UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO LEONIDA KOVAČIČ VPELJAVA METODE DOLOČITVE MUTACIJ W515L IN W515K V RECEPTORJU ZA TROMBOPOETIN, Z NAČINOM VERIŽNE REAKCIJE S POLIMERAZO V REALNEM ČASU, PRI BOLNIKIH Z ESENCIALNO TROMBOCITEMIJO THE THROMBOPOIETIN RECEPTOR W515L AND W515K MUTATIONS DETECTION BY REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION IN ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA PATIENTS DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana, 2011
Diplomsko nalogo sem opravljala v Specializiranem hematološkem laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo, Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana, pod mentorstvom doc. dr. Uroša Mlakarja, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, spec. med. biokem. Zahvala Iskreno se zahvaljujem vsem, ki so mi pri izdelavi diplomske naloge nesebično pomagali s svojimi strokovnimi nasveti in praktičnimi izkušnjami. Na prvem mestu gre zahvala somentorju asist. dr. Tadeju Pajiču, spec. med. biokem, ki me je vzel pod svoje okrilje in mentorju doc.dr. Urošu Mlakarju, dr. med. za vodenje in pravilen potek diplomske naloge. Posebna zahvala gre tudi celotnemu osebju Specializiranega hematološkega laboratorija UKC Ljubljana, še posebno osebju, ki dela na področju molekularne genetike (Nejcu Lamovšku, Martini Fink, Mariji-Jedrt Mandelc Mazaj, Anici Mihajlović in Urški Baruca), ki me je zelo lepo sprejelo medse in mi omogočilo prijetno delovno okolje, v katerem se strokovno izpopolnjujem že dobro leto in pol. Na tem mestu pa se seveda zahvaljujem tudi vsem ostalim, predvsem staršem, bratu, moji (naj)boljši polovici Damjanu in vsem sošolcem in prijateljem, ki ste me pri mojem študiju vzpodbujali in bodrili ter mi vedno stali ob strani. Upam da vas nisem razočarala Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr. Uroša Mlakarja, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, spec. med. biokem. Predsednik komisije: izr. prof. dr. Darko Černe, mag. farm., spec. med. biokem. Član komisije: doc. dr. Tomaž Vovk, mag. farm. Ljubljana, 2011
VSEBINA VSEBINA...I KAZALO SLIK... III KAZALO PREGLEDNIC... III POVZETEK... V SEZNAM OKRAJŠAV...VI 1 UVOD... 1 1.1 MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE (MPN)...1 1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA (ET)...2 1.2 MUTACIJE V GENU MPL...5 1.3 KVANTITATIVNA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMEZARO V REALNEM ČASU...9 1.3.1 ALELNA DISKRIMINACIJA...11 2 NAMEN DELA... 13 3 PREISKOVANCI IN METODE... 14 3.1 PREISKOVANCI...14 3.2 METODE...15 3.2.1 IZOLACIJA GRANULOCITOV IZ VZORCEV VENSKE KRVI Z GRADIENTNIM CENTRIFUGIRANJEM PREKO FIKOLA...15 3.2.2 IZOLACIJA CELOKUPNE DNA IZ GRANULOCITOV...18 3.2.3 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE VZORCEV DNA...20 3.2.4 KVANTITATIVNA DOLOČITEV MUTACIJ MPL W515L IN MPL W515K Z VERIŽNO REAKCIJO S POLIMERAZO V REALNEM ČASU...21 3.3 STATISTIČNA OBDELAVA VZORCEV...24 4 REZULTATI IN RAZPRAVA... 25 4.1 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE DNA IZOLIRANE IZ GRANULOCITOV PERIFERNE KRVI...26 4.2 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO V REALNEM ČASU...28 4.2.1 VREDNOSTI CQ POZITIVNIH, NEGATIVNIH KONTROLNIH IN RAZMEJITVENIH VZORCEV PRILOŽENIH H KOMPLETU MPL MUTASCREEN TM KIT...28 4.2.2 DOLOČANJE VREDNOSTI CQ VZORCEV BOLNIKOV Z ET...30 4.3 REZULTATI ALELNE DISKRIMINACIJE...34 I
5 ZAKLJUČKI... 38 6 LITERATURA... 39 7 PRILOGE... 42 II
KAZALO SLIK Slika 1: Princip kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qpcr). Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16)...10 Slika 2: Krivulja pomnoževanja pri PCR v realnem času. Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16)...11 Slika 3: Prikaz rezultatov alelne diskriminacije...12 Slika 4: Ločitev posameznih frakcij celic z gradientnim centrifugiranjem preko fikola...17 Slika 5 : Shema nanosa reakcijskih mešanic in vzorcev na mikrotitrsko ploščico...23 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica I: Razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po SZO (2008) (2)...1 Preglednica II: Diagnostični kriteriji za esencialno trombocitemijo po SZO 2008 (2)...3 Preglednica III: Sestava reakcijske mešanice za MPL W515L in MPL W515K...22 Preglednica IV: Pogoji qpcr...23 Preglednica V: Alelna diskriminacija- program Post read...24 Preglednica VI: Rezultati merjenja koncentracije in čistoče (A 260 /A 280 ) DNA izolirane iz granulocitov periferne krvi s kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)...27 Preglednica VII: Vrednosti Cq pozitivnih, negativnih kontrolnih in razmejitvenih vzorcev za mutaciji MPL W515K in MPL W515L, pridobljene v štirih reakcijah...1 Preglednica VIII: Vrednosti Cq bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K...30 Preglednica IX: Cq vrednosti bolnikov, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L...32 Preglednica X: Vrednosti Cq vzorcev 4 bolnikov, ki so imeli prisotni mutaciji MPL W515L/K...34 Preglednica XI: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca za mutacijo MPL W515K in mutacijo MPL W515L, pridobljenih v 4 analiznih poskusih...35 Preglednica XII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela pozitivne kontrole za mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih...36 III
Preglednica XIII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela negativne kontrole za mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih...36 Preglednica XIV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in prisotno mutacijo MPL W515L...37 Preglednica XV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in prisotno mutacijo MPL W515K...37 Preglednica XVI: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L...42 Preglednica XVII: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K...45 IV
