UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA DIPLOMSKO DELO VESNA ORAŽEM
UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijska smer: Biologija in Gospodinjstvo VPLIV OBRASTI NA OPTIČNE LASTNOSTI VODNIH LISTOV PRAVE POTOČARKE IN NAVADNE STRELUŠE DIPLOMSKO DELO Mentorica: prof. dr. Alenka Gaberščik Kandidatka: Vesna Oražem Ljubljana, 2013
II Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija biologije in gospodinjstva na Pedagoški fakulteti. Delo je potekalo Katedre za ekologijo in varstvo okolja na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete. Študijska komisija je Oddelka za biologijo je 7.12.2012 odobrila predlagano temo diplomske naloge z naslovom Vpliv obrasti na optične lastnosti vodnih listov prave potočarke in navadne streluše. Za mentorico je predlagala prof. dr. Alenko Gaberščik. Komisija za oceno in zagovor: Predsednica: doc. dr. Katarina Vogel Mikuš Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za Biologijo Mentorica: prof. dr. Alenka Gaberščik Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za Biologijo Recenzent: doc. dr. Igor Zelnik Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za Biologijo Datum zagovora: Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete in Pedagoške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji. Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Vesna Oražem
III KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK UDK 581.5(043.3)=163.6 KG AV SA navadna streluša/prava potočarka/obrast/odbojnost/presevnost/lastnosti listov ORAŽEM, Vesna GABERŠČIK, Alenka (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Program Biologija in Gospodinjstvo LI 2013 IN TD OP IJ JI AI VPLIV OBRASTI NA OPTIČNE LASTNOSTI VODNIH LISTOV PRAVE POTOČARKE IN NAVADNE STRELUŠE Diplomsko delo (univerzitetni študij) XI; 68 str., 74 virov sl sl/an Preučevali smo vpliv obrasti na optične lastnosti listov prave potočarke in navadne streluše. Merili smo listno odbojnost in presevnost ter specifično listno površino, debelino lista in posameznih tkiv (zg. in sp. povrhnjica, mezofil), gostoto listnih rež in prisotnost diatomej na zgornji in spodnji strani lista. Biokemijske analize so obsegale meritve vsebnosti klorofilov a in b, karotenoidov, antocianov in UV A in B absorbirajočih snovi. V odstranjeni obrasti smo izmerili vsebnost klorofila a. V raziskavi smo ugotovili, da na listno odbojnost in presevnost vplivajo vsi biokemijski parametri, gostota diatomej in listnih rež, SLA in debelina lista. Na odbojnost vpliva tudi debelina mezofila. Prisotnost obrasti vpliva predvsem na listno presevnost obeh vrst.
IV KEY INFORMATION DOCUMENTATION ŠD Dd DK UDC 581.5(043.3)=163.6 KG R. amphibia/s. sagittigfolia/periphyton/reflectance/transmittance/leaf properties AV ORAŽEM, Vesna SA GABERŠČIK, Alenka (supervisor) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 ZA University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotehnical Faculty, Academic Study LI 2013 Programme Biology and Home Economics IN THE EFFECTS OF PERIPHYTON ON OPTICAL PROPERTIES OF SUBMERGED LEAVES IN Rorippa amphibia AND Sagittaria sagittifolia TD OP IJ JI AI Graduation thesis (university studies) XI; 68 p., 74 ref. sl sl/an We studied the effects of periphyton on optical properties of the leaves of the species Rorippa amphibia and Sagittaria sagittifolia. Leaf reflectance and transmittance were measured. Morphological research included the measurements of specific leaf area, leaf thickness (upper and lower epidermis, mesophyll), the number of stomata and the presence of diatoms on upper and lower side of the leaves. Biochemical analyses included measurements of concentrations of chlorophyll a and b, carotenoides, anthocianins, UV-A and UV-B absorbing substances. We also measured concentrations of chlorophyll in periphyton. We can conclude that all biochemical parameters, stomata and diatom density, SLA and leaf thickness affected leaf reflectance and transmittance. Mesophyll thickness affected the reflectance, while periphyton presence affected mainly leaf transmittance in both studies species.
V KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... III KEY INFORMATION DOCUMENTATION... IV KAZALO VSEBINE... V KAZALO PREGLEDNIC... VII KAZALO SLIK... VIII KAZALO PRILOG... IX OKRAJŠAVE IN SIMBOLI... X 1 UVOD... 1 1.1 HIPOTEZE... 2 2 PREGLED OBJAV... 3 2.2 OPTIČNE LASTNOSTI... 3 2.2.1 Vpliv biokemijskih lastnosti listov... 4 2.2.2 Vpliv morfologije in anatomije listov... 5 2.2.3 Vpliv vsebnosti vode... 7 2.2.4 Vpliv okoljskih dejavnikov... 7 2.3 OBRAST... 8 3 MATERIALI IN METODE DELA... 10 3.1 VZORČNO MESTO... 10 3.2 PREUČEVANI RASTLINSKI VRSTI... 10 1.1.1 Navadna streluša (Sagittaria sagittifolia (L.))... 11 1.1.2 Prava potočarka (Rorippa amphibia (L.) Besser)... 11 3.3 MERITVE OPTIČNIH LASTNOSTI... 11 3.3.1 Meritve odbojnosti... 12 3.3.2 Meritve presevnosti... 12 3.2 MORFOLOŠKE IN ANATOMSKE ANALIZE... 12 3.4 BIOKEMIJSKE ANALIZE... 13 3.4.1 Klorofili in karotenoidi... 13 3.4.2 Antociani... 14
VI 3.4.3 UV absorbirajoče snovi... 14 3.5 STATISTIČNE ANALIZE... 15 4 REZULTATI... 16 4.1 MORFOLOGIJA IN ANATOMIJA LISTOV... 16 4.2 BIOKEMIJA LISTOV... 20 4.4 ODBOJNI SPEKTRI... 23 4.4.1 Odbojnost... 23 4.4.2 Presevnost... 25 4.4 KORELACIJE PREUČEVANIH PARAMETROV S SPEKTRI... 27 4.4.1 Odbojnost... 27 4.4.2 Presevnost... 30 5 RAZPRAVA... 32 6 SKLEPI... 35 7 POVZETEK... 36 8 PRENOS PRIDOBLJENEGA ZNANJA NA POUČEVANJE V OSNOVNI ŠOLI... 37 8.1 PREGLED UČNEGA NAČRTA ZA NARAVOSLOVJE IN BIOLOGIJO... 37 8.2 UČNA PRIPRAVA... 37 9 LITERATURA... 39 ZAHVALE... 45 PRILOGE... 46
