Univerza v Mariboru Fakulteta za naravoslovje in matematiko Oddelek za biologijo MAGISTRSKO DELO Tea Kelc Maribor, 2018

Univerza v Mariboru Fakulteta za naravoslovje in matematiko Oddelek za biologijo MAGISTRSKO DELO Tea Kelc Maribor, 2018

Univerza v Mariboru Fakulteta za naravoslovje in matematiko Oddelek za biologijo Vpliv genetske osiromašenosti na sposobnost preživetja majhnih populacij redkih rastlin: primer severne linejevke (Linnaea borealis) MAGISTRSKO DELO Influences of genetic impoverishment on survival ability of small populations of rare plants: the twinflower (Linnaea borealis) case Mentorica: doc. dr. Nataša Pipenbaher Somentor: prof. dr. Mitja Kaligarič Somentorica: izred. prof. dr. Metka Šiško Maribor, 2018

IZJAVA O AVTORSTVU IN ISTOVETNOSTI TISKANE IN ELEKTRONSKE OBLIKE MAGISTRSKEGA DELA Ime in priimek študentke: Tea Kelc Študijski program: Biologija in ekologija z naravovarstvom Naslov zaključnega dela: Vpliv genetske osiromašenosti na sposobnost preživetja majhnih populacij redkih rastlin: primer severne linejevke (Linnaea borealis) Mentorica: doc. dr. Nataša Pipenbaher Somentor: prof. dr. Mitja Kaligarič Somentorica: izred. prof. dr. Metka Šiško Podpisana študentka Tea Kelc izjavljam, da je zaključno delo rezultat mojega samostojnega dela, ki sem ga izdelala ob pomoči mentorice; izjavljam, da sem pridobila vsa potrebna soglasja za uporabo podatkov in avtorskih del v magistrskem delu in jih v magistrskem delu jasno in ustrezno označila; na Univerzo v Mariboru neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno prenašam pravico shranitve avtorskega dela v elektronski obliki, pravico reproduciranja ter pravico ponuditi zaključno delo javnosti na svetovnem spletu preko DKUM; sem seznanjena, da bodo dela deponirana/objavljena v DKUM dostopna široki javnosti pod pogoji licence Creative Commons BY-NC-ND, kar vključuje tudi avtomatizirano indeksiranje preko spleta in obdelavo besedil za potrebe tekstovnega in podatkovnega rudarjenja in ekstrakcije znanja iz vsebin; uporabnikom se dovoli reproduciranje brez predelave avtorskega dela, distribuiranje, dajanje v najem in priobčitev javnosti samega izvirnega avtorskega dela, in sicer pod pogojem, da navedejo avtorja in da ne gre za komercialno uporabo; dovoljujem objavo svojih osebnih podatkov, ki so navedeni v magistrskem delu in tej izjavi, skupaj z objavo zaključnega dela; izjavljam, da je tiskana oblika zaključnega dela istovetna elektronski obliki zaključnega dela, ki sem jo oddala za objavo v DKUM. Datum in kraj: Podpis: II

Vpliv genetske osiromašenosti na sposobnost preživetja majhnih populacij redkih rastlin: primer severne linejevke (Linnaea borealis) Rastline, ki so omejene na majhne in izolirane populacije, so bolj občutljive na podnebne, življenjske in biogenetske dejavnike. V raziskavo smo vključili dve majhni izolirani populaciji severne linejevke (Linnaea borealis L.) iz vzhodnih Alp in eno populacijo iz osrednjega borealnega območja na Švedskem. Namen magistrskega dela je bil z uporabo mikrosatelitskih markerjev dokazati, da je rastlinska vrsta (L. borealis) na omenjenih območjih prisotna v več klonih. Ugotavljali smo tudi, ali je genetska variabilnost obeh alpskih izoliranih populacij iz Slovenije in Avstrije zmanjšana glede na borealno populacijo iz Skandinavije. Na devetih mikrosatelitnih lokusih A5, A102, D100a, D7, D110, D118, A112, B119 in C105 smo pri 45 vzorcih (15 iz vsakega območja) skupaj namnožili 70 alelov, v povprečju 7,78 alela na lokus. Genetske razdalje analiziranih genotipov smo izračunali z Diceovim koeficientom in izdelali dendrogram ter multivariatno analizo. Ugotovili smo zelo nizke genetske razlike v obeh izoliranih populacijah in zelo visoke genetske razlike med obema populacijama, čeprav je med njima le 73 km zračne razdalje. Sklepamo, da sta zaradi visoke genetske variabilnosti med njima obe izolirani alpski populaciji glacialna relikta, najverjetneje zaradi zaporednih ozkih grl in dolgoročne izolacije v posebnih okoljskih pogojih. Izolirani populaciji L. borealis nista popolnoma izgubili svoje sposobnosti spolnega razmnoževanja, zato je»in-situ«preživetje še zmeraj mogoče. Vendar pa so glacialni relikti običajno povezani z ranljivimi habitati, ki si zaslužijo nujno pozornost zaradi preživetja z ohranjanjem in s posebnimi protiukrepi, zlasti z vidika globalnega segrevanja. Ključne besede: glacialni relikt, mikrosateliti, molekulski markerji, razpršena porazdelitev območja, vzhodne Alpe Influences of genetic impoverishment on survival ability of small populations of rare plants: the twinflower (Linnaea borealis) case Plants occurring under small and isolated populations are more vulnerable to climatic, habitat and biogenetic factors. We studied two small isolated populations of twinflower (Linnaea borealis L.) from the Eastern Alps and one population from the core Boreal distributional range in Sweden. The purpose of the thesis was, using microsatellite markers, to prove that the plant species (L. borealis) is in the Eastern Alps region present in several clones. We also examined whether the genetic variability of both alpine isolated populations from Slovenia and Austria was reduced due to the boreal population from Scandinavia. Nine microsatellite loci (A5, A102, D100a, D7, D110, D118, A112, B119, C105) were taken into account, 45 samples were examinated (15 from each area) and 70 alleles were exhibited with an average of 7.78 alleles per loci. The genetic distances of the analyzed genotypes were calculated by Dice coefficient to form a dendrogram and multivariate analysis. We found very low genetic variability in both isolated populations and very high genetic variability between the two populations, despite there is only 73 km of air distance between them. We conclude that because of the high genetic variability between them, both isolated alpine populations are glacial relict populations, probably due to III

