Diplomsko delo DOLOČEVANJE AKTIVNOSTI NEKATERIH ENCIMOV V GRANATNEM JABOLKU september, 2018 Tamara Kobale

Diplomsko delo DOLOČEVANJE AKTIVNOSTI NEKATERIH ENCIMOV V GRANATNEM JABOLKU september, 2018 Tamara Kobale

Tamara Kobale Določevanje aktivnosti nekaterih encimov v granatnem jabolku Diplomsko delo Maribor, 2018

Določevanje aktivnosti nekaterih encimov v granatnem jabolku Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa I. stopnje Študent: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Komentor: Komentor: Tamara Kobale visokošolski strokovni študijski program I. stopnje Kemijska tehnologija diplomirani/a inženir/ka kemijske tehnologije (VS) red. prof. dr. Maja Leitgeb asist. Katja Vasić, univ. dipl. inž. kem. tehnol. doc. dr. Maša Knez Hrnčič, univ. dipl. inž. kem. tehnol. Maribor, 2018

Kazalo Kazalo... I Izjava... III Zahvala... IV Povzetek... V Abstract... VI Seznam slik... VII Seznam tabel... VIII Uporabljeni simboli in kratice... IX 1 Uvod in opredelitev problema... 1 2 Teoretični del... 2 2.1 Granatno jabolko... 2 2.2 Encimi... 2 2.2.1 Aktivno mesto encima... 2 2.2.2 α-amilaza... 3 2.2.3 Celulaza... 3 2.2.4 Lipaza... 3 2.2.5 Katalaza... 4 2.2.6 Peroksidaza... 4 2.2.7 Proteaza... 4 2.2.8 Transglutaminaza... 5 2.3 Totalni fenoli... 5 2.4 Vitamin C... 5 2.5 Vitamin E... 5 3 Eksperimentalni del... 6 3.1 Soxhletova ekstrakcija z etanolom... 6 3.2 Homogenizacija... 8 3.3 Encimski aktivnostni testi... 8 3.3.1 Aktivnostni test za α-amilazo... 9 3.3.2 Aktivnostni test za celulazo... 10 3.3.3 Aktivnostni test za lipazo... 11 3.3.4 Aktivnostni test za katalazo... 12 3.3.5 Aktivnosti test za peroksidazo... 13 3.3.6 Aktivnostni test za proteazo... 13 3.3.7 Aktivnostni test za transglutaminazo... 14 3.3.8 Bradfordova metoda... 16 3.4 Določevanje vsebnosti totalnih fenolov... 17 3.4.1 Izračuni totalnih fenolov... 19 3.5 Določanje vsebnosti proantocianidov... 20 3.5.1 Izračun vsebnosti proantocianidov... 21 3.6 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo... 22 3.6.1 Izračun antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo... 23 3.7 Določevanje vitamina C... 23 3.7.1 Izračun prisotnosti vitamina C... 24 3.8 Določevanje vitamina E... 25 3.8.1 Izračun prisotnosti vitamina E... 26 4 Rezultati in diskusija... 27 4.1 Rezultati encimskih testov v posameznih vzorcih... 27 I

4.1.1 Aktivnost α-amilaze v različnih vzorcih granatnega jabolka... 27 4.1.2 Aktivnost celulaze v različnih vzorcih granatnega jabolka... 27 4.1.3 Aktivnost lipaze v različnih vzorcih granatnega jabolka... 28 4.1.4 Aktivnost katalaze v različnih vzorcih granatnega jabolka... 29 4.1.5 Aktivnost peroksidaze v različnih vzorcih granatnega jabolka... 29 4.1.6 Aktivnost proteaze v različnih vzorcih granatnega jabolka... 30 4.1.7 Aktivnost transglutaminaze v različnih vzorcih granatnega jabolka... 31 4.2 Vsebnost totalnih fenolov v posameznih vzorcih... 31 4.3 Vsebnosti proantocianidov v posameznih vzorcih... 32 4.4 Vsebnost antioksidantov v posameznih vzorcih... 33 4.5 Vsebnost vitamina C v posameznih vzorcih... 33 4.6 Vsebnost vitamina E v posameznih vzorcih... 34 5 Zaključek... 35 6 Literatura... 36 7 Priloge... 38 7.1 Rezultati encimskih testov... 38 7.2 Rezultati totalnih fenolov, proantocianidov, antioksidantov, vitamina C in vitamina E..40 8 Življenjepis... 41 Izjava o avtorstvu in istovetnosti tiskane in elektronske oblike zaključnega dela... 43 II

Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal/a sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: Vir: ScienceDirect (https://www.sciencedirect.com/) Gesla: Število referenc Activation of some enzymes in a pomegranate 134 enzymes in pomegranate 2995 Amylase in pomegranate 369 Cellulase in pomegranate 153 Lipase in pomegranate 351 Protease in pomegranate 553 Peroxidase in pomegranate 870 Transglutaminase in pomegranate 51 Vir: National center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gesla: Število referenc Lipase in pomegranate 12 Protease in pomegranate 3 Peroxidase in pomegranate 16 Transglutaminase in pomegranate 56 Vitamin C in pomegranate 67 Vitamin E in pomegranate 1 Skupno število pregledanih člankov: 18 Skupno število pregledanih knjig: 1 Maribor, september 2018 Tamara Kobale podpis III

Zahvala Zahvaljujem se mentorici, red. prof. dr. Maji Leitgeb, za strokovno pomoč, navodila in usmerjanje tekom diplomskega dela. Posebna zahvala gre somentorici, dipl. inž. kem. tehnol., Katji Vasić, za pomoč v laboratoriju, navodila, koristne nasvete in potrpežljivost. Prav tako se zahvaljujem doc. dr. Mateji Primožič in somentorici doc. dr. Maši Knez Hrnčič za pomoč v laboratoriju. Zahvaljujem se tudi družini, ki so me ves čas študija podpirali in bili razumevajoči. IV

Povzetek Diplomsko delo opisuje določevanje aktivnosti nekaterih encimov v različnih vzorcih granatnega jabolka. Vzorci, v katerih smo določevali encimsko aktivnost so naslednji: sveži sok, liofilizirani sok, zamrznjeni sok, etanolni ekstrakt svežih pečk, etanolni ekstrakt svežih lupin, etanolni ekstrakt liofiliziranih pečk, etanolni ekstrakt liofiliziranih lupin, vodni ekstrakt svežih pečk, vodni ekstrakt svežih lupin in vodni ekstrakt liofiliziranih lupin.vzorce smo pridobili z različnimi postopki, kot so centrifugiranje, homogeniziranje in ekstrakcija z etanolom. V teh vzorcih smo določevali tudi totalne fenole, proantocianide, antioksidativnost, vitamin C in vitamin E. Encimi, katere smo določevali v naših vzorcih so: α-amilaza, celulaza, katalaza, lipaza, peroksidaza, proteaza in transglutaminaza. Z Bradfordovo metodo smo vzorcem določili koncentracijo proteinov. Granatno jabolko je polno vitaminov in fenolov, kar smo z rezultati tudi dokazali, saj smo v vseh vzorcih dobili prisotne večje količine vitaminov in fenolov. Prav tako so rezultati pokazali, da so prisotni vsi encimi, katere smo določali, vendar ne v vseh vzorcih. Ključne besede: encimi, granatno jabolko, α-amilaza, celulaza, lipaza, katalaza, peroksidaza, proteaza, transglutaminaza, vitamin C, vitamin E UDK: 604.4:577.15(043.2) V

Determination of activity of enzymes in a pomegranate Abstract The diploma paper describes the determination of the activity of certain enzymes in different samples of pomegranate apples. The samples in which the enzyme activity was determined are as follows: fresh juice, lyophilized juice, frozen juice, ethanol extract of fresh stoves, ethanol extract of fresh peel, ethanol extract of lyophilized pellets, ethanol extract of lyophilized shells, aqueous fresh stoves extract, fresh peel extract and an aqueous extract of lyophilized shells. The samples have been obtained by various processes such as centrifugation, homogenization and extraction with ethanol. Relatively high proportion of total phenols, proanthocyanides, antioxidants, vitamin C and vitamin E has been demonstrated. The identified enzymes in our samples are following: α-amylase, cellulase, catalase, lipase, peroxidase, protease and transglutaminase. The Bradford method was used to determine the concentration of proteins in the samples. Pomegranate apple is wholesome fruit with a high content of vitamins and phenols. Their presencehas been proved by the obtained results, since high amounts of vitamins and phenols was determined in all of samples. The results also indicate the presence of all determined enzymes, but not in all samples. Key words: enzymes, pomegranate, α-amylase, cellulase, catalase, lipase, peroxidase, proteaze, transglutaminase, vitamin C, vitamin E UDK: 604.4:577.15(043.2) VI

Seznam slik Slika 2.1 Granatno jabolko [3]... 2 Slika 2.2 Model ključ - ključavnica [4]... 3 Slika 2.3: Struktura encima katalaza [13]... 4 Slika 3.1 Zmlete sveže lupine (levo) in sveže pečke (desno)... 6 Slika 3.2 Ekstrakcija iz svežih lupin... 7 Slika 3.3 Uparjanje ekstrakta iz svežih lupin... 7 Slika 3.4 Homogenizacija svežih lupin... 8 Slika 3.5 Bradfordova umeritvena krivulja... 16 Slika 3.6 Pripravljeni vzorci s koncentracijo 20 mg/ml... 18 Slika 3.7 Umeritvena krivulja z galno kislino... 19 Slika 3.8 Pripravljeni vzorci s koncentracijo 50 mg/ml... 21 Slika 3.9 Pripravljeni vzorci s koncentracijo 10 mg/ml... 23 Slika 3.10 Pripravljeni vzorci za določanje vitamina E... 25 Slika 3.11 Umeritvena krivulja za vitamin E... 26 Slika 4.1: Encimska aktivnost α-amilaze v različnih vzorci... 27 Slika 4.2: Encimska aktivnost celulaze v različnih vzorcih... 28 Slika 4.3: Encimska aktivnost lipaze v različnih vzorcih... 28 Slika 4.4: Encimska aktivnost katalaze v različnih vzorcih... 29 Slika 4.5: Encimska aktivnost encima peroksidaze v različnih vzorcih... 30 Slika 4.6: Encimska aktivnost proteaze v različnih vzorcih... 30 Slika 4.7: Encimska aktivnost transglutaminaze v različnih vzorcih... 31 Slika 4.8: Rezultati vsebnosti totalni fenolov v mg GA na g vzorca... 32 Slika 4.9: Rezultati vsebnosti proantocianidov v mg PAC na g vzorca... 32 Slika 4.10: Rezultati vsebnosti antioksidantov izraženih kot % inhibicije v različnih vzorcih... 33 Slika 4.11: Rezultati vitamina C podani kot koncentracija vitamina C v različnih vzorcih... 34 Slika 4.12: Rezultati vitamina E podani kot koncentracija vitamina E v µl/ml... 34 VII

Seznam tabel Tabela 7.1: Rezultati encimskih testov 1. del... 38 Tabela 7.2: Rezultati encimskih testov 2. del... 39 Tabela 7.3: Rezultati totalnih fenolov, proantocianidov, antioksidantov, vitamina C in vitamina E... 40 VIII

Uporabljeni simboli in kratice Simboli A c M absorbanca (nm) množinska koncentracija (mol/l) molarnost ( mol/l) Grški simboli masna koncentracija (g/l) W masni delež (%) Kratice EtOH ekstrakt etanolni ekstrakt H2O ekstrakt vodni ekstrakt ( ekstrakt po homogenizaciji) GA galna kislina PAC proantocianidi U/mL enote/ml encima ph vrednost ph rpm število obratov na minuto (ang. rotation per minute) IX

