ZANIMIVI PRIMERI GENETSKIH LASTNOSTI IZBRANIH POLJŠČIN IN ZELENJADNIC

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO Tomaž TRAFELA ZANIMIVI PRIMERI GENETSKIH LASTNOSTI IZBRANIH POLJŠČIN IN ZELENJADNIC DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja Ljubljana, 2020

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO Tomaž TRAFELA ZANIMIVI PRIMERI GENETSKIH LASTNOSTI IZBRANIH POLJŠČIN IN ZELENJADNIC DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja INTERESTING EXAMPLES OF GENETIC PROPERTIES OF SELECTED CROPS AND VEGETABLES B. SC. THESIS Academic Study Programmes Ljubljana, 2020

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Kmetijstvo agronomija. Delo je bilo opravljeno na Katedri za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin. Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Jerneja Jakšeta. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: Član: Član: prof. dr. Metka HUDINA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo prof. dr. Jernej JAKŠE Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo prof. dr. Zlata LUTHAR Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Datum zagovora: II

ŠD Du1 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA DK UDK 577.21: 575.117:633.34:633.11:633.43:635.64(043.2) KG AV SA Soja, KTi, BBI, pšenica, Rht, korenje, karotenoidi, antociani, paradižnik, sun, ovate TRAFELA, Tomaž JAKŠE, Jernej (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA LI 2020 IN TD OP IJ JI AI Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Univerzitetni študijski program prve stopnje Kmetijstvo - agronomija ZANIMIVI PRIMERI GENETSKIH LASTNOSTI IZBRANIH POLJŠČIN IN ZELENJADNIC Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) VI, 20 str., 7 sl., 60 vir. sl sl/en Mendel je kot utemeljitelj sodobne genetike odkril povezavo med lastnostmi in njihovim prenosom na potomce. Kasneje so odkrili molekulo DNA, ki omogoča prenos dednih informacij. Tako so mnoge lastnosti lahko razložene s poznavanjem genskega ozadja. Določeni geni, kot so naprimer Rht geni, ki vplivajo na višino pšenice so človeštvu omogočili prehransko varnost. Določeni geni pri korenju kodirajo naprimer encime potrebne v biosintezni poti karotenoidov. Medtem ima pri tvorbi antocianov močan vpliv gen, ki posredno vpliva na biosintezo antocianov. Tako obstaja korenje od vijolične, rumene, bele in do oranžne barve, kar je lahko posebej zanimivo za trg. Podobno so za trg zanimive različne oblike plodov, kot je to dobro poznano pri paradižniku. Raziskave so pokazale, da na obliko paradižnika vpliva več genov, ki imajo različno močan vpliv in tako omogočajo nastanek od sploščene do podolgovate oblike plodu paradižnika. S poznavanjem genskega ozadja določenih lastnosti pa lahko vplivamo na gospodarnost pridelave določene vrste. Tak primer je soja, ki načeloma vsebuje relativno velike količine tripsin in kimotripsin inhibitorjev, kot so KTi in BBI, ki ji znižujejo prehransko vrednost. Vendar je prišlo do mutacije, ki je znižala vsebnost teh inhibitorjev in s tem povečala prebavljivost. To lastnost je za splošno uporabnost potrebno dožlahtniti. Obstaja torej veliko lastnosti, ki vplivajo na naš vsakdan in so posledica delovanja in interakcije genov. III

ND Du1 KEY WORDS DOCUMENTATION DC UDC 577.21: 575.117:633.34:633.11:633.43:635.64(043.2) CX AU AA Soy, KTi, BBI, wheat, Rht, carrot, carotenoids, anthocyanin, tomato, sun, ovate TRAFELA, Tomaž JAKŠE, Jernej (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB PY 2020 TI DT NO LA AL AB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Academic Study Programme in Agriculture - Agronomy INTERESTING EXAMPLES OF GENETIC PROPERTIES OF SELECTED CROPS AND VEGETABLES B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) VI, 20 p., 7 fig., 60 ref. sl sl/en As the founder of modern genetics, Mendel discovered the connection between traits and their transfer to offspring. Later, a DNA molecule was discovered that enables the transmission of hereditary information. Thus, many traits can be explained by the knowledge of the genetic background. Certain genes, such as the Rht genes, which influence wheat height, have provided the human population with sufficient food. Certain genes in carrots encode enzymes that are needed for the biosynthetic pathways of carotenoids. Meanwhile, anthocyanin gene formation has a strong influence on a gene that indirectly influences the biosynthesis of anthocyanins. For example, carrots are available in purple, yellow, white and orange colours, which may be of particular interest to the market. Different fruit forms are also of interest for the market, as is known for tomatoes. Research has shown that the shape of the tomato fruit is influenced by several genes that act in different ways to produce a flattened to elongated shape of tomato fruit. By knowing the genetic background of certain traits, we can influence the economics of producing a particular species. One such example is soy, which in principle contains relatively large amounts of trypsin and chymotrypsin inhibitors such as KTi and BBI, which reduce its nutritional value. However, a mutation has occurred which has reduced the content of these inhibitors and thus increased digestibility, a property that needs to be refined for general use. So there are many traits that influence our daily life and are due to the genes. IV

KAZALO VSEBINE Str. KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... III KEY WORDS DOCUMENTATION... IV KAZALO VSEBINE... V KAZALO SLIK... VI 1 UVOD...1 2 ZANIMIVE LASTNOSTI IZBRANIH POLJŠČIN...3 2.1 SOJA Z NIŽJO VSEBNOSTJO INHIBITORJEV TRIPSINA IN KIMOTRIPSINA...3 2.2 NIŽJA RAST PŠENICE...6 3 ZANIMIVE LASTNOSTI IZBRANIH ZELENJADNIC...8 3.1 BARVA KORENJA...8 3.1.1 Biosinteza karotenoidov...8 3.1.2 Genetska osnova biosinteze karotenoidov...9 3.1.3 Biosinteza antocianov... 10 3.1.4 Genetska osnova biosinteze antocianov... 11 3.2 IZDOLŽENA OBLIKA PARADIŽNIKA... 11 4 ZAKLJUČEK... 15 5 VIRI... 16 V

KAZALO SLIK Str. Slika 1: Lastnosti, ki jih je obravnaval Mendel (prirejeno po Aryal, 2018)....2 Slika 2: KTi protein, njegova aminokislinska sestava in disulfidne vezi (Savage in Morrison, 2003).... 4 Slika 3: BBI protein, njegova aminokislinska sestava in disulfidne vezi (Savage in Morrison, 2003)....4 Slika 4: GRAS protein in označeno mesto spremembe (prirejeno po Hedden, 2003)....7 Slika 5: Biosintezna pot karotenoidov (Ma in sod., 2017)....9 Slika 6: Genska karta QTL-ov povezanih z obliko paradižnika (prirejeno po Jose Gonzalo in Van der Knaap, 2008).... 12 Slika 7: Struktura sun lokusa v LA1589 in Sun1642 (Xiao in sod., 2008).... 14 VI

