Magistrsko delo RAZVOJ KINETIČNEGA MODELA IN SPREMLJANJE RAZGRADNJE SPECIFIČNEGA ANTIBIOTIKA MED PROCESOM ODSTRANJEVANJA IZ ODPADNE VODE marec, 2018 Neja Tevž
Neja Tevž RAZVOJ KINETIČNEGA MODELA IN SPREMLJANJE RAZGRADNJE SPECIFIČNEGA ANTIBIOTIKA MED PROCESOM ODSTRANJEVANJA IZ ODPADNE VODE Magistrsko delo Maribor, 2018
RAZVOJ KINETIČNEGA MODELA IN SPREMLJANJE RAZGRADNJE SPECIFIČNEGA ANTIBIOTIKA MED PROCESOM ODSTRANJEVANJA IZ ODPADNE VODE Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje Študent: Študijski program: Predvideni strokovni naslov: Mentor: Komentor: Komentor: Neja Tevž magistrski študijski program II. stopnje Kemija magister/magistrica kemije red. prof. dr. Andreja Goršek doc. dr. Darja Pečar Roman Burja, univ. dipl. inž. kem. inž. Maribor, 2018
Kazalo Kazalo... I Izjava... III Zahvala... IV Povzetek... V Abstract... VI Seznam slik... VII Seznam tabel... VIII Uporabljeni simboli in kratice... IX 1 Uvod... 1 Opredelitev problema in namen magistrske naloge... 2 2 Teoretični del... 3 Amoksicilin (amoxicillin)... 3 Klavulanska kislina (clavulanic acid)... 5 Vpliv farmacevtikov na okolje... 7 2.3.1 Slovenska zakonodaja... 9 2.3.2 Obstoječe analizne metode za določanje farmacevtikov v odpadnih vodah... 11 3 Materiali in metode... 12 Kemikalije... 12 Instrumenti... 12 Metode dela... 13 3.3.1 Visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC)... 13 3.3.2 Priprava raztopin... 14 3.3.3 Potek dela... 15 3.3.4 Kinetika razgradnje specifičnega antibiotika... 17 4 Eksperimentalni del... 19 Izdelava umeritvene krivulje... 19 Izvedba reakcije... 20 Izvedba reakcije pri različnih začetnih ph vrednostih... 21 Izvedba reakcije pri različnih temperaturah... 21 Realni vzorec... 22 5 Rezultati in diskusija... 23 Procesni parametri... 24 5.1.1 Potek reakcije pri različnih ph vrednostih... 24 5.1.2 Potek reakcije pri različnih temperaturah... 28 Kinetika reakcije razpadanja amoksicilina... 33 5.2.1 Reakcija pri T = 15 C... 33 5.2.2 Reakcija pri T = 20 C... 34 5.2.3 Reakcija pri T = 25 C... 35 5.2.4 Reakcija pri T = 30 C... 36 5.2.5 Določitev aktivacijske energije reakcije... 37 Realni vzorec... 38 5.3.1 Realni vzorec vtočne vode... 38 5.3.2 Realni vzorec iztočne vode... 38 4. Zaključek... 39 I
5. Literatura... 41 6. Priloge... 44 6.1. Priloga 1... 44 6.2. Priloga 2... 46 7. Življenjepis... 48 II
Izjava Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal/a sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih: Vir: Science direct (www.sciencedirect.com) Gesla: Število referenc determination IN amoxicillin IN clavulanic acid 105 HPLC IN analysis 243 Pharmaceutical IN wastewater 121 Vir: Web of science (www.webofknowledge.com) Gesla: Število referenc QuEChERS IN pharmaceutical 48 waste water 67 environment IN pharmaceutical 34 Skupno število pregledanih člankov: 20 Skupno število pregledanih knjig: 2 Maribor, marec 2018 Neja Tevž podpis III
Zahvala Iskreno se zahvaljujem mentorici red. prof. dr. Andreji Goršek za vso strokovno pomoč, potrpljenje in vodenje pri izdelavi magistrske naloge. Zahvalila bi se obema somentorjema, doc. dr. Darji Pečar, ki me je vodila in mi pomagala skozi praktični del naloge in Romanu Burji, ki je pomagal pri izbiri tematike ter mi omogočil izdelavo naloge v okviru podjetja Lek na Prevaljah. Hvala staršem, sestri Daši, fantu Andražu in njegovi družini za spodbude, pomoč in razumevanje v času pisanja magistrske naloge. IV
Razvoj kinetičnega modela in spremljanje razgradnje specifičnega antibiotika med procesom odstranjevanja iz Povzetek Magistrsko delo prikazuje optimizacijo procesov čiščenja odpadnih vod pri proizvodnji antibiotikov. Na podlagi analiz reakcij, izvedenih v laboratorijskem merilu, so podani ocena stanja trenutnega procesa in predlogi izboljšav. V prvi fazi raziskav smo v manjšem reaktorju izvedli serijo eksperimentov na pripravljenih vzorcih vod in z analizo na HPLC za namene kinetskih študij, določili koncentracijske profile ključnih substanc amoksicilina in klavulanske kisline. Ugotovili smo, da za razpad klavulanske kisline ne moremo določiti kinetike, saj je reakcija prehitra in koncentracija kisline preide v območje pod mejo zaznave izbrane analitske metode. S pomočjo standardov smo določili linearno območje koncentracij, ki je za amoksicilin od (20-200) µg/ml. V drugi fazi raziskav smo s spreminjanjem določenih procesnih parametrov izvedli optimizacijo reakcije nevtralizacije, ki je del obstoječega procesa čiščenja. Cilj magistrske naloge je bil doseči najnižjo možno koncentracijo amoksicilina po koncu nevtralizacije, kar nam je uspelo pri T = 30 C in ph = 11. Raziskave smo zaključili z analizami realnih vzorcev vtočne in iztočne vode čistilne naprave. Ključne besede: antibiotik, amoksicilin, klavulanska kislina, čiščenje, HPLC. UDK: 577.18:628.179.2(043.2) V
KINETIC MODEL DEVELOPMENT AND MONITORING OF SPECIFIC ANTIBIOTIC DEGRADATION DURING THE WASTEWATER PROCESS Abstract The master's thesis presents the optimization of wastewater treatment processes in the production of antibiotics. Based on the analysis of reactions carried out on a laboratory scale, an assessment of the status of the current process and suggestions for improvements are given. In the first phase of the research, a series of experiments were carried out on the prepared water samples in a small reactor, and by determining the concentration profiles of the key substances - amoxicillin and clavulanic acid by HPLC analysis for the purposes of kinetic studies. We have found that clavulanic acid must not be used for the purposes of kinetic studies, as it rapidly decays during the reaction and thus passes into the area below the detection limit of the selected analytical method. Using the standards, a linear range was determined for amoxicillin from (20-200) μg / ml. In the second phase of the research, the optimization of the neutralization reaction, which is part of the existing wastewater treatment process, was performed by changing certain process parameters. The objective of the master's thesis was to achieve the lowest possible concentration of amoxicillin after the end of neutralization, which we succeeded at T = 30 C and ph = 11. The research was completed by analyzing the real samples of the inlet and outlet water of the treatment plant. Key words: antibiotic, amoxicillin, clavulanic acid, waste water treatment, HPLC. UDK: 577.18:628.179.2(043.2) VI