1 Uvod in opredelitev problema Encimi so beljakovine, ki uravnavajo smer in hitrost biokemijskih reakcij v živih in neživih celicah, pri čemer se ne porabljajo in ne spreminjajo. Vsak encim deluje na točno določeni substrat in tako katalizira kemijsko reakcijo. Na aktivnost encima vpliva koncentracija substrata, temperatura, ph, ionska jakost pufra, prisotnost koencimov, aktivatorjev in inhibitorjev. Aktivnost encima narašča s koncentracijo substrata in doseže maksimum, ko so zasedena vsa aktivna mesta encima. Ko je doseženi maksimum, aktivnost encima več ne narašča, kljub temu, če še koncentracija encima vedno narašča. Prav tako aktivnost encima narašča s temperaturo do temperaturnega optimuma encima. Nad temperaturnim optimumom encim preneha delovati in izgubi svoje lastnosti. To pomeni, da spremeni razporeditev aminokislin v aktivnih centrih. Aktivnost encima je največja pri optimalnem ph, kar pomeni, da vsako odstopanje od optimalnega ph zmanjša aktivnost encima. Encimi so torej katalizatorji, kar pomeni, da imajo naslednje lastnosti: povečajo hitrost reakcije, tako da znižajo energijsko bariero, med reakcijo se ne spreminjajo in ne porabljajo, ne vplivajo na ravnotežje reakcije, ampak samo na hitrost s katero dosežejo ravnotežje, običajno tvorijo z reaktanti začasni kompleks in tako stabilizirajo prehodno stanje. [1] Granatno jabolko je bogat vir vitamina C, vitamina B, vitamina E, antioksidantov, fenolov, mineralov, predvsem kalcija, fosforja, kalija in magnezija. [2] [3] Namen diplomskega dela je bil določiti aktivnost nekaterih encimov v granatnem jabolku. Encimi, ki smo jih določali so naslednji: α-amilaza, celulaza, lipaza, katalaza, peroksidaza, proteaza in transglutaminaza. Z Bradfordovo metodo smo določili vsebnosti proteinov v danih vzorcih. Diplomsko delo obsega Soxhletovo ekstrakcijo z etanolom, homogenizacijo, encimske aktivnostne teste, določevanje totalnih fenolov, proantocianidinov, določevanje antioksidativnosti z radikalsko metodo, določevanje vitamina C in vitamina E. 1

2 Teoretični del 2.1 Granatno jabolko Granatno jabolko je sadež značilne rdeče barve. Uvrščamo ga v družino granatovk. Sadež prihaja iz Zahodne Azije, uspeva predvsem v Sredozemlju. Po obliki je podobno jabolkam. Ima trdo, rdečkasto zlato lupino. Sadež granatnega jabolka vsebuje veliko sadnih kislin, vitaminov, mineralov. Granatno jabolko ima antioksidativne učinke, protivnetne učinke in številne zdravilne učinke, kot so upočasnitev staranja, zaradi visoke vsebnosti polifenolov, ne povišajo nivoja testosterona, ne nižajo nivoja slabega holesterola in tako zniževat možnosti za razvoj srčno-žilnih bolezni, preprečuje vnetja, uravnava krvni tlak, lahko prepreči Alzhmerjevo bolezen, je odlično v boju proti sladkorni bolezni in lahko tudi prepreči širjenje rakastih celic. [2] Na sliki 2.1 vidimo sadež granatnega jabolka. Na sredini so pečke, katere so užitne in so obdane z lupino. Slika 2.1 Granatno jabolko [3] 2.2 Encimi Encimi so proteini, ki katalizirajo kemijske in biokemijske reakcije. So selektivni, kar pomeni, da katalizirajo samo specifične kemijske reakcije. Specifičnost je posledica različnih oblik encimskih molekul. Proteini oz. molekule, ki sestavljajo encime so globularne beljakovine. Enicimi imajo kompleksno primarno, sekundarno, terciarno in kvartarno strukturo. V aktivnih mestih encimov je prisotnih veliko reaktivnih aminokislinskih ostankov, ki omogočajo katalitične aktivnosti. Reakcije se s pomočjo encimov odvijajo zelo hitro, kar pa je zelo pomembno pri uničevanju virusov, bakterij in rakastih celic. Brez encimov bi se metabolizem razvijal prepočasi, da bi celice imele korist.[2] 2.2.1 Aktivno mesto encima Molekula substrata se veže na molekulo encima, pri čemer nastane kompleks ES (kompleks encim substrat). Nastanek kompleksa encim substrat opisuje model ključa in ključavnice, kar vidimo na sliki 2.2. Molekula substrata se veže na aktivno mesto encima, to je posebno področje na molekuli encima, kjer je vdolbina v tridimenzionalni strukturi. Tukaj poteka kataliza. Aktivno mesto je specifično, kar pomeni, da izmed množice substratov prepozna le 2

nekatere. Aktivno mesto predstavlja relativno majhno tridimenzionalno področje v strukturi encimov. Substratne molekule se vežejo na pravo mesto v aktivnem mestu s šibkimi nekovalentnimi reverzibilnimi interakcijami. Prevladujejo ionske in vodikove vezi. [2] Slika 2.2 Model ključ - ključavnica [4] 2.2.2 α-amilaza Encim α-amilaza se uporablja v industriji škroba, pekarski industriji, pivovarstvu in tekstilni industriji. Amilaze spadajo med hidrolaze in hidrolizirajo škrob in glikogen. Hidrolaze katalizirajo hidrolizo C-O, C-N, C-C in drugih kovalentnih vezi. Amilaza razgrajuje škrob do enostavnih sladkorjev. Prisotna je v ustih, kjer se začne razgradnja škroba. Ima pomembno vlogo na področju biotehnologije. [4] Amilaza pomaga v telesu razgraditi ogljikove hidrate. Amilazo proizvaja trebušna slinavka, ki hidrolizira prehranski škrob v disaharide in polisaharide, ki se nato pretvorijo v glukozo in zagotavljajo potrebno energijo za človeško telo. Človeško telo ni edino, ki proizvaja amilazo. Najdemo jo tudi v rastlinah, bakterijah in plesnih. [5] [6] 2.2.3 Celulaza Celulaza je encim, ki ga proizvajajo bakterije, glive in enoceličarji. Celulaza hidrolizira β-1,4- glikozidne vezi celuloze. Celulaze razgradijo molekulo celuloze do molekule glukoze. Encimi celulaze so zelo koristni za človeško telo, ker nadzirajo koncentracijo sladkorja v krvi, tako da pretvorijo celulozo v β-glukozo. Encim celulaza je koristen tudi za razkroj nekaterih elementov v polisaharidih. Celulaza ima pomembno vlogo v industriji in farmaciji. Je pomembna sestavina detergentov za pranje perila, čistil in pralnih sredstev. V industriji biogoriv fermentira biomaso. Celulazo najdemo v sadju in zelenjavi, v človeškem telesu pa ni prisotna. [7] 2.2.4 Lipaza Lipaza je zelo pomemben encim v procesu prebave lipidov, najdemo ga v presnovi človeka ali kot del prehrane. Proizvaja se v trebušni slinavki. Lipaza pomaga telesu ohranjati zdravo stanje, zato pomanjkanje lipaze vodi do številnih bolezni. Prav tako pomaga prebavljati maščobe in ohranja pravilno delovanje žolčnika. [8][9] Lipaze so encimi, ki hidrolizirajo katalizo estrov - triacilglicerolov v diacilglicerole, monoacilglicerole, glicerole in maščobne kisline. Lipazo najdemo v bakterijah, glivah, rastlinah in živalih. Lipaze uporabljamo za hidrolizo maščob, pri sintezi arom, za razgradnjo odpadkov, v živilski industriji, farmaciji, medicini, papirni industriji. Lipaze so vsestranski biokatalizatorji, ki katalizirajo različne vrste reakcij, kot so hidroliza in esterifikacija. [10] 3

2.2.5 Katalaza Katalaza je encim, ki katalizira razgradnjo vodikovega peroksida v kisik in vodo. Katalaza je pogosti encim, ki ga najdemo v skoraj vseh živih organizmih in je pomemben na mnogih biotehnoloških področjih in v živilski industriji. Ena molekula katalaze lahko vsako sekundo razgradi milijon molekul vodikovega peroksida do vode in kisika. [11] Pri človeku se encim katalaza nahaja v jetrih. Katalaza je tetramerni protein, sestavljen iz 4 polipeptidnih verig, vsak monomer je iz 500 aminokislinskih ostankov. Ima primarno, sekundarno, terciarno in kvartarno strukturo. Katalazo uvrščamo v razred encimske klasifikacije imenovan oksidoreduktaze. Uporablja se v prehranski industriji, za odstranjevanje vodikovega peroksida iz mleka za sirne izdelke. V tekstilni industriji se uporablja za odstranjevanje vodikovega peroksida iz vlaken, da materiali ne vsebujejo peroksidov. Uprablja se tudi v ovitkih za hrano, da prepreči oksidacijo določene hrane. [12] Na sliki 2.3 vidimo strukturo encima katalaze. Slika 2.3: Struktura encima katalaza [13] 2.2.6 Peroksidaza Peroksidaza je encim iz skupine oksidoreduktaz. Po zgradbi je protein s prostetično skupino hem. Katalizira oksidacijo substrata, pri čemer se reducira vodikov ali organski peroksid. Uporablja se kot indikator v imunologiji, saj je živo obarvana v bližini UV svetlobe, lahko jo vežemo na protitelesa in je relativno stabilna. [14] [15] 2.2.7 Proteaza Proteaze lahko imenujemo tudi proteinaze ali peptidaze. So encimi, ki katalizirajo razgradnjo beljakovin v manjše peptide oziroma popolno razgradnjo do aminokislinskih preostankov. Proteaze so selektivne, saj posamezna proteaza razgradi polipeptidno verigo glede na specifično zaporedje aminokislin pod določenimi pogoji okolja. Spadajo v skupino hidrolaz, ki pri delovanju uporabljajo molekulo vode za nukleofilni napad na karbonilno skupino v amidni vezi. Glede na mesto hidrolize peptidne vezi v polipeptidni verigi delimo na endopeptidaze in eksopeptidaze. Proteaze omogočajo znotrajcelično in zunajcelično razgradnjo proteinov, regulirajo aktivnost pro-encimov in pro-hormonov, sodelujejo pri 4