1 UVOD Deoksiribonukleinska kislina (DNA) je kemijsko ime za molekulo, ki nosi genski zapis v vseh živih organizmih. Sestavljena je iz štirih osnovnih gradnikov nukleotidov, ki so sestavljeni iz deoksiriboze, fosfatne skupine in nukleinske baze. Nukleotidi se razlikujejo med seboj po dušikovi bazi, ki jo vsebujejo. Te so štiri: adenin, gvanin, citozin in timin. Nukleotidi se povezujejo v verigo preko fosfodiesterske vezi med fosfatno skupino in sladkorjem. DNA pa je največkrat v obliki dvojne vijačnice, ki nastane s povezovanjem z vodikovimi vezmi med komplementarnimi nukleotidi dveh verig nukleotidov (NHGRI, s. a.). DNA kodira zapise za izgradnjo beljakovin, vendar ta ne poteka direktno, ampak posredno preko molekul RNA (ribonukleinska kislina). DNA se namreč pri evkariontih vedno nahaja v jedru celice, izgradnja proteinov pa poteka v citosolu. Na DNA se pripne encim RNApolimeraza, ki začne prepisovanje iz DNA v mrna (informacijska RNA). Ta se nato prenese v citoplazmo, kjer se pripne na ribosom, ki bere mrna molekulo in na podlagi tega se na mrna molekulo vežejo trna (prenašalna RNA), ki s seboj nosijo aminokisline, ki se ob vezavi trna povezujejo zaporedno med seboj in tvorijo peptidno verigo, ki se nato zvije v določeno tridimenzionalno obliko, kar predstavlja končno funkcionalno beljakovino (Clancy in Brown, 2008) Beljakovine v organizmu opravljajo različne funkcije, kot so transportna, strukturna in katalitična. V tem diplomskem delu, bom govoril predvsem o proteinih, ki opravljajo katalitično funkcijo, torej o encimih. Vidimo lahko, da je veliko lastnosti rastlin oziroma nekega organizma posledica genetskega zapisa. Geni so osnovni elementi sistema za dedovanje informacij. Ko govorimo o enem genu, vendar različnih oblikah tega gena, govorimo o alelih. Teh je v neki populaciji osebkov lahko večje število, torej poznamo več oblik nekega gena (Griffiths in sod., 2008). Gregor Mendel, znan kot utemeljitelj sodobne genetike, je leta 1865 naredil prvo analizo dedovanja enega gena. Za modelno rastlino je uporabljal grah. Opazoval je sedem lastnosti, za vsako izmed teh lastnosti je pridobil dve čisti liniji, ki sta se v določeni lastnosti razlikovali (slika 1). S križanji je ugotavljal, kako se te lastnosti prenašajo iz staršev na potomce. Mendel ni vedel, kaj je nosilec teh lastnosti, vedel pa je, da se dedujejo. Da je DNA nosilec so ugotovili z nizi eksperimentov v 30-ih in 40-ih letih prejšnjega stoletja, pred tem je veljalo prepričanje, da so beljakovine nosilec dedne informacije (Griffiths in sod., 2008). 1

Slika 1: Lastnosti, ki jih je obravnaval Mendel (prirejeno po Aryal, 2018). Sama prisotnost nekega gena pa še ne pomeni, da se bo ta tudi izražal oziroma da bo njegova prisotnost vidna na organizmu kot neka lastnost. Ko govorimo o diploidnih organizmih to pomeni, da imajo dva seta enakih kromosomov, s čimer tudi dva gena za eno lastnost. V primeru, da ta gena na obeh kromosomih nista v enaki obliki oziroma sta alela različna, govorimo o heterozigotnem organizmu za ta določen gen. V primeru, da je en alel dominanten drug pa recesiven, prisotnost slednjega ne bo vidna v lastnosti, katero kodira ta določen gen. To je tudi vzrok za razmerja med potomci za določeno lastnost, ki jih je s križanji pridobil Mendel. Mendel je na podlagi svojih poskusov napisal tri zakone (Griffiths in sod., 2008): 1. Mendlov zakon zakon o enakosti križancev v F1 generaciji. Če se križata dve čisti liniji, imajo vsi potomci enake lastnosti. 2. Mendlov zakon zakon o razdvajanju znakov v F2 generaciji. S poskusi je ugotovil, da pri križanju F1 generacije med sabo dobi potomce z različnimi lastnostmi. 3. Mendlov zakon zakon o neodvisnem razporejanju alelov. Mendel je prišel do zaključka, da se aleli za različne lastnosti v gamete razporejajo neodvisno drug od drugega. Trdil je, da se lahko alel za neko lastnost pridruži kateremukoli alelu za neko drugo lastnost. 3. Mendlov zakon ne drži popolnoma, saj je možnost naključnega razporejanja alelov odvisna od razdalje med geni na samem kromosomu oz. predpostavlja, da so geni na različnih kromosomih. Povedano z drugimi besedami bližje, kot sta si gena na kromosomu, večja je možnost da bosta skupaj v isti gameti. 2

2 ZANIMIVE LASTNOSTI IZBRANIH POLJŠČIN 2.1 SOJA Z NIŽJO VSEBNOSTJO INHIBITORJEV TRIPSINA IN KIMOTRIPSINA Sojina semena vsebujejo kar 40 % beljakovin v suhi masi. Soja predstavlja v svetu prevladujoč vir beljakovin za živali (približno 67 %), ki je v največji meri uporabljen za prehrano perutnine (50 %) in prašičev (26 %). Soja je izjemno produktivna rastlina in semena soje se uporablja kot popoln vir esencialnih aminokislin, vsebujejo pa tudi številne sestavine, ki hkrati znižujejo njeno hranilno vrednost (Gillman in sod., 2015). Glavne takšne sestavine so inhibitorji kimotripsina in tripsina. Kimotripsin je prebavni encim, ki se sintetizira v trebušni slinavki. Pripada skupini encimov imenovani serinske proteaze, za katere je značilno, da cepijo proteine na manjše polipeptidne molekule, pri katerih ima ključno vlogo serinski ostanek v aktivnem mestu encima. Tako kot kimotripsin je tudi tripsin encim trebušne slinavke, ki pospešuje presnovo beljakovin v manjše molekule. Je prav tako serinska proteaza in tudi deluje enako kot kimotripsin. Glavna inhibitorja sta Bowman-Birk-ovi sojini proteinazni inhibitorji (BBI) in Kunitz-ovi sojini inhibitorji tripsina (KTi). KTi so bili prvi odkriti in identificirani proteinazni inhibitorji v soji. Ločimo več izoform tega proteina. KTi so sestavljeni iz 181 aminokislin, ki so med seboj povezane z dvema disulfidnima vezema, aktivno mesto pa se nahaja med aminokislinskima ostankoma 63 in 64 (slika 2). KTi delujejo kot kompetitivni inhibitorji, in sicer tako, da se vežejo na aktivno stran tripsina, podobno kot to naredi substrat, in povzročijo hidrolizo peptidne vezi v aktivnem mestu encima. Inhibitorji tripsina se od substrata razlikujejo tako, da sta aminokislinska ostanka v aktivnem mestu povezana z disulfidno vezjo. Po hidrolizi se modificiran inhibitor obdrži v isti konformaciji zaradi disulfidne vezi, kar tvori stabilen kompleks encim-inhibitor. Drugi izolirani in karakterizirani proteinazni inhibitor je BBI, ki je dvoglavi inhibitor z neodvisnima vezavnima mestoma za kimotripsin in tripsin (slika 3). Vsebuje kar 7 disulfidnih vezi, saj kar 20 % inhibitorja predstavlja aminokislina cistein. BBI je bolj temperaturno obstojen kot KTi. BBI proteini so skupina serinskih proteaznih inhibitorjev, ki se povežejo z encimom tako, da ga inhibirajo preko na površini izpostavljene zanke v ustrezni konformaciji. To vodi v nastanek nekovalentno povezanega kompleksa, ki inhibira encim (Savage in Morrison, 2003; McBride in sod., 2002). 3