consecutive bottlenecks and long-term isolation in particular environmental conditions. The isolated populations of the L. borealis in the Eastern Alps have not completely lost their sexual reproduction capacity, so in-situ survival is still possible. However, glacial relics are usually associated with vulnerable habitats which deserve urgent attention to survive involving conservation and special countermeasures especially in terms of global warming. Keywords: glacial relict, microsatellites, molecular markers, disjunct distributional range, Eastern Alps IV

KAZALO VSEBINE 1 UVOD... 1 2 PREGLED LITERATURE... 2 2.1 POPULACIJE GLACIALNIH RELIKTOV... 2 2.2 FRAGMENTACIJA HABITATA IN POPULACIJ... 2 2.3 IZGUBA GENETSKE VARIABILNOSTI... 3 2.4 SEVERNA LINEJEVKA (Linnaea borealis)... 5 2.4.1 Spolno in nespolno razmnoževanje vrste... 6 3 NAMEN IN HIPOTEZE RAZISKAVE... 8 3.1 PREDPOSTAVKE IN MOREBITNE OMEJITVE... 8 4 MATERIALI IN METODE... 9 4.1 MATERIALI... 9 4.1.1 Območje raziskave... 9 4.1.2 Kemikalije... 12 4.1.3 Pribor in oprema... 13 4.2 METODE... 14 4.2.1 Odvzem rastlinskega materiala... 14 4.2.2 Izolacija dnk... 14 4.2.3 Flourimetrično merjenje koncentracije dnk... 15 4.2.4 Agarozna gelska elektroforeza... 15 4.2.5 Redčenje dnk... 15 4.2.6 Verižna reakcija s polimerazo (pcr)... 16 4.2.7 Mikrosatelitski markerji... 18 4.2.8 Kapilarna elektroforeza... 18 4.2.9 Analiza rezultatov... 19 V

5 REZULTATI Z DISKUSIJO... 20 5.1 IZOLACIJE IN KONCENTRACIJE IZOLIRANE DNK... 20 5.2 NAMNOŽEVANJE S PCR IN MIKROSATELITI... 22 5.3 KAPILARNA ELEKTROFOREZA... 24 5.4 PREŽIVETVENA SPOSOBNOST VRSTE... 25 6 SKLEPI... 32 ZAHVALA... 34 7 LITERATURA... 35 VI

KAZALO SLIK Slika 1: Severna linejevka (Linnaea borealis)... 5 Slika 2: Lokacija študijskega področja populacije L. borealis; Slovenija... 10 Slika 3: Lokacija študijskega področja populacije L. borealis; Avstrija... 10 Slika 4: Lokacija študijskega področja populacije L. borealis; Švedska... 11 Slika 5: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Švedska... 20 Slika 6: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Avstrija... 21 Slika 7: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (D110a)... 23 Slika 8: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (D7)... 23 Slika 9: Dolžina fragmenta vzorca SE14 v obliki vrha na mikrosatelitskem lokusu D118... 24 Slika 10: DCA ordinacijski diagram matrike 45 genotipov L. borealis... 28 Slika 11: Dendrogram, ki opisuje genetske povezave med 45 genotipi L. borealis... 29 VII

KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Zaporedje parov začetnih oligonukleotidov... 16 Preglednica 2: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo temperaturni gradient.... 17 Preglednica 3: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo temperaturni gradient.... 18 Preglednica 4: Izmerjena koncentracija DNK v posameznih vzorcih... 21 Preglednica 5: Parametri genetske variabilnosti posameznih mikrosatelitskih lokusov... 25 Preglednica 6: Dolžina alelov (bp) in frekvenca alelov 45 genotipov L. borealis... 26 VIII