preoblikovanju kostnega tkiva, razgradnji in preoblikovanju zunajceličnega matriksa, sodelujo pri procesu razvoja embria, ovulaciji, zdravljenju ran in imunskem odzivu. [16] 2.2.8 Transglutaminaza Transglutaminaza je encim, ki katalizira tvorbo izopeptidnih vezi med beljakovinami. Uporablja se v različnih postopkih, kot je proizvodnja sira in drugih mlečnih izdelkov, pri predelavi mesa ter za proizvodnjo pekovskih izdelkov. Transglutaminaza ima potencial za izboljšanje trdnosti, viskoznosti, elastičnosti tkiva in sposobnosti vezave vode za živila. Pomembna je v biotehnologiji in v živilski industriji. [17] 2.3 Totalni fenoli Fenoli so najbolj znani sekundarni rastlinski metaboliti. Zaradi koristnih učinkov na rastline in ljudi so zelo cenjeni. Polifenoli so strukturno zelo različni. Fenoli v granatnem jabolku inhibirajo α-glukozidazo, dipeptidil peptidazo-4, lipazo. Polifenoli granatnega jabolka so znani kot močni antioksidanti s koristnimi učinki, kot so preprečevanje debelosti in diabetesa. [18] 2.4 Vitamin C Vitamin C je poznan kot askorbinska kislina. Vitamin C deluje kot antioksidant, samostojno ali v kombinaciji z vitaminom E in tako naše telo ščiti pred prostimi radikali. Pomemben je za normalno delovanje možganov, živčevja, sintezo kolagena in za vsa naša mehka tkiva. Vitamin C je topen v vodi. Askorbinska kislina sodeluje pri sintezi kortikosteroidov in aldosterona. Pomembno vlogo ima tudi pri biosintezi, razgradnji adrenalina in noradrenalina z dopamin β-hidroksilazo. Dober vir vitamina C je sveža zelenjava, sadje in krompir. Askorbinsko kislino presnavlja DHA, 2,3-diketoglukonska kislina in oksalna kislina. [19] Vitamin C je najpomembnejši antioksidant. Vsebnost vitamina C v sadju je različna in odvisna od sorte sadja, vrste tkiva, izvora, podnebja, lege, osvetljenosti tal in zrelosti. Mnoge živali so sposobne same sintetizirati vitamin C, medtem ko ga mora človek v svoj organizem vnesti z ustezno prehrano. Vitamin C je ogljikovim hidratom sorodna kemijska spojina, sintetizirana iz monosaharidov preko glukuronske kisline. [20] 2.5 Vitamin E Vitamin E imenovan tokoferol je topen v maščobi. Ima vlogo antioksidanta, kar pomeni, da ščiti celice pred oksidativnim stresom in s tem zmanjša tveganje za različne bolezni, predvsem srčno-žilne bolezni. V telo ga vnesemo z ustrezno prehrano, priporočen dnevni vnos za odraslega človeka je 12 mg. Med najbolj pomembne predstavnike vitamina E uvrščamo tokoferole in tokotrienole. Med sabo se strukturno razlikujejo, predvsem v številu dvojnih vezi, položaju metilnih in funkcionalnih skupin. V živilih se vitamin E najbolj nahaja v obliki γ-tokoferola, najbolj aktivna oblika pa je α-tokoferol. [21][22] 5

3 Eksperimentalni del Eksperimentalni del smo izvajali večinoma v mikrobiološkem laboratoriju in nekaj tudi v laboratoriju za separacijske procese in produktno tehniko na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Univerze v Mariboru. Za izvedbo eksperimentov smo uporabili naslednje laboratorijske metode: Soxhletova ekstrakcija z etanolom Homogenizacija Encimski aktivnostni testi Določanje totalnih fenolov Določanje vsebnosti proantocianidinov Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo Določanje vitamina C Določanje vitamina E in Bradfordova metoda za določanje koncentracije proteinov v vzorcih Za določanje encimskih aktivnostnih testov, totalnih fenolov, proantocianidinov, antioksidantov, vitamina C in vitamina E smo potrebovali vzorce, ki smo jih predhodno pripravili. Vzorci so bili naslednji: sveži sok, liofilizirani sok, zamrznjeni sok, EtOH ekstrakt svežih pečk in lupin, EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk in lupin ter H2O ekstrakt svežih in liofiliziranih pečk in lupin granatnega jabolka. Sveži sok smo dobili tako, da smo ga iztisnili iz granatnega jabolka. Nekaj svežega soka smo dali v liofilizator in tako dobili vzorec liofiliziranega soka, nekaj pa smo ga zamrznili za približno 2 meseca. Etanolne ekstrakte svežih in liofiliziranih lupin in pečk smo dobili s Soxhletovo ekstrakcijo z etanolom, ki je opisana v poglavju 3.1. Vodne ekstrakte svežih lupin in pečk smo dobili z homogenizacijo, opisano v poglavju 3.2. 3.1 Soxhletova ekstrakcija z etanolom Za ekstrakcijo smo uporabili sveže lupine in pečke ter liofilizirane lupine in pečke, tako da smo dobili 4 etanolne vzorce za določanje encimov in vitaminov. Najprej smo iz granatnega jabolka izluščili pečke ter jo olupili. Pečke in lupine smo nato zmleli s paličnim mešalnikom in dobili zmes, ki je prikazana na sliki 3.1. Pečke smo še centrifugirali in dobili sok, ki smo ga uporabili za določanje encimov in vitaminov ter maso pečk, ki smo jo uporabili pri ekstrakciji. Slika 3.1 Zmlete sveže lupine (levo) in sveže pečke (desno) 6

Za ekstrakcijo svežih lupin smo v tulec zatehtali 25 g tako pripravljenih svežih lupin. Kot topilo smo uporabili 150 ml etanola, ki smo ga nalili v bučko. Etanol v bučki smo segrevali preko vodne kopeli, v hladilniku so se utekočinile pare in kondenzat je kapljal v tulec iz filternega papirja. Ko je raztopina napolnila nastavek do višine odtoka, je stekla nazaj v bučko. Recikli so se tako ponavljali, dokler ni bila raztopina bistre barve in se je ekstrakcija zaključila. Ekstrakcijo smo izvajali pri sobni temperaturi približno 4 ure. Ekstrakt v bučki smo še uparjali z rotavaporjem, da smo se znebili etanola in vode. Ekstrakcija svežih lupin je prikazana na sliki 3.2. Uparjanje ekstrakta svežih lupin pa na sliki 3.3. Slika 3.2 Ekstrakcija iz svežih lupin Slika 3.3 Uparjanje ekstrakta iz svežih lupin 7

Enake postopke ekstrakcije smo ponovili za sveže in liofilizirane pečke ter lupine. Svežih pečk smo zatehtali 25 g, liofiliziranih pečk in lupin pa smo zatehtali 5 g. V vseh primerih smo dodali 150 ml etanola in ponovili postopek ekstrakcije. 3.2 Homogenizacija Pri homogenizaciji smo uporabili sveže pečke in lupine ter liofilizirane lupine. Homogeniziranje je potekala tako, da smo s homogenizatorjem zmešali zmes, ki je na sliki 3.4. Dobljene ekstrakte po homogeniziranju smo uporabili za določanje encimov, fenolov, proantocianidov, antioksidantov in vitaminov. Slika 3.4 Homogenizacija svežih lupin 3.3 Encimski aktivnostni testi Z encimskimi aktivnostnimi testi smo določali aktivnost določenih encimov v različnih vzorcih. Izvedli smo teste za sledeče encime: α-amilazo celulazo katalazo lipazo peroksidazo proteazo transglutaminazo Bradfordovo metodo smo izvedli za določanje koncentracije proteinov v vzorcih. Vzorci, dobljeni iz granatnega jabolka, katerim smo določali encimsko aktivnost so: sveži sok liofilizirani sok zamrznjeni sok EtOH ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin 8

EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin H2O ekstrakt svežih pečk H2O ekstrakt svežih lupin H2O ekstrakt liofiliziranih lupin Pri določanju encimskih aktivnostnih testov smo imeli vedno vzorec in slepo probo. S vzorcem smo merili aktivnost encimov v naših vzorcih, ki so zgoraj našteti. Slepo probo pa smo uporabljali za umerjanje spektrofotometra, ki so predstavljali prekuhane vzorce. Prekuhane vzorce smo dobili s prekuhavanjem 10 min v zaprti posodi. Natančen postopek posameznih encimskih aktivnostnih testov je opisan v podpoglavju 3.3. 3.3.1 Aktivnostni test za α-amilazo Kemijska reakcija: Amiloza Azur + H2O α amilaza produkt barvne reakcije Pripravili smo naslednje reagente: 20 mm kalijev fosfatni pufer z 50 mm natrijevim kloridom Pripravili smo 20 mm kalijev fosfatni pufer, tako da smo zatehtali 0,2722 g KH2PO4 in 0,2925 g NaCl ter raztopili v 100 ml bučki z deionizirano vodo do oznake. Raztopino smo umerili na ph 7 pri 37 C z 1 M KOH. Amylose Azure Zatehtali smo 22,5 mg Amylose Azure v vsako epruveto, ko smo začeli z izvajanjem testov. 2770 mm raztopina ocetne kisline (HOAc) Pripravili smo raztopino ocetne kisline (HOAc), tako da smo 15,8 ml ocetne kisline raztopili v 100 ml bučki z destilirano vodo do oznake. Vzorci, ki so našteti v poglavju 3.3 Opis postopka: V vsako epruveto za vzorec in slepo probo smo zatehtali 22,5 mg reagenta Amylose Azure. Dodali smo 1,125 ml 20 mm kalijevega fosfatnega pufra z 50 mm natrijevim kloridom v epruvete in inkubirali na 37 C 5 minut. Nato smo v tako pripravljeno mešanico dodali 0,125 ml vzorcev in v slepo probo 0,125 ml prekuhanih vzorcev. Vzorce in slepe probe smo zmešali na vorteksu in jih inkubirali na 37 C 10 minut. Po 10 minutah smo dodali 0,5 ml HOAc v vzorec in slepo probo. Nato smo vse vzorce prefiltrirali, saj se je ustvarila modra oborina, ki bi motila merjenje absorbance. Tako pripravljenim vzorcem smo izmerili absorbanco pri 595 nm. 9

3.3.1.1 Izračun aktivnosti α-amilaze Aktivnost encima α-amilaze v naših vzorcih smo izračunali iz enačbe 3.1: U ml = ΔA (10) (0,125) (3.1) kjer je: ΔA = povprečje absorbance (nm) 10 = čas testa (min) 0,125 = volumen vzorca (ml) 3.3.2 Aktivnostni test za celulazo Kemijska reakcija : Celuloza + H2O celulaza kjer je: ATP ADP β-nad β-nadh G-6PDH 6-PG D-Glukoza + ATP heksokinaza D-Glukoza D-Glukoza-6-fosfat + β-nad G 6PDH D-Glukoza-6-fosfat + ADP 6-PG + β-nadh = Adenozin-5'-trifosfat = Adenozin-5'-difosfat = β-nikotinamid adenin dinukletotid, oksidirana oblika = β-nikotinamid adenin dinukleotid, reducirana oblika = Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza = 6-fosfo-D-glukonat Pripravili smo naslednje reagente: 50 mm natrijev acetatni pufer Pripravili smo 50 mm natrijev acetatni pufer, tako da smo zatehtali 1,701 g natrijevega acetata (CH3COONa) in ga raztopili v 250 ml deionizirane vode. Raztopino smo umerili na ph 5 pri 37 C z 1 M HCl. 5 % raztopina Sigmacell Pripravili smo 5 % raztopino Sigmacell. Zatehtali smo 5 g Sigmacella in ga raztopili z 50 mm natrijevim acetatnim pufrom v 100 ml bučki do oznake. Vzorci, našteti v poglavju 3.3 Glukoza Assay Opis postopka: Pripravili smo centrifugirke za vzorce in slepe probe. V vse centrifugirke smo odpipetirali 4 ml 5 % raztopine Sigmacell in inkubuirali 5 minut na 37 C. Nato smo v vzorce dodali 1 ml vzorca in v slepo probo 1 ml prekuhanega vzorca. Raztopine smo premešali na vorteksu in inkubirali 2 uri pri 37 C. Po dveh urah smo vzorce v centrifugirkah ohladili na ledu ter počakali, da se raztopina posede. Kasneje smo raztopine v centrifugirkah centrifugirali 2 min pri 11000 rpm. V 1,5 ml mikrocentrifugirke smo odpipetirali 0,75 ml reagenta Glukoza Assay in tik pred merjenjem dodali 0,025 ml supernatanta iz centrifugirk. Tako pripravljenim vzorcem smo merili kinetiko 5 minut pri valovni dolžini 340 nm. 10

