Ivan Krmpotić Primerjava hitrega imunokemijskega testa z ELISA testom za določitev kalprotektina v blatu Diplomsko delo Maribor, februar 2012

Transkripcija

1 Ivan Krmpotić Primerjava hitrega imunokemijskega testa z ELISA testom za določitev kalprotektina v blatu Diplomsko delo Maribor, februar 2012

2 Primerjava hitrega imunokemijskega testa z ELISA testom za določitev kalprotektina v blatu Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa Študent: Študijski program: Ivan Krmpotić visokošolski strokovni študijski program Kemijska tehnologija Predvideni strokovni naslov: diplomirani inženir kemijske tehnologije (VS) Mentor: Komentor: izr. prof. dr. Uroš Potočnik mag. Evgenija Homšak, spec.med..biokem. izr. prof. dr. Peter Krajnc Maribor, februar 2012

3

4 IZJAVA Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal/a sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: Vir: PubMed ( Gesla: Število referenc inflammatory bowel disease IN calprotectin 289 inflammatory bowel disease IN calprotectin IN ELISA 72 irritable bowel syndrome IN calprotectin 50 Vir: COBIB-COBISS ( Gesla: Število referenc KVČB IN kalprotektin 1 KVČB IN ELISA 1 Skupno število pregledanih člankov: 24 Skupno število pregledanih knjig: 4 Za iskanje uporabite baze, kot npr.: Thomson Reuters Web of Knowledge (apps.isiknowledge.com) COBIB - COBISS ( Digitalna knjižnica Univerze v Mariboru (dkum.uni-mb.si) Digitalna knjižnica Univerze v Ljubljani (dikul.uni-lj.si) itd. Za vsako bazo, v kateri ste izvedli poizvedovanje, navedite ime baze (vir), uporabljena gesla oz. skupine gesel in število najdenih rererenc. Tabelo po potrebi kopirajte. Na koncu navedite skupno število člankov in knjig, ki ste jih pregledali. Maribor, februar 2012 Ivan Krmpotić I

5 Zahvala Zahvaljujem se mentorju izr. prof. dr. Urošu Potočniku in somentorici mag. Evgeniji Homšak za koristne napotke in za spremljanje ob izdelavi diplomskega dela. Prav tako se zahvaljujem Vilmi Šuštar, prof. mat. za pomoč pri statistični obdelavi podatkov ter ga. Majdi Štefanič za izvedbo meritev ELISA, katerih rezultate smo uporabili v diplomskem delu. Staršema se najlepše zahvaljujem za podporo pri študiju. II

6 Primerjava hitrega imunokemijskega testa z ELISA testom za določitev kalprotektina v blatu Povzetek Kalprotektin v blatu je nespecifični marker črevesnega vnetja in eden izmed parametrov, ki so pomembni v diagnostiki kronične vnetne črevesne bolezni. Uporaben je predvsem pri razlikovanju med kronično vnetno črevesno boleznijo in sindromom razdražljivega črevesja (IBS). Namen naloge je bila primerjava hitrega imunokromatografskega testa z, v rutinski diagnostiki že uveljavljenim testom ELISA, za merjenje proteina kalprotektina v blatu. V delu smo primerjali rezultate semikvantitativne imunokromatografske metode z rezultati kvantitativne metode ELISA. Kot statistično orodje za primerjavo obeh testov med seboj smo uporabili vrednotenje z diagnostično občutljivostjo in diagnostično specifičnostjo. Preverili smo tudi ujemanje rezultatov glede na podane intervale hitrega testa z kvantitativnimi rezultati ELISA testa. Pri primerjavi obeh testov glede na koncentracijske razrede, smo ugotovili najvišje ujemanje pri nizkih koncentracijah (do 15 µg/g). Ujemanje glede na ELISA je bilo kar 97%. V razredu od 15 µg/g do 60 µg/g je bilo ujemanje 17%, nad 60 µg/g smo ugotovili 79% ujemanje. Ob predlagani mejni vrednosti ELISA 50 µg/g smo določili s statistično analizo 100% diagnostično občutljivost hitrega testa glede na ELISA, diagnostična specifičnost je bila 92,3%. Ko smo mejno vrednost ELISA povišali na 60 µg/g, se rezultati niso bistveno spremenili. Diagnostična občutljivost hitrega testa glede na ELISA je ostala 100%, diagnostična specifičnost je znašala 85,7%. Hitri test je primerljiv z ELISA pri opredeljevanju negativnih vzorcev, njegova kvantitativna zanesljivost pri nizkih koncentracijah (nivo kalprotektina pod 15 µg/g) nakazuje na njegovo uporabnost pri izključitvi suma na vnetni proces v črevesni sluznici. Če hitri test pokaže pozitiven rezultat je potrebna nadaljnja diagnostika, predvsem napotitev na testiranje z ELISA, saj hitri test ne izmeri koncentracij kalprotektina nad 60 µg/g. Poznavanje natančnih koncentracij v tem območju je pomembno pri bolnikovi obravnavi. Ob negativnem rezultatu vzorca blata ni potrebno pošiljati v diagnostični laboratorij na nadaljnje preiskave, ki bi bile povezane z ugotavljanjem prisotnosti črevesnega vnetja. Ključne besede: kalprotektin, ELISA, hitri test, KVČB, IBS, primerjava UDK: 616.3(043.2) III

7 A comparison of rapid immunochemical test with ELISA test for determination of calprotectin in faeces Abstract Faecal calprotectin is a non specific marker of intestinal inflammation and one of the parameters that are important in the diagnostics of inflammatory bowel disease (IBD). Its most important application is in its ability to distinguish between IBD and IBS (irritable bowel syndrome). The goal of our thesis was to compare a rapid immunochromatographic test with an ELISA test, which is already well established in routine diagnostics for determining levels of faecal calprotectin. In the thesis we compared the results of semikvantitative immunocromathographic method with kvantitative ELISA method. As a statistical tool for comparing both tests we used evaluation with diagnostic sensitivity and diagnostic specificity. We also compared the results of both tests in terms of given intervals of the rapid test with kvantitative results of ELISA. As we compared both tests in terms of concentration intervals we found highest accordance at the low concentrations (below 15 µg/g) where it was 97%. In the interval between 15 µg/g and 60 µg/g we found 17% accordance and in the interval above 60 µg/g accordance was 79%. At the suggested cut off value for ELISA 50 µg/g we got 100% diagnostic sensitivity of the rapid test compared to ELISA, diagnostic specificity was 92,3%. At elevated cut off value for ELISA, 60 µg/g there was no significant change in the test results. Diagnostic sensitivity of the rapid test compared to ELISA remained 100%, diagnostic specificity was 85,7%. In our thesis we find the rapid test to be comparable to ELISA in evaluation of negative samples, its kvantitative accurateness at low concentrations (below 15 µg/g) points to its usefulness at exclusion of suspected inflammatory process in the intestinal mucosa. Positive test result obtained with the rapid test must be followed by further diagnostic procedures, firstly measurment of calprotectin with ELISA, as the rapid test cannot measure concentrations above 60 µg/g. Knowing the exact values of calprotectin concentrations in this interval is crucial for treatment of the patient. If the rapid test gives a negative test result there is no need for sending the faecal sample to the laboratory for further examinations regarding intestinal inflammation. Key words: calprotectin, ELISA, rapid test, IBD, IBS, comparison UDK: 616.3(043.2) IV

8 KAZALO 1. UVOD Kronična vnetna črevesna bolezen Značilnosti ulceroznega kolitisa in Chronove bolezni Ulcerozni kolitis Chronova bolezen Zunajčrevesni bolezenski znaki Zapleti KVČB Imunopatogeneza KVČB Zdravljenje KVČB z zdravili Protivnetna zdravila Imuno-modulatorji Infliximab IBS - sindrom razdražljivega črevesa Diagnostika kronične vnetne črevesne bolezni Endoskopija z biopsijo Rentgensko kontrastna preiskava Radioizotopska preiskava Laboratorijske biokemijske in hematološke preiskave Določitev protiteles Kalprotektin v blatu Kalprotektin Kalprotektin kot vnetni označevalec pri drugih obolenjih Določanje kalprotektina v blatu Vezanje antigena s protitelesi Semikvantitativna imunokromatografska metoda Encimsko imunski test na trdnem nosilcu ELISA NAMEN DELA MATERIALI IN METODE Materiali Vzorci Oprema in materiali Metode dela Metode določanja kalprotektina V