Seznam slik Slika 2-1: Kemijska struktura amoksicilina. 'Povzeto po [11]'... 3 Slika 2-2: Kemijska struktura kalijevega klavulanata. 'povzeto po [14]'... 5 Slika 2-3: Gliva Streptomyces clavuligerus. 'povzeto po [15]'... 6 Slika 2-4: Nastanek na antibiotik odpornih bakterij. (prirejeno po [20])... 7 Slika 2-5: Glavne poti širjenja farmacevtikov v okolje. (prirejeno po [21])... 8 Slika 3-1: HPLC z UV-detektorjem.... 16 Slika 3-2: Potrditev reakcije drugega reda. (prirejeno po [16])... 18 Slika 4-1: Umeritvena krivulja za amoksicilin.... 19 Slika 4-2: Reaktor z mešalnikom, termostatiran na željeno temperaturo.... 20 Slika 4-3: ph meter.... 21 Slika 4-4: Rotavapor za predkoncentriranje vzorec... 22 Slika 5-1: Koncentracijski profil amoksicilina pri ph = 9.... 24 Slika 5-2: Koncentracijski profil amoksicilina pri ph = 10.... 25 Slika 5-3: Koncentracijski profil amoksicilina pri ph = 11.... 26 Slika 5-4: Sprememba koncentracije amoksicilina v odvisnosti od časa pri različnih ph.... 27 Slika 5-5: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 15 C.... 28 Slika 5-6: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 20 C.... 29 Slika 5-7: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 25 C.... 30 Slika 5-8: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 30 C.... 31 Slika 5-9: Dinamični profil koncentracij amoksicilina pri različnih temperaturah.... 32 Slika 5-10: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 15 C.... 33 Slika 5-11: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 20 C.... 34 Slika 5-12: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 25 C.... 35 Slika 5-13: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 30 C.... 36 Slika 5-14: Grafična določitev aktivacijske energije in predeksponentnega faktorja reakcije razpada amoksicilina.... 37 Slika 7-1: Kromatograf realnega vzorca vhodne pridobljen s HPLC-UV/Vis.... 44 Slika 7-2: Rezultati merjenja realnega vzorca vhodne.... 45 Slika 7-3: Kromatograf dobljen po merjenju realnega vzorca izhodne vode na HPLC-UV/Vis.... 46 Slika 7-4: Rezultati merjenja realnega vzorca izhodne vode... 47 VII
Seznam tabel Tabela 2-1: Nadzorni seznam snovi za spremljanje na ravni Evropske unije. (prirejno po Ur. l. RS, št. 24/2016)... 10 Tabela 3-1: Izračun volumnov za pripravo delovnih raztopin za amoksicilin.... 15 Tabela 4-1: Izračunani kinetični parametri reakcije razpada amoksicilina.... 37 VIII
Uporabljeni simboli in kratice Simboli A površina pika vrhov [mau] crazt Ea k0 k p R množinska koncentracija [mol/l] aktivacijska energija [J/mol] predeksponentni faktor konstanta reakcijske hitrosti [ml µg -1 min -1 ] za reakcijo 2. reda tlak [mbar] plinska konstanta [J/molK] -ra proizvodnost reakcije [µg ml -1 min -1 ] T t V1 V2 temperatura [ C] čas [min] volumen osnovne standardne raztopine [ml] volumen delovne standardne raztopine [ml] Grški simboli β eksponent za betalaktam γ masna koncentracija [g/l] ω čistoča [%] Kratice EGS ES ELISA FAS HPLC Evropska gospodarska skupnost Evropska skupnost Enzyme-linked immuno sorbent assay Farmakološko aktivne snovi High-performance liquid cromatography (visokotlačna tekočinska kromatografija) INN LPME MS International Nonproprietary Names (mednarodno nelastniško ime) Liquid-phase microextraction (mikroekstrakcija s tekočinsko fazo) Masna spektrometrija IX
QuEChERS SPE UV Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe Solid phase extraction Ultravijolično X
XI
1 Uvod V podjetju Lek Prevalje, v eni izmed lokacij farmacevtske družbe Lek, Novartisove generične divizije, poteka proizvodnja najbolj prodajanega izdelka širokospektralnega antibiotika, ki je kombinacija amoksicilina in klavulanske kisline.[1] Tako kot v vsakem večjem industrijskem obratu, je tudi tukaj potreba po vodi velika, kar ima za posledico večje količine. Ostanki farmakološko aktivnih snovi (FAS) v vodi, med katere uvrščamo amoksicilin in klavulansko kislino, predstavljajo vse resnejši okoljski problem[2], katerega se zavedajo tudi v Leku v Prevaljah. Koncentracije teh učinkovin v vodi, ki zapušča proizvodnjo, morajo biti čim nižje, zato v ta namen uporabljajo čistilno napravo.[3] Nadzor nad vsebnostjo učinkovin v vodi, ki zapušča čistilno napravo, izvajajo z rednimi analizami, ki kažejo, da je ta v mejah normale. Zaradi zelo nizkih vsebnosti FAS v vodi, je vzorec, preden gre na analize, potrebno predkoncentrirati in hkrati odstraniti vse moteče snovi.[2] Analitske metode za določanje amoksicilina in klavulanske kisline vsebujejo mikrobiološke teste[5], encimske teste [6], UV spektrofotometrijo [7] in polarografijo [8]. Za bolj natančno in specifično določanje teh dveh spojin se izvajajo meritve na visokotlačnem tekočinskem kromatografu (HPLC), s katerim smo izvajali analize, predstavljene v tej magistrski nalogi. 1
Opredelitev problema in namen magistrske naloge Namen magistrske naloge je bil določiti natančno koncentracijo amoksicilina in klavulanske kisline ter kinetiko reakcije, ki poteka med procesom nevtralizacije oz. čiščenja industrijske vode podjetja Lek Prevalje. Reakcijo nevtralizacije izvajajo v bazenu, ki prenese do 50 m 3. Zaradi lažjega nadziranja reakcije smo v ta namen enak postopek prenesli v manjši reaktor s 500 ml pripravljenega vzorca, od koder smo lahko vzorce kontinuirano odvzemali. Koncentracije amoksicilina in klavulanske kisline smo ustrezno povišali, s čimer smo jih prilagodili merilnemu območju instumenta (meji detekcije). Tako smo pridobili rezultate, s katerimi smo lahko določili kinetiko reakcije razgradnje antibiotika. Cilji magistrskega dela so bili: Raziskava kinetike razpada amoksicilina v vodi pri različnih ph in temperaturah. Raziskava kinetike razpada kalijevega klavulanata pri različnih ph in temperaturah. Določitev procesnih parametrov, pri katerih bi lahko na iztoku iz čistilne naprave dosegli najnižjo koncentracijo amoksicilina in klavulanske kisline. Določitev koncentracije amoksicilina in klavulanske kisline v realnih vzorcih odpadnih vod. 2
