Določanje prisotnosti HPV DNA v ORL tumorjih

Transkripcija

1 Simon Pintarič Diplomsko delo Maribor, september 2014

2 Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje Študent: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Somentor: Delovni mentor: Simon Pintarič univerzitetni študijski program I. stopnje Kemija diplomirani/a kemik/kemičarka (UN) doc. dr. Mitja Kolar doc. dr. Špela Stangler Herodež, red. prof. dr. Darinka Brodnjak Vončina doc. dr. Špela Stangler Herodež Maribor, september 2014

3 I

4 IZJAVA Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: Vir: Science Direct, Medline, Wiley Gesla: Število referenc Treatment of HPV DNA in ORL tumors 162 HPV DNA in ORL tumors 192 Chain reaction with polimerase 587 Vir: COBIB-COBISS ( Gesla: Število referenc Humani virus papiloma 47 Verižna reakcija s polimerazo 147 Tipi HPV 1 Skupno število pregledanih člankov: 17 Skupno število pregledanih knjig: 7 Maribor, september 2014 Ime Priimek podpis II

5 ZAHVALA Zahvaljujem se mentorju, doc.dr. Mitji Kolarju za sodelovanje. Posebej bi se zahvalil, mentorici v Laboratoriju za medicinsko genetiko UKC Maribor, doc. dr. Špeli Stangler Herodež, za nasvete in navodila pri delu ter izdelavi diplomske naloge. Hvala za razumevanje in sodelovanje. Hvala tudi vodji Laboratorija za medicinsko genetiko, prof. dr. Nadji Kokalj Vokač, ter vsem ostalim zaposlenim. Iz srca pa bi se zahvalil staršem za pomoč in podporo skozi vsa leta študija. III

6 Povzetek Humani papiloma virusi predstavljajo družino izredno heterogenih in razširjenih majhnih DNA virusov, ki povzročajo različne novotvorbe pri ljudeh in živalih. So etiološko povezani z različnimi benignimi in malignimi novotvorbami epitelija in kože in so bili zadnjih 30 let predmet obsežnih raziskav po vsem svetu. V tem času so razvili številne metode za dokazovanje HPV. Namen naloge je bil, na vzorcu 51 tumorjev ORL področja določiti prisotnost HPV DNA. Uporabili smo metodo verižne reakcije s polimerazo ali PCR metodo, ki je trenutno najobčutljivejša metoda za dokazovanje okužb s HPV. Dokazovanje virusov s PCR metodo temelji na in vitro pomnoževanju za virus značilnega majhnega odseka genoma. PCR reakcija je sestavljena iz ponovitev temperaturnih ciklov zaporedne denaturacije osamljene DNA, spajanja izbranih začetnih oligonukleotidov s komplementarnimi zaporedji, ter sinteze nove komplementarne DNA v območju med začetnima oligonukleotidoma. Vsaka novo sintetizirana kopija odseka DNA v naslednjem ciklu reakcije služi kot matrica. Ugotovili smo, da je metoda verižne reakcije s polimerazo ali PCR metoda primerna, hitra in enostavna za določanje prisotnosti HPV DNA v ORL tumorjih. Ključne besede: HPV, PCR, ORL tumorji, začetni oligonukleotidi. UDK: :578.1(043.2). IV

7 Determining the presence of HPV DNA in ORL tumors Abstract The human papilloma viruses represent a family of highly heterogeneous and spread small DNA viruses that cause a variety of neoplasms in humans and animals. HPV are etiologically associated with various benign and malignant neoplasms of epithelial and skin and have been the subject of extensive worldwide research over the past 30 years. In the meantime, a number of methods have been developed to determinate HPV. The purpose of the research was to determine the presence of HPV DNA on the sample of 51 tumours of ORL area. For this purpose, we used the method of polymerase chain reaction or the PCR method. This reaction is currently the most sensitive method for the demonstration of the HPV presence. The determination of viruses by PCR method is based on the in vitro amplification for the virus of the small specific segments. The reaction consists of repeated temperature denaturation cycles of isolated DNA sequence, annealing of primers to complementary sequences, and the synthesis of the new complementary DNA in the region between the primers. Each newly synthesized copy of the DNA segment in the next cycle of the reaction serves as a matrix. We determined that the PCR method is adequate, quick and easy for determining the presence of the HPV DNA in the ORL tumours. Key words: HPV, PCR, ORL tumours, primers. UDK: :578.1(043.2). V

8 Kazalo 1 Uvod Teoretični del Humani papiloma virus (HPV) Razvrščanje Zgradba in pomnoževanje Epidemiologija Rak glave in vratu Okužba s HPV v Sloveniji Zaščita pred okužbo Tumorji ORL Diagnostične preiskave Zdravljenje Instrument Nanodrop Elektroforeza nukleinskih kislin Agarozna gelska elektroforeza Verižna reakcija s polimerazo Uporaba PCR Materiali in metode Število vzorcev Osnovne kemikalije Začetni oligonukleotidi Laboratorijska oprema Metode Merjenje koncentracij nukleinske kisline DNA vzorcev z instrumentom Nanodrop Razvrščanje DNA vzorcev v skupine Verižna reakcija s polimerazo Priprava agaroznega gela in elektroforeza Rezultati Rezultati PCR reakcije pri programu MM Rezultati verižne reakcije s polimerazo skupin 2 in Razprava VI

9 6 Sklep Literatura Življenjepis VII

10 Seznam tabel Tabela 3-1: Uporabljene kemikalije in proizvajalci le teh Tabela 3-2: Začetni oligonukleotidi, njihovi proizvajalci in zaporedje Tabela 3-3: Laboratorijska oprema in njeni proizvajalci Tabela 3-4: Vzorci DNA preiskovancev, njihova koncentracija nukleinske kisline in faktor, ki nam pove, če je vzorec čist ali so v njem prisotne nečistoče Tabela 3-5: Vzorci razdeljeni na 5. podskupin Tabela 3-6: Kemikalije in uporabljen volumen VIII

11 Seznam slik Slika 2-1: Organizacija genoma HPV Slika 2-2: Papilom grla Slika 2-3: Pomnoževanje specifičnih odsekov DNA z metodo PCR Slika 3-1: Naprava Nanodrop Slika 3-2: Nanašanje produktov na gel Slika 3-3: Elektroforeza Thermo Scientific Slika 3-4: Transiluminator del sistema za slikanje gelov Slika 4-1: Skupini P2 in P5 sta HPV pozitivni Slika 4-2: Rezultat verižne reakcije s polimerazo skupine P5 za vzorce: 46, 61, 20, 57, 60, 6, 23, 37, 38, 8, 12 in za slepi vzorec Slika 4-3: Rezultat verižne reakcije s polimerazo skupine P2 za vzorce: 51, 41, 48, 31, 34, 35, 29, 30Č, 53, 19 in za slepi vzorec Slika 4-4: Rezultati verižne reakcije s polimerazo za vzorec 41 iz skupine P2, vzorec 57 iz skupine P5, slepi vzorec in vzorec 12 iz skupine P5. V vzorcu 57 je potrjen HPV IX

12 Uporabljeni simboli in kratice BFB - bromfenol modro DNA - deoksiribonukleinska kislina HPV - humani papiloma virus (Human papilloma virus) PV - papiloma virus MM mešanica PCR kemikalij ORL - otorinolaringološko področje PCR - verižna reakcija s polimerazo (Polymerase chain reaction) SNP - enonukleotidni polimorfizem H 2 O voda Pul skupina EF elektroforeza cdna komplementarna DNA mdna sporočevalna oz. informacijska DNA tdna transportna DNA EGF epidermalni rastni faktor PDGF rastni faktor izpeljan iz ploščic ORF odprti bralni okvirji kda kilo Dalton kbp kilo bazni pari LCR dolga kontrolna regija PHK poglavitni kompleks tkivne skladnosti ATP adenozin-5-trifosfat ORI začetek podvojevanja HNC rak glave in vratu HNSCC skvamoznocelični karcinomi raka glave in vratu OCP ustna votlina in žrelo ZDA združene države Amerike FDA uprava za hrano in zdravila CT računalniška tomografija MR magnetna resonanca UZ ultrazvok X

13 FNAC igelna aspiracijska biopsija RT-PCR verižna reakcija s polimerazo v realnem času mrna informacijska ribonukleinska kislina TBE tris borat etilendiamintetraocetna kislina rpm obrati/min XI

