UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO VID PRIJATELJ MAGISTRSKA NALOGA ODKRIVANJE IN POTRJEVANJE VLOGE MIKRORNA hsa-mir-125b-5p PRI IZRAŽANJU GENA ESRRA V CELICAH HOS ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2017
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO VID PRIJATELJ MAGISTRSKA NALOGA ODKRIVANJE IN POTRJEVANJE VLOGE MIKRORNA hsa-mir-125b-5p PRI IZRAŽANJU GENA ESRRA V CELICAH HOS MICRORNA hsa-mir-125b-5p ROLE DISCOVERY AND CONFIRMATION IN ESRRA GENE EXPRESSION IN HOS CELLS ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2017
Magistrsko nalogo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo, na Katedri za klinično kemijo in biokemijo, pod mentorstvom prof. dr. Janje Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom asist. dr. Tilna Kranjca, mag. farm. Meritve sem opravljal v laboratoriju za molekularno diagnostiko na Fakulteti za farmacijo. Zahvala Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Janji Marc, mag. farm., spec. med. biokem. Prav tako se zahvaljujem somentorju asist. dr. Tilnu Kranjcu, mag. farm. za vodenje in pomoč pri načrtovanju, izvajanju eksperimentalnega dela ter interpretiranju rezultatov. Izjava Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom prof. dr. Janje Marc, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom asist. dr. Tilna Kranjca, mag. farm. I
Vsebina Povzetek... V Abstract... VI Seznam okrajšav... VII 1 Uvod... 1 1.1 Oksidativni stres pri kostnih boleznih... 1 1.1.1 Kostna homeostaza... 1 1.1.2 Vpliv oksidativnega stresa na kosti... 3 1.1.3 Signalna pot WNT/β-katenin... 4 1.1.4 ESRRα in vpliv na kosti... 6 1.2 MikroRNA... 7 1.2.1 Genska osnova... 7 1.2.2 Funkcija in vpliv mir na kostno homeostazo... 8 1.3 Eksperimentalni in bioinformatski pristopi za odkrivanje mikrorna... 10 1.3.1 Identifikacija in merjenje izražanja mikrorna s sistemom Nanostring ncounter... 10 1.3.2 Bioinformatsko orodje TargetScan za identifikacijo tarč in kvantifikacijo vpliva mirna... 12 1.3.3 Merjenje vpliva mikrorna na izražanje genov... 12 2. Namen... 14 3 Materiali in metode... 15 3.1 Odkrivanje mirna vpletenih v signalne poti kostne remodelacije... 15 3.2 Iskanje tarč... 15 3.2.1 mirwalk2.0... 15 3.2.2 Cytoscape... 17 3.3 Iskanje zaporedja za pripravo oligonukleotidov... 18 3.4 Priprava kompetentnih celic z metodo kalcijevega klorida... 18 3.5 Določitev kompetentnosti celic... 20 3.6 Transformacija bakterij... 21 3.7 Izolacija plazmida iz bakterij ter določanje koncentracije... 22 3.8 Linearizacija izolirane DNA z dvojno restrikcijo... 23 3.9 Agarozna gelska elektroforeza... 24 3.10 Izolacija DNA iz gela... 25 3.11 Hibridizacija inserta s sledečo ligacijo... 26 3.12 Kloniranje konstrukta z bakterijsko transformacijo in izolacijo plazmida ter potrjevanjem ligacije z uporabo restrikcijske endonukleaze ApaI... 28 3.13 Celična kultura... 30 3.14 In vitro DNA transfekcija v celice HOS... 31 3.15 Liza celic in izvedba dvojnega luciferaznega testa... 32 4. Rezultati in razprava... 34 4.1 Obdelava podatkov HOS... 34 4.2 Iskanje tarč za mikrorna... 36 4.2.1 Iskanje tarčnih genov s pomočjo podatkovne baze mirwalk2.0... 36 II
4.2.2 Izgradnja mreže interakcij mikrorna s tarčnimi geni s pomočjo programa Cytoscape... 38 4.3 Potrditev najdenih tarč... 41 4.3.1 Iskanje vezavnega zaporedja za mikrorna hsa-mir-125b-5p... 41 4.3.2 Konstrukcija oligonukleotidov za prenos in transfekcijo v celice HOS... 41 4.4 Preskus uspešnosti ligacije in transformacije... 43 4.5 Preverjanje vezave preiskovanih mirna na tarčne oligonukleotide... 45 5. Razprava... 48 6. Sklep... 51 7. Viri... 52 8. Priloge... 57 8.1 Skripta normalizacije podatkov izražanja mirna v HOS celicah... 57 8.2 Skripta normalizacije, statistične obdelave in vizualizacije podatkov izražanja luciferaznih proteinov... 59 III
Kazalo slik in preglednic Slika 1: WNT/ β -katenin signalna pot in načini njene inhibicije.... 5 Slika 2: Proces sinteze in zorenja mirna.... 8 Slika 3: Princip metode ncounter.... 11 Slika 4: Reagenti pri procesu kemijskih reakcij luciferaz.... 13 Slika 5: Pomember vnos nastavitev... 16 Slika 6: Označena hiperpovezava do prenosa izračunanih podatkov.... 17 Slika 7: Semenska sekvenca gena ter hsa-mir-125b-5p s komplementarno vezavo obeh. 18 Slika 8: Pregled osnovnega delovanja mirwalk2.0.... 36 Slika 9: Funkcionalne skupine genov.... 39 Slika 10: "Regulation of ossification".... 39 Slika 11: Grafični prikaz parov mirna tarčni geni.... 40 Slika 12: Grafični skupek mir-125b- 5p in tarčnihi genov.... 40 Slika 13: Sekvenca konstruktnega plazmida *NEW* ESRRA-SacI-XbaI... 43 Slika 14: Sekvenca konstruktnega plazmida *NEW* MUT ESRRA-SacI-XbaI.... 43 Slika 15: Slika gelske elektroforeze.... 44 Slika 16: Rezultat sekvenciranja plazmidne DNA (1)... 45 Slika 17: Rezultat sekvenciranja plazmidne DNA (2)... 45 Slika 18: Grafični prikaz rezultatov izražanja.... 47 Preglednica I: mirna, ki vplivajo na pozitivno regulacijo osteoblastogeneze... 9 Preglednica II: mirna, ki vplivajo na negativno regulacijo osteoblastogeneze... 9 Preglednica III: mirna, ki vplivajo na pozitivno regulacijo osteoklastogeneze... 10 Preglednica IV: mirna, ki vplivajo na negativno regulacijo osteoklastogeneze... 10 Preglednica V: 20 mikrorna z razlikami v izražanju v celicah PE in celicah K... 35 Preglednica VI: Preglednica z neobdelanimi odčitki luminiscence luciferaznih testov.... 46 Enačba 1: Osnovna enačba in izračun viabilnosti celic.... 21 IV
Povzetek MikroRNA so od 21 do 24 nukletoidov dolge molekule RNA, ki na proces prenosa genskega materiala vplivajo z utišanjem izražanja informacijskih RNA s pomočjo mikrorna induciranega utišalnega kompleksa. Zaradi svojega mehanizma delovanja predstavljajo možne terapevtske tarče pri številnih boleznih, tudi pri osteoporozi. Spremembo izražanja mikrorna hsa-mir-125b-5p so povezali tudi s kakovostjo kostnega tkiva. Estrogenskim receptorjem sorodni receptor α, jedrni receptor sirota, je vpleten v več fizioloških in patofizioloških procesov, med drugim pri nastanku raka dojke, raka prostate, metabolizmu ogljikovih hidratov, celičnem dihanju in kostni premeni. Kostna premena je dobro raziskan biološki proces, vendar so vpleteni epigenetski mehanizmi slabo raziskani. V naši študiji smo želeli odkriti in eksperimentalno preveriti nove pare molekul mikrorna in njihovih genskih tarč. V ta namen smo analizirali podatke izražanja mikrorna v modificiranih celicah humanega osteosarkoma (celice HOS) v razmerah oksidacijskega stresa in pri tem odkrili mikrorna z značilno spremenjenim izražanjem. Nato smo želeli odkriti možne tarče teh mikrorna. Z uporabo bioinformacijskih orodij smo in silico predvideli možen vpliv mikrorna hsa-mir-125b-5p na tarčni del za estrogenskim receptorjem sorodni receptor α, kar smo želeli preiskusiti in vitro. Reporterskemu luciferaznemu vektorju pmirglo smo z uporabo restriktivnih endonukleaz in reakcijo ligacije dodali komplementarno semensko sekvenco estrogenskim receptorjem sorodnega receptorja α, uspešnost ligacije preverili z uporabo agarozne gelske elektroforeze in sekvenciranja, ter na koncu plazmid transfecirali v celice humanega osteosarkoma. Dokazali smo, da vnos vezavnega mesta za hsa-mir- 125b-5p v plazmid pmirglo značilno zmanjša aktivnost luciferaze v primerjavi s kontrolnim plazmidom ter plazmidom z mutiranim vezavnim mestom za to mikrorna. Na osnovi naših rezultatov smo zaključili, da estrogenskim receptorjem sorodni receptor α vsebuje vezavno mesto za hsa-mir-125b-5p ter da na ta način mikrorna zmanjša izražanje estrogenskim receptorjem sorodnega receptorja α. Ključne besede: ESRRα, hsa-mir-125b-5p, kostna premena, luciferaza, mikrorna V
Abstract MicroRNAs are 21 to 24 nucleotides long molecules, that repress messenger RNA via their mechanism of action as part of RNA-induced silencing complex. Due to their nature they represent a class of attractive therapeutical targets. A correlation between a change in expression of microrna hsa-mir-125b-5p and bone tissue quality is known. Role of estrogen receptor-related receptor α has been implied in a number of biological and pathological processes, including breast cancer, prostate cancer, carbohydrates metabolism, cellular respiration and bone turnover. Whereas bone turnover as a process is well researched and documented, epigenetic mechanisms surrounding it are still largely unknown. We set on to discover novel microrna and their target gene pairs. By analysing microrna expression data in human osteosarcoma cells under oxidative conditions we identified those micrornas with changed expression. In silico methods showed a possibility of pairing of microrna hsa-mir-125b-5p to estrogen receptor-related receptor α which we verified in vitro. We added the complementary seed sequence of estrogen receptor-related receptor α to dual-luciferase pmirglo target expression vector by means of using restriction endonucleases and ligation. Successful ligation was determined by digesting the resulting plasmid construct with ApaI restriction endonuclease and running the resulting DNA fragments through agarose gel, and by sequencing the resulting construct. We discovered that by ligating complementary seed sequence of hsa-mir-125b-5p to 3'-UTR of firefly luciferase inside pmirglo the expression of said luciferase was significantly reduced in comparison to control pmirglo plasmid and pmirglo plasmid with mutated complementary seed sequence for the same microrna. This is a proof that estrogen receptor-related receptor α does contain a complementary seed sequence for hsa-mir-125b-5p and thus this microrna inhibits expression of estrogen receptor-related receptor α. Keywords: bone turnover, ESRRα, hsa-mir-125b-5p, luciferase, microrna VI
Seznam okrajšav 3'-UTR 3' konec neprevedene regije (ang. three prime untranslated region) Ago Argonavt proteini (ang. argonaute) ALP Alkalna fosfataza (ang. alkaline phosphatase) BMD Mineralna gostota kosti (ang. bone mineral density) BMP Kostni morfogeni protein (ang. bone morphogenic protein) BMU Kostna večcelična remodelacijska enota (ang. basic multicellular remodeling unit) bp Bazni par (ang. base pair) cdna Komplementarna DNA (ang. complementary DNA) C-FOS Homolog aktivatorja murinskega osteosarkom virusnega onkogena (ang. activation of FBJ murine osteosarcoma viral oncogen humolog) CSF1R Receptor kolonije spodbujajočega dejavnika 1 (ang. colony stimulating factor 1 receptor) DGCR8 DiGeorge Sindrom Kritična Regija 8 (ang. DiGeorge Syndrome Critical Region 8) DKK1 Dickkopf 1 DSH Ang. Dishevelled ds-mirna Dvoverižna mirna (ang. double stranded mirna) ER Estrogenski receptorji (ang. estrogen receptors) ESRR Estrogenskemu receptorju sorodni receptorji (ang. estrogen receptorrelated receptors) FASL Ligand apoptoznega antigena 1 (ang. apoptosis antigen 1 ligand) FOXO Ang. Forkhead box O FZD Ang. Frizzled GIT Gastrointestinalni trakt (ang. gastrointestinal tract) gs-mirna Vodilna mirna (ang. guide strand mirna) HDAC Histonska deacetilaza (ang. histone deacetylase) HOXA Ang. Homeobox IFN Ang. Interferon IGF-1 Inzulinu podoben rastni dejavnik 1 (ang. insulin-like growth factor 1) IL Interlevkin (ang. interleukin) LRP5/6 Protein soroden receptorju za lipoprotein nizke gostote 5/6 (ang. lowdensity lipoprotein receptor-related protein 5/6) MAPK Od mitogena aktivirana protein kinaza (ang. mitogen-activated protein kinase) M-CSF Makrofagni kolonije stimulirajoči dejavnik (ang. macrophage colony stimulating factor) mirna MikroRNA (ang. microrna) MITF Transkripcijski dejavnik povezan z mikroftalmijo (ang. microphtalmiaassociated transcription factor) mrna Informacijska RNA (ang. messenger RNA) VII