Slika 2: KTi protein, njegova aminokislinska sestava in disulfidne vezi (Savage in Morrison, 2003). Slika 3: BBI protein, njegova aminokislinska sestava in disulfidne vezi (Savage in Morrison, 2003). Obe skupini proteinov, KTi in BBI, lahko ireverzibilno inaktiviramo s toploto, BBI proteini pa so na to bolj odporni (DiPietro in Liener, 1989). Zato je soja pred uporabo termično obdelana. Ta postopek pa sicer zmanjša kvaliteto proteinov in prebavljivost semena, postopek pa je hkrati tudi drag in energetsko potraten. Zato je trajen cilj pridelave soje razvoj visoko donosnih linij, ki bi zahtevale manj termične obdelave ali pa le-te sploh ne bi potrebovale (Gillman in sod., 2015). Jofuku in sodelavci (1989) so v raziskavi iskali genetske mutacije KTi v soji (Glycine max), ki preprečujejo akumulacijo Kunitz tripsin inhibitorja v semenu med razvojem le tega. Sekvencirali so gen pri KTi+ (linije, ki so vsebovale KTi) in KTi- (linije, ki niso vsebovale KTi) in ugotovili, da se med seboj razlikujeta le v treh nukleotidih kodirajoče regije. Rezultati njihove raziskave so pokazali, da mutacija gena za Kunitz tripsin inhibitorje vsebuje eno zamenjavo baznih parov in delecijo dveh baznih parov, kar je povzročilo premik bralnega okvirja. KTi- fenotip se deduje kot preprosta recesivna lastnost. Ugotovili so, da je transkripcija 4

KTi v embriju podobna med KTi+ in KTi-, kar pomeni, da je zmanjšanje količine KTi posledica aktivnosti, ki se zgodi/-jo po prepisu v mrna. Te bi lahko bile na primer spremenjena učinkovitost transporta iz jedra, kjer nastaja mrna, zmanjšana stabilnost KTi- mrna v citoplazmi in še druge. KTi se akumulira med razvojem semena, prisoten je v embrionalni osi in kotiledonih (kličnih listih), KTi mrna pa je manj prisotna v odraslih rastlinah, kar pomeni, da se gen izraža v glavnem v semenu. Genom soje vsebuje približno 10 genov, ki so komplementarni genu Kunitz tripsin inhibitorja. Več teh DNA nukleotidnih zaporedij (Kti1, Kti2 in Kti3) predstavlja funkcionalne gene, ki so izraženi specifično glede na razvojni stadij rastline. Kti3 ima višjo raven transkripcije v primerjavi z Kti1 in Kti2 genoma. Zaradi tega je težko dobiti recesivne mutante za vseh 10 genov. Pri vrsti Glycine microphylla so ugotovili pomanjkanje BBI proteinov v zrelih semenih, kar je posledica mutacije, ki je povzročila premik bralnega okvirja (Krishnan in Kim, 2003). Pojavi se na enem BBI genu, posledica tega pa je izguba funkcije proteina. Razvoj linije Glycine max z zmanjšano vsebnostjo BBI iz Glycine microphylla zaenkrat ni bila uspešna, saj obstajajo pomembne hibridizacijske ovire med tema dvema vrstama. Pomembne variacije v vsebnosti BBI so bile ugotovljene v Glycine max, vendar ni bilo najdene nobene sorte, ki bi imela popolno oziroma stalno zmanjšano vsebnost BBI v semenih. To je verjetno zopet posledica prisotnosti več BBI genov, ki so izraženi v semenu (Deshimaru in sod., 2004; de Almeida Barros in sod., 2012) in vpliva okolja na akumulacijo BBI proteinov (Krishnan in sod., 2012). Gillman in sodelavci (2015) so iskali linije soje (Glycine max) z zmanjšano vsebnostjo KTi in med obravnavanimi linijami je imela ena linija nižji nivo KTi proteina (PI 68679). Pri tej liniji so nato iskali gensko ozadje za nižji nivo KTi proteinov in našli so tri izooblike (KTi1, KTi2 in KTi3). KTi1 in KTi2 sta bila močno povezana in močno podobna (>90 %). Raziskava KTi1 je razkrila, da je prišlo do delecije enega samega nukleotida (GGG356 358GG), kar pomeni zamik bralnega okvirja. Skladno s prej imenovanim KTi3 alelom, so ta novi mutiran alel poimenovali KTi1. Z uporabo tradicionalnih hibridizacijskih metod so križali linijo, ki nosi KTi1 mutacijo (PI 68679) z linijo, ki nosi KTi3 mutacijo (PI 542044). Poskušali so razviti rutinski molekulski marker za novo KTi1 mutacijo ampak so bili neuspešni. PCR in določanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje) je pokazalo, da so vse linije, ki imajo nizke vrednosti KTi1 in KTi3 proteinov, homozigoti za obe KTi1 in KTi3 mutaciji in ta lastnost se je kazala v F1 in F2 generaciji. Semena linij homozigotov za KTi1- in KTi3- mutante (linija E16) imajo zmanjšan katerikoli KTi protein. Za BBI proteine pa je veljalo, da so bili akumulirani v veliko višjih količinah v zrelih semenih, ki so imela eno ali obe KTi mutaciji, glede na linijo Williams 82, ki nosi divji tip KTi genov. Do podobnih ugotovitev so prišli tudi v predhodnih študijah. V semenih linije Williams 82 so identificirali KTi1, KTi2 in KTi3 proteine, od katerih je bil v najvišji koncentraciji prisoten KTi3. KTi1- mutant je akumuliral veliko KTi3 proteina, pri KTi3- mutantih pa tega proteina seveda ni bilo moč zaznati. Pri homozigotnem dvojnem mutantu (linija E16) ni bilo moč zaznati KTi proteinov. Čeprav so bili v sojinem genomu prisotni vsaj štirje KTi geni, je kombinacija teh dveh mutacij (KTi1- in KTi3-) privedla do odsotnosti oziroma nezaznavnosti KTi proteinov. Genotip E16 je imel le 50 % tripsin 5