14 1 Uvod Ob spreminjanju slovenske nacionalne patologije je na področju, ki ga obravnava otorinolaringologija, v zadnjih desetletjih najbolj opazen izrazit porast incidence raka zgornjih dihalnih in prebavnih poti. Rak ustne votline, žrela in grla narašča bistveno hitreje od drugih vrst rakavih obolenj glave in je pri moških srednjih let po pogostnosti na drugem mestu takoj za pljučnim rakom. Zaradi strmega naraščanja incidence (3,2 % letno) se je vsakoletno število novo odkritih bolnikov z rakom ustne votline, žrela in grla v zadnjih dvajsetih letih podvojilo. Obstaja verjetnost, da bo za to vrsto raka v Sloveniji zbolel vsak dvajseti moški in vsaka dvestota ženska 1. Najpomembnejša etiološka dejavnika, ki sodelujeta pri nastanku raka ustne votline, žrela in supraglotisnega dela grla sta kajenje in sočasno pretirano uživanje alkoholnih pijač. Kajenje samo pa je najpomembnejše pri nastanku karcinoma glotisa. Izpostavljenost nekaterim kemičnim sredstvom na delovnem mestu (katran, bitumen, azbest) lahko skupaj z zgoraj naštetimi dejavniki še dodatno pospeši razvoj raka. K pojavu malignoma zelo verjetno botruje tudi kakovostno slabša prehrana in pomanjkljiva ustna higiena. Ker omenjeni dejavniki pripomorejo tudi k nastanku karcinoma v drugih organih, se neredko pojavi pri istem bolniku karcinom na več različnih mestih, bodisi hkrati, ali v časovnem razmiku. Govorimo o multiplih sinhronih oziroma metahronih tumorjih 1. Diagnostika ORL karcinomov je v praksi razmeroma pozna, saj preteče od prvih znakov bolezni do njene potrditve več kot 6-12 mesecev. Odstotek 5-letnega preživetja je zato majhen. Omenjene ugotovitve kažejo na pomen preventive in zgodnjega odkrivanja raka ORL področja. Pri tem je zelo pomembna vloga splošnega zdravnika pri odkrivanju obolenja v razvojnem stadiju, ko še obstajajo možnosti za ozdravitev, oziroma za zadovoljiv uspeh zdravljenja 1. Vedno več je dokazov, da igra HPV pomembno vlogo pri nekaterih vrstah raka na grlu. Obstaja veliko tipov HPV-a, ki živi na telesu, ampak le majhno število le teh povzroči težave vezane na spreminjanje z obračanjem celic iz normalnega v nenormalno stanje. Večina HPV infekcij izgine, še preden povzročijo kakšno zdravstveno težavo. Nekateri tipi ustnega HPV-a 1

15 (ki se nahajajo v ustih ali žrelu) lahko povzročijo bradavice. To so»nizkorizične«oblike HPV-a, ki ne povzročajo raka. Druge lahko povzročajo raka v predelu glave in vratu, te so znane kot»visokorizični«tipi HPV-a. Trenutne raziskave kažejo, da ti tipi spremenijo gostiteljevo celico, vendar potrebujejo dodatne sprožilce, ki povzročijo raka. Morebitni drugi sodelujoči dejavniki, ki lahko povzročijo tveganje za razvoj raka na grlu, so: kajenje, oslabljen imunski sistem, slaba ustna higiena in pogoji, ki povzročajo kronično draženje grla (kemične dražilne snovi) 2. V zadnjih 20 letih so razvili več PCR protokolov za odkrivanje različnih tipov HPV za raziskovalne in diagnostične namene 3. V diplomski nalogi smo se osredotočili predvsem na omenjeno PCR metodo s katero smo hoteli dokazati prisotnost HPV DNA v ORL tumorjih. Diplomsko delo obsega vzorce ORL tumorjev s katerimi smo izvajali PCR reakcijo in oceno uporabnosti metode verižne reakcije s polimerazo na podlagi statistične obdelave rezultatov. 2

16 2 Teoretični del 2.1 Humani papiloma virus (HPV) Virusi iz družine Papillomaviridae ali papilomavirusi (PV) so zelo heterogena in široko razprostranjena skupina DNA-virusov, ki povzroča različne novotvorbe pri ljudeh in živalih. Do leta 2000 so bili ti virusi taksonomsko uvrščeni v družino Papovaviridae, ki je bila nato razdeljena na dve družini: Papillomaviridae in Poliomaviridae. Ime papiloma izhaja iz latinske besede papilla (bradavica) in oma (tumor). Na podlagi skladnosti nukleotidnih zaporedij PV razvrščamo v različne virusne genotipe, ki predstavljajo tudi osnovno taksonomsko enoto pri njihovi klasifikaciji. PV najdemo pri večini sesalcev in ptičev ter pri nekaterih plazilcih. Nekateri, predvsem evolucijsko nižji sesalci, imajo samo en za vrsto značilen genotip, medtem ko je raznolikost PV pri opicah in ljudeh mnogo večja. Skupino genotipov PV, ki so pomembni v humani medicini, imenujemo človeški papiloma virusi (angl. human papilloma viruses, HPV) 4. Odkrivanje novih tipov HPV spremljajo v Referenčnem centru za HPV Deutsches Krebs- Forschungzentrum v Heilderbergu (Nemčija), kjer določajo tudi zaporedne številke novo opredeljenih genotipov HPV 5. Genotipi HPV so (na žalost) oštevilčeni popolnoma naključno, glede na vrstni red osamitve, in ne glede na biološke lastnosti virusov ali njihovo genomsko podobnost. Tako npr. genotip HPV 16 oz. krajše HPV-16, predstavlja šestnajsti po vrsti odkriti genotip HPV. Do oktobra 2010 je bilo popolnoma opredeljenih 148 različnih genotipov HPV, označenih od HPV-1 do HPV-152 (HPV-46, HPV-55, HPV-64 in HPV-79 ne ustrezajo kriteriju za uvrstitev med nove virusne genotipe oz. predstavljajo podtipe obstoječih genotipov HPV). Za opredelitev in priznanje novega genotipa HPV je treba celotni genom izolata HPV (lahko tudi po delih) vklonirati v plazmidne vektorje in mu določiti nukleotidno zaporedje oz. za PV značilna genomska področja. Celotni genom potencialno novega genotipa HPV lahko pridobimo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) ali s tehniko klasičnega kloniranja 4. Molekularno kloniranje je pripeljalo do intenzivnega razvoja v raziskavi papiloma virusov okoli leta 1970, kar je omogočilo znanstvenikom klonirati papilomske genome. Ta znanstveni dosežek je v veliki meri izboljšal študijo bioloških in biokemijskih lastnosti papiloma virusov. 3

17 Sekveniranje, dovoljeno za identifikacijo odprtih bralnih okvirjev (ORF), kot domnevnih virusnih genomov je omogočilo raziskovalcem ugotoviti funkcijo virusnih genov 6. 4

18 2.1.1 Razvrščanje Vseh 148 znanih genotipov HPV uvrščamo, skupaj še z nekaterimi opičjimi PV, v 5 rodov (alfa, beta, gama, mu in nu). Posamezni rodovi HPV izkazujejo afiniteto za določeno vrsto epitela. Največji in za človeka klinično najbolj pomemben je rod alfa (sestavlja ga 14 virusnih vrst), v katerega so uvrščeni genotipi HPV, povezani z nastankom številnih benignih in malignih novotvorb ploščatoceličnega epitela. Približno 40 genotipov HPV iz rodu alfa izkazuje tropizem za epitel sluznic in se glede na vrsto novotvorb, ki jih povzročajo, deli na»visokorizične«in»nizkorizične«genotipe HPV 4. Med»visokorizične«vrste HPV spadajo: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 7.»Visokorizični«genotipi HPV (najpomembnejša sta HPV-16 in HPV-18) so odgovorni za nastanek več kot 99 % primerov raka materničnega vratu, % raka zadnjika in nožnice, 40 % raka ženskega zunanjega spolovila (vulve), 47 % raka penisa, ter % raka ustnega dela žrela 4. Nasprotno so»nizkorizični«genotipi HPV iz rodu alfa (najpomembnejša sta HPV-6 in HPV- 11) odgovorni za nastanek vseh primerov anogenitalnih bradavic in papilomov grla. V rod alfa so uvrščeni tudi nekateri genotipi HPV, ki okužijo predvsem večskladni ploščatocelični epitel kože. Najpogosteje povzročajo navadne kožne bradavice in anogenitalne bradavice pri otrocih. Rod beta (sestavlja ga 6 virusnih vrst) združuje genotipe HPV povezane z nastankom različnih benignih in malignih novotvorb na koži pri imunsko oslabljenih osebah in pri bolnikih z redko dedno boleznijo, imenovano bradavičasta epidermodisplazija. Pri osebah, ki nimajo genetske predispozicije, ti virusi najpogosteje vzpostavijo t.i. prikrito (latentno) okužbo in redko povzročajo benigne novotvorbe kože. Genotipi HPV iz rodov gama (10 virusnih vrst), mu (2 virusni vrsti) in nu (1 virusna vrsta) pa povzročajo različne benigne spremembe na koži 4. 5