9 ELISA Hitri semikvantitativni imunokromatografski test Statistična obdelava podatkov REZULTATI Rezultati ELISA Rezultati»hitrega«semikvantitativnega imunokromatografskega testa Diagnostična vrednost testa CalDetect kot presejalnega testa glede na različne mejne vrednosti ELISA testa Ponovljivost meritev hitrega testa Razvrstitev rezultatov glede na koncentracijske razrede RAZPRAVA Razprava o rezultatih Primerjava z drugimi sorodnimi raziskavami Smiselnost uporabe obeh testov Zaključek SKLEP LITERATURA VI

10 SEZNAM SLIK IN TABEL Slika 1 : Shema prizadetih predelov prebavnega trakta. Chronova bolezen (a) in ulcerozni kolitis (b)... 2 Slika 2 : Shema histoloških značilnosti. Chronova bolezen (a) in ulcerozni kolitis (b)... 2 Slika 3 : Sekundarna struktura kalprotektina Slika 4 : Vezanje antigena s protitelesi v imunski kompleks pri sendvič ELISA Slika 5 : Metoda sendvič ELISA v laboratoriju Slika 6 : Kalibracija standardov in generiranje umeritvene krivulje pri sendvič ELISA Slika 8 : Interpretacija rezultatov hitrega testa CalDetect Slika 9 : Uporaba hitrega testa Slika 10 : Rezultati ELISA, mejna vrednost 50 µg/g in 60 µg/g Slika 11 : Razporeditev rezultatov hitrega testa po stopnjah Slika 12 : Razporeditev rezultatov hitrega testa glede na mejno vrednost Slika 13 : Razporeditev rezultatov hitrega testa, mejna vrednost za ELISA je 50 µg/g Slika 14 : Razporeditev rezultatov hitrega testa, mejna vrednost za ELISA je 60 µg/g Slika 15 : Graf razpršenosti rezultatov ELISA glede na stopnjo hitrega testa Slika 16 : Diagnostični parametri hitrega testa glede na ELISA, mejna vrednost Slika 17 : Diagnostični parametri hitrega testa glede na ELISA, mejna vrednost Slika 18 : Semikvantitativno ujemanje hitrega testa z ELISA Slika 19 : Ujemanje hitrega testa z ELISA glede na koncentracijske razrede Tabela 1 : Razlike v kliničnih znakih med ulceroznim kolitisom in Chronovo boleznijo [2]... 3 Tabela 2 : Nanos standardov, kontrol in vzorcev na ploščo reagenčnih mikrokivet Tabela 3 : Vrednosti kalprotektina pri različnih kliničnih slikah [16] Tabela 4 : Rezultati ELISA, mejna vrednost 50 µg/g Tabela 5 : Rezultati ELISA, mejna vrednost 60 µg/g Tabela 6 : Rezultati»hitrega«semikvantitativnega imunokromatografskega testa Tabela 7 : Razporeditev rezultatov hitrega testa glede na ELISA, mejna vrednost za ELISA je 50 µg/g Tabela 8 : Razporeditev rezultatov hitrega testa glede na ELISA, mejna vrednost za ELISA je 60 µg/g Tabela 9 : Tabela razpršenosti rezultatov ELISA glede na stopnjo hitrega testa Tabela 10 : Razporeditev rezultatov za izračun diagnostičnih parametrov hitrega testa glede na ELISA, mejna vrednost za ELISA je 50 µg/g Tabela 11 : Razporeditev rezultatov za izračun diagnostičnih parametrov hitrega testa glede na ELISA, mejna vrednost za ELISA je 60 µg/g Tabela 12 : Semikvantitativno ujemanje rezultatov hitrega testa in razporeditev rezultatov po intervalih Tabela 13 : Semikvantitativno ujemanje rezultatov hitrega testa z ELISA VII

11 SEZNAM KRATIC KVČB ELISA CB UC IBS ANCA ASCA Ag Pt kronična vnetna črevesna bolezen encimsko imunska metoda na trdnem nosilcu Chronova bolezen ulcerozni kolitis sindrom raždražljivega črevesa antinevtrofilna citoplazemska protitelesa anti-sacchromyces cerevisiae protitelesa antigen protitelo VIII

12 1. UVOD 1.1. Kronična vnetna črevesna bolezen KVČB (kronična vnetna črevesna bolezen) je skupina kroničnih vnetnih bolezni, ki prizadenejo gastrointestinalni trakt, predvsem črevesje. Glavni podskupini sta Chronova bolezen in ulcerozni kolitis. Zanjo je značilen, običajno, doživljenjski potek z akutnimi zagoni ter vmesnimi krajšimi ali daljšimi remisijami. Najpogosteje se bolezen prvič pojavi v mladosti (med 20. in 30. letom), vendar pa za njo obolevajo ljudje v vseh starostnih obdobjih. V Sloveniji je incidenca za ulcerozni kolitis 5/ , za Chronovo bolezen pa 3,6/ KVČB se pojavlja pogosteje pri belcih, najpogosteje pri Židih.[1] Ulcerozni kolitis je pri ženskah nekoliko pogostejši, medtem ko pri Chronovi bolezni oba spola obolevata približno enako pogosto Značilnosti ulceroznega kolitisa in Chronove bolezni Ulcerozni kolitis Ulcerozni kolitis prizadene praviloma samo debelo črevo (Slika 1 b). Vedno je prizadet rektum (ulcerozni proktitis). Vnetni proces se običajno širi v sigmo in descendentni kolon ter pogosto prizadene celotno debelo črevo (ulcerozni pankolitis). Vnetne spremembe so vedno kontinuirane, osnovno patološko dogajanje je vnetna reakcija, ki primarno prizadene samo sluznico in le v manjši meri sega še v submukozo. Sluznica postane makroskopsko edematozna, pordela in izgubi sijaj, pojavijo se manjše pikčaste ulceracije, ki mezeče krvavijo.[1] Histološko so značilne degenerativne spremembe s propadanjem črevesnega epitelija (Slika 2 b) in infiltracijo sluznice z nevtrofilci, izguba površinskih epitelijskih celic in drobne ulceracije. Zaradi prestopanja levkocitov v kripte pride do nastanka drobnih kriptnih abscesov. V sluznici propadejo čašaste celice. Značilna je hiperplazija žilja v sluznici, zaradi česar je značilno povečana nagnjenost h krvavitvam.[1] Klinična slika se kaže v obliki številnih krvavo sluzastih iztrebljanj, bolečin v trebuhu, zvišane telesne temperature, anemije in hujšanja. Blaga oblika bolezni poteka pri polovici bolnikov. Prizadeta sta rektum ali pa rektum in sigma. Pri hudi obliki je običajno prizadeto celotno debelo črevo, značilna so številna krvavo sluzasta in gnojna iztrebljanja, visoka telesna temperatura in trebušni krči. Zaradi izgube vode, elektrolitov in krvi nastopi progresivna izsušenost, anemija, hujšanje in hipoalbuminemija Chronova bolezen Pri Chronovi bolezni lahko bolezenski proces zajame vse dele prebavne cevi, od sluznice v ustni votlini do anusa. V zgornjih prebavilih je bolezen redka, najpogosteje sta prizadeta terminalni ileum in/ali debelo črevo. Vnetni proces v nasprotju z ulceroznim kolitisom zajame vse sloje črevesne stene. Bolezen se začenja v globljih slojih črevesa vključno z mezenterijem in regionalnimi bezgavkami. Makroskopske spremembe na površini sluznice so zelo različne in so običajno odsev dogajanj v globljih plasteh stene prebavne cevi (Slika 2a). 1

