionalni karcinom Moda 0/1 Ependimom Možgani 0/1 Feokromocitom Nadledvična žleza 0/1 Glioblastom Možgani 0/1 Hepatoblastom Jetra 0/1 Hepatocelični karcinom Jetra 0/5 Hondrosarkom Kost 0/1 Hordom Medenična votlina 0/1 Intersticijska novotvorba Kolon 0/1 Rektum 0/1 Tanko črevo 0/1 Karcinom Nazofaringealni, NPC 0/1 Mehko tkivo, stena prsnega koša 0/1 Leiomiosarkom Mehur 0/1 Limfom Anaplastični velikocelični Limfni vozel 0/1 Difuzni B-celični Limfni vozel 0/4 Hodgkinov Limfni vozel 2/2 Nehodgkinov Limfni vozel 1/1 Medularni karcinom Ščitnica 0/1 Meduloblastom Možgani 0/1 Nosna votlina 0/1 Melanom Rektum 0/1 Meningiom Možgani 0/2 Mezoteliom Peritonej 0/1 Nevroblastom Retroperitonej 0/1 Nevrofibrom Mehko tkivo, spodnji del hrbta 0/1 Osteosarkom Kost 0/2 Pečatnocelični karcinom Kolon 0/1 Metastatski pečatnocelični karcinom kolona z zasevki v jajčniku 0/1 Glava in vrat 0/2 Koža 0/2 Maternica 0/1 Maternični vrat 2/5 Ploščatocelični karcinom Metastatski ploščatocelični karcinom 0/1 požiralnika z zasevki v limfnem vozlu Pljuča 1/2 Požiralnik 0/7 Prehodnocelični karcinom Ledvice 0/1 Mehur 0/6 Primitivni nevroektodermalni tumor (PNET) Retroperitonej 0/1 Rabdomiosarkom Mehko tkivo, embrionalni 0/1 Prostata 0/1 Retroperitonej 0/1 Renalnocelični karcinom Papilarni Ledvice 0/1 Svetlocelični Ledvice 0/6 Seminom Moda 0/2 Sinovialni sarkom Medenična votlina 0/1 Spermatocitom Moda 0/2 Timom Mediastinum 1/1 Tumor otočnih celic Trebušna slinavka 0/1 P03928SL_03/SK / str. 11/14

12 Ponovljivost/zunanja obnovljivost Ponovljivost in zunanja obnovljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx sta bili ocenjeni v družbi Dako in na treh zunanjih lokacijah za testiranje. Podatki o delovanju so navedeni v tabelah 6 9. Pri raziskavah ponovljivosti, izvedenih v družbi Dako, so bile določene vrednosti za odstotek negativnega ujemanja (NPA), odstotek pozitivnega ujemanja (PPA) in skupno ujemanje (OA), in sicer za mejno vrednost 1 % in 50 %, kot prikazujeta tabeli 6 in 7. Ker so rezultati raziskav ponovljivosti pokazali 100-odstotno ujemanje, so bili intervali zaupanja izračunani z metodo Wilson Score na podlagi števila neodvisnih primerjav po parih. Pri zunanjih raziskavah ponovljivosti so bile določene odstotne vrednosti za povprečno negativno ujemanje (ANA), povprečno pozitivno ujemanje (APA) in skupno ujemanje (OA), in sicer za mejno vrednost 1 % in 50 %, kot prikazujeta tabeli 8 in 9. Ker pri parametrih obnovljivosti, kot sta lokacija in opazovalec, ne obstaja naravna referenca, so bila izračunana povprečna ujemanja. Intervali zaupanja za povprečna ujemanja so bili izračunani z metodo centilnega samovzorčenja. (Raziskave ponovljivosti niso bile analizirane s samovzorčevalnimi intervali zaupanja, ker tega ni mogoče izračunati na podatkih z ničelno neskladnostjo.) Tabela 6: ponovljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, pri testiranju na eni lokaciji ( 1 %) Raziskava Diagnostični presek ponovljivosti Zasnova preiskave Med instrumenti 1 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (8 PD-L1-negativnih in 8 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran na vsakem od šestih instrumentov Autostainer Link 48. Med upravljavci 1 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (8 PD-L1-negativnih in 8 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran s šestimi analitiki na enem instrumentu Autostainer Link 48. Med dnevi 1 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (8 D-L1-negativnih in 8 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran šest nezaporednih dni na instrumentu Autostainer Link 48. Med