POVZETEK Pri večini bolnikov s policitemijo vera (PV) in pri približno polovici bolnikov z esencialno trombocitemijo (ET) in primarno mielofibrozo (PM) lahko dokažemo pridobljeno somatsko mutacijo JAK2 V617F. Nadaljnje raziskave so pokazale, da v približno 1-9 % bolnikov z ET in v 5-11 % bolnikov s PM ugotovimo somatske mutacije v genu za trombopoetinski receptor MPL. Slednje se pri drugih mieloproliferativnih novotvorbah (MPN) pojavijo redko. Določitev mutacije JAK2 V617F in mutacij v genu MPL sta pomembni dodatni preiskavi pri postavitvi diagnoze mieloproliferativnih novotvorb. Zamenjavi aminokisline triptofan za levcin (MPL W515L) in lizin (MPL W515K) na mestu 515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin sta najpogosteje ugotovljeni pridobljeni mutaciji trombopoetinskega receptorja pri bolnikih z ET in PM. Mutaciji najverjetneje povzročata, da je beljakovina aktivna brez vezanega liganda. Namen našega dela je bil vpeljava metode določitve mutacij MPL W515L/K v receptorju za trombopoetin, z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času (uporaba reagenčnega kompleta MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen, Francija)) in določitev deleža bolnikov z ET, ki so imeli mutaciji MPL W515L/K. Oblikovali smo delovni hipotezi in sicer, da reagenčni komplet MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča določitev mutacij MPL W515L/K in da se mutaciji MPL W515L/K pojavljata pri 1-9 % bolnikov z ET. Da bi hipotezi dokazali smo iz vzorcev venske krvi 77 bolnikov z ET izolirali granulocite z gradientnim centrifugiranjem preko fikola. Iz granulocitov smo izolirali celokupno DNA in ji spektrofotometrično izmerili koncentracijo ter čistočo. Prisotnost mutacij MPL W515L/K smo nato določili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qpcr) in alelno diskriminacijo. Prisotnost mutacije MPL W515L/K smo dokazali pri štirih (5 %) bolnikih z ET, kar je v skladu s podatki iz literature. Ugotovili smo tudi, da je mutacija MPL W515L pogostejša, saj smo jo dokazali pri treh (4 %) bolnikih z ET. Mutacijo MPL W515K smo dokazali pri enem (2 %) bolniku. Reagenčni komplet MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča določanje mutacij MPL W515L/K. V
SEZNAM OKRAJŠAV COS razmejitveni vzorec (ang. Cut-Off Sample) Cq cikel pri katerem fluorescenčni signal preseže predviden prag DNA deoksiribonukleinska kislina DNaza encim, ki cepi DNA EDTA etilendiamintetraocetna kislina ET esencialna trombocitemija FAM 6-karboksifluorescein Hb hemoglobin HU hidroksiurea JAK2 Janus kinaza 2 KML kronična mieloična levkemija KNL kronična nevtrofilna levkemija LDH holesterol majhne gostote M molarnost, koncentracija mol/l MDS mielodisplastični sindrom MPL gen za trombopoetinski receptor (ang. Myeloproliferative Leukemia Virus Oncogene) MPN mieloproliferativne novotvorbe NC negativna kontrola PBS fosfatni pufer s soljo PC pozitivna kontrola PCR verižna reakcija s polimerazo Ph-kromosom spremenjen kromosom 22 PM primarna mielofibroza PV policitemija vera PVSG Polycythemia Vera Study Group qpcr kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času RNA ribonukleinska kislina RNaza encim, ki cepi RNA STAT molekule, ki posredujejo signal in aktivirajo prepis DNA SZO Svetovna zdravstvena organizacija Taq - polimeraza polimeraza iz organizma Thermophilus aquaticus T m temperatura taljenja UPD uniparentalna disomija WT divji tip, nemutiran (ang. Wild Tipe) VI
1 UVOD 1.1 MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE (MPN) Mieloproliferativne novotvorbe so klonske bolezni, za katere je značilno zvečano nastajanje krvnih celic zaradi motnje na ravni matične krvotvorne celice in kroničen potek bolezni. Hematopoeza je še učinkovita, zato v odvisnosti od vrste MPN lahko poraste število eritrocitov, levkocitov ali trombocitov v periferni krvi. Razraščajo se celice kostnega mozga z znaki dozorevanja brez displastičnih sprememb. Bolezen opredelijo na osnovi kliničnih znakov, krvni sliki in drugih laboratorijskih preiskavah, citoloških in histoloških preiskavah kostnega mozga in drugega tkiva in v vse večjem obsegu na osnovi molekularno genetskih sprememb. Bolezni imajo precej skupnih kliničnih značilnosti. Potek je večinoma dolgotrajen, v končnem obdobju pa pospešen ali pa ima značilnosti akutne levkemije. Ena oblika bolezni lahko prehaja v drugo, vendar to ni običajno. Bolniki so nagnjeni h krvavitvam in trombozam v skladu z znaki in simptomi, povezanih z razrastjo hematopoetske vrste (1). Z izjemo kronične mieloične levkemije (KML), molekularno genetsko ozadje drugih MPN dolgo ni bilo pojasnjeno. Preglednica I: Razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po SZO (2008) (2) kronična mieloična levkemija, BCR/ABL1 pozitivna (KML), kronična nevtrofilna levkemija (KNL), policitemija vera (PV), primarna mielofibroza (PM), esencialna trombocitemija (ET), kronična eozinofilna levkemija, mastocitoza, neklasificirane MPN 1
1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA (ET) Esencialna trombocitemija (ET) je klonska bolezen, ki jo uvrščamo v skupino mieloproliferativnih novotvorb. Pojavnost bolezni je 1 do 2,5 na 100,000 prebivalcev. Najbolj pogosta je med petdesetim in sedemdesetim letom starosti, nekoliko manj pogosta pri ljudeh v tretji in četrti dekadi življenja, občasno se pojavi tudi pri otrocih. Pogosteje obolevajo ženske (Ž:M = 2:1). Za ET je značilno razraščanje velikih, zrelih megakariocitov v kostnem mozgu in zato se posledično zveča število trombocitov v periferni krvi. Tvorba trombocitov je lahko šest do petnajstkrat večja od normalne, njihova življenjska doba pa je lahko tudi normalna. Pri ET ne ugotavljajo značilne genetske oziroma kromosomske spremembe. Značilna je nagnjenost h krvavitvam in trombozam. Krvavitve so posledica motene funkcije trombocitov. Klinična slika Dve tretjini bolnikov ob odkritju bolezni nimata simptomov. Redki znaki prisotnosti ET so znaki povečane presnove, npr. izguba telesne teže, znojenje, utrujenost. Okoli 40 % bolnikov ima povečano vranico, zato se pojavi napetost v trebuhu in tope bolečine pod levim rebrnim lokom. Jetra so redko povečana. Pri 20 do 50 % bolnikov se bolezen manifestira v obliki tromboz ali krvavitev, ki so tudi glavni vzrok smrti bolnikov. Krvavitve so lahko v prebavila, v kožo, sluznice, iz nosu, po poškodbah in operacijah. Arterijske tromboze so malo bolj pogoste kot venske, od venskih pa jih je četrtina v venah spodnjih udov. Tromboza hepatične in vraničnih ven je zelo pogosta. Žilje je lahko prizadeto tudi na ravni arteriol in kapilar in se klinično izraža kot ishemija prstov rok in nog, kar imenujemo eritromelalgija. Diagnoza Diagnoza temelji na kliničnih znakih, krvni sliki, citoloških in histoloških preiskavah kostnega mozga in v vse večjem obsegu na osnovi molekularno genetskih sprememb. 2