13 Za bolezen so značilne nepravilne, vzdolžne, včasih zvezdaste in globoke srpaste ulceracije, ki lahko prodirajo v submukozo in mišični sloj. Tvorijo se tudi za Chronovo bolezen značilne globoke fisure, pogosti so še abscesi v črevesni steni in fistule med svetlino vnetnega dela črevesa ter organi v okolici (koža, nožnica, sečni mehur). Za to bolezen so značilne zožitve prebavne cevi in lahko pride tudi do popolne zapore. Približno ena tretjina bolnikov s Chronovo boleznijo ima prizadet terminalni ileum, druga tretjina kolon, tretja tretjina pa oba predela (Slika 1 a). Bolezenski simptomi so odvisni od anatomske lokalizacije vnetja, njegove intenzivnosti, zoževanja črevesne svetline in prehajanja vnetnega procesa na sosednje organe. Bolezen prizadene najpogosteje mlade ljudi, tudi otroke. Začetni znaki so: utrujenost, hujšanje, rahlo povišana telesna temperatura, driske s primesmi krvi in sluzi ter bolečina v trebuhu. Bolezen praviloma poteka kronično. Včasih so prvi znaki bolezni zunajčrevesni, simptomi s strani prebavil se pojavijo šele kasneje. [1,2] Slika 1 : Shema prizadetih predelov prebavnega trakta. Chronova bolezen (a) in ulcerozni kolitis (b) Slika 2 : Shema histoloških značilnosti. Chronova bolezen (a) in ulcerozni kolitis (b) 2

14 Ulcerozni kolitis in Chronova bolezen se razlikujeta v kliničnih znakih (Tabela 1). Razlike se kažejo v prisotnosti krvi in sluzi v blatu, sistemskih znakih ter prisotnosti bolečine. Fistule so bolj pogoste pri Chronovi bolezni, prav tako obstrukcija kolona in tankega črevesa. Chronova bolezen se bolje odziva na zdravljenje z antibiotiki kakor ulcerozni kolitis, prav tako se Chronova bolezen pogosteje kot ulcerozni kolitis vrne po operativnem posegu. Oba podtipa KVČB kažeta prisotnost različnih serumskih označevalcev (ANCA - antinevtrofilna citoplazemska protitelesa pogosteje določimo pri ulceroznem kolitisu, ASCA - anti- Sacchromyces cerevisiae protitelesa pa so pogosteje prisotna pri Chronovi bolezni). Tabela 1 : Razlike v kliničnih znakih med ulceroznim kolitisom in Chronovo boleznijo [2] Ulcerozni kolitis Kri v blatu Da Občasno Sluz Da Občasno Sistemski simptomi Občasno Pogosto Bolečina Občasno Pogosto Izrazita perianalna bolezen Ne Pogosto Fistule Ne Da Obstrukcija tankega črevesa Ne Chronova bolezen Pogosto Obstrukcija kolona Redko Pogosto Odziv na zdravljenje z antibiotiki Povratek bolezni po operaciji Ne Ne ANCA-pozitiven Pogosto Redko ASCA-pozitiven Redko Pogosto Da Da Zunajčrevesni bolezenski znaki Potrebno je natančneje omeniti zunajčrevesne bolezenske znake, saj ti veliko prispevajo k bolj kompliciranemu poteku bolezni. Pri obeh oblikah bolezni najdemo izvenčrevesna znamenja pri 10-15% obolelih. Najpogosteje gre za komplikacije, ki zadevajo kožo, sklepe, hrbtenico, oči, jetra in žolčne kanale. Bolezenska stanja na koži vključujejo boleče pike na nogah (erythema nodosum) in ulcerozno kožno stanje, ki se navadno pojavi okrog gležnjev (pyoderma gangrenosum). Boleče očesne komplikacije (uveitis, episcleritis) lahko povzročajo težave z vidom. Artritis lahko povzroča bolečino, otekline in okorelost sklepov. Vnetje križnega predela hrbta in hrbtenice (ankilozirajoči spondilitis) povzročata bolečino in okorelost hrbtenice. Jetrne komplikacije vključujejo pojav hepatitisa oziroma ciroze. [1, 2, 3] 3

15 Zapleti KVČB Pri ulceroznem kolitisu se pojavljajo vnetja analnega kanala, prolaps rektalne sluznice in hemoroidi, pri Chronovi bolezni pa najpogosteje fisure, perianalne fistule in abscesi. Toksični megakolon je najhujši in najpomembnejši zaplet ulceroznega kolitisa in je običajno najhujša stopnja bolezni. Če se pojavijo še lokalne nekroze z perforacijo gre za resno komplikacijo, ki zahteva operacijski poseg. Pri bolnikih z ulceroznim kolitisom se pojavlja kolorektalni karcinom pogosteje kot pri preostalem prebivalstvu. [1] Imunopatogeneza KVČB V zadnjih 20ih letih je bil viden velik napredek v razumevanju imunologije, genetike in mehanizma nastanka tkivnih poškodb pri kronični vnetni črevesni bolezni. Iz leta v leto se razumevanje tega izredno kompleksnega področja širi in nadgrajuje. Uvidi v patogenezo KVČB so osnova vseh novih terapevtskih strategij. Ključno je razumevanje genetske dovzetnosti ter povezave genetike z vlogo bakterijske flore pri avtoimunem vnetnem odzivu. Do nedavnega je bila glavna hipoteza, da gre za prekomeren imunski odziv celic T pomagalk tipa 1 in inhibirano apoptozo teh celic v lamini propriji [4]. Novejše raziskave [5] predlagajo drugačno sliko imunopatogeneze pri kateri ni nujno da gre za prekomeren imunski odziv, temveč je predpostavka, da je odziv oslabljen in neprimeren. Glavni gen asociiran s KVČB je NOD2/CARD15, njegova funkcija je med drugim prepoznavanje mikrobnih produktov. Podatki o ekspresiji tega gena nakazujejo, da bi lahko bili makrofagi in epitelijske celice mesto primarnega patofiziološkega defekta in da obstaja možnost, da je T celična aktivacija le sekundarni efekt, ki inducira kronifikacijo vnetja. Morda je celo T celična aktivacija le pomožni mehanizem k neustrezni prirojeni imunosti. Vloga normalne in patogene flore pri vodenju vnetnega odziva je predmet sodobnih raziskav. Dognanja so privedla do sovpadanja»genetskega«in»bakterijskega«koncepta. Bakterije so člen, ki povezuje okolje in sluznični obrambni sistem. V lezijah kolona Chronovih bolnikov je bila najdena bakterija E.coli [4,5], dodatna ugotovitev je, da je pri CB bolnikih povečana translokacija bakterij v globlje sloje sluznice. Povečan vdor bakterij v sluznico bi lahko bil posledica neučinkovitega prirojenega odziva, zaradi mutacije in okvare NOD2 [5]. Neprimerni imunski odziv poškoduje sluznico in s tem dovoli vstop še večim bakterijam iz črevesne svetline. Tako je vzpostavljen začaran krog vzrokov in pozročitve okvar ter obvladovanja le teh. [4] Mukozna plast pri zdravih ljudeh loči in preprečuje kontakt bakterij z epitelijskimi celicami. Pri KVČB je ta pregrada porušena, zato je opazna kolonizacija mukusa z bakterijami. [5] Pri razumevanju Chronove bolezni in ulceroznega kolitisa je torej potrebno upoštevati genetske, imunološke in faktorje okolja (kajenje, prehrana, stres). Dosedanji rezultati raziskav so privedli do odkritja novih zdravil, kot je infliximab, ki je predstavljal bistveno spremembo v zdravljenju težkih oblik KVČB. V prihodnosti se vlaga veliko upanje v klinično aplikacijo dognanj, ki se tičejo genetike KVČB. 4