inhibitorno aktivnost, glede na Williams 82. Kljub popolni odsotnosti KTi proteinov v genutipu E16, celotno zmanjšanje aktivnosti inhibitorjev tripsina ni bilo značilno različno kot pri KTi3- mutantih. Predvideli so, da je to posledica kompenzacije z mutacijo, ki povzroča prekomerno sintezo BBI proteinov v liniji E16. Aktivnost inhibitorjev kimotripsina je bila nižja v vseh genotipih, ki so imeli KTi1- ali KTi3- mutacijo (Gillman in sod., 2015). Opravljena je bila analiza za KTi3 in BBI med genotipi. Izražanje KTi3 gena je bilo podobno med Williams 82 in KTi1- genotipoma in med KTi3- in KTi1/3- genotipoma. Izražanje BBI gena je bilo v zgodnji fazi razvoja semena višje v KTi1- in KTi1/3- v primerjavi z Williams 82, medtem ko ni bilo značilne razlike med KTi3- in Williams 82. V pozni fazi razvoja semena ni bilo značilne razlike med obravnavanimi genotipi (KTi1-, KTi1/3-, KTi3- in Williams 82). V sojinih semenih obstaja vsaj 10 BBI izoform, za katere je bilo ugotovljeno, da imajo različne specifične inhibitorne aktivnosti za tripsin, kimotripsin in elastazo (Bösterling in Quast, 1981; Tan-Wilson in sod., 1987). Razmerja teh izoforem variirajo med kultivarji (Tan-Wilson in sod., 1986). V študiji niso zaznali spremembe v količini mrna za BBI v semenih KTi3- mutantov, kar kaže, da povečanje BBI proteinov ni posledica povečane transkripcije in/ali izboljšane mrna stabilnosti v KTi3- linijah. V nasprotju so zaznali znatno višjo stopnjo BBI transkriptov v KTi1- linijah. Ti rezultati nakazujejo, da se razvijajoča semena odzivajo na KTi- okvare, da bi ohranile homeostazo proteinov, na dva načina, prvi je s povečanjem BBI mrna, kot je to v KTi1-, drug način, ki je prisoten pri KTi3- mutantih, je proteomsko rebalansiranje. Mehanizmi teh dveh načinov še niso popolnoma znani. Ugotovili so, da povečana akumulacija BBI proteinov ne vodi v povečano inhibitorno aktivnost kimotripsina. Izgube KTi1 in KTi3 se bi torej lahko kazale v zmanjšani aktivnosti inhibitorjev kimotripsina (Gillman in sod., 2015). Če bi lahko dosegli dovolj močno zmanjšanje količine inhibitorjev tripsina in kimotripsina, kar bi bilo verjetno možno z KTi1- in KTi3- mutanti, bi bilo mogoče za krmo izkoristiti surove sojine derivate, brez pojava zapletov s trebušno slinavko in slabšega prirasta živine (Gillman in sod., 2015). 2.2 NIŽJA RAST PŠENICE Populacija ljudi na Zemlji že nekaj časa eksponentno narašča, pridelovalne površine pa so konstantne, v nekaterih delih sveta pa celo padajo, kar vodi do zaključka, da se mora pridelava hrane povečati. Zadnje večje napredeke v produktivnosti je prinesla zelena revolucija (tretja kmetijska revolucija), ki se je začela okrog leta 1950 in je potekala do konca 60-ih let prejšnjega stoletja. Napredek v pridelavi žit v tem obdobju je bil predvsem skupek tehnologij pridelave in vpeljave novih sort. Ena pomembnejših lastnosti za doseganje višjih pridelkov pri pšenici je bila nižja rast te kulture, saj je tako pridobila na nosilnosti, kar je omogočilo vpeljavo visoko produktivnih sort pšenice (Hedden, 2003). Pšenica je svetovno gledano ena izmed glavnih poljščin namenjenih za prehrano ljudi. Leta 2018 je svet pridelal 0,734 milijarde ton pšenice, kar je približno četrtina (24,8 %) pridelanih žit (preračunano po podatkih FAO, 2020). 6

Pšenica je heksaploid, ki ima tri sete kromosomov A, B in D, ki so jih prispevali trije divji predniki. Za nizko rast pšenice sta v glavnem odgovorna gena Rht-B1 (Rht1) in Rht-D1 (Rht2), manjši vpliv na to lastnost imajo še geni Rht8, Ppd-B1 in Ppd-D1 (Würschum in sod., 2015). Raziskave Rht1 in Rht2 so pokazale, da sta povezana s produkcijo hormona giberelina (GA) (Gale in sod., 1985). Rht gen je odkril Peng s sodelavci (1999) in izkazalo se je, da je ortolog gena GAI iz repnjakovca (Arabidopsis thaliana) in gena dwarf8 (d8) iz koruze, za slednjega je bila prav tako najdena mutacija, ki vodi v pritlikavo rast koruze. Rht-1a/d8/GAI so oblike divjih tipov proteinov, ki tvorijo skupino proteinov, poznanih pod imenom GRAS, ki delujejo kot regulatorji transkripcije. Člani skupine GRAS vsebujejo dve ohranjeni domeni, ena je 27 aminokislin dolg motiv, ki se imenuje DELLA, druga pa TVHYNP (slika 4). Peng in sodelavci (1999) so identificirali tudi osnovne zamenjave v Rht1 in Rht2 pritlikavih alelih, ki predstavljajo stop kodone znotraj regije DELLA. Njihova ideja je bila, da ponoven začetek translacije, na enem izmed metioninov, ki sledijo stop kodonu, vodi v tvorbo krajših Rht proteinov, ki ne vsebujejo DELLA domene in da ti proteini delujejo kot stalno prisoten represor rasti, ki pa je neobčutljiv na GA. Izkazalo se je da je njihova ideja napačna, na N-koncu proteina je namreč regija na katero se veže GID1-GA povezovalna domena (Pearce in sod., 2011). Rht geni pa naredijo na tem mestu drugačen protein, zato se nanj ne more vezati GID1-GA, kar prepreči degradacijo s strani GA in tako delujejo kot stalni zaviralci rasti in razvoja odvisnega od GA (Thomas, 2017). Thomas in sodelavci (2016) so odkrili, da so osrednji regulatorji GA signalne poti DELLA proteini, ki se nahajajo v jedru in delujejo preko zmanjševanja od GA odvisne rasti, preko fizične povezanosti s transkripcijskimi faktorji in drugimi komponentami. D8 in gai mutacije so prav tako vodile v delecijo DELLA in/ali TVHYNP regije (Peng in sod., 1997; 1999). Divji tipi proteinov Rht-a1/d8/GAI delujejo kot negativni regulatorji GA signalizacije, vendar GA zavira njihovo funkcijo pod pogojem, da je prisotna DELLA domena (Dill in sod., 2001; Harberd in sod., 1998). V podporo tej ideji je ektopično izražanje gai gena v rižu induciralo nizko rast (Peng in sod., 1999) in mutacija, ki je povzročila izgubo funkcije Rht podobnim genom v rižu, je povzročila visoke fenotipe (Ikeda in sod., 2001; Chandler in sod., 2002). Slika 4: GRAS protein in označeno mesto spremembe (prirejeno po Hedden, 2003). V rižu je bil najden ortolog gena Rht-1a znan kot OsGAI ali SLR1, v ječmenu pa SLN1. Žita vsebujejo enega izmed genov Rht-1A/d8/GAI, medtem ko Arabidopsis zraven GAI kodira še 7