19 2.1.2 Zgradba in pomnoževanje Virusi DNA so majhni, goli saj v premeru merijo le 55 nm. Dedni material HPV je obdan z dvoplastnim beljakovinskim plaščem, imenovanim kapsida. Kapsida je ikozaedrična in sestavljena iz 72 morfoloških enot, kapsomer, ki predstavljajo dva tipa strukturnih beljakovin, t.i. veliko (L1) in malo (L2) plaščno beljakovino. Velika plaščna beljakovina ima povprečno molekulsko maso 54 kda in tvori približno % vseh beljakovin virusnega plašča. Ostali del beljakovinskega virusnega plašča sestavlja mala plaščna beljakovina z molekulsko maso kda 4. Slika 2-1: Organizacija genoma HPV 16. Virusni genom je krožna, zaprta, dvovijačna molekula DNA, velikosti 7,5 8 kbp in molekulske mase 5,2 x 10 6 Da. Genom je sestavljen iz kodirajočega in nekodirajočega območja. Kodirajoče območje genoma delimo na zgodnje območje E (angl. early) in pozno območje L (angl. late) 8. Območje E vsebuje zapise (gene) za beljakovine, pomembne za uravnavanje podvojevanja virusne DNA, uravnavanje izražanja virusnih genov in interakcijo s celičnimi beljakovinami gostitelja. Večina do sedaj opredeljenih genotipov HPV ima najmanj šest različnih genov E, in sicer E1, E2, E4, E5, E6 in E7. Ti se prepisujejo kot različne bi- ali poli- cistronske molekule mrna vsebujejo bralne okvirje za več različnih beljakovin iz zgodnjega promotorja P1 (HPV-11), ki se nahaja v nekodirajočem območju LCR (angl. long control region). Izjema so nizkorizični genotipi HPV, pri katerih se mrna-beljakovine E7 prepiše posebej, in sicer s promotorja P2 (HPV-11), ki se nahaja v genu E6 8. 6

20 Gena E6 in E7 sta med vsemi območji genoma HPV najbolj raziskana, saj imata najpomembnejšo vlogo v onkogenezi novotvorb, katerih nastanek se povezuje s HPV. Virusni beljakovini E6 in E7 vplivata na številne celične procese, ki lahko vodijo do maligne transformacije s HPV okuženih celic. Med njimi so najpomembnejši spodbujanje oz. vzdrževanje celične proliferacije, zaviranje zaščitnega delovanja celičnih tumor zavirajočih beljakovin ter indukcija celične nesmrtnosti. Transformirajoče lastnosti izraža tudi virusna beljakovina E5, za katero domnevamo, da bi lahko sodelovala v začetni stopnji onkogeneze, posredovane s HPV iz rodu alfa. Beljakovina E5 spodbuja receptorje celičnih rastnih dejavnikov EGF (angl. epidermal growth factor) in PDGF (angl. platelet derived growth factor) ter na ta način povišuje nivo mutagenih dejavnikov, ki spodbujajo celično proliferacijo. Najnovejše raziskave ji pripisujejo tudi pomembno vlogo pri spodbujanju rasti novih krvnih žil iz že obstoječih. Ob tem E5 omogoča tudi izmikanje HPV imunskemu odgovoru, saj ovira zorenje molekul PHK razreda 1. Zapis za beljakovino E5 manjka pri večini genotipov HPV iz rodov beta in gama. E5 je trenutno ena najbolj raziskovanih virusnih beljakovin. Virusna beljakovina E1 je pomembna za začetek podvojevanja virusne DNA in vzdrževanje HPV v obliki zunaj kromosomskih krožnih DNA-delcev ali episomov. E1 se veže skupaj z beljakovino E2 v bližino ORI mesta podvojevanja virusnega genoma (angl. origin of replication) v nekodirajočem območju LCR in deluje kot encim z ATP-azno in helikazno aktivnostjo 8. 7

21 2.1.3 Epidemiologija Različni rodovi HPV se prenašajo na različne načine. Genotipi HPV iz rodu alfa se v glavnem prenašajo z intimnimi stiki sluznic in kože, najpogosteje s spolnimi odnosi. Poleg tega se lahko HPV iz rodu alfa prenašajo tudi s samo-raznašanjem ter ob porodu z okužene matere na otroka. Redkeje se ti virusi prenašajo posredno preko kontaminiranih površin ali predmetov (npr. spodnje perilo, igrače, kirurške rokavice, kirurški instrumenti oz. pripomočki) 8. Pogostost okužbe s HPV iz rodu alfa v splošni populaciji žensk znašajo med 5-40 %, odvisno od starosti (večina je okuženih z»visokorizičnimi«genotipi HPV). V prvih letih po začetku spolnega življenja bo vsaj polovica žensk prišla v stik z najmanj enim genotipom HPV iz rodu alfa. Tako je pogostost okužbe s HPV najvišja pri spolno aktivnih ženskah mlajših od 30 let (20-40 %), nato naglo upada (pod 10 %), saj okužbe bodisi izginejo ali pa preidejo v prikrite. Med 40. in 45. letom starosti se iz še neznanih razlogov pojavi drugi vrh pogostosti pojavljanja okužbe. Kljub zelo visoki pogostosti okužbe s HPV velika večina okuženih žensk ne bo razvila novotvorb, povezanih s HPV. Epidemiološke raziskave so pokazale, da več kot 90 % okužb z»visokorizičnimi«genotipi HPV traja najmanj eno leto in ne vodi do nastanka pre-malignih sprememb. Le pri okoli 5-10 % okuženih žensk se razvije trajna (perzistentna) okužba z enim ali več»visokorizičnim«genotipom HPV. Te ženske imajo višje tveganje za nastanek malignih novotvorb 8. Pogostost okužbe z genotipi HPV iz rodu alfa je pri moških podobna kot pri ženskah. Nedavne raziskave so pokazale, da pride v prvih dveh letih po začetku spolnega življenja vsaj polovica moških v stik z najmanj enim genotipom HPV iz rodu alfa. Večina okužb (80 %) s HPV izzveni spontano znotraj enega leta od okužbe. Za razliko od žensk je pri moških okužba s HPV najpogosteje asimptomatska 8. Za razliko od genotipov HPV iz rodu alfa se genotipi HPV, uvrščeni v rodove beta, gama, mu in nu, v glavnem prenašajo z neposrednim stikom kože s kožo oseb, ki imajo klinično izražene spremembe povezane s HPV (npr. navadne kožne bradavice), ali subklinično, asimptomatsko okužbo, lahko pa tudi posredno preko kontaminiranih površin ali predmetov (npr. tuši, kopališča, savne). Za razliko od genotipov HPV iz rodu alfa domnevamo, da genotipi HPV iz rodov beta in gama perzistirajo v koži daljše obdobje, morda tudi doživljenjsko, in povzročajo predvsem prikrito okužbo. Do okužbe s temi genotipi najverjetneje pride že v zgodnjem otroštvu, saj so pogosto enake genotipe HPV iz rodu beta 8

22 našli tako pri starših kot tudi njihovih otrocih. Najnovejše raziskave kažejo, da se s starostjo pogostost okužb z beta-hpv povečuje, bodisi zaradi de novo okužb bodisi zaradi reaktivacije prikritih virusov. Z uporabo zelo občutljivih molekularnih metod je viruse iz rodu beta možno dokazati v koži in dlačnih mešičkih (najlažje dostopen klinični material kože) pri skoraj polovici vseh ljudi. Pri imunsko oslabljenih osebah, še posebej pri osebah, okuženih s HIV, in pri osebah s presajenimi organi in tkivi, je te viruse možno dokazati v dlačnih mešičkih skoraj vseh bolnikov. Pod vplivom imunosupresije se zaradi aktivacije HPV iz rodov beta in gama pri teh bolnikih pogosto razvijejo tudi s HPV povezane novotvorbe na koži 8. Ploščatocelični karcinom predstavlja približno 90 % vseh malignih tumorjev grla. Humani papiloma virus (HPV) je bil predlagan kot potencialen etiološki dejavnik skvamozno celičnih karcinomov grla 9. Slika 2-2: Papilom grla. Podobno kot genitalne bradavice so vsi primeri papilomov grla povezani z okužbo z nizkorizičnimi genotipi HPV, najpogosteje s HPV-6 in HPV-11. Papilomi grla se najpogosteje pojavijo med 2. in 3. ter med 20. in 40. letom starosti. Za otroško obliko bolezni je značilno hitrejše napredovanje, invanzivnejša rast papilomov, pogostejši zapleti in ponovitve. Papilomi grla najpogosteje vzniknejo na prostem robu glasilk in v sprednji komisuri. Razširijo se lahko tudi v ostale predele dihal (najpogosteje v sapnik, sapnice in ustno votlino). Nastanek in razvoj papilomov grla pri otrocih in mladostnikih povezujejo z obporodnim prenosom virusa z okužene matere na novorojenca, medtem ko ga pri odraslih največkrat pripisujejo spolnemu prenosu ali pozni reaktivaciji obporodno pridobljene HPVokužbe 8. 9