16 Zdravljenje KVČB z zdravili Osnovni namen zdravljenja KVČB je prekinitev akutnega zagona bolezni in nato vzdrževanje remisije. Pred začetkom zdravljenja je potrebno poznati anatomsko lego in razširjenost bolezni ter njeno aktivnost. Zdravila za zdravljenje Chronove bolezni vključujejo protivnentna zdravila, kot so zdravila na osnovi 5-ASA in kortikosteroide ter biološka zdravila, kot so topični antibiotiki in imunomodulatorji. [1,3] Protivnetna zdravila Med protivnetna zdravila uvrščamo spojine na osnovi 5 aminosalicilne kisline (5-ASA) kot so sulfasalazin (Azulfidine) in mesalazin (Pentasa, Asacol, Dipentum, Colazal, Rowasa), ki delujejo topično na vneto tkivo. Kortikosteroidi so protivnetna zdravila, ki delujejo sistemsko. Sistemski kortikosteroidi imajo pomembne in predvidljive stranke učinke, če se jih uporablja na dolgi rok. V novejši razred topičnih kortikosteroidov uvrščamo budezonid. Ta tip kortikosteroidov ima manj stranskih učinkov kot jih imajo sistemski kortikosteroidi, ki se absorbirajo v telo Imuno-modulatorji Imuno-modulatorji zmanjšajo vnetje tkiva s tem, da znižajo populacijo imunskih celic oziroma ovirajo njihovo izdelavo proteinov. Zmanjšanje aktivnosti imunskega sistema z imunomodulatorskimi agenti poveča možnost infekcije; vendar pa, koristi obvladanja zmerne do hude Chronove bolezni navadno pretehtajo tveganje za infekcijo zaradi oslabljene imunosti.[3] Primeri imuno modulatorskih zdravil so: 6-merkaptopurin (6-MP), azatioprin (Imuran), metotreksat (Rheumatrex, Trexall), infliximab (Remicade), adalimumab (Humira), certolizumab (Cimzia) in natalizumab (Tysabri) Infliximab Infliximab je protitelo za TNF-α. TNF-α je protein, ki ga izražajo aktivirane imunske celice in stimulira vnetje. Je najpomembnejši mediator vnetja pri Chronovi bolezni. Infliximab se veže na TNF-α in s tem vnetje zmanjša. Gre za himerno človeško-murinsko monoklonsko protitelo, ki se z veliko afiniteto veže na topne in transmembranske receptorje TNF-α. Pridobivajo ga tako, da mišim vbrizgajo človeški TNF-α. Mišja protitelesa nato modificirajo, da so bolj podobna človeškim. To modificirano protitelo je infliximab. Infliximab je namenjen zdravljenju zmerne do hude oblike Chronove bolezni tistih pacientov, ki se ne odzivajo primerno na kortikosteroide, azatioprin ali 6-MP.[3] Infliximab je učinkovito in hitro delujoče zdravilo. V skupini tistih pacientov, ki se niso odzivali na kortikosteroide in oralne imunomodulatorje, se je 65% bolnikom stanje izboljšalo po eni infuziji infliximaba. Pri tistih, ki se odzivajo na infliximab pride do izboljšanje simptomov in hitrega celjenja razjed, uspešen pa je tudi pri zdravljenju fistul. Večini bolnikov, ki so se odzvali na na prvo infuzijo infliximaba, se bolezen povrne znotraj treh mesecev. Vendar, študije so pokazale, da so ponavljajoče se infuzije, vsakih 8 tednov, varne in učinkovite pri vzdrževanju remisij, ki trajajo od enega do dveh let. 5

17 Stranski učinki infliximaba vključujejo : bolečine v prsih, zadihanost, slabost, glavobol in infekcije zgornjega respiratornega trakta. V redkih primerih pride do pljučnice, tuberkoloze in optičnega nevritisa. [1,3] Ker je infliximab delno mišji protein, lahko nekateri pacienti razvijejo protitelesa, ki zmanjšajo njegovo učinkovitost. Verjetnost, da se to zgodi se zmanjša z sočasno uporabo 6-MP in kortikosteroidov IBS - sindrom razdražljivega črevesa Sindrom razdražljivega črevesa je najpogostejša funkcionalna bolezen prebavil, ki prizadene kar 13 odstotkov odrasle populacije. Ženske obolevajo dva do trikrat pogosteje kot moški. [2] V ZDA je IBS razlog za 35 odstotkov obiskov pri gastroenterologu. Bolezen delimo na štiri podskupine glede na vodilni simptom: IBS s prevladujočo bolečino, IBS s prevladujočim zaprtjem, IBS s prevladujočo drisko ter IBS z izmenjavanjem driske in zaprtja. [1] Glavni klinični znaki IBS so kronična, ponavljajoča se abdominalna bolečina ali nelagodje povezano z motenimi prebavnimi navadami - ob izostanku strukturnih abnormalnosti, ki bi te simptome povzročale. Simptomi so velikokrat podobni simptomom kronične vnetne črevesne bolezni in bi naj trajali vsaj 6 mesecev pred dokončno diagnozo, s tem kriterijem ločimo IBS od kratkotrajnih infekcij ali črevesnega karcinoma.[6] Diagnostika IBS je predvsem izključitvena, saj zanjo ne obstaja noben specifični bolezenski označevalec. Pripomoček pri diagnozi so merila ROMA II, ki temeljijo na kliničnih simptomih. Z natančno anamnezo, rektalnim digitalnim pregledom in osnovnimi laboratorijskimi preiskavami (rdeča krvna slika, železo v serumu in hematest v blatu) se poskuša izključiti organske vzroke prebavnih motenj [1]. Kot novejši označevalec se za to nalogo uporablja kalprotektin v blatu. Le majhen odstotek bolnikov z abdominalnimi težavami ima organsko bolezen. S preprostimi kliničnimi preiskavami je težje postaviti pravilno diagnozo, zato je določanje kalprotektina v blatu primerna metoda za razlikovanje med organskimi in funkcionalnimi boleznimi. Kalprotektin se presežno izloča pri KVČB, ampak ne pri IBS. [7,8,9] Njegova glavna klinična aplikacija je razlikovanje IBS od KVČB in spremljanje aktivnosti KVČB. 6

18 1.3. Diagnostika kronične vnetne črevesne bolezni Diagnostika KVČB temelji na že omenjenih kliničnih znakih in simptomih: kronična driska z ali brez primesi krvi, bolečine v trebuhu, pogosto pa tudi na sistemskih znakih vnetja. Prav tako je potrebno upoštevati zunajčrevesne bolezenske znake, pri Chronovi bolezni pa še znake malabsorpcije ter perianalne bolezenske spremembe. KVČB se diagnosticira z endoskopskimi metodami, rentgensko kontrastnimi preiskavami, radioizotopsko preiskavo, CT slikanjem in laboratorijskimi preiskavami Endoskopija z biopsijo Endoskopija je natančna preiskovalna metoda pri detekciji manjših razjed ali manjših območij vnetja kolona in terminalnega ileuma.[1] Začetna endoskopska instrumentalna metoda se imenuje rektosigmoidoskopija in prikaže prisotnost vnetnih sprememb, njihovo intenzivnost in obseg. Naredijo se tudi biopsije iz vnete sluznice, pri sumu na Chronovo bolezen pa prav tako iz sluznice, ki je navidezno zdrava. Kolonoileoskopija je najobčutljivejša in najzanesljivejša preiskovalna metoda, ki omogoči pregled celotnega debelega in tudi končnega dela tankega črevesa. S preiskavo lahko natančno določijo spremembe v sluznici, njihovo razširjenost in intenzivnost. Z biopsijskimi kleščami se odvzamejo vzorčki tkiva za histopatološki pregled. S kolonoskopom se lahko pride globoko v terminalni ileum, kjer pri Chronovi bolezni tega segmenta najdejo podobne spremembe kot v kolonu. [1] Kot novejša endoskopska metoda se uporablja endoskopija s pomočjo video kapsule. Za izvedbo video kapsulne endoskopije pacient pogoltne kapsulo, ki vsebuje miniaturno kamero. Ko kamera potuje skozi tanko črevo, pošilja video posnetke prejemniku, ki ga pacient nosi okrog pasu. Ti posnetki se nato pregledajo na računalniku. Vrednost endoskopije s pomočjo video kapsule je, da lahko identificira zgodnje, blage abnormalnosti Chronove bolezni. [3] Še posebej je koristna, ko obstaja močan sum na prisotnost Chronove bolezni, vendar pa so barijeve rentgenske slike normalne. V preiskavi so pokazali, da je endoskopija s pomočjo kapsule superiorna od radiografskih študij in CT slikanj tankega črevesa. Ta vrsta endoskopije je kontraindicirana pri bolnikih, ki imajo obstrukcijo tankega črevesa, strikture tankega črevesa ali pa uporabljajo srčne spodbujevalnike in defibrilatorje.[3] Rentgensko kontrastna preiskava Barijeve rentgenske preiskave se uporabljajo za opredelitev porazdelitve, narave in stopnje črevesne bolezni. Če je barij vzet oralno (slikanje zgornjih prebavil) dobimo slike želodca in tankega črevesa. Barijev klistir daje slike kolona in terminalnega ileuma. Slike kažejo razjede, zožitve ter črevesne fistule. Irigografija (rentgenska preiskava debelega črevesa) je v času fibroptične in videoendoskopije izgubila svoj nekoč odločilni pomen. Uporablja se le, kadar kolonoskopija ni mogoča ali je kontraindicirana. V začetni fazi bolezni je irigografija popolnoma neznačilna, 7