2 Teoretični del Glavni komponenti pri našem delu sta bili farmakološko aktivni sestavini amoksicilin in klavulanska kislina oz. kalijev klavulanat. To sta kemikaliji, iz katerih v podjetju Lek Prevalje pridobivajo širokospektralni antibiotik, amoksiklav. Amoksicilin (amoxicillin) Kemijsko ime: (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-amino-2-(4-hidroksifenil)acetil]amino]-3,3dimetil-7-- okso-4-tia-1-azabiciklo[3.2.0]heptan-2-karboksilna kislina [12] INN: amoksicilin trihidrat Molekulska formula: C16H19N3O5 Molska masa: 365,40 g/mol Kemijska struktura je prikazana na sliki 2-1. Slika 2-1: Kemijska struktura amoksicilina. 'Povzeto po [11]' Amoksicilin je betalaktamski širokospektralni penicilinski antibiotik, ki se uporablja za zdravljenje mnogih infekcij, ki jih povzročijo Gram-pozitivne in Gram-negativne bakterije v človeškem in živalskem organizmu. Sem spadajo npr. akutno vnetje srednjega ušesa, okužbe sečil, pljučnica, gonoreja in infekcije, ki jih povzroči E. Coli ali salmonela. 3
Po kemijski sestavi je podoben ampicilinu (pol-sintetičnemu aminopenicilinu), z razliko, da ima amoksicilin hidrolizirano stransko verigo fenila. Na voljo je kot bel prah ali kristalinično trdna snov, ki ima tališče pri 194 C in je delno topen v vodi, slabo topen v v etanolu, in skoraj netopen v olju. [10][28] Amoksicilin, tako kot vsi drugi penicilini, zavira rast celičnih sten bakterij. Z odprtjem laktamskega obroča se veže na encimsko transpeptidazo, s čimer preprečuje nastanek peptidnih vezi med peptidoglikanskimi verigami in posledično rast bakterije. [11] Amoksicilin so odkrili leta 1958, uporabljati so ga začeli leta 1972. Spada med najpomembnejša zdravila in je na seznamu osnovnih zdravil Svetovne zdravstvene organizacije. Na tržišču se pojavlja v obliki generičnih zdravil (to je zdravilo z isto kakovostno in količinsko sestavo učinkovine in je iste farmacevtske oblike kot originatorsko zdravilo), v Sloveniji pod zaščitenimi imeni Hiconcil in Ospamox. [11] 4
Klavulanska kislina (clavulanic acid) Kemijsko ime: (2R,5R,Z)-3-(2-hidroksietildien)-7-okso-4-oksa-1-aza-biciklo[3.2.0] heptan- 2-karboksilna kislina [12] INN: kalijev klavulanat Molekulska formula: C2H2NO5 Molska masa: 199,16 g/mol Kemijska struktura je prikazana na sliki 2-2. Slika 2-2: Kemijska struktura kalijevega klavulanata. 'povzeto po [14]' Klavulanska kislina je snov, ki v kombinaciji z amoksicilinom služi kot zaviralec encima betalaktamaze, ter na ta način poveča učinkovitost antibiotika. Betalaktamaze so družine encimov, ki hidrolizirajo betalaktamski obroč pri penicilinskih antibiotikih in jih na ta način deaktivirajo. Ta encim proizvajajo le nekatere bakterije, ki so na ta način razvile odpornost proti tovrstnim antibotikom. Torej, encim betalaktamaza deaktivira penicilin, klavulanska kislina pa deaktivira betalaktamazo na način, da se ireverzibilno veže na aktivno skupino encima. [13][14] Klavulanska kislina je dobila ime po gobi Streptomyces clavuligerus, ki je vir te snovi v naravi (slika 2-3). Biosintezno se sicer tvori iz aminokisline arginin in sladkorja gliceraldehid-3- fosfata.[14] 5
Slika 2-3: Gliva Streptomyces clavuligerus. 'povzeto po [15]' Zanimivo je, da so S. clavuligerus prvotno izolirali zaradi sposobnosti izdelave betalaktamskega antibiotika, cepamicina C in ostalih sorodnih betalaktamskih antibiotikov, nato pa so leta 1975 v farmacevtski družbi Beecham odkrili, da proizvaja tudi klavulansko kislino. Leta 1985 je podjetje dobilo patentno zaščito za to snov. [13][14] 6
Vpliv farmacevtikov na okolje Glede na število izdanih receptov je poraba zdravil v preteklem desetletju narastla za približno 20 %. Kot posledica, je vedno več ostankov in metabolitov teh zdravil v odpadnih in površinskih vodah. Iz literature [17] je razvidno, da so največji onesnaževalci ravno analgetiki in antibiotiki. Učinkovine lahko pridejo v okolje oz. vodni sistem na različne načine. Največ ostankov zdravil se v okolje prenese zaradi porabe zdravil, torej preko izločkov ljudi in živali, saj čistilne naprave, kot jih poznamo do sedaj, še niso dovolj razvite, da bi te substance v celoti odstranile iz. Glavni viri so še industrijske vode, ki prihajajo iz proizvodnih obratov zdravil ter nepravilno odlaganje odpadnih zdravil. [18] Pojav antibiotikov v vodi lahko povroči rast odpornih mikroorganizmov, kar pripelje do razvoja resnejših bolezni pri ljudeh. Kako nastanejo na antibiotik odporne bakterije in na kakšen način se širijo v okolju, je prikazano na sliki 2-4. Slika 2-4: Nastanek na antibiotik odpornih bakterij. (prirejeno po [20]) 7
Velik problem je pojav hormonskih zdravil v okolju, saj so v biološkem sistemu organizmi, ki imajo podobne receptorje, kot ljudje, kar lahko posledično povzroči razne hormonske motnje.[19] Koncentracije farmacevtikov v odpadnih vodah so sicer zelo nizke (µg in ng/l), vendar so to še vedno aktivne snovi, katerih kopičenje lahko pripelje celo do toksičnosti. So pa te snovi lahko prisotne tako v kanalizaciji, površinski vodi, podtalnici, vodi v pipah, sedimentih, gnoju, tleh in drugih okoljskih matrikah. [18] Prikaz nekaterih virov širjenja farmacevtikov v okolje je prikazan na sliki 2-5. Slika 2-5: Glavne poti širjenja farmacevtikov v okolje. (prirejeno po [21]) 8
2.3.1 Slovenska zakonodaja Z zakonom o varstvu okolja, ki je bil sprejet leta 2004, se je v slovenski pravni red preneslo vrsto direktiv Evropske skupnosti s področja varstva okolja. Zakon ureja ukrepe varstva okolja, spremlja stanje okolja, ekonomske in finančne instrumente okolja, javne službe na področju varstva okolja in vse ostalo, kar je povezano s tem. [22] Zakon o varstvu okolja je bil nazadnje spremenjen leta 2013. Na podlagi Zakona o varstvu okolja so bile sprejete uredbe in predpisi, ki določajo mejne vrednosti emisij in ukrepe za zmanjševanje emisij ter toplote pri odvajanju odpadnih voda iz industrijskh naprav. Osnovni predpis, ki na tem področju velja, je Uredba o emisiji snovi in toplote pri odvajanju odpadnih voda v vode in javno kanalizacijo, katere zadnja verzija je bila sprejeta leta 2012 in je bila do danes še dvakrat spremenjena. Ta Uredba v zvezi z zmanjševanjem onesnaževanja okolja zaradi emisije snovi in emisije toplote, ki nastajata pri odvajanju komunalne, industrijske in padavinske ter njihovih mešanic v vode, določa mejne vrednosti emisij snovi in toplote, vrednotenje emisij snovi in toplote, ukrepe preprečevanja emisij snovi in toplote pri odvajanju odpadnih voda, ukrepe zmanjševanja emisij snovi in toplote pri odvajanju odpadnih voda, druge ukrepe zmanjševanja emisij snovi, pogoje za odvajanje odpadnih voda in obveznosti investitorjev in upravljavcev naprav, ki se nanašajo na pridobitev okoljevarstvenega dovoljenja in obratovanje naprave v skladu z: - Direktivo Sveta z dne 21. maja 1991 o čiščenju komunalne (91/271/EGS), - Direktivo Evropskega parlamenta in Sveta 2000/60/ES z dne 23. oktobra 2000 o določitvi okvira za ukrepe Skupnosti na področju vodne politike, - Direktivo 2006/118/ES Evropskega parlamenta in Sveta z dne 12. decembra 2006 o varstvu podzemne vode pred onesnaževanjem in poslabšanjem in - Direktivo 2010/75/ES Evropskega parlamenta in Sveta z dne 24. novembra 2010 o industrijskih emisijah (celovito preprečevanje in nadzorovanje onesnaževanja) [23]. Uredba o stanju površinskih voda, ki je bila sprejeta leta 2009, določa merila za ugotavljanje stanja površinskih voda, okoljske standarde kakovosti za ugotavljanje kemijskega stanja ter merila in okoljske standarde kakovosti za ugotavljanje ekološkega stanja površinskih voda ter 9
