UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO DIPLOMSKO DELO. Ines Kulašić. Ljubljana, 2020

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO DIPLOMSKO DELO Ines Kulašić Ljubljana, 2020

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJA Sinteza derivatov bifenila z elektron-privlačnimi skupinami DIPLOMSKO DELO Ines Kulašić MENTOR: prof. dr. Janez Košmrlj Ljubljana, 2020

IZJAVA O AVTORSTVU diplomskega dela Spodaj podpisana Ines Kulašić sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Sinteza derivatov bifenila z elektron-privlačnimi skupinami. S svojim podpisom zagotavljam, da: 1. je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. dr. Janeza Košmrlja; 2. sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili; 3. se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007); 4. sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela; 5. je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela. V Ljubljani, 9.6.2020 Podpis avtorice:

Zahvala Zahvaliti se želim najboljšemu delovnemu mentorju, dr. Luki Rejcu, za vso strokovno pomoč, svetovanje in zabavne trenutke v laboratoriju. Boljšega delovnega mentorja si ne bi mogla želeti. Zahvaljujem se tudi prof. dr. Janezu Košmrlju za vse nasvete, spodbudo in pomoč pri pisanju diplomske naloge. Hvala, ker ste mi ves čas stali ob strani. Nenazadnje pa bi se najlepše želela zahvaliti svoji družini in fantu Mateju za vso strpnost, razumevanje in spodbujanje v času mojega študija. Brez vas mi ne bi uspelo. Mami, oči, Nejc in Matej - rada vas imam.

Sinteza derivatov bifenila z elektron-privlačnimi skupinami Povzetek: Sintetizirani so bili štirje novi bifenilni analogi z različnimi elektronprivlačnimi skupinami: karbonilno, 1,3-dikarbonilno, malononitrilno in oxo-pirankarbonitrilno. Spojine emitirajo svetlobo različnih valovnih dolžin, kar kaže na pomemben vpliv elektron-privlačnih skupin na optične lastnosti molekul. Produkti so bili sintetizirani s kombinacijo reakcij spajanja po Suzukiju, Claisenove in Knoevenagelove kondenzacije. Pripravljeni analogi bi bili lahko v nadaljnjih raziskavah uporabljeni kot molekulske sonde za detekcijo tau agregatov v krvi bolnikov z nevrodegenerativnimi boleznimi. Ključne besede: bifenilni analogi, optične lastnosti, molekulske sonde, nevrodegenerativne bolezni, reakcije spajanja. Synthesis of biphenyl derivatives with electron-accepting groups Abstract: In this work, I successfully synthesised four new biphenyl analogues with different electron-accepting groups: carbonyl, 1,3-dicarbonyl, malononitrile, and oxo-pyran-carbonitrile. A large difference in the wavelength of the emitted light was observed suggesting a significant effect of electron-withdrawing groups on optical properties of molecules. The products were synthesised using a combination of Suzuki cross-coupling, Claisen, and Knoevenagel condensation reactions. The derivatives prepared in this work could be potentially used as molecular probes for the detection of tau aggregates in the blood of patients with neurodegenerative diseases. Keywords: biphenyl derivatives, optical properties, molecular probes, neurodegenerative disease, cross-coupling reactions.

Kazalo 1 Uvod... 2 1.1 Nevrodegenerativne bolezni... 2 1.2 Proteini tau in nevrodegenerativne bolezni... 2 1.3 CST in PET slikanje... 3 1.4 Fluorescenčna mikroskopija in krvni testi... 4 1.5 Načrt sinteze novih molekulskih sond... 5 1.6 Spajanje po Suzukiju... 6 1.7 Claisenova in Knoevenagelova kondenzacija... 8 2 Namen dela... 10 3 Rezultati in razprava... 12 3.1 Sinteza produkta 1, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)etanona... 12 3.2 Sinteza produkta 2, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)butan-1,3-diona.... 13 3.3 Sinteza produkta 3, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etiliden)propanodinitrila... 15 3.4 Sinteza produkta 4, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'bifenil]-4-il)-4-(metilsulfanil)- 2-oxo-2H-piran-3-karbonitrila... 16 3.5 Sinteza produkta 5, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)-4-metil-2-oxo- 2H-piran-3-karbonitrila... 18 3.5.1 Zastavljena sintezna pot za pripravo spojine 5... 18 3.5.2 Modificirana sintezna pot za pripravo spojine 5... 18 4 Zaključek... 22 5 Eksperimentalni del... 23 5.1 Reagenti, topila in aparature... 23 5.2 Sinteza spojine 1, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)etanona... 25 5.2.1 Sinteza produkta 1 iz (4-acetofenil)borove kisline... 25 5.2.2 Sinteza spojine 1 iz 4-bromoacetofenona s katalizatorjem Pd(PPh3)4... 25

5.2.3 Sinteza spojine 1 iz 4-bromoacetofenona s katalizatorjem Pd(PPh3)2Cl2... 26 5.3 Sinteza spojine 4, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)butan-1,3-diona 28 5.4 Sinteza spojine 7, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etiliden)propanodinitrila... 30 5.5 Sinteza spojine 8, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)-4-(metilsulfanil)-2- oxo-2h-piran-3-karbonitrila... 32 5.6 Sinteza spojine 11, 1-(4-bromofenil)prop-2-en-1-ona... 34 5.6.1 Prva stopnja sinteze sinteza 2-bromo-1-(4-bromofenil)etan-1-ona.... 34 5.6.2 Druga stopnja sinteze sinteza fosforjevega ilida... 36 5.6.3 Tretja stopnja sinteze sinteza 1-(4-bromofenil)but-2-en-1-ona... 37 6 Literatura... 39

UVOD Seznam uporabljenih kratic in simbolov Aβ amiloid beta CST cerebrospinalna tekočina DCM diklorometan DMSO dimetilsulfoksid EA etil acetat EtOH etanol HRMS ESI masna spektrometrija visoke ločljivosti z ionizacijo z elektrorazprševanjem NIR bližnje-infrardeča svetloba NMR nuklearna magnetna resonanca PE petroleter PET pozitronska emisijska tomografija THF tetrahidrofuran TLC tankoplastna kromatografija UV ultravijolična svetloba VQIVYK aminokislinska sekvenca valin-glutamin-izolevcin-valin-tirozin-lizin 1

UVOD 1 Uvod 1.1 Nevrodegenerativne bolezni Nevrodegenerativne bolezni so ene izmed najpogostejših bolezni, s katerimi se srečujejo starostniki. Pojavijo se kot posledica odpovedi in kasnejšega odmrtja živčnih celic in perifernega živčnega sistema. [1] Demenca in zmanjšana kognitivna sposobnost vodita do oteženega samostojnega življenja in povečane smrtnosti bolnikov. Z daljšanjem življenjske dobe človeka in naglim naraščanjem prebivalstva je v prihodnosti moč pričakovati porast števila ljudi, obolelih za nevrodegenerativnimi boleznimi. [3] Njihovo razumevanje, preprečevanje in zdravljenje je zato zelo pomembno. Navadno se nevrodegenerativne bolezni kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen diagnosticira s pomočjo poznavanja zgodovine bolezni v pacientovi družini, njegovi sposobnosti opravljanja fizičnih opravil in dodatnih meritev, opravljenih s krvnimi testi in slikanjem možganov, s katerimi preverijo, ali bi lahko bila zmanjšana kognitivna sposobnost odraz druge, ne-nevrodegenerativne bolezni. [3] Mnoge raziskave v zadnjih desetletjih pa so pokazale, da je mogoče razvoj nevrodegenerativne bolezni pri pacientu napovedati že leta pred pojavom prvih simptomov. [4] Prednost takšnega diagnosticiranja bi lahko bila v preprečitvi nastanka bolezni, saj trenutno ni poznanega zdravila, ki bi že razvito nevrodegenerativno bolezen lahko povsem pozdravilo. Terapije in zdravila kot sta holinesterazni inhibitor in N-metil-D-aspartat receptorski antagonist namreč zgolj olajšajo določene simptome bolezni. [4] 1.2 Proteini tau in nevrodegenerativne bolezni Raziskave so pokazale, da ima eno izmed pomembnejših vlog pri razvoju nevrodegenerativnih bolezni protein tau. [4] Njegova glavna vloga je sicer sestavljanje in stabilizacija mikrotubulov v aksonih, zato se nahaja predvsem v nevronih v centralnem živčnem sistemu. Nenadzorovana post-translacijska modifikacija (hiperfosforilacija, glikozilacija ipd.) spremeni normalno delujoč tau protein v toksično molekulo in povzroči njegovo agregacijo. [4] Nastali skupki skupaj 2