23 2.1.4 Rak glave in vratu Rak glave in vratu je peti najpogostejši rak na svetu in osmi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka. HNC (head and neck cancer) opredeljuje raznoliko skupino malignih bolezni, vključno s tistimi od: ustnic, ustne votline, nosu in obnosnih sinusov, do: nazofarinksa, orofarinksa, hipofarinksa in grla; od katerih je večina (85%) s histologijo potrjenih skvamoznih karcinomov (HNSCC) 10. To so večinoma skvamoznocelični karcinomi (HNSCC), ki so tradicionalno povezani s kajenjem tobaka in pitjem alkohola. Podmnožica HNSCC izvira iz orofarinksa (OCP), vključno z rakom tonzil, bazo jezika, mehkega neba in stene žrela in je vedno bolj povezana z okužbo HPV. HPV je že dobro znan kot zastopnik, ki je kriv za razvoj skoraj vseh (99,7 %) rakov na materničnem vratu, kakor tudi redkejših anogenitalnih rakov, vključno z rakom vulve, vagine, anusa in penisa 11. Meta-analiza 60-ih študij, v katere je bilo vključenih 5046 bolnikov z rakom glave in vratu, je pokazala, da je razširjenost okužbe s HPV 25,9 %. Od teh je bilo bolnikov s karcinomom žrela 35,6 %, s karcinomom ustne votline 23,5 % in s karcinomom grla 24 %. Najpogostejši so HPV v tkivu karcinomov ustnega dela žrela. V večini študij je genom HPV vsebovalo vsaj 50 % karcinomov žrela. V številnih študijah je bilo ugotovljeno, da se HPV - pozitivni karcinomi pojavljajo predvsem v limfatičnih foliklih jezika (tonzila lingualis) in mandljev (tonzila palatina). Prisotnost virusnega genoma je povezana s histološkimi tipi bazaloidnega in slabo diferenciranega karcinoma, ni pa povezave s stadijem bolezni. Pri % tumorjev, ki vsebujejo virusni genom, je to HPV tipa 16. Čeprav HPV lahko okuži epitelne celice kjer koli v aerodigestivnem traktu, se zdi, da so za okužbo posebno občutljivi mandlji. Podobno kot za transformacijski predel materničnega vratu tudi zanje velja, da razlog za to posebno občutljivost ni znan. Kje se nahaja oz HPV»počiva«, ni znano, čeprav se ve, da je lahko prisoten tudi 10 let pred nastankom karcinoma žrela. Okužba s HPV je povezana tudi s predstopnjami ploščatoceličnega karcinoma na drugih mestih (npr. na koži, vulvi, penisu, požiralniku, očesni veznici, obnosnih votlinah, bronhijih), vendar je patogeneza teh sprememb manj raziskana kot pri raku materničnega ustja. Bolniki s karcinomi glave in vratu s HPVpozitivnimi tumorji so v primerjavi z bolniki, katerih tumorji nisi okuženi s HPV, pogosteje mlajši (povprečno 5 let), nekadilci (15-krat večja verjetnost) in abstinenti. Njihovo splošno in specifično preživetje je daljše, tveganje za smrt zaradi raka je manjša za %. Vzrok za to je večja občutljivost s HPV okuženega karcinomskega tkiva za ionizirajoče sevanje, do česar 10

24 pride, ker imajo HPV-pozitivni tumorji polno funkcionalen apoptozni odgovor na obsevanje

25 2.1.5 Okužba s HPV v Sloveniji Okužba s humanim papiloma virusom (HPV) je vzročno povezana z benignimi in malignimi boleznimi. Nizkorizični HPV-i tipa 6 in 11 so prevladujoči vzroki papilomatoze. Le HPV 16 dokončno izpolnjuje oboje, molekularna in epidemiološka vzročna merila, kot rakotvoren ali visokorizični tip HPV v zgornjih dihalih 13. V nacionalni raziskavi pogostosti 14 visokorizičnih genotipov HPV iz reda alfa, v kateri je sodelovalo več kot 4550 žensk v starosti let, ki sodelujejo v organiziranem programu presejanja raka materničnega vratu, končani novembra 2010, so ugotovili, da so okužbe s HPV v Sloveniji najpogostejše v skupini žensk v starosti let (26 %). Pogostost ostaja visoka tudi v skupini let (20 %) in let (14 %), v nadaljnjih starostnih skupinah pade pod 8% in je najnižja v skupini žensk v starosti let 8. Letna pojavnost raka materničnega vratu se je večala od leta 1950 (22,5/ žensk) do leta 1962, ko je bila 34/ žensk. Po letu 1962 sta se zaradi uvedbe oportunističnega presejanja pojavnost in umrljivost začeli zmanjševati in leta 1979 je bila pojavnost najmanjša (14/ žensk) 8. Na novo odkrijejo med 8-16 primerov papilomov grla na leto, najpogosteje pri otrocih, mlajših od 5 let. Papilome grla najpogosteje povzročata HPV-6 (58 %) in HPV-11 (32 %) 8. 12

26 2.1.6 Zaščita pred okužbo Najboljša zaščita je cepljenje. V Sloveniji so v šolskem letu 2009/10 razširili program imunoprofilakse z neobveznim, brezplačnim cepljenjem proti HPV s štirivalentnim cepivom za deklice v starosti od 11 do 12 let ob sistematskem pregledu v šestem razredu osnovne šole. Poleg tega je za ostale starostne skupine na voljo samoplačniško cepljenje z obema profilaktičnima cepivoma 8. V ZDA je FDA (Food and Drug Administration) odobrila cepljenje z vakcino HPV za preprečevaje raka materničnega vratu že junija Od 40 serotipov HPV sta tipa 16 in 18 povzročitelja približno 70 % vseh karcinomov materničnega vratu. Na trgu sta dve vakcini, dvokomponentna (tipa 16 in 18) ter štirikomponentna (tipi 6, 11, 16, 18). Obe sta bili klinično preizkušeni in sta se izkazali kot zelo učinkoviti. V podskupini, ki pred cepljenjem ni bila izpostavljena obema tipoma HPV v cepivu, je bila učinkovitost skoraj 100-odstotna. Ker je okužba spolno prenosljiva, je smiselno in verjetno najučinkovitejše cepljenje mladostnikov obeh spolov, preden so izpostavljeni okužbi, torej pred začetkom spolnega življenja. Navedeni študiji sta namreč pokazali, da je učinkovitost cepljenja pri populaciji, ki je že bila izpostavljena okužbi s HPV, manjša. O dolgoročni imunosti seveda ni podatkov, saj je od prvih cepljenj minilo samo 4 do 5 let, zato vprašanje o potrebi obnovitvenega odmerka ostaja odprto. Ker je približno četrtina bolnikov s karcinomi glave in vratu okužena s HPV, naj bi bilo cepljenje preventiva tudi za te vrste karcinomov, vendar podatkov o tem ni. Po analogiji pa lahko upravičeno pričakujemo zmanjšanje pojavnosti tudi v teh primerih

27 2.2 Tumorji ORL Pojem raki ORL predstavlja heterogeno skupino malignih tumorjev. Mednje uvrščamo malignome nosu in obnosnih votlin, ustne votline, žrela, grla in žlez slinavk. Ti tumorji se med seboj razlikujejo ne le po mestu od koder izvirajo, temveč tudi po bolezenskih znakih, histološki sliki, načinu in pogostosti metastaziranja, hitrosti napredovanja ter ne nazadnje tudi po načinu zdravljenja in izidu bolezni. Resno ogrožajo bolnikovo življenje, hkrati pa prizadenejo del telesa z izredno pomembnimi fiziološkimi funkcijami, ki so bistvenega pomena v človekovem psihičnem, emocionalnem in socialnem življenju 15. Pri večini ORL rakavih obolenj sta glavna dejavnika tveganja tobak in alkohol. Metaboliti nikotina se vežejo na DNA in povzročajo mutacije, ki lahko aktivirajo proto-onkogene ali zavirajo tumor-supresorske gene. Mehanizem karcinogeneze etanola še ni docela pojasnjen, povzroča atrofijo sluznice in naj bi tako olajšal penetracijo drugih kancerogenih spojin. Istočasno uživanje alkohola in tobaka tveganje izrazito povečuje. Več študij potrjuje tudi vpliv prehranskih navad, predvsem nezadostnega vnosa vitaminov, na večjo pojavnost rakavih obolenj 15. V predelu glave in vratu so, če ne upoštevamo kožnih tumorjev, najpogostejši tumorji grla (v Sloveniji 100 primerov na leto). Najpogosteje se pojavljajo karcinomi glotisa. Moški zbolijo pogosteje kot ženske. Najpomembnejši dejavnik tveganja je kajenje. Pri bivših kadilcih se začne tveganje za nastanek raka zniževati po 5 letih abstinence, po 10 letih pa je enako kot pri nekadilcih. Pomembna dejavnika tveganja sta še preobremenjenost glasilk in izpostavljenost azbestu, pomemben pa je tudi genetski vpliv - mutacija na genu p