RGA sorodne proteine in tri RGA podobne proteine (RGL1, RGL2 in RGL3). Ni popolnoma jasno kako je lahko en protein v žitih funkcionalno enak petim v Arabidopsis. Ta razlika bi lahko bila posledica funkcionalne odvečnosti teh proteinov v Arabidopsis ali pa posledica razlike v signalnih poteh GA med žiti in repnjakovcem (Hedden, 2003). 3 ZANIMIVE LASTNOSTI IZBRANIH ZELENJADNIC 3.1 BARVA KORENJA Korenje (Daucus carota L.), ena najbolj priljubljenih korenovk, se goji splošno po celem svetu in je bogato z mnogimi bioaktivnimi pigmenti, kot so lutein, α-karoten in β-karoten (Ma in sod., 2017) in antocianidini. Korenje izvira iz Afganistana in je bilo odkrito nekje v 9. stoletju. V zgodnjem 16. stoletju se je korenje v beli in oranžni barvi pojavilo v zahodni Evropi (Banga, 1963) in skoraj simultano se je v Aziji pojavilo rdeče korenje (Laufer, 1919; Shinohara, 1984). Karotenski pigmenti so lahko rdeči, rumeni ali oranžni, v rastlinah pa ti pigmenti opravljajo predvsem varovalno funkcijo z razprševanjem odvečne svetlobne energije, ki jo absorbira fotosintezni mehanizem (Just in sod., 2007). So tudi prekurzorji hormona strigolaktona in abscizinske kisline (ABA). V človeški prehrani so karotenoidi pomembni, saj se nekateri (βkaroten, α-karoten, kriptoksantin) s cepljenjem pretvorijo v vitamin A. Nekateri drugi karotenoidi (likopen, lutein in zeaksantin) delujejo kot močni antioksidanti, za katere je bilo ugotovljeno, da zmanjšujejo verjetnost nastanka nekaterih vrst raka, vaskularnih bolezni in poslabšanja vida. Zraven rumenih, oranžnih in belih sort korenja poznamo tudi vijolične (znane tudi kot črne) sorte, pri katerih so glavna barvila antociani. Antociani so podskupina flavonoidov, ki imajo širok spekter barv in se nahajajo v različnih organih višjih rastlin (Yildiz in sod., 2013). Antociani privabljajo opraševalce in živali za raznašanje semena, delujejo antioksidativno, varujejo rastline pred UV sevanjem in močno intenzivno svetlobo, pred nizkimi temperaturami, vodnim stresom, pred poškodbami in delujejo proti fitopatogenom (McClure, 1975; Mo in sod., 1992; Koes in sod., 1993; Li in sod., 1993; Holton in Cornish, 1995; Dixon in Palva, 1995; Shirley, 1996; Chalker-Scott, 1999). 3.1.1 Biosinteza karotenoidov Biosinteza karotenoidov (slika 5) poteka v plastidih in se začne z združitvijo izopentenildifosfata (IPP) in dimetilalil difosfata (DMADP), to reakcijo katalizira geranil-geranil-difosfat sintaza (GGPS) in nastane geranilgeranil difosfat (GGPP). Fitoen sintaza (PSY) nato združi dve molekuli GGPP in nastane fitoen. Fitoen opravi štiri zaporedne reakcije, ki vključujejo štiri encime, prva dva fitoen desaturaza (PDS) in zeta-karoten desaturaza (ZDS) katalizirata tvorbo poli-cis komponent in te so nato izomerizirane v trans obliko s strani zeta-karoten izomeraze (ZISO) in karotenoid izomeraze (CRTISO). Po teh štirih reakcijah iz fitoena nastane likopen. Od likopena naprej se biosintezna pot loči v dve veji. Ena veja vključuje v naslednjem koraku 8

le encim likopen β-ciklazo (LCYB), ki katalizira tvorbo β-cikličnih struktur na obeh straneh likopena in tako nastane β-karoten (oranžne barve), iz katerega se lahko z nadaljnjimi reakcijami tvori najprej zeaksantin in nato violaksantin. Druga veja pa vključuje v prvem koraku dva encima, prvi je LCYB, drugi pa likopen ε-ciklaza in tako nastane molekula, ki ima na eni strani β-ciklično strukturo, na drugi ε-ciklično strukturo, molekula ki nastane je α- karoten. Iz α-karotena lahko s pomočjo določenih encimov nastane lutein, ki je rumene barve (Hannoufa in Hossain, 2012; Ma in sod., 2017; Just in sod., 2007). Biosinteza karotenoidov ni edino kar vpliva na količino le teh v tkivu. Nivoji transkripcije, ki so opisani v naslednjem podpoglavju, ne morejo vedno pojasniti količine karotenoidov, saj prihaja tudi do degradacije karotenoidov. Količina karotenoidov skozi razvoj korena pri korenju ni enaka, ampak narašča z razvojem, prav tako ni enaka barva floema in ksilema, kar je posledica neenakomerne porazdelitve karotenoidov. Slika 5: Biosintezna pot karotenoidov (Ma in sod., 2017). 3.1.2 Genetska osnova biosinteze karotenoidov V študiji, ki so jo opravili Ma in sodelavci (2017), so uporabili šest kultivarjev korenja, od tega so bili trije oranžni, dva rumena in en bel kultivar. Analizirali so gene odgovorne za nastanek karotenoidov in analizirali so njihove transkripcijske nivoje, ti imajo namreč pomembno vlogo pri barvni variabilnosti med sortami korenja. Geni DcIPI, DcGGPS, DcPSY2, DcPSY3 in 9

DcZDS1 so pozitivno uravnavani in so bili enakomerno izraženi med vsemi obarvanimi kultivarji. Pri negativno reguliranih genih je več genov pokazalo močno variabilnost med kultivarji različnih barv, na primer DcCHXB4, DcCYP97A3 in DcCHXE so imeli nizko izražanje v oranžnih kultivarjih, med tem ko je bilo njihovo izražanje močno v rumenih kultivarjih. DcCHXB1 in DcCHXB2 kodirata hidroksilazo tipa»non-heme«(bch tip) in sta pokazala inverzno izražanje med rumenimi in oranžnimi kultivarji. Ti rezultati so pokazali, da transkripcijska regulacija genov za karoten hidroksilaze narekuje formiranje luteina v rumenem korenju. DcVDE je gen, ki je bil stabilno izražen v vseh obravnavanih kultivarjih. Posledica razlik v izražanju genov je privedla do drugače delujočih biosinteznih poti in posledično do različnih barv korenja. Stopnja transkripcije vedno ne more razložiti prisotnosti ali odsotnosti karotenoidov, prisotni so namreč lahko encimi, ki razgradijo karotenoide. Nisar in sodelavci (2015) so v študiji odkrili, da so karotenoid cepitvene dioksigenaze (CCD) glavni faktor degradacije karotenoidov. V študiji, ki so jo izvedli Ma in sodelavci (2017), so pri vseh obravnavanih kultivarjih zaznali ekspresijo DcCCD8 in DcCCD4. Slednji je bil identificiran kot glavni razlog za nastanek večino oblikovanih apokarotenoidov (Lätari in sod., 2015). Rezultati so pokazali, da v belem korenju karotenoidi razpadejo oziroma so preusmerjeni v sintezo apokarotenoidov ali drugih karotenoidnih cepljenih derivatov (Ma in sod., 2017). 3.1.3 Biosinteza antocianov Kot je bilo že zgoraj omenjeno obstajajo tudi vijolični kultivarji korenja, katerih glavna barvila so antociani. Dve skupini genov sta vključeni v biosintezo antocianinov, strukturni geni, ki kodirajo encime, ki so direktno vključeni v formiranje antocianinov in drugih flavanoidov in druga skupina so regulatorni geni, ki kontrolirajo prepisovanje strukturnih genov. Biosinteza antocianinov je bila najbolj doštudirana v cvetovih, sadju, listih in le nekaj študij je bilo narejenih na temo podzemnih organov (Jung in sod., 2005; Lalusin in sod., 2006; Lu in Yang 2006; Mano in sod., 2007). Zelo malo je znanenga o kontroliranju antocianinskih genov v koreninah. Korenje je ena izmed vrst, ki akumulira velike količine antocianinov v korenu. Medtem, ko so bili cianidni derivati odgovorni za vijolično ali črno barvo korenin karakterizirani s strani Harborna (1976), in en gen, ki kontrolira akumulacijo antocianinov je bil opisan (Simon, 1996), ni več drugih študij na temo biosinteze flavonoidov v korenju, ki bi se ukvarjale z izražanjem genov, ki so pomembni za flavanoidno biosintezno pot (Yildiz in sod., 2013). Flavonoidna biosintezna pot (slika 6) se začne z združitvijo treh molekul malonil-co-a in 4- kumaroil-coa in s tem nastane molekula naringenin halkona, kar katalizira encim halkon sintaza (CHS). V sledeči reakciji, ki jo vodi encim halkon flavanon izomeraza, je naringenin halkon izomeriziran v naringenin, nato flavanon-3-hidroksilaza (F3H) vnese hidroksilno skupino in dobimo dihidrokaempferol. Tukaj se biosintezna pot loči na cianidine in delfinidine, v obeh vejah delujejo enaki encimi, v cianidinski veji so produkti cianidin-3-galaktozid in peonidin-3-glukozid, v delfinidinski veji pa sta to petunidin-3-glukozid in malvidin-3-glukozid. 10