UVOD z depoziti amiloid β proteinov (Aβ) povzročijo odmrtje nevrofibrilov, kar privede do razvoja nevrodegenerativnih in ostalih bolezni, imenovanih tauopatije. Zadnje analize morfologije tau depozitov so pokazale, da je za agregacijo skupkov pomembna heksapeptidna sekvenca valin-glutamin-izolevcin-valin-tirozin-lizin (VQIVYK). [5] Delno poznavanje morfologije je omogočilo napoved, katere molekulske sonde bi se lahko uporabljale za detekcijo tau agregatov pri pacientih. Popolna sestava tega kompleksnega proteina še ni znana, kar poleg ostalih omejitev in silico metod za napoved bioloških lastnosti narekuje dodatna testiranja kandidatov za molekulske sonde z biološkimi in histokemijskimi testi. [6] 1.3 CST in PET slikanje Ker so tau depoziti v možganih prisotni že leta, predno oseba pokaže prve simptome, se trenutno razvijajo tehnike, s katerimi bi bilo mogoče napovedati, ali bo pacient nevrodegenerativno bolezen razvil ali ne. [3] Glavna načina diagnosticiranja, ki sta trenutno v razvoju, sta preverjanje prisotnosti skupkov v cerebrospinalni tekočini (CST) in preverjanje njihove prisotnosti v možganih s slikanjem s pozitronsko emisijsko tomografijo (PET) in vivo (Slika 1). Slika 1: Primer diagnosticiranja Alzheimerjeve bolezni s slikanjem s pozitronsko emisijsko tomografijo. Vir: https://scx1.b-cdn.net/csz/news/800/2013/fluorescentc.jpg. 3

UVOD Dve izmed že obstoječih molekulskih sond sta 2-(1-{6-[(2-[F-18]fluoroetil)- (metil)amino]-2-naftil}etiliden)malononitril ([ 18 F]FDDNP) in 7-(6-(F-18)fluoropiridin- 3-il)-5H-pirido(4,3-b)indol ([ 18 F]AV-1451). Oba sicer uspešno detektirata proteinske depozite pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo [9],[10] in pri upokojenih igralcih ameriškega nogometa s kronično travmatično encefalopatijo, [11] vendar se, podobno kot ostale molekulske sonde, ne vežeta na vse patološke izoforme tau depozitov enako, [12] hkrati pa je njuna specifičnost v primerjavi z ostalimi biološkimi molekulami dokaj slaba. Pogosto se namreč in vivo vežeta tudi na ne-tarčno tkivo, zato je težko predvideti, ali je proteinski agregat, na katerega se je vezala molekulska sonda, dejansko depozit tau proteinov ali kakšen drug proteinski skupek. [13] Sinteza učinkovitih in selektivnih molekulskih sond za odkrivanje tau agregatov tako še vedno predstavlja velik izziv. Slika 2: Molekulski sondi [ 18 F]FDDNP (levo) in [ 18 F]AV-1451 ( [18] flortaucipir) (desno). Poleg nepopolno razvitih molekulskih sond pa imata CST in PET še dodatne omejitve. Za meritev tau skupkov v CST je potrebna invazivna in neprijetna lumbalna punkcija, pri PET pa je poleg visoke cene testov in inštrumentov težavna tudi draga radiosinteza izotopsko označenih molekulskih sond. [3],[14] 1.4 Fluorescenčna mikroskopija in krvni testi Edina tehnika, s katero je bilo do sedaj mogoče nedvoumno potrditi Alzheimerjevo bolezen, je preverjanje prisotnosti depozitov v tkivu post mortem s fluorescenčno mikroskopijo. [7] Pri slednji je pomembno, da je mogoče uporabljene molekulske sonde vzbujati s svetlobo valovne dolžine 400 nm ali več, s čimer se zagotovi najmanjša možna poškodba tkiva, hkrati pa svetloba ne vzbudi ostalih molekul v tkivu, ki navadno absorbirajo pri nižjih valovnih dolžinah, zaradi česar je razmerje signal-šum (S/N) večje. [8] 4

UVOD Da se lahko spojina uporablja kot molekulska sonda za detekcijo tau proteinov s fluorescenčno mikroskopijo, mora zadostiti naslednjim kriterijem: [6] 1. Molekula mora imeti prost pretok elektronov. Vsebovati mora elektronprivlačno skupino na enem in elektron-donorsko skupino na drugem koncu, ki morata biti med seboj povezani s konjugiranim π-sistemom. Nastali t.i. push-pull sistem povzroči premik emisijskega maksimuma v področje bližnje-infrardečega dela spektra (NIR), velik Stokesov premik in posledično večji kvantni izkoristek. Žal se to zgodi le v optimalnih primerih - veliko molekul s takšno strukturo namreč ne izkazuje ustreznih optičnih lastnosti. 2. Molekula mora imeti veliko afiniteto do proteina tau. V nekaterih primerih se je za idealno izkazala paličasta, rigidna oblika molekule, ki je hkrati omogočila, da se lahko spojina brez večje dodatne energije dobro veže v žepe tau depozitov. [6] 3. Za in vivo teste mora biti molekula dovolj hidrofilna, da dovoljuje intravenozno injiciranje in hkrati dovolj hidrofobna, da preide možgansko bariero in doseže znotrajcelične tarče. Raziskave so pokazale, da se v nekaterih primerih tau agregati po tvorbi iz možganov prenesejo tudi v kri preko eksosomov, [15] ekstracelularnih veziklov, ki v telesu odstranjujejo poškodovane ali odvečne proteine in ostale celične gradnike. [16] Koncentracija eksosomov, polnih s P-T181, P-S396-tau in Aβ1-42 skupki, tako pravilno predvidi pacientov prehod iz normalnega staranja v demenco že 10 let pred pojavom prvih simptomov Alzheimerjeve bolezni. [14] Zaradi te ugotovitve postajajo čedalje obetavnejši krvni testi, s katerimi bi lahko na cenejši in hitrejši način začeli rutinsko pregledovati paciente. Sinteza spojin, ki bi se lahko uporabljale kot molekulske sonde za detekcijo tau agregatov s fluorescenčno mikroskopijo v vzorcih krvi pacientov, je zato trenutno zelo pomembna. 1.5 Načrt sinteze novih molekulskih sond Poleg molekulske sonde [ 18 F]FDDNP je bilo v zadnjih letih sintetiziranih veliko novih fluorescenčnih molekul, ki bi se jih lahko potencialno uporabilo pri detekciji tau agregatov s fluorescenčno mikroskopijo. Med njimi so bili tudi podaljšani analogi molekule [ 18 F]FDDNP, izmed katerih je najbolj izstopala spojina 2-(1-(4'- (etil(2-fluoroetil)amino)[1,1-bifenil]-4il)etiliden)malonitiril (A), ki je izkazala odlične optične in vezavne lastnosti. [6] 5