vrste monitoringa stanja površinskih voda. Šele v spremembi te uredbe, leta 2016, so v nadzornem seznamu, ki je priloga te uredbe, prvič vključeni tudi farmacevtiki (tabela 2-1). Tabela 2-1: Nadzorni seznam snovi za spremljanje na ravni Evropske unije. (prirejno po Ur. l. RS, št. 24/2016) Iz nadzornega seznama je razvidno, da monitoring amoksicilina in klavulanske kisline še vedno ni obvezen, podjetje Lek na zahtevo skupine Novartis ta monitoring izvaja. Mejne vrednosti parametrov industrijske in posebne ukrepe v zvezi z zmanjševanjem emisij snovi za naprave za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov in učinkovin v zvezi z emisijami snovi in toplote pri odvajanju industrijske, ureja Uredba o emisiji snovi in toplote pri odvajanju iz naprav za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov in učinkovin. Uredba je bila sprejeta leta 2007.[24] 10
2.3.2 Obstoječe analizne metode za določanje farmacevtikov v odpadnih vodah Največji problem analiz in določanja farmacevtikov v odpadnih vodah je kompleksen vzorec, saj je v njem raztopljenih več različnih organskih snovi. Prav tako so koncentracije analitov zelo nizke (govorimo o ng/l) in je v večini primerov potrebna predkoncentracija vzorca, za katero lahko uporabimo različne tehnike. Najpogostejša tehnika za pripravo in čiščenje vzorca je ekstrakcija iztrdne faze (SPE), ki se uporablja predvsem pred merjenjem s tekočinsko kromatografijo sklopljene z npr.: masnim spektrometrom (MS), tandemskim masnim spektrometrom (MS-MS), masnim spektrometrom z uporabo ionizacije z elekropršilom (ESI), UV-Vis spektroskopijo, itd. [25] Druge pogostejše tehnike za pripravo vodnega vzorca so še QuEChERS, ki se pogosto uporablja za okoljske matrike in mikroekstrakcija s topili (LPME), katere glavna prednost je zelo majhna poraba organskega topila in nizka cena. [26][27] Kot že zgoraj omenjeno, sta največkrat uporabljeni tehniki za določanje farmacevtikov in njihovih metabolitov v vodi, tekočinska kromatografija z masno spektroskopijo oz. visokotlačna tekočinska kromatografija z masno spektroskopijo. V literaturi lahko najdemo še druge tehnike določanja farmacevtikov, kot npr.: potenciometrična titracija, razne kolorimetrične metode, polarografija, itd. Poročali so o testiranju amoksicilina z mikrobiološkimi testi z agar ploščo (ELISA), ki je sicer dolgotrajna in občutljiva metoda. [28] 11
3 Materiali in metode V preliminarni fazi raziskav smo morali določiti pogoje, ki bi nam omogočali določanje koncentracije amoksicilina in klavulanske kisline z uporabo HPLC. Dejanska koncentracija obeh preiskovanih komponent je namreč tako nizka, da njunega razpada z aparatom, ki smo ga imeli na razpolago, ne bi mogli slediti. Zato smo pripravili raztopino z nekoliko višjo koncentracijo od realne (γ = 1 g/l), saj smo le na ta način lahko spremljali potek reakcije. Vrednosti koncentracij smo lahko umestili v umeritveno krivuljo. Kemikalije Pri delu smo uporabljali naslednje kemikalije (Molekulska formula, M = molska masa, dobavitelj, ω = čistost): Natrijev hidroksid (NaOH, M = 40,00 g/mol, Riedel-deHaën), Klorovodikova kislina (HCl, M = 36,46 g/mol, Sigma-Aldrich, ω = 37 %), Natrijev hipoklorit (NaOCl, Šampionka), Kalijev dihidrogen fosfat, (KH2PO4, M = 136,08 g/mol, Merck), Standard kalijev klavulanat (C2H2NO5, M = 199,16 g/mol, Lek), Standard amoksicilin (C16H19N3O5S, M = 365,4 g/mol, Lek,, ω = 85,4 %) in Metanol (CH4O, M = 32,04 g/mol, Sigma-Aldrich). Instrumenti Pri delu smo uporabljali naslednje instrumente: HPLC (Varian 9012) (C-18 kolona, 150 x 4,6 mm I.D., velikost delcev 5 µm), UV/VIS detektor (Varian, 9065 Polychrom), analitsko tehtnico (Mettler Toledo), ultrazvočno kopel (Iskra), termostat (Wise Circu), stresalnik (Yellow line), magnetni mešalnik z grelno ploščo (Velp Scientifica), 12
propelersko mešalo in stekleno reaktorsko posodo z nastavki (V = 1 L) Metode dela Kemikaliji amoksicilin in kalijev klavulanat za pripravo standardov in raztopin, ter navodila za izvedbo postopka nevtralizacije, smo dobili od podjetja Lek. Metodo za določanje amoksicilina in kalijevega klavulanata smo povzeli po članku iz revije International Journal of ChemTech Research [9]. 3.3.1 Visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC) Visokotlačna tekočinska kromatografija (HPLC,) je najpogostejša analitska metoda, ki se uporablja za določanje in raziskovanje številnih zdravil. Z njim lahko izvajamo kvalitativne in kvantitativne analize neznanih spojin ter ločujemo mešanice spojin kot pripravo za nadaljne analize separacija. Deluje tako, da majhna količina raztopine, ki jo želimo analizirati, s pomočjo mobilne faze/topila eluira skozi kolono, kjer se pozamezne molekule na podlagi interakcij s stacionarno fazo ločijo in zapuščajo kolono ob različnih retenzijskih časih. Pri HPLC je velikost delcev, ki predstavljajo stacionarno fazo v koloni, zelo majhna. Standardna velikost delcev za tekočinsko kromatografijo je 60 µm, medtem, ko se pri HPLC uporabljajo delci veliki le 5 µm, kar poveča površino stacionarne faze, maksimizira interakcijo med delci ter posledično izboljša ločitev. Primarni deli HPLC so črpalka, injektor, kolona in detektor. Črpalka nadzira pretok mobilne faze skozi sistem. Ko zapusti črpalko, vstopi mobilna faza v injektor, nato skozi kolono in končno skozi optično enoto detektorja, ki kaže kdaj se določen analit eluira iz kolone. Na podlagi retenzijskega časa in površine vrhov nato določimo koncentracijo analita. [29] 13