Sprva so uporabljali za opredelitev in zdravljenje ET klinična diagnostična merila PVSG (Polycythemia Vera Study Group), danes pa bolezen opredeljujejo na osnovi kriterijev Svetovne zdravstvene organizacije, ki s histološkim pregledom kostnega mozga ločijo ET od obdobja prefibroze in zgodnje fibroze primarne mielofibroze. Histološki pregled kostnega mozga s poudarkom na oceni stopnje fibroze ima diagnostični, predvsem pa napovedni pomen. Praviloma ga morajo opraviti pred zdravljenjem z zdravili za zmanjšanje števila trombocitov. Danes za potrditev ET redno določajo somatsko mutacijo JAK2 V617F, ki je prisotna pri nas pri 61 % bolnikov z ET. Približno pri 9 % bolnikov z ET dokažejo tudi mutacije v genu MPL. Izjemoma se zadovoljimo z opredelitvijo ET po kriterijih PVSG pri starejših prizadetih bolnikih, ki že prejemajo zdravila za zmanjšanje števila trombocitov (3). Število trombocitov pri ET praviloma presega 450 10 9 /L, pogosto je med 1000 in 2000 10 9 /L. Trombociti imajo večji volumen, posamezni so lahko zelo veliki in nepravilnih oblik. Njihova funkcija je lahko zmanjšana. Pri biopsiji kostnega mozga lahko dobijo normocelularen kostni mozeg ali pa blago hipercelularen. Najbolj značilno je razraščanje zelo velikih, skoraj gigantskih megakariocitov, ki imajo hiperlobulirana jedra in obilno citoplazmo (1). Preglednica II: Diagnostični kriteriji za esencialno trombocitemijo po SZO 2008 (2) Za potrditev ET vsa našteta merila: stalno zvečano število trombocitov v krvi: > 450 10 9 /L značilne histološke spremembe v kostnem mozgu: povečano število pretežno velikih zrelih megakariocitov s hiperlobuliranim jedrom in zrelo citoplazmo, normalna celularnost kostnega mozga, odsotnost ali mejno povečana količina retikulina brez proliferacije ali pomnožitve nezrelih granulocitov, normalna normoblastna eritropoeza prisotnost klonskega označevalca: JAK2 V617F, drugi klonski označevalci Za izključitev ET, odsotnost meril SZO za: prava policitemija, KML, MPN, MDS odsotnost JAK2 V617F ali ni znakov za reaktivno trombocitozo 3
Diferencialna diagnostika: ET morajo razlikovati od reaktivne trombocitoze, prave policitemije, KML in mielofiboze. Za razliko od ET pri reaktivnih trombocitozah ni krvavitev in tromboz, pa tudi število trombocitov v krvi običajno ni večje od 1000 x 10 9 /L. Trombociti so morfološko normalni, tako kot tudi njihova funkcija. Pri pravi policitemiji najdejo povečano maso eritrocitov, povečano aktivnost alkalne fosfataze nevtrofilcev, v makrofagih kostnega mozga ne najdejo železa. KML se od ET razlikuje po prisotnosti kromosoma Ph, ki je posledica translokacije med kromosomoma 9 in 22 (t(9;22)), večinoma zmanjšani aktivnosti alkalne fosfataze nevtrofilcev in izrazitem razrastu granulocitne vrste v kostnem mozgu. Izrazita trombocitoza je le redko prisotna. Mielofibrozo z mieloidno metaplazijo ločijo od ET po veliki vranici in po tem, da so v razmazu kapljice periferne krvi pri PM značilni dakriociti. Zdravljenje: Osnovni namen zdravljenja je zmanjšati bolnikove težave, predvsem pa preprečevati življenjsko ogrožajoče tromboze, trombembolije in krvavitve. Verjetnost krvavitev zmanjšajo, če z zdravili zmanjšajo število trombocitov v krvi pod 1000 10 9/ L in v času zmanjševanja števila trombocitov prenehajo dajati antiagregacijska zdravila. Med antikoagulacijskimi zdravili najpogosteje uporabljajo acetilsalicilno kislino (Aspirin), v dnevnem odmerku 50 do 100 mg ali 100 mg vsak drugi dan. Acetilsalicilna kislina je pri bolnikih z ET učinkovita pri preprečevanju arterijskih tromboz, posebno pri ishemiji v predelu prstov rok in nog (eritromelalgija), preprečevanju gangrene in cerebrovaskularne ishemije. Hidroksiurea (HU) je zdravilo za zmanjšanje števila trombocitov. Zaradi možnosti, da po daljši uporabi (okoli 10 15 let) povzroči pojav sekundarne akutne mieloične levkemije, se naj ne bi uporabljalo pri mlajših bolnikih. Kljub temu pa hidroksiureo pogosto uporabijo za nekajtedensko hitro zmanjševanje velikega števila trombocitov tudi pri mlajših bolnikih. 4
Trombofereza je indicirana za hitro zmanjšanje števila trombocitov, a le za kratek čas. Za trajno zdravljenje uporabljajo interferon alfa. Rekombinantni interferon alfa učinkovito zavre rast nenormalnega klona megakariocitov v kostnem mozgu. Najnovejše zdravilo za zdravljenje ET je anagrelid. Dnevni odmerek 2 do 3 mg anagrelida, ki zavira proliferacijo megakariocitov in ni citostatik, zelo hitro zmanjša število trombocitov in skoraj ne vpliva na ostale celice v kostnem mozgu (4). Potek in prognoza: ET velja za neozdravljivo bolezen, s kroničnim potekom. Življenjska doba bolnikov z ET predvidoma ni skrajšana, odvisna je od mnogih dejavnikov, med drugim od naravnega poteka bolezni in njenih zapletov ter načina zdravljenja. Najpogostejši vzrok smrti so krvavitve in tromboze. S prihodom zdravila anagrelid na slovenski trg zdravil so poenotili način zdravljenja ET z drugimi evropskimi državami. Kljub številnim raziskavam zaenkrat še ni povsem pojasnjen pomen določanja mutacije V617F v genu JAK2 za oceno napovedi izida bolezni. 1.2 MUTACIJE V GENU MPL Onkogen v-mpl so prvič odkrili leta 1990 pri miših z mieloproliferativnim levkemičnim virusom (ang. Myeloproliferative leukemia virus). Leta 1992 so klonirali človeški homolog, imenovan C-MPL. Gen C-MPL kodira protein, ki je homologen članom hematopoetske receptorske naddružine. Trombopoetin, ki je ligand proteina C-MPL pa je bil kloniran leta 1994. Trombopoetin je primarni in najpomembnejši regulator rasti in diferenciacije megakariocitov ter nastanka trombocitov (5). Gen MPL (ang. Myeloproliferative Leukemia Virus Oncogene, MPL) je sestavljen iz 12 eksonov, pri človeku se nahaja na kromosomu 1p34. Gen MPL kodira membranski protein, ki je sestavljen iz 635 aminokislin, z dvema zunajceličnima receptorskima domenama za citokine in dvema znotrajceličnima aktivacijskima domenama. Protein na površini celice imenujejo tudi CD110 (ang. Cluster of Differentiation 110) (5, 6). 5