NFATC1 Jedrni dejavnik aktiviranih T-celic (ang. nuclear factor of activated T cells) NFIA Jedrni dejavnik I/A (ang. nuclear factor I/A) NF-κβ Jedrni faktor κβ (ang. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) nt Nukleotid (ang. nucleotide) OPG Osteoprotegerin PDCD4 Programirana celična smrt 4 (ang. programmed cell death protein 4) Pre-miRNA Prekurzorska mirna (ang. precursor mirna) Pri-miRNA Primarna mirna (ang. primary mirna) ps-mirna Spremljevalna mirna (ang. passenger strand mirna) Ran-GTP Gvanozin-trifosfat vezavni jedrni protein Ran (ang. GTP-binding nuclear protein Ran) RANKL Ligand receptorja za aktivacijo jedrnega dejavnika κ-β (ang. receptor activator of nuclear factor κ-β ligand) RE Restrikcijska endonukleaza (ang. restriction endonuclease) RISC Z mirna induciran utišalni kompleks (ang. RNA-induced silencing complex) RMA Robustno vrstno povprečje (ang. robust multi-array average) RNAP II RNA polimeraza II (ang. RNA polymerase II) ROS Reaktivne kisikove zvrsti (ang. reactive oxygen species) RUNX Z Runt povezan transkripcijski dejavnik 2 (ang. runt-related transcription factor 2) sfrp Izločeni FRP (ang. secreted FRP) SOST Sklerostin (ang. sclerostin) TBRP HIV-1 TAR RNA-vezujoč protein (ang. HIV TAR element binding protein) TGF Transformirajoči rastni dejavnik (ang. transforming growth factor) TNF Dejavnik nekroze tumorjev (ang. tumor necrosis factor) WIF1 WNT inhibitorni dejavnik 1 (ang. WNT inhibitory factor 1) WNT Družina brezkrilnih integracijskih mest MMTV (ang. wingless-type MMTV integration site) XPO5 Eksportin-5 (ang. exportin-5) VIII
1 Uvod 1.1 Oksidativni stres pri kostnih boleznih 1.1.1 Kostna homeostaza Človeški skelet je stalno podvržen procesu kostne premene: procesu resorbiranja stare kostnine in izgradnji nove. V mladosti prevladuje proces nastanka, v obdobju mlade odraslosti sta procesa v ravnotežju, po 35. letu pri ženskah oz. kasneje pri moških se ravnovesje med procesoma ponovno poruši in prevlada proces resorpcije. Tako se z leti povečujeta tveganje strukturne šibkosti in zmanjšanja kostne mase (1). Glavne celice, vpletene v kostno homeostazo, so osteoblasti, celice ki proizvajajo in izločajo sestavine zunajceličnega matriksa, osteoklasti, večjedrne celice ki kostnino resorbirajo, in osteociti, ki izvirajo iz osteoblastov in ostanejo vpeti v kostni matriks med nastankom kosti. Prvi dve vrsti celic sta medsebojno povezani v kostno remodelacijsko enoto (BMU). Remodelacija sestoji iz: - aktivnosti osteoklastov in osteoblastov - delovanja različnih citokinov - prometa/kroženja mineralov - delovanja hormonov Pred začetkom preoblikovanja kostnine se neaktivni ploščati osteoblasti umaknejo s kostne površine. Začetek zaznamujeta migracija in aktivacija prekurzorskih celic osteoklastov in njihova diferenciacija pod vplivom citokinov v večjedrne zrele celice. Osteoklasti potujejo vzdolž kosti ter z izločanjem vodikovih protonov (H + ) in proteolitičnih encimov (katepsin K) razgrajujejo kostnino. Med tem se iz kostnine sproščajo citokini, ki aktivirajo osteoblaste k izgradnji nove kostnine. Osteoblasti sintetizirajo kolagen in ostale sestavine osteoida, nemineraliziranega dela kostnine, ki kasneje mineralizira s pomočjo alkalne fosfataze (ALP) in osteokalcina. V procesu izgradnje kostnine določen delež osteoblastov ostane ujet v kostnem matriksu. Ti osteoblasti se spremenijo v osteocite, medtem ko preostali delež osteoblastov aktivira nove prekurzorje osteoklastov. Taka 1
potujoča kostna večcelična remodelacijska enota se premika s hitrostjo prbližno 25 µm/dan (2). Najbolj pogosta predstavnika citokinov, ujetih v osteoidu, sta inzulinu podoben rastni dejavnik 1 (IGF-1), ki vzdržuje proliferacijo osteoblastov, in transformirajoči rastni dejavnik β (TGF-β), pomemben za diferenciacijo nekaterih prekurzorjev kostnih celic in odgovoren za apoptozo osteoklastov (2, 3). Ostali citokini udeleženi v samem procesu kostne premene, so tudi kostni morfogeni proteini (BMP), različni interlevkini (IL) in člani družine dejavnikov tumorske nekroze (TNF). Med slednje uvrščamo tudi ligand receptorja za aktivacijo jedrnega dejavnika κ-β (RANKL), ki je nujen za diferenciacijo, proliferacijo in preživetje osteoklastov in se izraža na membrani osteoblastov in osteocitov. Vključen je tudi osteoprotegerin (OPG), topni receptor, ki se veže na RANKL in preprečuje njegovo vezavo na receptor za aktivacijo jedrnega dejavnika κ-β (RANK), ki ga ravno tako sintetizirajo osteoblasti. Ravno RANKL in OPG sta odločilna dejavnika pri razvoju osteoklastov iz hematopoetskih matičnih celic, hkrati pa mora biti prisoten tudi citokin makrofagnega kolonije stimulirajočega dejavnika (M-CSF) (4). V procesu kostne premene dnevno potrebujemo 700 mg kalcija. Vsi biološki procesi, v katerih je kalcij udeležen, so uravnani glede na koncentracijo kalcija v zunajceličini tekočini (ECF), ki znaša med 2,2 in 2,6 mm. Plazemske koncentracije kalcija primarno uravnavajo parathormon (PTH), oblike vitamina D, estrogeni in kalcitonin. Sodelujejo tudi glukokortikoidi in ščitnični hormoni. Parathormon zvišuje plazemsko koncentracijo kalcija, tudi na račun njegove mobilizacije iz kosti, z aktivacijo izražanja RANKL na membrani osteoblastov in zaviranjem sinteze OPG. Aktivna oblika vitamina D (kalcitrol) povečuje plazemsko koncentracijo kalcija s povečanjem absorbcije iz gastrointestinalnega trakta (GIT), ledvic in kosti. Estrogeni igrajo pomembno vlogo pri ohranjanju kostne mase z blokiranjem vpliva parathormona na kosti, posredno pa preko parathormona hkrati vplivajo na povečano absorpcijo kalcija iz gastrointestinalnega trakta (5, 6). Estrogeni ravno tako zvečajo proliferacijo osteoblastov, povišajo produkcijo TGF-β in BMP, zmanjšajo apoptozo osteocitov in osteoblastov, spodbudijo diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic v razvoj osteoblastov ter zavirajo diferenciacijo osteoklastov in pospešujejo njihovo apoptozo (7, 8). 2
Glukokortikoidi vplivajo na kostno premeno s povečanjem izražanja RANKL, zmanjšanjem izražanja OPG in spremenjenega izražanja rastnih dejavnikov (9). 1.1.2 Vpliv oksidativnega stresa na kosti Oksidativni stres definiramo kot stanje zvišanega nivoja oksidacijskih zvrsti, primarno reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS), ki zmoti znotrajcelični redukcijsko-oksidacijski potencial. Oksidacijske zvrsti fiziološko nastajajo pri celičnem dihanju in imunskem odzivu kot produkt vnetnih procesov. Pomembno vlogo odigrajo pri delovanju levkocitov, ki ROS dodatno sintetizirajo kot obrambni mehanizem, mehanizem začetka in ojačanja antigenskih signalov (10). Oksidativni stres igra tudi pomembno patofiziološko vlogo pri nekaterih bolezenskih stanjih. ROS so zaradi svojih intrinzičnih reaktivnih lastnosti sposobne spremeniti oz. poškodovati celične strukture zaradi oksidacije lipidov in proteinov na njihovih membranah. Mikrookolje kosti se močno odzove na prisotnost oz. odsotnost ROS, saj je regulacija njihovega nastajanja pomemben dejavnik preprečevanja poškodb kosti (11). Osteoklasti si namreč delijo skupnega predhodnika z mieloidnimi celicami imunskega sistema, kjer je sinteza ROS ključna lastnost. Dokazali so, da povečan oksidativni stres povzroči izgubo kostne mase s TNF-α povezano signalno potjo. Ta poveča sintezo vnetnih citokinov, ki posledično povečajo resorpcijo kosti s stimulacijo osteoklastnih diferenciacijskih dejavnikov preko aktivacije poti jedrnega dejavnika κβ (NF-κB) oz. inhibicijo proizvodnje OPG preko osteoblastov (11). Tako je možno razložiti korelacijo med zmanjšano mineralno gostoto kosti (BMD) in povišanimi nivoji oksidativnih zvrsti pri pacientih ter korelacijo plazemskih nivojev superoksid dismutaze (SOD) z vrednostjo BMD lumbarnih vretenc. Pomenopavzalna populacija z osteoporozo ima zmanjšani aktivnosti katalaze in glutation-peroksidaze, kar pripomore k višjim nivojem ROS, živalski modeli pa dokazujejo statistično pomembno zaviranje tvorbe vodikovega peroksida pri upočasnitvi razvoja osteoporoze. Po trenutnem kostnem modelu je za od RANKL odvisno osteoklastogenezo potrebna prisotnost ROS, saj le-ti stimulirajo izražanje TNF-α, hkrati pa ROS znižajo izražanje ALP. Vse to nakazuje na vlogo vodikovega peroksida pri zdravju 3
kosti in razvoju osteoporoze. So tudi dokazi o vplivu ROS na od mitogena aktivirane protein kinaze (MAPK), kar privede do povečanja diferenciacije osteoklastov (12). Opazili so, da oksidativni stres vpliva na družino brezkrilnih integracijskih mest MMTV (WNT) / β-katenin signalno pot v osteoblastnih modelnih celicah HOS. Razmerje RANKL/OPG se je dvignilo na račun zvišanja izražanja RANKL oz. znižanja izražanja OPG, odvisno od uporabljenega stresorja. ROS tudi povečajo produkcijo adapterskega proteina p66shc, ki posledično poveča vezavo med transkripcijskimi dejavniki Forkhead box O (FOXO) in β-kateninom in s tem izražanje proteinov, odgovornih za lovljenje radikalov. β-katenin tako ne more potovati v jedro celice, kjer je udeležen v stimulaciji osteoblastnih markerjev in s tem v diferenciaciji osteoblastov, kar privede do apoptoze osteoblastov in osteocitov (13). 1.1.3 Signalna pot WNT/β-katenin WNT so zunajcelični proteini, ki aktivirajo različne površinske receptorje povezane s poglavitno ali stranskimi signalnimi potmi. Signalizacija WNT je pomembna za razvoj mase trabekularne in kortikalne kostnine. Začetek poglavitne poti se prične z nastankom trimernega kompleksa sestavljenega iz liganda WNT, membranskega koreceptorja proteina sorodnega receptorju za lipoprotein nizke gostote 5/6 (LRP5/6) z eno transmembransko domeno, in signalnega membranskega receptorja frizzled (FZD) s sedmimi transmembranskimi domenami. Kadar WNT ni vezan na LRP5/6/FZD, se β-katenin znotraj celice fosforilira s pomočjo destrukcijskega kompleksa sestavljenega iz Axina, adenomatoznega polipoznega coli (APC), kazein-kinaze 1 (CK1) in konstitutivno aktivnega encima glikogen-sintaze-kinaze 3 (GSK3). Fosforiliran β-katenin se nato poliubikvitinira s pomočjo ubikvitin-ligaze E3 in razgradi s pomočjo proteasoma. Vezava WNT na LRP5/6/FZD znotrajcelično veže Dishevelled (DSH) na FZD, kar posledično pripelje do vezave Axina na znotrajcelični del LRP5/6. S tem se ustavi fosforilacijska aktivnost destruktivnega kompleksa in povzroči znotrajcelično kopičenje β-katenina. Končni rezultat je odmik ko-represorja Groucho iz kompleksa Groucho/TCF/LEF in nadaljnjo aktivacijo tarčnih genov, npr. OPG in gen za z Runt povezanim transkripcijskim dejavnikom 2 (RUNX2) (14). 4
Stransko signaliziranje WNT je neodvisno od aktivnosti LRP5/6 in β-katenina. V signalni poti»wnt-planar cell polarity«pripelje vezava WNT na FZD in koreceptorja z nevtrotrofno tirozin-kinaza sorodnim receptorjem 2 (ROR2) ali receptorju podobno tirozinkinazo (RYK) do vezave DSH na FZD in nadaljnjo kaskadno aktivacijo poti. Pri WNTkalcijevi signalni poti pripelje vezava WNT na FZD do vezave DSH in proteina Gq, kar pripelje do aktivacije inozitol trifosfatne (IP3) poti oz. diacil-glicerolne (DAG) poti (14). Signalno pot WNT lahko zavrejo nevtralizatorji prostih WNT, npr. WNT inhbitorni dejavnik 1 (WIF1) in izločeni FRP (sfrp) oz. inhibitorji vezave WNT na LRP5/6 in FZD. Signalno pot WNT zavreta proteina sklerostin (SOST) in dickkopf 1 (DKK1) z vezavo na LRP5/6 ter tako preprečita nastanek heterotrimernega kompleksa (slika 1). Osteociti trabekularne in kortikalne kostenine proizvajajo SOST, ki deluje parakrino na osteoblaste in je tako najmočnejši negativni regulator kostne mase povezan z osteoblastno celično linijo. Serumski nivoji SOST se s starostjo višajo, poleg tega pa so višji pri pomenopavzalni populaciji v primerjavi s premenopavzalno. Dokazali so tudi, da povišanje izražanja DKK1 Slika 1: WNT/ β -katenin signalna pot in načini njene inhibicije. 5