1 UVOD Populacije glacialnih reliktov so ostanki arealov arktično-alpinskih vrst. Nastale so kot rezultat premika arealov med glaciacijo in interglaciali. Le-te imajo danes vedno večji naravovarstveni pomen, ker so naselila območja, kjer vladajo ekološko ekstremne, stresne razmere. Ta območja se zaradi podnebnih sprememb zdaj hitro spreminjajo (Vogler in Reisch, 2013). Zaradi hitro spreminjajočega okolja je prišlo do izgube in fragmentacije habitatov. Posledično so številne rastlinske vrste postale redke in omejene na majhne in zelo izolirane populacije s povečanim tveganjem za lokalno ali globalno izumrtje (Saunders in sod., 1991; Schemske in sod., 1994). Zaradi velikih razdalj med izoliranimi populacijami se zmanjšuje možnost prenosa in raznašanja semen (Wilcock in Neiland, 2002). Problem majhnih populacij redkih rastlinskih vrst nastane zaradi zmanjšanja ali celo nepopolnega uspeha spolnega razmnoževanja (Warburton in sod., 2000; Wolf in Harrison, 2001; Fischer in sod., 2003; Aigner, 2004; Scobie in Wilcock, 2009). Vsi omenjeni problemi pa so še večji, kadar gre za vrsto, ki potrebuje navzkrižno oprašitev (Wroblewska, 2013). Takšen primer je karizmatična rastlina severna linejevka (Linnea borealis), borealno-alpinska vrsta, ki je v strmem upadanju v Evropi (Scobie in Wilcock, 2009). 1

2 PREGLED LITERATURE 2.1 POPULACIJE GLACIALNIH RELIKTOV Pleistocenske glaciacije na severni polobli so povzročile velike kvantitativne in kvalitativne spremembe v različnih skupinah organizmov. Ostanki ledene dobe v zmernih območjih Evrope se kažejo v nepravilnih blokih, morenah, jezerih, šotnih bregovih in v majhni skupini živih organizmov, imenovanih glacialni relikti (Chlebicki, 2002). Izraz»relic«je bil uporabljen za takson, katerega obseg je bil spremenjen zaradi podnebnih dejavnikov (Jackson, 1965), npr. Pedicularis sudetica Wild. v srednji Evropi, medtem ko je bil izraz relikt (»relict«) uporabljen za običajno stare taksone, npr. Ginkgo biloba L. Vendar pa se v zadnjem času za oba primera uporablja izraz relikt (Hickey in King 2000; Chlebicki, 2002). Glacialni relikti so del podnebnih reliktov (Kornaś Medwecka-Kornaś, 1986). Večina današnjih reliktnih vrst je bila v zadnjem poledenelem obdobju zelo razširjena, ko so bile njihove ekološke zahteve dobro izpolnjene (Cox in Moore, 2006). Danes te vrste niso dobro prilagojene prevladujočim podnebnim razmeram in so zato pogosto zelo redke in lokalizirane, tako da so njihova pojavljanja na splošno dobro dokumentirana (Zimmermann in sod., 2010). 2.2 FRAGMENTACIJA HABITATA IN POPULACIJ Izguba habitata (angl. habitat loss) in fragmentacija oz. drobljenje ter degradacija so najpomembnejši vzroki za upad biodiverzitete (Tilman in sod., 2001). Razdrobljenost se pojavi, ko se velika površina habitata preoblikuje v številne manjše zaplate (angl. patches). Ti so izolirani drug od drugega z matriko habitatov, drugačno od izvirnika (Wilcove in sod., 1986). Ko je pokrajina, ki obdaja drobce, neprimerna za vrste prvotnega habitata in kadar je razpršitev nizka, se lahko ostanki zaplat štejejo za»habitatne otoke«, lokalne skupnosti pa postanejo»izolati«(preston, 1962; Wilcove in sod., 1986). Fragmentiranost habitatov izhaja iz izgube habitatov. Obstajajo trije mehanizmi fragmentacije: prvi mehanizem je mogoče pripisati neposredni izgubi območja habitata (Wilson in sod., 2016); 2

drugi mehanizem je mogoče pripisati spremembam prostorske konfiguracije krajine, kar privede do izolacije (Wilson in sod., 2016). Zmanjšanje skupnega območja habitata torej v prvi vrsti vpliva na stopnjo razpršenosti populacije in posledično na izumrtje (Wilcove in sod., 1986); tretji mehanizem je mogoče pripisati posrednim ali interakcijskim učinkom izgube habitatov in spremembam prostorske konfiguracije (Didham in sod., 2012) ter interakciji fragmentov z matriko (npr. učinek prelivanja) (Wilson in sod., 2016). Prerazporeditev preostale površine v ločene fragmente prvenstveno prizadene razpršenost populacije in s tem stopnjo priseljevanja (Wilcove in sod., 1986). Fragmentacija predstavlja temeljno grožnjo biološki diverziteti, saj zmanjšuje velikost rastlinskih populacij, hkrati pa povečuje prostorsko izolacijo le-teh (Kryštufek, 1999; Young, 1996). Posledično so številne rastlinske vrste postale redke in omejene na majhne in zelo izolirane populacije s povečanim tveganjem za lokalno ali globalno izumrtje (Saunder in sod., 1991; Schemske in sod., 1994). Fragmentacijo spremljajo erozija genetske pestrosti in povečana genetska razhajanja znotraj populacij (Young, 1996). Z manjšanjem velikosti populacij in povečano izoliranostjo se sprožijo negativni dejavniki, kot sta povečan naključni genski zdrs (angl. genetic drift) in povišano križanje v sorodstvu (angl. inbreeding), kar vodi v zmanjšan pretok genov in zmanjšanje heterozigotnosti (Young, 1996; Kryštufek, 1999). Zaradi hitrih okoljskih sprememb, povzročenih predvsem s strani človeških dejavnosti, je fragmentacija krajine povsod prisotna posledica sprememb v okolju. Človeške dejavnosti vplivajo in spreminjajo naravne ekološke in evolucijske procese. Končni rezultat teh sprememb se kaže v izgubi biološke raznovrstnosti in ne nazadnje v izumrtju populacij in vrst (Leimu in sod., 2010). Danes je za ohranjanje in varstvo narave izziv ohraniti čim večje število vrst v razdrobljenih populacijah kljub neprestani grožnji uničenja habitatov (Wilcove, 1986). 2.3 IZGUBA GENETSKE VARIABILNOSTI Geni se prenašajo iz generacije v generacijo. So osnovna enota procesa evolucije in se izražajo v obliki dednih lastnosti organizmov. Dedne lastnosti pa se znotraj populacije razlikujejo. V tem primeru govorimo o genetski variabilnosti (raznolikosti, pestrosti) osebkov 3