3.3.2 Priprava raztopin Večino raztopin, ki smo jih uporabljali pri delu, smo pripravili v naprej. Priprava raztopine NaOH Pripravili smo 50 % raztopino NaOH, ki smo jo uporabljali pri reakciji nevtralizacije. V 100 ml čašo smo natehtali 50 g NaOH, dodali približno 80 ml vode in med ohlajanjem mešali, da se je raztopil. Vse skupaj smo prenesli v 100 ml bučko in dopolnili do oznake. Priprava mobilne faze Za mobilno fazo smo uporabili mešanico fosfatnega pufra in metanola v razmerju 95:5. V 900 ml destilirane vode smo raztopili 7,8 g KH2PO4, raztopino prenesli v 1000 ml bučko, dopolnili do oznake ter uravnali ph na 4,4 ± 0,1. Odmerili smo 950 ml tako pripravljene raztopine, ji dodali 50 ml metanola in dali mešati za nekaj minut. Priprava raztopine za redčenje Raztopino za redčenje osnovne standardne raztopine smo pripravili tako, da smo zmešali 60 ml destilirane vode in 60 ml mobilne faze. Priprava osnovne standardne raztopine amoksicilina oz. kalijevega klavulanata Za pripravo osnovne standardne raztopine s koncentracijo 1000 µg/ml, smo v 100 ml bučko zatehtali 100 mg amoksicilina oziroma kalijevega klavulanata, dopolnili s približno 50 ml mobilne faze in dali za 20 min v ultrazvočno kopel. Ko se je vse raztopilo, smo z dodatkom mobilne faze dopolnili do oznake. 14
3.3.3 Potek dela Priprava standardnih raztopin za umeritveno krivuljo Iz osnovne standardne raztopine, pripravljene po postopku, opisanem v poglavju 3.3.2.4, smo z razredčevanjem pripravili sedem raztopin v koncentracijskem območju od (20 200) µg/ml. Odpipetirali smo izračunani volumen (enačba 3.1) osnovne raztopine in z raztopino, pripravljeno po postopku, opisanem v poglavju 3.3.2.3, razredčili do volumna standardne raztopine, 1000 µl. Izračunane vrednosti volumnov za pripravo standardnih raztopin, so podane v tabeli 3-1. Izračun za pripravo standardnih raztopin: osnovna razt.... (3.1) V1 V2 γ1 γ2 volumen osnovne standardne raztopine [µl] volumen standardne raztopine [µl] masna koncentracija osnovne standardne raztopine [µg/ml] masna koncentracija standardne raztopine [µg/ml] Tabela 3-1: Izračun volumnov za pripravo standardnih raztopin za amoksicilin. γ2 [µg/ml] V1 [µl] Vrazt. za redč. [µl] 0 0 1000 20 20 980 40 40 960 60 60 940 80 80 920 100 100 900 200 200 800 15
Standardne raztopine v primeru kalijevega klavulanata smo pripravili v koncentracijskem območju od (40 300) µg/ml. Koncentracij, nižjih od 40 µg/ml, nismo zaznali. Sledili smo enakemu postopku, kot v primeru amoksicilina. Izdelava umeritvene krivulje Mobilno fazo, ki smo jo pripravili po postopku, opisanem v 3.3.2.2, smo pred začetkom dela prefiltrirali, vključili HPLC (slika 3-1), ter počakali približno 30 min, da se je kolona uravnotežila. Nato smo pričeli z injiciranjem pripravljenih standardnih raztopin, ki smo jih po izračunanem postopku (poglavje 3.3.3.1) pripravili v 1500 µl eppendorf epruvetah. Metodo in parametre za delovanje HPLC smo povzeli po članku [9]. Slika 3-1: HPLC z UV-detektorjem. 16
3.3.4 Kinetika razgradnje specifičnega antibiotika Za izračun kinetičnih parametrov reakcije razpada antibiotika smo uporabili tako integralno kot diferencialno metodo. Najprej je bilo potrebno določiti red reakcije. Naše eksperimentalne podatke smo prilegali različnim modelom in predpostavili, da je reakcija nepovratna bimolekularna in drugega reda (n = 2). Sledi enačbi (3.2) Amoksicilin (a) + NaOH (b) produkti razpada (3.2) Enačba proizvodnosti za to reakcijo v primeru 2. reda je: = (3.3) -ra hitrost razgradnje specifičnega antibiotika [µg ml -1 min -1 ] k konstanta reakcijske hitrosti [ml µg -1 min -1 ] t čas reakcije [min] a koncentracija amoksicilina [µg/ml] Integralna oblika enačbe (3.3) je: d (3.4) začetna koncentracija amoksicilina [µg/ml] Z integriranjem enačbe (3.4) in po preureditvi dobimo enačbo premice: + (3.5) Na sliki 3-2 je prikazan graf, s katerim smo potrdili 2. red reakcije. 17
1 Slika 3-2: Potrditev reakcije drugega reda. (prirejeno po [16]) Konstanta reakcijske hitrosti, k, je odvisna od temperature. Zanjo velja Arrheniusov zakon: e / (3.6) k0 predeksponentni faktor [ml µg -1 min -1 ] Ea R T aktivacijska energija [J/mol] plinska konstanta [J/molK] temperatura reakcije [K] Po logaritmiranju enačbe 3.6 dobimo zapis, ki ustreza enačbi premice: ln =ln (3.7) Na osnovi enačbe 3.7 rišemo graf funkcije ln k v odvisnosti od 1/T, ter iz naklona premice izračunamo aktivacijsko energijo in z odseka na y osi predekponentni faktor. 18
4 Eksperimentalni del Eksperimentalni del smo izvajali v Laboratoriju za bioreakcijsko tehniko na fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo v Mariboru. Izdelava umeritvene krivulje Za določitev koncentracije amoksicilina med laboratorijskimi poskusi in kasneje v realnem vzorcu, smo s pomočjo standardnih raztopin z znanimi koncentracijami predhodno izdelali umeritveno krivuljo, ki jo prikazuje slika 4-1. 60000 50000 y = 293,97x + 130,26 R² = 0,9996 40000 A [/] 30000 20000 10000 0 0 50 100 150 200 ƴ[μg/ml] Slika 4-1: Umeritvena krivulja za amoksicilin. Linearno območje smo določili v koncentracijskem območju od (20-200) µg/ml. Ugotovljeno je bilo, da je regresijska enačba za koncentracijo amoksicilina: 293,97 +130,26 (4.1) kjer y predstavlja površino pod krivuljo posameznega pika (A), x pa koncentracijo amoksicilina (γ). Linearnost smo dodatno potrdili s koeficientom determinacije, R > 0,99. 19
Izvedba reakcije Raztopino z masno koncentracijo 1 g/l smo pripravili tako, da smo v 500 ml bučko zatehtali 0,5 g amoksicilina, dopolnili s približno 450 ml destilirane vode, dali za 20 min v ultrazvočno kopel, ter dopolnili do oznake. Tako pripravljeno raztopino smo prelili v reaktor in pričeli z mešanjem (slika 4-2). Postopoma smo dodajali pripravljeno raztopino NaOH (3.3.2.1), da smo dosegli določeno ph vrednost in mešali 15 min. Po 15 min smo dodali dvakratni volumen natrijevega hipoklorita oz. varekine glede na NaOH. Po izteku 4 h mešanja smo postopoma dodajali klorovodikovo kislino, da smo ponovno dosegli ph vrednost približno 7, ter mešali še približno 30 min. Koncentracijo vzorca smo izmerili na začetku in nato vsakih nadaljnih 15 min, vse do konca reakcije. Slika 4-2: Reaktor z mešalnikom, termostatiran na željeno temperaturo. Za kalijev klavulanat smo ponovili isti postopek, le da smo na začetku pripravili raztopino s koncentracijo 2 g/l, saj je le ta pri nižji koncentraciji prehitro razpadel in ga s HPLC nismo več zaznali. 20