UVOD Ugotovili so, da na optične lastnosti molekule najbolj vpliva njena elektronprivlačna skupina. Za boljše razumevanje, kako različne elektronsko revne skupine vplivajo na premik absorpcijskega in emisijskega maksimuma molekule k večjim valovnim dolžinam, sem zasnovala sintezo novih petih molekul, analogov spojine A, ki se med seboj razlikujejo v elektron-privlačnih skupinah. Novim spojinam, 1 5, sta skupna dimetilaminska skupina (elektron-donorska komponenta) in centralni, bifenilni skelet. Molekule vsebujejo različne elektronakceptorske skupine: karbonilno, 1,3-dikarbonilno, malononitrilno in oxopiran-karbonitrilno (slika 3). Končne bifenilne produkte je mogoče tvoriti v kombinaciji različnih reakcij: spajanjem po Suzukiju ter Claisenovo in Knoevenagelovo kondenzacijo. Spojina Skupina R 2 4 7 8 10 Slika 3: 2-(1-(4'-(etil(2-fluoroetil)amino)[1,1-bifenil]-4il)etiliden)malononitril (A) (levo) in splošna struktura analogov spojine A (desno). Na desni je prikazana tabela elektron-privlačnih skupin v različnih analogih. 1.6 Spajanje po Suzukiju Za tvorbo bifenilnih analogov se pogosto uporablja spajanje po Suzukiju (ang. Suzuki cross-coupling). Suzukijeva reakcija je reakcija spajanja med organskim halidom in organsko borovo kislino, kjer morata biti reagenta arilnega, vinilnega ali alkilnega tipa. [17] Da reakcija poteče je potrebno dodati paladijev katalizator in bazo. [18] Baza ima v reakciji več vlog: aktivira borovo kislino, tvori paladijev kompleks [RPd(OH)Ln] in pospeši korak reduktivne eliminacije. [19] 6

UVOD Reakcija poteka v katalitskem ciklu v več stopnjah (slika 4) [18] : 1. Oksidativna adicija: paladijev katalizator se vrine v vez R X v organskem halidu. Pri tem se Pd(0) oksidira v stanje Pd(II). 2. Transmetalacija: arilna ali alkilna skupina organske borove kisline se prenese na paladijev kompleks. Da je ta korak uspešen, je potrebna predhodna aktivacija borove kisline in paladijevega kompleksa z bazo. 3. Reduktivna eliminacija: izloči se končni produkt spojena organska dela obeh reagentov. Paladij se pri tem reducira v Pd(0) in se tako regenerira za ponoven vstop v katalitski cikel. Shema 1: Shematski prikaz poteka katalitskega cikla v reakciji spajanja po Suzukiju. Spajanje po Suzukiju ima v primerjavi z ostalimi podobnimi reakcijami veliko prednosti. Blagi pogoji izvedbe reakcije, velika kompatibilnost z raznovrstnimi prisotnimi stranskimi skupinami reagentov, komercialna dostopnost in stabilnost reagentov ter enostavna odstranitev nastalih anorganskih stranskih produktov so le nekateri razlogi, da je Suzukijeva reakcija eden glavnih načinov priprave bifenilnih produktov. [20] Na podlagi teh razlogov sem se tudi sama odločila uporabiti spajanje po Suzukiju za tvorbo centralnega bifenilnega skeleta. 7

UVOD 1.7 Claisenova in Knoevenagelova kondenzacija Podobno kot spajanje po Suzukiju sta tudi Claisenova in Knoevenagelova kondenzacija namenjeni tvorbi novih vezi ogljik-ogljik, predvsem za nastanek novih β-dikarbonilnih spojin in spojin z malononitrilno skupino. Claisenova kondenzacija je analogna aldolni reakciji, pri čemer kondenzacija poteče med estrom in drugo karbonilno spojino po mehanizmu adicije s sledečo eliminacijo ob prisotnosti močne baze. [21] Da lahko reakcija poteče, mora biti vsaj eden izmed reagentov enolizabilen vsebovati mora vsaj en kisel proton na α- mestu, da lahko ob eliminaciji protona tvori enoletnih anion. [21] Reakcija lahko poteče intramolekularno (t.i. Dieckmannova kondenzacija) ali pa intermolekularno med dvema enakima ali različnima spojinama. Claisenova reakcija poteče v večih stopnjah [21] v prvi fazi baza odcepi kisel proton na α-mestu, s čimer nastane enolatni anion. Nastali nukleofil napade karbonilni ogljik druge molekule, čemur sledi eliminacija alkoksidnega aniona. Navadno nastanku β-dikarbonilne spojine sledi odcep kislega protona na α-mestu med karbonilnima skupinama. Ponovno protoniranje omogočimo z dodatkom kisline. [21] Shema 2: Mehanizem Claisenove kondenzacije. 8

UVOD Podobno kot Claisenova tudi Knoevenagelova kondenzacija poteče med dvema karbonilnima spojinama. Njena prednost je, da na koncu kondenzacije poteče spontana dekarboksilacija, [22] tako da se lahko enostavno znebimo karbonilne skupine dodanega reagenta, kot je prikazano na naslednji sliki: Shema 3: Mehanizem Knoevenagelove kondenzacije. Da lahko poteče Knoevenagelova kondenzacija, mora biti eden izmed reagentov dikarbonilna spojina, ki na eni strani vsebuje skupino, ki lahko v kasnejših korakih izstopi kot CO2 (esterska, karboksilna, ). [22] Prednost Knoevenagelove reakcije je tudi, da je protone na α-mestu ob karbonilnima skupinama veliko lažje odstraniti, zato je lahko baza, uporabljena za deprotoniranje, šibkejša. [21] V primeru, da za reagent uporabimo malononitril, na koncu do dekarboksilacije ne bo prišlo, zato lahko ta kondenzacija služi kot ugoden način uvedbe malononitrilne skupine, kar sem uporabila tudi v eni izmed zastavljenih sintez. 9

NAMEN DELA 2 Namen dela Namen dela je bil sintetizirati pet novih potencialnih molekulskih sond za označevanje tau agregatov, 1 5, ki se med seboj razlikujejo v elektron-privlačni skupini. Postavila sem si naslednjih šest hipotez: 1. Uspešno bom sintetizirala produkt 1, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etanon, z uporabo Suzukijeve reakcije po naslednji reakcijski shemi: Shema 4: Predvidena retrosintezna pot za sintezo 1. 2. Uspešno bom sintetizirala produkt 2, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)butan-1,3-dion, z uporabo Claisenove kondenzacije po naslednji reakcijski shemi: Shema 5: Predvidena retrosintezna pot za sintezo spojine 2. 3. Uspešno bom sintetizirala produkt 3, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etiliden)propanodinitril, z uporabo Knoevenagelove kondenzacije po naslednji reakcijski shemi: 10

NAMEN DELA Shema 6: Predvidena retrosintezna pot za sintezo spojine 3. 4. Uspešno bom sintetizirala produkt 4, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)-4- (metilsulfanil)-2-oxo-2h-piran-3-karbonitril, po naslednji reakcijski shemi: Shema 7: Predvidena retrosintezna pot za sintezo spojine 4. 5. Uspešno bom sintetizirala produkt 5, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)-4- metil-2-oxo-2h-piran-3-karbonitril, po naslednji reakcijski shemi: Shema 8: Predvidena retrosintezna pot za sintezo spojine 5. 6. Spojine bodo imele med seboj različne optične lastnosti. 11

REZULTATI IN RAZPRAVA 3 Rezultati in razprava 3.1 Sinteza produkta 1, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etanona Reakcija spajanja po Suzukiju med bromoanilinom, 6, in (4-acetilfenil)borovo kislino 7 je ob uporabi Pd(PPh3)4 v vlogi katalizatorja potekla z nizkim, 21% izkoristkom (22% v primeru, ko sem reakcijo izvedla na več-gramski skali). Sprememba barve reakcijske zmesi iz oranžne v črno in potreba po večkratnem dodajanju paladijevega katalizatorja med reakcijo kažeta na redukcijo paladijevega kompleksa v neaktivni kovinski (črni) paladij v obliki nanodelcev, kar bi lahko bil razlog za nizek izkoristek reakcije. Shema 9: Prvotno zastavljena sintezna pot z uporabo spajanja po Suzukiju. Kot katalizator je bil uporabljen Pd(PPh3)4. Reakcija je potekala pri 70 C pod argonovo atmosfero. Prisotnost produkta 1 sem potrdila s HRMS in 1 H NMR tehnikama. Oba se dobro ujemata z literaturnimi podatki. [23] V NMR spektru so dobro vidni signali za vodike, ki pripadajo dvema para-disubstituiranima benzenovima obročema. Pod UV svetlobo valovne dolžine 366 nm produkt 1 fluorescira z intenzivno modro svetlobo. Slika 4: Čiščenje reakcijske zmesi z radialno kromatografijo (levo) ter približana slika produkta 1 pod UV svetlobo valovne dolžine 366 nm v NMR cevki (sredina) in čaši (desno). 12