(Stolzfus, 2006). Genetska pestrost med osebki iste vrste je nujno potrebna za evolucijo (Dobzhansky, 1964). Genetska variabilnost se tvori zaradi mutacije v genih in prenosa genov med populacijami in vrstami (Stolzfus, 2006). Ekološka prilagodljivost je odločilnega pomena za uspevanje in preživetje populacij. Le-to jim omogoča velika genetska variabilnost (Knapp in Dyer, 1997). K ohranjanju koristnih in zmanjšanju škodljivih mutacij pripomore spolno razmnoževanje (Otto, 2003). Kadar se okolje hitro spreminja, številne rastlinske vrste postanejo omejene na majhen habitat, posledično pa postanejo redke in jim lahko hitro sledi izumrtje (Saunders in sod., 1991; Schemske in sod., 1994). Poleg takojšnjega izumrtja je usodna posledica lahko tudi izguba genetske pestrosti, ki se lahko kaže kot rezultat genskega zdrsa (angl. genetic drift), križanja v sorodstvu in zmanjšanega pretoka genov med populacijami (Young in Brown, 1999). Posledici tega sta izguba v številu in viabilnosti potomcev (Oostermeier in sod., 1995; Fischer in sod., 2003) ter sposobnost prilagoditi se okoljskim spremembam (Willi in sod., 2006). Viabilnost populacije je podatek, s katerim lahko ugotovimo verjetnost za obstoj populacije v prihodnosti (Allendorf in Ryman, 2002). Zmanjšanje števila rastlin na splošno povzroči zmanjšanje genetskih razlik znotraj njihove populacije (Van Treuren in sod., 1991). Majhne populacije, ki jih je povzročila fragmentacija habitatov, so občutljive in jim potencialno grozi nevarnost lokalnega izumrtja (Fischer in Stocklin, 1997; Wilcock, 2002). Male klonske populacije so zaradi izginotja nekaterih genetov precej izpostavljene izgubi genetske variabilnosti; zlasti so občutljive populacije, kjer je število genetov manjše kot število posameznih rastlin znotraj populacije. Iz teh razlogov se postopna izguba genetov iz populacije lahko nadaljuje, dokler populacija ni enoklonska (sestavljena zgolj iz enega genotipa), kar kasneje privede do izumrtja tega geneta (Wilcock, 2002). Trenutno je genet pri klonskih rastlinah opredeljen kot genetski posameznik, ki se razvije iz zigote in vegetativno proizvaja ramete (Scrosati, 2002). Ravno nasprotno pa so lahko bile majhne enoklonske populacije ustvarjene iz zgolj enega semena in so s pomočjo vegetativnega razmnoževanja ohranile populacijo do te mere, da lahko to predstavlja začetek populacije razširjene vrste (Wilcock, 2002). 4

2.4 SEVERNA LINEJEVKA (Linnaea borealis) Severna linejevka (Linnaea borealis L.) (Slika 1) je vednozelen pritlikav grmiček, ki tolerira senco (Wroblewska, 2013). Uvrščamo jo v rod Linnaea, ta pa spada v družino Caprifoliceae (kovačnikovke). Vrstno ime rastline (borealis) se nanaša na njeno severno razširjenost, rodovno ime pa je dobila po Carlu Linneju. Slika 1: Severna linejevka (Linnaea borealis) (Foto: Nataša Pipenbaher). Vrsta L. borealis ima tri podvrste. Te imajo razlike v morfoloških značilnostih, ki se prekrivajo po geografskih območjih (Hulten, 1968; Munz in Keck, 1975; Wroblewska, 2013). Linejevka je cirkumpolarna rastlina (Hulten 1968; Wilcock, 1999; Scobie, 2009; Wroblewska, 2013), kar pomeni, da je razširjena po celem svetu v vlažnih subarktičnih, borealnih ali hladnih zmernih gozdovih (Wroblewska, 2013). L. borealis subsp. borealis raste v borealnem predelu Evrazije in SZ Severne Amerike. L. borealis subsp. americana se pojavlja v borealnem območju Severne Amerike. L. borealis 5