Yildiza in sodelavci (2013) so v študiji ugotovili, da je v glavnem prisoten cianidin-3- galaktozid, ki nastane iz dihidrokvercetina v štirih reakcijah, ki jih vodijo encimi dihidroksiflavanol-4-reduktaza (DFR), antocianin sintaza (LDOX), flavanoid-oglikozitransferaza (UFGT) in metiltransferaza (MT). 3.1.4 Genetska osnova biosinteze antocianov Yildiz in sodelavci (2013) so v študiji ovrednotili izražanje šestih genov, ki so pomembni za biosintezo antocianov in so vključeni v začetni, osrednji in končni del poti v vijoličnem ter oranžnem korenju. Odkrili so, da je transkripcija genov PAL3, CHS1, F3H, DFR1 in LDOX2 v vijoličnem korenju višja kot pri vijolično oranžnem (ksilem je oranžen, floem vijoličen), v oranžnem korenju so bili zelo nizko izraženi ali so bili pod mejo detekcije. Stopnja izražanja je bila v glavnem opazna tudi vizualno in koncentracija antocianinov med razvojem korenov je bila takšna kot jo običajno opazimo v študijah o kopičenju antocianinov v plodovih, cvetovih, listih različnih rastlinskih vrst in pri gomoljih sladkega krompirja (Mano in sod., 2007), kar kaže na podoben postopek v vseh rastlinskih tkivih. Ugotovljeno je bilo, da je ekspresija gena UFGT relativno nespremenljiva glede na barvo korena in fazo razvoja, vendar glede na zapletenost biosinteze antocianov, ne preseneča, da je pri drugih rastlinskih vrstah povezana količina antocianov z izraženostjo gena UFGT (Yildiz in sod., 2013). Na primer mutacija UFGT v grozdju je povzročila obarvanje (Kobayashi in sod., 2001) in enako tudi bz1, ki je mutacija UFGT gena pri koruzi (Sharma in sod., 2011), torej ne bi preveč presenetilo, če bi tudi pri korenju našli kultivarje, katerih kopičenje antocianov bi bilo pogojeno z izražanjem UFGT gena. Pet od šestih obravnavanih genov biosintezne poti antocianov, je bilo močneje izraženih v vijoličnem (P1P1) korenju, kot v oranžnem (p1p1), kar kaže, da je P1 (na kromosomu 3) verjetno transkripcijski faktor, ki regulira izražanje več antocian strukturnih genov in tako vpliva na pigmente v korenju. Analize antocianskih genov v drugih rastlinskih vrstah so pokazale pozicijsko vezanost F3H genov z antocianskim kontrolnim lokusom (Yildiz in sod., 2013). 3.2 IZDOLŽENA OBLIKA PARADIŽNIKA Paradižnik je zelenjadnica, pri kateri uživamo mesnate plodove, ki pa lahko po obliki precej variirajo med kultivarji. Paradižnik so domesticirali ameriški staroselci, predvideva pa se, da se je to zgodilo na območju današnje Mehike. Že pred prihodom Evropejcev so poznali veliko različnih tipov (Jenksin, 1948; Rick, 1995). Ker se je domestikacija začela že v prazgodovini, nihče ne pozna dejanske evolucijske poti s katero so nastale divje vrste z različnimi velikostmi in oblikami plodov. Tanksley (2004) meni, da je precej verjetno, da smo ljudje izbrali mutante z večjimi plodovi in postopoma odbirali velikoplodne mutante, kar je privedlo do današnjih kultivarjev. Za razliko od udomačenih sort paradižnika, kjer imamo široko paleto oblik plodov, se pri divjih tipih in divjih sorodnikih pojavlja predvsem sferična oblika (Gonzalo in Van der Knaap, 2008). 11

V 20. stoletju se je z razvojem genetike pričela tudi identifikacija osnovnih genov, odgovornih za obliko plodov pri paradižniku. Ugotovili so, da je oblika plodov pri paradižniku kvantitativna lastnost, izdolženo obliko pa so pripisali v glavnem dvema lokusoma, označenima kot sun in ovate. V študiji sta Gonzalo in Van der Knaap (2008), sta izbrala tri udomačene sorte paradižnika z izdolženimi plodovi, ki pa so bili morfološko različni in jih križala z divjim okrogloplodnim sorodnikom z namenom, da bi določila gene odgovorne za izdolženo obliko plodov. Uporabljene sorte so bile 'Howard German' (HG), 'Sausage' (SA) in 'Rio Grande' (RG). Te so bile skrižane z divjim sorodnikom Solanum pimpinellifolium LA1589, tako so se lokusi naključno pojavljali v potomcih in so lahko s pomočjo statističnih analiz ugotovili njihov vpliv na določene morfološke lastnosti plodov. V študiji so sicer obravnavali štirinajst morfoloških lastnosti plodov, vendar se bom v tem delu osredotočil le na indeks oblike plodov, ki je definiran kot razmerje med dolžino in širino plodov, torej bolj kot je izdolžen plod, višji je indeks oblike plodov. QTL-i zaznani v eni populaciji QTL-i zaznani v dveh populacijah QTL-i zaznani v treh populacijah SA specifične regije HG specifične regije RG sepecifične regije Skupne regije za obliko plodov Slika 6: Genska karta QTL-ov povezanih z obliko paradižnika (prirejeno po Gonzalo in Van der Knaap, 2008). Plodovi pri sorti HG so bili najbolj izdolženi, nekoliko manjši indeks oblike plodov je bil pri SA sorti in najmanjši pri sorti RG, če zraven ne prištevamo LA1589, ki ima okroglo obliko plodov in je torej indeks približno enak 1. V populacijah, ki so jih dobili s križanjem, so poiskali lokuse odgovorne za morfologijo plodov. Našli so tri glavne lokuse odgovorne za vrednost 12