privede do zmanjšanja mase trabekularne in kortikalne kostnine zaradi zmanjšanja števila osteoblastov (14). Regulacija nivojev β-katenina preko poglavitne signalne poti WNT v osteoblastih je pomembna za nastanek kostnine. Manjšanje koncentracije β-katenina privede do upada kostne mase zaradi povečanega števila osteklastov, saj β-katenin uravnava inhibicijo osteoklastov z aktivacijo OPG, čigar produkt je inhibitor osteoklastov. Uravnavanje količine β-katenina preko signalne poti WNT v osteoklastih je tudi udeleženo pri tvorbi kostnine. β- katenin vpliva intrinzično na samo osteoklastogenezo - ima bifazično, od doze odvisno delovanje. Fiziološko so nivoji β-katenina povišani med proliferacijo osteoklastnih predhodnikov in znižani med njihovim dozorevanjem. Tako aktivacija signalne poti WNT znižuje osteoklastogenezo neposredno in posredno - preko vpliva na osteoklaste same in s pomočjo osteoblastov preko sinteze OPG (15). 1.1.4 ESRRα in vpliv na kosti Jedrne receptorje lahko delimo na receptorje z znanimi ligandi in na receptorje sirote. Oboji imajo podobno struktuo: domeno C, s katero se vežejo na DNA in domeno E, s katero vežejo ligande. Pri jedrnih receptorjih sirotah ligandi še niso znani ali pa imajo receptorji intrinzično aktivnost brez prisotnosti liganda. Družino estrogenskemu receptorju sorodnih receptorjev (ESRR) uvrščamo med receptorje sirote. Družini estrogenskih receptorjev (ER) in ESRR imata močno konzervirano domeno C z več kot 68-odstotnim aminokislinskim ujemanjem, medtem ko je domena E slabo konzervirana s 36-odstotnim ujemanjem, kar lahko razloži nevezavo estrogena s strani ESRR. ESRRα povezujejo z uravnavanjem metabolizma maščob in človeške aromataze v dojkah. Dokazali so tudi, da ESRRα uravnava aktivnost estrogenov na promotorski regiji laktoferina, kar nakazuje na možno proteinprotein interakcijo med ESRRα in družino ER (16). Glede na homologijo ER in ESRR je trenutna hipoteza, da ESRRα vpliva na signalne poti, povezane z estrogenskimi hormoni v kostninah. Uravnava namreč izražanje gena osteopontina (zunajcelična matriksna molekula, ki jo izločajo osteoblasti, s pomembno vlogo pri razgradnji kosti). ESRRα je vpleten tudi pri proliferaciji in diferenciaciji osteoprogenitornih celic. Na modelu in vitro podganjih fetalnih celic kalvarije (RC) so 6
dokazali, da je izražanje ESRRα povečano v diferenciacijski fazi RC ob prisotnosti estrogena in in vivo znižano pri populaciji podgan po ovariektomiji. Dokazali so, da se je in vitro v RC z dodatkom protismiselnih (AS) oligonukleotidov za gen ESRRα zmanjšal nivo osteogeneze, kot tudi povišalo število kolonij adipocitov skupaj s številom z adipociti povezanih markerjev PPARγ, lipoprotein-lipazo (LPL), CCAAT/povečanje-vezave proteina α (c/ebpα) in adipocitnega proteina 2 (ap2). Glede na to je možno tudi, da je ESRRα lahko vpletena v staranje kostnega tkiva, kot tudi v proces kostne premene in formacije (17). 1.2 MikroRNA 1.2.1 Genska osnova MikroRNA (mirna) so 21 do 24 nukletodov (nt) dolge molekule RNA, ki preko delnega baznoparnega ujemanja prepoznajo tarčne informacijske RNA (mrna) in utišajo njihovo prevajanje na ribosomih in tako uravnavajo izražanje genov. Njihova disfunkcija je povezana s številnimi boleznimi (18, 19). Biogeneza mirna se prične v celičnem jedru s prepisovanjem s pomočjo RNA polimeraze II (RNAP II). Nastane dolga primarna mirna (pri-mirna), ki vsebuje značilno lasnično strukturo. Značilno strukturo izreže mikroprocesor sestavljen iz Drosha, encima RNaze III, in kofaktorja DiGeorge sindrom kritična regija 8 (DGCR8). Zizrezovanjem nastane prekurzorska mirna (pre-mirna), ki iz jedra izstopi s pomočjo transportnega proteina eksportin 5 (XPO5). RNaza III encim Dicer v citoplazmi razreže pre-mirna v 21 do 24 nt dolgo dvoverižno mirna (ds-mirna). Le-ta se nato cepi v vodilno mirna (gsmirna) in spremljevalno (ps-mirna) verigo. Gs-miRNA se poveže z Argonavt (Ago) proteini in tvori z mirna induciran utišalni kompleks (RISC). Tako vezana aktivna mirna preko delnega baznoparnega ujemanja znotraj kompleksa prepozna tarčno mrna, se nanjo veže in preko RISC utiša izražanje mrna preko njene destabilizacije oz. translacijske represije. Aktivna komponenta RISC kompleksa je protein Ago2 (slika 2) (18, 19). Več kot 70 % vseh genov mirna se nahaja znotraj intronov kodirajočih regij, preostanek se približno ekvivalentno porazdeli med introne in eksone nekodirajočih regij. Proces alternativnega razreza pripelje tudi do tega, da so mirna lahko zapisane hkrati v intronu in eksonu. Pogosto so mnoge mirna prepisane hkrati v dolgi gručni transkripcijski 7
enoti. Take mirna si delijo enako nukleotidno heptamerno sekvenco na pozicijah od 2 do 8, gledano s strani 5 -mirna, imenovano semenska sekvenca, ki je odgovorna za vezavo mirna z mrna, in so klasificirane kot del iste družine. MiRNA iste družine so odgovorne za uravnavanje sekvenčno podobnih genov (19). Slika 2: Proces sinteze in zorenja mirna. 1.2.2 Funkcija in vpliv mir na kostno homeostazo Vpletenost številnih celic in signalnih poti v proces kostne premene odpira mnoge tarče, na katere lahko mirna vplivajo posredno ali neposredno. V preteklih letih so vzeli pod drobnogled vpliv mirna na diferenciacijo osteoblastov. Prepoznali so nekaj molekul mirna, ki zavirajo diferenciacijo osteoblastov - z vplivom na izražanje glavnega osteogenskega transkripcijskega dejavnika RUNX2. Ravno tako se njegovo izražanje poveča z zaviranjem izražanja njegovih inhibitornih molekul histonske deacetilaze 5 (HDAC5) in homeobox 2 (HOXA2). Na regulacijo osteoblastov mirna vplivajo tudi preko WNT/β-kateninskega sistema. Z neposrednim ciljanjem antagonistov WNT (DKK1, DKK2, SOST, sfrp2) se okrepi WNT/β-kateninska signalna pot, kar promovira diferenciacijo osteoblastov. Do enakega rezultata pride z zaviranjem izražanja uničevalnega kompleksa β- katenina (APC). Povečanje osteogeneze je lahko možno tudi z zaviranjem izražanja β- katenin-interagirajočega proteina 1 (CTNNBIP1), inhibitorja transkripcije, ki jo regulira β- katenin (preglednica I) (20, 21). 8
Preglednica I: mirna, ki vplivajo na pozitivno regulacijo osteoblastogeneze mirna z vplivom pozitivne regulacije osteoblastogeneze mir Geni Vpliv mir-27 APC WNT/β-katenin mir29a, mir-218, mir- 335-5p mir-29b DKK1/2, SOST, sfrp2 COL1, HDAC4, CTNNBIP1, C-FOS WNT/β-katenin WNT/β-katenin RUNX2 mir-2861, mir-3960 HDAC5, HOXA2 RUNX2 Povečano izražanje gruče mir-23a/mir-27a/mir-24-2 povzroči utišanje izražanja RUNX2, hkrati pa utišajo tudi izražanje posebnega AT-bogatih sekvenc vezavnega proteina 2 (SATB2), ki olajša diferenciacijo osteoblastov. Z zmanjšanjem izražanja Notch1 in 2 ter Jag1 naj bi mir-34c utišala signalno pot Notch in zmanjšala inhibicijo diferenciacije osteoblastov, vendar je učinek inhibicije mir-34c na RUNX2 močnejši, zato zmanjšuje zorenje osteoblastov. MiR-93 in mir-637 zmanjšujeta izražanje transkripcijskega dejavnika osteriks (OSX), odgovornega tudi za mineralizacijo osteoblastov (preglednica II) (20, 21). Preglednica II: mirna, ki vplivajo na negativno regulacijo osteoblastogeneze mirna z vplivom negativne regulacije osteoblastogeneze mir Geni Vpliv mir cluster 23a~27a~24-2 RUNX2, SATB2 RUNX2 mir-34c RUNX2, Notch1/2, Jag1 RUNX2 mir-93, mir-637 OSX β-katenin Za razliko od vpliva mirna na osteoblaste so mirna, udeležene pri diferenciaciji osteoklastov, manj raziskane. Prikazali so vpliv mirna-21 na pospešitev diferenciacije osteoklastov in njihovo varovanje pred apoptozo. MiRNA-21 vpliva na inhibicijo izražanja programirane celične smrti 4 (PDCD4), zato se zniža represija homologa aktivatorja murinskega osteosarkomskega virusnega onkogena (C-FOS) in s tem poviša osteoklastogeneza. Isti učinek doseže mirna-21 z znižanjem izražanja liganda apoptoznega antigena 1 (FASL). Ta opažanja so pripeljala do hipoteze, da povečano izražanje mirna-21 lahko zmanjša anti-osteoklastno delovanje estrogena. MiRNA-223 naj bi zmanjšala izražanje jedrnega dejavnika I/A (NFIA), ki je odgovoren za inhibicijo 9
izražanja receptorja kolonije spodbujajočega dejavnika 1 (CSF1R), le-ta pa stimulira izražanje C-FOS in transkripcijskega dejavnika povezanega z mikroftalmijo (MITF) (preglednica III). Na izražanje MITF vpliva tudi mir-155. Interferon β (IFN-β), antiosteoklastogeni dejavnik, poveča izražanje C-FOS, ki posledično vpliva na izražanje mir-155. MiR-155 tako tvori negativno povratno zanko z molekulami poti RANK/RANKL. MiR-146a je najverjetneje odgovorna za inhibicijo izražanja jedrnega dejavnika aktiviranih celic T (NFATC1) in tako za inhibicijo osteoklastogeneze (preglednica IV) (20, 22). Preglednica III: mirna, ki vplivajo na pozitivno regulacijo osteoklastogeneze mirna z vplivom pozitivne regulacije osteoklastogeneze mir Geni Vpliv mir-21 PDCD4, FASL C-FOS mir-223 NFIA C-FOS Preglednica IV: mirna, ki vplivajo na negativno regulacijo osteoklastogeneze mirna z vplivom negativne regulacije osteoklastogeneze mir Geni Vpliv mir-146a NFATC1 NFATC1 mir-155 MITF Diferenciacija osteoklastov 1.3 Eksperimentalni in bioinformatski pristopi za odkrivanje mikrorna 1.3.1 Identifikacija in merjenje izražanja mikrorna s sistemom Nanostring ncounter Sekvenciranje RNA je skupek metod, namenjenih ugotavljanju zaporedja molekul RNA. Čeprav si metode delijo ime, se postopki med seboj razlikujejo, predvsem glede izbranih analiziranih tarčnih RNA. Te molekule so prisotne v vseh tkivih organizma in so neposreden odraz celičnega transkriptoma, vendar so veliko bolj nestabilne v primerjavi z molekulami DNA. Velika večina metod analize molekul RNA se zato zanaša na pripravo knjižic komplementarne DNA (cdna) z uporabo encima reverzne transkriptaze (RT). V metodi se nadalje analizira pripravljene cdna molekule. V preteklosti se je uporabljala 10
Sangerjeva metoda sekvenciranja, v današnjih časih pa metode sekvenciranja naslednje generacije oz. metode sekvenciranja visoka zmogljivosti (23). Druga skupina metod za analizo molekul RNA uporablja mikromreže. Primarnojih uporabljamo za analizo molekul DNA, vendar jih z manjšimi modifikacijami lahko uporabljamo tudi za RNA. Tehnologija temelji na sposobnosti hibridizacije verig DNA oz. tvorjenju dvoverižnih struktur, ki so medsebojno komplementarne. Z uporabo specifičnih sond se lahko zato s komplementarnim parjenjem lovi specifične željene DNA in nadalje določimo njihovo številčnost (24). Metoda ncounter mirna podjetja Nanostring je metoda za analizo RNA, pri kateri ni potrebna prevotrba RNA v cdna, vendar analiza molekul mirna poteka neposredno. Analiza poteka na principu označevanja molekul mirna z unikatnimi reporterskimi sondami. Z vsako molekulo mirna izvedemo komplementarno hibridizacijo z za mirna unikatno povezovalno»mostno«molekulo. Nadalje nanjo pripnemo komplementarno unikatno podaljševalno molekulo»mirtag«. Molekula mirtag se kovalentno poveže na mirna z reakcijo ligacije, nato pa»mostna«molekula disociira od tako podaljšane molekule. Za vsak tak konstrukt obstaja unikatna označevalna sondna molekula, ki se nanj komplementarno veže (slika 3). Sondna molekula je z enim koncem pritrjena na površino mikromrežnega čipa, zato je skupek imobiliziran. Po koncu označevanja in pričvrstitve mirna se reagentske molekule speremo. Preko površine čipa se vzpostavi šibko električno polje, potrebno za orientacijo vseh imobiliziranih molekul v isto smer. Tako pripravljen čip nato analiziramo. Preštejemo pogostost vseh barvnih sond in rezultate računalniško obdelamo (25). Slika 3: Princip metode ncounter. Vsaka mirna ima svojo unikatno označevalno sondo. 11