3.3.2.1 Izračun aktivnosti celulaze Aktivnost encima celulaze v naših vzorcih smo izračunali iz enačbe 3.2. U ml = (ΔA(vzorec) ΔA(slepa proba)) (0,775) (5) (df) (6,22) (2) (1) (0,025) (3.2) kjer je: (ΔA (vzorec) ΔA(slepa proba)) = povprečje absorbance vzorcev minus povprečje absorbance slepe probe (nm) 0,775 = volumen reagenta Glukoza Assay (ml) 5 = končni volumen, ki ga dodamo pred dvema urama inkubiranja df = faktor redčenja 6,22 = milimolarni koeficient β-nadh pri 340 nm 2 = pretvorbeni faktor 1 = volumen dodanega vzorca (ml) 0,025 = volumen supernatanta (ml) 3.3.3 Aktivnostni test za lipazo Kemijska reakcija: PNPB + H2O LPL p-nitrofenol + butanojska kislina kjer je: PNPB = p-nitrofenil butirat LPL = lipoprotein lipaza Pripravili smo naslednje reagente: 100 mm natrijev fosfatni pufer z 150 mm natrijevim kloridom in 0,5 % tritonom Pripravili smo 100 mm natrijevega fosfatnega pufra z 150 mm natrijevega klorida in 0,5 % tritona, tako da smo zatehtali 1,2 g natrijevega fosfata (NaH2PO4), 0,88 g natrijevega klorida (NaCl) in odpipetirali 0,5 ml tritona. Raztopino smo umerili na ph 7,2 pri 37 C z 1 M NaOH. Acetonitril (CH3CN) 50 mm p-nitrofenil butirat (PNPB) Pripravili smo 50 mm p-nitrofenil butirat (PNPB), tako da smo zatehtali 10,45 mg PNPB-ja in ga raztopili v 1 ml acetonitrila. Vzorci, ki so našteti v poglavju 3.3 Opis postopka: Pripravili smo 1,5 ml mikrocentrifugirke za vzorce in slepe probe ter v vsako odpipetirali 0,9 ml pripravljenega reagenta 100 mm natrijevega fosfatnega pufra z 150 mm natrijevim kloridom in 0,5 % tritonom in 0,10 ml vzorcev. Mikrocentrifugirke z raztopino smo premešali na vorteksu in dali inkubirat za 5 minut na 37 C. Nato smo tik pred merjenjem v slepe probe dodali 0,01 ml deionizirane vode in v vzorce 0,01 ml vzorca. Merili smo kinetiko 5 minut na 400 nm. 11

3.3.3.1 Izračun aktivnosti lipaze Aktivnost encima lipaze v naših vzorcih smo izračunali iz enačbe 3.3. U ml = (ΔA(vzorec) ΔA(slepa proba)) (1,01) (df) (0,0148) (0,1) (3.3) kjer je: 1,01 = volumen dodanih reagentov (ml) 0,0148 = mikromolarni koeficient p-nitrofenola pri 400 nm 0,1 = volumen dodanega vzorca (ml) 3.3.4 Aktivnostni test za katalazo Pripravili smo naslednje reagente : 50 mm kalijev fosfatni pufer Pripravili smo 50 mm kalijev fosfatni pufer, tako da smo odpipetirali 6,15 ml 1 M K2HPO4 in 3,85 ml 1 M KH2PO4 ter razredčili z deionizirano vodo v 200 ml bučki do oznake. Raztopino smo umerili na ph 7 pri 25 C z 1 M KOH. 0,036 % vodikov peroksid (H2O2) Pripravili smo raztopino 0,036 % vodikov peroksid (H2O2), tako da smo odpipetirali 0,12 ml H2O2 v 100 ml bučko in z deionizirano vodo dopolnili do oznake. Vzorci, ki so našteti v poglavju 3.3 Opis postopka: V epruvete smo odpipetirali 2,90 ml H2O2 in tik pred merjenjem dodali vzorce. V slepe probe smo dodali 0,10 ml prekuhanega vzorca, s čimer smo umerili spektrofotomer. V vzorce smo dodali 0,10 ml vzorca, s katerimi smo merili aktivnost encima v danem vzorcu, tako, da smo merili kinetiko 3 minute pri 240 nm. 3.3.4.1 Izračun aktivnosti katalaze Aktivnost encima katalaze smo izračunanali iz enačbe 3.4. U = (3,45) (df) ml (t) (0,1) (3.4) kjer je: 3,45 = pretvorbeni faktor t = čas, ko se zmanjša absorbanca od 0,45 do 0,40 nm (min) 0,1 = volumen dodanega vzorca (ml) 12

3.3.5 Aktivnosti test za peroksidazo Pripravili smo naslednje reagente: 4-APP (4-aminoantipiridin) Pripravili smo 4-APP (4-aminoantipiridin), tako da smo zatehtali 810 mg fenola in 25 mg 4- APP ter raztopili v 50 ml destilirane vode. Vodikov peroksid ( H2O2) Pripravili smo vodikov peroksid (H2O2), tako da smo odmerili 99 ml destilirane vode in dodali 1 ml H2O2 ter premešali. Nato smo dodali 49 ml PBS in 1 ml H2O2 ter raztopino dobro premešali. PBS pufer Pripravili smo PBS pufer, tako da smo zatehtali 6,89 g Na2H2PO4xH2O in ga raztopili z deionizirano vodo v 250 ml bučki do oznake. Vzorci, ki so našteti v poglavju 3.3 Opis postopka: Pripravili smo epruvete za vzorce in slepe probe, v katere smo odpipetirali 1,4 ml 4-APP, 1,5 ml H2O2 in tik pred merjenjem smo dodali 0,5 ml prekuhanega vzorca v slepo probo in 0,5 ml vzorca v vzorce. Merili smo kinetiko 4 minute pri 510 nm. 3.3.5.1 Izračun aktivnosti peroksidaze Aktivnost encima peroksidaze v vzorcih smo izračunali iz enačbe 3.5. A = ΔA 6,58 V c kjer je: A = encimska aktivnost v U/mg V = volumen dodanih reagentov (ml) 6,58 = konstanta (M -1 cm -1 ) C = koncentracija proteinov (mg/ml) (3.5) 3.3.6 Aktivnostni test za proteazo Pripravili smo naslednje reagente: Fosfatni pufer Zatehtali smo 0,157 g KH2PO4 in 1,25 g NaHPO4 vsakega v svojo čašo in ju s pomočjo magnetnega mešala raztopili v majhni količini deionizirane vode. Raztopljeni raztopini smo prenesli v 100 ml bučko in jo razredčili z deionizirano vodo do oznake. Raztopina trikloroocetne kisline (5 % TCA) V 100 ml bučko smo z deionizirano vodo raztopili 5 g kristalinične TCA. Kazein V manjšo časo smo zatehtali 0,2 g kazeina (Hammarsten bovine) in mu dodali 20 ml predhodno pripravljenega fosfatnega pufra. Raztopino smo mešali in segrevali do vrenja, da se je raztopil ves kazein. Tako pripravljen kazein smo hranili v hladilniku največ 1 teden. 13

Opis postopka: V pripravljene centrifugirke za vzorce in slepe probe smo dali 1 ml kazeina in ga 5 min inkubirali na 35 C. Nato smo v vzorce dali 0,5 ml vzorca in v slepe probe 0,5 ml prekuhanega vzorca. V vse smo dodali še 0,5 ml fosfatnega pufra in inkubirali 20 min pri 35 C. Po inkubiranju smo dodali 3 ml 5 % TCA raztopine in inkubirali še 30 min pri sobni temperaturi. Nato smo vzorce dali v centrifugo za 20 minut na 6000 rpm. Po centrifugiranju smo odpipetirali supernatant in izmerili absorbanco supernatanta pri valovni dolžini 280 nm. 3.3.6.1 Izračun aktivnosti proteaze Aktivnost proteaze v naših vzorcih smo izračunali iz enačbe 3.6. 1 TUCAS (µl) = V(vzorca) 20 A(Test) kjer je: V(vzorca) = volumen vzorca (500 µl) 20 = faktor A(Test) = izmerjena absorbanca vzorca pri 280 nm (3.6) 3.3.7 Aktivnostni test za transglutaminazo Kemijska reakcija: CBZ-Gln-Gly + hidroksilamin transglutaminaza CBZ-Gln-Gly-hidroksamat kjer je: CBZ Gln Gly = ogljikov benzol = glutamin = glicin Pripravili smo naslednje reagente: 1000 mm Tris pufer Zatehtali smo 6,057 g Trizma base in ga raztopili v 50 ml deionizirane vode. Raztopino smo umerili na ph 6 pri 37 C z ocetno kislino. CBZ-glutaminglicin 200 mm hidroksilamin in 20 mm glutation Zatehtali smo 138,98 mg hidroksilamin hidroklorida in 61,5 mg glutationa ter raztopili v 10 ml deionizirane vode. Ta reagent smo pripravili vedno sveži. 1000 mm raztopina kalcijevega klorida (CaCl2) Zatehtali smo 0,147 g kalcijevega klorida dihidrata (CaClx2H2O) in ga raztopili v 1 ml deionizirane vode. 10 mm L-glutaminska kislina Y-monohidroksamat Zatehtali smo 16,21 mg L-glutaminske kisline Y-monohidroksamata in ga raztopili v 10 ml destilirane vode. 12 % trikloroocetna kislina (TCA) V 100 ml deionizirane vode smo raztopili 12 g trikloroocetne kisline. 5 % raztopina železovega klorida (FeCl3) 14

Zatehtali smo 5 g železovega klorida heksahidrata in ga raztopili v 100 ml 100 mm klorovodikove kisline. 100 mm klorovodikova kislina Odpipetirali smo 0,83 ml 37% klorovodikove kisline in jo raztopili v 100 ml deionizirane vode. Vzorci, našteti v poglavju 3.3 Reakcijski koktajl Pripravili smo vedno sveže pripravljen reakcijski koktajl, tako da smo zatehtali 120 mg reagenta CBZ-glutaminglicin in dodali 2 ml reagenta 1000 mm Tris pufer in 5 ml reagenta 200 mm hidroksilamin in 20 mm glutation. Raztopino smo zmešali na vorteksu ter dodali 0,05 ml reagenta 1000 mm CaCl2. Raztopino smo ponovno zmešali na vorteksu in jo umerili na ph 6 pri 37 C z 100 mm NaOH. Nato smo dodali še deionizirano vodo do končnega volumna 10 ml. Opis postopka: Pripravili smo centrifugirke. Pri tem testu smo imeli še poleg vzorca in slepe probe tudi Standard (Std.) in Standard slepo probo (Std.slepa proba). V vzorce smo odpipetirali 0,20 ml reakcijskega koktajla in ga inkubirali na 37 C 5 minut. Nato smo v vzorce dodali 0,03 ml vzorca in jih inkubirali 10 minut na 37 C. Med tem časom smo v Std. slepo probo odpipetirali 0,10 ml deionizirane vode, v slepo probo 0,20 ml reakcijskega koktajla in v Std. 0,10 ml 10 mm L-glutaminske kisline Y-monohidroksamata. Po 10 minutah smo vzorce vzeli iz inkubatorja. V vse vzorce smo dodali 0,50 ml TCA. V slepo probo smo dodali 30 ml prekuhanega vzorca. Vse centrifugirke smo zvorteksirali, da se je raztopina dobro premešala. Nato smo v vse dodali 0,50 ml FeCl3, premešali na vorteksu in jih centrifugirali 5 minut. Po 5 minutah smo odpipetirali raztopino v 1,5 ml mikrocentrifugirke in izmerili absorbanco pri 525 nm. 3.3.7.1 Izračun aktivnosti transglutaminaze Aktivnost transglutaminaze za vzorce smo izračunali iz enačbe 3.7. U ml = (ΔA(vzorec) ΔA (slepa proba)) E(mM) (1,23) 10 (3.7) kjer je: 1,23 = volumen barvnega miksa (ml) 10 = čas reakcije (min) E(Mm) = se izračuna po enačbi 3.8 E(mM) = (A(Std. ) A(Std. slepa proba)) 1.1 (3.8) kjer je: 1,1 = volumen standarda (ml) 15