19 ker se radiološke značilnosti pojavijo šele kasneje. Chronov kolitis je rentgensko nemogoče ločiti od ulceroznega kolitisa. Jejunoileografija in enterokliza sta rentgensko kontrastni preiskavi tankega črevesa. Z njima se da ugotoviti togost prizadetega predela, edem, ulceracije, sluznico s podobo tlakovane ceste, fistule med sosednjimi črevesnimi vijugami in organi, pogosto tudi močno zoženo in neravno svetlino. [1,3] Radioizotopska preiskava Radioizotopska preiskava z označenimi levkociti je dopolnilo endoskopskim in rentgenskim tehnikam. Z njo lahko dobro ocenijo lokalizacijo, intenzivnost in razširjenost vnetja ter odkrijejo abscese. Preiskava je po natančnosti primerljiva z endoskopsko metodo in je bolj specifična za Chronovo bolezen. Indicirana je v akutni fazi, kjer sta kolonoileoskopija in irigografija kontraindicirani. Uporablja se tudi za oceno uspešnosti zdravljenja bolezni. [1,3] Laboratorijske biokemijske in hematološke preiskave Laboratorijske biokemijske preiskave so diagnostično nespecifične in so odsev trajanja bolezni, njene razširjenosti, intenzivnosti vnetja in krvavitev ter tudi malabsorpcije. Preiskave pogosto prikazujejo levkocitozo, trombocitozo, povišane vrednosti SR, CRP in orosomukoida (proteina akutne faze vnetja). Anemija, če je prisotna, je posledica krvavitev in pomanjkanja železa zaradi krvavitev in kroničnega vnetja. Pri Chronovi bolezni tankega črevesa pa je anemija tudi posledica malabsorpcije železa, vitamina B 12 in folatov. Hipoalbuminemija je posledica kroničnega vnetja, malabsorpcije aminokislin ter obilne izgube proteinov skozi vneto sluznico. Prisotne so tudi motnje elektrolitskega ravnotežja. Patološki jetrni testi so posledica sprememb v jetrih. [1,2,3] Določitev protiteles V serumu bolnikov s KVČB določamo tudi prisotnost različnih protiteles. V diagnostiki UC se določajo predvsem panca (perinuklearna antinevtrofilna citoplazemska protitelesa) in GAB (protitelesa proti čašastim celicam). V diagnostiki Chronove bolezni pa panca, PAB (protitelesa proti eksokrinemu pankreasu) in ASCA (anti-sacchromyces cerevisiae protitelesa). Poseben podtip panca protiteles je povezan z ulceroznim kolitisom. Antigeni proti katerim so ta protitelesa usmerjena še niso bili identificirani, so pa različni od tistih, ki jih povezujejo z vaskulitisom. [1] Pozitivnost na panca se pojavlja pri 60-70% bolnikov z ulceroznim kolitisom in 5-10% bolnikov s Chronovo boleznijo. 5-15% bližnjih sorodnikov bolnikov z ulceroznim kolitisom ima pozitiven panca test, medtem ko je samo 2-3% splošne populacije panca pozitivne.[1] panca v Chronovi bolezni je povezana z boleznijo kolona, ki je podobna ulceroznem kolitisu.[1,8] ASCA protitelesa prepoznajo manozne sekvence v celični steni S.cerevisiae % Chronovih bolnikov, 10-15% bolnikov z ulceroznim kolitisom in do 5% ne-kvčb kontrol je ASCA pozitivnih. [1] 8

20 Kalprotektin v blatu Kalprotektin izločajo z antigenom stimulirani nevtrofilci in je pokazatelj črevesnega vnetja, ne glede na vzrok. Poleg povišanih vrednosti pri bolnikih z KVČB, zaznamo visok nivo tega proteina tudi pri gastrointestinalnih infekcijah, NSAID enteropatijah, malignih tvorbah, kolorektalni neoplaziji, gastrointestinalnih krvavitvah in pri sorodnikih bolnikov s KVČB. [10,11] Kalprotektin Mieloidu podobna protein 8 (Myeloid-related protein 8, MRP8) in 14 (MRP14) sta kalcijvezavna proteina družine S100, ki tvorita heterodimer, znan kot kalprotektin oziroma MRP8/14. Ta je prisoten v citosolu nevtrofilcev in monocitov. [12] MRP8/14 se povezuje z endotelijem na adhezivnih in transmigracijskih mestih monocitov in nevtrofilcev ter inducira trombogeni in vnetni odziv z povečanjem endotelijske transkripcije proinflamatornih kemokinov in adhezijskih molekul. Porazdelitev MRP8/14 med nevtrofilnimi granulami in plazemskimi membranami je nejasna in raziskave potekajo, s katerimi bi bolje razumeli vpliv te molekule pri akutnem vnetju. [12] Kalprotektin je bil najprej opisan s strani Fagertola leta Povišane koncentracije so izmerljive v plazmi, cerebrospinalni tekočini, sinovialni tekočini, urinu in fecesu, kadar je prisotno vnetje ali ko gre za maligna stanja. Povišane koncentracije fekalnega kalprotektina (FC) so bile določene tako v gastričnem kot kolorektalnem raku, kakor tudi pri KVČB. Visoke koncentracije določene pri KVČB lahko pojasnimo s povišano migracijo nevtrofilcev v črevesni lumen. [13] Kalprotektin je protein, ki se nahaja v citoplazmi nevtrofilnih granulocitov (30-60%), monocitov in makrofagov. Med procesom vnetja črevesne sluznice, kalprotektin izločajo z antigenom stimulirani nevtrofilci, kar privede do rasti njegove koncentracije v fecesu. Zaradi tega se koncentracija fekalnega kalprotektina uporablja kot marker črevesnega vnetja (marker črevesne sedimentacije). [7] Kalprotektin odlično razmejuje kronično vnetno črevesno bolezen od sindroma razdražljivega črevesa (IBS) in s tem omogoča izognitev invazivne diagnostike pri IBS [7]. IBS ima namreč velikokrat podobne simptome kot KVČB, vendar pa ni strukturnih abnormalnosti, ki bi te simptome povzročale.[6] Kalprotektin prav tako dobro označi neaktivno oziroma aktivno fazo KVČB in s tem omogoči pravočasno prilagoditev terapije - preden nastopi vidno klinično poslabšanje. [7] Vrednosti FC se lahko uporabijo za oceno odziva na zdravljenje bolezni, za spremljanje asimptomatskih pacientov in za napovedovanje poslabšanj KVČB. [13] Kalprotektin natančneje napove ponovitev poslabšanja bolezni pri ulceroznem kolitisu kot pri Chronovi bolezni. Klinični potek vnetnih črevesnih bolezni je karakteriziran z nizem poslabšanj in remisij. Interakcija monocitnega kalprotektina z aktiviranim endotelijem vodi do njegovega sproščanja (Frosch et al. 2000), kar je verjetno vzrok za visoke koncentracije kalprotektina v telesnih tekočinah bolnikov z akutnimi ali kroničnimi vnetnimi boleznimi. Sproščen 9