subsp. longifolia pa je omejena predvsem na severozahodno pacifiško regijo. Nam najbližja je L. borealis subsp. borealis (angl. twinflower ime se nanaša na obliko socvetja). Ta raste v iglastih gozdovih od nižin do nadmorskih višin, ki so nad gozdno mejo. V gorah na Norveškem doseže nadmorsko višino 1320 m, v Alpah pa celo 1600 1800 m. Tipičen habitat je iglasti gozd (Wroblewska, 2013). 2.4.1 SPOLNO IN NESPOLNO RAZMNOŽEVANJE VRSTE Severna linejevka je tipična klonalna rastlina, ki ima veliko sposobnost vegetativnega razmnoževanja. Vegetativno razmnoževanje poteka predvsem s stoloni, pri čemer rastlina tvori velike klone, ki se lahko razprostirajo tudi do 10 m daleč. Kloni tvorijo velike zaplate, ki so lahko med seboj zelo oddaljene in stare tudi več sto let (Eriksson, 1988; Niva, 2003; Wroblewska, 2013). Pomlajevalni poganjki, ki se razmnožujejo vegetativno, tvorijo nove ramete, ki imajo potencial, da postanejo neodvisni od materinske rastline. V enem letu proizvedejo cvetoče poganjke povprečno 1 2 % vseh rametov (Niva, 2003). Ramet je definiran kot posamezen klon eden izmed skupine klonov. Je torej posamezna rastlina, ki je vegetativno rastla od drugega posameznika kot klona te rastline, vendar sta obe ločeni (Scrosati, 2002). Rastlinska vrsta (L. borealis) ima sistem poganjkov, ki se deli na dva tipa: glavni (plazeči) in stranski. Glavni poganjek tvori vsako leto listne pare, listi pa so jajčasti in si nasprotni, vedno zeleni in ostanejo tudi do 2 leti. Zakoreninja se vzdolž glavnih poganjkov. Stranski poganjki se razvijejo v zalistjih listov na glavnem poganjku, pri tem pa ima vsak listni par potencial za razvoj enega stranskega poganjka (Eriksson, 1988; 1992). Glede na funkcijo se ti poganjki delijo na: asimilacijske (nespolne), cvetoče (spolno reproduktivne) ali nove glavne oz. pomlajevalne poganjke (Eriksson, 1988; 1992; Niva, 2003). Asimilacijski in cvetoči poganjki so krajši in pokončni (4 6 cm, socvetje doseže višino do 15 cm), pomlajevalni poganjki pa omogočajo vegetativno razmnoževanje. Linejevka ima mehanizme, ki preprečujejo samooploditev, kot je npr. inhibicija nastanka pelodne cevi v vratu (Wilcock in Jennings, 1999). Zanjo je torej značilna gametofitska nezdružljivost (Wilcock in Jennings, 1999; Wroblewska, 2013). Zaradi svoje gametofitske nerazdružljivosti potrebuje linejevka za uspešno oprašitev in oploditev pelod genetsko različnega osebka, ki se razlikuje vsaj za en alel na S-lokusu (Scobie in Wilcock, 2009). Če je 6

ta t. i. kompatibilni partner zaradi določenih razlogov predaleč, ne bo prihajalo do navzkrižnega opraševanja in posledično ne bo tvorbe semen in novih genetov. Problem je torej izguba genetske diverzitete, ki se z neuspehom spolnega razmnoževanja še bolj zmanjšuje. Opraševalci severne linejevke so predvsem dvokrilci (Diptera) in tudi kožekrilci (Hymenoptera). Najpogostejše so manjše muhe iz družine Muscidae. Po uspešni oploditvi plodnica dozori in nastane enosemenski plod (Scobie in Wilcock, 2009). Plod je orešek, ki je obdan z dvema krovnima listoma z žleznimi trihomi (Eriksson, 1992). Plod ima majhen kaveljček, s katerim se pritrdi na krzno živali in perje ptic. Takšen način disperzije semen se imenuje ektozoohorija ali epizoohorija. Kolikor je znano, linejka ne tvori obstojne talne semenske banke (Eriksson, 1992; Wroblewska, 2013). V raziskavi, ki je potekala na Škotskem, so slabo obstojnost semenske banke pripisali pomanjkanju združljivih spolnih partnerjev znotraj populacij in tudi omejenosti gibanja cvetnega prahu (Wilcock in Jennings, 1999; Scobie in Wilcock, 2009; Wroblewska, 2013). 7

3 NAMEN IN HIPOTEZE RAZISKAVE Namen magistrskega dela je dokazati, da je rastlinska vrsta (L. borealis), ki je sicer klonalno uspešna na izoliranih rastiščih v Alpah, prisotna v več klonih. Prav tako želimo dokazati, da je genetska variabilnost obeh alpskih izoliranih populacij iz Slovenije in Avstrije zmanjšana glede na borealno populacijo iz Skandinavije. Vsi odgovori bodo imeli pomembne aplikacije ne le za samo rastlinsko vrsto, katere pomen v Sloveniji je izjemen, temveč za vse vrste, ki so postale redke zaradi fragmentacije habitatov na splošno. Pri raziskovalnem delu v okviru magistrskega dela smo si zastavili naslednji hipotezi: Hipoteza 1: Primerjava genetske variabilnosti med izoliranima populacijama iz Slovenije in Avstrije z borealno populacijo bo pokazala zmanjšano genetsko variabilnost izven borealnega dela areala. Hipoteza 2: S pomočjo ugotavljanja genetske variabilnosti z molekulskimi markerji (mikrosateliti) bomo potrdili, da sta izolirani populaciji v Avstriji in Sloveniji sestavljeni v glavnem iz istega klona, kontrolna populacija na Švedskem pa je sestavljena iz več klonov. 3.1 PREDPOSTAVKE IN MOREBITNE OMEJITVE Omejitve so se pojavile pri sami izolaciji DNK iz rastlinskega materiala, kjer je bilo zahtevno doseči dovolj velike koncentracije DNK za nadaljnje delo, kar najverjetneje pogojuje zgradba rastlinskega materiala. 8