absorbanca pri 595 nm 3.3.8 Bradfordova metoda Z Bradfordovo metodo smo vzorcem izmerili koncentracijo proteinov, ki smo jo potrebovali pri izračunih encimskih aktivnostnih testov. Reagenti: Bradfordov reagent Bradfordov reagent smo pripravili tako, da smo raztopili 50 mg Coomassie Brilliant Blue v 25 ml 95 % etanola in v 50 ml 85 % fosforne kisline (H3PO4) ter razredčili z destilirano vodo v 500 ml bučki do oznake. Nato smo Bradfordov reagent prenesli v plastenko zavito z aluminijasto folijo, saj reagent ne sme biti izpostavljen svetlobi. Opis postopka: Pripravili smo 1,5 ml mikrocentrifugirke za vzorce in slepe probe. V vse mikrocentrifugirke smo odpipetirali 1 ml Bradfordovega reagenta. V slepo probo smo dodali 20 µl prekuhanega vzorca, v vzorce pa 20 µl vzorca. Raztopine smo zvorteksirali, da se je raztopina dobro premešala. Po 15 minutah inkubiranja na sobni temperaturi smo izmerili absorbanco pri 595 nm. Umeritvena krivulja: Pripravili smo umeritveno krivuljo, ker smo jo potrebovali za izračune encimskih aktivnostnih testov. Za pripravo umeritvene krivulje smo uporabili protein albumin v koncentracijskem območju od 0 do 1 mg/ml. Zatehtali smo 10 mg albumina in dodali 1 ml Milli-Q vode. Pripravili smo si koncentracijo albumina 10 mg/ml in razredčili po naslednjem principu: Samo Milli-Q voda 0,0 mg/ml 20 µl albumina + 980 µl Milli-Q vode 0,2 mg/ml 40 µl albumina + 960 µl Milli-Q vode 0,4 mg/ml 60 µl albumina + 940 µl Milli-Q vode 0,6 mg/ml 80 µl albumina + 920 µl Milli-Q vode 0,8 mg/ml 100 µl albumina + 900 µl Milli-Q vode 1,0 mg/ml Umeritvena krivulja, ki smo jo dobili je prikazana na sliki 3.5. 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 y = 0,6157x R² = 0,9988 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 koncentracija BSA [mg/ml] Slika 3.5 Bradfordova umeritvena krivulja 16

3.3.8.1 Izračun vsebnosti proteinov po Bradfordu Enačba 3.9 prikazuje izračun koncentracije proteinov po Bradfordu. c = ΔA 0,6157 kjer je: C = koncentracija proteinov v naših vzorcih (mg/ml) ΔA = povprečje absorbance (nm) 0,6157 = naklon iz umeritvene krivulje (3.9) 3.4 Določevanje vsebnosti totalnih fenolov Kemikalije: Foln-Ciocalteu reagent (FC) Galna kislina (GA) Natrijev (V) karbonat (Na2CO3) Reagenti: Raztopina FC reagenta (Folin-Ciocalteu reagent) Osnovno raztopino FC reagenta smo razredčili z destilirano vodo v razmerju 1:10 Raztopina Na2CO3 koncentracije 75 g/l Pribor: Merilne bučke (10 ml in 25 ml) Stekleničke Avtomatska pipeta Spatula Aparature: Analitska tehnica Spektrofotometer Vzorci, dobljeni iz granatnega jabolka: Sveži sok Liofilizirani sok Zamrznjeni sok EtOH ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin H2O ekstrakt svežih pečk H2O ekstrakt svežih lupin H2O ekstrakt liofiliziranih lupin 17

Opis postopka: V 10 ml merilne bučke smo zatehtali 20 mg predhodno pripravljenih vzorcev in dopolnili z destilirano vodo do oznake. Na sliki 3.6 vidimo pripravljene vzorce. 0,5 ml raztopine vzorca smo odpipetirali v stekleničko in dodali 2,5 ml raztopine FC ter 2 ml Na2CO3. Tako pripravljene vzorce smo termostatirali na vodni kopeli 5 minut pri temperaturi 50 C. Ohlajenim raztopinam smo izmerili absorbanco pri 760 nm. Za umerjanje spektrofotometra smo uporabili kontrolni vzorec, kjer smo namesto raztopine vzorca uporabili destilirano vodo. Slika 3.6 Pripravljeni vzorci s koncentracijo 20 mg/ml Umeritvena krivulja z galno kislino: Najprej smo pripravili umeritveno krivuljo z galno kislino. Pripravili smo osnovno raztopino galne kisline (GA) v destilirani vodi s koncentracijo 0,4 mg/ml, tako da smo zatehtali 10 mg galne kisline v 25 ml merilno bučko in razredčili z destilirano vodo do oznake. V 10 ml merilne bučke smo odpipetirali naslednje volumne raztopine GA: 7,5 ml, 5,0 ml, 2,5 ml, 1,0 ml, 0,75 ml, 0,5 ml, 0,25 ml in 0,1 ml ter razredčili do oznake. Raztopine smo dobro premešali. Nato smo v stekleničke odpipetirali 0,5 ml raztopine GA, dodali smo 2,5 ml raztopine FC reagenta in 2 ml raztopine Na2CO3. Hkrati smo si pripravili tudi slepi vzorec, kjer smo namesto raztopine GA uporabili destilirano vodo. Raztopine smo premešali in termostatirali na vodni kopeli 5 minut pri 50 C. Nato smo raztopine ohladili in izmerili absorbanco pri 760 nm. Na osnovi izmerjenih absorbanc smo narisali diagram odvisnosti absorbance (abs) od koncentracije GA (mg/ml) v raztopinah. Umeritvena krivulja je prikazana na sliki 3.7. 18

absorbanca pri 760 nm 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 6,8625x + 0,0183 R² = 0,9922 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 koncentracija GA [mg/ ml] Slika 3.7 Umeritvena krivulja z galno kislino 3.4.1 Izračuni totalnih fenolov Enačba 3.10 prikazuje izračun koncentracije totalnih fenolov v vzorcih s pomočjo umeritvene krivulje. Abs = a γ(ga) + b γ(ga) = Abs b a (3.10) kjer je: Abs b a γ(ga) = absorbanca raztopine vzorca izmerjena pri 760 nm = odsek premice umeritvene krivulje GA na y-osi = naklon premice umeritvene krivulje GA (ml/mg) = koncentracija GA v raztopini vzorca (mg/ml) Rezultate vsebnosti totalnih fenolov smo izrazili v mg GA na g vzorca (W(GA vzorec)) iz enačbe 3.11 oziroma mg GA na g materiala (W(GA material)) po enačbi 3.13. W(GA,ekstrakt) = γ(ga) γ(vzorec) *1000 (3.11) kjer je: γ(vzorec) = koncentracija vzorca v raztopini (mg/ml), ki smo jo izračunali iz enačbe 3.12 γ(vzorec)= m(vzorec) V(razt.) (3.12) kjer je: m(vzorec) V(razt.) = masa zatehtanega vzorca, ki smo ga pripravili za analizo (mg) = volumen raztopine, ki je 10 ml ekstrakcije W(GA, material)= W(GA, vzorec)* 100 (3.13) 19

kjer je: ekstrakcije = izkoristek ekstrakcije (%) 3.5 Določanje vsebnosti proantocianidov Kemikalije: Fe(SO4)x7H2O HCl N-butanol Reagenti: Raztopina Fe(SO4)x7H2O v zmesi HCl : butanol v razmerju 2:3 Zatehtali smo 77 mg Fe(SO4)x7H2O v 500 ml merilno bučko in dodali 200 ml HCl in 300 ml butanola Pribor: Merilne bučke (10 ml) Avtomatska pipeta Stekleničke Aparature: Analitska tehtnica Ultrazvočna kopel Grelna plošča Spektrofotometer Vzorci, dobljeni iz granatnega jabolka : Sveži sok Liofilizirani sok Zamrznjeni sok EtOH ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin H2O ekstrakt svežih pečk H2O ekstrakt svežih lupin H2O ekstrakt liofiliziranih lupin 20

Opis postopka: V 10 ml merilne bučke smo zatehtali 50 mg vzorca in ga razredčili z destilirano vodo do oznake. Na sliki 3.8 vidimo pripravljene vzorce. 1 ml raztopine vzorca smo odpipetirali v stekleničko in dodali 10 ml raztopine železovega sulfata. Hkrati smo pripravili kontrolni vzorec, kjer smo namesto raztopine vzorca odpipetirali enako količino destilirane vode. Tako pripravljene vzorce smo termostatirali 15 minut na vodni kopeli pri temperaturi 95 C. Nato smo raztopine ohladili in jim izmerili absorbanco pri 540 nm. Za umerjanje spektrofotometra smo uporabili kontrolni vzorec. Slika 3.8 Pripravljeni vzorci s koncentracijo 50 mg/ml 3.5.1 Izračun vsebnosti proantocianidov Iz enačbe 3.14 smo izračunali koncentracijo proantocianidov (PAC) v naših vzorcih na osnovi izmerjene absorbance pri valovni dolžini 540 nm. Abs = kjer je: Abs cianidin l c (PAC) C (PAC) = Abs cianidin l = absorbanca raztopine vzorca pri valovni dolžini 540 nm cianidin = absorbcijski koeficient (=34700 L/(cm mol)) l = premer oz. stranica kivete (1 cm) c (PAC) = molska koncentracija PAC v raztopini vzorca (mol/l) (3.14) Masno koncentracijo PAC v raztopini vzorca smo izračunali iz enačbe 3.15. γ(pac) = c(pac) Mr(PAC) V(k.razt.) Mr (PAC) V(k.razt.) =Abs* V(vzorca) cianidin l V(vzorca) kjer je: γ(pac) = masna koncentracija PAC v raztopini vzorca (mol/l) Mr(PAC) = molska masa proantocianidinov (=277,9 g/mol) V (k.razt.) = volumen končne raztopine za analizo (11 ml) V (vzorca) = volumen vzorca (1 ml) (3.15) 21