1.3.2 Bioinformatsko orodje TargetScan za identifikacijo tarč in kvantifikacijo vpliva mirna Zaradi učinka mirna na izražanje specifičnih genov je pomembno prepoznati specifične molekule mrna, na katere mirna vplivajo, in napovedati moč njihove interference. Kljub temu, da je semenska sekvenca mirna heptamerno zaporedje in se komplementarno veže na tarčno zaporedje mrna znotraj 3' konca neprevedene regije (3'- UTR), obstajajo tudi možnosti nepopolnega parjenja s samo šestimi nukleotidnimi pari. Prav tako se lahko veže veliko različnih mirna na isto 3'-UTR mrna, zato je pomembno ovrednotiti posamezni vpliv na izražanje gena. Vezava na prvih 15 nukleotidov 3'-UTR mrna zunaj poti ribosoma je pri utišanju mrna veliko manj učinkovita. Za razliko ima vezava na mesto 3'-UTR, ki omogoča alosterično lažji dostop RISC, veliko večji učinek na izražanje mrna. Prav tako ima mirna, vezana na mrna z močno konzerviranimi 3'- UTR, veliko večji učinek na utišanje zaradi samih lastnosti take mrna. Na moč utišanja genov vpliva tudi moč komplementarnega vezanja mirna-mrna. Če ima taka interakcija veliko število parjenj adenin-uracil (A-U), je zaradi manjšega števila vodikovih vezi šibkejša od parjenj gvanin-citozin (G-C) (SPS seed pairing stability; stabilnost vezave semenskih sekvenc). Enako velja, ko ima mirna več tarčnih sekvenc znotraj 3'-UTR mrna. Jakost vsake take vezave je veliko bolj šibka kot v primeru manjšega števila tarčnih sekvenc znotraj 3'-UTR (TA target-site abundance). Vse te lastnosti lahko kvantificiramo in postavimo model vpliva vseh spremenljivk s pomočjo analize multiple regresije. Agarwal in sodelavci so tako postavili model, katerega končni izračun je specifičen parameter»context++«za vsak par mirna-mrna, ki opiše jakost vpliva mirna na izražanje tarčne mrna (26, 27). 1.3.3 Merjenje vpliva mikrorna na izražanje genov Vezava mirna in njen učinek na izražanje genov se izraža v spremenjeni sintezi proteinov. Merjenje vpliva mirna tako lahko opravimo posredno, na čemer temeljita metodi western blot in merjenje izražanja luciferaznih encimov. Pri metodi western blot najprej pripravimo celični lizat, pri katerem inhibiramo proteazne encime. Na dvonivojnem dvogelskem pripravku se ločijo proteini glede na svojo velikost. Razvrščene proteine prenesemo iz gela na membrano z izkoriščanjem lastnosti električnega polja. Po prenosu na membrano proteine označimo s specifičnimi protitelesi. Za prepoznavo tako nastalih 12
skupkov izvedemo vezavo sekundarnih protiteles, ki so označena, največkrat s hrenovo peroksidazo. Takšni skupki nam omogčajo možnost identifikacije izražanja nivojev proteina. V primeru inhibicije izražanja proteina zaradi delovanja mirna, lahko to prepoznamo z nižjim izražanjem hrenove peroksidaze glede na kontrolo. Sistem izražanja luciferaznih encimov je način prikaza izražanja genov po principu kombiniranja regulatornih elementov iskanega gena z geni luminiscentnih proteinov, specifično kresničkinega luciferaznega gena vrste Renilla reniformis ali luciferaznih genov insektov družine Elateroidea. Pri izražanju luciferaznega gena se po izolaciji proteina dodamo specifični substrat, ki se oksidira, če je encim prisoten (slika 3). Stranski produkt takšne reakcije je svetloba, katere intenziteta je linearno odvisna od števila izraženih luciferaznih proteinov. Slika 4: Reagenti pri procesu kemijskih reakcij kresničkine luciferaze in renilla luciferaze, in svetloba kot produkt teh reakcij. 13
2. Namen Starostne bolezni kosti so razširjene in terjajo velik delež zdravstvenega proračuna. Gre za kompleksne bolezni na katere vplivajo okoljski, genetski in epigenetski dejavniki. Novi podatki kažejo, da se epigenetski mehanizmi, kot so metilacija DNA, de- in acetilacija histonov in/ali mikrorna, vpletajo v patofiziološke procese tudi pri kostnih boleznih. MikroRNA so majhne molekule RNA, ki svoje učinke na kostnino izvajajo preko uravnavanja izražanja genov in posredno preko uravnavanja signalnih poti, ki so odgovorne za nastanek in razvoj kostno specifičnih celic. Trenutno poznavanje procesov kostne premene ima določene pomanjkljivosti, saj so epigenetski mehanizmi še slabo raziskani. Ker je veliko predvidenih parjenj mikrorna s tarčnimi geni še eksperimentalno nepodprtih z metodami in vitro, smo se odločili z dokazi razširiti bazo znanja. Namen magistrske naloge bo: - odkriti mikrorna, ki se različno izražajo v modelnih osteoblastnih celicah v razmerah povečanega oksidativnega stresa na osnovi bioinformacijskih analiz podatkov, - poiskati tarčne gene za odkrite mikrorna - izbrati tiste tarče, ki so vpletene v procese kostnega tkiva glede na gensko ontologijo, - izbrati par mirna-tarčni gen, ki ga bomo eksperimentalno validirali, - pripraviti in izvesti eksperimentalno delo na osnovi luciferazne aktivnosti za validacijo izbranega para mikrorna-tarčni gen. 14
3 Materiali in metode 3.1 Odkrivanje mirna vpletenih v signalne poti kostne remodelacije Dr. Peter Vrtačnik je za del svoje doktorske naloge izoliral mirna iz celic HOS, izpostavljenih pogojem, ki so posnemali hipoksijo oz. oksidativni stres. Celično linijo HOS je pridobil od American Type Culture Collection (ATCC). Tehnično analizo vsebnosti mirna je opravili v podjetju VIB Nucleomics Core (Belgija) z uporabo Nanostring ncounter sistema (27). Tako pridobljene podatke smo normalizirali po navodilih proizvajalca (28). Najprej smo iz vsakega seta meritev izločili rezultate, katerih vrednosti so bile rezultat napake - to smo preverili z izračunom SD (standardne deviacije) izražanja določene mirna preko vseh setov meritev. Če je bila SD bila enaka 0, so bili odčitki mirna očitno napačni in zato nepomembni. Za vsak set meritev smo izračunali geometrijsko sredino, nato izračunali aritmetično sredino vseh geometrijskih sredin setov meritev, to aritmetično sredino delili s specifično geometrijsko sredino vsakega seta meritev in s tem pridobili specifičen faktor normalizacije za vsak set podatkov. S tem specifičnim faktorjem normalizacije za vsak set podatkov smo vse podatke znotraj seta podatkov pomnožili. Tako smo dobili normalizirane vrednosti za vsak set meritev. Od dobljenih normaliziranih vrednosti smo odšteli vrednost ozadja z uporabo metode robustnega vrstnega povprečja (RMA) (29). Tako smo dobili standardizirane podatke izražanja mirna za vsak set meritev. Zanimale so nas razlike v izražanju mirna med celicami, transfeciranimi s plazmidom pcmv-esr1 ter tretiranimi s 500 µm vodikovim peroksidom (celice PE), in celicami transfeciranimi s plazmidom pcmv-esr1 ter tretiranimi s kontrolnim topilom (celice K). Te razlike smo uredili po padajoči velikosti ter izbrali prvih 20 mirna znotraj take ureditve. 3.2 Iskanje tarč 3.2.1 mirwalk2.0 Iskanje tarč smo izvedli s pomočjo spletne baze podatkov mirwalk2.0 (30). Na spletni strani mirwalk2.0 smo izbrali možnost»predicted Target Module«in v podmeniju izbrali možnost»microrna-gene Targets«, ki je odprla spletno stran z vmesnikom 15
»microrna information retrieval system«. V koraku»step 1«smo pri biološki vrsti izbrali»human«, ker so nas zanimali podatki o interakcijah v človeku, bazi podatkov»mirbase«, bazi podatkov o predvidenih lokacijah lasnic na pre-mirna in zaporedju zrelih mirna, identifikacijskemu tipu»mirna (hsa-mir-1)«, ter v»paste identifiers«napisali 20 izbranih mir pridobljenih pri obdelavi podatkov HOS. Pri naštevanju mir smo jih medsebojno ločili z vejico z vpisom v novo vrstico. V koraku»step 3«smo pri»input parameters«odkljukali možnost»3 UTR«kot predvideno mesto utišanja mrna. Pri»minimum seed length«smo pustili vrednost 7 ter pri»other databases«izbrali operator»and«med vsemi že odkljukanimi bazami. Pri koraku»step 4«smo pazili, da je odkljukana možnost»go BP«. Pri koraku»step 5«smo nato kliknili gumb»search«(slika 5). Slika 5: Vnos nastavitev za iskanje tarčnih genov mirna. Pri generiranih rezultatih smo vzpostavili hiperpovezavo»3'utr«v podtabeli»putative target genes predicted by mirwalk algorithm within mrna selected regions«tabele»putative target genes tables«(slika 6). Pri novi odprti spletni strani s podatki smo nato izbrali možnost»download complete table«. 16
Slika 6: Z rdečim pravokotnikom označena hiperpovezava do prenosa izračunanih podatkov. 3.2.2 Cytoscape Uporabili smo tekstovno datoteko z informacijami pridobljenimi iz mirwalk2.0. V njej so bili zbrani podatki o interakcijah mir-gen, moči interakcije, začetku in koncu interakcije na nukleotidnih mestih 3'-UTR genov ter verjetnost navedene interakcije. Po zagonu programa Cytoscape (31) smo zgradili novo omrežje iz datoteke (»import network from file«). Stolpec»miRNA«smo klasificirali kot izvorno vozlišče (»source node«), stolpec»gene«smo klasificirali kot tarčno vozlišče (»target node«) in kliknili na gumb»ok«. Označili smo vsa vozlišča in povezave grafa (ctrl+shift+a) in jih poenostavili (»edit«;»remove duplicate edges«; iz seznama smo označili ime našega grafa, označili možnost»ignore edge direction«in kliknili na gumb»ok«). Zagnali smo vtičnik BinGO (»Apps«;»BinGO«). BinGO je orodje oz. podprogram v Cytoscape, ki ga uporabljamo za analizo pogostosti in značilnosti pojavljanja različnih bioloških procesov genske ontologije (32). Našo mrežo smo poimenovali (»Cluster name«), izbrali človeško bitje kot živalsko vrsto zanimanja (»Select organism/annotation«;»homo Sapiens«) ter kliknili na gumb»start BinGO«. Za lažjo predstavo medsebojno povezanih sistemov smo graf GO uredili po hierarhični razporeditvi predstavitve (»Layout«;»Hierarchical Layout«). Označili smo kategorijo»regulation of ossification«v okencu»bingo output«in kliknili na gumb»select 17
nodes«. To dejanje je v osnovnem grafu mirna-gen povezav izbralo gene - tarčna vozlišča, ki spadajo pod izbrano ontološko kategorijo regulacija osifikacije. V osnovnem grafu mirna - gen povezave smo izbrali mirna - izvorna vozlišča in povezave med temi izvornimi in tarčnimi vozlišči (»Select«;»Edges«;»Select adjacent edges«; in nato še»select«;»nodes«;»first Neighbours of Selected Nodes«;»Undirected«), ter skrili vse neizbrane elemente osnovnega grafa povezav (»Select«;»Hide uselected nodes and edges«). Za lažjo vizualizacijo mreže smo jo uredili (»Layout«;»yFiles Layouts«;»Organic«). 3.3 Iskanje zaporedja za pripravo oligonukleotidov Za uspešno pripravo oligonukleotidov je potrebno poznati tarčno mesto mir-125b na 3 -UTR gena ESRRα. To smo opravili z orodjem TargetScan (33). Pri koraku 1 smo izbrali vrsto»human«, pri koraku 2. smo vpisali naš gen zanimanja (»ESRRA«) in kliknili na gumb»submit«. Odprla se je nova spletna podstran z grafičnim prikazom 3'-UTR gena ESRRα in odsekov, na katere vplivajo različne mirna. Kliknili smo na grafiko za našo izbrano mirna (»mir-125-5p«). Pod grafičnim prikazom se je odprla tabela s tekstovnim nukleotidnim prikazom 3'-UTR gena ESRRα za različne živalske vrste in mesta vezave različnih mir (slika 7). V plazmidni vektor smo vstavili večji fragment, zato smo izberemo sekvenco 3'-UTR ESRRα dolgo 32 baznih parov (bp), z vezavnimi mesti na približno sredini izbrane sekvence. Slika 7: Sekvenca gena ESRRα komplementarna semenski sekvenci ter sekvenca hsa-mir-125b-5p s prikazano komplementarno vezavo obeh. 3.4 Priprava kompetentnih celic z metodo kalcijevega klorida Material Tekoče gojišče LB (Sigma-Aldrich GmbH, Nemčija) Agar (Sigma-Aldrich GmbH, Nemčija) Avtoklav (Kambič d. o. o., Slovenija) 18