Najpogostejše somatske mutacije so MPL W515L, MPL W515K in MPL W515A. Nahajajo se v juxtamembranski domeni receptorja za trombopoetin. Mutacije se zgodijo znotraj eksona 10 gena MPL. Mutacija G T na mestu 1544 nukleotidnega zaporedja povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z levcinom na mestu 515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin (W515L). Mutacija GT AA na mestih 1543 in 1544 nukleotidnega zaporedja povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z lizinom na mestu 515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin (W515K). Tretja omenjena mutacija pa povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z alaninom na mestu 515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin (W515A). Mutacija MPL W515L povzroča proliferacijo hematopoetskih celic neodvisno od citokinov ter povečano odzivnost receptorja za trombopoetin in posledično konstantno fosforilacijo signalnih proteinov in aktivacijo signalnih poti, kot so STAT3, STAT5, MAPK in PI3K/AKT. Prvič je bila opisana leta 2006 pri bolnikih z JAK2 V617F-negativno primarno mielofibrozo. Mutacija MPL W515L je najpogostejša izmed vseh opisanih mutacij v genu MPL (7, 8, 9). Triptofan na mestu 515 se nahaja v juxtamembranskem delu citoplazemske domene proteina MPL in je del ohranjenega amfipatskega motiva (RWQFP), ki je pomemben pri ohranjanju receptorja za trombopoetin v neaktivni obliki, ob odsotnosti trombopoetina (10). Zelo redko se pri bolnikih z ET pojavi mutacija MPL S505N. Mutacija (1073G A) povzroči zamenjavo aminokisline serin z asparginom na mestu 505 aminokislinskega zaporedja. Mutacija MPL S505N je bila prvič opisana pri Japonski družini z avtosomno dominantno trombocitozo. Identično mutacijo so odkrili tudi pri miših in sicer z mutacijsko analizo, pri kateri so uporabili retroviruse. Pred kratkim so jo opisali tudi kot sporadično mutacijo pri ET (10, 11, 19). Poleg že omenjenih mutacij MPL W515L/K/A in MPL S505N so raziskovalci pri bolnikih s primarno mielofibrozo odkrili še štiri mutacije in sicer MPL S204P, MPL A506T, MPL L510P in MPL A519Y, katerih funkcija in pomen je še neznan (10). 6
Mutaciji S204F in Y591D so odkrili pri bolnikih z uniparentalno disomijo na kromosomu 1p (1pUPD). Tudi njuna funkcija je še neznana (12). Pri približno 7 % afriških Američanov so odkrili mutacijo MPL K39N, imenovano tudi MPL Baltimore, ki naj bi se nahajala na N-terminalni regiji proteina MPL. Mutacija G T na mestu 1238 nukleotidnega zaporedja povzroči zamenjavo aminokisline lizina z asparginom na mestu 39 aminokislinskega zaporedja (K39N). Heterozigotni bolniki imajo blago trombocitozo oz. število trombocitov na zgornji meji referenčnih vrednosti. Homozigoti pa imajo število trombocitov med 600-800 x 10 9 /L (10, 13). Pred kratkim so pri družinah arabskega rodu odkrili tudi mutacijo MPL P106L. Homozigotni bolniki imajo število trombocitov > 1000 x 10 9 /L, medtem ko heterozigotni bolniki izražajo blago trombocitozo ali pa imajo normalno število trombocitov. Bolniki imajo v serumu povišano raven trombopoetina, kar kaže na to, da mutacija MPL P106L interferira, sodeljuje z internalizacijo in/ali razgradnjo trombopoetina, ohrani pa zmožnost vezave trombopoetina in aktivacijo receptorja (10). Somatske mutacije v genu MPL so redke in ponavadi povezane z MPN. Pojavljajo se predvsem pri bolnikih z ET in PM, pri bolnikih z PV niso prisotne. Ugotovili pa so jih tudi pri bolnikih z akutno megakariocitno levkemijo (11,14). Pogostost pojavljanja mutacij W515L in W515K je najvišja pri bolnikih s PM, pojavi se v 5 do 11 % (10, 15, 20). Nekoliko nižjo pojavnost so ugotovili pri bolnikih z ET. Pojavi se v 1 do 9 % (10, 15, 20) Razponi v pojavnosti mutacij so lahko posledica uporabe različnih kriterijev za postavitev diagnoze (Polycythemia Vera Study Group ali Svetovne zdravstvene organizacije) in verjetno tudi od občutljivosti testa s katerim so mutacije določili. Istočasno prisotnost mutacije JAK2 V617F in MPL W515L/K so odkrili le pri redkih bolnikih. Nejasno je tudi, ali so te mutacije pri istem bolniku prisotne v istem klonu ali ločenih subklonih (8, 15). Skupina raziskovalcev je leta 2008 pri bolnikih z ET ocenjevala povezavo med mutacijami MPL, mutacijo JAK2 V617F in kliničnimi ter laboratorijskimi parametri, na osnovi katerih so želeli nadalje opredeliti bolnike z ET v podskupine. Ugotovili so, da imajo bolniki s 7
prisotno mutacijo JAK2 V617F višjo raven hemoglobina in višje število nevtrofilcev ter nižje število trombocitov, serumskega feritina in eritropoetina v primerjavi z bolniki, ki nimajo prisotne mutacije JAK2 V617F. Ugotovili so tudi, da imajo bolniki z ET pri katerih so prisotne mutacije v genu MPL, večje število trombocitov in nižjo raven hemoglobina kot bolniki z ET pri katerih je prisotna mutacija JAK2 V617F, vendar se ne razlikujejo od bolnikov z JAK2/MPL-divjim tipom. Poleg tega so številne študije pokazale, da lahko endogene megakariocitne kolonije, ne pa tudi eritroidne, zrastejo iz MPL W515-pozitivnih celic. Ti podatki kažejo na to, da lahko bolnike z ET opredelimo glede na različno stopnjo megakariopoeze in eritropoeze. Tako je za bolnike z ET in prisotno mutacijo MPL W515 ali bolnike z JAK2/MPL-divjim tipom značilna višja stopnja megakariopoeze, višje število trombocitov in nižja raven hemoglobina. Za bolnike z ET in prisotno mutacijo JAK2 V617F pa je značilna višja stopnja eritropoeze, nižja raven eritropoetina in višja raven hemoglobina (8, 10). Vsekakor bodo potrebne še nadaljnje raziskave za potrditev teh raziskav in vpeljavo v redno klinično prakso. 8
1.3 KVANTITATIVNA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMEZARO V REALNEM ČASU Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qpcr) predstavlja nadgradnjo klasičnega ali konvencionalnega PCR. Omogoča namreč sprotno zaznavanje in spremljanje količine pridelka reakcije PCR v vsakem ciklu med samo reakcijo PCR. Detekcija pridelkov reakcije PCR je mogoča zaradi fluorescenčnih molekul, ki prikazujejo povečanje količine pridelkov DNA s sorazmernim povečanjem fluorescenčnega signala. Izmerjena fluorescenca odraža količino podvojenih pridelkov PCR v vsakem ciklu (16). Prednosti PCR v realnem času pred konvencionalnim PCR se odražajo v hitrosti izvajanja, visoki občutljivosti in ponovljivosti, kot tudi v minimalni možnosti kontaminacije, saj reakcija in vrednotenje podatkov poteka v zaprtem sistemu. Odlikuje ga široko dinamično območje, kar omogoča sočasno analizo vzorcev z zelo različnimi koncentracijami. Rezultati PCR v realnem času so lahko kvalitativni (prisotnost ali odsotnost zaporedja) ali kvantitativni (število kopij DNA). Vrednotenje rezultatov poteka brez gelske elektroforeze, kar skrajša čas preizkusa in poveča pretočnost vzorcev. Za zaznavanje nastalega pridelka PCR se uporablja več načinov, med katerimi so najbolj pogosti nespecifičen način zaznave z barvilom SYBR Green I in specifični načini zaznave s hidrolizirajočimi sondami in dvojno hibridizacijskimi sondami. Pri analizi s hidrolizirajočimi sondami se v reakcijski zmesi poleg začetnih oligonukleotidov, nahaja še dvojno označena sonda (TaqMan ), ki ima T m (temperatura taljenja) za 5 10 C višjo od obeh začetnih oligonukleotidov. Sonda TaqMan je označena s fluorescenčnim barvilom (ang. reporter) na 5 koncu in z dušilcem fluorescenčnega signala (ang. quencher) na 3 koncu sonde. Ker dušilec signala ujame signal, ki ga pošilja fluoresecenčno barvilo na drugi strani sonde, sonda ne fluorescira. Ko pa se med reakcijo PCR izgrajuje preiskovano zaporedje (tarčni gen), se sonda TaqMan veže na ustrezno mesto v novo nastajajoči verigi. Encim Taq-polimeraza s 5 eksonukleazno aktivnostjo sondo hidrolizira, zato se razdalja med fluorescenčnim barvilom in dušilcem poveča in tako je onemogočeno prestrezanje fluorescence. Fluorescenca barvila zato poraste in je sorazmerna s količino produkta PCR (Slika 1) (16). 9