Rezultate vsebnosti proantocianidov (PAC) smo izrazili v mg PAC na g vzorca (W(PAC, vzorec)) iz enačbe 3.16 oziroma v mg PAC na g materiala (W(PAC, material)) iz enačbe 3.17. W(PAC,vzorec) = γ(pac) 1000 (3.16) γ(vzorec) W(PAC,material) = W(PAC,vzorec)* ekstrakcije 100 (3.17) 3.6 Določanje antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo Kemikalije: 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) Metanol Reagenti: Raztopina DPPH v metanolu (6 x 10-5 M) Zatehtali smo 2.36 mg DPPH in razredčili z destilirano vodo v 100 ml bučki do oznake ter dobro premešali, da se je ves DPPH raztopil. Pribor: Stekleničke Avtomatska pipeta Aparature: Analitska tehtnica Spektrofotometer Opis postopka: V 10 ml merilne bučke smo zatehali 10 mg vzorca in ga razredčili do oznake z metanolom. Na sliki 3.9 vidimo pripravljene vzorce. Vzorce smo dobro premešali in jih dali na ultrazvočno kopel, da se je vse raztopilo. V temno stekleničko (zavita steklenička z aluminijasto folijo) smo odpipetirali 3 ml raztopine DPPH in 77 µl raztopine vzorca. Tako pripravljene raztopine smo dobro premešali in jih termostatirali 15 minut pri sobni temperaturi v temnem prostoru. Pripravili smo tudi referenčno raztopino, kjer smo namesto raztopine vzorca odpipetirali 77 µl metanola tik pred merjenjem. Izmerili smo absorbanco raztopin pri 515 nm. Za umerjanje spektrofotometra smo uporabili čisti metanol. 22

Slika 3.9 Pripravljeni vzorci s koncentracijo 10 mg/ml 3.6.1 Izračun antioksidativne aktivnosti z radikalsko metodo Enačba 3.18 prikazuje izračun antioksidativne aktivnosti naših vzorcev in je podana kot % inhibicije glede na referenčno raztopino. %inhibicije = ( A(C,0) A(S,15) ) 100 (3.18) A(C,0) kjer je: A (c,0) A (s,15) = absorbanca referenčne raztopine v času 0 min = absorbanca raztopine vzorca v času 15 min 3.7 Določevanje vitamina C Kemikalije: Jod Kalijev jodid Topni škrob Reagenti: 0,05 M jodova raztopina Pripravili smo jodovo raztopino, tako da smo zatehtali 2 g kalijevega jodida in 1,3 g joda v 100 ml časo in smo dodali nekaj destilirane vode ter mešali toliko časa, da se je vse raztopilo. Raztopino smo nato prenesli v 1 L merilno bučko ter dopolnili z destilirano vodo do oznake. Škrobni indikator (0,25%) Zatehtali smo 0,25 g topnega škroba v čašo in dodali 50 ml skoraj vrele vode. Raztopino smo mešali, da se je vse raztopilo in pred uporabo ohladili. Pribor: Merilni bučki (100 ml in 200 ml) Avtomatska pipeta 10 in 100 ml merilna valja 250 ml čaše 23

Aparature: Bireta in stojalo Vzorci: Sveži sok Liofilizirani sok Zamrznjeni sok EtOH ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin H2O ekstrakt svežih pečk H2O ekstrakt svežih lupin H2O ekstrakt liofiliziranih lupin Opis postopka: V 250 ml časo smo zatehtali 50 mg vzorca, dodali 20 ml destilirane vode in vzorec raztopili. Tako smo pripravili raztopino s koncentracijo 2,5 mg/ml. Dodali smo 150 ml destilirane vode in 1 ml raztopine škrobnega indikatorja. Tako pripravljen vzorec smo titrirali s pripravljeno 0,005 M jodovo raztopino. Končna točka titracije je bila trajna sprememba barve v temno modro zaradi nastanka škrobno-jodnih kompleksov. 3.7.1 Izračun prisotnosti vitamina C Iz enačbe 3.19 smo izračunali koliko molov joda je reagiralo v posameznih vzorcih. n(i2) = 0,005 mol L -1 * (171 ml + volumen titrirane jodove raztopine) (3.19) S pomočjo kemijske reakcije: askorbinska kislina + I2 2 I + dehidroaskorbinska kislina smo izračunali število molov (n) askorbinske kisline (vitamin C), ki je enako število molov joda, ki je zreagiralo. Nato smo izračunali koncentracijo askorbinske kisline v mol/l iz enačbe 3.20. C = n V = n(vit.c) 20 ml (3.20) 24

3.8 Določevanje vitamina E Kemikalije: Etanol Pribor: 10 ml merilne bučke Aparature: Spektrofotometer Vzorci, dobljeni iz granatnega jabolka: Sveži sok Liofilizirani sok Zamrznjeni sok EtOH ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin Vodni ekstrakt svežih pečk Vodni ekstrakt svežih lupin Vodni ekstrakt liofiliziranih lupin Opis postopka: V 10 ml merilne bučke smo zatehtali 10 mg vzorca in jih razredčili z etanolom do oznake. Na sliki 3.10 vidimo pripravljene vzorce. Tako smo si pripravili raztopine s koncentracijo 0,1 mg/ml. Pripravljenim raztopinam smo izmerili absorbanco pri 286 nm. Slika 3.10 Pripravljeni vzorci za določanje vitamina E 25

absorbanca pri 286 nm Umeritvnena krivulja za vitamin E: Pripravili smo umeritveno krivuljo za vitamin E, ker smo jo potrebovali za izračune. Pripravili smo jo tako, da smo najprej iz kapsule dobili 10 µl vitamina E in dodali 1 ml etanola. Iz tako pripravljene raztopine smo v centrifugirke odpipetirali naslednje volumne: 200 µl, 400µL, 600 µl in 800 µl ter dopolnili z etanolom do oznake 1 ml. Tako pripravljenim raztopinam smo pomerili absorbanco pri valovni dolžini 286 nm. Na sliki 3.11 je prikazana umeritvena krivulja, ki smo jo dobili. 1 0,8 0,6 0,4 y = 0,0845x + 0,0041 R² = 0,9969 0,2 0 0 2 4 6 8 10 12 koncentracija vitamina E [µl/ml] Slika 3.11 Umeritvena krivulja za vitamin E 3.8.1 Izračun prisotnosti vitamina E Iz enačbe 3.21 smo izračunali koncentracijo vitamina E v µl/ml. C= Abs b a (3.21) kjer je: Abs = absorbanca vzorcev izmerjena pri valovni dolžini 286 nm b = odsek premice umeritvene krivulje na y-osi a = naklon premice umeritvene krivulje 26

VZORCI 4 Rezultati in diskusija 4.1 Rezultati encimskih testov v posameznih vzorcih Rezultati encimskih testov so zbrani v prilogah v tabeli 7.1 in 7.2. 4.1.1 Aktivnost α-amilaze v različnih vzorcih granatnega jabolka Na sliki 4.1 so prikazani rezultati aktivnostnega testa α-amilaze v različnih vzorcih. Zanimalo nas je, ali je encim α-amilaza prisoten v granatnem jabolku in v katerih vzorcih. Pripravili smo različne vzorce, kot je opisano v poglavju 3 in preverili prisotnost encimov v naših vzorcih. Iz slike 4.1 je razvidno, da je encim α-amilaza prisoten v granatnem jabolku, vendar ne v vseh vzorcih. Pečke vsebujejo več encima α-amilaza, kot lupine. V vzorcu EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk smo dobili najvišjo aktivnost, in sicer je znašala 0,0676 U/mL encima α- amilaza. Nekaj encima α-amilaza smo zaznali tudi v lupinah in sicer v vzorcu EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin, kjer je encimska aktivnost znašala 0,0002 U/mL encima α-amilaza.v vzorcih svežega soka, zamrznjenega soka, EtOH ekstrakta svežih lupin, H2O ekstrakta svežih lupin in H2O ekstrakta liofiliziranih lupin nismo zaznali encimske aktivnosti α-amilaze. Iz rezultatov lahko razberemo, da je največ encima α-amilaza najdemo v pečkah, medtem ko ga v lupinah zasledimo v manjših količinah ali sploh ne zasledimo. H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 U/mL Slika 4.1: Encimska aktivnost α-amilaze v različnih vzorci 4.1.2 Aktivnost celulaze v različnih vzorcih granatnega jabolka Na sliki 4.2 so prikazani rezultati aktivnostnega testa celulaze v različnih vzorcih. Zanimala nas je prisotnost encima celulaza v granatnem jabolku. Najvišjo aktivnost encima celulaze smo zaznali v svežem soku granatega jabolka, in sicer je znašala 7.0589 U/mL encima celulaza. Aktivnost encima celulaze smo zaznali tudi v pečkah granatnega jabolka, ki je znašala 1,6094 U/mL encima celulaza. Iz tega predvidevamo, da granatno jabolko vsebuje encim celulazo. V vzorcih EtOH ekstrakt liofilizirane lupine in v vzorcih H2O ekstrakt liofilizirane lupine encima celulaze nismo zaznali. Iz tega sklepamo, da encim celulaza ni prisoten v lupinah ali pa je prisoten v tako majhni količini, da ga ni bilo možno zaznati. Višja aktivnost celulaze je v pečkah. Predvidevamo, da je encim celulaza lahko prisoten tudi v lupinah, vendar v nižji koncentraciji in ga zato nismo zaznali. Pričakovali smo, da je encim 27

VZORCI VZORCI celulaza prisoten v granatnem jabolku in smo to tudi dokazali. Prišli smo do spoznanja, da vzorec svežega soka granatnega jabolka vsebuje največ encima celulaza. H2O ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke sveži sok 0 1 2 3 4 5 6 7 8 U/mL Slika 4.2: Encimska aktivnost celulaze v različnih vzorcih 4.1.3 Aktivnost lipaze v različnih vzorcih granatnega jabolka Na sliki 4.3 so prikazani rezultati aktivnostnih testov lipaze v različnih vzorcih. Zanimalo nas je kakšna je aktivnost encima lipaza v različnih vzorcih granatega jabolka. Encim lipaza je bil prisoten v lupinah granatnega jabolka, in sicer smo v vzorcu EtOH ekstrakta sveže lupine določili najvišjo aktivnost, ta je znašala 0,4682 U/mL encima lipaza. Encim lipaza je bil prisoten v vseh vzorcih lupin. V svežih lupinah je encimska aktivnost višja kot v liofiliziranih lupinah. Predvidevamo, da v pečkah ni prisotnega encima lipaza, saj v vzorcih od pečk encima lipaza nismo zaznali. Encimska aktivnost je višja v lupinah. H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke liofilizirani sok sveži sok 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 U/mL Slika 4.3: Encimska aktivnost lipaze v različnih vzorcih 28