REZULTATI IN RAZPRAVA Kljub uspešni reakciji pa nizek izkoristek onemogoča pripravo večjih količin bifenilnega derivata. Elektronski vpliv skupin na izkoristek reakcije sem izključila z izvedbo reakcije spajanja po Suzukiju med borovo kislino 8 in bromoacetofenonom 9. Ob uporabi Pd(Ph3)4 katalizatorja je bil izkoristek reakcije nižji (15%), ta pa se je ob uporabi katalizatorja PdCl2(PPh3)2 le malenkost zvišal, na 21%. Tudi v tem primeru je bilo tekom reakcije potrebno dodajati paladijev katalizator, kar kaže na tvorbo neaktivnega črnega paladija. Nadaljnjih vzrokov za nizek izkoristek reakcije nisem iskala. Ker je bila optimizacija reakcij spajanja izven okvirov teme moje diplomske naloge, sem se v tej stopnji osredotočila na nadaljnje pretvorbe sintetiziranega produkta 1. Shema 10: Modificirana sintezna pot s spajanjem po Suzukiju. Za katalizator je bil enkrat uporabljen Pd(PPh3)4, drugič pa Pd(PPh3)2Cl2. Reakcija je potekala pri 70 C v argonovi atmosferi. 3.2 Sinteza produkta 2, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)butan-1,3-diona Analogno z uspešno sintezo produkta 1 sem zasnovala tudi sintezo produkta 2. Pri tem je bilo potrebno pripraviti 1,3-diketon 10. Njegova sinteza je bila načrtovana sorodno, kot je opisano v literaturnem postopku. [24] Kljub temu, da sem reakcijsko zmes mešala 22 h, namesto 1 h, kot je opisano v literaturi, [24] je bila na koncu na TLC ploščici vidna le lisa izhodne spojine. Zaključila sem, da ta sintezna pot za pridobitev produkta 2 ni uspešna. 13

REZULTATI IN RAZPRAVA Shema 11: Predvidena dvostopenjska sintezna pot za pripravo produkta 2. Sintezo spojine 2 sem zato načrtovala iz predhodno pripravljene spojine 1 (Shema 12). Kot reagent in topilo sem uporabila etil acetat, kot bazo pa NaH. Ta se ob stiku z vodo pretvarja v NaOH, ki pa ni dovolj močna baza za željeno reakcijo. Da bi se izognila vplivu vlage, ki bi lahko bila prisotna v reakcijski zmesi, sem NaH že na začetku dodala v velikem presežku. Sintezna pot se je izkazala za uspešno. Produkt 2 sem izolirala z uporabo radialne kromatografije in sledeče prekristalizacije, njegovo identiteto pa potrdila s tehnikama 1 H NMR in HRMS. Iz NMR spektra lahko ugotovim, da je prevladujoča njegova enolna oblika dobro sta vidni resonanci protonov pri 16.3 ppm (razširjen vrh, -OH) in pri 6.20 ppm (proton na α-mestu med obema karbonilnima skupinama). Rezultat je bil pričakovan, saj je enolna oblika β-dikarbonilnih spojin stabilizirana z intramolekularno vodikovo vezjo. [25] Shema 12: Modificirana sintezna pot za pripravo produkta 2 iz izhodne spojine 1. 14

REZULTATI IN RAZPRAVA Produkt 2 pod UV lučjo fluorescira rumeno. Slika 5: Primerjava produkta 2 (levo) in 1 (desno) pod UV svetlobo valovne dolžine 366 nm. 3.3 Sinteza produkta 3, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etiliden)propanodinitrila Knoevenagelova kondenzacija med spojino 1 in malononitrilom je bila uspešna. Potekla je s 34% izkoristkom. Ker je bilo po čiščenju produkta z radialno kromatografijo še vedno prisotna velika količina izhodnega malononitrila, sem za analizo produkt dodatno očistila s prekristalizacijo iz etil acetata. Po prekristalizaciji je bil celokupen izkoristek le še 7%. Sklepam, da so bile izgube med prekristalizacijo znatne predvsem zato, ker sem čiščenje produkta izvedla v čistem topilu produkt je že sam po sebi delno topen v etil acetatu, medtem ko bi ob uporabi mešanice etil acetat/petroleter delala na meji topnosti, zato bi bile izgube manjše. Shema 13: Sinteza produkta 3 z uporabo Knoevenagelove kondenzacije med reaktantom 1 in malononitrilom. 15

REZULTATI IN RAZPRAVA Izbrana sintezna pot je bila uspešna. Produkt 3 sem izolirala ter njegovo prisotnost potrdila s tehnikama 1 H NMR in HRMS. Produkt pod UV svetlobo valovne dolžine 366 nm fluorescira oranžno. Slika 6: Primerjava produkta 1 (moder) in produkta 3 (oranžen) pod UV svetlobo valovna dolžine 366 nm. 3.4 Sinteza produkta 4, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'bifenil]-4-il)-4- (metilsulfanil)-2-oxo-2h-piran-3-karbonitrila Sintezo produkta 4 sem izvedla analogno z literaturnim postopkom. [26] Zaradi uporabe drugačnega reagenta in precej razredčene raztopine je reakcija potekala dlje kot je opisano v literaturi. V tem času se je barva raztopine spremenila iz rumene v oranžno. Ker se tekom reakcije produkt v bučki ni izoboril, sem ga namesto s filtracijo, kot je bilo opisano v literaturnem postopku, od preostale reakcijske zmesi ločila z uporabo ekstrakcije v DCM. V liju ločniku se je v vmesni fazi tvorila emulzija, zato je bila ekstrakcija zelo otežena. Prisoten DMSO je tako po ekstrakciji delno ostal v organski fazi. Popolnoma sem ga iz produkta 4 odstranila z uporabo kolonske in radialne kromatografije. Prisotnost produkta 4 sem potrdila tako s HRMS kot s 1 H NMR tehniko. Slednja je pokazala prisotnost nečistot, katerih bi se morda lahko znebila s prekristalizacijo. V tej stopnji dodatnega čiščenja nisem izvedla, vendar lahko uspešna tvorba produkta služi kot vodilo za nadaljnjo sintezo večjih količin spojine 4. 16

REZULTATI IN RAZPRAVA Produkt 4 pod UV svetlobo valovne dolžine 366 nm fluorescira svetlobo oranžne barve. Shema 14: Shema sinteze produkta 4. Za topilo je bil uporabljen DMSO, za bazo pa KOH. Reakcija je potekala 24h na sobni temperaturi. Slika 7: Izolacija produkta 4 z uporabo ekstrakcije v liju ločniku. Organska faza se nahaja spodaj. 17

REZULTATI IN RAZPRAVA 3.5 Sinteza produkta 5, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)-4- metil-2-oxo-2h-piran-3-karbonitrila 3.5.1 Zastavljena sintezna pot za pripravo spojine 5 Sintezna pot za pripravo produkta 5 je bila zasnovana analogno z literaturnim postopkom. [27] Reakcija med spojino 2 in etil cianoacetatom je bila neuspešna, prav tako se je za neuspešno izkazala analogna sintezna pot iz spojine 12, saj vmesni produkt 14 ni nastal oz. je nastal v zanemarljivi količini. a) b) Shema 15: Zastavljena pot sinteze produkta spojine 5 iz 2 (a) in spojine 12 (b). 18