VII KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Prikaz korelacij gostote diatomej in listnih rež z odbojnostjo listov... 27 Preglednica 2: Prikaz korelacij SLA in zgradbe lista (zgornja in spodnja povrhnjica, mezofil) z odbojnostjo listov... 28 Preglednica 3: Prikaz korelacij vsebnosti listnih pigmentov z listno odbojnostjo... 29 Preglednica 4: Prikaz korelacije prisotnosti obrasti na listni površini z odbojnostjo listov.....29 Preglednica 5: Prikaz korelacij gostote diatomej in listnih rež s presevnostjo listov... 30 Preglednica 6: Prikaz korelacij SLA in zgradbe lista (zgornja in spodnja povrhnjica, mezofil) s presevnostjo listov... 30 Preglednica 7: Prikaz korelacij vsebnosti listnih pigmentov z listno presevnostjo... 31 Preglednica 8: Prikaz korelacije prisotnosti obrasti na listni površini s presevnostjo listov.... 31
VIII KAZALO SLIK Slika 1: Prikaz povprečnih vrednosti SLA listov pri vrstah prava poročarka in navadna streluša [cm 2 g -1 ]... 16 Slika 2: Listna reža prave potočarke... 17 Slika 3: Prikaz gostote listnih rež [mm 2 ] na listih prave potočarke... 17 Slika 4: Prikaz gostote diatomej [cm 2 ] na listih navadne streluše... 18 Slika 5: List prave potočarke (zgoraj) in navadne streluše (spodaj) v prečnem prerezu... 19 Slika 6: Prikaz zgradbe listov obeh vrst... 20 Slika 7: Prikaz vsebnosti klorofilov in katorenoidov na površino lista [mgcm -2 ]... 20 Slika 8: Prikaz vsebnosti antocianov na površino lista [relativna enota] [cm 2 ] obeh vrst.. 21 Slika 9: Prikaz vsebnosti UV-A in UV-B absorbirajočih snovi na površino lista [relativna enota] [cm 2 ] obeh vrst;... 22 Slika 10: Prikaz vsebnosti klorofilov v obrasti na površino lista [gcm -2 ] obeh vrst... 22 Slika 11: Prikazana je odbojnost listov prave poročarke z ali brez obrasti... 23 Slika 12: Prikazana je odbojnost listov navadne streluše... 24 Slika 13: Prikazana je presevnost listov prave potočarke... 25 Slika 14: Prikazana je presevnost listov navadne streluše... 26
IX KAZALO PRILOG Priloga 1: Testiranje spektrov odbojnosti za statistično značilno različnost podatkov v odbojnosti... 46 Priloga 2: Testiranje spektrov odbojnosti za statistično značilno različnost podatkov v presevnosti... 49 Priloga 3: Korelacije vseh parametrov z odbojnostjo listov (Spearmanov test)... 52 Priloga 4: Korelacije vseh parametrov s presevnostjo listov (Spearmanov test)... 54
X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI PAR VIS NIR IR UV UV-A UV-B UV-C ANOVA r t-test SD Kl a Kl b Kar Ant ss SLA RR RT S O fotosintezno aktivno sevanje (0 700 nm) območje vidne svetlobe (0 750 nm; vijolična 0 450 nm, modra 450 495 nm, zelena 495 570 nm, rumena 570 0 nm, oranžna 0 620 nm, rdeča 620 750 nm) bližnje infrardeče sevanje (700 10 nm) infrardeče sevanje (700 nm 1 mm) ultravijolično sevanje (200 0 nm) ultravijolični del svetlobnega spektra (320 0 nm) ultravijolični del svetlobnega spektra (280 320 nm) ultravijolični del svetlobnega spektra (200 280 nm) analiza variance Spearman-ov korelacijsko koeficient dvosmerni Studentov t-test standardna deviacija klorofil a klorofil b karotenoidi antociani suha snov specifična lista površina serija vzorčnih listov prave potočarke za odbojnost serija vzorčnih listov prave potočarke za presevnost serija vzorčnih listov navadne streluše listi z obrastjo
XI OS BO listi z obrastjo na spodnji strani listi brez obrasti a podatki niso statistično značilno različni (p > 0,05) b statistično značilno različni podatki (p < 0,01)
1 1 UVOD Interakcija rastlin z okoljskimi dejavniki je zelo kompleksen pojav. Interakcije z okoljem potekajo tako na makro- kot tudi na mikro-ravneh, zato je zelo pomembno razumevanje fizikalnih in bioloških odzivov rastlin na spremembe v okolju (Liew in sod., 2008). Svetloba, ki doseže list rastline, se odbija, preseva ali absorbira (Fourty in sod., 1996; Woolley, 1971). Absorpcija v vidnem in infra rdečem delu spektra je odvisna predvsem od kovalentnih vezi spojin kot so sladkorji, lignin, celuloza in proteini v rastlini (Fourty in sod., 1996). Nanjo pa vpliva tudi prisotnost absorpcijskih pigmentov (Liew in sod., 2008). Merjenje optičnih lastnosti listov se navadno uporablja za namen ugotavljanja zdravja rastlin in povezave s stresnimi dejavniki. Pri tem se uporablja invazivne in neinvazivne metode. Pri neinvazivnih metodah je v ospredju vprašanje, kakšna je interakcija svetlobe z listom rastline, preko merjenja spreminjanja optičnih lastnosti rastline glede na specifičen stresni dejavnik. Za doseganje takšnih ugotovitev je potrebno razumevanje biokemijskih in anatomsko-morfoloških značilnosti rastline v povezavi z listno odbojnostjo, presevnostjo in vpojnostjo (Liew in sod., 2008). Za ugotavljanje zdravja rastlin v povezavi z optičnimi lastnostmi potekajo meritve v delu svetlobnega spektra od 0 do 2500 nm (Carter, 1993). Optične lastnosti listov rastlin v povezavi z biotskimi in abiotskimi stresnimi dejavniki so že v veliki meri raziskane (Carter, 1993). V nalogi so nas zanimale predvsem povezave med biokemijskimi in anatomskomorfološkimi značilnostmi rastline v povezavi z listno odbojnostjo in presevnostjo. Spektralne lastnosti listov nam povedo, kako list odbije ali prepušča svetlobo v določenem svetlobnem spektru. Te lastnosti so odvisne od količine sevanja, rastlinske vrste, zgradbe listov, vsebnosti barvil v listih in tudi prisotnosti ter sestave obrasti. Namen diplomske naloge je bil raziskati vpliv prisotnosti obrasti na spektralne lastnosti vodnih listov rastlin prave potočarke (Rorippa amphibia) in navadne streluše (Sagittaria sagittifolia). Želeli smo tudi ugotoviti, kako sta presevnost in odbojnost povezani z biokemijskimi in morfološkimi lastnostmi listov. Vodne rastline imajo zelo pomembno vlogo v vodnih ekosistemih, saj vplivajo na razmerja plen-plenilec, obrast pa je vir hrane drugim organizmom (Jeppesen in sod., 1998).
2 1.1 HIPOTEZE Predvidevamo, da se odbojni in presevni spektri listov obeh rastlih razlikujejo zaradi obrasti in morfoloških ter biokemijskih lastnosti listov. Predvidevamo tudi, da prisotnost obrasti vpliva tako na presevnost kot na odbojnost listov.