VZORCI 4.1.4 Aktivnost katalaze v različnih vzorcih granatnega jabolka Na sliki 4.4 so prikazani rezultati aktivnostnega testa katalaze v različnih vzorcih. Zanimala nas je prisotnost encima katalaza v naših vzorcih granatnega jabolka. Iz rezultatov je razvidno, da je encim katalaza prisoten v vseh vzorcih. V vzorcih sveži sok, EtOH ekstrakt sveže lupine, H2O ekstrakt sveže pečke in H2O ekstrakt sveže lupine smo določili 0,1917 U/mL encimske vrednosti katalaze. V vzorcih liofilizirani sok, zamrznjeni sok, EtOH ekstrakt liofilizirane pečke, EtOH ekstrakt liofilizirane lupine in H2O ekstrakt liofilizirane lupine smo določili 1,9167 U/mL encima katalaze. Višja encimska aktivnost se je v teh vzorcih pojavila zaradi različne koncentracije vzorcev. Pri izračunih smo upoštevali faktor razredčitve. Iz teh rezultatov sklepamo, da je aktivnost encima katalaze enaka tako v pečkah, kot lupinah in tudi v sokovih. Predvidevamo, da vsebuje granatno jabolko veliko encima katalaza. H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 0,5 1 1,5 2 2,5 U/mL Slika 4.4: Encimska aktivnost katalaze v različnih vzorcih 4.1.5 Aktivnost peroksidaze v različnih vzorcih granatnega jabolka Na sliki 4.5 so prikazani rezultati aktivnostnega testa peroksidaze v različnih vzorcih. Zanimala nas je aktivnost peroksidaze v vzorcih granatnega jabolka. Najvišja aktivnost je bila v vzorcu svežega soka granatnega jabolka, in sicer je znašala 0,1131 U/mL encima peroksidaza. V zamrznjenem soku encimske aktivnosti peroksidaze nismo zaznali. Iz tega sklepamo in potrjujemo, da nizka temperatura vpliva na aktivnost encimov, tako da jih uniči. Prav tako encimske aktivnosti nismo zaznali v liofiliziranem soku. Predvidevamo, da pečke granatnega jabolka vsebujejo več encima peroksidaza kot lupine, saj smo v vzorcih EtOH ekstrakt sveže pečke določili 0,1122 U/mL encima peroksidaza, v vzorcih EtOH ekstrakt liofilizirane lupine pa smo določili 0,0020 U/ml encima peroksidaza. V vzorcih liofilizirani sok, zamrznjeni sok, EtOH ekstrakt sveže lupine, EtOH ekstrakt liofilizirane pečke, H2O ekstrakt sveže pečke, H2O ekstrakt sveže lupine in H2O ekstrakt liofilizirane lupine encimske aktivnosti peroksidaze nismo zaznali. Dokazali smo, da encimi izgubijo encimsko aktivnost pri nizkih temperaturah, saj smo določili, da ni prisotnih encimov v zamrznjenem soku. Predvidevamo, da je encim peroksidaza v manjših količinah prisoten v pečkah in lupinah, saj smo ga določili v vzorcih EtOH ekstrakt sveže pečke in EtOH ekstrakt liofilizirane lupine. V vodnih ekstraktih aktivnost encima peroksidaza ni bila zaznana, predidevamo, da so lahko bili prisotni v tako majhnih količinah, da jih nismo zaznali. Največjo aktivnost encima peroksidaza smo določili v svežem soku, kar smo pričakovali, saj smo se iz teorije naučili, da so encimi najbolj aktivni v svežem sadju, kasneje pa izgubijo svojo aktivnostno moč in denaturirajo. 29

VZORCI VZORCI H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 U/mL Slika 4.5: Encimska aktivnost encima peroksidaze v različnih vzorcih 4.1.6 Aktivnost proteaze v različnih vzorcih granatnega jabolka Na sliki 4.6 so prikazani rezultati aktivnostnega testa proteaze v različnih vzorcih. Zanimala nas je aktivnost encima proteaza v različnih vzorcih granatnega jabolka. Iz slike 4.6 je razvidno, da je encim proteaza aktiven v pečkah, medtem ko ga v lupinah ni prisotnega. Najvišjo aktivnost smo določili v vzorcih EtOH ekstrakt liofilizirane pečke, in sicer je aktivnost znašala 0,0326 U/mL encima proteaza. Prav tako smo encimsko aktivnost določili v H2O ekstraktu svežih pečk, ki je znašala 0,0136 U/mL encima proteaza. Predvidevamo, da je encim proteaza aktiven v pečkah granatnega jabolka, saj smo določili aktivnost encima v EtOH ekstraktu liofiliziranih pečk in H2O ekstraktu svežih pečk ter liofiliziranem soku. Prav tako predvidevamo, da v lupinah ni prisotnega encima proteaza, saj encimske aktivnosti proteaze v vzorcih lupin nismo zaznali, kar je razvidno iz slike 4.6. Dokazali smo, da encim proteaza ni aktiven v zamrznjenem soku. H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 U/mL Slika 4.6: Encimska aktivnost proteaze v različnih vzorcih 30

VZORCI 4.1.7 Aktivnost transglutaminaze v različnih vzorcih granatnega jabolka Na sliki 4.7 so prikazani rezultati aktivnostnega testa transglutaminaze v različnih vzorcih. Zanimala nas je aktivnost encima transglutaminaza v različnih vzorcih granatnega jabolka. Encimska aktivnost transglutaminaze se je pokazala v vzorcu svežega soka, ki je znašala 0,3371 U/mL encima transglutaminaza. Na podlagi tega smo pričakovali, da se bo aktivnost pojavila tudi v ostalih vzorcih. Encimska aktivnost je bila višja v lupinah kot v pečkah. V vzorcu EtOH ekstrakt svežih lupin smo dobili 0,1080 U/ml encima transglutaminaza. V vzorcu H2O ekstrakt svežih pečk je bila nižja aktivnost, in sicer je znašala 0,0166 U/mL encima transglutaminaza. V vzorcih EtOH ekstrakt svežih pečk, EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk, EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin, H2O ekstrakt svežih lupin in H2O ekstrakt liofiliziranih lupin encimske aktivnosti transglutaminaze nismo zaznali. H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 U/mL Slika 4.7: Encimska aktivnost transglutaminaze v različnih vzorcih 4.2 Vsebnost totalnih fenolov v posameznih vzorcih Na sliki 4.8 so prikazani rezultati vsebnosti totalnih fenolov v mg GA na g vzorca. Zanimala nas je vsebnost totalnih fenolov v različnih vzorcih granatnega jabolka. Predpostavili smo, da je granatno jabolko bogato s totalnimi fenoli, nato smo to z eksperimenti dokazali. Iz slike 4.8 lahko razberemo, da so totalni fenoli prisotni v večjih količinah v različnih vzorcih. Višja vsebnost se je pokazala v lupinah, in sicer v vzorcu EtOH ekstrakt svežih lupin smo dobili 24,0599 mg GA na g vzorca. V vzorcu EtOH ekstrakt svežih pečk je vsebnost totalnih fenolov znašala 15,7898 mg GA na g vzorca. Predvidevamo, da so lupine in pečke bogate s totalnimi fenoli, vendar je vsebnost totalnih fenolov malo višja v lupinah. Iz slike 4.8 vidimo, da so totalni fenoli prisotni v vseh vzorcih, razen v vzorcu H2O ekstrakt svežih pečk, kjer ga nismo zaznali. Predvidevamo, da je bil vzorec preveč redčen in se zato vsebnost ni pokazala. Dokazali smo, da je granatno jabolko polno totalnih fenolov. Vsebnost totalnih fenolov se pojavi v svežem soku, in sicer 3,6387 mg GA na g vzorca. Za primerjavo smo preverili tudi vsebnost totalnih fenolov v zamrznjenem soku in dobili rezultat 4,4851 mg GA na g vzorca. Iz tega predvidevamo, da nizka temperatura ne vpliva na totalne fenole, saj so bili totalni fenoli aktivni tudi v zamrznjenem soku. 31

VZORCI VZORCI H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O estrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 5 10 15 20 25 30 w (GA ekstrakt) [mg GA/g vzorca] Slika 4.8: Rezultati vsebnosti totalni fenolov v mg GA na g vzorca 4.3 Vsebnosti proantocianidov v posameznih vzorcih Slika 4.9 prikazuje rezultate vsebnosti proantocianidov v mg PAC na g vzorca. Zanimala nas je vsebnost proantocianidov v različnih vzorcih granatnega jabolka, katere smo si predhodno pripravili. Predpostavili smo, da granatno jabolko vsebuje proantocianide. Najvišja vsebnost se je pokazala v vzorcu EtOH ekstrakt svežih pečk, in sicer 4,671 mg PAC na g vzorca. V vzorcu H2O ekstrakt svežih lupin in vzorcu H2O ekstrakt svežih pečk nismo zaznali vsebnosti proantocianidov. Predvidevamo, da se proantocianidi v vodnih ekstraktih težje zaznajo kot v etanolnih ekstraktih. Različne vsebnosti proantocianidov zasledimo v lupinah in v pečkah granatnega jabolka. Predvidevamo, da zamrznjeni sok izgubi proantocianide, zato jih nismo zaznali. H2O ekstrakt liofiliziranih lupin H2O ekstrakt svežih lupin H2O ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin EtOH ekstrakt svežih pečk zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 1 2 3 4 5 w (PAC,ekstrakt) Slika 4.9: Rezultati vsebnosti proantocianidov v mg PAC na g vzorca 32

VZORCI 4.4 Vsebnost antioksidantov v posameznih vzorcih Na sliki 4.10 so prikazani rezultati vsebnosti antioksidantov v % inhibicije. Zanimala nas je vsebnost antioksidantov v različnih vzorcih granatnega jabolka. Predpostavili smo, da so antioksidanti prisotni v vseh vzorcih granatnega jabolka. Na podlagi eksperimenta smo ugotovili, da so antioksidanti prisotni v vseh vzorcih, kot je razvidno iz slike 4.10. V vzorcih EtOH ekstrakt svežih lupin, EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin in H2O ekstrakt liofiliziranih lupin je vsebnost antioksidantov 90 %. Na podlagi rezultatov predvidevamo, da so lupine granatne jabolke bolj antioksidativne kot pečke. Pri vseh vzorcih smo dokazali antioksidativno učinkovitost, torej sklepamo, da je granatno jabolko bogato z antioksidanti. V zamrznjenem soku je antioksidativnost najmanjša, iz tega sklepamo, da nizka temperatura uniči antioksidante. H2O ekstrakt liofiliziranih lupin H2O ekstrakt svežih lupin H2O ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin EtOH ekstrakt svežih pečk zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 20 40 60 80 100 % inhibicije Slika 4.10: Rezultati vsebnosti antioksidantov izraženih kot % inhibicije v različnih vzorcih 4.5 Vsebnost vitamina C v posameznih vzorcih Na sliki 4.11 so prikazani rezultati vitamina C podani kot koncentracija vitamina C v mol/l v različnih vzorcih. Zanimala nas je vsebnost vitamina C v različnih vzorcih granatnega jabolka. Vzorce smo si predhodno pripravili, kot je opisano v poglavju 3. Pričakovali smo, da bo v vseh vzorcih prisoten vitamin C, saj smo se iz teorije naučili, da granatno jabolko vsebuje veliko vitamina C. Iz rezultatov vidimo, da je vitamin C bil prisoten v vseh vzorcih. Dokazali smo, da je granatno jabolko polno vitamina C. Predvidevamo, da je vitamina C prisotnega več v lupinah kot v pečkah. V vzorcu EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin ter H2O ekstrakt svežih pečk smo določili 0,0451 mol/l vitamina C. V vzorcu EtOH ekstrakt svežih pečk pa 0,0431 mol/l vitamina C. Veliko vitamina C najdemo v svežem soku granatnega jabolka, in sicer 0,0438 mol/l vitamina C. Predvidevamo, da se pri nižjih temperaturah vitamin C ne uniči, saj je tudi vzorec zamrznjenega soka bil bogat z vitaminom C, in sicer je vseboval 0,0433 mol/l vitamina C. 33