Stresalni inkubator ES-20 (Biosan, Latvija) Spektrofotometer LAMBDA Bio z λ = 590nm (Perkin Elmer Inc., ZDA) Ampicilin 100 mg/ml (Sigma-Aldrich GmbH, Nemčija) Sev bakterij E.coli DH5α Raztopina kalcijevega klorida (CaCl2) Centrifuga Heraeus Megafuge 16R (Thermo Fisher Scientific Inc., ZDA) Polipropilenske 50-mililitrske epruvete (BD inc., ZDA) Polipropilenske 1,5-mililitrske mikrocentrifugirke (BD Inc., ZDA) Potek dela V dve 500-mililitrske steklenici smo v vsako zamešali 8 g medija LB v 400 ml ultra čiste vode. Raztopini smo avtoklavirali 15 minut pri 121 C in nato ohladili na sobno temperaturo. V eno izmed steklenic smo dodali 400 µl ampicilina za pripravo medija LBA. Obe gojišči smo nato hranili pri temperaturi 4 C. 50 ml pripravljenega gojišča LB smo v 500-mililitrski stresalni erlenmajerici inokulirali s celicami ene dobro ločene kolonije bakterij DH5α, ter stresali čez noč v inkubatorju pri temperaturi 37 C. S 4 ml tako pripravljene prekonočne kulture smo inokulirali 400 ml medija LB v 2-litrski stresalni erlenmajerici ter stresali v inkubatorju pri 37 C pri 250 RPM do OD(590) = 0,375. Kulturo smo alikvotirali v 8 ohlajenih sterilnih 50-mililitrskih falkonkah in inkubirali na ledu 10 minut. Od tega koraka naprej smo vso delo opravljali na ledu. Celice smo nato s centrifugiranjem (7 minut, 1600 g, 4 C) precipitirali, odlili supernatant in resuspendirali celice v 10 ml ledeno hladne raztopine CaCl2. Celice smo ponovno precipitirali s centrifugiranjem (5 minut, 1100 g, 4 C), odlili supernatant in resuspendirali celice v 20 ml ledeno hladne raztopine CaCl2. Suspenzijo celic smo inkubirali na ledu 30 minut. Celice smo ponovno precipitirali s centrifugiranjem (5 minut, 1100g, 4 C), odlili supernatant in resuspendirali v 2 ml ledeno hladne raztopine CaCl2. Tako resuspendirane celice smo alikvotirali v ohlajene sterilne 1,5-mililitrske mikrocentrifugirke po 100 µl in takoj zamrznili na -70 C. 19
3.5 Določitev kompetentnosti celic Material Petrijevke premera 10 cm Pripravljeno tekoče gojišče LB Agar (Sigma-Aldrich GmbH, Nemčija) Ampicilin 100 mg/ml (Sigma-Aldrich GmbH, Nemčija) puc-19 plazmid (10 pg/µl) Vodna kopel WB-4MS (Biosan, Latvija) Stresalni inkubator ES-20 (Biosan, Latvija) Centrifuga MiniSpin (Eppendorf GmbH, Nemčija) Potek dela V 500-mililitrsko steklenico smo zamešali 8 g medija LB in 6 g agarja v 400 ml ultra čiste vode. Raztopino smo avtoklavirali 15 minut pri 121 C in nato ohlajali pri sobni temperaturi. Ko se je raztopina ohladila pod 55 C, smo vanjo dodali 400 µl ampicilina. Vsebino steklenice smo previdno prelili na petrijevke. Na vsako petrijevko smo prelili približno 20 ml gojišča. Petrijevke smo pri sobni temperaturi ohlajali do sobne temperature, nato smo jih shranili pri 4 C do nadaljne uporabe. Na ledu smo odmrznili 100 µl kompetentnih celic in po 20 minutah alikvotirali 50 µl suspenzije celic v 1,5-mililitrski mikrocentrifugirki. Preostanek smo zamrznili nazaj na 70 C. V alikvot smo odpipetirali 2 µl raztopine plazmida puc-19. Vsebino mikrocentrifugirke smo nežno premešali s tapkanjam s prsti in inkubirali na ledu nadaljnih 20 minut. Mikrocentrifugirko smo preneseli v vodno kopel za 45 sekund na 42 C in ponovno na led za 2 minuti. Nato smo vanjo preneseli 250 µl medija LB ter vsebino inkubirali na stresalnem inkubatorju 1 uro pri 37 C. Celice smo precipitirali s centrifugiranjem (5 minut, 2500 g, 25 C) in odstranili 200 µl supernatanta. Peletirane celice smo resuspendirali v preostalem mediju. Na pripravljene petrijevke z agarjem in LBA smo prenesli 30 µl resuspendiranih celic, ki smo jih razširili po gojišču. Bakterije smo gojili preko noči v inkubatorju pri 37 C. Naslednji dan smo našteli 38 razraslih kolonij in izračunali viabilnost celic po formuli: 20
N kolonij pg transformirane DNA 106 pg µg Največji V reakcijske raztopine = Prenesen V na petrijevko = 38 kolonij 20 pg transformirane DNA 106 pg µg 302µL 30µL = = 1,9 107 transformantov µg plazmidne DNA 3.6 Transformacija bakterij Enačba 1: Osnovna enačba in izračun viabilnosti celic. Material Raztopina pmirglo (1 ng/µl) Kompetentne bakterije E.coli DH5α Petrijevka premera 10 cm z gojiščem agar LBA Vodna kopel WB-4MS (Biosan, Latvija) Stresalni inkubator ES-20 (Biosan, Latvija) Centrifuga MiniSpin (Eppendorf GmbH, Nemčija) Tekoče gojišče LBA Polipropilenska 5-mililitrska epruveta z okroglim dnom Potek dela Na ledu smo odmrznili 50 µl kompetentnih celic in po 20 minutah vanje odpipetirali 5 µl raztopine plazmida. Vsebino mikrocentrifugirke smo nežno premešali s tapkanjam s prsti in inkubirali na ledu nadaljnjih 20 minut. Mikrocentrifugirko smo preneseli v vodno kopel za 45 sekund na 42 C in nato ponovno na led za 2 minuti. Vanjo smo prenesli 250 µl medija LB ter vsebino inkubirali na stresalnem inkubatorju 1 uro pri 37 C. Celice smo precipitirali s centrifugiranjem (5 minut, 2500 g, 25 C) in odstranili 230 µl supernatanta. Peletirane celice smo resuspendirali v preostalem mediju. Na pripravljene petrijevke z 21
agarjem LBA smo prenesli celotno količino resuspendiranih celic, ki smo jih razširili po gojišču. Petrijevko smo prekrili z aluminijasto folijo. Bakterije smo gojili preko noči v inkubatorju pri 37 C. Naslednji dan smo pripravili tekoče prekonočno gojišče. V 5- mililitrsko polipropilensko tubico smo prenesli 5 ml LBA, v katerega smo nacepili izbrano kolonijo bakterij iz trdnega gojišča agarja LBA. Tako pripravljeno kulturo bakterij smo gojili preko noči v stresalnem inkubatorju pri 37 C in 120 RPM. 3.7 Izolacija plazmida iz bakterij ter določanje koncentracije Plazmide smo izolirali s temu namenjenim kitom Solarbio Small Plasmid Extraction Kit (cat. D1100-50T) Material Solarbio Small Plasmid Extraction Kit D1100-50T (Solarbio, Kitajska) - RNaza A 300 µl - Raztopina I 15 ml - Raztopina II 15 ml - Raztopina III 20 ml - Raztopina za spiranje 15 ml - Elucijski pufer 15 ml - Adsorpcijske kolone 50-kos - Zbiralne tubice 50-kos Vodna kopel WB-4MS (Biosan, Latvija) Centrifuga MiniSpin (Eppendorf GmbH, Nemčija) Izoliran plazmid pmirglo Ultra čista voda Spektrofotometer NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, ZDA) Potek dela Vse procese centrifugiranja smo izvajali pri sobni temperaturi in hitrosti 12.000 RPM. Tubico s tekočim gojiščem LBA z izbrano bakterijsko kulturo smo centrifugirali 1 minuto. Supernatant smo odlili ter peletirane bakterije resuspendirali v 250 µl raztopine I. 22
Resuspendirane bakterije smo prenesli v sterilno 1,5-mililitrsko mikrocentrifugirko. Dodali smo 250 µl raztopine II in dobro premešali vsebino z inverzijo mikrocentrifugirke 6 do 8- krat. Reakcijo lize smo prekinili po 4 minutah z dodatkom 350 µl raztopine III in ponovnim dobrim premešanjem vsebine. Bakterije smo prenesli v namizno mikrocentrifugirko in centrifugirali 10 minut. V zbiralno tubico smo vstavili adsorpcijsko kolono in vanjo odpipetirali 700 µl supernatanta po centrifugiranju. Supernatant smo pustili stati v koloni 2 minuti in nato centrifugirali 1 minuto. Eluat smo zavrgli. Na kolono smo dodali 700 µl raztopine za spiranje, centrifugirali 1 minuto, eluat zavrgli, na kolono dodali 500 µl raztopine za spiranje, ponovno centrifugirali 1 minuto in eluat zavrgli. Prazno kolono smo centrifugirali 2 minut, da smo odstranili ostanke raztopine za spiranje. Elucijski pufer smo segreli na 65 C, prenesli kolono v sterilno 1,5-mililitrsko mikrocentrifugirko ter vanjo odpipetirali 50-200 µl elucijskega pufra. Pufer smo na koloni pustili inkubirati 2 minuti ter kolono centrifugirali 1 minuto. Eluat smo odpipetirali nazaj na kolono, ponovno inkubirali pufer na koloni 2 minuti ter jo centrigurali 1 minuto. Del eluata smo shranili za določitev koncentracije in čistosti izolirane DNA, preostanek eluata smo shranili na - 20 C. Za določitev absorbance slepe raztopine smo na nosilec spektrofotometra nanesli 1,5 µl ultra čiste vode v enotni kapljici, približali merilno roko nosilcu vzorca in izmerili absorbanco. Po opravljeni meritvi smo nosilec vzorca očistili z brisačko brez prostih vlaken in nanesli 1,5 µl raztopine izoliranega plazmida ter izmerili absorbanco. Priložena programska oprema je izračunala tudi koncentracijo in čistost izolirane DNA. 3.8 Linearizacija izolirane DNA z dvojno restrikcijo Material Izoliran plazmid pmirglo (110 ng/ul) Restrikcijska endonukleaza SacI (10.000 U/µL, New England Biolabs, ZDA) Restrikcijska endonukleaza XbaI (20.000 U/µL, New England Biolabs, ZDA) Restrikcijski pufer CutSmart 10x (50 mm kalijev acetat, 20 mm Tris-acetat, 10 mm magnezijev acetat, 100 ug/ml BSA, ph 7,9, New England Biolabs, ZDA) Ultračista voda Vodna kopel WB-4MS (Biosan, Latvija) 23
Polipropilenske 50-mikrolitrske mikrocentrifugirke (BD Inc., ZDA) Potek dela Raztopino plazmida, ultračisto vodo in restrikcijski pufer smo odtalili na sobni temperaturi. V 50-mikrolitrski mikrocentrifugirki smo zamešali 20 µl plazmida, 3 µl pufra in 5 µl vode. Iz zamrzovalnika s temperaturo 20 C smo nato vzeli tubici z endonukleazama in ju postavili na led. V mikrocentrifugirko smo zamešamo po 1 µl vsake endonukleaze in vsebino nežno premešali s tapkanjam mikrocentrifugirke s prsti. Mikrocentrifugirko z reakcijsko zmesjo smo postavili v vodno kopel za 2 uri pri 37 C in takoj zatem za 20 minut pri 65 C. Vzorec iz mikrocentrifugirke smo po koncu reakcije takoj analizirali in izolirali s postopkom agarozne gelske elektroforeze. 3.9 Agarozna gelska elektroforeza Material Uprašena agaroza - Agarose for routine use (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemčija) Pufer 1x Tris Acetat EDTA (TAE) Označevalno barvilo za nukleinske kisline Midori Green (Nippon Genetics Europe GmbH, Nemčija) Ultra čista voda Kadička za elektroforezo Wide Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad Inc., ZDA) Vir enosmerne napetosti Power Pac 300 (Bio-Rad, ZDA) UV luč s fotoaparatom G:Box (Syngene, VB) Programska oprema Gene Snap (Syngene, VB) Produkt dvojne restrikcijske reakcije 1Kb DNA ladder (Nippon Genetics Europe GmbH, Nemčija) Nanašalni elektroforezni pufer 6x Blue-Orange loading dye (Promega, ZDA) Potek dela V 200-mililitrsko erlenmajerico smo zatehtali 0,75 g agaroze in vanjo odmerili 75 ml pufra 1x TAE. Vsebino erlenmajerice smo dobro premešali. Erlenmajerico smo 24
odstavili od tehtnice, na tehtnico postavili A4 list, na list postavili erlenmajerico, na vrat erlenmajerice postavili urno steklo, s tem odprtino zakrili in tehtnico tarirali. V mikrovalovni pečici smo segreli raztopino agaroze do vrelišča, jo premešali in ponovno segreli do vrelišča. Postopek smo ponavljali dokler ni bila raztopina popolnoma bistra. Erlenmajerico smo postavili na tehtnico in izparjeno tekočino nadomestili z ultra čisto vodo. Počakali smo, da se je vsebina erlenmajerice ohladila, vendar se še ni strdila. Erlenmajerico smo prenesli v digestorij, kjer smo nadaljevali svoje delo. Dodali smo 3 µl barvila Midori Green in vsebino dobro premešali. Vsebino erlenmajerice smo previdno oddekantirali v nosilec za agarozni gel ter nastavili glavniček z nastavki za 30 žepkov. Nosilec smo zaščitili pred svetlobo in počakali 30 minut na strditev gela. Pripravljen gel smo odstranili iz nosilca in shranili pri 4 C do izvedbe elektroforeze S sterilnim skalpelom smo izrezali kos gela s potrebnim številom žepkov. V elektroforezno kadičko smo nalili tolikšen volumen pufra 1x TAE, da smo zakrili osrednji nosilec kadičke, nanj položili odrezan kos gela in dolili pufer do popolne potopljenosti gela. V prvi žepek agaroznega gela smo odpipetirali 5 µl označevalca DNA. V epico s produktom restrikcijske reakcije smo dobro zamešali 6 µl nanašalnega elektroforeznega pufra in odmerili 36 µl mešanice v drugi žepek agaroznega gela. Kadičko smo pokrili s pokrovom, jo prikloplili na vir enosmerne napetosti ter izvedli elektroforezo pri konstantnih 100 V, variabilnih 400 ma 40 minut. Po končani elektroforezi smo preneseli gel v G:Box in posneli sliko z zaslonko nastavljeno na f/1.2 ter čas snemanja 200 ms. Vir svetlobe je oddajal svetlobo kratke valovne dolžine (UV svetloba). 3.10 Izolacija DNA iz gela Material Izolacijo iz gela smo opravili z Monarch DNA gel extraction Kit (New England Biolabs Inc., ZDA) - Monarch DNA gel extraction kit - Monarch pufer za raztapljanje gela - Monarch pufer za spiranje DNA 25