3 2 PREGLED OBJAV 2.2 OPTIČNE LASTNOSTI Gladek transparenten objekt odbija svetlobo glede na vpadni kot svetlobe in glede na svoj lomni količnik ter lomni količnik medija, ki ga obdaja. Pri poševnem vpadnem kotu svetlobe sta tako odbojni kot presevni žarek polarizirana. Objekti s heterogeno površino odbijajo in lomijo svetlobo ob vsaki spremembi lomnega količnika. Presevnost je količina svetlobe, ki prehaja skozi objekt v okolico, odbojnost pa količina svetlobe, ki se od objekta odbije nazaj v okolico. Rastlinsko tkivo, ki ima reliefno oblikovano površino in zračne medcelične prostore (z lomnim količnikom 1.0) in hidrirane celične stene (z lomnim količnikom 1.33-1.50) je dober prevodnik (Woolley, 1971). Za preučevanje mehanizmov regulacije UV sevanja pri rastlinah se uporabljajo meritve presevnosti in odbojnosti listov. Višje razvite rastline imajo približno 5% odbojnost listov in presevnost, ki popolnoma zmanjša sevanje v UV spektralni regiji. UV sevanje je razdeljeno na UV-A (pri valovnih dolžinah 320-0 nm), UV-B (280-320 nm) in UV-C (200-280 nm). Sevanje, ki ima najkrajše valovne dolžine, je najbolj škodljivo. UV-C sevanje ne pride do površja Zemlje, saj se absorbira v plasti ozona v stratosferi. Pri fotosintezi proizveden kisik omogoča nastanek ozonske plasti, ki prestreza škodljivo in UV-B in UV-C sevanje (Yoshimura, 2010). Ljudje s svojim onesnaževanjem povzročamo tanjšanje ozonske plasti (Farman in sod., 1985), zato UV-B sevanje, ki dosega tudi Zemljino površje in vseskozi narašča (McKenzie in sod., 1999). Pri živih organizmih UV- B sevanje povzroča poškodbe DNK, kot je formacija ciklobutan pirimidinskega dimera (Droulin in Therrien, 1997). Povišano UV-B sevanje ima vpliv na morske (Karentz in Bosch, 2001) in sladkovodne ekosisteme (Häder in sod., 1998). Manj škodljivo UV-A sevanje se ne absorbira v ozonski plasti, zato večinoma doseže zemljino površje (Lavker in sod., 1995). Dolgotrajna izpostavljenost UV-A sevanju lahko povzroči nastanek rakavih obolenj (Agar in sod., 2004). UV-B sevanje narašča z nadmorsko višino (Caldwell in sod., 1989). Rastlinstvo v gozdovih, kjer je oblačnost pogosta, pomeni tudi zaščito pred UV-B sevanjem (Dahlback, 1996). Različne rastlinske vrste imajo različne optične lastnosti, saj imajo različno morfološko in anatomsko sestavo listov. Razlika v količini presevnosti lista je odvisna od transparentnosti lista za svetlobo (Yoshimura, 2010). List je osnovna enota interakcije z UV sevanjem. UV sevanje, ki doseže list se lahko v njem absorbira, odbije ali preseva. Rastline naj bi imele v območju UV sevanja nizko odbojnost, presevnost pa naj bi bila odsotna (Grant in sod., 2003).
4 Prilagoditve rastlin na svetlobne razmere v okolju so razvidne iz lastnosti listov (Sims in Gamon, 2002). To so lastnosti, ki so pomembne za izrabo svetlobe ali fotozaščito rastline in so tudi dober pokazatelj odgovora rastlin na spremenljive dejavnike okolja (González in sod., 2007) in za preučevanje fotosinteznega potenciala rastlin (Slaton in sod., 2001). Če pregledamo vse karakteristike lista in jih povežemo z odbojnostjo in presevnostjo ugotovimo, da nekateri listi delujejo kot prevodniki sevanja (Woolley, 1971). 2.2.1 Vpliv biokemijskih lastnosti listov Študije optičnih lastnosti listov se večinoma uporabljajo za merjenje klorofilov (Baltzer in Thomas, 2005), vsebnosti dušika (Filella in Peñuelas, 1994) in karotenoidov (Gitelson in sod., 2002). Svetloba vpliva na listno odbojnost na več načinov (npr. z mehanizmi foto zaščite, fotobeljenja, ali s spremembami listne površine) (Baltzer in Thomas, 2005). Na odbojnost vpliva tako morfologija oziroma anatomija kot tudi biokemijske lastnosti listov. Znani so tako imenovani trije vrhi odbojnosti in sicer v modrem delu spektra (450-495 nm), kjer nanjo vpliva predvsem absorpcija klorofilov in karotenoidov, del na meji med zelenim in modrim spektrom (495-570 nm), kjer je najbolj opazen tako imenovan zeleni vrh pri 550 nm in nazadnje še na meji rdečega spektra (620-750 nm), kjer je opazen predvsem vpliv absorpcije klorofila (Liew in sod., 2008). Primanjkljaj nutrientov privede do zmanjšanja koncentracije klorofilov, kar lahko vpliva na porast odbojnosti v vidnem in infrardečem delu spektra (Ayala-Silva in Beyl, 2005). Listni pigmenti večinoma absorbirajo predvsem v PAR (0-700 nm) in UV spektru (Woolley, 1971). Na prehodu med rdečim in NIR spektrom odbojnost zelo naraste. Ta pojav imenujejo tudi rdeči vrh, ki je odvisen od vsebnosti klorofila, poleg tega pa tudi od fenološkega stanja rastline in stresnih dejavnikov (Carter, 1993). Optične lastnosti listov v UV in PAR spektru so tako odvisne od fotosinteznih in antenskih pigmentov (Yoshimura 2010; Baltzer in Thomas, 2005), predvsem spektralna odbojnost in presevnost listov sta odvisni od koncentracije klorofilov (Baltzer in Thomas, 2005) in karotenoidov (Baltzer in Thomas, 2005). V vidnem delu spektra je količina odbite svetlobe najmanjša, saj v tem delu pigmenti najbolje absorbirajo svetlobo (Knipling, 1970). Če v listu primanjkuje pigmentov, je v PAR in NIR odbojnost visoka (Knipling, 1970). Woolley (1971) v svoji raziskavi navaja, da barvni pigmenti, izolirani iz listov, močno absorbirajo svetlobo v UV in vijoličnem delu spektra. V tem delu je odbojnost nizka, presevnost pa skoraj zanemarljiva (Woolley, 1971).