28 2.2.1 Diagnostične preiskave Najbolj značilen simptom, ki se pojavi pri tumorju na glasilkah, je hripavost. Pri diagnostiki upoštevamo anamnezo (predvsem prejšnje bolezni, družinska anamneza, vnetja, delovno okolje, razvade - kajenje). Pri raku glasilk pride pogosto do prehoda iz benignega obolenja v maligno, zato je potrebno dolgotrajno in pozorno spremljanje kroničnih vnetij in drugih sprememb, kot npr. atipične hiperplazije ali displazije, ki privede do karcinoma in situ ter končno do invazivnega karcinoma. Opravi se celosten pregled glave in vratu z vključno laringoskopijo (indirektna z zrcalcem in direktna z laringoskopom) 15. Diagnozo tumorja lahko potrdi le patolog ali citolog. Za natančno razvrstitev tumorja po TNM sistemu vse pogosteje uporabljamo naslednje preiskave: računalniško tomografijo (CT), ki pokaže dobro lego, velikost, razširjenost tumorja v okoliška tkiva, predvsem pa kostno destrukcijo. Uporaba kontrastnega sredstva tumor še jasneje zameji. To preiskavo najpogosteje uporabljamo pri oceni sprememb kostnih struktur; magnetno resonanco (MR), ki dobro pokaže mehke dele, brez ionizirajočega žarčenja. Visoka mehkotkivna kontrastna ločljivost je boljša kot pri CT. Pri vrsti bolezenskih stanj mehkotkivnih struktur zagotavlja ob visoki občutljivosti, kot jo imajo nekatere radionuklidne preiskave, še visoko specifičnost. Pri slikanju z MR ni artefaktov, ki jih sicer pri CT povzroča gosta kostnina ali zobne zalivke. Pomanjkljivost MR je slabši prikaz infiltracije v kosti, zato preiskavo dopolnimo s CT. Obe preiskavi lahko napravimo v poljubnih plasteh, ki jih med seboj poljubno sestavljamo in dobimo tako zadovoljiv prostorski prikaz tumorja; ultrazvočna diagnostika (UZ) je prikaz preiskovanega področja z ultrazvokom. V primerjavi s prej opisanima preiskavama je cenejša in jo lahko večkrat ponovimo, brez nevarnosti, ki jih ima sevanje. Vedno pogosteje jo uporabljamo pri preiskavah oteklin na vratu in ustnem dnu. Dopolnjena s tanko igelno aspiracijsko biopsijo (FNAC) lahko nadomesti prejšnji preiskavi in v rokah izkušenega preiskovanca zmanjša število napačno po TNM razvrščenih bolnikov. Dobro služi tudi pri UZ kontrolah bezgavk na vratu po zdravljenju s kemoterapevtiki in obsevanju. Z uporabo endoskopskih sond lahko prikažemo tudi globlje ležeče spremembe v spodnjem žrelu in medpljučju. Z UZ lahko ocenimo tudi invazijo tumorja v arterialne stene; angiografija in digitalna substrakcijska angiografija prikažeta žilne tumorje; 15

29 scintigrafija služi za ugotavljanje narave otekline in morebitne razširjenosti zasevkov. Slednji sta le dopolnilo CT preiskavi. Po opravljenih preiskavah bolnika skupaj pregledata otorinolaringolog in onkolog, ki se na podlagi predložene dokumentacije odločita za najbolj ustrezno obliko zdravljenja 1. 16

30 2.2.2 Zdravljenje Diagnosticiranje in zdravljenje tumorjev se je v zadnjem desetletju izboljšalo, vendar je še vedno veliko nenatančnosti pri oceni tako primarnega tumorja kot stičnih metastaz. Posledično so v neskladju tudi primarne in sekundarne bolezni oz. bolezenska stanja 16. Na primer, optimalno zdravljenje raka zgornjega digestivnega trakta zahteva tako izkoreninjenje tumorja kot ohranitev organov, kjer je to mogoče. Zlasti pri upravljanju supraglotičnega grla in raka žrela bi morali zaščititi tri najpomembnejše funkcije, dihalne poti (izogibanje aspiraciji), dihanje in fonacijo. Prav tako je pomembno, da se zavedamo, da ohranjanje organov ne pomeni nujno tudi delovanja le teh 16. Namen zdravljenja je torej, da tumor uničimo, hkrati pa ohranimo funkcijo organov. Uporabljamo oblike terapije kot so: Radioterapija; Kirurška odstranitev tumorja. Učinek zdravljenja je odvisen tudi od starosti bolnika, njegovega splošnega počutja ter stadija bolezni

31 2.3 Instrument Nanodrop 2000 Nanodrop 2000 je natančna naprava za enostavno merjenje koncentracije in čistosti DNA ali RNA proteinskih vzorcev. Z uporabo samo 1 μl lahko dobimo rezultate v manj kot 15 s od pipetiranja vzorca do čiščenja podstavka naprave 17. Naprava ima številne prednosti, kot so: - ima širok spekter območja za merjenje različnih tipov vzorcev, kot so: peptidi (205 nm) DNA ali RNA (260 nm) očiščeni proteini (280 nm) toksikološki testi in industrijske barve (490 nm) nanodelci zlata (520 nm) kolorimetrični beljakovinski testi (BCA 562 nm, 595 nm Bradford, Modified Lowry 650 nm, Pierce nm) meritve optične gostote (600nm); - ne zahteva nobenih razredčitev, niti pri visoko koncentriranih vzorcih; - patentiran sistem za hrambo vzorcev samodejno optimizira dolžino poti za sprejem nizke in visoke koncentracije (2 15 ng/μl dsdna); - zahteva samo 0,5 2 μl vašega vzorca; - izračuna razmerje čistosti vzorca (260/280 nm in 260/230 nm); - vnaprej ima konfigurirane metode za DNA, beljakovine A 280, mikromreže, beljakovine, itd.; - hiter čas merjenja, manj kot 5 s. Od s od pipetiranja vzorca do brisanja podstavka naprave; - uporabniku prijazna programska oprema, ki vključuje metode po meri in ima zmogljivost izvoza podatkov

32 2.4 Elektroforeza nukleinskih kislin Elektroforeza je kemijska analitska metoda, s katero lahko glede na velikost ločujemo, prepoznavamo in čistimo molekule DNA. Z elektroforezo ločimo delce z različnimi naboji, ker se razlikujejo njihove elektroforezne mobilnosti, prav tako pa tudi delce z enakimi naboji, če so različnih velikosti ali oblike, ker nanje delujejo različne zavorne sile. Pri tem moramo DNA molekule, ki jih hočemo analizirati, omejiti v določenem mediju, t.i. gelu 18. Pod vplivom električnega polja se začnejo DNA fragmenti različno hitro premikati proti pozitivni elektrodi, to je anodi (zaradi negativnega naboja fosfatne skupine na verigi DNA). Večje oz. daljše molekule fragmenti namreč potujejo z manjšo hitrostjo kot manjše, saj se soočajo z večjo silo trenja, ko potujejo skozi gel. Manjši fragmenti tako pripotujejo v določenem časovnem intervalu bliže anodi kot večji. Po določenem času električni tok prekinemo in analiziramo ločene fragmente DNA 18. V molekularni biologiji sta najpogosteje uporabljeni sestavini za elektroforezni gel za DNA agaroza in poliakrilamid

33 2.4.1 Agarozna gelska elektroforeza Agaroza je linearni polimer s ponavljajočim dimerom D galaktoze in 3,6-anhidro-Lgalaktoze. Hitrost potovanja DNA skozi agarozni gel je odvisna od sledečih dejavnikov: Velikosti DNA (krajše manjše molekule potujejo hitreje, ker se lažje prebijajo skozi pore v gelu in ker imajo manjši upor trenja). - Oblike DNA (relativna hitrost posamezne oblike je sicer odvisna od koncentracije agaroze, jakosti električnega polja in ionske jakosti pufra. Pod pogoji, ki jih običajno uporabljamo pri agarozni elektroforezi, potuje najhitreje dodatno zvita krožna molekula, nekoliko počasneje linearna in najpočasnejša molekula v sproščeni obliki). - Koncentracije agaroze (linearna DNA določene velikosti potuje skozi gele z različnimi koncentracijami agaroze z različno hitrostjo. V gelu z visoko koncentracijo agaroze molekule potujejo počasneje. Zato lahko v gelu določene gostote ločujemo le molekule določenih velikosti. Večje molekule ločujemo v gelih z nižjo koncentracijo agaroze). - Napetosti električnega polja (pri nizki napetosti je hitrost potovanja linearne DNA proti anodi sorazmerna z uporabljeno jakostjo električnega polja. Za ločevanje molekul, večjih od 2 kb, moramo zato uporabljati napetost, ki je manjša od 5 V/cm razdalje med elektrodama). - Sestave elektroforeznega pufra (prisotnost ionov v pufru je potrebna, da skozi gel teče tok, potreben za gibanje molekul. Za ločevanje dvovijačne DNA, uporabljamo kombinacijo EDTA in tris-acetata (TAE), tris-borata (TBE) ali tris-fosfata (TPE) s približno 50 mm koncentracijo ionov) 18. Na hitrost potovanja DNA pa ne vplivata: - zaporedje nukleotidov DNA in - temperatura, pri kateri teče elektroforeza. Paziti moramo le, da ne presežemo temperature tališča gela