Slika 1: Princip kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qpcr). Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16). Metoda qpcr temelji na merjenju fluorescence v eksponentni fazi, in sicer na osnovi izmerjenih podatkov narišemo krivuljo, ki podaja odvisnost intenzitete fluorescenčnega signala posameznih vzorcev od števila ciklov. Krivulja pomnoževanja je razdeljena na dve fazi: eksponentna faza in plato faza (Slika 2). V eksponentni fazi se količina produkta PCR v vsakem ciklu podvoji. V poznejših ciklih se reakcija pomnoževanja postopno upočasnjuje zaradi porabe sestavin reakcijske zmesi, manjše aktivnosti DNA-polimeraze in kopičenja inhibitornih produktov in zaradi tega preide v plato fazo (cikli 28 40 na Sliki 2). V začetnih ciklih (cikli 1 18 na Sliki 2) intenziteta fluorescence ne preseže intenzitete 10
fluorescenčnega ozadja. Sčasoma pa je količina pridelka dovolj velika, da lahko zaznamo fluorescenčni signal. Cikel, pri katerem se to zgodi, imenujemo cikel kvantifikacije (angl. quantification cycle) oz. Cq (Slika 2) (21). Vrednost Cq je sorazmerna številu kopij matrice v začetku reakcije. Pri večjem začetnem številu kopij matrice signal prej preseže prag in tako določimo nižji Cq. Vrednosti Cq so torej obratno sorazmerne z začetnim številom kopij matrice in na osnovi njih primerjamo vzorce med seboj. Slika 2: Krivulja pomnoževanja pri PCR v realnem času. Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16). 1.3.1 ALELNA DISKRIMINACIJA Po končanem qpcr lahko v neeksponentni fazi krivulje qpcr izvedemo še alelno diskriminacijo (ang. Allelic Discrimination). To je način ugotavljanja določene genske spremembe po izvedenem qpcr-ju. Za učinkovito alelno diskriminacijo potrebujemo smerni in protismerni oligonukleotidni začetnik ter par hidroliznih sond TaqMan, 11
označenih s 5 reporterskim barvilom. Prva sonda ima na 5 koncu vezano reportersko barvilo, ki se razlikuje od reporterskega barvila druge sonde, na 3 koncu pa imata obe sondi vezan enak dušilec, ki je lahko fluorescenčno ali nefluorescenčno barvilo z dodatkom za izboljšano vezavo na ciljno zaporedje DNA. Običajno je mutiran alel (alel 2) označen z reporterskim barvilom FAM TM, nemutiran (alel 1) pa z VIC. Z merjenjem povečanja intenzitete fluorescence posameznega barvila po qpcr pridobimo podatke o genotipu za gensko spremembo, ki jo želimo ugotoviti. Če izmerimo povečanje intenzitete le fluorescenčnega barvila VIC je vzorec homozigot za prvi alel. Če izmerimo povečanje intenzitete le fluorescenčnega barvila FAM TM je vzorec homozigot za drugi alel. V primeru da izmerimo povečanje intenzitete obeh fluorescenčnih barvil, potem je vzorec heterozigot za preiskovana alela (Slika 3). - homozigot alel Y (FAM) - heterozigot - homozigot alel X (VIC) - H 2 O Slika 3: Prikaz rezultatov alelne diskriminacije 12
2 NAMEN DELA Mutaciji MPL W515L in MPL W515K sta pomemben dodaten diagnostičen kriterij pri opredelitvi MPN (2). Sta dokaz klonalnosti in se pojavljajata pri približno 1 do 9 % bolnikov z ET in pri 5 do 11 % bolnikov s PM (10, 15, 20). Oblikovali smo hipotezi: - reagenčni komplet MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča določanje mutacij MPL W515L in MPL W515K v receptorju za trombopoetin - mutaciji MPL W515L in MPL W515K se pojavljata pri približno 1-9 % bolnikov z ET. Namen našega dela je: - vpeljava metode določitve mutacij MPL W515L in MPL W515K v receptorju za trombopoetin, z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času (uporaba reagenčnega kompleta MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen, Francija)). Način bomo preizkusili na pozitivnih, negativnih kontrolnih vzorcih DNA reagenčnega kompleta in na vzorcih DNA, dobljenih iz granulocitov bolnikov z ET. - določiti delež bolnikov z ET, ki imajo mutacijo MPL W515L/K in rezultate primerjati s podatki iz literature. K delu bomo pristopili tako, da bomo izolirali granulocite z gradientnim centrifugiranjem preko fikola iz periferne krvi 77 bolnikov z ET. Iz le-teh bomo izolirali celokupno DNA z reagenčnim kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) in ji spektrofotometrično izmerili koncentracijo ter čistočo. Prisotnost mutacij MPL W515L/K bomo nato določili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qpcr). Genotip mutacij bomo določili z alelno diskriminacijo. Pričakujemo, da bomo hipotezi dokazali in potrdili. Uvedba metode določitve mutacij MPL W515L in MPL W515K z reagenčnim kompletom MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen, Francija) bo pripomogla k postavitvi diagnoze bolnikov z ET in PM, v skladu s smernicami kriterijev diagnostičnih meril Svetovne zdravstvene organizacije. 13
3 PREISKOVANCI IN METODE 3.1 PREISKOVANCI V raziskavo smo vključili 77 bolnikov z esencialno trombocitemijo, od tega 59 (77 %) žensk in 18 (23 %) moških. Vsi bolniki so bili negativni za prisotnost mutacije JAK2 V617F. Starost bolnikov ob prvem odvzemu oz. ob napotni diagnozi je bila od 18 do 89 let. Mediana starosti bolnikov je znašala 48 let. Vzorci periferne krvi bolnikov so bili odvzeti v ambulanti Kliničnega oddelka za hematologijo, UKC Ljubljana. Meritve smo opravili na vzorcih DNA, shranjenih pri temperaturi 20 C v Specializiranem hematološkem laboratoriju kliničnega oddelka za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana. Diagnoza je bila postavljena s strani zdravnika hematologa na osnovi kriterijev SZO 2008 (2). DNA je bila izolirana iz granulocitov vzorcev periferne krvi. Granulocite smo pridobili z liziranjem eritrocitov po odstranitvi mononuklearnih celic po gradientnem centrifugiranju vzorcev periferne krvi preko fikola. DNA pa smo izolirali z reagenčnim kompletom QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). Izvedeni postopki so bili v skladu z načeli Helsinške deklaracije o biomedicinskih raziskavah na človeku (1975). 14