5 Koncentracije klorofila lahko upadejo zaradi zvišanja količine svetlobe v okolici (Givnish, 1988). Tak odgovor naj bi bil povezan z zvišano odbojnostjo listov (Baltzer, 2005). V spektru nad 10 nm sta zelo pomembna dejavnika vsebnost dušika (Yoder in Pettigrew- Crosby, 1995) in koncentracija karotenoidov ter ksantofilov (Gitelson in sod., 2002). Yoshimura in sod. (2010) so v svoji raziskavi dokazali, da zeleni listi v UV spektru praktično ne presevajo, odbojnost pa je zelo nizka in sicer približno 5%. V nasprotju z presevnostjo in odbojnostjo pa je bila vpojnost kar 95%. V območju vidne svetlobe zeleni listi močno vpijajo modro in rdečo svetlobo, zeleno pa veliko manj, kar povezujejo s klorofili in karotenoidi v listu. V NIR spektru (valovne dolžine nad 700 nm) sta zelo visoka odbojnost (Gausman, 1974) in presevnost listov, vpojnost pa zelo nizka (Knipling, 1970), saj fotosintezni pigmenti višjih rastlin ne absorbirajo NIR sevanja (Yoshimura, 2010). Zvišane količine UV-B sevanja se navadno kaže v lastnostih listov (Sullivan in sod., 1992). Listi tropskih rastlin na višje ležečih mestih vsebujejo velike koncentracije UV-B absorbirajočih snovi (Ziska, 1996). 2.2.2 Vpliv morfologije in anatomije listov Kot posledica visokega UV-B sevanja se spremembe kažejo na ravni lista v zmanjšani listni površini in anatomskih spremembah (Antonelli in sod., 1997). Na odbojnost vpliva struktura listne povrhnjice in sestava lista (Liew in sod., 2008). Odbojnost listov je v NIR (700-10 nm) najbolj pogojena z listno in celično strukturo (Slaton in sod., 2001). Celice povrhnjice se lahko po strukturi zelo razlikujejo in so nameščene tesno ena poleg druge, vmesne prostore predstavljajo le listne reže. Pojavljajo se lahko v obeh povrhnjicah, predvsem pa so prisotne v spodnji povrhnjici. Celice povrhnjice navadno ne vsebujejo kloroplastov. Njihova naloga je prepuščanje svetlobe posredovanje fotonov v globlje ležeča tkiva, ki vsebujejo kloroplaste (Myres in sod., 1994). Celice povrhnjice so lahko prevlečene z voski kot je kutin, ki je sestavni del predvsem vrhnjega sloja zgornje povrhnjice, ki se imenuje kutikula. Prisotnost in debelina kutikule je odvisna od okolja, v katerem rastlina uspeva (Liew in sod., 2008). Aklimacija na močno svetlobo se kaže navadno v zmanjšani debelini kutikule, katere primarna funkcija je zaščita pred izgubo vode (Grace in van Gardingen, 1996 v Baltzer in Thomas, 2005). Take kutikularne spremembe listov bi lahko spreminjale odbojnost listov (Grant in sod., 1993). Če odbojnost narašča s svetlobo, bi bile lahko te spremembe povezane s spremembami na kutikuli (Johnson in sod., 1997). Debelina kutikule vpliva na količino odbite svetlobe (Grant in sod., 1993; Baltzer in Thomas, 2005). Slaton in sod. (2001) so v svoji raziskavi dokazali, da je kutikula z debelino več kot 1µm glavni dejavnik za napovedovanje
6 odbojnosti v NIR spektru (Slaton in sod., 2001). Vendar pa vpliv debeline kutikule in prisotnost trihomov na površini lista na odbojnost ni še povsem raziskan (Levizou in sod., 2005). Pri zvišanem UV-B sevanju naraste debelina kutikule in povrhnjice. Absorpcija v UV-B narašča z nadmorsko višino, v PAR pa se zmanjšuje. Velazquez (2010) je v raziskavi ugotovil, da se spremembe v listih vedno ne sovpadajo linearno s spremembo nadmorske višine. Prilagajanje rastlin je zelo odvisno od njihove fenotipske plastičnosti (Velazquez, 2010). V spektru vidne svetlobe imajo tanki listi navadno višjo odbojnost (Yoshimura, 2010). Woolley (1971) meni, da odbojnost ni zelo povezana z debelino lista. Ta vpliva bolj na presevnost svetlobe (Woolley, 1971). Žile v listu so od preostalega mezofila ločene s kompaktnimi parenhinskimi celicami, ki vsebujejo zelo malo ali celo nič kloroplastov. Mezofil je navadno deljen v gobasti in stebričasti. Celice v strebričastem mezofilu vsebujejo veliko kloroplastov. Kloroplasti močno absorbirajo svetlobo v modrem in rdečem delu spektra. V gobastem tkivu so celice nameščene veliko bolj neurejeno in so nepravih oblik. Vsebujejo tudi veliko manj kloroplastov (Slaton in sod., 2001). Listi z večjo vsebnostjo gobastega in stebričastega mezofila imajo nižjo odbojnost v NIR, saj v tem spektru bolje absorbirajo svetlobo (Slaton in sod., 2001). Pri vodnih rastlinah je mezofil navadno enoten. V gobastem mezofilu se svetloba lomi, ko se odbija od spodnje povrhnjice. Ker je zgornja povrhnjica povezana z mezofilom, lahko svetloba, ko prodre skozi zgornjo povrhnjico, preide tudi v ostala tkiva lista. Ko se svetloba odbije od listne površine, prehaja le skozi zgornjo povrhnjico. Ko pa se skozi list preseva, mora prodreti skozi vsa tkiva v listu (Woolley, 1971). V listu se svetloba razprši med celičnimi stenami in medceličnimi prostori zaradi različnega lomnega količnika (od 1.00 do 1.33) (Gausman in sod., 1969). Poševni žarek svetlobe se lahko odbija tudi od spodnje povrhnjice, saj je le-ta večja pregrada za prodor svetlobe (Woolley, 1971). Količina odbite svetlobe v NIR je odvisna tudi od prisotnosti medceličnih prostorov z aerenhimom. Povezava se kaže med hidratiranimi celičnimi stenami in zrakom v medceličnih prostorih kar vpliva na potrošnjo svetlobe in s tem zelo nizko vpojnostjo le-te (Slaton in sod., 2001). Na tem nivoju poteka difuzija svetlobe (Woolley 1971). Še vedno pa je veliko neznanega o vplivu morfologije listov na optične lastnosti (Liew in sod., 2008).
7 2.2.3 Vpliv vsebnosti vode Odbojnost suhih listov v VIS spektru je večja kot pri listih z večjo vsebnostjo vode (Liew in sod., 2008). Večja količina vode poveča absorpcijo v IR spektru (Woolley, 1971; Liew in sod., 2008). Pri meritvah odbojnosti je vsebnost vode zelo pomemben dejavnik (Woolley, 1971). Če list ali listno tkivo zmrzne, voda kristalizira, kar vpliva na zvišanje lomnega količnika in s tem povišanje odbojnosti svetlobe. Kristali lahko poškodujejo stene medceličnih prostorov in vanje preide voda, ki ima nižji lomni količnik in zniža odbojnost svetlobe v tkivu (Woolley, 1971). 2.2.4 Vpliv okoljskih dejavnikov Na fotosintezno aktivnost vodnih rastlin vplivajo okoljski dejavniki kot so dostopnost svetlobe, temperatura vode, hitrost vodnega toka in koncentracije nutrientov (Carr in sod., 1997). V višjih delih spektra nad 10 nm je, poleg biokemijskih dejavnikov, najmočnejši vpliv vodnega okolja (Carter in Spiering, 2002). Največ raziskav na to temo se nanaša na stresne faktorje za rastline kot so plinska onesnaževalca (Carter in sod., 1995), povišana temperatura in vrednost CO2 (Carter in sod., 2000), izpostavljenost težkim kovinam (Schwaller in sod., 1983), UV-B sevanje (Bornman in Vogelmann, 1991), suša in pomanjkanje nutrientov (Carter, 1993). Na optične lastnosti listov vpliva količina fotosinteznega sevanja na celičnem nivoju, zmožnost prodora svetlobe skozi tkiva in njena izguba (Carter in sod., 1995). Spremembe v količini razpoložljivih virov različno vplivajo na optične lastnosti listov. Optične lastnosti listov se spreminjajo glede na obseg stresnih dejavnikov in se razlikujejo med vrstami (Baltzer in Thomas, 2005). Naraščanje koncentracije nutrientov v tleh, predvsem dušika, je navadno povezano z naraščajočo koncentracijo dušika in klorofila v listih (Johnson in sod., 1997). Tak odziv bi se moral odražati v zmanjšani odbojnosti listov. Kombinacija učinkov spremenjene količine svetlobe in virov hranil na optične lastnosti listov so predmet špekulacij. Odbojnost vidne svetlobe običajno narašča pri močni svetlobi, upade pa pri naraščajoči koncentraciji nutrientov, ki so na voljo (Baltzer in Thomas, 2005).