21 kalprotektin bi lahko sodeloval pri vnetju z stopnjevanjem ekspresije CD11b v monocitih in s sodelovanjem pri transendotelijskem migracijskem mehanizmu. [14] Ob nevtrofilski aktivaciji ali adheziji monocitov na endotelij, se kalprotektin sprošča in lahko doprinese, ne samo bakteriostatski, ampak tudi citokinom podoben učinek v lokalnem okolju. Kadar je metabolizem kalprotektina prizadet na sistemskem nivoju, lahko cink-vezujoče lastnosti proteina povzročijo močno porušenje homeostaze cinka. To vodi do resnih kliničnih simptomov. Obstajajo različni dokazi, ki kažejo pomembnost kalprotektina v obrambnih mehanizmih in fizioloških funkcijah imunskega sistema. Kalprotektin se je pokazal klinično uporaben, kot vnetni marker ne le v gastroenterologiji, kjer je neinvaziven parameter za spremljanje patoloških procesov v sluznici, temveč tudi kot zelo občutljiv in ne-specifičen vnetni marker v raznovrstnih kliničnih okvirih. [7] Prednost določanja kalprotektina v blatu je v tem, da je v neposrednem stiku s črevesnim tkivom, to je mestom vnetja, in se ga da meriti na neinvaziven način. Prednost je tudi njegova obstojnost, na sobni temperaturi je obstojen sedem dni Kalprotektin kot vnetni označevalec pri drugih obolenjih Povišan nivo serumskega kalprotektina je lahko del različnih imunskih in imunopatoloških reakcij, še posebej je prisoten pri akutnem vnetju ali pri Th 1 mediiranih odzivih. V nekaterih pogledih občutljivost in dinamika kalprotektina presegata tradicionalne vnetne markerje, kot je npr. C-reaktivni protein (CRP). Transplantacija organov Pokazano je bilo, da se pri bakterijski okužbi alografskih prejemnikov ledvic ali srca serumski nivo kalprotektina naglo poviša. [14] Koncentracija serumskega kalprotektina se poviša tudi med procesom akutne zavrnitve. Kalprotektin bi lahko bil zelo občutljiv marker za komplikacije pri presaditvi organov, še posebej v kombinaciji z drugimi vnetnimi markerji, kot je prokalcitonin, ki je izrazito specifičen za sistemske bakterijske infekcije. Pljučne bolezni Kalprotektin je koristen marker pri zelo zgodnji stopnji vnetnih reakcij v človeških pljučih. Zdi se, da je primerljiv s CRP pri razlikovanju med bakterijskimi in virusnimi okužbami. Od kratni nivo kalprotektina je pogosto viden med življenjsko ogrožujočimi okužbami, kot so septikemija, meningitis ali pljučnica. Bolniki z aktivno tuberkolozo so imeli značilno povišan plazemski kalprotektin v primerjavi z bolniki s pljučno sarkoidozo in zdravimi kontrolami. [14] Revmatoidni artritis Revmatsko vnetje je posredovano predvsem preko aktiviranih proinflamatornih Th 1 celic. Koncentracija plazemskega kalprotektina se je izkazala kot primeren marker bolezenske aktivnosti in vnetja sklepov, vendar pa ni uporabna pri prognozi bolnikov z revmatoidnim artritisom. Pri mladostniškem revmatoidnem artritsu se zdi, da je kalprotektin boljši od konvencionalnih markerjev pri spremljanju patološke aktivnosti. [14] 10

22 Molekularni model prikazuje sekundarno strukturo kalprotektina (Slika 3). Testi za kalprotektin v vzorcih blata lahko razlikujejo med kroničnimi vnetnimi črevesnimi boleznimi (ang. IBD), kot so Chronova bolezen, nekaterimi rakastimi obolenji in ulceroznim kolitisom, kjer je nivo kalprotektina povišan in na drugi strani sindromom razdražljivega črevesa (ang. IBS), kjer je nivo kalprotektina normalen. Pri IBD je potrebno opraviti invazivne teste, medtem ko pri IBS to ni potrebno. Slika 3 : Sekundarna struktura kalprotektina 1.5. Določanje kalprotektina v blatu Vezanje antigena s protitelesi Reakcija med antigeni in protitelesi pri kateri nastanejo imunski kompleksi je osnova imunskim tehnikam, ki jih uporabljamo za kvantitativno in kvalitativno vrednotenje antigenov in protiteles v bioloških vzorcih. Večina antigenov so makromolekule, največkrat proteini. Kljub temu, da so v mnogih primerih natančno določili zgradbo proteinov, se o konformaciji antigenskih determinant (epitopov) ve le malo. Reakcija med antigenom in protitelesom je bimolekulsko vezanje, ki ne vodi do kemične spremembe ne antigena ne protitelesa. Izvrstna specifičnost reakcij antigen-protitelo je omogočila razvoj različnih imunskih preskusov za določitev antigena ali protiteles. [15] 11

23 Semikvantitativna imunokromatografska metoda Hitri test za določitev kalprotektina v blatu deluje na podlagi vezave antigen protitelo. Na testni ploščici so pritrjena za kalprotektin specifična monoklonalna protitelesa. Kontrolna linija se obarva ko jo preteče ekstrakcijski pufer. Kadar analit, zaradi kapilarne aktivnosti preteče testno linijo, se kalprotektin iz vzorca veže na pritrjeno protitelo, kar se pokaže kot rdeče obarvana testna linija. Interpretacija rezultata se izvede glede na število obarvanih testnih trakov Encimsko imunski test na trdnem nosilcu ELISA Princip testa temelji na reakciji antigen protitelo. Na podlago vezano protitelo (primarno Pt) veže antigen iz vzorca. Po dodatku sekundarnega protitelesa (signalno Pt), označenega z encimom pride do vezave na nastali imunski kompleks z antigenom in do nastanka trojnega»sendvič«imunskega kompleksa (Slika 4). Za detekcijo nastale reakcije je potrebno dodati še substrat, ki ga encim cepi. Pri tem je izmerjena absorbanca nastalega obarvanega produkta premosorazmerna s koncentracijo prisotnega analita v vzorcu. Osnovne komponente encimsko imunskega testa na trdnem nosilcu ELISA so: - (1) antigen, ki je dovolj velik da se lahko nanj istočasno vežeta dve protitelesi na dveh različnih vezavnih mestih. - (2) fiksirano protitelo usmerjeno na eno antigensko mesto na antigenu, to protitelo je pritrjeno na trdno fazo, da omogoči imunološko ekstrakcijo imunskega kompleksa - (3) signalno (sekundarno) protitelo usmerjeno na drug epitop na antigenu, na to protitelo je vezan označevalec encim. Za to metodo je značilen velik presežek vezavnih protiteles v primerjavi s koncentracijo antigena. Slika 4 : Vezanje antigena s protitelesi v imunski kompleks pri sendvič ELISA 12

24 V laboratoriju izvajamo metodo ELISA na sledeči način: v mikrotitrski posodici fiksiramo protitelo. Dodamo vzorec, ki vsebuje antigen in pustimo da reagira z vezanimi protitelesi. Ko posodico speremo, dodamo drugo z encimom vezano protitelo, specifično za drug epitop na antigenu in pustimo, da reagira z vezanim antigenom. S spiranjem odstranimo prosto drugo protitelo. Dodamo substrat in izmerimo obarvan produkt reakcije. Obarvan produkt merimo v posebnem spektrofotometru za merjenje v mikrotitrskih ploščicah (Slika 5). Slika 5 : Metoda sendvič ELISA v laboratoriju 13