34 2.5 Verižna reakcija s polimerazo Je metoda za hitro pomnoževanje DNA in vitro. Polimerna verižna reakcija s polimerazo (PCR) omogoča neposredno kloniranje genomske DNA ali cdna, usmerjeno mutagenezo DNA, analizo DNA, ki je dostopna v majhnih količinah, ter različne diagnostične postopke 12. Pri PCR reakciji so v reakcijski zmesi trije tipi molekul DNA: osnovni odsek dvoverižne DNA, ki ga želimo pomnožiti in dva začetna oligonukleotida, ki sta komplementarna vsak enemu koncu odseka; v reakcijski zmesi so še DNA polimeraza, vsi deoksiribonukleozidtrifosfati in pufer, ki zagotavlja optimalno delovanje encima. Vsak oligonukleotid hibridizira na svojo verigo toplotno denaturiranega odseka DNA, tako da sta 3 - konca oligonukleotidov obrnjena drug proti drugemu. DNA polimeraza zato sintetizira del DNA, ki je med obema oligonukleotidoma. En krog reakcije verižne polimerizacije je sestavljen iz treh stopenj. Na prvi stopnji z visoko temperaturo denaturiramo tarčno DNA (obe komplementarni verigi se ločita). Na naslednji stopnji temperaturo reakcijske zmesi znižamo pod temperaturo tališča vezave obeh oligonukleotidov, na zadnji stopnji pa temperaturo dvignemo na optimalno območje za delovanje encima DNA polimeraze. En krog reakcije nam omogoči, da iz ene tarčne DNA dobimo dve molekuli; z vsakim naslednjim krogom se število molekul veča eksponentno, tako da npr. po desetih krogih iz ene molekule dobimo 2 10 molekul 12. Vsaka kombinacija tarčne DNA in oligonukleotidov zahteva svoje pogoje reakcije, če želimo uspešno pomnožiti želeni odsek DNA. Zavedati se moramo, da lahko le z izbiro ustreznih eksperimentalnih pogojev dosežemo optimalno specifičnost in učinkovitost reakcije

35 Slika 2-3: Pomnoževanje specifičnih odsekov DNA z metodo PCR. 22

36 2.5.1 Uporaba PCR PCR metode se uporabljajo za raziskovanje ali v diagnostične namene. Najpomembnejši primeri uporabe PCR so: - neposredno določevanje nukleotidnega zaporedja odsekov DNA, brez predhodne stopnje vgrajevanja v plazmid; analiza zelo majhnih količin nukleinskih kislin in redkih nukleinskih kislin; - kloniranje odsekov DNA in manipulacija nukleotidnega zaporedja odseka; pripravimo lahko primerne konce odseka za direktno kloniranje ali sestavljanje več odsekov; - posamezne nukleotide v DNA lahko zamenjamo z usmerjeno mutagenezo s pomočjo PCR; - z njegovo pomočjo lahko v nekaj urah namnožimo katerikoli odsek DNA (priprava sond); - lažja analiza genskih prepisov (pri RT-PCR je PCR povezan s predhodno sintezo cdna z reverzibilno transkriptazo; - metoda diferencialnega prikaza/«differential display«pa omogoča prepoznavo in izolacijo genov, ki izražanje spreminjajo pri pogojih, ki jih proučujemo); - analiza organizacije genov, kadar poznamo nukleotidno zaporedje cdna; - določevanje relativnih količin neke določene mrna v določenem vzorcu (kvantitativna PCR metoda) v reakcijsko zmes dodamo DNA znane količine, s parom ustreznih začetnih oligonukleotidov; - v medicinski diagnostiki je PCR-metoda izrinila nekatere klasične metode, npr. točkovno hibridizacijo (uporablja se za določevanje prisotnosti virusov in bakterij v vzorcih bolnikov, pri predporodni diagnostiki ugotavljamo najrazličnejše motnje pri zarodku, uporablja se v diagnostiki rakavih obolenj); - forenzične preiskave, za identifikacijo oseb

37 3 Materiali in metode 3.1 Število vzorcev Analizirali smo DNA 51-ih tumorjev iz ORL področja. Te vzorce smo glede na njihovo koncentracijsko območje razdelili v 5 skupin in preverili prisotnost humanega papiloma virusa oziroma HPV-ja. 3.2 Osnovne kemikalije Uporabljene kemikalije pri eksperimentalnem delu za dokazovanje HPV DNA v ORL tumorjih in njihovi proizvajalci so navedeni v tabeli: Kemikalija Agaroza MM BFB EDTA Proizvajalec Sigma Qiagen Sigma Sigma Tabela 3-1: Uporabljene kemikalije in proizvajalci le teh. 24

38 3.3 Začetni oligonukleotidi V tabeli 3-2 so navedeni uporabljeni začetni oligonukleotidi, njihovo nukleotidno zaporedje, ter proizvajalci. Začetni oligonukleotidi Proizvajalec Nukleotidno zaporedje HPV MY 09 Sigma CGTCCMARRGGAWACTGATC HPV MY 11 Sigma GCMCAGGGMCATAAYAATGG HPV 6 E7 F1 Sigma CGAAGTGGACGGACAAGATTCAC HPV 6 E7 R1 Sigma CTTCGGTGCGCAGATGGGAC HPV 11 E7 F1 Sigma GTACTAGACCTGCAGCCTCCT HPV11 E7 R1 Sigma TCACATCCACAGCAACAGGTCA HPV 16 E7 F1 Sigma AACCGGACAGAGCCCATTACAA HPV 16 E7 R1 Sigma TGAGAACAGATGGGGCACACAA HPV 18 E7 F1 Sigma ATCATCAACATTTGCCAGCCCG HPV 18 E7 R1 Sigma ACAACGGACACACAAAGGACAG Tabela 3-2: Začetni oligonukleotidi, njihovi proizvajalci in zaporedje. 25

39 3.4 Laboratorijska oprema V preglednici 3-3 je navedena vsa uporabljena laboratorijska oprema in njeni proizvajalci. Laboratorijska oprema Proizvajalec Centrifuga Tehnica Centric 150 Tehtnica Precisa 310C B010D Mikrovalovna pečica Gorenje Elektroforezni sistem Bio Rad, Powerpac 300; Bio Rad, Powerpac Basic Mikropipete Finnipipette; Thermo Labsystems; Gilson UV VIS spektrofotometer Nanodrop 2000 Thermo Scientific Vorteks IKA MS 3 Basic PCR blok Biometra; Tprofessional Basic Thermocycler; Tprofessional Basic Gradient Transiluminator Thermo Scientific Tabela 3-3: Laboratorijska oprema in njeni proizvajalci. 26

40 3.5 Metode Merjenje koncentracij nukleinske kisline DNA vzorcev z instrumentom Nanodrop Vsem DNA vzorcem smo izmerili koncentracijo nukleinske kisline v μl/ng. 1 ml DNA v epicah smo najprej vzeli iz hladilnika in jih pustili 10 min, da so se segreli na sobno temperaturo (22 C). Nato smo vse 5 s premešali na vibracijskem mešalniku in 10 s centrifugirali pri 2200 rpm (obratih/min). Tako so bili vzorci pripravljeni za naslednji korak, merjenje koncentracije nukleinske kisline. To meritev sem opravljal na instrumentu Nanodrop 2000 in ustreznim računalniškim programom Nanodrop. V Nanodrop 2000 sem na ustrezno mesto nanesel 1,5 μl DNA vzorca, jo ustrezno zaprl in z računalniškim programom preveril koncentracijo nukleinske kisline in faktor 260/280, ki nam pove, če je vzorec čist ali so v njem prisotne nečistoče. Slika 3-1: Naprava Nanodrop

41 Rezultati meritev opravljenih z Nanodropom so prikazani v tabeli 3-4. DNA (številka oz oznaka) c (ng/μl) f (260/280) / 80 1, , ,7 1, ,6 1, ,2 1, ,4 1, ,2 1, ,7 1, ,4 1, , ,7 1, ,4 1, ,2 1, ,4 1, ,5 1, ,6 1,85 26 moder 76,7 1,83 26 črn 54,9 1, ,1 1, ,1 1, ,3 1,84 30 moder 65,9 1,88 30 črn 110,3 1, ,3 1, ,5 1, ,2 1, ,9 1, ,9 1, ,6 1, ,9 1,86 28

42 40 37,0 1, ,1 1, ,3 1, ,7 1, ,4 1, ,0 1, ,6 1, ,5 1, , ,5 1, ,5 1, ,9 1, ,8 1, ,9 1, ,4 1, ,2 1, ,2 1, ,9 1, ,0 1, ,7 1, ,7 1,86 Tabela 3-4: Vzorci DNA preiskovancev, njihova koncentracija nukleinske kisline in faktor, ki nam pove, če je vzorec čist ali so v njem prisotne nečistoče. Izmerjena koncentracija nam pove, kolikšen volumen določene DNA moramo dodati k ostalim preparatom za testiranje prisotnosti HPV. 29

43 3.5.2 Razvrščanje DNA vzorcev v skupine Vzorce DNA smo glede na podobne koncentracijske nivoje razdelili na 5 podskupin (tabela 3-5). Skupina c Skupina c Skupina c Skupina c Skupina c , , , , , , , , , , , , , , , , , ,2 26 črn 54, , , , , , , , , , , , , ,6 30 moder 65,9 30 črn 110, , , ,9 26 moder 76, , , , ,6 / 80, , , , , ,7 Tabela 3-5: Vzorci razdeljeni na 5. podskupin. 30