8 2.3 OBRAST Povečana vsebnost nutrientov v vodi navadno sproži procese evtrofikacije (Orth in Moore, 1983), ki povzroča namnožitev fitoplanktona in obrasti na listih vodnih rastlin (Dennison in sod., 1993). Proces evtrofikacije navadno povzroči zmanjšanje dostopnosti svetlobe za vodne rastline (Bulthuis in Woelkerling, 1983). Rastline so se prisiljene umakniti v plitvejšo vodo, kjer so izpostavljene številčnejšim stresnim dejavnikom kot so povečana možnost izsušitve, večja slanost, valovanje in višje UV-B sevanje (Dawson in Dennison, 1996). Povečano UV-B sevanje vodi do poškodb kloroplastov (Dawson in Dennison, 1996) in s tem znižuje fotosintezno aktivnost (Wells in Nachtwey, 1982). Trocine in sod. (1981) so v svojih raziskavah ugotovili, da UV-B sevanje manj vpliva na fotositnezno aktivnost morske trave, če je prekrita z obrastjo, kot če obrasti na listih ni (Trocine in sod., 1981). Alge v obrasti vsebujejo UV-absorbirajoče pigmente, ki zmanjšujejo dostop UV sevanja na rastlino, vendar pa ta lahko poškoduje alge same (Post in Larkum, 1993). Na razrast morske trave vpliva evtrofikacija morja (McGlathery, 2001) in večje koncentracije obrasti na njenih listih (Orth in Moore, 1983). Borowitzka in Lethbridge (1989) sta obrast definirala kot kompleksno združbo organizmov. Poleg živih in neživih organizmov obrast sestavljata tudi mukus in delci sedimenta (Borowitzka in Lethbridge, 1989 v Brandt in Koch, 2003). Borowitzka in Lethbrigde (1989) ugotavljata, da je obrast lahko vir hrane in ostankov kremenastih alg ter indikator kakovosti vode (Borowitzka in Lethbridge, 1989 v Brandt in Koch, 2003). Brandt in Koch (2003) ugotavljata, da bi morali k temu dodati tudi pomen obrasti kot UV-B filtra (Brandt in Koch, 2003). V svoji raziskavi sta Brandt in Koch (2003) potrdili, da je prisotnost obrasti na listih večja v vodah z višjo koncentracijo nutrientov. Obrast na listih naj bi presevala bistveno manj UV-B sevanja kot PAR do lista rastline (Brandt in Koch, 2003), čeprav vpliva tudi na zmanjšanje dostopnosti PAR za rastlino (Bulthuis in Woelkerling, 1983). Ker je presevnost PAR območju večja kot UV-B, je iz raziskav razvidno, da je obrast na listih morske trave učinkovit zaščitni faktor pred škodljivim UV-B sevanjem, dokler presevnost PAR ne doseže vrednosti, ko prične omejevati fotosintezno aktivnost rastline (Brandt in Koch, 2003). Ker je obrast sestavljena iz različnih komponent (alge, cianobakterije, mukus, sedimentni delci), ima vsaka značilno vpojnost svetlobe v PAR (Losee in Wetzel, 1983) in UV-B spektru (Brandt in Koch, 2003). Presevnost svetlobe je torej odvisna od vseh komponent obrasti (Brandt in Koch, 2003). Brandt in Koch (2003) sta v raziskavi dokazali, da je prisotnost obrasti na obeh straneh lista enako učinkovita kot dvojna debelina obrasti le na eni strani (Brandt in Koch, 2003).
9 Frankovich in sod. (2005) so v raziskavi dokazali, da obrast v kateri prevladuje kalcij, veliko bolj preseva svetlobo kot obrast z večjo vsebnostjo silicija (Frankovich in sod., 2005). Razlog je, da kristali kalcijevega karbonata manj absorbirajo svetlobo, kar privede do večje odbojnosti svetlobe (Losee in Wetzel, 1983). Raeder in sod. (2010) so v raziskavi preučevali koliko obrast duši svetlobo v različnih trofičnih stanjih jezer. Ugotovili sta, da izpostavljenost, letni čas in trofično stanje jezera vplivajo na to, koliko svetlobe preseva obrast. V vseh jezerih je dušenje svetlobe naraslo v prisotnosti obrasti v času njene dlje trajajoče kolonizacije, vendar v različnih časovnih obdobjih. Obrast se v jezerih, ki so bogata s hranili in tistih, ki so s hranili revni, razlikuje v vrstni sestavi in zgradbi. V evtrofnih jezerih se je pojavljala obrasti, ki je relativno debela, vendar slabo pritrjena. Spremembe v presevnosti te vrste obrasti so povezane predvsem z pojavljanjem nitastih zelenih alg, ki vsebujejo fotosintezne pigmente, ki absorbirajo najbolje v delu od 0 500 nm in 650 700 nm. V oligotrofnih jezerih pa so kolonije obrasti bolj kompaktne in dokaj neprepustne za svetlobo (Raeder in sod. 2010). Obrast lahko uravnava dostopnost svetlobe za morsko travo s tem, da svetlobo odbija ali vpija, preden le-ta doseže list (Bulthuis in Woelkerling, 1983; Orth in Moore, 1983). Vsi ti pogoji za dostopnost svetlobe poleg rastne strategije morske trave vplivajo na njeno razširjenost (Madden in Kemp, 1996). Po vseh že obstoječih raziskavah zmanjšanja presevnosti svetlobe s strani obrasti, še vedno ne obstaja standardna metodologija za te meritve (Frankovich in sod., 2005). V raziskavah so bile uporabljene metode z odstranitvijo obrasti z listov ali resuspendiranje v vodi (Neckles, 1993 v Frankovich in sod., 2005). Uporabljeno pa je tudi zbiranje materiala na filtrih za merjenje presevnosti (Cebrian in sod., 1999). Dosedanje študije so pokazale, da se lahko meritve presevnosti svetlobe izvajajo le na potopljenih združbah (Vermaat in Hootsmans, 1994; Brush in Nixon, 2002; Stankelis in sod., 2003). To velja predvsem za obrast, kjer prevladujejo nitaste oblike in odstopa od površine lista (Brush in Nixon, 2002; Stankelis in sod., 2003). Kremenaste alge in ostanki koral tvorijo ploščat sloj na listu (Vermaat in Hootsmans, 1994). Meritve odbojnost obrasti lahko potekajo na naravnih listih (Bulthuis in Woelkerling, 1983; Brush in Nixon, 2002) in umetnih listih (Stankelis in sod., 2003). Meritve lahko potekajo na enostranskih (Brush in Nixon, 2002) ali obojestranskih vzorcih (Stankelis in sod., 2003). Za natančne meritve je potrebno odstraniti obrast na eni strani lista (Brush in Nixon, 2002). Obojestranski vzorci so primerni, ko imamo sloj kremenastih alg, ki jih lahko odstranimo najprej z ene strani (Frankovich in sod., 2005).