3.2 METODE 3.2.1 Izolacija granulocitov iz vzorcev venske krvi z gradientnim centrifugiranjem preko fikola Izolirani granulociti so izhodni material za izolacijo DNA, ki jo uporabljamo za molekularno genetske preiskave pri MPN. Fikol se uporablja za izolacijo posameznih vrst krvnih celic (granulociti, mononuklearne celice) iz periferne krvi ali kostnega mozga. Različne krvne celice imajo različno specifično gostoto in se tako ločijo v gradientu s fikolom, ki nastane med centrifugiranjem. Reagenti, pribor in aparature: Ficoll Paque TM PLUS (GE Healthcare Bio-Science AB) - brezbarvna, bistra tekočina za gradientno ločevanje celic, hranimo jo v temnem prostoru; 1 fosfatni pufer s soljo (PBS) - uporablja se za redčenje vzorcev periferne krvi in kostnega mozga, za spiranje celic ter raztapljanje celic na koncu izolacije. Pripravimo ga iz 10 pufra PBS (GIBCO-Invitrogen), ki je fiziološka raztopina s solmi (NaCl, KCl, Na 2 HPO 4 7H 2 O, KH 2 PO 4), a brez dodatka CaCl 2 ter MgCl 2 ; ph: 7,2 ± 0,05; (Priprava PBS: Za pripravo PBS z merilnim valjem odmerimo 100 ml 10 pufra PBS ter ga prenesemo v 1000 ml bučko in z redestilirano vodo, ki ne vsebuje encimov DNaz in RNaz, redčimo do oznake); raztopina za lizo eritrocitov je pufer, ki povzroči lizo eritrocitov in nam tako omogoča izolacijo čistih levkocitov. Najprej pripravimo 10 matično raztopino za lizo eritrocitov, ki vsebuje soli (82,6g NH 4 Cl, 10,0g KHCO 3, 0,37g EDTA) raztopljene v 1000mL redestilirane vode in prefiltrirane skozi vakuumskofiltracijski sistem. (Priprava raztopine za lizo eritrocitov: Za pripravo raztopine za lizo eritrocitov z valjem odmerimo 100 ml 10 matične raztopine za lizo eritrocitov in jo prenesemo v 1000 ml bučko ter z redestilirano vodo, ki ne vsebuje encimov DNaz in RNaz, redčimo do oznake); pipete in nastavki za pipete (10 100 µl, 100 1000 µl Eppendorf); 10 ml epruveta Vacuntainer z antikoagulantom K 2 /K 3 EDTA; 15
15 ml plastične, sterilne epruvete Falcon (Greiner bio-one CELLSTAR PP-test tube); sterilna 50 ml centrifugirka (Falcon); 1,5 ml mikrocentrifugirke (Safe-lock tubes; Eppendorf Biopur); sterilna brizga in igla za injiciranje fikola; stojalo za epruvete; komora, ki omogoča sterilno delo (Iskra Bio LFVP 12); hematološki analizator Beckman Coulter LH 750 Analyzer; centrifuga Labofuge 400 ( Heraeus); orbitalni mešalnik Postopek: Odvzeli smo 10 ml venske krvi v epruveto Vacuntainer z antikoagulantom EDTA. Vensko kri smo redčili s fosfatnim pufrom s soljo (PBS) v razmerju 1 : 1, ogretim na sobno temperaturo. V 15 ml plastične epruvete smo z iglo in brizgalko nabrizgali 3 ml fikola. Razredčeno vensko kri smo počasi in previdno pipetirali ob steni epruvete na plast fikola, tako da je meja med fikolom in razredčeno vensko krvjo ostala popolnoma ostra. Nato smo vzorce centrifugirali 22 minut pri 2200 obr./min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus) pri sobni temperaturi. Po centrifugiranju so bile lepo vidne vse štiri plasti celic: eritrociti in granulociti, fikol, mononuklearne celice in plazma. Eritrociti in granulociti so se zaradi večje specifične gostote usedli na dno epruvete pod plast fikola. Plast fikola je ostala bistra, nad njo pa se je nabrala plast mononuklearnih celic. Nad plastjo mononuklearnih celic v supernatantu so se nabrali PBS, plazma in maščoba (Slika 4). 16
Slika 4: Ločitev posameznih frakcij celic z gradientnim centrifugiranjem preko fikola Po centrifugiranju smo odstranili supernatant, plast mononuklearnih celic in fikola. Granulocite smo s pipeto prenesli v sterilno 50 ml centrifugirko in dolili 45 ml raztopine za lizo eritrocitov, premešali z obračanjem in inkubirali na sobni temperaturi 10 min. Nato smo vzorce centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Po centrifugiranju smo supernatant previdno odlili, skupek celic razbili z mešanjem na orbitalnem mešalniku in dodali 25 ml raztopine za lizo eritrocitov. Ponovno smo premešali z obračanjem in inkubirali na sobni temperaturi 10 min ter po inkubiranju vzorce centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Supernatant smo odlili in granulocite s pipeto prenesli v manjšo 15 ml sterilno epruveto. V epruveto smo dolili 14 ml 1 x fosfatnega pufra s soljo (PBS), premešali z obračanjem in centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Nato smo odlili supernatant, celice raztopili v preostali tekočini in dolili 12 ml 1 x fosfatnega pufra s soljo (PBS). Premešali z obračanjem in centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Po končanem spiranju granulocitov s fosfatnim pufrom s soljo smo odlili supernatant in odpipetirali še vso preostalo tekočino nad celicami. Nato smo uravnali koncentracijo celic na 5 10 6 celic v 200 µl raztopine PBS. Število celic smo prešteli s pomočjo 17
hematološkega analizatorja (Beckman Coulter LH 750 Analyzer). Te celice smo nato prenesli v 1,5 ml sterilno mikrocentrifugirko, ki ni vsebovala encimov RNaz in DNaz. Vzorec izoliranih granulocitov smo shranili v zamrzovalnik (-20 ºC). 3.2.2 Izolacija celokupne DNA iz granulocitov Reagenčni komplet QIAamp DNA Mini Kit (kat. št. 51304, QIAGEN) je namenjen izolaciji celotne DNA iz različnih bioloških vzorcev, kot so polna kri, plazma, serum, kostni mozeg in celice, vključno granulociti in mononuklearne celice. Reagenčni komplet se lahko uporablja na svežih ali zamrznjenih vzorcih krvi, ki so jim dodani različni antikoagulanti (EDTA, citrat, heparin). Reagenti, pribor in aparature: 1 fosfatni pufer s soljo (PBS) QIAamp DNA Mini Kit (kat. št. 51304, QIAGEN), ki vsebuje: - pufer AL pufer za lizo celic; - pufer ATL; - pufer AW1, ki se mu pred začetkom uporabe doda 25mL absolutnega etanola; - pufer AW2, ki se mu pred začetkom uporabe doda 30mL absolutnega etanola; - pufer AE; - proteinaza K; - filtrirne epruvetke z volumnom 700 µl; - zbiralne epruvetke z volumnom 2 ml (sterilne, brez prisotnih encimov RNaz in DNaz); pipete in nastavki za pipete (10 100 µl, 100 1000 µl Eppendorf); 1,5 ml mikrocentrifugirke (Eppendorf Safe-lock tubes; Eppendorf Biopur); stojalo za mikrocentrifugirke; komora, ki omogoča sterilno delo (Iskra Pio LFVP 12); centrifuga Biofuge Pico (Heraeus); orbitalni mešalnik; termoblok TDB-120 (Biosan). 18