- Monarch pufer za elucijo DNA - Monarch DNA adsorpcijske kolone Ultra čista voda Variabilni kronometerski Grelec CH-100 (Biosan, Latvija) Vibracijski stresalnik Bio Vortex V1 (Biosan, Latvija) Centrifuga MiniSpin (Eppendorf GmbH, Nemčija) Analitska tehtnica ATILON (Acculab Inc., ZDA) UV luč (Vilber Lourmat, Francija) Spektrofotometer NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, ZDA) Potek dela Na analitsko tehtnico smo postavili 1,5-mililitrsko mikrocentrifugirko ter maso starirali. Gel s komponentami ločenimi pri elektroforezi smo prenesli na ohišje UV luči. Pod UV lučjo smo iz agaroznega gela izrezali pas zanimanja z najbolj verjetnim fragmentom DNA, ki smo ga preneseli v mikrocentrifugirko. V isto mikrocentrifugirko smo dodali štirikratni volumen (400 µl na 100 mg), glede na maso izrezanega pasu agaroznega gela, Monarch pufra za raztapljanje gela iz priloženega kita. Zmes smo inkubirali na heatblocku pri temperaturi 55 C s periodičnim stresanjem na vibracijskem stresalniku na par minut, dokler ni bil gel popolnoma raztopljen. Raztopljen gel smo odpipetirali v kolono priloženo kitu, ki smo jo predhodno vstavili v 2-mililitrsko zbiralno epruvetko priloženo kitu. Vsebino kolone smo centrifugiralli 1 minuto pri 13,4 krpm in eluat zavrgli. V kolono smo prenesli 200 µl Monarch pufra za spiranje DNA ter ponovno centrifugirali kolono pri istih pogojih. Eluat smo zavrgli in ponovili postopek spiranja DNA. Kolono smo prenesli v čisto 1,5-mililitrsko mikrocentrifugirko, dodali 20 µl Monarch pufra za elucijo DNA, inkubirali pufer na koloni 1 minuto in centrifugirali kolono pri istih pogojih. Kolono smo zavrgli, DNA v eluatu pa določili čistost in koncentracijo s spektrofotometrom. 3.11 Hibridizacija inserta s sledečo ligacijo Material 26
ESRRA FWD oligonukleotid za ESRRA insert 5 -CgggcccgaggcagaaacctatctcagggagggaaggggT-3 ESRRA REV oligonukleotid za ESRRA insert 5 -CTAGAccccttccctccctgagataggtttctgcctcgggcccGAGCT-3 ESRRA mut FWD oligonukleotid za ESRRA mut insert 5 -CgggcccgaggcagaaacctatctcaggagggaaggggT-3 ESRRA mut REV oligonukleotid za ESRRA mut insert 5 -CTAGAccccttccctcctgagataggtttctgcctcgggcccGAGCT-3 Hibridizacijski pufer (10mM TRIS, 50mM NaCl, 1mM EDTA, ph = 7.5) Ultra čista voda Vodna kopel WB-4MS (Biosan, Latvija) T4 DNA ligase (400.000 U/mL, New England Biolabs, ZDA) 10x T4 DNA ligase buffer (New England Biolabs, ZDA) Lineariziran plazmidni vektor (lineariziran pmirglo) Insert Potek dela Za hibridizacijo vsakega inserta smo zamešali 1,5 µl FWD in REV oligonukletotida vsakega inserta skupaj s 47 µl hibridizacijskega pufra. Raztopino smo prenesli na vodno kopel za 5 minut pri 95 C in nato ohlajali do sobne temperature. Ligacijo inserta v lineariziran plazmidni vektor smo opravili po protokolu NEB(34) s spremembo časa ligacije - reakcijo ligacije smo pustili potekati preko noči pri sobni temperaturi. Uporabili smo molsko razmerje vektor : insert = 1 : 3 = 0,01 pmol : 0,03 pmol. Preračunano na masno razmerje dobimo 50 ng vektorja : 1 ng inserta. To nanese na končno zmes 1 µl T4 ligase, 1 µl 10x T4 DNA ligase buffer, 50 ng lineariziranega vektorja, 1 ng 100R inserta ter ultra čista voda do končnega skupnega volumna 10 µl. 27
3.12 Kloniranje konstrukta z bakterijsko transformacijo in izolacijo plazmida ter potrjevanjem ligacije z uporabo restrikcijske endonukleaze ApaI Pripravljeni plazmid smo transformirali v bakterije. Ko smo po prekonočnem gojenju na gojišču agar z LBA dobili več kolonij, smo iz vsakega gojišča naključno vzeli več kolonij in jih nacepili v tekoče gojišče LBA, ter inkubirali preko noči. Material Več prekonočnih tekočih kultur LBA za insert ESRRA Več prekonočnih tekočih kultur LBA za insert ESRRA mut Solarbio Small Plasmid Extraction Kit D1100-50T - RNaza A 300 µl - Raztopina I 15 ml - Raztopina II 15 ml - Raztopina III 20 ml - Raztopina za spiranje 15 ml - Elucijski pufer 15 ml - Adsorpcijske kolone 50-kos - Zbiralne tubice 50-kos Vodna kopel WB-4MS (Biosan, Latvija) Centrifuga MiniSpin (Eppendorf GmbH, Nemčija) Suspenzije izoliranih plazmidov s konstrukti ESRRA oz. ESRRA mut Ultra čista voda Restrikcijska endonukleaza ApaI (20.000 U/µL) Pufer za restrikcijske endonukleaze (Restriction Enzyme Buffer SA, Sigma-Aldrich GmBH, Nemčija) Polipropilenske 50-mikrolitrske mikrocentrifugirke (BD Inc., ZDA) Uprašena agaroza - Agarose for routine use (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemˇcija) Pufer 1x Tris Acetat EDTA (TAE) 28
Označevalno barvilo za nukleinske kisline Midori Green (Nippon Genetics Europe GmbH, Nemčija) Ultračista voda Kadička za elektroforezo Wide Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad Inc., ZDA) Vir enosmerne napetosti Power Pac 300 (Bio-Rad, ZDA) Svetilka z variabilno valovno dolžino svetlobe in fotoaparatom G:Box (Syngene, VB) Programska oprema Gene Snap (Syngene, VB) Produkt dvojne restrikcijske reakcije 1Kb DNA ladder (Nippon Genetics Europe GmbH, Nemčija) Nanašalni elektroforezni pufer 6x Blue-Orange loading dye (Promega, ZDA) Potek dela Vse procese centrifugiranja smo izvajali pri sobni temperaturi in hitrosti 12000 RPM. 1,5 ml gojišča iz vsake tubice s tekočim gojiščem LBA z izbrano bakterijsko kulturo smo prenesli v 2-mililitrsko mikrocentrifugirko in centrifugirali 1 minuto. Preostanke gojišč iz tubic smo shranili v hladilniku. Supernatant centrifugiranja smo odlili ter peletirane bakterije resuspendirali v 250 µl raztopine I. Resuspendirane bakterije smo prenesli v sterilno 1,5- mililitrsko mikrocentrifugirko. Dodali smo 250 µl raztopine II in dobro premešali vsebino z inverzijo mikrocentrifugirke 6- do 8-krat. Reakcijo lize smo prekinili po 4 minutah z dodatkom 350 µl raztopine III in ponovnim dobrim premešanjem vsebine. Bakterije smo prenesli v namizno mikrocentrifugirko in centrifugirali 10 minut. V zbiralno tubico smo vstavili adsorpcijsko kolono in vanjo odpipetirali 700 µl supernatanta po centrifugiranju. Supernatant smo pustili stati v koloni 2 minuti in nato centrifugirali 1 minuto. Eluat smo zavrgli. Na kolono smo dodali 700 µl raztopine za spiranje, centrifugirali 1 minuto, eluat zavrgli, na kolono dodali 500 µl raztopine za spiranje, ponovno centrifugirali 1 minuto in eluat zavrgli. Prazno kolono smo centrifugirali 2 minut, da smo odstranili ostanke raztopine za spiranje. Elucijski pufer smo segreli na 65 C, kolono prenesli v sterilno 1,5-mililitrsko mikrocentrifugirko ter vanjo odpipetirali 50-200 µl elucijskega pufra. Pufer smo na koloni inkubirali 2 minuti ter kolono centrifugirali 1 minuto. Eluat smo odpipetirali nazaj na kolono, ponovno inkubirali pufer na koloni 2 minuti ter jo centrifugirali 1 minuto. 29
Za vsak eluat smo pripravili reakcijsko mešanico za restrikcijo z ApaI RE. V 50- mikrolitrsko mikrocentrifugirko smo zamešali 1 µl vzorca, 1 µl ApaI, 2µL pufra za restrikcijske endonukleaze ter 16 µl ultračiste vode. Pozitivna kontrola je bila priprava iste mešanice s plazmidnim konstruktom pmirglo-mir21, ki ima potrjeno restrikcijsko mesto ApaI, negativna kontrola je bil nemodificiran plazmid pmirglo z enim restrikcijskim mestom ApaI. Reakcijo restrikcije smo pustili potekati 1 uro pri sobni temperaturi. Produkte reakcije smo nato analizirali z agarozno gelsko elektroforezo po postopku 3.9 Agarozna gelska elektroforeza. Tekoča gojišča LBA z bakterijskimi kulturami, katerih izolirane plazmidne DNA so imele potrjeno ligacijo inserta, smo shranili za nadaljnje delo. 3.13 Celična kultura Material Donorsko gojišče s celicami HOS Predhodno segret popoln Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) z dodatkom 10 % fetal bovine serum (FBS), 1% glutamata (Glu), 1% raztopine antimikotika amfotericina B (AntiM) in antibiotikov penicilina s streptomicinom (AntiB) na 37 C Predhodno segret 1X fosfatni pufer (PBD) na 37 C Predhodno segreta 0.5 odstotna suspenzija tripsina na 37 C 3 sterilne petrijevke premera 10 cm Petrijevka s tekočim gojiščem donorskih celic HOS 10-mililitrska plastična centrifugirka Neubauerjeva komora za štetje celic Potek dela Z donorskega gojišča celic HOS odlijemo medij. Gojišče nato natančno a previdno speremo s 4 ml PBS. PBS odlijemo. Na gojišče odpipetiramo 3 ml tripsina, gojišče prenesemo v inkubator, pustimo tripsin delovati 3 minute in odstavimo iz inkubatorja. Gojišču dodamo 7 ml DMEM in premešamo. V vsako od novih petrijevk odpipetiramo 10.8 ml svežega DMEM. Iz prvotnega gojišča vzamemo po 1,2 ml gojišča z deadheriranimi celicami in prenesemo v novo 30
pripravljena gojišča. Novo pripravljena gojišča narahlo pretresemo in prenesemo v inkubator. Preostanek, približno 6,4 ml gojišča z deadheriranimi celicami prenesemo v falkonko, ki jo po longitudinalni osi parkrat zavrtimo. Odvzamemo 15 µl gojišča in prenesemo v Neubauerjevo celico. Preštejemo vse celice v 4 robnih kvadrantih, delimo s 4 in dobljen rezultat pomnožimo z 10.000. S tem izračunamo število celic na 1 ml suspenzije. 3.14 In vitro DNA transfekcija v celice HOS Material Suspenzija z deadheriranimi celicami HOS Plošča za gojenje celic s 24 vdolbinicami Predhodno segret popoln DMEM na 37 C Izolirani konstrukti Nemodificiran plazmid pmirglo Predhodno segret DMEM brez seruma na 37 C PolyJet transfekcijski reagent in vitro (SignaGen Laboratories, ZDA) 8 mikrocentrifugirk volumna 0,5 ml Potek dela Končne izolirane konstrukte smo razredčili na enotne delovne koncentracije (170 ng/µl). Enotnost koncentracij je pomembna zaradi olajšanja procesa transfekcije. Za gostiteljske celice smo izbrali človeško celično linijo HOS, transfekcijski reagent je bil PolyJet. Za vsak konstrukt, nemutiran in mutiran, smo izvedli 3 biološke ponovitve. Prav tako smo izvedli 3 biološke ponovitve za pozitivno kontrolo, ki je nemodificiran plazmid pmirglo, in negativno kontrolo, ki so celice brez inserta. Skupaj smo potrebovali 12 vdolbinic s po 20.000 celicami v vsakem vodnjačku. Na 1 ml suspenzije celic se nahaja 160.000 celic. V vsako vdolbinico smo odpipetirali po 0,5 ml končne mešanice celic z gojiščem. Skupni volumen potrebne končne mešanice celic z gojiščem je 6 ml, od tega je 1,5 ml suspenzije celic in 4,5 ml popolnega medija DMEM. Celice smo nasadili v plošči 31
za gojenje celic s 24-vdolbinicami 24 ur pred izvedbo transfekcije in jih preko noči pustili v inkubatorju. Pol ure pred transfekcijo smo v vsako vdolbinico dodatno odpipetirali po 0,5 ml popolnega medija DMEM, nadaljnji potek transfekcije smo opravili po predpisanem protokolu za PolyJet reagent pri uporabi plošče za gojenje celic s 24-vdolbinicami (35). Za vsako vdolbinico potrebujemo dve komponenti, ki sta med seboj ločeni in ju združimo tik pred prenosom v vdolbinico komponenta z genskim materialom: 500 µg konstruktne DNA (3 µl) v 25 µl DMEM brez seruma in komponenta z reagentom: 1,5 µl reagenta PolyJet v 25 µl DMEM brez seruma. Za vsak konstrukt in kontrolo smo zamešali skupni volumen vsake komponente. Pripravili smo 4 0,5-mililitrske mikrocentrifugirke z genskim materialom, vsako s sestavo 9 µl svoje konstruktne DNA oz. kontrole v 75 µl DMEM brez seruma, in jih označili z oznakami»e«,»em«,»pmg«in»0«. Negativna kontrola»0«je bila sestavljena iz 84 µl DMEM brez seruma. Pripravili smo nove 4 0,5-mililitrske mikrocentrifugirke z reagentom, vsako s sestavo 4,5 µl reagenta PolyJet v 75 µl DMEM brez seruma, in jih označili z oznakami»r«. Vsako»R«mikrocentrifugirko smo dobro premešali s pipetiranjem in prenesli v svojo mikrocentrifugirko z genskim materialom, kjer smo končno mešanico dobro premešali s pipetiranjem. Vse 4 pipete s končnimi mešanicami smo inkubirali 15 minut pri sobni temperaturi. Po inkubaciji smo kapljično prenesli po 54 µl zmesi vsakega konstrukta v vsako od 3 vdolbinic, namenjenih posameznemu konstruktu oz. kontroli. Ploščico za gojenje celic smo prenesli v inkubator in pričeli s končno inkubacijo. Po 15 urah od začetka končne inkubacije smo predhodno segreli popoln medij DMEM na 37 C. Zamenjali smo medij v vseh 12 vdolbinicah; odpipetirali celotno kapljevino vsake vdolbinice in v vsako napipetirali po 0,5 ml predhodno pripravljenega popolnega DMEM 3.15 Liza celic in izvedba dvojnega luciferaznega testa Material Celice, nagojene na plošči za gojišča s 24 vdolbinicami Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Inc., ZDA) 32