10 3 MATERIALI IN METODE DELA 3.1 VZORČNO MESTO Reka Rak je del Kraške Ljubljanice. Prihaja iz ponorov Zelških jam in teče pod Malim in Velikim mostom. Ponikne na območju Tkalce jame in teče v smeri Planinske jame (Krajnc, 2003). Ob obilnem deževju vodotok reke Rak naraste do oboka Velikega mostu. Ko je vode največ, pretok v ali iz jam znaša tudi do 30 m 3 /s (Habič in Gospodarič, 1987). Ob poplavah voda pri Velikem naravnem mostu seže do vrha odprtine, kar znaša v globino 10 m v višino pa do nadmorske višine 512 m (Gams, 2004). Pritoki in odtoki Cekrniškega jezera so lahko obremenjeni s hranili, na kar vpliva tudi človekovo delovanje (Gaberščik in sod., 1994; Gaberščik in Urbanc-Berčič, 1996). Življenjske združbe so na tem območju prilagojene na nihanje vodostajev, ne pa tudi na obremenjenost vode. Prav tako so lahko obremenjeni s hranili izviri kraških voda (Gaberščik in sod. 1994). Zaradi obremenjenosti pride do zmanjšane koncentracije kisika. Vodotoki Cerkniškega jezera imajo veliko alkaliteto in trdoto, na kar vpliva karbonatna podlaga. Značilnost pritokov je nekoliko večja temperaturna stabilnost med letnimi časi, kot v samem jezeru. Površinski pritoki vsebujejo visoke koncentracije fosforja in dušika (Gaberščik in Urbanc-Berčič, 2003). Nekoliko manj so obremenjeni kraški izviri, vendar tudi ti nosijo posledice površinskih pritokov (Gaberščik in sod. 1994). Vzorčne liste rastlin prave potočarke (R. amphibia) in navadne streluše (S. sagittifolia) smo nabrali v reki Rak (v bližini velikega naravnega mostu). Da sta rastlini ostali sveži in da bi ohranili prerast, smo ju transportirali v laboratorij v vedru napolnjenem z vodo iz vodotoka. V laboratoriju smo opravili meritve absorpcijskih spektrov, biokemijske analize ter morfološke in anatomske analize. 3.2 PREUČEVANI RASTLINSKI VRSTI Na vodne rastline vpliva veliko okoljskih dejavnikov. Med te sodijo lastnosti vodnih teles, geomorfologija, sedimenti in klima. Nanje vplivajo pa tudi različne biološke interakcije kot so kompeticija, predatorstvo in bolezni (Lacoul and Freedman, 2006). Vodne rastline oziroma makrofiti so rastline, ki uspevajo v vodnih in obvodnih habitatih. Prave vodne rastline (hidrofiti) uspevajo le v vodnih habitatih, druge skupine vodnih rastlin kot so helofiti in amfibijske rastline pa so prilagojene na usihanje vode (Aznar in sod., 2003). Prave vodne rastline so lahko potopljene ali plavajoče. Nekatere izmed njih pa
11 lahko poženejo poganjke, prilagojene na terestrične razmere. Tiste, ki tega niso sposobne, odmrejo, če voda usahne in zrastejo v novi sezoni. Za amfibijske rastline je zelo pomembna prisotnost akvatične in terestrične faze, v kateri tla vseeno vsebujejo dovolj vode. V akvatični fazi lahko amfibijske rastline uspevajo tudi v globini do dveh metrov ali celo več. Listi, zrasli v akvatični fazi, lahko nekaj časa obstojijo tudi ko rastlina preide na terestrični način življenja. Nato ti listi odpadejo in zrastejo novi, prilagojeni na terestrično fazo (Martinčič, 2003). 1.1.1 Navadna streluša (Sagittaria sagittifolia (L.)) Navadna streluša je prava vodna rastlina in zelnata trajnica, ki spada v družino porečnikovk. Njena rastišča so stoječe ali počasi tekoče vode ter nabrežja (Martinčič in sod., 2007a). Je rastlinska vrsta, ki je zaradi svoje fenotipske plastičnosti zelo dobro prilagojena na življenje v različnih sladkovodnih habitatih. V stadiju ontogeneznega razvoja lahko pod vplivom okoljskih dejavnikov razvije različne tipe listov kot so potopljeni, plavajoči in emergentni (Hroudova in sod., 1988). 1.1.2 Prava potočarka (Rorippa amphibia (L.) Besser) Prava potočarka spada v družino križnic. Je amfibijska rastlina in zelnata trajnica, katere rastišča so navadno ob vodah in v jarkih (Martinčič in sod., 2007b). Prava potočarka je prilagojena rastlina na različne vodostaje (Stift in sod., 2008). Lahko preživi tako v vodnem kot tudi kopenskem okolju (Vartapetian in Jackson, 1997). 3.3 MERITVE OPTIČNIH LASTNOSTI Pri meritvah optičnih lastnosti je potrebno upoštevati, da se rezultati meritev razlikujejo glede na to kje in na katerem listu meritve izvajamo. Na eni sami rastlini je rezultat meritev odvisen od starosti in nameščenosti listov na rastlini. Pri primerjanju meritev med različnimi vrstami je pomembno, da uporabimo rastline, ki rastejo v podobnih razmerah, enak spektrofotometer in enako serijo parametrov (Liew in sod., 2008). Pri obeh rastlinskih vrstah smo opravili meritve presevnosti in odbojnosti na desetih listih (pri S. sagittifolia na osrednjih delih listov s povprečno debelino, ker so potopljeni listi lahko zelo dolgi). Meritve smo izvajali v območju valovnih dolžin 280-880 nm.
12 Pri vseh nadaljnjih opisanih meritvah optičnih lastnosti smo uporabili spektrofotometer Jaz Modular Optical Sensing Suite (Ocean Optics, Inc., Dunedin, Florida, USA), ki je bil preko optičnega kabla QP600-1-SR-BX (Ocean Optics, Inc., Dunedin, Florida, USA) povezan z integracijsko sfero ISP-30-6-R (Ocean Optics, Inc., FL, USA). Liste rastlin obeh vrst smo osvetljevali s svetlobnim virom (UV-VIS-NIR, DH-2000, Ocean Optics, Inc., FL, USA). Za umerjanje naprave smo uporabili belo referenčno ploščico (Spectrolon, Labsphere, North Sutton, New Hampshire, USA). 3.3.1 Meritve odbojnosti Pri meritvah smo uporabili spektrofotometer, ki je bil preko optičnega kabla povezan z integracijsko sfero, pod katero smo vstavili vzorce desetih listov v dveh paralelkah (listi z obrastjo, listi brez obrasti). Sfero smo položili na zgornjo stran lista, ki smo jo osvetljevali s svetlobnim virom. Svetloba, ki se je odbila od površine lista, se je preusmerila v sfero in nato v spektrofotometer. Ločljivost/natančnost merjenja odbojnosti je bila približno 0,3 nm. Za umerjanje naprave na 100% odbojnost smo uporabili belo referenčno ploščico. Odbojnost smo izračunali kot razmerje med količino odbite svetlobe od listne površine in belo referenčno ploščico. 3.3.2 Meritve presevnosti Pri meritvah presevnosti smo uporabili deset vzorcev listov obeh rastlinskih vrst v treh paralelkah (listi z obrastjo, listi brez obrasti zgoraj, listi brez obrasti zgoraj in spodaj). Liste smo namestili pod integracijsko sfero tako, da je bila sferi izpostavljena spodnja stran lista. Z virom svetlobe smo osvetljevali zgornjo stran lista. Prepuščena svetloba je prehajala skozi list do integracijske sfere na spodnji strani lista. Pred meritvami vzorcev smo spektrofotometer umerili na 100% prepustnost, tako da smo svetlobni prehajala neposredno v integracijsko sfero. Presevnost listov smo izračunali kot razmerje zmanjšanja jakosti svetlobnega žarka po prehodu skozi list. 3.2 MORFOLOŠKE IN ANATOMSKE ANALIZE Morfološke meritve na rastlinah smo opravili na koščkih listov pri obeh vrstah. Koščke z znano površino smo najprej stehtali, izmerili njihovo površino, jih nato zavili v folijo znane mase in jih 24h sušili v pečici na 105 C. Tako smo lahko določili suho maso lista (ss) in vsebnost vode [%]. Ko smo pridobili vse potrebne podatke, smo z njih izračunali specifično listno površino (SLA) [cm 2 /g].