Izvedba reakcije pri različnih začetnih ph vrednostih V postopku za nevtralizacijo, ki smo ga pridobili od firme, je zapisano, da moramo na začetku z NaOH doseči ph = 10. Da bi našli najbolj optimalen ph, s katerim bi po koncu reakcije dosegli najnižjo koncentracijo amoksicilina oz. klavulanske kisline, smo reakcijo, opisano v poglavju 4.2, izvedli trikrat, kjer smo z dodatkom NaOH dosegli ph = 9, ph = 10 in ph = 11. Pri vseh reakcijah smo spremljali spremembo ph in koncentracije vsakih 15 min, ter rezultate primerjali. ph vrednost smo merili s ph-metrom, prikazanim na sliki 4-3. Slika 4-3: ph meter. Izvedba reakcije pri različnih temperaturah Ves čas procesa smo imeli reaktor v vodni kopeli, kjer smo s termostatom vzdrževali kontantno temperaturo. V postopku za nevtralizacijo je zapisano, da naj reakcija poteka pri T = 20 C. Potek reakcije smo zasledovali pri temperaturah, T = (15, 25 in 30) C. Ponovno smo sledili postopku, opisanem v poglavju 4.2, beležili rezultate in jih primerjali. 21
Realni vzorec Od podjetja Lek Prevalje smo pridobili dva realna vzorca in sicer vzorec, ki priteče direktno iz proizvodnje, ter vzorec iztočne vode, ki je že nevtralizirana oz. očiščena. Oba vzorca smo zaradi predvidenih nizkih koncentracij predčasno skoncentrirali na rotavaporju pri T = 45 C, p = 45 mbar in t = 15 min tako, da smo izparili približno 50 % vode (slika 4-4). Slika 4-4: Rotavapor za predkoncentriranje vzorcev. Koncentracijo amoksicilina v realnih vzorcih vode smo izračunali z uporabo preprostih izpeljav. S pomočjo zatehtanih mas in sklepnega računa smo dobili podatek o deležu izparjenega vzorca in ta odstotek upoštevali pri dobljenih meritvah na HPLC. Ko smo imeli znano površino pod pikom, smo z enačbo umeritvene krivulje izračunali koncentracijo vzorca. 22
5 Rezultati in diskusija Namen naloge je bil na podlagi eksperimentov, izvedenih v laboratorijskem merilu, pridobiti podatke o kinetiki reakcije, ki se v realnosti izvaja v večjem merilu. Prav tako smo želeli določiti optimalne procesne parametre, pri katerih ob koncu reakcije dobimo najnižje koncentracije amoksicilina in kalijevega klavulanata v vodi. Spreminjali smo temperaturo in ph reakcijskega medija. Na tem mestu moramo omeniti, da smo podali meritve in rezultate le za primer amoksicilina. Kalijev klavulanat je namreč tekom reakcije prehitro razpadel (kljub višji začetni koncentraciji) tako, da smo pri posameznih eksperimentih uspeli pridobiti le po tri meritve, ki pa so premalo za izračun kinetičnih parametrov. Na osnovi izvedenih eksperimentov lahko z veliko verjetnostjo trdimo, da kalijev klavulanat razpade veliko hitreje kot amoksicilin, torej po koncu nevtralizacije v vodi skoraj zagotovo ni več prisoten. 23
Procesni parametri 5.1.1 Potek reakcije pri različnih ph vrednostih Z izvedbo reakcije, ki je opisana v poglavju 4.3, smo iskali najbolj optimalen začetni ph, torej tisti, pri katerem je ob koncu reakcije koncentracija amoksicilina v vzorcu najnižja. ph 9 Koncentracija amoksicilina v odvisnosti od časa pri začetnem ph = 9 je prikazana na sliki 5-1. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 ƴ[g/l] 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 50 100 150 200 250 300 t[min] Slika 5-1: Koncentracijski profil amoksicilina pri ph = 9. Vidimo, da koncentracija amoksicilina s časom pada. NaOH začne reagirati šele po prvih 15 min, saj je prvi večji upad koncentracije viden šele po 30 min poteka reakcije. Začetna koncentracija se začne pri 0,87 g/l, saj je standard amoksicilina, ki smo ga imeli na voljo 85,4 %. Končna koncentracija je bila 0,49 g/l. Prav tako smo tekom reakcije spremljali ph vrednost in ugotovili, da ta ves čas pada, kar je razumljivo, saj se NaOH, ki smo ga na začetku dodali, porablja, kar vodi do nižanja ph. 24
ph 10 Koncentracija amoksicilina v odvisnosti od časa pri začetnem ph = 10 je prikazana na sliki 5-2. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 ƴ[g/l] 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 50 100 150 200 250 300 350 t[min] Slika 5-2: Koncentracijski profil amoksicilina pri ph = 10. Graf na sliki 5-2 prikazuje koncentracijo amoksicilina v primeru, ko smo z dodatkom NaOH na začetku reakcije uravnavali ph vrednost na 10. Prav tako, kot v primeru 5.1.1.1, ko je bil ph = 9, koncentracija s časom pada. Začetna koncentracija je bila 0,89 g/l, končna dosežena pa 0,20 g/l. Iz slike 5-3 lahko sklepamo, da s podaljšanjem časa reakcije (več kot 4 h), ne bi dosegli bistveno boljših rezultatov, saj zadnje meritve kažejo skoraj konstantne vrednosti koncentracije. 25
ph 11 Koncentracija amoksicilina v odvisnosti od časa pri začetnem ph = 11 je prikazana na sliki 5-3. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 ƴ[g/l] 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 50 100 150 200 250 300 350 t[min] Slika 5-3: Koncentracijski profil amoksicilina pri ph = 11. Graf na sliki 5-3 prikazuje koncentracije amoksicilina v primeru, ko smo z dodatkom NaOH na začetku reakcije naravnali ph vrednost na 11. Najbolj se koncentracija spreminaj na začetku reakcije, kjer se je sorazmerno s koncentracijo znižal tudi ph, kar pomeni hitro porabo NaOH. V večini primerov smo s samo reakcijo na koncu dosegli dovolj nizek ph, da uravnavanje le tega s HCl, ni bilo potrebno. Koncentracija na začetku je bila 0,85 g/l, končna pa 0,11 g/l. 26
Primerjava vseh ph-vrednosti Na sliki 5-4 je prikazana sprememba koncentracije amoksicilina v odvisnosti od časa pri različnih ph vrednostih. 1 0,9 0,8 0,7 0,6 ƴ[g/l] 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 50 100 150 200 250 300 t[min] ph 9 ph 10 ph 11 Slika 5-4: Sprememba koncentracije amoksicilina v odvisnosti od časa pri različnih ph. Iz grafa na sliki 5-4 je razvidno, da se je v vseh primerih koncentracija amoksicilina nižala s časom, najnižjo smo dosegli pri ph = 11. Nadaljne eksperimente smo zato izvajali pri tej ph vrednosti. Potrdimo lahko, da se z večanjem količine reaktanta (NaOH), viša začetni ph, reakcija poteče hitreje in z nižjo končno koncentracijo amoksicilina. 27