4 MATERIALI IN METODE 4.1 MATERIALI 4.1.1 OBMOČJE RAZISKAVE Pri raziskovalnem delu smo preučevali populacijo L. borealis na treh različnih lokacijah: 1. soteska Nomenj, Slovenija (46,30 N, 14,04 E, nadmorska višina približno 495 m) (Slika 2); 2. Diselingsee v Krških (Gurktalerskih) Alpah na Štajerskem, Avstrija (46,95 N, 13,95 E, nadmorska višina približno 1760 m) (Slika 3); 3. mešani iglasti gozd (škotski bor) zunaj mesta Bollnäs v osrednji Švedski na približno 70 m nadmorske višine (Slika 4). V analiziranih vzorcih iz prve in druge lokacije je bila izolirana alpska populacija v primerjavi s kontrolno populacijo na Švedskem, ki je bila delno znotraj svojega borealnega (cirkumpolarnega) območja. Populacija v Julijskih Alpah je najbolj jugovzhodni kraj pojavljanja L. borealis v Evropi (Wraber, 1963). Na tej lokaciji populacija severne linejevke pripada združbi Rhodothamno-Rhodoretum hirsute (Aichinger) Br.-Bl. in Siss. Laricetosum (Wraber, 1963). 9

Slika 2: Lokacija raziskovalnega območja populacije L. borealis: Soteska Nomenj, Slovenija (na sliki označena s črno barvo) (Vir: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/29/central_ Europe_location_map.svg). Slika 3: Lokacija raziskovalnega območja populacije L. borealis: Diselingsee v Krških Alpah na Štajerskem, Avstrija (na sliki označena s črno barvo) (Vir: https://upload.wikimedia.org/ wikipedia/commons/2/29/centraleuropelocation_map.svg). 10

Slika 4: Lokacija raziskovalnega območja populacije L. borealis: Mešan iglast gozd zunaj mesta Bollnäs, Švedska (na sliki označena s črno barvo) (Vir: https://upload.wikimedia.org/ wikipedia/commons/thumb/9/92/northern_and_central_europe_location_map.svg/819px Northern_and_Central_Europe_location_map.svg.png). V Sloveniji L. borealis raste v Soteski pri Nomenju na nadmorski višini 500 do 520 m. Gre za njeno najjužnejšo točko razširjenosti v Evropi. Tukaj se pojavlja v pasu listnatega (bukovega) gozda skupaj s subalpinsko združbo sleča in slečnika z macesnom. Rastišče, kjer se je pojavila linejevka, je strmo severno pobočje. Tukaj ni močne sončne svetlobe. Zaradi bližine reke je velika zračna vlaga. Pomembna značilnost rastišča je dodatno ohlajanje. Iz številnih odprtin in rež na apnenčasti površini piha hladen zrak, kar bi lahko bil razlog, da rastišča v celoti ne preraste bukov gozd. L. borealis kaže tipično arktično-alpsko razširjenost in v Alpah predstavlja glacialni element (Wraber, 1963). 11

Lokacijo v Krških Alpah na Štajerskem delu v goratem območju sta prvič omenila Ernet in Franz (2011). Nadmorska višina na tem predelu znaša 1850 m. L. borealis sodi na tej lokaciji v združbo Rhododendrum ferruginei Rubel 1911. Obe alpski lokaciji imata severno izpostavljenost, kjer se pod balvani sprošča mrzel zrak, še posebej v poletnem času. Na Švedskem se L. borealis pogosto pojavlja od province Småland in naprej proti severu. Tukaj se tipično pojavlja v iglastih gozdovih, vendar dobro uspeva tudi v gorskih brezovih gozdovih (Niva, 2003). 4.1.2 KEMIKALIJE 4.1.2.1 Kemikalije za izolacijo deoksiribonukleinske kisline (DNK) Za izolacijo DNK smo uporabili naslednje kemikalije: CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) pufer: 2 g CTAB (Merck), 8,18 g NaCl (Kemika), 10 ml 1 M TRIS (ph 8), 4 ml 0,5 M EDTA (ph 8), 200 µl merkaptoetanol (Merck) in destilirana voda; 0,5M EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid), ph 8; TRIS, ph 8; 3M NaAc (natrijev acetat), ph 5,2; TE pufer: 1 M TRIS (ph 8), 0,5 M EDTA (ph 8) in destilirana voda; kloroform (Sigma): izoamilalkohol (Merck) v razmerju 24 : 1; izopropanol; 70 % etanol (Sparmachem). 4.1.2.2. Kemikalije za fluorimetrično merjenje koncentracije DNK Delovno raztopino, v kateri smo merili koncentracijo DNK, so sestavljale naslednje kemikalije: filtrsko steriliziran (0,2 µl premer por) 1x pufer TNE: 10 mm TRIS, 1 nm EDTA, 0,1 M NaCl, ph 7,4); 0,1 µg/ml benzimidazol/hoechst 33258 (Stigma, St. Louis, MO, ZDA). 12