13 Na v naprej pripravljenih preparatih iz svežih listov obeh vrst rastlin smo na seriji 10 listov (vsak list po 5 meritev) izvajali histološke analize kot so merjenje spodnje in zgornje povrhnjice ter mezofila [µm] s svetlobnim mikroskopom Olympus CX41 (100 povečava). Iz teh podatkov smo lahko izračunali debelino lista [µm]. Pri pravi potočarki (R. amphibia) smo pod svetlobnim mikroskopom Olympus CX41 (0 povečava) šteli listne reže na svežih listih (na spodnji in zgornji povrhnjici). Pri vrsti S. sagittifolia nismo šteli listnih rež, ker jih na takem tipu lista ni pričakovati. Merili smo prisotnost diatomej (na zgornji in spodnji strani lista) na določenem vidnem polju (enako na 10 listih, na vsakem po 5 meritev) pod svetlobnim mikroskopom Olympus CX41 (0 povečava). Na seriji drugih 10 listov smo pri obeh rastlinskih vrstah postrgali obrast (zgoraj in spodaj posebej) z vato (z znano maso), jo položili na folijo (z znano maso) in sušili pri 104 C. Izračunali smo suho maso obrasti na določeni površini lista. 3.4 BIOKEMIJSKE ANALIZE Za biokemijske meritve smo pripravljene koščke svežih rastlin z znano površino zamrznili. Analizah so vključevale meritve vsebnosti klorofilov, karotenoidov, antocianov in UV absorbirajočih snovi. 3.4.1 Klorofili in karotenoidi Za analizo vsebnosti klorofilov (a in b) in karotenoidov v listih smo uporabili metodo Lichtenthaler in Buschmann (2001a, 2001b). Vzorce (10 paralelk) smo strli v terilnici, ekstrahirali v 5 ml acetona in centrifugirali (00 rpm, 4 C, 4 min) v centrifugi in odčitali prostornine ekstraktov. Estinkcije smo zmerili z VIS spekrtofotometrom pri valovnih dolžinah 470, 645 in 662 nm. Vsebnosti klorofilov (Kl a in Kl b) in karotenoidov (Kar) smo izrazili na suho maso in površino vzorca: Kl a [mg g -1 P] = c a V/ P = (11.24 E 662 2.04 E 645 ) V / P Kl b [mg g -1 P] = c a- c b V/ P = (20.13 E 645 4.19 E 662 ) V / P Kar [mg g -1 P] = (1000 E 470 1.9 c a 63.14 c b ) V / P / 214 c a, b = koncentracija klorofila a oziroma b V = volumen ekstrakta [ml] P = površina vzorca [cm 2 ] E = ekstinkcija pri izbrani valovni dolžini
14 Sproti odstranjeno obrast iz vzorcev listov za merjenje odbojnosti in presevnosti (pri R. amphibia z vato, pri S. sagittifolia z mehko ščetko, nato popivnano z vato), smo shranili v steklene epruvete skupaj z vato in prelili s 5 ml acetona in po 24 urah v temi izmerili vsebnost klorofila a. Za izračun vsebnosti klorofila a v obrasti smo uporabili formulo: Kl a [mg/cm 2 ] = (13,9 (A 665 A 750 ) Vm)) / (P 1), pri kateri smo podatek o volumnu prefiltrirane vode nadomestili s podatkom o površini lista. A 665 = absorpcija pri 665 nm A 750 = absorpcija pri 750 nm Vm = volumen metanola [ml] P = površina lista, na kateri je bil odstranjen prerast [cm 2 ] 1 = širina kivete v spektrofotometru [cm] 3.4.2 Antociani Za analizo vsebnosti antocianov v listih smo uporabili metodo po Khareju in Guruprasadu (1993). Vzorce smo strli v terilnici, jih ekstrahirali v 5 ml ekstrakcijskega medija (metanol : HCl (37%) = 99:1), centrifugirali (00 rpm, 4 C, 4 min) in odčitali prostornine ekstraktov, Vzorce smo nato shranili v temi (24h pri 3-5 C). Ekstinkcije smo izmerili z UV/VIS spekrtofotometrom (Lambda 25, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) in računalniškim programom Lambda (uporabljen tudi pri nadaljnjih meritvah ekstinskcij) pri 530 nm. Formula za izračun vsebnosti antocianov (Ant): Ant [relativna enota] = E 530 V ss -1 ; E 530 V P -1 E 530 = ekstinkcija pri valovni dolžini 530 nm V = prostornina ekstrakta [ml] ss = suha masa vzorca [g] P = površina vzorca [cm 2 ] 3.4.3 UV absorbirajoče snovi Za analizo vsebnosti UV (-B in -A) absorbirajočih snovi v listih (UV-B 280-320 nm, UV- A 320-0 nm) smo uporabili metodo po Caldwellu (1968). Vzorce smo strli v terilnici, ekstrahirali v 5 ml ekstrakcijskega medija (metanol : destilirana voda : HCl (37%) = 79:20:1), nato 20 min inkubirali. Za tem smo vzorce centrifugirali (00 rpm, 10 C, 10 min) in odčitali prostornine ekstraktov. Pri tej analizi smo uporabljali kvarčne kivete pri merjenju ekstinkcij z VIS spektrofotometrom.
15 Formule za izračun vsebnosti UV absorbirajočih snovi: UV abs [relativna enota] = I V -1 ss -1 ; I V -1 P -1 I = integral ekstinkcijskih vrednosti v intervalu 280 319 nm ter 320 0 nm V = prostornina vzorca [cm 2 ] ss = suha masa vzorca [g] 3.5 STATISTIČNE ANALIZE Za analizo statistično značilne različnosti lastnosti listov obeh vrst smo uporabili t-test in ANOVA test. Za testiranje normalnosti podatkov smo uporabili Kolmogorov-Smirnov test in Shapiro-Wilk W test. Odbojne spektre smo testirali z ANOVA testom, če so bili podatki normalno porazdeljeni. Za podatke, ki niso bili normalno razporejeni smo uporabili testiranje s Kruskal-Wallis testom. Za testiranje normalnosti podatkov je bil uporabljen Kolmogorov-Smirnov test. Korelacije preučevanih parametrov s spektri pa smo testirali s Spearmanovim testom.
16 4 REZULTATI V nadaljevanju so predstavljene morfološke in anatomske ter biokemijske lastnosti listov. V grafih je predstavljena gostota listnih rež na listih prave potočarke, gostota diatomej na površini listov navadne streluše, zgradba listov obeh vrst, vsebnost klorofilov a in b, karotenoidov, antocianov in UV absorbirajočih snovi v listih obeh vrst. Prikazana je tudi vsebnost klorofila a v obrasti listov obeh vrst. Prikazana sta odbojnost in presevnost listov obeh vrst z obrastjo, brez obrasti ali z obrastjo le na eni strani (v primeru meritev presevnosti). V preglednicah so prikazane korelacije vseh obravnavanih morfoloških in biokemijskih lastnosti listov ter biomase obrasti z odbojnostjo in presevnostjo listov obeh vrst. 4.1 MORFOLOGIJA IN ANATOMIJA LISTOV SPECIFIČNA LISTNA POVRŠINA SLA [cm2/g] 900 800 700 600 500 0 300 200 100 0 a b b S RR RT Slika 1:Prikaz povprečnih vrednosti SLA listov pri vrstah prava potočarka in navadna streluša [cm 2 g -1 ] ± SD; n = 10; S predstavlja vzorce listov navadne streluše, RR vzorčne liste prave potočarke pri merjenju odbojnosti, RT vzorčne liste prave potočarke pri merjenju presevnosti; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati testa ANOVA), črka b označuje statistično značilno različne podatke (p < 0,01; rezultati testa ANOVA) SLA [cm 2 g -1 ] vzorčnih listov navadne streluše je bila večja kot pri obeh serijah vzorcev prave potočarke. SLA listov prave potočarke se statistično značilno razlikuje od SLA listov navadne streluše (Slika 1).