indeksa oblike plodov, ki so se v populacijah pojavljali različno. V populaciji HG x LA1589 je bila izdolženost plodov močno povezana z lokusom sun, ki se nahaja na kromosomu 7 in z lokusom fs8.1 na kromosomu 8. Medtem ko je bila ta lastnost v populaciji SA x LA1589 kontrolirana s strani lokusa ovate, ki se nahaja na kromosomu 2 in kot pri predhodni populaciji, so tudi v tej našli povezavo med izdolženostjo plodov in lokusom fs8.1 na kromosomu 8. Za lokus fs8.1 Gonzalo in Van der Knaap (2008) navajata, da ima nekje 20 % vpliva na indeks oblike plodov v primerjavi z lokusom sun. V populaciji RG x LA1589 niso našli niti lokusa sun niti lokusa ovate, ampak sta njuno vlogo pri tej populaciji prevzela lokusa fs8.1, ki je lociran na kromosomu 8 in fw2.2, ki je lociran na kromosomu 2. Slednji je imel manj močan vpliv na indeks oblike plodov. Pri tej populaciji nista našla nobenega od pomembnih QTL-ov, ki bi imeli močan vpliv na obliko plodov, kot sta to bila sun in ovate, pri prejšnjih dveh populacijah. V študiji so ugotovili tudi, da sun lokus pri sorti 'Howard German' ne vpliva le na izdolženost plodov, ampak še na mnoge druge morfološke lastnosti plodov paradižnika. Precej podobno je bilo ugotovljeno za ovate lokus pri sorti 'Sausage', kar kaže na močno dominanco teh dveh lokusov nad drugimi. Pri sorti 'Rio Grande' so ugotovili, da na morfologijo plodov vpliva več lokusov kot pri prej omenjenih sortah. 'Rio Grande' torej ne nosi ekstremno efektivnih lokusov za obliko plodov kot sta sun in ovate (Gonzalo in Van der Knaap, 2008). Našli so nekaj QTL-ov, ki so bili prisotni v vseh treh populacijah in so imeli vpliv na morfologijo plodov. Nahajali so se na koncu kromosoma 2, 8 in 11. Te regije so znane kot nekakšna 'pristanišča' za QTL-e, ki vplivajo na morfologijo plodov. Fw2.2 kontrolira maso plodov, medtem ko lokus f kontrolira število 'prekatov' v plodu (Frary in sod., 2008; Barrero in sod., 2006). Xiao in sodelavci (2008) so se podali v podrobnejšo obravnavo lokusa sun z namenom, da bi v njem odkrili ključni gen za morfologijo plodu. Kot je bilo že ugotovljeno, se sun nahaja na kromosomu 7, ki vključuje v manjšem obsegu (ang. small-scale) insercije, delecije in duplikacije. Eden izmed insertov bi naj bil velik približno 30 kb, ki ni prisoten v LA1589 (isti divji sorodnik je bil uporabljen v prej obravnavani študiji), je pa prisoten v variateti Sun1642 in je povezan z obliko plodov. Kasneje so določili natančnejšo dolžino inserta, ki znaša 24,7 kb in ima močan vpliv na fenotip. Southern blot analiza je pokazala, da LA1589 vsebuje eno kopijo tega lokusa, medtem ko ima Sun1642 dve kopiji (slika 7). Predvideva se, da je insertni segment na kromosomu 7 v Sun1642 izvorno iz kromosoma 10. Analiza 24,7 kb dolgega duplikata je pokazala, da je bil IQD12 preurejen glede na druga nukleotidna zaporedja v 24,7 kb segmentu. Še več, edina nukleotidna sprememba med kopijama je 3 bp dolgo neujemanje na koncu preureditve, kar kaže na izvor duplikacije. Podrobnejši pregled lokusa je pokazal, da je bil retrotranspozon, ki so ga imenovali»rider«, prisoten na obeh lokusih (kromosom 10 in 7). Retrotranspozon Rider je spominjal na dolge končne ponovitve (LTR) retrotranspozona, saj je imel na straneh 398 bp dolga LTR-ja (na sliki 7 označena z rdečo in številkama 1 in 2) in 5 bp dolge ciljne stranske podvojitve (ang. TSD-target site duplication) nukleotidna zaporedja GACCT. Podobno je imela regija na kromosomu 7 identičen Rider del med dvema LTR-oma (LTR1 in LTR2), naknadni (LTR3) je bil identificiran dlje navzdol od Rider-ja na kromosomu 13

7, ki (skupaj z LTR1) omejuje celoten podvojeni fragment. Na straneh sta domnevni vstavitvi, takoj za LTR1 in LTR3, 5 bp dolga ATATT motiva, ki spominjata na TSD dogodek transpozona. Sekvenciranje LA1589 je podprlo predvidevanje, da je prišlo do integracije segmenta pri tem 5 bp dolgem motivu. Ti podatki so zraven analize polipurinskih regij (angl. poly purine tracts - PPT) nakazali, da je celoten 24,7 kb dolg fragment prestavljen prek Riderja iz kromosoma 10 na kromosom 7 kot en velik retrotranspozon (Xiao in sod., 2008). Slika 7: Struktura sun lokusa v LA1589 in Sun1642 (Xiao in sod., 2008). Ker je izdolžena oblika plodov sovpadala s prenešenim segmentom, so predvideli, da je to posledica genov na lokusu sun ali pa motnja gena, ki bi bila posledica prenosa. Tako so identificirali pet genov na lokusu: IQDI12, SDL1-like gen (podoben genu v tobaku in navadnem repnjakovcu), dva hipotetična gena HYP1 in HYP2 ter DEFL1 gen. Ugotovili so tudi, da Rider kodira 1307 aminokislin dolg protein, integrazo in reverzno transkriptazo. Z uporabo izogenih linij (ang. near isogenic lines - NIL) so ugotavljali kakšen vpliv ima sun lokus na obliko plodov, če se pojavlja v homozigotnem ali heterozigotnem stanju. Precej višji nivo transkripcije IQD12 je bil opažen v NIL s Sun1642 alelom v primerjavi z NIL z LA1589 alelom. Transkripcijski nivoji gena DEFL1 so pokazali obratno izrazni vzorec glede na IQD12: ko je bil IQD12 izražen, DEFL1 ni bil. Metoda RT-qPCR metoda ni zaznala nobenega DEFL1 prepisa v NIL-ih, ki so imeli kromosomsko duplikacijo, kar kaže na to, da je bila ekspresija DEFL1 ukinjena kot rezultat Rider-ske transpozicije v ta gen. Transkripcijske ravni SDL1-like, HYP1 in HYP2 niso bile spremenjene v NIL-ih ali pa so bile nezaznavne in so jih zato šteli kot manj verjetni kandidati za gen SUN. Ugotovili so, da je fenotip oblike plodov odvisen od efekta doze genov, saj heterozigotni sun NIL-i predstavljajo po obliki plodov vmesno fazo glede na starše LA1589 insun1642. Northern blot analiza je pokazala, da je bil IQD12 v homozigotih za prenešen fragment dvakrat bolj izražen kot v heterozigotih. Enako, vendar v obratni smeri, je veljalo za DEFL1. Z nadaljnjimi raziskavami so dokazali, da povečanje ali zmanjšanje izražanja IQD12 gena povzroča spremembe v obliki plodov in, da je ta gen potreben in zadosten za kontroliranje 14