Postopek: Pred začetkom izolacije smo segreli termoblok TDB-120 (Biosan) na 56 ºC. Vzorce s 5 x 10 6 celic resuspendiranih v 200 µl pufra PBS smo segreli na sobno temperaturo. K 200 µl vzorca celic smo dodali 20 µl proteinaze K in 200 µl pufra AL. Zaprte mikrocentrifugirke smo dobro (15 20 s) premešali z vorteksiranjem in nato še kratko centrifugirali ( spin down ) v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Nato smo vzorce vstavili v termoblok in jih inkubirali 10 min pri 56 ºC. Po končani inkubaciji smo k vzorcu celic dodali 200 µl absolutnega etanola. Dobro (15 20 s) premešali z vorteksiranjem in kratko centrifugirali ( spin down ) v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Medtem smo si v stojalu za mikrocentrifugirke sestavili zbiralne epruvete s kolonami in nanje prenesli celotno raztopino iz mikrocentrifugirk. Nato smo centrifugirali 1 min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Po končanem centrifugiranju smo zavrgli zbiralno epruveto in znova sestavili kolono z novo zbiralno epruveto. K vzorcu celic smo dodali 500 µl pufra AW1 in centrifugirali 1 min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Ponovno smo zavrgli zbiralno epruveto in sestavili novo zbiralno epruveto s kolono. Dodali smo 500 µl pufra AW2 in centrifugirali 3 min na 13000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Kolone smo nato vstavili v 1,5 ml mikrocentrifugirke, ki so bile RNaz in DNaz proste. Dodali smo 200 µl pufra AE ter inkubirali 5 min na sobni temperaturi. Nato smo centrifugirali 1 min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Po končanem centrifugiranju smo kolone zavrgli, v mikrocentrifugirki nam je ostal le še eluat DNA. Mikrocentrifugirke z DNA smo shranili v zamrzovalniku (-20 C). 19
3.2.3 Merjenje koncentracije in čistoče vzorcev DNA Vzorcem z izolirano DNA smo pred nadaljnjo analizo najprej izmerili koncentracijo DNA ter preverili njeno čistočo, saj smo za reakcijo potrebovali 25ng vzorčne DNA. To smo določili s pomočjo spektrofotometra Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio), z merjenjem absorbance pri treh valovnih dolžinah 260 nm (A 260 ), 280 nm (A 280 ) in 320 nm (A 320 ). S spektrofotometrično metodo mora biti izmerjena absorbanca (A 260 ) večja od 0,15. Če je A 260 = 1, pomeni, da smo imeli v vzorcu 50 µg/ml DNA. Ta povezava velja samo pri nevtralnem ph. Čistočo vzorcev smo preverjali z določanjem razmerja absorbance pri valovni dolžini 260 in 280 nm in odštetjem tega razmerja od absorbance pri valovni dolžini 320 nm. Predpostavljamo, da je čistoča DNA ustrezna, če je razmerje A 260 /A 280 = 1,7-2,0. V primeru, da je razmerje A 260 /A 280 manjše od 1,7, so v vzorcu lahko prisotni proteini in/ali aromatske spojine (npr. fenol). Razmerje A 260 /A 280 > 2,0 nakazuje, da je v vzorcu lahko prisotna RNA. Reagenti, pribor in aparature: raztopine za spiranje spektrofotometra: - 70 % etanol, - 0,1 M in 1 M NaOH, - redestilirana voda, - DNaza in RNaza prosta deionizirana voda, 2 ml epruvetke (Eppendorf, BioPure); spektrofotometer Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio). Postopek: V sterilno 2 ml epruvetko (Eppendorf, BioPure) smo odpipetirali 45 μl deionizirane vode in dodali 5 μl vzorčne DNA ter dobro premešali. Nato smo zagnali program Lambda 20 Bio in z ukazom Wp določili aplikacijo DNA ter pričeli z merjenjem absorbanc. 20
3.2.4 Kvantitativna določitev mutacij MPL W515L in MPL W515K z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času Za določitev izražanja mutacij MPL W515L in MPL W515K smo uporabili kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času z uporabo hidrolizirajočih sond. V reakciji smo uporabili smerni in protismerni oligonukleotidni začetnik ter par sond označenih s 5' reporterskim barvilom. Pri alelni diskriminaciji reakcijska mešanica vsebuje za vsak alel specifično fluorescenčno označeno sondo (v našem primeru je bil mutiran alel označen z reporterskim barvilom FAM TM, nemutiran pa z VIC ), kar omogoča spremljanje pomnoževanja posameznega alela (17). Reagenti, pribor in aparature: univerzalna reakcijska mešanica TaqMan Universal PCR Master Mix 2X (Applied Biosystems); reagenčni komplet MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen), ki je sestavljen iz: - IPSOGEN PPM MPL W515L 10X (kat. št. PF-000552) je mešanica specifičnih smernih in protismernih oligonukleotidov za gen MPL ter specifičnih sond za mutacijo (W515L) FAM TM in divji tip VIC ; - IPSOGEN PPM MPL W515K 10X (kat. št. PF-000553) je mešanica specifičnih smernih in protismernih oligonukleotidov za gen MPL ter specifičnih sond za mutacijo (W515K) FAM TM in divji tip VIC ; - PC-W515L (pozitivna kontrola) (kat. št. PF-000547); - PC-W515K (pozitivna kontrola) (kat. št. PF-000548); - NC-MPL (negativna kontrola) (kat. št. PF-000549); - COS-MPL W515L (Cut Off Sample oz. razmejitveni vzorec) = 1,5 % W515L/WT (kat. št. PF-000550); - COS-MPL W515K (Cut Off Sample oz. razmejitveni vzorec) = 1,5 % W515K/WT (kat. št. PF-000551); redestilirana voda (brez encimov DNaz in RNaz); sterilne pipete in nastavki za pipete (10 100 µl, 0,5 10 µl Eppendorf); avtomatska pipeta (Multipipette stream, Eppendorf); komora, ki omogoča sterilno delo (Holten LaminAir); orbitalni mešalnik Multi-Spin MSC-6000 (Biosan) 21
mikrotitrska ploščica ABI PRISM TM 96-well Optical Reaction Plate; ciklični pomnoževalnik ABI PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems). Postopek: Reakcijo smo izvedli po navodilu priloženem kompletu MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen Cancer Profiler, december 2008). Vzorce in reagente smo najprej prenesli iz zamrzovalnika in jih odtalili na sobni temperaturi. Nato smo jih premešali z orbitalnim mešalnikom in kratko centrifugirali ( short spin ). Vzorce in reagente smo ves čas hranili na hladnem, raztopini IPSOGEN PPM W515L/K pa smo še dodatno zaščitili pred svetlobo z aluminijasto folijo, ker sta vsebovali fluorescenčni barvili. Najprej smo v dve 1,5 ml mikrocentrifugirki pripravili za ustrezno število reakcij reakcijski mešanici za MPL W515L in MPL W515K in pri tem zaradi izgub pri pipetiranju prišteli še 2 dodatni reakciji. Pripravljeni reakcijski mešanici smo z aluminijasto folijo zaščitili pred svetlobo, rahlo premešali in kratko centrifugirali ( short spin ). Vsaka reakcija je vsebovala v dvojniku pozitivno in negativno kontrolo, razmejitveni vzorec (Cut- Off Sample), slepo kontrolo (DNaza in RNaza prosta voda) in do 20 preiskovanih vzorcev. Preglednica III: Sestava reakcijske mešanice za MPL W515L in MPL W515K REAGENT TaqMan Universal PCR Master Mix 2x IPSOGEN PPM-MPL W515L ali MPL W515K 10x RNaza, DNaza prosta voda Celotna reakcijska zmes Volumen za 1 vzorec 12,5 µl 2,5 µl 5 µl 20 µl Nato smo si pripravili mikrotitrsko ploščico in v posamezne vdolbinice z avtomatsko pipeto napipetirali 20 µl ustrezne reakcijske mešanice (Slika 5). V vsako vdolbinico, kjer je že bila reakcijska mešanica, smo dodali 5 µl vzorca, tako da je bil končni volumen reakcijske mešanice 25 µl. Po nanosu vseh vzorcev smo mikrotitrsko ploščico pokrili s 22