serijami 1 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (8 PD-L1-negativnih in 8 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran s tremi ponovitvami in vsako od treh serij reagentov na instrumentu Autostainer Link 48. Znotraj serije 1 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (8 PD-L1-negativnih in 8 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran s šestimi ponovitvami znotraj barvanja na instrumentu Autostainer Link 48. Znotraj dneva 1 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (8 D-L1-negativnih in 8 D-L1-pozitivnih) z razponom testiran z dvema barvanjema na en dan s tridnevnim ponavljanjem na instrumentu Autostainer Link 48. NPA = odstotek negativnega ujemanja; PPA = odstotek pozitivnega ujemanja; OA = skupno ujemanje % ujemanja (95 % CI) NPA 100 % (91,2 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 100 % (91,0 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 100 % (91,2 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 98,6 % (96,0 100 %) PPA 98,6 % (95,7 100 %) OA 98,6 % (95,8 100 %) NPA 100 % (91,2 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) NPA 100 % (91,0 100 %) PPA 100 % (91,2 100 %) Tabela 7: ponovljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, pri testiranju na eni lokaciji ( 50 %) Raziskava Diagnostični presek ponovljivosti Zasnova preiskave Med instrumenti 50 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (10 PD-L1-negativnih in 6 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran na vsakem od šestih instrumentov Autostainer Link 48. Med upravljavci 50 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (10 PD-L1-negativnih in 6 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran s šestimi analitiki na enem instrumentu Autostainer Link 48. Med dnevi 50 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (10 PD-L1-negativnih in 6 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran šest nezaporednih dni na instrumentu Autostainer Link 48. Med serijami 50 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (8 PD-L1-negativnih in 8 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran s tremi ponovitvami in vsako od treh serij reagentov na instrumentu Autostainer Link 48. Znotraj serije 50 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (10 PD-L1-negativnih in 6 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran s šestimi ponovitvami znotraj barvanja na instrumentu Autostainer Link 48. % ujemanja (95 % CI) NPA 100 % (92,9 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) NPA 100 % (92,7 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) NPA 100 % (92,9 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) NPA 100 % (92,6 100 %) PPA 100 % (92,6 100 %) OA 100 % (96,2 100 %) NPA 100 % (92,9 100 %) PPA 100 % (88,6 100 %) P03928SL_03/SK / str. 12/14

13 Raziskava Diagnostični presek ponovljivosti Zasnova preiskave Znotraj dneva 50 % Vsak od 16 vzorcev NSCLC (10 PD-L1-negativnih in 6 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran z dvema barvanjema na en dan s tridnevnim ponavljanjem na instrumentu Autostainer Link 48. NPA = odstotek negativnega ujemanja; PPA = odstotek pozitivnega ujemanja; OA = skupno ujemanje % ujemanja (95 % CI) NPA 100 % (88,3 100 %) PPA 100 % (82,4 100 %) OA 100 % (92,4 100 %) Tabela 8: obnovljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx pri testiranju na treh zunanjih lokacijah ( 1 %) Raziskava Diagnostični presek obnovljivosti Zasnova preiskave Med lokacijami 1 % Vsak od 36 vzorcev NSCLC (16 PD-L1-negativnih in 20 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran pet nezaporednih dni. Analiza med lokacijami je bila opravljena med tremi lokacijami na skupaj 2700 primerjavah po parih. Znotraj lokacije 1 % Vsak od 36 vzorcev NSCLC (16 PD-L1-negativnih in 20 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran pet nezaporednih dni na vsaki od treh lokacij raziskave. Analiza znotraj lokacije je bila opravljena za tri lokacije na skupaj 1080 primerjavah po parih. Med opazovalci 1 % Ocenjevanje 62 vzorcev NSCLC (28 PD-L1- negativnih in 34 PD-L1-pozitivnih) z razponom imunohistokemičnega izražanja PD-L1, obarvanih s PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, so na tri nezaporedne dneve izvedli trije patologi (po en na vsaki od treh lokacij raziskave). Analiza med opazovalci je bila opravljena med tremi lokacijami na skupaj 1674 primerjavah po parih. Znotraj opazovalca 1 % Preštevanje 62 vzorcev NSCLC (28 PD-L1-negativnih in 34 PD-L1-pozitivnih) z razponom imunohistokemičnega izražanja PD-L1, obarvanih s PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, so na tri nezaporedne dneve izvedli trije patologi (po en na vsaki od treh lokacij raziskave). Analiza znotraj opazovalca je bila opravljena za tri lokacije na skupaj 558 primerjavah po parih. ANA = povprečno negativno ujemanje; APA = povprečno pozitivno ujemanje; OA = skupno ujemanje % ujemanja (95 % CI) ANA 94,8 % (90,3 98,4 %) APA 95,5 % (91,2 98,7 %) OA 95,2 % (90,8 98,6 %) ANA 96,2 % (94,1 97,5 %) APA 96,7 % (95,0 97,9 %) OA 96,5 % (95,2 97,4 %) ANA 85,8 % (79,3 91,8 %) APA 88,2 % (82,2 93,3 %) OA 87,1 % (81,0 92,6 %) ANA 93,7 % (90,0 96,1 %) APA 94,8 % (91,6 96,7 %) OA 94,3 % (92,0 95,9 %) Tabela 9: obnovljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx pri testiranju na treh zunanjih lokacijah ( 50 %) Raziskava Diagnostični presek obnovljivosti Zasnova preiskave % ujemanja (95 % CI) Med lokacijami 50 % Vsak od 36 vzorcev NSCLC (21 PD-L1-negativnih in 15 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran pet nezaporednih dni. Analiza med lokacijami je bila opravljena med tremi lokacijami na skupaj 2700 rimerjavah po parih. ANA 90,3 % (84,4 95,2 %) APA 85,2 % (75,6 92,9 %) OA 88,3 % (81,4 94,3 %) Znotraj lokacije 50 % Vsak od 36 vzorcev NSCLC (21 PD-L1-negativnih in 15 PD-L1-pozitivnih) z razponom testiran pet nezaporednih dni na vsaki od treh lokacij raziskave. Analiza znotraj lokacije je bila opravljena za tri lokacije na skupaj 1080 primerjavah po parih. Med opazovalci 50 % Ocenjevanje 62 vzorcev NSCLC (30 PD-L1-negativnih in 32 PD-L1-pozitivnih) z razponom imunohistokemičnega izražanja PD-L1, obarvanih s PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, so na tri nezaporedne dneve izvedli trije patologi (po en na vsaki od treh lokacij raziskave). Analiza med opazovalci je bila opravljena med tremi lokacijami na skupaj 1674 primerjavah po parih. Znotraj opazovalca 50 % Ocenjevanje 62 vzorcev NSCLC (30 PD-L1-negativnih in 32 PD-L1-pozitivnih) z razponom imunohistokemičnega izražanja PD-L1, obarvanih s PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, so na tri nezaporedne dneve izvedli trije patologi (po en na vsaki od treh lokacij raziskave). Analiza znotraj opazovalca je bila opravljena za tri lokacije na skupaj 558 primerjavah po parih. ANA = povprečno negativno ujemanje; APA = povprečno pozitivno ujemanje; OA = skupno ujemanje ANA 91,9 % (88,8 94,8 %) APA 87,6 % (82,5 92,2 %) OA 90,2 % (86,3 93,7 %) ANA 92,6 % (87,8 96,7 %) APA 92,8 % (88,1 96,8 %) OA 92,7 % (88,1 96,8 %) ANA 96,4 % (94,0 98,5 %) APA 96,5 % (94,3 98,6 %) OA 96,4 % (94,3 98,6 %) P03928SL_03/SK / str. 13/14