44 3.5.3 Verižna reakcija s polimerazo Vsaki od navedenih skupin smo dodali 2,5 μl mešanice PCR kemikalij, po 0,5 μl začetnih oligonukleotidov HPV MY 09 in HPV MY 11, ter 0,5 μl vode (H 2 O). Komponente smo v 5- ih epicah dobro premešali z vibracijskim mešalnikom (vorteksom) in 10 s centrifugirali pri 2200 rpm. Dobro premešano vsebino epic smo nato prenesli v PCR aparat in nastavili program MM 60: 1. stopnja: denaturacija DNA pri 94 C 2. stopnja: hibridizacija začetnih oligonukleotidov pri 60 C 3. stopnja: podaljševanje DNA verig pri 72 C. Reakcija je trajala 1 h in 47 min. Na vzorcih smo po končani PCR reakciji izvedli še elektroforezo, ter jim nato dodali še barvilo brom-fenol-modro (BFB). Tako smo lahko odčitali rezultate pod UV svetlobo s pomočjo transiluminatorja. Skupine, v katerih je bil prisoten HPV, smo nadalje uporabili za preverjanje izbranih določenih vzorcev, ki so HPV pozitivni. Uporabljali smo PCR reakcijo s končnim volumnom 5 μl. Vse kemikalije smo pred uporabo odtalili in centrifugirali, saj bi v nasprotnem primeru lahko dobili napačne rezultate. Kemikalije, ki smo jih uporabili in njihov volumen so podane v tabeli 3-6. Kemikalija (kratica) Volumen (μl) DNA 1 MM 2,5 HPV MY 09 0,5 HPV MY 11 0,5 H 2 O 0,5 Tabela 3-6: Kemikalije in uporabljen volumen. Mešanico smo pripravili po vrstnem redu, kot je navedeno v tabeli 3-6, jo premešali z vibracijskim mešalnikom in nato še centrifugirali, da so se vse komponente v epici med seboj dobro premešale. Epico smo prenesli v PCR aparat Tprofessional Basic Thermocycler in izbrali program MM

45 Število ciklov se prilagodi količini izolirane genomske DNA (običajno 30 ciklov). Po končani PCR reakciji smo izvedli gelsko elektroforezo, kjer so se dobljene lise ločile na 3 % agaroznem gelu. 32

46 3.5.4 Priprava agaroznega gela in elektroforeza Pripravili smo si 3-vrstični gel, v vsaki vrstici po 8 prostih mest. Gel smo pripravili tako, da smo v erlenmajerico zatehtali 1,05 g agaroze in dolili do 35 g 50 mm 5xTBE pufra. Nato smo postavili erlenmajerico v mikrovalovno pečico in pustili dobro minuto, da je vsebina zavrela. Nato smo erlenmajerico prenesli iz mikrovalovne pečice, premešali in jo ponovno postavili nazaj v mikrovalovno pečico, da je gel ponovno zavrel. Nato smo ga še dobro premešali in zlili v nosilec za gel, ter vstavil 3 glavničke. Počakali smo 15 min, da se je gel strdil. Na strjen gel smo nanesli PCR produkte. Slika 3-2: Nanašanje produktov na gel. Agarozni gel s produkti smo vstavili v 50 mm 5xTBE puferno tekočino in začeli z elektroforezo (EF), ki smo jo nastavili na napetost 160 V in časovno omejili na 13 min. 33

47 Slika 3-3: Elektroforeza Thermo Scientific. Po končani EF smo rezultate produktov odčitali pod UV svetlobo z valovno dolžino 312 nm s pomočjo transiluminatorja, sistema za slikanje gelov. V to napravo vstavimo gel z lisami, ki smo jih dobili po končani EF. Vklopimo UV svetlobo in na računalniškem ekranu se nam prikažejo rezultati, ki si jih lahko natisnemo. Slika 3-4: Transiluminator del sistema za slikanje gelov. 34

48 4 Rezultati 4.1 Rezultati PCR reakcije pri programu MM 60 Pripravili smo si 5 skupin (P1, P2, P3, P4, P5) vzorcev DNA tumorjev s približno enakim koncentracijskim območjem nukleinske kisline in slepi vzorec (0). Vsaki smo dodali 2,5 μl mešanice PCR kemikalij, po 0,5 μl začetnega oligonukleotida HPV MY 09 in HPV MY 11 ter 0,5 μl vode. Vse skupaj smo premešali na vibracijskem mešalniku in centrifugirali 10 s pri 2200 rpm. Sledila je PCR reakcija v PCR bloku, kjer smo nastavili že omenjeni program MM 60. Po pretečeni reakciji, smo epice vzeli iz PCR aparata, jim dodali 0,5 μl barve BFB in izvedli EF. Po 13 min je bila EF končana. Izstopajoče lise smo preverili pod UV svetlobo valovne dolžine 312 nm z transiluminatorjem, Na računalniškem ekranu so se nam prikazali rezultati, ki nam jih prikazuje slika 4-1. Dve skupini, P2 in P5, sta bili HPV pozitivni. Slika 4-1: Skupini P2 in P5 sta HPV pozitivni. 35

49 Na sliki lahko opazimo intenzivna signala v zgornji vrstici pri P2 in P5, ki označujeta prisotnost humanega papiloma virusa. Pri ostalih lahko vidimo odsotnost signala značilnega za HPV. Slepa proba oz slepi vzorec (0) je vseboval enake količine PCR kemikalij, začetnih oligonukleotidov in vode kot ostale skupine, vendar ni vseboval DNA in nam je služil za kontrolo PCR reakcije. 36

50 4.2 Rezultati verižne reakcije s polimerazo skupin 2 in 5 Zastavili smo si načrt, da bomo delo nadaljevali samo s skupinami, v katerih bo potrjen HPV. V teh skupinah bomo točno preverili zaradi katerih DNA vzorcev, so bile posamezne skupine pozitivne na HPV. Na HPV potrjenih DNA vzorcih bomo poskusili odkriti tudi vrsto HPV. Metoda dela bo enaka, torej PCR, le da bomo preverjali posamezne DNA vzorce v teh skupinah in ne več skupka DNA tumorjev. Ko smo izvedeli, da se v skupini 2 in 5 nahajajo pozitivni DNA vzorci, smo na teh 21 vzorcih DNA izvedli verižno reakcijo polimeraze in dobili rezultate, ki jih prikazujeta sliki 4-2 in 4-3. Slika 4-2: Rezultat verižne reakcije s polimerazo skupine P5 za vzorce: 46, 61, 20, 57, 60, 6, 23, 37, 38, 8, 12 in za slepi vzorec. 37

51 Slika 4-3: Rezultat verižne reakcije s polimerazo skupine P2 za vzorce: 51, 41, 48, 31, 34, 35, 29, 30Č, 53, 19 in za slepi vzorec. Iz slik je razvidno, da sta izmed 21 vzorcev pozitivna samo 41 in 57. Pri vseh ostalih ne vidimo nobenih signalov, kar kaže na to, da ni prisotnosti HPV-a. Nato smo še obema pozitivnima vzorcema želeli določiti tip HPV. Preverjali smo le najpogostejše tipe HPV, to so: 6, 11, 16 in 18. Izkazalo se je, da je v vzorcu 57 prisoten HPV 11, kar prikazuje spodnja slika, medtem, ko vzorec 41 vsebuje enega od redkejših tipov. 38

52 Slika 4-4: Rezultati verižne reakcije s polimerazo za vzorec 41 iz skupine P2, vzorec 57 iz skupine P5, slepi vzorec in vzorec 12 iz skupine P5. V vzorcu 57 je potrjen HPV