REZULTATI IN RAZPRAVA 3.5.2 Modificirana sintezna pot za pripravo spojine 5 Ker sta se zastavljeni sintezi iz dikabonilnih spojin izkazali za neuspešni, sem poskusila produkt 5 sintetizirati po poti, predstavljeni v Shemi 13. Sintezna pot je sestavljena iz treh stopenj: 1. Sinteza spojine 13, 1-(4-bromofenil)prop-2-en-1-ona, 2. Reakcija med produktom 13 in etil cianoacetatom sinteza produkta 14, 3. Spajanje spojine 14 z (4-(dimetilamino)fenil)borovo kislino 8 po Suzukiju. Shema 16: Modificirana sintezna pot za pripravo produkta 5. 19

REZULTATI IN RAZPRAVA 3.5.2.1 Priprava spojine 13, 1-(4-bromofenil)prop-2-en-1-ona Produkt 13 sem sprva poskusila sintetizirati s postopkom aldolne kondenzacije med produktom 9 in acetaldehidom, opisanim v literaturi. [28] Kljub daljšemu reakcijskemu času pri višji temperaturi je po čiščenju reakcijske zmesi 1 H NMR analiza pokazala, da je bila sintezna pot neuspešna. Produkt 13 ni nastal. Vpliv vrstnega reda dodajanja reagentov v reakcijsko zmes sem izključila s ponovitvijo poskusa z drugačnim vrstnim redom dodajanja reagentov: v EtOH sem najprej raztopila NaOH, dodala spojino 9 in po mešanju 10 min po kapljicah dodala raztopino acetaldehida v EtOH. Tudi ta sintezna pot se je izkazala za neuspešno, zato sem zaključila, da aldolna kondenzacija ni primeren način za pripravo produkta 13. Shema 17: Sinteza produkta 13 s postopkom aldolne kondenzacije. Za uspešno se je izkazala sintezna pot z Wittigovo reakcijo, predstavljena v naslednji reakcijski shemi: Shema 18: Večstopenjska sinteza produkta 13 z uporabo Wittigove reakcije. 20

REZULTATI IN RAZPRAVA Prvi korak sinteze sem zasnovala analogno literaturnemu postopku. [29] Reakcija je potekla z opazno spremembo barve iz intenzivno zelene se je reakcijska zmes obarvala rumeno. Po čiščenju se je v NMR spektru videl premik alifatske resonance, kar je potrdilo prisotnost produkta 15, a je bilo hkrati prisotne še 10% izhodne spojine 9. Presodila sem, da nadaljnje čiščenje ne bi močno pripomoglo k izboljšanju pogojev za reakcijo v naslednji stopnji. Nadaljnja tvorba Wittigovega reagenta 16 je potekla uspešno analogno po literaturnem postopku, [30] le da sem namesto vodnega NaOH dodala vodno raztopino Na2CO3. Prisotnost produkta 16 sem potrdila tako s HRMS kot tudi z 1 H NMR tehniko. Pri reakciji med 16 in acetaldehidom v THF se je uspešno tvoril produkt 13, kot je opisano na podobnem primeru v literaturi. [31] Njegov nastanek sem potrdila tako z 1 H NMR kot tudi s HRMS tehniko - NMR spektru so dobro vidni njegova dubleta kvarteta ter dublet dubleta. 3.5.2.2 Reakcija med produktom 13 in etil cianoacetatom sinteza produkta 14 Sintezo produkta 14 iz spojine 13 in etil cianoacetatom sem izvedla analogno literaturnemu postopku (topilo: EtOH, baza: piperidin). [32] Kljub 48 h mešanju pod pogoji refluksa je 1 H NMR analiza pokazala, da je nastalo veliko različnih produktov, med katerimi spojine 14 ni bilo zaznati. Tudi ob spremembi reakcijskih pogojev (topilo: CH3CN, baza: Et3N) reakcija ni potekla v NMR spektru so se videle le resonance izhodne spojine. Zaključila sem, da reakcija med spojino 13 in etil cianoacetatom ni primerna za sintezo produkta 14. Shema 19: Prvi način sinteze produkta 14. Neuspela sinteza spojine 14 je onemogočila njeno nadaljnje spajanje z borovo kislino 8. Nobena izmed preizkušenih poti za sintezo spojine 10 ni bila uspešna. Morebitno uspešno sintezo produkta 10 bi lahko dosegla z izvedbo sinteze po alternativni poti ali pa z optimizacijo že zastavljenih poti. 21

ZAKLJUČEK 4 Zaključek Uspešno lahko potrdim pet od šestih zastavljenih hipotez. Sintetizirala, izolirala in okarakterizirala sem štiri nove fluorescenčne molekule, 1, 2, 3 in 4. Pri vzbujanju s svetlobo valovne dolžine 366 nm spojine emitirajo svetlobo različnih valovnih dolžin, kar nakazuje na pomemben vpliv elektron-privlačnih skupin na optične lastnosti molekulskih sond. Čeprav je bila sinteza spojine 13 z Wittigovo reakcijo uspešna, pa sinteza končnega produkta 5 ni uspela. Podobno so bile neuspešne tudi sinteze iz izhodnih spojin 2 in 12, zato na podlagi dobljenih rezultatov pete hipoteze nisem mogla potrditi. Prepričana sem, da bodo moji rezultati in ugotovitve, predstavljene v tej diplomski nalogi, pomagale pri razumevanju vpliva elektron privlačnih skupin na optične lastnosti molekulskih sond. Hkrati verjamem, da bodo postopki priprave spojin pomagali pri uspešni sintezi in uporabi le-teh. 22

LITERATURA 5 Eksperimentalni del 5.1 Reagenti, topila in aparature Kemikalije so bile pridobljene iz komercialnih virov (Fluka, Sigma Aldrich, FluoroChem). Brezvodni DMSO je bil pred uporabo pripravljen z vakuumsko destilacijo. Ostala topila so bila uporabljena brez predhodnega čiščenja, sušenja ali drugačnega načina predpriprave. Tališča so bila izmerjena s Koflerjevim mikroskopom z ogrevalno mizico Leica Galen III in niso korigirana. NMR spektri so bili posneti s 500 MHz spektrometrom Bruker Avance III. Kemijski premiki protonskih resonanc so podani glede na rezidualni signal CDCl3 (δ = 7.26 ppm), DMSO (δ = 2.50 ppm). Kemijski premiki ogljikovih resonanc so prav tako podani glede na rezidualni signal CDCl3 (δ = 77.2 ppm). Kemijski premiki (δ) so podani v ppm. Sklopitvene konstante (J) so podane v Hz. Sklopitveni vzorci so podani kot: s (singlet), d (dublet), t (triplet), q (kvartet), quint (kvintet), m (multiplet) in br (razširjen). Masni spektrometri visoke ločljivosti (HRMS) so bili izmerjeni z Agilentovim Accurate Mass TOF LC/MS spektrometrom (Agilent 6224) na prelet ionov (TOF, angl. time of flight) nastalih pri elektrorazprševanju (ESI, angl. electrospray ionization) pri atmosferskem tlaku. Za tankoplastno kromatografijo sem uporabljali TLC ploščice (Fluka Analytical) s silikagelskim matriksom na aluminijastih nosilcih, impregnirane s fluorescenčnim indikatorjem (λe = 254 nm). Opazovala sem jih pod UV-svetilko (CAMAG) pri valovnih dolžinah 254 nm in 366 nm. Za preparativno kolonsko kromatografijo sem uporabljala silikagel (Fluka Silica gel 60, mesh 220 240). Za preparativno radialno tankoplastno kromatografijo sem uporabila Harrison Research Chromatotron 7924T. Kromatografske plošče sem pripravila iz vodne mešanice silikagela Merk 60 PF254 in mavca, ki sem jo nanesla na steklene plošče, sušila na 50 C in pred uporabo zbrusila na želeno debelino (1 mm, 2 mm, 4 mm). 23