5.1.2 Potek reakcije pri različnih temperaturah Drugi parameter, ki smo ga spreminjali, je bila temperatura reakcije. Vse nadaljnje eksperimente smo izvajali pri predhodno določenem ph = 11. Reakcije smo izvajali po postopku iz poglavja 4.4. Reakcijsko temperaturo smo vzdrževali s termostatom, potek reakcije smo preverjali pri štirih različnih temperaturah, T = (15, 20, 25 in 30) C. Zanimala nas je temperatura, pri kateri bi dobili najnižjo koncentracijo amoksicilina. Reakcija pri T = 15 C Graf na sliki 5-5 prikazuje spremembo koncentracije amoksicilina v odvisnosti od časa pri T = 15 C. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 ƴ[g/l] 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 50 100 150 200 250 300 t[min] Slika 5-5: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 15 C. Na sliki 5-5 vidimo, da se koncentracija amoksicilina konstantno niža. Na začetku reakcije je bila 0,89 g/l, končna 0,23 g/l. Prvi dve točki na grafu, torej prvih 15 min reakcije, rahlo izstopata, saj NaOH še ni začel dobro reagirati. 28
Reakcija pri T = 20 C Koncentracija amoksicilina v odvisnosti od časa pri T = 20 C je prikazana na sliki 5-6. 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 ƴ[g/l] 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 50 100 150 200 250 300 t[min] Slika 5-6: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 20 C. Graf na sliki 5-6 prikazuje koncentracijo amoksicilina v odvisnosti od časa pri T = 20 C. Največji preskok ponovno vidimo v točki pri 30 min. Koncentracija na začetku je bila 0,89 g/l, končna 0,12 g/l. 29
Reakcija pri T = 25 C Koncentracija amoksicilina v odvisnosti od časa pri T = 25 C je prikazana na sliki 5-7. ƴ[g/l] 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 50 100 150 200 250 300 350 t[min] Slika 5-7: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 25 C. Na grafu na sliki 5-7 je prikazana koncentracija amoksicilina v odvisnosti od časa pri T = 25 C. Začetna koncentracija, ki smo jo pripravili, je bila 0,85 g/l, končna 0,08 g/l. 30
Reakcija pri T = 30 C Časovna odvisnost koncentracije amoksicilina pri T = 30 C je prikazana na sliki 5-8. ƴ[g/l] 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 50 100 150 200 250 300 t[min] Slika 5-8: Koncentracijski profil amoksicilina pri T = 30 C. Iz grafa na sliki 5-9 vidimo hitrejše in intenzivnejše znižanje koncentracije, kot pri ostalih temperaturah. Začetna koncentracija amoksicilina je bila 0,84 g/l, končna pa 0,02 g/l, kar je tudi najnižja vrednost izmed vseh izvedenih poskusov. 31
Primerjava vseh temperatur Na sliki 5-9 je graf, ki prikazuje spremembe koncentracij amoksicilina v odvisnosti od časa pri različnih temperaturah. 1,2 1 0,8 ƴ[g/l] 0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 250 300 350 t[min] T = 15 C T = 20 C T = 25 C T = 30 C Slika 5-9: Dinamični profili koncentracij amoksicilina pri različnih temperaturah. Iz slike 5-9 lahko ugotovimo da z višanjem temperature reakcija poteka hitreje in dosežemo nižjo končno koncentracijo amoksicilina. S temi rezultati smo lahko potrdili eno izmed pravil kinetike, ki pravi, da višja kot je temperatura, večja je kinetična energija delcev, ter s tem povečana njihova gibljivost in število trkov v časovni enoti. Če primerjamo rezultate, smo pri T = 15 C dobili končno koncentracijo amoksicilina 0,23 g/l, pri T = 30 C pa le 0,02 g/l. 32
Kinetika reakcije razpadanja amoksicilina V nadaljevanju raziskav smo na osnovi ekperimetalnih meritev ( = f (t)) določili kinetiko testirane reakcije. 5.2.1 Reakcija pri T = 15 C Red reakcije in reakcijsko konstanto za primer reakcije pri T = 15 C smo določili na podlagi grafičnega testa (slika 5-10). Predpostavili smo 2. red reakcije in sledili teoretičnim osnovam, opisanim v poglavju 3.3.4. 5 4,5 1/ƴa 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 y = 0,0128x + 1,1938 0 50 100 150 200 250 300 t[min] Slika 5-10: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 15 C. Na podlagi grafa na sliki 5-10, lahko potrdimo, da je reakcija 2. reda, saj točke ležijo na premici. Konstanta proizvodnosti pri T = 15 C je 0,0128 ml µg -1 min -1. 33
5.2.2 Reakcija pri T = 20 C V primeru, ko je reakcija razpada amoksicilina potekala pri T = 20 C, smo za določanje kinetičnih parametrov (reda reakcije in reakcijske konstante) uporabili enak grafični postopek, kot za reakcijo pri T = 15 C slika 5-11. 9 8 7 6 y = 0,0324x + 0,2226 1/ƴa 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 250 300 t[min] Slika 5-11: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 20 C. Iz slike 5-11 sledi, da se eksperimentalne točke dobro prilegajo premici grafa 1/γa = f(t), kar potrjuje 2. red reakcije. Konstanta proizvodnosti za reakcijo, ki poteka pri 20 C, je 0,0324 ml µg -1 min -1. 34
5.2.3 Reakcija pri T = 25 C Grafično določitev reda reakcije in konstante proizvodnosti za primer reakcije pri T = 25 C prikazujemo na sliki 5-12. 14 12 10 1/ƴa 8 6 4 y = 0,0473x + 0,198 2 0 0 50 100 150 200 250 300 t [min] Slika 5-12: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 25 C. Točke na sliki 5-12 sledijo premici, z izjemo zadnjih nekaj točk, ki so nekoliko bolj razpršene, kot v prvih dveh primerih. Predvidevamo lahko, da je to zaradi višje temperature in posledično večje kinetične energije delcev, kar povzroči rahla nihanja med potekom reakcije. Konstanta proizvodnosti za reakcijo pri T = 25 C je 0,0473 ml µg -1 min -1. 35
5.2.4 Reakcija pri T = 30 C Reakcijo razpada amoksicilina smo izvedli še pri T = 30 C. Tudi v tem primeru smo preverili 2. red reakcije in določili konstanto proizvodnosti. Postopek prikazuje slika 5-13. 30 25 20 1/ƴa 15 10 y = 0,1208x -2,9324 5 0 0 50 100 150 200 250 300 t[min] Slika 5-13: Preverjanje 2. reda reakcije pri T = 30 C. Iz grafa na sliki 5-13 vidimo, da lahko tudi v primeru T = 30 C, potrdimo 2. red reakcije, sicer z manjšim odstopanjem točk proti koncu reakcije. Glede na vse zbrane rezultate lahko sklepamo, da se pri višjih temperaturah in posledično intenzivnejših interakcijah med molekulami, pojavijo večja odstopanja od linearnosti. Najbolj linearna je premica za primer reakcije pri T = 15 C (slika 5-10). Konstanta proizvodnosti za reakcijo pri T = 30 C je 0,1208 ml µg -1 min -1. 36