- Pufer za pasivno lizo celic (PLB) - Zmes Luciferase assay reporter II (LAR II) - Reagenčna zmes Stop n Glo Predhodno segret 1X PBS na 37 C 12 mikrocentrifugirk volumna 0,5 ml Well ploščica NUNC EDGE 96 (ploščica za luminometer) Potek dela Po 25 urah od začetka končne inkubacije smo napravili lizo celic in izvedli luciferazni test po protokolu Dual luciferase reporter assay (36). PLB in LAR II smo imeli že predhodno pripravljena in globoko zamrznjena na 80 C. Stop n Glo reagent smo predpripravili pred samo uporabo. Za 12 vzorcev smo potrebovali vsaj 1,2 ml reagenta Stop n Glo, zato smo vmešali 24 µl substrata 50X Stop n Glo smo v 1,2 ml pufra Stop n Glo. Iz vsake vdolbinice plošče z gojišča smo odpipetirali medij gojišča, ga sprali s 100 µl 1X PBS, odpipetirali PBS in napipetirali 100 µl PLB. Ploščo z gojišči smo nato 15 minut stresali na stresalniku. Lizate celic smo iz vsakega vodnjačka prenesli v svojo mikrocentrifugirko in označili z»e1, Em1, pmg1, 01, E2, Em2...pmG3, 03«. Nato smo po 20 µl lizatov celic iz vsake mikrocentrifugirke prenesli v dva vodnjačka ploščice za luminometer za izvedbo dveh tehničnih ponovitev. Dobili smo 6 vodnjačkov za vsako linijo celic s svojimi inserti (ESRRA, ESRRAmut, pmirglo, blank), skupaj 24 vodnjačkov, v luminometer ploščici. V vsako zapolnjeno vdolbinico s celičnim lizatom smo odpipetirali 100 µl LAR II, dobro premešali s pipetiranjem in izmerili luminiscenco oz. aktivnost kresničkine luciferaze (firefly luciferase). Nato smo v vsako vdolbinico odpipetirali 100 µl substrata Stop n Glo, dobro premešali s pipetiranjem in ponovno izmerili luminiscenco oz. aktivnost luciferaze renilla. Dobljene podatke smo tabelarično shranili v primerno datoteko. 33
4. Rezultati in razprava 4.1 Obdelava podatkov HOS Osnovni sklop podatkov so bile meritve izraženih mikrorna v celicah HOS ob izpostavitvi različnim razmeram tekom 24- in 72-ur, ki jih je opravil dr. Peter Vratčnik v sklopu svoje doktorske naloge. Mi smo želeli podatke ponovno statistično ovrednotiti, ker se je dr. Vrtačnik osredotočil na spremembe izražanja mikrorna podanie kot faktorji spremembe izražanja. Čeprav je tak pregled spremembe statistično najmočnejši, je njegova šibkost v možnosti spregledanja sprememb izražanja mikrorna, katerih absolutne vrednosti izražanja kot tudi absolutne razlike izražanja so velike, vendar so relativno, glede na faktor spremembe, nizke. V sklopu doktorske naloge je dr. Peter Vrtačnik raziskoval različne vplive na epigenetske procese v osteoblastih. Različne celične kulture iste celične linije je izpostavil različnim stresorjem oz. vplivom ter tekom različnih časovnih točk ekperimenta izmeril nivoje izražanja mikrorna. Celice so bile transfecirane s plazmidom pcmv-esr1 ter tretirane s 500 μm vodikovim peroksidom in 10 nm 17β-estradiolom 24 ur po transfekciji (celice PE) oz. transfecirane s plazmidom pcmv-esr1 in tretirane s kontrolnim topilom 24 ur po transfekciji (celice K). Nas so zanimale razlike v izražanju mikrorna po 72 urah od izpostavitve različnim topilom. Celice HOS so zaradi svojih lastnosti dobre modelne celice za proučevanje osteoblastov, vendar ne izražajo ERα (estrogenski receptor α). Za čimboljši približek osteoblastom je dr. Vrtačnik vanje transfeciral gen ERα. Podatke o izražanju 800 različnih mikrorna smo dobili z metodo ncounter mirna assay podjetja Nanostring Technologies Inc. Analizo so opravilili v podjetju VIB Nucleomics Core iz Belgije. Tako pridobljene podatke smo najprej obdelali za pridobitev normaliziranih podatkov. Za izračun signala smo se večinoma držali navodil proizvajalca metode ncounter, ozdaje pa smo odšteli z metodo RMA (29). Metoda je uporabna za odštetje ozadja pri meritvah, katerih signali so porazdeljeni eksponentno in ozadja porazdeljena normalno, kar drži za podatke pridobljene pri večini mikromrež, kamor spada tudi metoda ncounter mirna (29). Za vsak set meritev smo dobili standardizirane podatke, ki smo jih med seboj primerjali. Zanimale so nas razlike v izražanju mikrorna med celicami K in PE 34
v 72 urah po dodatku vodikovega peroksida. Te razlike smo padajoče uredili po velikosti ter izbrali prvih 20 mikrorna znotraj take ureditve, saj smo predvidevali, da so tako pridobljene modelno izražene mikrorna najbolj odzivne na vpliv oksidativnih procesov v osteoblastih oz. najbolje opisujejo profil mirna vpletenih v spremembe kostnega tkiva pri patologijah (priloga 8.1). Te mikrorna so zbrane v preglednici V. Med tako pridobljenimi mikrorna so bile tudi mikrorna s predvideno korelacijo s kakovostjo kostnega tkiva na osnovi vrednosti mineralne gostote kosti lumbarnih vretenc in vratu stegnenice, (hsa-mir- 125b-5p (37,38), let-7a-5p (37), hsa-mir-93-5p (37), hsa-mir-100-5p (37)) kot tudi predvideno korelacijo z znižanim rezultatom kvalitete kostne trabekule (TBS) (hsa-mir- 125b-5p (39)). Preglednica V: 20 mikrorna z razlikami v izražanju v celicah PE in celicah K po 72 urah od tretiranja, urejene po padajočih vrednostih. mikrorna Razlika K - PE Fold change K - PE hsa-mir-29b-3p 9168.04557 0.647800456 hsa-let-7a-5p 6236.67778-0.173270846 hsa-mir-1246 4157.11468 4.856266453 hsa-mir-145-5p 3157.98539-0.330084036 hsa-let-7b-5p 1762.38928-0.278641194 hsa-mir-125b-5p 1198.9042 0.267008704 hsa-mir-93-5p 1157.13278 0.280219125 hsa-mir-100-5p 1130.14158 0.510557018 hsa-mir-221-3p 1123.08572 0.503832367 hsa-mir-29a-3p 1106.38944 0.690654725 hsa-mir-125a-5p 1046.61903-0.319933454 hsa-mir-143-3p 931.89356-0.199646003 hsa-mir-23a-3p 841.66636 0.249248685 hsa-mir-20a-5p 770.4288 0.12667663 hsa-mir-106a-5p 765.52083 0.14824487 hsa-mir-107 765.13189-0.285524548 hsa-mir-27b-3p 743.41975-0.302890979 hsa-mir-4454 718.37279 0.032984194 hsa-mir-26a-5p 646.34791-0.440734515 hsa-mir-720 646.0663 0.121762087 35
4.2 Iskanje tarč za mikrorna 4.2.1 Iskanje tarčnih genov s pomočjo podatkovne baze mirwalk2.0 Iskanje tarč smo izvedli s pomočjo spletne baze podatkov mirwalk2.0 (30). Namen te baze je agregacija javno dostopnih podatkov o potrjenih ter izračunanih interakcijah med mirna in njihovimi tarčami. Baza mirwalk2.0 pridobi svoje podatke iz splošno sprejetih interakcij mirna-tarča (lokalno izračunane interakcije in predpostavljene interakcije prejete iz zunanjih virov), validiranih interakcij mirna-tarča iz zunanjih virov in funkcijskih pripisov. Podatke in uporabnikov vnos spletna stran obdela in vrne iskane rezultate oz. povezavo do rezultatov iz zunanjih virov. Namen vključenih baz so prosto dostopni, v laboratoriju eksperimentalno potrjeni ter računalniško izračunani rezultati interakcij. Slika 8: Pregled osnovnega delovanja mirwalk2.0. 36
Splošno sprejete interakcije izračunajo znotraj programskega okvirja de novo. Primerjajo sekvence mirna s sekvencami genov, ki jih nato lokalni programi (mirwalk, miranda, RNAhybrid, PITA, TargetScan) obdelajo in prikažejo rezultate t.j. izračunane interakcije mirna z njihovimi tarčami. Hkrati poiščejo tudi predvidene interakcije mirna z 3'-UTR genov iz zunanjih baz (Diana-microT4, Diana-micro-CDS, mirbrdige, mirdb, mirmap, mirnamap, Pictar2, RNA22). Ker se interakcije vsakič izračunajo de novo in ker so zunanje baze pogosto osvežene z novimi podatki, je tudi baza podatkov mirbase2.0 relevantna in moderna. Validirane podatke programski okvir pridobi z rudarjenjem podatkov po bazi Pubmed in kombiniranjem validiranih podatkov iz zunanjih baz (mirtarbase, HMDO, PhenomiR, mir2disease). Za obogatitev informacije in umestitev pridobljenih informacij v kontekst, programska oprema rudari tudi po funkcijskih pripisih, kot so npr. identifikatorji, signalne poti, biološke poti in ontologija genov (GO). Skupaj z uporabnikovim iskalnim nizom oz. vnosom iskalnih pojmov programski okvir sprocesira informacije ter jih predstavi, kjer so informacije podprte tudi z zunanjimi referencami, ob obstoju slednjih (slika 8). Ob izbiranju različnih možnosti smo stremeli k iskanju tarč, ki bi jih naše mirna utišale. To je pomembno pri»step 3«pri»input parameters«. Možnosti, ki bi jih lahko izbrali, so»5 UTR«,»CDS«in»3 UTR«. Zaradi tega smo odkljukali možnost 3 -UTR skupaj z»minimum seed length«7. Čeprav je primarni način utišanja mrna preko interakcij z 3 -UTR, obstajajo tudi drugi, manj raziskani, a še vedno pomembni načini interakcije mirna z mrna. RISC lahko interagira z 5 -UTR mrna kot tudi kodirajočo regijo gena, vendar končni rezultat ni vedno enak. Parjenje mirna s 3 -UTR skorajda zagotovo pripelje do zaviranja izražanja gena, medtem ko lahko parjenje s 5 -UTR pripelje do ravno obratnega rezultata, kar pa nas ni zanimalo (40). Rezultate smo prenesli v obliki tekstovne datoteke, v kateri so zbrani podatki o interakcijah mirna-gen, moči interakcije, začetku in koncu interakcije na nukleotidnih mestih 3 -UTR genov ter verjetnost navedene interakcije. Rezultati sami v taki obliki so preobširni za analizo, hkrati pa ne predstavljajo vizualno lahko preglednih podatkov. 37
4.2.2 Izgradnja mreže interakcij mikrorna s tarčnimi geni s pomočjo programa Cytoscape Dobili smo podatke, iz katerih so nas zanimali vplivi med posameznimi mirna in tarčami, zato smo uporabili orodje Cytoscape, ki omogoča izris mreže s povezavami med prej omenjenimi pari. Za nas je prišla v upoštev izgradnja mreže povezav oz. interakcij med mirna in tarčnimi geni na podlagi datoteke, pridobljene s strani mirwalk2.0, kot tudi uporaba dodatnih vtičnikov za kvantitativno in kvalitativno analizo prikazanih mrež. Po zagonu programa Cytoscape (31) smo zgradili novo omrežje iz datoteke. Tarčno orodje za uporabo Cytoscape je bil vtičnik BinGO (32), ki so ga pripravili z namenom funkcijske karakterizacije skupine genov. S pridobljeno mrežo kategorij genov, udeleženih v interakcijah, in prerazporeditvijo mreže za lažjo predstavitev, smo s pregledom reprezentativnosti posameznih kategorij in verjetnostjo te reprezentativnosti določili kategorijo zanimanja. Zanimale so nas kategorije, ki so funkcionalno najbolje razdeljene in medsebojno različne (kategorije so na grafu BinGO pri vrhu grafa). Tako smo odkrili kategorijo»regulation of ossification«, ki jo lahko tudi označimo v okencu»bingo output«in kliknemo na gumb»select nodes«(sliki 9 in 10). To dejanje nam je v osnovnem grafu parov mirna-gen povezav izbralo gene - tarčna vozlišča, ki ontološko spadajo pod dotično funkcionalno kategorijo regulacije osifikacije. Po olajšani vizualizaciji povezave oz. regulacije mirna na gene smo označili izvorna vozlišča in povezave med temi izvornimi in tarčnimi vozlišči (»Select«;»Edges«;»Select adjacent edges«; in nato še»select«;»nodes«;»first Neighbours of Selected Nodes«;»Undirected«), ter skrili vse neizbrane elemente osnovnega grafa povezav (»Select«;»Hide uselected nodes and edges«). Za lažjo vizualizacijo mreže smo jo uredili (»Layout«;»yFiles Layouts«;»Organic«) (sliki 11 in 12). 38