LITERATURA Za avtomatsko flash kromatografijo sem uporabljala sistem PuriFlash XS520Plus (Interchim, Francija). Kot stacionarno fazo sem uporabila pred-polnjene kolone za flash kromatografijo (SiO2, PF50-SIHC-F0040; Interchim, Francija) kot mobilno fazo pa mešanico etil acetata in petrol etra (gradientna elucija). Produkt sem na kolono nanesla preko suhega nanosa na SiO2. Frakcije sem zbirala na podlagi UV kromatograma (254 nm, prag zbiranja: 20 mau) v 25-mL epruvete. 24

LITERATURA 5.2 Sinteza spojine 1, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etanona 5.2.1 Sinteza produkta 1 iz (4-acetofenil)borove kisline 4-Bromo-N,N-dimetilanilin, 6, (662 mg, 3.33 mmol) sem raztopila v dioksanu (20 ml) ter raztopini dodala Pd(PPh3)4 (167 mg, 0.14 mmol) in nasičeno vodno raztopino NaHCO3 (10 ml). Raztopino sem mešala 5 min pri 75 C v argonovi atmosferi, nato pa dodala raztopino borove kisline 7 (200 mg, 1.22 mmol) v dioksanu (4 ml). Po 1 h mešenja sem dodala dodatno količino Pd(PPh3)4 (170 mg, 0.15 mmol), 9 mol% glede na spojino 6. Reakcijsko zmes sem mešala še 30 min, črn Pd(0) odfiltrirala in filtratu dodala slanico. Reakcijsko zmes sem ekstrahirala v DCM (3 10 ml). Združene organske frakcije sem sušila nad brezvodnim Na2SO4 in uparila topilo pod znižanim tlakom. Produkt sem očistila z avtomatsko kromatografijo na PuriFlash (stacionarna faza SiO2; produkt eluiran z mešanico PE/EA, gradientna elucija: 93.2% PE do 8.6% PE v EA; čas ločbe: 55 min). Dobila sem kristaliničen produkt 1 (170 mg, 0.71 mmol, 21%). 5.2.2 Sinteza spojine 1 iz 4-bromoacetofenona s katalizatorjem Pd(PPh 3 ) 4 25

LITERATURA 4-Bromoacetofenon, 9 (604 mg, 3.05 mmol) sem raztopila v dioksanu (10 ml) ter raztopini dodala Pd(PPh3)4 (389 mg, 0.34 mmol) in nasičeno vodno raztopino NaHCO3 (7.5 ml). Raztopino sem mešala 5 min pri 75 C v atmosferi argona, nato pa dodala mešanico spojine 8 (608 mg, 3.68 mmol) in dioksana (10 ml). Pri tem se borova kislina ni povsem raztopila v dioksanu. Po 2.5 h mešenja pri 70 C v atmosferi argona sem dodala dodatno količino Pd(PPh3)4 (86 mg, 0.075 mmol), po 1 h pa še 84 mg (0.073 mmol), 17 mol% glede na spojino 9. Reakcijsko zmes sem mešala še 30 min, nato pa ji dodala slanico in jo ekstrahirala v DCM (3 10 ml). Združene organske frakcije sem sušila nad brezvodnim Na2SO4 in uparila topilo pod znižanim tlakom. Produkt sem očistila z avtomatsko kromatografijo na PuriFlash (stacionarna faza SiO2; produkt eluiran z mešanico PE/EA, gradientna elucija: 93.2% PE do 8.6% PE v EA; čas ločbe: 55 min). Dobila sem kristaliničen produkt 1 (111 mg, 0.46 mmol, 15%). 5.2.3 Sinteza spojine 1 iz 4-bromoacetofenona s katalizatorjem Pd(PPh 3 ) 2 Cl 2 4-Bromoacetofenon, 9 (607 mg, 3.03 mmol) sem raztopila v dioksanu (10 ml) ter mešanici dodala Pd(PPh3)2Cl2 (212 mg, 0.30 mmol) in nasičeno raztopino NaHCO 3 (8 ml). Raztopino sem mešala 5 min pri 75 C v atmosferi argona, nato pa dodala mešanico spojine 8 (607 mg, 3.68 mmol) in dioksana (10mL). Pri tem se borova kislina ni povsem raztopila v dioksanu. Po 1.5 h mešenja pri 75 C v atmosferi argona sem dodala dodatno količino Pd(PPh3)4 (126 mg, 0.18 mmol), 16 mol% glede na spojino 9. Reakcijsko zmes sem mešala še 30 min, nato pa ji dodala slanico in jo ekstrahirala v DCM (3 10 ml). Združene organske frakcije sem sušila nad brezvodnim Na2SO4 in uparila topilo pod znižanim tlakom. Produkt sem očistila z avtomatsko kromatografijo na PuriFlash (stacionarna faza SiO2; produkt eluiran z mešanico PE/EA, gradientna elucija: 93.2% PE do 8.6% PE v EA; čas ločbe: 55 min). Dobila sem kristaliničen produkt 1 (149 mg, 0.62 mmol, 21%). 26

LITERATURA Izled: rumeni kristali. Ttal: 215 216 C. 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.02 7.96 (m, 2H), 7.66 7.63 (m, 2H), 7.60 7.54 (m, 2H), 6.84 6.78 (m, 2H), 3.03 (s, 6H), 2.61 (s, 3H). HRMS ESI (m/z): [M + H]+ izračunana za C16H18NO, 240.1383; izmerjena, 240.1386. 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) produkt 1 po čiščenju s kolonsko kromatografijo. 27

LITERATURA 5.3 Sinteza spojine 4, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)butan- 1,3-diona V EA (4 ml) sem raztopila 1 (68.2 mg, 0.29 mmol) in dodala 60% NaH (121 mg, 3.02 mmol NaH). Reakcijsko zmes sem mešala 1 h pri 80 C v atmosferi argona in jo nato razredčila z EA (10 ml) ter dodala slanico (15 ml). Mešanico sem nakisala z 1M HCl do ph = 5 in ekstrahirala v DCM (3 5 ml). Združene organske frakcije sem sušila nad brezvodnim Na2SO4 in topilo uparila pod znižanim tlakom. Zmes sem ločila z radialno kromatografijo (SiO2), tako da sem na suho ploščo nanesla vzorec v DCM, ploščo osušila in produkt spirala z mešanico PE/EA = 5:1. Mobilno fazo sem gradientno spreminjala do mešanice PE/EA = 1:1. Dobila sem kristaliničen produkt 2 (38.8 mg, 0.14 mmol, 48%). Izgled: rumeni kristali. Ttal: 195 196 C. 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 16.25 (s, 1H), 7.92 7.88 (m, 2H), 7.65 7.61 (m, 2H), 7.58 7.52 (m, 2H), 6.83 6.77 (m, 2H), 6.20 (s, 1H), 3.02 (s, 6H), 2.20 (s, 3H). 13 C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 193.14, 183.35, 150.50, 145.12, 132.90, 129.35, 127.97, 127.82, 128.57, 127.33, 126.00, 125.95, 112.57, 112.51, 96.37, 40.41, 40.35, 25.78. Pri 1 H NMR in 13 C NMR so izpisani le signali enolne oblike produkta. HRMS ESI (m/z): [M + H] + izračunana za C18H20NO2, 282.1489; izmerjena, 282.1417. 28

LITERATURA 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) produkt 2 po čiščenju z radialno kromatografijo. 13 C NMR (126MHz, CDCl3) produkt 2 po čiščenju z radialno kromatografijo. 29