5.2.5 Določitev aktivacijske energije reakcije Odvisnost konstant proizvodnosti od temperature na splošno opisuje Arrheniusov zakon. Slika 5-14 prikazuje grafično določitev aktivacijske energije reakcije in predeksponentnega faktorja za reakcijo razpada amoksicilina. 0-0,5-1 -1,5 ln K -2-2,5-3 y = -12.795,7930x + 40,0755 R² = 0,9732-3,5-4 -4,5-5 0,00325 0,0033 0,00335 1/T 0,0034 0,00345 0,0035 Slika 5-14: Grafična določitev aktivacijske energije in predeksponentnega faktorja reakcije razpada amoksicilina. Na sliki 5-14 je prikazan graf a ln k v odvisnosti od 1/T. Dobili smo premico, ki jo predstavlja enačba, na podlagi katere smo lahko izračunali aktivacijsko energijo in predekponentni faktor. Štiri točke na premici predstavljajo logaritme koeficientov proizvodnosti pri štirih različnih temperaturah. Izračunani parametri so podani v tabeli 4-1: Tabela 5-1: Izračunani kinetični parametri reakcije razpada amoksicilina. -Ea/RT ln k0 Ea [kj mol -1 ] k0 [ml µg -1 min -1 ] -12795,8 40,1 106,4 2,55. 10 17 37
Realni vzorec Ob zaključku raziskav smo želeli določiti še koncentracijo amoksicilina v realnih vzorcih vode, ki smo jih prejeli iz podjetja Lek. Pričakovali smo, da bomo lahko določili koncentracijo amoksicilina le na vzorcu odpadne vode, ki priteka v čistilni sistem. Voda na iztoku, po nevtralizaciji, pa bi morala imeti koncentracije antibiotika že tako nizke, da jih z izbrano metodo ne bo mogoče izmeriti. 5.3.1 Realni vzorec vtočne vode Dobljeni vzorec vode, ki iz proizvodnje priteka v čistilno napravo, smo najprej na rotavaporju skoncentrirali, tako, da smo lahko kasneje izvedli meritve na HPLC. Izparili smo 44,4 % vzorca, katerega smo nato injicirali v kolono. V prilogi 1 lahko vidimo kromatogram, ki smo ga dobili po koncu merjenja realnega vzorca vhodne vode. Retenzijski čas za amoksicilin je bil določen pri 5,3 min. Površina vrha je bila 9777 od katere smo nato odšteli 44,4 % te vrednosti, ter dobili A = 5432,1. To vrednost A smo vstavili v enačbo 4.1 in dobili, da je v vzorcu vode, ki vstopa v čistilno napravo, koncentracija amoksicilina 18,04 µg/l. 5.3.2 Realni vzorec iztočne vode Isti postopek smo ponovili še za vzorec, ki je bil odvzet na iztoku iz čistilne naprave. Kot je razvidno iz priloge 2, se pri retenzijskem času amoksicilina vrh ni pojavil. To pomeni, da je bila v odvzetem vzorcu, kljub predkoncentriranju, prenizka koncentracija amoksicilina za določanje z izbrano metodo. Zato na tem mestu prav tako ne moremo z gotovostjo trditi, da je bil amoksicilin iz vode popolnoma odstranjen, se je pa koncentracija močno znižala. 38
4. Zaključek Onesnaženost odpadnih voda zaradi ostankov farmacevtikov oziroma ostankov zdravil je v okolju, zaradi njihove vse večje uporabe, vedno večja. Na tem področju se v evropskem merilu, tudi v Sloveniji, namenja vedno več pozornosti. Gradi se na tehnološkem napredku čistilnih naprav, ki bi kar se da najučinkovitejše odstranile farmakološko aktivne snovi iz, nadgrajujejo se analitske metode za določevanje nizkih koncentracij FAS v odpadni vodi, prilagaja in spreminja se zakonodaja itd. Namen te magistrske naloge je bil preučiti kinetiko razgradnje specifičnega antibiotika, ki kot nevtralizacija poteka v lastni čistilni napravi podjetja Lek v Prevaljah. Poleg tega smo s spreminjanjem določenih parametrov želeli določiti najboljše pogoje, pri katerih bi iz čistilne naprave iztekala voda s čim nižjo koncentracijo amoksicilina in klavulanske kisline. Tekom eksperimentov smo ugotovili, da bomo lahko analize izvajali samo v primeru amoksicilina, saj je klavulanat med reakcijo nevtralizacije prehitro razpadel in prišel v območje pod mejo zaznave. Glede na podatke, ki smo jih dobili iz strani podjetja Lek, je vrednost kalijevega klavulanata v odpadni vodi, v nasprotju z amoksicilinom, precej nižja. Ne glede na vse lahko sklepamo, da se koncentracija klavulanata tekom nevtralizacije niža in na koncu reakcije doseže zanemarljive vrednosti. Reakcijo smo izvajali šaržno v 500 ml reaktorju in sicer najprej pri različnih začetnih ph vrednostih (ph = 9, 10, 11) ter nato pri različnih temperaturah (T = 15, 20, 25 in 30 C). Na podlagi rezultatov, dobljenih z številnimi eksperimenti, lahko potrdimo, da najnižjo koncentracijo amoksicilina po koncu nevtralizacije dobimo pri višji temperaturi, v našem primeru pri T = 30 C, ter pri višjem začetnem ph, v našem primeru pri ph = 11. Z reakcijo pri ph = 11 in T = 20 C smo koncentracijo amoksicilina iz 0,85 g/l znižali na 0,11 g /L, ko pa smo pri istem ph povišali še temperaturo, smo iz 0,84 g/l koncentracijo znižali na 0,02 g /L. Glede na to, da se sorazmerno s temperaturo povečuje tudi hitrost reakcije lahko rečemo, da je bil dobljeni rezultat (najnižja končna koncentracija dosežena pri T = 30 C) pričakovan. Predvidevamo, da bi z dodatnim višanjem temperature dosegli še boljšo razgradnjo, vendar tega nismo izvedli, saj bi tak postopek, kjer bi vodo segreli preko T = 30 C, težko vključili v realni sistem. V tem primeru bi bilo potrebno očiščeno oz. nevtralizirano vodo pred izpustom nazaj v okolje ohladiti do temperature, ki jo zahteva zakonodaja, kar lahko predstavlja večji ekonomski problem za podjetje. V nasprotnem primeru lahko povzročimo toplotno 39
onesnaženje površinskih voda, kar bi povečalo hitrost kemijskih reakcij in zmanjšalo topnost kisika. Prav tako bi se zmanjša viskoznost vode, povečalo bi se izparevanje in kot posledica bi bilo hitrejše raztapljanje in usedanje suspendiranih snovi. Pričakovano je bilo, da bo najučinkovitejša razgradnja amoksicilina potekla pri višji ph vrednosti, kar pomeni večjo količino dodanega NaOH, to je reagenta, s katerim lahko amoksicilin reagira. Z eksperimenti smo to tudi potrdili. Na podlagi rezultatov smo lahko izračunali kinetične parametre reakcije. Določili smo, da sledi kinetiki 2. reda, aktivacijska energija reakcije je 106,4 kj/mol, predeksponentni faktor pa 2,5. 10 17 ml µg -1 min -1. Glede na to, da nevtralizacija, ki se izvaja v podjetju Lek, trenutno ne poteka šaržno, tako kot smo eksperimente izvajali v laboratoriju, ne moremo reči, da bo s predlaganimi spremembami parametrov, nevtralizacija enako učinkovita, kot v našem primeru. Zahteva glede popolne odstranitve FAS je zahteva Novartisa. Slovenska zakonodaja na tem področju ne definira tako ostrih zahtev. Vrednosti antibiotika v odpadni vodi glede na slovensko zakonodajo so pod dovoljeno mejo, zato bi na podlagi tega, lahko odpadno vodo odstranjevali tudi v naravne toke, (reke). Amoksicilina ni na nadzornem seznamu snovi, kot najverjetneje mnogih ostalih snovi, ki lahko pustijo neželene posledice v okolju. 40