53 5 Razprava Izoliranih HPV virusov je vedno več. Mnogi med njimi so si zelo podobni. Je pa tudi vedno več metod kako določevati njihovo prisotnost. Prav tako je tehnologija določanja skozi leta napredovala, tako, da se da enostavno določiti prisotnost HPV DNA v tumorjih in vrsto le tega 4. V diplomskem delu smo določali prisotnost HPV-a na 51 DNA vzorcih. Preiskovali smo DNA vzorce ORL tumorjev oz. natančneje raka grla. DNA vzorcem smo najprej izmerili koncentracijo. To smo merili s posebno napravo imenovano Nanodrop Vzorce smo sprva segreli na sobno temperaturo (22 C), jih premešali na vibracijskem mešalniku in centrifugirali pri 2200 rpm. Nato smo z napravo Nanodrop 2000 in računalniškim programom Nanodrop vzorcem izmerili koncentracijo nukleinske kisline. Glede na približno enake vrednosti koncentracije nukleinske kisline smo vzorce razdelili v 5 skupin. Vsaka skupina je vsebovala po 1 μl posamezne DNA, 2,5 μl mešanice PCR kemikalij, 0,5 μl začetnega oligonukleotida HPV MY 09, 0,5 μl začetnega oligonukleotida HPV MY 11 in 0,5 μl H 2 O. Tako pripravljene epice smo ponovno dobro premešali na vibracijskem mešalniku, jih centrifugirali 10 s pri 2200 rpm in jih prenesli v PCR aparat, kjer smo nastavili program MM 60. Po 1 h in 47 min je PCR reakcija potekla. Epice smo vzeli iz PCR bloka, jim dodali 0,5 μl barvila BFB in prenesli v EF instrument. Po 13 min smo prekinili električni tok ter rezultate preverili s pomočjo transiluminatorja, sistema za slikanje gelov. Na računalniškem ekranu smo videli izrazite signale, ki so nam prikazali katere od skupin vsebujejo HPV, ter jih s pomočjo tiskalnika natisnili. PCR je trenutno najobčutljivejša metoda za dokazovanje okužb s HPV. Omogoča neposredno kloniranje genomske DNA ali cdna, usmerjeno mutagenezo DNA, analizo DNA, ki je dostopna v majhnih količinah, ter različne diagnostične postopke. Reakcija je sestavljena iz ponovitev temperaturnih ciklov zaporedne denaturacije osamljene DNA, spajanja izbranih začetnih oligonukleotidov s komplementarnimi zaporedji, ter sinteze nove komplementarne DNA v območju med začetnima oligonukleotidoma. Vsaka novo sintetizirana kopija odseka DNA v naslednjem ciklu reakcije služi kot matrica. En krog reakcije verižne polimerizacije je sestavljen iz treh stopenj. Na prvi stopnji z visoko temperaturo denaturiramo tarčno DNA. Na naslednji stopnji temperaturo znižamo pod temperaturo tališča vezave obeh oligonukleotidov, na zadnji stopnji pa temperaturo dvignemo 40

54 na optimalno območje za delovanje encima DNA polimeraze. En krog reakcije nam omogoči, da iz ene tarčne DNA dobimo dve molekuli, z vsakim naslednjim krogom pa se število molekul eksponentno veča. Da uspešno pomnožimo določeni odsek DNA, moramo izbrati pravilne pogoje s katerimi dosežemo optimalno specifičnost in učinkovitost same reakcije 19. Med potekom reakcije smo si pripravili še 3% agarozni gel, katerega smo po končani PCR reakciji prenesli v EF instrument. Po 13 min smo električni tok v EF prekinili in analizirali ločene odseke DNA. Tako smo dobili izrazite signale, ki smo si jih ogledali pod UV svetlobo pri 312 nm. Ta nam je pokazala v katerih skupinah obstajajo vzorci, ki so pozitivni na zgoraj omenjeni virus. Delo smo nadaljevali samo z obema HPV pozitivnima skupinama, torej s skupino 2 in 5. Vsak posamezen vzorec iz teh skupin smo vstavili v lastno epico in mu dodali MM, vodo, ter začetne oligonukleotide. Nato smo ga ustrezno premešali in centrifugirali, tako, da je bil pripravljen za PCR reakcijo. Končani PCR reakciji je ponovno sledila gelska elektroforeza in detekcija v UV območju. Izkazalo se je, da je v vsaki skupini HPV prisoten le v enem vzorcu. Tako nam je z opisano PCR metodo uspelo določiti prisotnost HPV DNA v ORL tumorjih. Vzorcema smo želeli ugotoviti še tip HPV-a. Osredotočili smo se na najpogostejše oz. tiste, ki smo jih imeli na razpolago, to so bili: 6, 11, 16 in 18. Postopek dela je bil enak, le da smo zamenjali začetne oligonukleotide. Uspelo nam je dokazati, da je v vzorcu 57 prisoten HPV 11, medtem, ko je bil vzorec 41 negativen na preskušane tipe HPV. Tako lahko sklepamo, da je v drugemu vzorcu prisoten eden od redkejših tipov HPV-a. S PCR metodo nam je torej uspelo ugotoviti tudi tip HPV za vzorec DNA. Da pa bi lahko zanesljivo potrdili, da je ta metoda učinkovita tudi za določevanje tipov HPV, bi morali poskus opraviti na večjem številu vzorcev. 41

55 6 Sklep V diplomskem delu smo dokazali prisotnost HPV DNA v ORL tumorjih s pomočjo PCR metode. Ta se je izkazala za enostavno, hitro in učinkovito. Rezultate dobimo že v manj kot dveh urah. Ti po končani EF dajo jasne signale, ki si jih je moč ogledati s pomočjo UV svetlobe. S temi signali nato ni težko razbrati v katerih DNA vzorcih je prisoten HPV. S to isto metodo smo določili tudi tip HPV-a enega od pozitivnih vzorcev, s čimer je PCR reakcija nakazala, da bi se lahko uporabljala tudi v namene odkrivanja točno določenega tipa HPV-a v DNA vzorcu. Da pa bi to dokazali, bi morali opraviti celotno validacijo uporabljene PCR metode na večjem številu vzorcev. 42

56 7 Literatura 1. Budihna M., Lindtner J., Zveza slovenskih društev za boj proti raku, Slovensko zdravniško društvo (Ljubljana), Kancerološka sekcija (Ljubljana). Rak glave in vratu zbornik / 7. onkološki vikend. Ljubljana: Glaxo, str. 7, 16 in 20, Hpv.org. HPV and throat cancer. The New Zealand HPV project (dostop: ). 3. Alos L., Cardesa A., Gale N., Luzar B., Pižem J., Poljak M., Strojan M., Vizjak A., Volavšek M., Zidar N. Tumorji v povezavi z okužbo s človeškimi virusi papiloma (HPV). Ljubljana : Inštitut za patologijo, Medicinska fakulteta, str. 13, Gale N., Fujs K., Kocjan B. J., Luzar B., Poljak M., Potočnik M., Seme K. Humani virusi papiloma (HPV). Ljubljana: Onkologija / v žarišču, str. 60, dkfz.de. Deutsches Krebsforschungszentrum. (dostop: ). 6. Gravitt P., Hoory T., Monie A., T. Wu. Molecular Epidemiology of Human Papillomavirus. Baltimore, USA: Elsevier & Formosan Medical Association, str. 198, Bagheri A., Chung C., D Souza G. Epidemiology of oral human papillomavirus infection. Baltimore, US: Oral Oncology, str. 1, Petrovec M., Poljak M. Medicinska virologija. Ljubljana: Medicinski razgledi, str.: 41-43, 50-53, 58-59, Altemani A., Brito H., Vassallo J. Detection of human papillomavirus in laryngeal squamous dysplasia and carcinoma. An in situ hybridization and signal amplification study. Campinas, Brazil: Acta Otolaryngol 120, str. 540,

57 10. Anderson A., Ellison M., James J., Moran M., Murray L., O Rorke A. Human papillomavirus related head and neck cancer survival: A systematic review and metaanalysis. Belfast, UK: Oral Oncology 48, str. 1191, Evans M., Powell N. The Changing Aetiology of Head and Neck Cancer: the Role of Human Papillomavirus. Cardiff, UK: Clinical Oncology 22, str. 538, Kokalj V. N., Herodež Š., Zagorac A., Zagradišnik B. Navodila za vaje iz molekularne biologije, skripta (4.izdaja). Maribor: Medicinska fakulteta, str. 19 in 21, Castellsague X., Schwartz S.. Human Papillomavirus and Diseases of the Upper Airway: Head and Neck Cancer and Respiratory Papillomatosis. Columbus, OH, USA: Vaccine 30S, str. F34, U.S. Department of Healt and Human Services. U.S. Food and Drug Administration (dostop: ). 15. Medenosrce.net. ORL raki (dostop: ). 16. Buckley J., Ferlito A., Rinaldo A., Shaha A. Contemporary important considerations in diagnosis and treatment of head and neck cancer. New York, USA: Acta Otolaryngol 122, str. 115, Thermo Scientific Nanodrop products (dostop: ). 18. Erjavec Š. A., Kokalj V. N., Stangler H. Š., Zagorac A.. Navodila za vaje iz molekularne biologije, skripta (5. izdaja). Maribor: Medicinska fakulteta, str. 30 in 31, Jančar B. Okužba s humanim virusom papiloma in tveganje za nastanek raka glave in vratu. Ljubljana: Onkološki inštitut. št. 2, str.: ,

58 8 Življenjepis OSEBNI PODATKI Simon Pintarič Mariborska cesta 2, SI-2234 Benedikt (Slovenija) Spol Moški Datum rojstva 16/1/1991 Državljanstvo slovensko ŽELENO PODROČJE DELA Molekularna biologija, Kemik analitik DELOVNE IZKUŠNJE 1/3/2013 1/4/2013 Izbirni predmet: študijska praksa Laboratorij za medicinsko genetiko, UKC Maribor, (Slovenija) PCR analize, diagnostika 1/4/2013 7/5/2013 Usposabljanje za pripravo diplomske naloge Laboratorij za medicinsko genetiko, UKC Maribor, (Slovenija) delo z metodo PCR IZOBRAŽEVANJE IN USPOSABLJANJE Osnovna šola Osnovna šola Benedikt, Benedikt (Slovenija) Gimnazijski maturant III. gimnazija, Maribor (Slovenija) Univerzitetni diplomirani kemik Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Maribor (Slovenija) KOMPETENCE Materni jezik slovenščina 45