LITERATURA 5.4 Sinteza spojine 7, 1-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4- il)etiliden)propanodinitrila V piridinu (4 ml) sem raztopila 1 (96.2 mg, 0.40 mmol) in malononitril (417 mg, 6.31 mmol). Reakcijsko mešanico sem mešala 3.5h pri 80 C, dodala DCM in sprala z destilirano H2O. Zmes sem ekstrahirala v DCM (3 5 ml) in združene organske frakcije sušila nad brezvodnim Na2SO4. Topilo sem uparila pod znižanim tlakom. Piridina sem se znebila z dodatkom toluena in uparevanjem z rotacijskim uparjalnikom. Postopek sem ponovila dvakrat. Zmes sem ločila z radialno kromatografijo (SiO2), tako da sem na suho ploščo nanesla vzorec v DCM, ploščo osušila in produkt spirala z mešanico PE:EA = 5:1. Mobilno fazo sem gradientno spreminjala do PE:EA = 1:3. Izkoristek po ločbi z radialno kromatografijo je bil 34% (185.2 mg, prisotne nečistoče). Zaradi velike prisotnosti malononitrila, sem produkt dodatno očistila s prekristalizacijo v čistem EA. Izolirala sem čist kristaliničen produkt 3 (7 mg, 0.025 mmol, 7%). Izgled: rdeči kristali. Ttal: 218 219 C. 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.70 7.67 (m, 2H), 7.66 7.63 (m, 2H), 7.58 7.54 (m, 2H), 6.82 6.78 (m,2h), 3.03 (s, 6H), 2.66 (s, 3H). 13 C NMR (126MHz, CDCl3) δ 174.42, 150.71, 145.49, 132.79, 128.26, 127.85, 126.47, 126.17, 113.45, 113.30, 112.53, 82.8, 40.34, 23.88. HRMS ESI (m/z): [M + H] + izračunana za C19H18N3, 288.1495; izmerjena, 288.1494. 30

LITERATURA 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) produkt 3 po prekristalizaciji. 13 C NMR (126MHz, CDCl3) produkt 3 po prekristalizaciji. 31

LITERATURA 5.5 Sinteza spojine 8, 6-(4'-(dimetilamino)[1,1'-bifenil]-4-il)-4- (metilsulfanil)-2-oxo-2h-piran-3-karbonitrila V bučki sem zmešala 1 (48.5 mg, 0.20 mmol), 11 (38.7 mg, 0.19 mmol), KOH (16.4 mg, 0.29 mmol) in brezvodni DMSO (50 ml). Reakcijsko zmes sem mešala 22 h pri sobni temperaturi, nato pa dodala še KOH (52.2 mg, 0.93 mmol) in mešala še 2 h. Mešanici sem dodala slanico in destilirano H2O. Ekstrakcijo v DCM sem ponovila večkrat, saj se je v vmesni plasti naredila emulzija in je bila zato ekstrakcija otežena. Združene organske frakcije sem sušila nad brezvodnim Na2SO4, topilo pa uparila pod znižanim tlakom. Reakcijsko zmes sem očistila s kolonsko kromatografijo (SiO2), mobilna faza: EA/PE = 1:7, nato gradientno z mešanico PE/EA do 100% EA. Tekom kromatografije sem se uspešno znebila večine topila DMSO, vendar nisem uspela odstraniti vseh ostalih nečistoč. Dobila sem nečist produkt 4 (79.6 mg, 0,22 mmol, prisotne nečistoče). Izgled: kristali umazano bele barve. 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.91 7.87 (m, 2H), 7.72 7.68 (m, 2H), 7.60 7.56 (m, 2H), 6.83 6.79 (m, 2H), 6.71 (s, 1H), 3.03 (s, 5H), 2.90 (s, 1H), 2.72 (s, 3H). HRMS ESI (m/z): [M + H] + izračunana za C21H19N2O2S, 363.1162; izmerjena, 363.116. 32

LITERATURA 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) produkt 4 po čiščenju s kolonsko kromatografijo. 33

LITERATURA 5.6 Sinteza spojine 11, 1-(4-bromofenil)prop-2-en-1-ona 5.6.1 Prva stopnja sinteze sinteza 2-bromo-1-(4-bromofenil)etan-1-ona V kloroformu (15 ml) sem raztopila 9 (3.99 g, 20 mmol) ter mu dodala črn CuBr2 (8.93 g, 40 mmol) in EA (20 ml). Reakcijsko zmes sem intenzivno mešala 5h pri 90 C in jo filtrirala čez celit, da sem se znebila belega CuBr. Sprala sem jo s 5% raztopino Na2CO3 in slanico ter mešanico trikrat ekstrahirala v DCM. Združene organske frakcije sem sušila nad brezvodnim Na2SO4, topilo pa uparila pod znižanim tlakom. Izolirala sem kristaliničen, a nečist produkt 15 (4.49 g, 16 mmol, 81%). Prisotno je bilo še 10% izhodne spojine (določeno iz NMR spektra). Produkt sem v naslednji stopnji sinteze uporabila brez dodatnega čiščenja. NMR spekter se sklada s spektrom iz literature. [33] 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.87 7.81 (m, 2H), 7.66 7.59 (m, 2H), 4.41 (s, 2H). 34

LITERATURA 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) produkt 15 ekstrakciji in uparitvi topila, brez dodatnega čiščenja. 35

LITERATURA 5.6.2 Druga stopnja sinteze sinteza fosforjevega ilida Produkt 15 (4.49 g, 16 mmol) iz prejšnjega koraka sinteze sem zmešala s PPh3 (4.557 g, 17 mmol) in ju raztopila v toluenu (30 ml). Reakcijsko mešanico sem mešala 24 h pri sobni temperaturi in jo filtrirala. Filtrat sem zavrgla, trdnemu ostanku pa dodala DCM (15 ml) in vodno raztopino Na2CO3 (4.83 g v 20 ml vode). Pri tem se je raztopina iz bele barve obarvala oranžno. Reakcijsko zmes sem dvakrat ekstrahirala v DCM, združeni organski frakciji pa sušila nad brezvodnim Na2SO4 in topilo uparila pod znižanim tlakom. Po spiranju s PE in filtracijo sem dobila čist trden produkt 16 (4.96 g, 10 mmol, 66%). 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.85 7.81 (m, 2H), 7.74 7.66 (m, 6H), 7.58 7.54 (m, 3H), 7.50 7.44 (m, 8H), 4.44 4.34 (m, 1H). HRMS ESI (m/z): [M + H] + izračunana za C26H21BrOP, 459.0508; izmerjena, 459.0506. 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) produkt 16 po spiranju s PE in filtraciji. 36

LITERATURA 5.6.3 Tretja stopnja sinteze sinteza 1-(4-bromofenil)but-2-en-1-ona Produkt 16 (4.96 g, 10 mmol) iz prejšnjega koraka sinteze sem raztopila v THF (30 ml) in mu dodala acetaldehid (1.43 g, 32 mmol). Reakcijsko zmes sem mešala 4h pri 70 C in topilo uparila pod znižanim tlakom. Produkt sem očistila s kolonsko kromatografijo (SiO2), mobilna faza: PE:EA = 20:1, nato gradientno z mešanico PE/EA do mešanice PE:EA = 10:1. Izolirala sem kristaliničen produkt 13 (161 mg, 0.72 mmol, 7%), ki glede na NMR spekter ni popolnoma čist. NMR spekter se sklada z literaturnim. [34] 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.82 7.77 (m, 2H), 7.63 7.58 (m, 2H), 7.09 (dq, J = 15.3, 6.9Hz1H), 6.86 (dq, J = 15.3, 1.6Hz1H), 2.00 (dd, J = 1.6Hz, 3H). HRMS ESI (m/z): [M + H] + izračunana za C10H10BrO, 224.991; izmerjena, 224.008. 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) produkt 13 po čiščenju s kolonsko kromatografijo. 37