25 Iz meritev absorbanc standardov z znano koncentracijo antigena generiramo umeritveno krivuljo (Slika 6). Prisoten mora biti presežek protitelesa na trdnem nosilcu, ki ujame antigen iz vzorca in presežek signalnega protitelesa. Signal premosorazmerno narašča s koncentracijo antigena. Slika 6 : Kalibracija standardov in generiranje umeritvene krivulje pri sendvič ELISA 14

26 2. NAMEN DELA V zadnjih dvajsetih letih je prišlo do napredka v poznavanju in razumevanju imunologije, genetike in mehanizma nastanka poškodb tkiva pri kronični vnetni črevesni bolezni. Raziskave teh področij so zelo pomembne, saj gre za skupino hudih in kroničnih obolenj, ki bolniku povzročajo dolgotrajne težave ter zmanjšujejo njegovo kvaliteto življenja. Napredek je viden predvsem pri razumevanju imunskega odziva, preko tega je prišlo do razvoja novih terapevtskih strategij in učinkovitih zdravil. Kalprotektin v blatu je eden izmed parametrov, ki so pomembni v diagnostiki kronične vnetne črevesne bolezni. Vrednosti fekalnega kalprotektina se uporabljajo za oceno odziva na zdravljenje, za spremljanje asimptomatskih pacientov in za napovedovanje poslabšanj kronične vnetne črevesne bolezni. Namen naloge je primerjava hitrega imunokromatografskega testa z, v rutinski diagnostiki že uveljavljenim testom ELISA, za merjenje proteina kalprotektina v blatu. V delu želimo primerjati rezultate semikvantitativne imunokromatografske metode z rezultati kvantitativne metode ELISA. V nalogi bomo preverili tudi ujemanje rezultatov glede na podane intervale hitrega testa z kvantitativnimi rezultati ELISA testa. 15

27 3. MATERIALI IN METODE 3.1. Materiali Vzorci V raziskavo je bilo vključenih 75 vzorcev blata. Od teh jih je bilo 70 (36 moških, 29 žensk) prinešenih v laboratorij v okviru rednih rutinskih diagnostičnih preiskav iz GIT oddelka zaradi spremljanja KVČB ali na osnovi diagnostičnega postopka. Starostni razpon pacientov je bil od 2 do 57 let. Nadaljnjih 5 vzorcev (3 moški, 2 ženski) je sestavljalo kontrolno skupino ljudi brez opredelitve ali simptomov črevesne bolezni. Njihov starostni razpon je bil od 27 do 66 let. Vzorce smo vzporedno analizirali z dvema različnima imunološkima metodama na prisotnost proteina kalprotektina. Vsi zbrani vzorci blata so bili do analiz hranjeni na -20 C. Predhodno smo jih označili kodirali, tako je bila zagotovljena anonimnost preiskovancev ter korektnost izvajanja analiz in njihove interpretacije. Analiza nekaterih dostavljenih vzorcev, zaradi majhne količine ali tekočega stanja, ni bila mogoča. Vzorce za našo raziskavo smo pridobili iz ostankov vzorcev blata, ki so bili analizirani v okviru rednih rutinskih preiskav, zato zanje ni bilo potrebno pridobiti privoljenja preiskovancev in mnenja etične komisije Oprema in materiali Oprema ELISA čitalec: TECAN SUNRISE laboratorijska digitalna tehtnica (40-150mg) programsko orodje Magellan stresalnik pipete z možnostjo nastavitve volumna µL pipete z možnostjo nastavitve volumna µL pipete z možnostjo nastavitve volumna 0,5-5mL večkanalna pipeta z možnostjo nastavitve volumna µL ura štoparica z možnostjo nastavitve časa od 1-60min mikrocentrifuga Vortex mešalec Materiali sterilne polistirenske posodice z žličko za zbiranje blata polistirenske epruvete z zamaškom na navoj volumna 15mL Eppendorf epruvetke (1-1,5mL) steklene bučke destilirana ali deionizirana voda 1M NaOH 16

28 posodice za spiranje parafilm stojala za epruvete 3.2. Metode dela Metode določanja kalprotektina Koncentracijo proteina kalprotektina smo določali z dvema imunološkima metodama: 1. ELISA 2. Hitri semikvantitativni imunokromatografski test ELISA Za primerjalno metodo določitve kalprotektina v blatu smo uporabili ELISA Calprest od proizvajalca Eurospital (Eurospital SpA, Trst) [16] Reagenti : Vsem reagentom z izjemo substrata in koncentrata raztopine za spiranje je dodan Proclin 300 kot stabilizator. Standardi 6 stekleničk vsebuje 1mL kalibratorjev rdeče barve z znanimi koncentracijami kalprotektina, označenimi na nalepkah stekleničk. Plošča reagenčnih mikrokivet s specifičnimi protitelesi Reagenčne mikrokivete, ki so prevlečene s poliklonalnimi protitelesi proti kalprotektinu na notranji strani površine. Komplet vsebuje testne trakove (12x8) v vrečki iz folije, kateri je priloženo sredstvo za sušenje. Konjugat raztopina encimsko označenih protiteles (IgG) Steklenička vsebuje 15mL z alkalno fosfatazo označenih zajčjih protiteles IgG proti človeškemu kalprotektinu v puferni raztopini z dodatkom vijoličnega barvila. Substrat Steklenička vsebuje 15mL substrata z dodatkom stabilizatorja natrijevega azida. Raztopina za spiranje (20x) Steklenička vsebuje 50mL 20x koncentrirane raztopine za spiranje. Pred uporabo se vsebina stekleničke razredči z destilirano vodo do volumna 1000mL. Razredčena je stabilna 30 dni pri sobni temperaturi. Raztopina za redčenje (10x) Steklenička vsebuje 20mL 10x koncentrirane raztopine za redčenje modre barve. Pred uporabo se razredči s 180mL destilirane vode do končnega volumna 200mL. Razredčena je stabilna 30 dni pri 2-8 C. Raztopina za ekstrakcijo (2,5x) Vsebini stekleničke (50mL) dodamo 950mL destilirane ali deionizirane vode in premešamo. Razredčena je stabilna 3 mesece pri 2-8 C. 17

29 Postopek izvedbe Priprava vzorcev blata Zbrali smo približno 1-5g blata v primernih posodicah, ki so morale biti dostavljene v laboratorij v 4 dneh. Temperatura med transportom ni smela preseči 30 C. Do analize smo jih hranili pri -20 C. Odtalili smo zmrznjene vzorce pri sobni temperaturi. Stehtali smo prazne epruvete na navoj skupaj z žličko odlomljeno iz praznih posodic za zbiranje blata. To žličko smo uporabili za prenos blata. Z žličko smo prenesli približno 100mg blata v stehtano epruveto skupaj z žličko. Ponovno smo stehtali in izračunali neto težo blata, ki je morala biti med 40mg in 120mg. Dodali smo razredčeno raztopino za ekstrakcijo v razmerju teža/volumen je 1/50. Temeljito smo premešali na Vortexu 30s. Homogenizirali smo 25 ± 5 min na stresalniku. Žlička v epruvetah je imela funkcijo mešalca. Prenesli smo 1 ml homogenizata v Eppendorfove epruvete. Ekstrakt bi lahko takoj analizirali z ELISA postopkom ali ga shranili do 3 mesece pri -20 C. ELISA postopek Ekstrahirane vzorce smo odtalili pri sobni temperaturi. Vse reagente smo držali na sobni temperaturi pred analizo. Razredčili smo vzorce 1:50 (20µL ekstrakta + 980µL raztopine za redčenje) in dobro premešali na Vortexu. Slepi vzorec, standarde, kontrole in vzorce pacientov smo nanesli na ploščo z reagenčnimi mikrokivetami v dvojnikih. (Shema plošče z reagenčnimi mikrokivetami : kontrole so nanešene v enojniku, vsi ostali elementi pa so v dvojniku, zato da lahko v eni seriji naredimo analizo 40 vzorcev (Tabela 2). 18