Slika 9: Funkcionalne skupine genov, na katere vplivajo izbrane mirna. Temnejša barva nakazuje večjo verjetnost predstavitve biološkega procesa iz zbirke genov. Biološki procesi bolj proti vrhu grafike nakazujejo večjo funkcionalno diferenciacijo le-tega procesa. Slika 10: "Regulation of ossification" je končna veja povezav funkcionalnih skupin genov. Je del funkcionalnih skupin z navječjo diferenciacijo. 39
Slika 11: Grafični prikaz mirna iz naše osnovne zbirke ter genov, na katere te mirna vplivajo Slika 12: Grafični skupek prikazuje mir-125b- 5p in gene, znotraj procesa»regulation of ossification«, na katere ima vpliv. 40
4.3 Potrditev najdenih tarč 4.3.1 Iskanje vezavnega zaporedja za mikrorna hsa-mir-125b-5p Mreža, zgrajena s programskim orodjem Cytoscape, je predstavlja osnovo za nadaljnjo analizo interakcij med mirna in tarčnimi geni. Z analizo robustnosti/moči interakcij, z zborom in pregledom literature smo določili naši tarči zanimanja - mikrorna hsa-mir-125b-5p (mirna-125b) in gen ESRRα. Pri pregledu literature nismo zasledili neposredne povezave oz. vpliva mirna na ta gen, medtem ko so vplive ESRRα kot tudi možnost vpliva mirna-125b na biologijo kosti že zabeležili. Regulacijo oz. vpliv so predvideli z računalniškimi metodami, kot smo že prikazali v prejšnjih poglavjih, eksperimentalni dokaz pa še ne bil opravljen (41). Z uporabo baze oz. orodja TargetScan smo pridobili tarčno sekvenco mir-125b na genu ESRRα. Pri grafičnem prikazu 3'-UTR ESRRα vidimo, da imajo poleg družine mirna- 125-5p na to regijo močno vezavo tudi druge mirna (družina mirna-135-5p in družina mirna-137). Pri označitvi»mir-125-5p«na grafiki smo v tabeli»conserved«pod grafiko lahko videli tudi jakost preračunane vezave in s tem vpliva na izražanje mrna (weighted context++ in ostale spremenljivke, ki so del izražuna te kvantifikacije) in verjetnost vpliva izbrane mirna na izbrano mrna (PCT). Opazili smo, da ima sorodna mir-125a-5p višji vpliv na izražanje ESRRα. To si lahko razlagamo zaradi dodatne stabilizacije dimera mirna-mrna s strani trimera nukleotidov 13-15 mir-125a-5p. mir-125b-5p se pri človeku veže na mestih 311-319 3 -UTR ESRRA, ki jih predstavlja sekvenca»cucaggg«(vezavno mesto). V plazmidni vektor smo tako vstavili večji fragment od vezavnega mesta, zato smo izbrali sekvenco 3'-UTR ESRRα, dolgo 32 bp, z vezavnim mestom na sredini izbrane sekvence. 4.3.2 Konstrukcija oligonukleotidov za prenos in transfekcijo v celice HOS Osnova za našo pripravo oligonukleotidov je bilo 32 bp dolgo zaporedje 5 - GAGGCAGAAACCUAUCUCAGGGAGGGAAGGGG-3, kjer je z rumeno barvo označeno vezavno mesto družine mirna-125-5p. Plazmidni vektor pmirglo, ki smo ga uporabili za transformacijo bakterij in transfekcijo celic, je luciferazni tarčni ekspresijski vektor. Uporabljamo ga za 41
kvantitativno evalvacijo aktivnosti mirna. Vsebuje kresničkin luciferazni gen (luc2); reporter za prikaz vpliva mirna na transkripcijsko stabilnost in aktivnost tarčnih sekvenc. Promotor človeška fosfoglicerat-kinaza (PGK) v plazmidu je neviralen univerzalen promotor, kar omogoča uporabo plazmida za transfekcijo v več različnih evkariontskih sistemih. Plazmid vsebuje tudi multiklonalno mesto (MCS) s prepoznavnimi mesti za več restrikcijskih encimov. Dve sekvenci znotraj MCS sta 5'- GAGCTC-3' in downstream od nje 5'-TCTAGA-3', kjer prvo cepi RE SacI, drugo pa XbaI. PmirGLO ima tudi na neomicin odporno humanizirano Renilla luciferazno kaseto (hrluc-neo) kot kontrolni reporter za potrebe normalizacije genskga izražanja, Amp r gen za beta laktamazno aktivnost, ColE1 ORI ter SV40 promotorsko zaporedje. Za potrebe ligacije smo konstruirali oligonukleotide s fragmenti restrikcijskih zaporedij za SacI in XbaI oz. zaporedji, ki so enaka produktom restrikcijske reakcije. Ker bakterijska transformacija s kontrukti ni vedno 100-odstotno učikovita, smo pripravili plazmidne vektorje, ki nam bodo omogočali selekcijo bakterijskih kolonij, ki izražajo naš vektor. Tako smo konstruirali oligonukleotide z dodatnim restrikcijskim mestom, ki je v osnovnem plazmidnem vektorju prisotno samo še na enem mestu zunaj MCS. To je sekvenca 5 -GGGCCC-3, ki jo cepi RE ApaI na relativnem nukleotidnem mestu plazmida 5690. Vstavili smo jo med SacI restrikcijsko sekvenco upstream od njega in preostankom oligonukleotida downstream od njega. Tako dobljena oligonukleotida smo imenovali»*new* ESRRA-SacI-XbaI FWD«za sense oligonukleotid in»*new* ESRRA-SacI- XbaI REV«za antisense oligonukleotid. Njuni sekvenci sta 5 - CGGGCCCGAGGCAGAAACCTATCTCAGGGAGGGAAGGGGT-3 (sense) oziroma 3 -TCGAGCCCGGGCTCCGTCTTTGGATAGAGTCCCTCCCTTCCCCAGATC-5 (antisense) (slika 13). Vzporedno z njima smo pripravili tudi mutirana oligonukleotida. Inserta pripravljena z njima, sta služila pri končni transfekciji kot kontroli dejanske inhibicije pri vzorčnih insertih. Mutirana oligonukleotida smo pripravili z delecijo ene gvanozinske oziroma njene komplementarne enote vezavnega mesta. Tako dobljena oligonukleotida imenujemo»*new* MUT ESRRA-SacI-XbaI FWD«s sekvenco 5 - CGGGCCCGAGGCAGAAACCTATCTCAGGAGGGAAGGGGT-3 (sense) in *NEW* 42
MUT ESRRA-SacI-XbaI REV s sekvenco 3 - TCGAGCCCGGGCTCCGTCTTTGGATAGAGTCCTCCCTTCCCCAGATC-5 (antisense) (slika 14). Slika 13: Končna sekvenca dela konstruktnega plazmida *NEW* ESRRA- SacI-XbaI, kjer sta prilegajoče prikazana tudi oligonukleotida FWD oz. REV. Z modro barvo je označeno mesto vezave družine mir-125-5p (zaporedje CTCAGGG). Slika 14: Končna sekvenca dela konstruktnega plazmida *NEW* MUT ESRRA-SacI-XbaI. V primerjavi z nemutiranim bratskim plazmidom ima en bazni par manj, t.j. G-C bazni par manj. Z modro barvo je označeno modificirano mesto vezave družine mir-125-5p (zaporedje CTCAGGA). 4.4 Preskus uspešnosti ligacije in transformacije Po opravljeni hibridizaciji insertov in njihovi ligaciji v plazmid, bakterijski transformaciji in izolaciji kontruktnih plazmidnih DNA smo preizkusili uspešnost celotnega postopka. To smo opravili z reakcijo restrikcije z ApaI RE in analizo nastalih fragmentov z gelsko EF. Če je bil postopek ligacije uspešen, smo videli pri razvitju gelske elektroforeze dva fragmenta DNA. Prvi je bil dolg približno 5,7 kbp, drugi pa približino 1,7 kbp. Ob 43
neuspešni ligaciji pa smo videli samo en fragment v velikosti 7,4 kbp. Razlog za to je v sami konstrukciji insertov, v katere smo vneslo sekvenco, ki jo cepi ApaI. Pozitivna kontrola uspešnosti transformacije je bil izoliran plazmidni vektor»mir-21«, ki je bil predhodno pripravljen pred samimi poskusi in je dokazano vseboval mesto za RE ApaI. Slika 15: Slika levo konstrukt ESRRα; M - marker, E1-E6 - bakterijske kolonije, E1 - bakterijska kolonija z uspešno transformacijo t.j. vsebuje mesto ApaI, P - pozitivna kontrola t.j. mir-21. Slika desno konstrukt ESRRαmut; M marker, P pozitivna kontrola t.j. mir-21, C negativna kontrola t.j. nespremenjen krožni pmirglo, Em bakterijska kolonija z uspešno transformacijo t.j. vsebuje mesto ApaI. Gelska elektroforeza je potrdila vsebnost restrikcijskega mesta ApaI (slika 15)., vendar pa smo za absolutno potrditev transformacije morali še sekvenirati končno plazmidno DNA. Z rezultati sekvenciranja smo poravnali naše oligonukleotide *NEW* ESRRA-SacI- XbaI oz. mutirane oligonukleotide *NEW* MUT ESRRA-SacI-XbaI in videli, da je bila transformacija konstruktnih plazmidnih DNA uspešna (sliki 16 in 17). 44
Slika 16: Rezultat sekvenciranja plazmidne DNA z vstavljenim insertom za ESRRα. Vidmo popolno ujemanje plazmidne sekvence s sekvencami oligonukleotidov uporabljenih za pripravo inserta. Slika 17: Rezultat sekvenciranja plazmidne DNA z vstavljenim mutiranim insertom za ESRRα. Vidimo popolno ujemanje plazmidne sekvence s sekvencami oligonukleotidov uporabljenih za pripravo inserta. 4.5 Preverjanje vezave preiskovanih mirna na tarčne oligonukleotide Tako pripravljeni raztopini plazmidnih konstruktov smo vneseli v človeško celično linijo (transfekcija). Metoda temelji na uporabi polimernih polikationov, ki kompleksirajo negativno nabito DNA, kar je v našem primeru plazmidni konstrukt. Zaradi presežka kationskih mest je neto naboj takih kompleksov pozitiven, kar pripomore k interakciji kompleksov z negativno nabito celično membrano. Celice te komplekse privzamejo s procesom endocitoze, kjer se DNA in polikationski nosilec ločita. Slednji se v citoplazmi razgradi, medtem ko DNA migrira v celično jedro. V celičnem jedru pride do transkripcije plazmidne DNA. Tak primarni transkript preživi proces izrazovanja, kjer se eksoni povežejo v mrna, ki se transportira v citoplazmo. Tam se mrna preko večstopenjskega procesa translacije prevede v proteine. Pri uporabi plazmida pmirglo pride do prevajanja proteinov 45
kresničkine luciferaze in luciferaze Renilla. Če je na 3 -UTR mrna proteina kresničkine luciferaze prisotna tarčna sekvenca za mirna prisotne v citoplazmi celic, bo proteinska translacija zavrta oz. nižja kot bi bila drugače. To smo opazili pri merjenju luciferaznih aktivnosti pri naših konstruktih. Opravili smo tri paralelne biološke poskuse z dvema tehničnima ponovitvama. Merili smo luciferazne aktivnosti celic z vstavljenimi konstrukti z vstavljeno 3 -UTR gena ESRRα, mutiranimi konstrukti 3 -UTR gena ESRRα, nemodificiranim plazmidom pmirglo ter celicami, pri katerih pri procesu transfekcije nismo vstavili tuje DNA (prazne celice). Preglednica VI: Preglednica z neobdelanimi odčitki luminiscence luciferaznih testov. Za vsak insert (»E«za nemodificiran konstrukt,»em«za mutiran konstrukt,»pmg«za nemodificiran pmirglo in»blank«za netransfecirane celice) smo opravili tri biološke ponovitve in dve tehnični.»firefly«nakazuje izražanje kresničkine luciferaze,»renilla«nakazuje izražanje luciferaze Renilla. Števke nakazujejo tehnično ponovitev (prva števka npr. Firefly 1-) oz. biološko ponovitev (druga števka npr. Firefly-3). E Em pmg blank Firefly11 291071 6103 1558003 776 Firefly12 549996 8171 1642790 819 Firefly13 520320 4721 1012854 588 Renilla11 358870 6077 1689038 1715 Renilla12 614463 7240 1764500 735 Renilla13 567015 4334 852460 558 Firefly21 190313 3521 765289 810 Firefly22 372748 4177 884413 633 Firefly23 261253 2927 627251 730 Renilla21 461534 7202 1595394 2026 Renilla22 734698 7550 1537384 955 Renilla23 481413 3787 893573 780 Vrednosti znotraj preglednice VI smo normalizirali z odštetjem aktivnost ozadja, netransfecirane celice, za vsako ponovitev. Za vsako ponovitev smo nato vrednosti izražanja kresničkine luciferaze delili z vrednostmi izražanja luciferaze renilla. Tako dobljene količnike za vsako ponovitev smo delili s količnikom za ponovitev z nemodificiranim plazmidom pmirglo. Takšne končne količinike smo nato statistično obdelali. Najprej smo z uporabo Shapirovega testa normalnosti potrdili, da so meritve za vse konstrukte normalno 46
porazdeljene in lahko nadaljujemo z uporabo parametričnih testov. P-vrednost Shapiro testa za nemodificiran konstrukt je bil p = 0,3791, za modificiran konstrukt pa p = 0,6097. Z uporabo studentovega t-testa smo ugotovili statistično pomembno razliko med jakostmi izražanja obeh konstruktov, tistega z vstavljeno 3'-UTR gena ESRRα in tistega z vstavljeno mutirano 3'-UTR gena ESRRα. Rezultat t-testa je bil p = 0,01342. Aritmetična sredina izražanja nemodificiranega konstrukta je bila 0,8546 (95 % CI 0,7784 0,9308), modificiranega pa 1,0876 (95 % CI 0,9217 1,2535) (priloga 8.2). Rezultat smo tudi grafično predstavili (slika 18). Slika 18: Normalizirano izražanje konstruktov z nemodificiranim (»E«) in modificiranim (»Em«) insertom ob primerjavi z osnovnim insertom pmirglo (»pmg«). Ob bazi stolpca je izražena povprečna vrednost preračunov izražanja luciferazih proteinov. 47