VZORCI VZORCI H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt sveže pečke EtOH ekstrakt liofilizirane lupine EtOH ekstrakt liofilizirane pečke EtOH ekstrakt sveže lupine EtOH ekstrakt sveže pečke zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0,042 0,0425 0,043 0,0435 0,044 0,0445 0,045 0,0455 koncentracija vitamina C [mol/l] Slika 4.11: Rezultati vitamina C podani kot koncentracija vitamina C v različnih vzorcih 4.6 Vsebnost vitamina E v posameznih vzorcih Na sliki 4.12 so prikazani rezultati vitamina E podani kot koncentracija vitamina E v µl/ml. Zanimala nas je vsebnost vitamina E v različnih vzorcih granatnega jabolka, ki smo si jih predhodno pripravili. Predpostavili smo, da bo tudi vitamin E prisoten v vseh vzorcih granatnega jabolka. Iz slike 4.12 lahko razberemo, da smo pravilno predpostavili, saj se je vitamin E pokazal v vseh vzorcih. V najvišji vsebnosti se je pojavil v vzorcu EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk, in sicer 7,1349 µl/ml vitamina E. Predvidevamo, da je več vitamina E prisotnega v pečkah kot v lupinah. Sklepamo, da če sok granatnega jabolka zamrznemo s tem ne uničimo vitamina E, saj smo dobili v vzorcu zamrznjenega soka približno enako koncentracijo vitamina E kot v vzorcu svežega soka granatnega jabolka. V vzorcu svežega soka se je pojavil v vsebnosti 1,4300 µl/ml vitamina E, v vzorcu zamrznjenega soka pa v vsebnosti 1,3523 µl/ml vitamina E. Dokazali smo, da je granatno jabolko bogato z vitaminom E. H2O ekstrakt liofiliziranih lupin H2O ekstrakt svežih lupin H2O ekstrakt svežih pečk EtOH ekstrakt liofiliziranih lupin EtOH ekstrakt liofiliziranih pečk EtOH ekstrakt svežih lupin EtOH ekstrakt svežih pečk zamrznjeni sok liofilizirani sok sveži sok 0 1 2 3 4 5 6 7 8 koncentracija [µl/ml] Slika 4.12: Rezultati vitamina E podani kot koncentracija vitamina E v µl/ml 34

5 Zaključek V okviru diplomske naloge smo določili nekatere encime v granatnem jabolku. Uporabili smo lupine in pečke granatnega jabolka, tako da smo jabolko olupili in izbodli pečke. Lupine in pečke smo zmleli s paličnim mešalnikom. Nekaj lupin in pečk smo uporabili svežih za ekstrakcijo, nekaj pa smo jih dali v liofilizator in nato uporabili liofilizirane lupine in pečke. Z etanolno ekstrakcijo smo dobili etanolne ekstrakte svežih in liofiliziranih materialov, z homogenizacijo pa vodne ekstrakte svežih in liofiliziranih materialov. Določali smo aktivnost encimov α-amilaza, celulaza, katalaza, lipaza, peroksidaza, proteaza in transglutaminaza v različnih vzorcih granatnega jabolka. Izračunali smo encimsko aktivnost v vzorcih. Določali smo tudi vsebnost totalnih fenolov, proantocianidinov, antioksidativnost z radikalsko metodo, vsebnost vitamina C in vitamina E v pripravljenih vzorcih granatnega jabolka. Ugotovili smo, da so prisotni vsi encimi v granatnem jabolku, vendar ne v vseh vzorcih. Encimska aktivnost granatnega jabolka je različna v lupinah in v pečkah. Ugotovili smo, da je v vzorcih najvišja encimska aktivnost katalaze in transglutaminaze, saj sta bili prisotni v največ vzorcih. Aktivnost katalaze v vzorcih sveži sok, EtOH ekstrakt svežih lupin, H2O ekstrakt svežih pečk in lupin je znašala 1,9167 U/mL encima katalaze. Najvišja aktivnost transglutaminaze je bila v vzorcu svežega soka, ki je znašala 0,3371 U/mL encima transglutaminaza. V največji količini je bila prisotna celulaza v vzorcu soka, ki je znašala 7,0589 U/mL encima celulaza. Aktivnost α-amilaze smo določili v pečkah, medtem ko aktivnosti v lupinah nismo zaznali. Encim lipaza je bil prisoten v lupinah, v vzorcih od pečk encima nismo zaznali. Najnižjo encimsko aktivnost v granatnem jabolku smo določili encimu proteaza, ta je bil zaznan le v majhni količini v etanolnem ekstraktu iz liofiliziranih pečk in vodnem ekstraktu iz svežih pečk. Določevali smo tudi vsebnost totalnih fenolov, proantocianidinov, antioksidativnost, vsebnost vitamina C in vitamina E. Iz rezultatov smo dobili potrditev, da je granatno jabolko bogato s fenoli, proantocianidi, ima antioksidante, vitamin C in vitamin E. Prisotni so bili v vseh vzorcih. 35

6 Literatura [1] Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. [2] Domanjko S. Nanos formulacije hitozana in ekstrakta granatnega jabolka na polietilen tereftalat (PET), magistrsko delo. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2013. [3] Bodi eko. Granatno jabolko rajski sadež, ki pomaga izgubljati kilograme. Revija Bodi eko. 29. november 2012. https://www.bodieko.si/granatno-jabolko (dostop 2.8.2018) [4] Chemistry for Biologists. Enzymes http://www.rsc.org/education/teachers/resources/cfb/enzymes.htm (dostop 2.8.2018) [5] Kovač J., Kranjc S., Lenarčič B., Lenček A. Proizvodnja amilaz, Seminar. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2001. [6] World of enzymes and probiotics. Amylase, 2013. http://worldofenzymes.info/enzymes-introduction/amylase/ (dostop 2.8.2018) [7] World of enzymes and probiotics. Cellulase, 2013. http://worldofenzymes.info/enzymes-introduction/cellulase/ (dostop 2.8.2018) [8] World of enzymes and probiotics. Lipase, 2013. http://worldofenzymes.info/enzymes-introduction/lipase/ (dostop 2.8.2018) [9] Kolar A. Naravna znanost o zdravju. 21. februar 2013. http://naravnaznanostozdravju.blogspot.com/2013/02/encimi.html ( dostop 2.8.2018) [10] Žarn M. Imobilizacija lipaze na maghemitne nanodelce, modificirane z aminosilanom, diplomsko delo. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2014. [11] Kaushal J., Gursharan Singh S., Raina A., Kumar Arya S. Catalase enzyme: Application in Bioremediation and Food Industry. Biocatalysis and Agricultural Biotechology, 2018. [12] Wiki FKKT UL. Katalaza, 2012. http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/katalaza (dostop 3.8.2018) [13] Wikipedia. Catalase structure, 2009. https://en.wikipedia.org/wiki/file:catalase_structure.png (dostop 3.8.2018) [14] Banci L. Structural properties of peroxidases. J. Biotechnol., 53 (2-3), 253-63, 1997. [15] Worthington Biochemichal Corporation. Peroxidase, 2018. http://www.worthingtonbiochem.com/hpo/default.html (dostop 4.8.2018) [16] Vozelj S., Obermajer N., Kos J. Proteaze in njihovi ihibitorji v telesnih tekočinah kot diagnostični in prognostični tumorski kazalci, 2007. https://www.dlib.si/stream/urn:nbn:si:doc-c1nrosh7/0ab16460-b3ab-474e-9b4c- 246e63777536/PDF (dostop 4.8.2018) [17] Kieliszek M., Misiewicz A. Microbial transglutaminase and its application in the food industry. A review. Folia Microbiol (Praha). 59(3), 241-50, 2013. [18] Les F., Miguel Arbones-Mainar J., Sofia Valero M., Lopez V. Pomegranate polyphenols and urolithin A inhibit α-glucosidase, dipeptidyl peptidase-4, lipase, triglyceride accumulation nd adipogenesis relater genes in 3T3-L1 aspocyte-like cells. Journal of Ethnopharmacology. 220, 67-74, 2018. 36

[19] Inštitut za nutricionistiko, 2011. https://www.nutris.org/prehrana/abcprehrane/vitamini/103-vitamin-c.html (dostop 6.8.2018) [20] Jezerenik V. Vsebnost vitamina C v plodovih sadnih kislin, diplomski projekt. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012. [21] Inštitut za nutricionistiko, 2011. https://www.nutris.org/prehrana/abcprehrane/vitamini/191-vitamin-e.html (dostop 7.8.2018) [22] Kemnic TR., Coleman M. Vitamin E, Deficiency. StatPearls Publishing, 2018. 37

7 Priloge 7.1 Rezultati encimskih testov Tabeli 7.1 in 7.2 prikazujeta rezultate encimskih testov. Tabela 7.1: Rezultati encimskih testov 1. del TEST/VZORCI Sveži sok Liofilizirani sok Zamrznjeni sok EtOH ekstrakt sveže pečke A-amilaza / 0,0009 U/mL / 0,0119 U/mL Celulaza 7,0589 U/mL Lipaza 0,0328 U /ml Katalaza 1,9167 U/mL Peroksidaza 0,1131 U/mL EtOH ekstrakt sveže lupine / / / 0,4682 U/mL 0,1917 U/mL 0,1917 U/mL 0,1917 U/mL / / 0,1122 U/mL / 1,9167 U/ml Proteaza / / / / / Transglutaminaza 0,3371 0,0048 U/mL 0,0239 U/mL / 0,1080 U/mL U/mL Bradfordova metoda 0,4409 mg/ml 0,1229 mg/ml 0,0019 mg/ml 0,0230 mg/ml 0,0206 U/mL / 38

Tabela 7.2: Rezultati encimskih testov 2. del TEST/VZOREC EtOH ekstrakt liofilizirane pečke α-amilaza 0,0002 U/mL EtOH liofilizirane lupine 0,0676 U/mL H2O ekstrakt sveže pečke 0,0025 U/mL H2O ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt liofiloizirane lupine / / Celulaza 1,6094 / / Lipaza / 0,0492 U/mL Katalaza 0,1917 U/mL 0,1917 U/mL Peroksidaza / 0,0020 U/mL Proteaza 0,0326 U/ml / 0,1570 U/mL 1,9167 U/mL / 0,0136 U/mL Transglutaminaza / / 0,0166 U/mL Bradfordova metoda 0,1177 mg/ml 0,1264 mg/ml 1,9167 U/mL 0,0670 U/mL 0,1917 U/mL / / / 0,1000 mg/ml / / / / 0,1000 mg/ml 0,1221 mg/ml 39

7.2 Rezultati totalnih fenolov, proantocianidov, antioksidantov, vitamina C in vitamina E Tabela 7.3 prikazuje rezultate totalnih fenolov, proantocianidov, antioksidantov, vitamina C in vitamina E. Tabela 7.3: Rezultati totalnih fenolov, proantocianidov, antioksidantov, vitamina C in vitamina E VZORCI Totalni fenoli [mg GA/g vzorca] Proantocianidi [mg PAC/g ekstrakta] Antioksidanti [% inhibicije] Vitamin C [mol/l] Vitamin E [µl/ml] Sveži sok 3,6387 0,0755 5,3416 0,0438 1,4300 Zamrznjeni 4,4851 / 4,3401 0,0434 1,3523 sok Liofilizirani 7,5588 0,8406 7,6564 0,0433 1,8943 sok EtOH 20,1662 1,5924 18,2951 0,0434 7,1349 ekstrakt lio pečke EtOH 16,7613 1,3687 90,0512 0,0445 4,5262 ekstrakt lio lupine EtOH ekstrakt sveže pečke 15,8798 4,6710 15,8256 0,0431 5,6000 EtOH ekstrakt sveže lupine H2O ekstrakt liofilizirane lupine H2O ekstrakt sveže pečke H2O ekstrakt sveže lupine 24,0599 3,0549 90,4518 0,0451 4,4702 23,3928 1,7882 90,3405 0,0451 2,0351 / 0,0035 10,1714 0,0434 1,5870 13,5547 / 14,2666 0,0436 6,0067 40

8 Življenjepis 41

42

Izjava o avtorstvu in istovetnosti tiskane in elektronske oblike zaključnega dela 43