38 LITERATURA

LITERATURA 6 Literatura [1] B. N. Dugger, D. W. Dickson: Pathology of Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017, 1 22. [2] M. Lassonde, S. Candel, J. Hacker, A. Quadrio-Curzio, T. Onishi, V. Ramakrishnan, M. McNutt: The Challenge of neurodegenerative diseases in an aging population. G7 Academies' Joint Statements 2017. [3] T. Lashley, J.M. Schott, P. Weston, C. E. Murray, H. Wellington, A. Keshavan, S. C. Foti, M. Foiani, J. Toombs, J. D. Rohrer, A. Heslegrave, H. Zetterberg: Molecular biomarkers of Alzheimer's disease: progress and prospects. Dis. Model. Mech. 2018, 11, 1 9. [4] M. E. Orr, A. C. Sullivan, B. Frost: A Brief Overwiew of Tauopathy: Causes, Consequences, and Therapeutic Strategies. Trends Pharmacol. Sci. 2017, 38, 637 648. [5] M. R. Sawaya, S. Sambashivan, R. Nelson, M. I. Ivanova, S. A. Sievers, M. I. Apostol, M. J. Thompson, M. Balbrinie, J. J. W. Wiltzius, H. T. McFarlane, A. Ø. Madsen, C. Riekel, D. Eisenberg: Atomic structures of amylid cross-β spines reveal varied steric zippers. Nature 2007, 447, 453 457. [6] L. Rejc, L. Šmid, V. Kepe, Č. Podlipnik, A. Golobič, M. Bresjanac, J. R. Barrio, A. Petrič, J. Košmrlj: Design, Synthese, and in Vitro Evaluation of New Fluorine-18 Radiolabeled Tau-Labeling Molecular probes. J. Med. Chem. 2017, 60, 8741 8757. [7] Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2006, 8, 1 33. [8] W. R. Zipfel, R. M. Williams, R. Christine, A. Y. Nikitin, B. T. Hyman, W. W. Webb: Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100, 7075 7080. 39

LITERATURA [9] K. Leung: 2-(1-{6-[(2-[ 18 F]Fluoroethyl)(methyl)amino]-2-naphthyl}ethylidene)malononitrile. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [Internet]. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2004 2011. 2005 Jul 25 [updated 2011 Jun 26]. [10] M. Mariqué, M. D. Normandin, C. E. Vanderburg, I. M. Costantino, E. A. Bien, L. G. Rycyna, W. E. Klunk, C. A. Mathis, M. D. Ikonomovic, M. L. Debnath, N. V. Vasdev, B. C. Dickerson, S. N. Gompetrs, J. H. Growdon, K. A. Johnson, M. P. Frosch, B. T. Hyman, T. Gómez-Isla: Validating Novel Tau Positron Emission Tomography Tracer [F-18]-AV-1451 (T807) on Postmortem Brain Tissue. Ann. Neurol. 2015, 78, 787 800. [11] J. R. Barrio, G. W. Small, K.-P. Wong, S.-C. Huang, J. Liu, D. A. Merrill, C. C. Giza, R. P. Fitzsimmons, B. Omalu, J. Bailes, V. Kepe: In vivo characterization of chronic traumatic encephalopathy using [F-18]FDDNP PET brain imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 2039 2047. [12] K. Sander, T. Lashley, P. Gami, T. Gendron, M. F. Lythgoe, J. D. Rohrer, J. M. Schott, T. Revesz, N. C. Fox, E. Arstad: Characterization of tau positron emission tomography tracer [ 18 F] AV-1251 binding to postmortem tissue in Alzheimer's disease, primary tauopathies, and other dementias. Alzheimers Dement. 2016, 1 9. [13] L. Lemonie, A. Leuzy, K. Chiotis, E. Rodriguez-Vieitez, A. Nordberg: Tau positron emission tomography imaging in tauopathies: The added hurdle of off-target binding. Alzheimers Dement. 2018, 1 5. [14] C. N. Winston, E. J. Goetzl, J. C. Akers, B. S. Carter, E. M. Rockenstein, D. Galasko, E. Masliah, R. A. Rissman: Prediction of conversion from mild cognitive impairment to dementia with neuronally derived blood exosome protein profile. Alzheimers Dement. 2016, 63 72. [15] M. Shi, A. Kovac, A. Korff, T. J. Cook, C. Ginghina, K. M. Bullock, F. Kerr, C. P. Zabetian, E. R. Peskind, S. C. Hu, J. F. Quinn, D. R. Galasko, T. J. Montine, W. A. Banks, J. Zhang: CNS tau efflux via exosomes is likely 40

LITERATURA increased in Parkinson desease but not in Alzheimer disease. Alzheimers Dement. 2016, 1 7. [16] R. Kalluri, V. S. LeBleu: The biology, function and biomedical applications of exosomes. Science 2020, 367, 1 15. [17] S. R. Chemler, D. Trauner, S. J. Danishefsky: The B-Alkyl Suzuki-Miyaura Cross-Coupling Reaction: Development, Mechanistic Study, and Applications in Natural Product Synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 4544 4568. [18] N. Miyaura, K. Yamada, A. Suzuki: A new stereospecific cross-coupling by the palladium-catalyzed reaction of 1-aklenylboranes with 1-alkynyl halides. Tetrahedron Lett. 1979, 20, 3437 3440. [19] C. Amatore, A. Jutand, G. Le Duc: Kinetic Data for the Transmetalation/Reductive Emilimation in Palladium Catalyzed Suzuki- Miyaura Reactions: Unexpected Triple Role of Hydroxide Ions Used as Base. Chem. Eur. J. 2011, 17, 2492 2503. [20] R. Martin, S. L. Buchwald: Palladium-Catalyzed Suzuki-Miyaura Cross- Coupling Reactions Employing Dialkylbiaril Phosphine Ligands. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1461 1473. [21] P. Vollhardt, N. Schore: Organic Chemistry, Structure and Function (Seventh Edition). New York: W. H. Freeman and Company, 2014, str. 1039 1049. [22] J. Clayden, N. Greeves, S. Warren: Ogranic Chemistry. Oxford (UK): Oxford University Press, 2012, str. 703. [23] H. Tye, M. Whittaker, S. Ramdeehul: Minimisation of Palladium Content in Suzuki Cross-Coupling Reactions. Comb. Chem. High Trhoughput Screen. 2006, 9, 703 710. 41

LITERATURA [24] Inagaki, S.; Saito, K.; Suto, S.; Aihara, H.; Sugawara, A; Tamura, S.; Kawano, T. Synthesis of 5-aryl-3(2H)-furanones using intramolecular cyclization of sulfonium salts. J. Org. Chem. 2018, 83, 13834 13846. [25] J. Clayden, N. Greeves, S. Warren: Ogranic Chemistry. Oxford (UK): Oxford University Press, 2012, str. 531. [26] H. K. Maurya, P. G. Vasudev, A. Gupta: A regioselective synthesis of 2,6 diarylpyridines. RSC Adv. 2013, 3, 12955 23962. [27] M. A. M. A. Raheim, I. S. A. Hafiz, S. Mohamed: Utility of β-diketones in heterocyclic synthesis: Synthesis of new tetrahydropyrimidinethione, pyrazole, thiophene, dihydropyridine, dihydropyrane, pyridazine derivatives and investigation of their antimicrobial activity. Eur. J. Chem. 2016, 7, 298 308. [28] Z. Lin, C. Li, Z. Zhou, S, Xue, J. Gao, Q. Ye, Y. Li: Copper(II)-Promoted Oxidation/[3+2]Cycloaddition/Aromatization Cascade: Efficient Synthesis of Tetrasubstituted NH-Pyrrole from Chalcones and Iminodiacetates. Synlett. 2019, 30, 1442 1446. [29] M. Sun, Q. Xu, J. Xu, Y. Wu, Y. Wang, D. Zuo, Q. Guan, K. Bao, J. Wang, Y. Wu, W. Zhang; Synthesis and bioevaluation of N,4-diaryl-1,3-thiazole-2- amines as tubulin inhibitors with potent antiproliferative activity. PLoS ONE 2017, 12: e0174006. [30] A. Matviitsuk, J. E. Taylor, D. B. Cordes, A. M. Z. Slawin, A. D. Smith: Enantioselective Stereodivergent Nucleophile-Dependent Isothiourea- Catalysed Domino Reactions. Chem. Eur. J. 2016, 22, 17748 17757. [31] Z. Chen, F. Hu, S. Huang, Z. Zhao, H. Mao, W. Qin: Organocatalytic Enantioselective Selenosulfonylation of a C-C Double Bond To Form Two Stereogenic Centers in an Aqueous Medium. J. Org. Chem. 2019, 84, 8100 8111. 42