prozorno samolepilno folijo (MicroAmp TM Optical Adhesive Film, Applied Biosystems) in jo centrifugirali 1 min pri 2000 obr./min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A +K MPL W515L +K MPL W515L NC NC COS COS +K MPL W515K +K MPL W515K Slika 5 : Shema nanosa reakcijskih mešanic in vzorcev na mikrotitrsko ploščico (Legenda: +K MPL W515L/K= pozitivna kontrola, NC= negativna kontrola, COS= razmejitveni vzorec (Cut-Off Sample), H 2 O (RNaz in DNaz prosta voda). Z oranžno barvo so označeni prostorčki, kjer smo določali prisotnost mutacije W515L, z rumeno barvo pa so označeni prostorčki, kjer smo določali prisotnost mutacije W515K. NC NC COS COS B H 2 O H 2 O Vz.1 Vz.1 Vz.2 Vz.2 H 2 O H 2 O Vz.1 Vz.1 Vz.2 Vz.2 C Vz.3 Vz.3 Vz.4 Vz.4 Vz.5 Vz.5 Vz.3 Vz.3 Vz.4 Vz.4 Vz.5 Vz.5 D Vz.6 Vz.6 Vz.7 Vz.7 Vz.8 Vz.8 Vz.6 Vz.6 Vz.7 Vz.7 Vz.8 Vz.8 E Vz.9 Vz.9 Vz.10 Vz.10 Vz.11 Vz.11 Vz.9 Vz.9 Vz.10 Vz.10 Vz.11 Vz.11 F Vz.12 Vz.12 Vz.13 Vz.13 Vz.14 Vz.14 Vz.12 Vz.12 Vz.13 Vz.13 Vz.14 Vz.14 G Vz.15 Vz.15 Vz.16 Vz.16 Vz.17 Vz.17 Vz.15 Vz.15 Vz.16 Vz.16 Vz.17 Vz.17 H Vz.18 Vz.18 Vz.19 Vz.19 Vz.20 Vz.20 Vz.18 Vz.18 Vz.19 Vz.19 Vz.20 Vz.20 Mikrotitrsko ploščico smo prenesli v ciklični pomnoževalnik ABI PRISM 7000 SDS in zagnali program absolutne kvantifikacije. Preglednica IV: Pogoji qpcr qpcr program Temperatura Čas Št. ponovitev 50 2 min 1x 95 10 min 1x 92 15 s 50x 60 1 min Po končani reakciji je sledila še alelna diskriminacija (ang.: Allelic Discrimination, Post- Read; sledili smo navodilom za uporabo aparata ABI PRISM 7000 SDS, User Guide, Applied Biosystems 2001). Aparat je pri 60 ºC izvedel 1 cikel in zaznal jakost fluorescence posameznega barvila. 23
Preglednica V: Alelna diskriminacija- program Post read Temperatura Čas Št. ponovitev 60 ºC 1 min 1x 3.3 STATISTIČNA OBDELAVA VZORCEV Statistično obdelavo vzorcev smo izvedli s pomočjo statističnega programa SPSS (Statsoft Inc, ZDA). Kot parametre opisne statistike smo določili povprečno vrednost, standardno deviacijo in koeficient variacije. 24
4 REZULTATI IN RAZPRAVA Pri večini bolnikov s policitemijo rubro vera (PRV) in pri približno polovici bolnikov z ET in PM lahko dokažemo pridobljeno somatsko mutacijo JAK2 V617F. Nadaljnje raziskave so pokazale, da v približno 1-9 % bolnikov z ET in v 5-11 % bolnikov s PM ugotovimo somatske mutacije v genu za trombopoetinski receptor MPL. Slednje se pri drugih MPN pojavijo redko. Določitev mutacije JAK2 V617F in mutacij v genu MPL sta pomembni dodatni preiskavi pri postavitvi diagnoze mieloproliferativnih novotvorb (2). Glede na pomen določanja mutacij v MPL smo se odločili preiskavo vpeljati v redno delo Specializiranega hematološkega laboratorija in določiti odstotek pojavljanja mutacij W515L in W515K pri populaciji 77 bolnikov z ET. Prisotnost pridobljenih mutacij MPL W515L/K smo določili s pomočjo reagenčnega kompleta MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen) na aparatu ABI PRISM 7000 SDS. Po navodilu priloženem kompletu MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen Cancer Profiler, december 2008), smo za reakcijo potrebovali 25 ng vzorčne DNA s čistočo A 260 /A 280 =1,7-2,0. Zato smo najprej izmerili koncentracijo in čistočo vzorcev DNA s pomočjo spektrofotometra Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio). MPL MutaScreen TM Kit (Ipsogen) je raziskovalno orodje namenjeno natančni detekciji mutacij MPL W515L in MPL W515K ter določanju deleža mutiranega alela v genomski DNA. Metoda je osnovana na verižni reakciji s polimerazo v realnem času s hidrolizo fluorescenčno označenih oligonukleotidnih sond. Princip določanja genotipa pa je alelna diskriminacija. Izvedli smo štiri analizne preizkuse, kjer smo istočasno določali tako mutacijo MPL W515L, kot tudi mutacijo MPL W515K. Pri vsakem analiznem preizkusu smo najprej izvedli qpcr, da smo pridobili zadostno količino produkta PCR. Pridobili smo podatke o vrednosti Cq, ki je sorazmerna številu kopij DNA segmenta v začetku reakcije. Z določanjem vrednosti Cq in analize teh podatkov smo pridobili povprečno vrednost, standardni odklon in koeficient variacije vrednosti Cq za posamezen genotip. Pri rednem 25
delu nam te vrednosti lahko služijo kot kontrola natančnosti določanja prisotnosti mutacij MPL W515L/K v različnih preizkusih. Po končanem qpcr smo izvedli še alelno diskriminacijo, kjer smo izmerili intenziteto fluorescence posameznega barvila. Preizkuse smo opravili v dvojniku. Iz dobljenih vrednosti intenzitete fluorescence reporterskih barvil za mutiran (barvilo FAM TM ) in nemutiran (barvilo VIC ) alel smo za vsak vzorec najprej izračunali povprečno vrednost mutiranega in nemutiranega alela, nato razmerje med povprečno vrednostjo mutiranega in nemutiranega alela (povprečje FAM TM /povprečje VIC oz. povprečje alel Y/povprečje alel X) in to razmerje primerjali z razmerjem mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca ((vzorec povprečje alel Y/povprečje alel X)/ (razmejitveni vzorec povprečje alel Y/povprečje alel X)). Če je bilo to razmerje 1 je bil vzorec pozitiven za mutaciji MPL W515L/K, če je bilo razmerje < 1 pa je bil vzorec WT za mutaciji MPL W515L/K. Razmejitveni vzorec vsebuje 1,5 % mutiranega alela W5151L ali W515K. Pomeni tudi občutljivost detekcije našega analitskega sistema. 4.1 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE DNA IZOLIRANE IZ GRANULOCITOV PERIFERNE KRVI Podatki o čistoči DNA kažejo na to, da reagenčni komplet QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) omogoča izolacijo DNA ustrezne čistoče (A 260 /A 280 =1,7-2,0) in zadovoljive koncentracije. V našem primeru sta le dva vzorca (J2170 in J2123) odstopala od predpisanega intervala ustrezne čistoče, vendar smo ju kljub temu vključili v raziskavo in ugotovili, da neustrezna čistoča ni vplivala na rezultat qpcr in alelne diskriminacije (glej rezultate v preglednici VIII in preglednici IX). Povprečna koncentracija izolirane DNA je znašala 90,88±51,72 ng/μl. Povprečno razmerje (A 260 /A 280 ) je znašalo 1,8±0,1, razpon od 1,6 do 2,0. 26