oblike na lokusu sun. Od tod tudi preimenovanje gena IQD12 v SUN gen. V paradižniku se prekomerno izražanje SUN kaže v ekstremno izdolženih in velikokrat brezsemenskih plodovih, kar spominja na partenokarpne plodove, ki so prav tako izdolženi in špičasti in so rezultat ekspresije biosinteznega gena auksina iaam. To nakazuje na to, da bi SUN lahko vplival na nivo avksina in njegovo distribucijo v plodovih. Obstaja verjetnost, da je SUN vključen v spreminjanje oblike plodov preko regulacije rastlinskih hormonov in/ali ravni sekundarnih metabolitov, ki vplivajo na plodove (Xiao in sod., 2008). 4 ZAKLJUČEK Lastnosti rastlin so odraz okolja in molekulskih osnov rastline. Na okolje lahko vplivamo do neke mere, vendar mora biti za doseganje lastnosti prisotna tudi molekulska osnova. Poznavanje molekulskih osnov nam omogoča natančno razumevanje lastnosti in tudi lažje vnašanje željenih lastnosti v kulturne rastline. Katere so te željene lastnosti je odvisno od sprememb okolja, zahtev pridelovalcev, povpraševanja potrošnika, problemov do katerih prihaja z uporabo določene rastline in še mnogih drugih vplivov. Sodobna genetika je omogočila hitrejše odkrivanje molekulskih osnov in lažje razumevanje nekaterih mehanizmov delovanja le teh. Izboljšala je učinkovitost vnašanja željenih genov v rastline z uporabo tradicionalnega žlahtnjenja in omogočila vnašanje lastnosti s sodobnimi tehnikami, ki ne zahtevajo močne sorodstvene povezanosti med organizmi. To je omogočilo hitrejši razvoj, boljšo energetsko učinkovitost in višje pridelke, ki so pomembni za prehransko varnost. 15

5 VIRI Aryal S., 2018, Mendel s Experiment and Laws, Aryel Sagar. https://microbenotes.com/mendels-experiment-and-laws/ (16. avg. 2020) Banga O. 1963. Origin and distribution of the western cultivated carrot. Genetica Agraria, 17, 357-370 Barrero L. S., Cong B., Wu F., Tanksley S. D. 2006. Developmental characterization of the fasciated locus and mapping of Arabidopsis candidate genes involved in the control of floral meristem size and carpel number in tomato. Genome, 49, 8: 991-1006 Bösterling B., Quast U. 1981. Soybean trypsin inhibitor (Kunitz) is doubleheaded: kinetics of the interaction of α-chymotrypsin with each side. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Enzymology, 657, 1: 58-72 Chalker Scott L., Scott J. D. 2004. Elevated Ultraviolet B Radiation Induces Cross protection to Cold in Leaves of Rhododendron Under Field Conditions. Photochemistry and Photobiology, 79, 2: 199-204 Chandler P. M., Marion-Poll A., Ellis M., Gubler F. 2002. Mutants at the Slender1 locus of barley cv Himalaya. Molecular and physiological characterization. Plant Physiology, 129, 1: 181-190 Clancy S., Brown W. 2008. Translation: DNA to mrna to protein. Nature Education, 1, 1: 101 https://www.nature.com/scitable/topicpage/translation-dna-to-mrna-to-protein-393/ (http://www.fao.org/faostat/en/#data/qc (14. avg. 2020) de Almeida Barros B., Da Silva W. G., Moreira M. A., de Barros E. G. 2012. In silico characterization and expression analysis of the multigene family encoding the Bowman Birk protease inhibitor in soybean. Molecular Biology Reports, 39, 1: 327-334 Deshimaru M., Yoshimi S., Shioi S., Terada S. 2004. Multigene family for Bowman Birk type proteinase inhibitors of wild soja and soybean: The presence of two BBI-A genes and pseudogenes. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 68, 6: 1279-1286 Dill A., Jung H. S., Sun T. P. 2001. The DELLA motif is essential for gibberellin-induced degradation of RGA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98, 24: 14162-14167 DiPietro C. M., Liener I. E. 1989. Heat inactivation of the Kunitz and Bowman-Birk soybean protease inhibitors. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 37, 1: 39-44 Dixon R. A., Paiva N. L. 1995. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. The Plant Cell, 7, 7: 1085-1097 Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 2018. Rim, Food and Agriculture Organization of the United Nations http://www.fao.org/faostat/en/#data/qc (14. avg. 2020) Frary A., Nesbitt T. C., Frary A., Grandillo S., Van Der Knaap E., Cong, B., Tanksley, S. D. 2000. fw2. 2: a quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size. Science, 5476, 289: 85-88 16

Gale M. D., Youssefian S., Russell G. E. 1985. Dwarfing genes in wheat V: Progress in plant breeding 1. Russell G. E. (ur.). Butterworth, Elsevier: 338 str. Gillman J. D., Kim W. S., Krishnan H. B. 2015. Identification of a New Soybean Kunitz Trypsin Inhibitor Mutation and Its Effect on Bowman Birk Protease Inhibitor Content in Soybean Seed. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63, 5: 1352-1359 Gonzalo M. J., Van Der Knaap E. 2008. A comparative analysis into the genetic bases of morphology in tomato varieties exhibiting elongated fruit shape. Theoretical and Applied Genetics, 116, 5: 647-656 Griffiths A. J. F., Wessler S.R., Lewontin R.C., Carroll S.B. 2008 Introduction to Genetic Analysis, 9. izd., New York, W. H. Freeman and Company: 852 str. Hannoufa A., Hossain Z. 2012. Regulation of carotenoid accumulation in plants. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 1, 3: 198-202 Harberd N. P., King K. E., Carol P., Cowling R. J., Peng J., Richards D. E. 1998. Gibberellin: inhibitor of an inhibitor of...?. BioEssays, 20, 12: 1001-1008 Harborne J. B. 1976. A unique pattern of anthocyanins in Daucus carota and other Umbelliferae. Biochemical Systematics and Ecology, 4, 1: 31-35 Hedden P. 2003. The genes of the Green Revolution. Trends in Genetics, 19, 1: 5-9 Holton T. A., Cornish E. C. 1995. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. The Plant Cell, 7, 7: 1071 Ikeda A., Ueguchi-Tanaka M., Sonoda Y., Kitano H., Koshioka M., Futsuhara Y., Yamaguchi J. 2001. slender rice, a constitutive gibberellin response mutant, is caused by a null mutation of the SLR1 gene, an ortholog of the height-regulating gene GAI/RGA/RHT/D8. The Plant Cell, 13, 5: 999-1010 Jenkins J. A. 1948. The origin of the cultivated tomato. Economic Botany, 2,4: 379-392 Jofuku K. D., Schipper R. D., Goldberg R. B. 1989. A frameshift mutation prevents Kunitz trypsin inhibitor mrna accumulation in soybean embryos. The Plant Cell, 4, 1: 427-435 Jung C. S., Griffiths H. M., De Jong D. M., Cheng S., Bodis M., De Jong W. S. 2005. The potato P locus codes for flavonoid 3, 5 -hydroxylase. Theoretical and Applied Genetics, 110, 2: 269-275 Just B. J., Santos C. A. F., Fonseca M. E. N., Boiteux L. S., Oloizia B. B., Simon P. W. 2007. Carotenoid biosynthesis structural genes in carrot (Daucus carota): isolation, sequencecharacterization, single nucleotide polymorphism (SNP) markers and genome mapping. Theoretical and Applied Genetics, 114, 4: 693-704 Kobayashi S., Ishimaru M., Ding C. K., Yakushiji H., Goto N. 2001. Comparison of UDPglucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase (UFGT) gene sequences between white grapes (Vitis vinifera) and their sports with red skin. Plant Science, 160, 3: 543-550 Koes R. E., Quattrocchio F., Mol J. N. 1994. The flavonoid biosynthetic pathway in plants: function and evolution. BioEssays, 16, 2: 123-132 17