17 GOSTOTA LISTNIH REŽ Slika 2:Listna reža prave potočarke Na sliki je prikazana listna reža na povrhnjici lista prave potočarke (Slika 2). gostota listnih rež [mm2] 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 a spodnja stran a zgornja stran Slika 3:Prikaz gostote listnih rež [mm 2 ] na listih prave potočarke; prikazane so povprečne vrednosti ± SD; n=10; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati t-testa) Gostota listnih rež [mm 2 ] je bila večja na zgornji strani vzorčnih listov prave potočarke kot na spodnji strani. Tak rezultat je pričakovan, saj se listne reže pri takem tipu lista nahajajo vedno v večji meri na zgornji strani. Gostota listnih rež se na spodnji in zgornji strani statistično značilno ne razlikujeta (Slika 3).
18 GOSTOTA DIATOMEJ gostota diatomej na listu [cm2] 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 a spodnja stran a zgornja stran Slika 4:Prikaz gostote diatomej [cm 2 ] na listih navadne streluše; prikazane so povprečne vrednosti ± SD; n=10; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati t-testa) Gostota diatomej oziroma kremenastih alg [cm 2 ] je bila pri vzorčnih listih navadne streluše večja na spodnji strani kot na zgornji strani listov, vendar se gostoti na obeh straneh lista statistično značilno ne razlikujeta (Slika 4).
19 Oražem, V. Vpliv obrasti na optične ne lastnosti vodnih listov prave potočarke in navadne streluše. 201 ZGRADBA LISTOV Slika 5:List prave potočarke (zgoraj) in navadne streluše (spodaj) v prečnem prerezu Pri prerezu lista navadne streluše je opazna prisotnost prisotnost velikih intercelularjev v mezofilu (Slika 5).
20 [um] 200 180 160 1 120 100 80 60 20 0 a a a a a a a a a a a a RR RT S RR RT S RR RT S RR RT S zg. povrhnjica mezofil sp. povrhnjica debelina lista Slika 6:Prikaz zgradbe listov obeh vrst; prikazane povprečne vrednosti ± SD; n = 10; S predstavlja vzorce listov navadne streluše, RR vzorčne liste prave potočarke pri merjenju odbojnosti, RT vzorčne liste prave potočarke pri merjenju presevnosti; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati testa ANOVA) Pri obeh vrstah vidimo, da sta zgornja in spodnja povrhnjica veliko tanjši v primerjavi z debelino mezofila, ki je pri obeh tipih listov enoten (Slika 6). 4.2 BIOKEMIJA LISTOV KLOROFILI IN KAROTENOIDI [mg/cm2] 35 30 25 20 15 10 5 0 a a a a b a b b b RR RT S RR RT S RR RT S Kl a Kl b Kar Slika 7:Prikaz vsebnosti klorofilov in katorenoidov na površino lista [mgcm -2 ] obeh vrst; prikazane so povprečne vrednosti serij 10 vzorcev; S predstavlja vzorce listov navadne streluše, RR vzorčne liste prave potočarke pri merjenju odbojnosti, RT vzorčne liste prave potočarke pri merjenju presevnosti; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati testa ANOVA), črka b označuje statistično značilno različne podatke (p < 0,01; rezultati testa ANOVA)
21 Pri seriji vzorčnih listov prave potočarke je opazna veliko večja vsebnost klorofilov (a in b) kot tudi karotenoidov. Koncentracije klorofila a in b v listih navadne streluše se statistično značilno razlikujejo od koncentracij v listih prave potočarke. Statistično značilna razlika se kaže tudi pri koncentracijah karotenoidov v listih navadne streluše in prave potočarke (vzorci RT) (Slika 7). ANTOCIANI [relativna enota] [cm2] 0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 b a a RR RT S Ant Slika 8: Prikaz vsebnosti antocianov na površino lista [relativna enota] [cm 2 ] obeh vrst; prikazane so povprečne ± SD; n = 10; S predstavlja vzorce listov navadne streluše, RR vzorčne liste prave potočarke pri merjenju odbojnosti, RT vzorčne liste prave potočarke pri merjenju presevnosti; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati testa ANOVA), črka b označuje statistično značilno različne podatke (p < 0,01; rezultati testa ANOVA) Vsebnost antocianov je višja pri seriji vzorčnih listov navadne streluše. Koncentracija antocianov v listih navadne streluše se statistično značilno razlikuje od koncentracije antocianov snovi v listih prave potočarke (Slika 8).
22 UV ABSORBIRAJOČE SNOVI [relativna enota] [cm2] 12 10 8 6 4 2 0 a a a a b b RR RT S RR RT S UV-A abs UV-B abs Slika 9:Prikaz vsebnosti UV-A in UV-B absorbirajočih snovi na površino lista [relativna enota] [cm 2 ] obeh vrst; prikazane so povprečne vrednosti ± SD; n = 10; S predstavlja vzorce listov navadne streluše, RR vzorčne liste prave potočarke pri merjenju odbojnosti, RT vzorčne liste prave potočarke pri merjenju presevnosti; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati testa ANOVA), črka b označuje statistično značilno različne podatke (p < 0,01; rezultati testa ANOVA) Listi prave potočarke vsebujejo višje koncentracije UV absorbirajočih snovi kot listi navadne streluše. Koncentracije UV absorbirajočih snovi v listih navadne streluše se statistično značilno razlikujejo od koncentracij UV absorbirajočih snovi v listih prave potočarke (Slika 9). KLOROFIL a V OBRASTI [g/cm2] 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 a a a a a RR obe strani RT zgoraj RT spodaj S spodaj S zgoraj Kl a Slika 10:Prikaz vsebnosti klorofila a v obrasti na površino lista [gcm -2 ] obeh vrst; prikazane so povprečne vrednosti ± SD; n = 10; S predstavlja vzorce listov navadne streluše, RR vzorčne liste prave potočarke pri merjenju odbojnosti, RT vzorčne liste prave potočarke pri merjenju presevnosti; črka a označuje, da podatki niso statistično značilno različni (p > 0,5; rezultati testa ANOVA)
23 V obrasti smo merili le koncentracije Kl a, saj je ta prisoten pri večini alg, ki vsebujejo fotosintezne pigmente. Kl b pa najdemo le pri zelenih algah. Opazna je večja vsebnost klorofila v obrasti z zgornje strani lista pri pravi potočarki. Pri obrasti navadne streluše je ravno nasprotno. Večjo koncentracijo klorofila vsebuje obrast na spodnji strani listov. Vendar pa se koncentracije med seboj statistično značilno ne razlikujejo. Dobljene vrednosti bi lahko razlagali z različno sestavo obrasti na zgornji in spodnji strani lista, kar bi bil lahko predmet nadaljnjih raziskav (Slika 10). 4.4 ODBOJNI SPEKTRI 4.4.1 Odbojnost PRAVA POTOČARKA 100 90 80 70 60 50 30 20 10 0 280 0 480 580 680 780 880 valovna dolžina [nm] z obrastjo brez obrasti Slika 11: Prikazana je odbojnost listov prave potočarke z ali brez obrasti; prikazane so povprečne; n = 10 Iz grafa je razvidno, da listi brez obrasti močneje odbijajo svetlobo v območju UV, rdečega in NIR sevanja kot listi z obrastjo (Slika 11).