30 Tabela 2 : Nanos standardov, kontrol in vzorcev na ploščo reagenčnih mikrokivet A Slepi STD4 Vz 1 Vz 5 Vz 9 Vz 13 Vz 17 Vz 21 Vz 25 Vz 29 Vz 33 Vz 37 B Slepi STD4 Vz 1 Vz 5 Vz 9 Vz 13 Vz 17 Vz 21 Vz 25 Vz 29 Vz 33 Vz 37 C STD1 STD5 Vz 2 Vz 6 Vz 10 Vz 14 Vz 18 Vz 22 Vz 26 Vz 30 Vz 34 Vz 38 D STD1 STD5 Vz 2 Vz 6 Vz 10 Vz 14 Vz 18 Vz 22 Vz 26 Vz 30 Vz 34 Vz 38 E STD2 STD6 Vz 3 Vz 7 Vz 11 Vz 15 Vz 19 Vz 23 Vz 27 Vz 31 Vz 35 Vz 39 F STD2 STD6 Vz 3 Vz 7 Vz 11 Vz 15 Vz 19 Vz 23 Vz 27 Vz 31 Vz 35 Vz 39 G STD3 Ctr. 1 Vz 4 Vz 8 Vz 12 Vz 16 Vz 20 Vz 24 Vz 28 Vz 32 Vz 36 Vz 40 H STD3 Ctr. 2 Vz 4 Vz 8 Vz 12 Vz 16 Vz 20 Vz 24 Vz 28 Vz 32 Vz 36 Vz 40 Pipetirali smo 100µL raztopine za redčenje na pozicijo A1B1 kot slepi vzorec. Pipetirali smo 100µL vsakega standarda v dvojniku na pozicije od C1 do F2. Pipetirali smo 100µL vsake od obeh kontrol na pozicijo G2H2 in A3B3. Pipetirali smo 100µL razredčenih vzorcev v dvojniku na preostale pozicije. Pokrili smo ploščo in inkubirali 45 ± 5 min na sobni temperaturi. Po koncu inkubacije smo sprali ploščo s 300 µl razredečene raztopine za spiranje. Postopek smo ponovili še 2x. Po koncu spiranja smo ploščo obrnili na staničevino in z nežnim udarcem po staničevini odstranili ostanke tekočine. Pipetirali smo 100 µl konjugata v vse pozicije. Pokrili smo ploščo in inkubirali 45 ± 5 min na sobni temperaturi. Ponovili smo spiranje enako kot zgoraj. Pipetirali smo 100 µl substrata v vse pozicije. Priporočljiva je uporaba večkanalne pipete, da se izognemo različnemu času pri razvijanju barve substrata. Pipetirali smo pazljivo, da nismo ustvarjali mehurčkov. Inkubirali smo pokrito ploščo v temnem prostoru približno 30 min. Odčitali smo absorbance na ELISA čitalcu pri 405 nm. Ko 6. standard doseže absorbanco med 1,8 2,1 lahko reakcijo ustavimo z dodatkom 100µL 1M NaOH ali pa takoj odčitamo vse absorbance. Če reakcijo ustavimo z NaOH je barva obstojna 24 ur pri 4 C. Vrednosti kalprotektina v standardih so podane na etiketah stekleničk. Absorbanca slepega vzorca ne sme presegati 0,20. Pozitivna in negativna kontrola služita za kontrolo kvalitete testnih ploščic in sta vključeni pri vsakem testiranju. Če pride do odstopanj vrednosti kontrol od predvidenih mejnih vrednosti je potrebno obvestiti vodjo laboratorija. 19

31 Tabela 3 : Vrednosti kalprotektina pri različnih kliničnih slikah [16] Zdrava populacija Značilni vnetni procesi Kolorektalni rak Vnetna črevesna bolezen (CB in UC) 26 µg/g nad 100 µg/g 350 µg/g 1722 µg/g Rezultat, ki smo ga dobili ob uporabi programskega orodja smo pomnožili z 2,5, tako smo upoštevali razredčitev in pretvorbo iz ng/l v µg/g. Rezultate smo podali v µg/g. Interpretacija rezultatov Vzorci, ki dajejo vrednosti nad 50 µg/g se smatrajo za pozitivne. Pri zdravih odraslih osebah je medijana okoli 26 µg/g. Medijana pri pacientih z kolorektalnim rakom je okoli 350 µg/g. Pacienti z aktivno, simptomatsko vnetno črevesno boleznijo imajo nivo kalprotektina med 200 in µg/g (Tabela 3) Hitri semikvantitativni imunokromatografski test Za analize smo uporabili semikvantitativni imunokromatografski hitri test PreventID Cal Detect proizvajalca Preventis GmbH (Bensheim) [17] Vsak PreventID Cal Detect testni komplet vsebuje: PreventID Cal Detect testno napravo (z dodanim sušilnim sredstvom, ki ni namenjeno za uporabo pri testu) Napravo za vnos vzorca blata z ekstrakcijsko pufersko raztopino in palčko za vnos Papirni odrezek za zbiranje vzorca blata Navodilo za zbiranje in pripravo vzorca za analizo Postopek izvedbe: Priprava vzorcev blata (1)Vzorec smo zbrali v posodico za zbiranje blata. (2)Odvili smo kapico naprave za vnos vzorca in palčko za vnos vtaknili v blato na treh različnih mestih (približno 2 cm globoko). (3)Palčko z nanešenim vzorcem blata smo vrnili v napravo, ki vsebuje ekstrakcijsko pufersko raztopino. Kapico smo trdno navili in močno premešali. Naprave za vnos vzorca se ne sme prenapolniti z blatom, puferska raztopina mora ostati tekoča. (4)Še enkrat smo ponovili koraka 2 in 3. Če analiza s hitrim testom ni opravljena v obdobju enega dneva od priprave vzorca, lahko napravo z vzorcem hranimo na temperaturi 2 8 C, vendar ne več kot 7 dni. 20

32 Testni postopek Testno napravo smo vzeli iz folije in položili na suho površino. Okroglo okence, kjer nanašamo vzorec je bilo na desni strani. Testno napravo smo označili z imenom pacienta ali z identifikacijsko številko. Napravo smo uporabili takoj. Če je bilo to potrebno, smo počakali da se je naprava za vnos vzorca segrela na sobno temperaturo in jo še enkrat pretresli. Po tem, ko smo vzorec pripravili po navodilih, smo previdno odlomili konico naprave za vnos vzorca (napravico nagnemo nazaj, tako da se izognemo kapljanju). Iztisnili smo 3 kapljice ekstrahiranega vzorca na vzorčno okence testne naprave (s tem da smo nežno pritisnili sredino epruvete). (Slika 9) V pravilno delujočem testu, vijolični trak preteče skozi pravokotno okence za rezultate, v sredini testne naprave. Rezultat smo odčitali 10 minut od zadnje iztisnjene kapljice. Interpretacija rezultatov hitrega testa CalDetect (Slika 8): - Obarvana kontrolna linija pomeni, da je test potekel pravilno. Kalprotektina ni bilo zaznati. Rezultat je negativen. - Prisotnost dveh obarvanih trakov (C in T1) pomeni nivo kalprotektina pod 15 µg/g. Rezultat je negativen - Prisotnost treh obarvanih trakov (C,T1,T2) pomeni nivo kalprotektina med 15 in 60 µg/g. Rezultat je pozitiven. - Prisotnost štirih obarvanih trakov (C,T1,T2,T3) pomeni nivo kalprotektina nad 60 µg/g. Rezultat je pozitiven. - Če kontrolni trak ostane modre barve je test neveljaven. 21

33 Slika 7 : Interpretacija rezultatov hitrega testa CalDetect 22

34 Slika 8 : Uporaba hitrega testa Statistična obdelava podatkov Primerjava rezultatov "hitrega" semikvantitativnega imunokromatografskega testa z ELISA testom, uporabljena za izračun diagnostičnih parametrov hitrega testa glede na ELISA in razporeditev rezultatov obeh testov v koncentracijske razrede, je bila narejena s statistično metodo kontingenčnih tabel. Uporabljeno je bilo programsko orodje SPSS. 23