Delovno raztopino smo zmeraj pripravili svežo in jo med delom hranili v temi. V kiveto smo odpipetirali 2 ml delovne raztopine in dodali 2 µl izolirane DNK. 4.1.2.3. Kemikalije za agarozno elektroforezo Za agarozno elektroforezo smo uporabili naslednje kemikalije: 5x TBE pufer za elektroforezo: 54 g TRIS (Sigma), 27,5 g borova kislina (Sigma), 20 ml 0,5 M EDTA (ph 8) in destilirana voda; 1 % agarozni gel: agaroza (Sigma) in 1x TBE pufer; SYBER GREEN: 1 µl SyberGreen (Fluka), 99 µl DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma); DNK velikostni standard 1 kb (Fermentas). 4.1.2.4 Kemikalije za verižno reakcijo s polimerazo (PCR) Sestava PCR-reakcijske mešanice: 5 µl Qiagen Multiplex PCR 10x (Qiagen), 0,5 µl začetnega oligonukleotida 1 (Sigma, ZDA), 0,5 µl začetnega oligonukleotida 2 (Sigma, ZDA), 0,5 µl DNK in 3,5 µl vode brez RNA-ze. Zgoraj naveden postopek priprave PCR-reakcijske mešanice velja za en vzorec. 4.1.2.5. Kemikalije za kapilarno elektroforezo Za kapilarno elektroforezo smo zraven PCR-pomnožkov v vsako odprtino na plošči dodali Formamid (Sigma, St. Luis, MO, ZDA) in dolžinski standard 400 (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, ZDA), na vrh pa kapljico mineralnega olja (Sigma, ZDA), ki je preprečila izhlapevanje. Tako pripravljene vzorce smo analizirali s kapilarno elektroforezo (Beckman Coulter CEQ 8000). 4.1.3 PRIBOR IN OPREMA Pri laboratorijskem delu smo uporabljali laboratorijsko opremo, kot so epruvetke, čaše, erlenmajerice, merilne valje, žličke, steklene palčke in različna stojala. 13

Uporabljali smo tudi standardne laboratorijske aparature, kot so centrifuga (Beckman Coulter), avtoklav (Kambič, Slovenija), aparatura za PCR (Whatman Biometra T-Gradient, Goettingen, Nemčija), avtomatski pipetni nastavki za pipete, digitalna tehtnica, elektroforezna kadička, električni napajalnik za elektroforezo, inkubator, hladilnik, zamrzovalnik, magnetno mešalo in mikrovalovna pečica. 4.2 METODE 4.2.1 ODVZEM RASTLINSKEGA MATERIALA Poleti leta 2015 smo naključno vzorčili rastline na vseh treh raziskovalnih območjih. Da bi preprečili izbiro istih klonov, smo vzeli poganjke, ki so rastli vsaj 3 5 m narazen, kot predlaga Wróblewska (2013). Poganjki so bili shranjeni na hladnem mestu do izolacije DNK v laboratoriju. V raziskavo je bilo vključenih 45 vzorcev L. borealis, 15 za vsako raziskovalno območje. 4.2.2 IZOLACIJA DNK Izolacijo DNK smo izvedli z metodo CTAB iz svežih listov. Postopek izolacije DNK je potekal po protokolu, ki so ga opisali Šiško in sod. (2009), in sicer: 1. Manjši količini svežega rastlinskega materiala (mladi listi) dodamo 1 ml CTAB pufra, segretega na 68 C, in ga v terilnici dobro stremo. Prelijemo v sterilno 2 ml epruvetko. 2. Inkubiramo pri 68 C 1,5 2 h. 3. Dodamo 600 µl topila kloroform : izoamilalkohol v razmerju 24 : 1 in dobro premešamo. 4. Centrifugiramo 10 min pri 11.000 obratih. 5. Previdno odpipetiramo supernatant v novo 1,5 ml epruvetko in dodamo 60 µl NaAc in 600 µl ledeno hladnega izopropanola. 6. Vzorce postavimo v zamrzovalnik za 20 min. 7. Vzorce pretresemo in ponovno centrifugiramo 10 min pri 11.000 obratih. 14

8. Previdno odlijemo supernatant in dodamo 600 µl 70 % etanola. Ob rahlem mešanju počakamo, da se DNK»odlepi«in spere v etanolu. 9. Previdno odpipetiramo etanol in posušimo DNK pri sobni temperaturi ali v sušilniku pri 40 50 C. 10. Dodamo 100 µl TE pufra in postavimo v hladilnik, da se čez noč DNK raztopi. Nato jo hranimo pri 20 C. 4.2.3 FLOURIMETRIČNO MERJENJE KONCENTRACIJE DNK Koncentracijo DNK smo izmerili kvantitativno z miniflourimetrom TK200 (Hoefer Scientific, San Francisco, ZDA) na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede ter kvalitativno s pomočjo gelske elektroforeze. 4.2.4 AGAROZNA GELSKA ELEKTROFOREZA Postopek je bil naslednji: 1. V manjšo erlenmajerico smo zatehtali agarozo. Dolijemo 1x TBE pufer k zatehtani agarozi v erlenmajerici in jo dobro raztopimo v mikrovalovni pečici. 2. Ko se agaroza popolnoma raztopi, ohladimo gel na 50 60 C in ga vlijemo v pripravljen nosilec za gel. Takoj namestimo glavnik za jamice in počakamo, da se gel strdi (15 30 min). 3. Gel prenesemo na nosilec in ga prelijemo z 1x TBE pufrom za elektroforezo. 4. Nanos vzorcev: odpipetiramo po 2 µl DNK in dodamo 3 µl pripravljenega barvila SyberGreen. 4.2.5 REDČENJE DNK Potek redčenja: v epico smo dali 2 µl vzorca DNK in dodali izračunano količino vode. Vzorce smo redčili na koncentracijo 4 ng/µl. Redčenje vzorcev smo preračunali po formuli: izmerjena koncentracija DNK/*2 2 = količina vode. 15

4.2.6 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR) Odseke DNK smo namnožili z verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Uporabili smo 9 začetnih oligonukleotidov: A5, A102, A112, B119, C105, D7, D110, D110a in D118 (Preglednica 1). Liofilizirane začetne oligonukleotide smo najprej redčili na koncentracijo 500 pmol/µ. Ker pa smo v delovni raztopini želeli imeti začetne oligonukleotide s koncentracijo 10 pmol/µl, smo jih nadalje ponovno redčili. Preglednica 1: Zaporedje parov začetnih oligonukleotidov analiziranih lokusov, uporabljenih v študiji rastline L. borealis. Zap. Lokus Začetni oligonukleotidi v smeri 5' proti 3' Barvilo Dolžina št. alelov v bp 1 A5 For: ACA-CAC-TTT-TGA-GGG-CAT-CC Cy 5 172-186 Rev: TGC-TTT-TCC-TTG-TGC-TTC-CT 2 A102 For: CTT-CCA-CCA-CCC-CAA-TGT-A Rev: TAA-CAA-CCA-CCT-TCG-TGT-GC 3 A112 For: CCA-ACA-ACT-ACT-TCG-TCA-CTG Rev: TCC-AAG-AAT-GAG-ACC-ATC-AG Cy 5,5 204-250 Cy 5,5 244-284 4 B119 For: GAT-GGC-ACC-GAT-TGT-TTG Rev: AAA-GGC-TGT-GAA-GTC-GTC-G 5 C105 For: CCA-ATC-CAC-ACA-ACC-CTA-AC Rev: ACC-TCT-CGC-AAG-CAT-CTT-C Cy 5 214-248 Cy 5,5 262-277 6 D7 For: CCT-TAC-GCT-TTG-GAG-ATG-TC Rev: GTG-AGG-CCA-CAG-AGA-AGA-TC 7 D110 For: CCC-AGT-GTT-CAG-TGG-ATT-C Rev: GAT-GGT-GGT-GCT-TTG-TTG 8 D110a For: ACA-AAG-CAC-CAC-CAT-CAC Rev: GCA-AAC-CTT-AGA-TAC-CAA-GTT-G Cy 5 168-192 Cy 5,5 242-244 Cy 5 285-312 9 D118 For: CGG-ACA-TAT-TCC-ACC-CAT-TC Rev: TCC-TGT-AAG-TTT-GGC-CGA-GA Cy 5 177-193 16

PCR-reakcija je bila izvedena z uporabo termocikla Whatman Biometra T-Gradient (Goettingen, Nemčija). Za ugotovitev optimalnih pogojev za PCR-reakcije smo najprej naredili temperaturni gradient. Temperature prileganja, vključene v reakciji, so bile: 55 C, 55,2 C, 55,6 C, 56,2 C, 56,9 C, 57,6 C, 58,4 C, 59,1 C, 60,4 C, 60,8 C in 61 C (Preglednica 2). Preglednica 2: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo temperaturni gradient. PCR-pogoji Čas trajanja reakcije Temperatura ( C) Število ciklov Začetna denaturacija DNK 15 min 94 Denaturacija DNK 30 s 94 40 Prileganje začetnih oligonukleotidov 120 s 55 61 Podaljševanje verige DNK 90 s 72 Inkubacija 30 min 72 Vzdrževanje neskončno 4 Optimalna ugotovljena temperatura za rekombinacijo DNK je znašala za vsak začetni oligonukleotid 60,4 C. PCR-reakcije so nato potekale pod pogoji, predstavljenimi v Preglednici 3. 17

Preglednica 3: Program pomnoževanja s Taq-polimerazo temperaturni gradient. PCR-pogoji Čas trajanja reakcije Temperatura ( C) Število ciklov Začetna denaturacija DNK 15 min 94 Denaturacija DNK 30 s 94 Prileganje začetnih oligonukleotidov 120 s 60,4 40 Podaljševanje verige DNK 90 s 72 Inkubacija 30 min 72 Vzdrževanje neskončno 4 4.2.7 MIKROSATELITSKI MARKERJI Za analizo mikrosatelitov smo uporabili devet mikrosatelitskih lokusov, razvitih s strani A'Hara in sod. (2011). Seznam devetih parov začetnih oligonukleotidov je predstavljen v Preglednici 1. Za detekcijo fragmentov na kapilarni elektroforezi smo začetne oligonukleotide označili z dvema različnima barviloma: Cy 5 in Cy 5,5. Različna barvila smo uporabili zato, da smo lahko v eni reakciji analizirali tri vzorce oz. PCR-pomnožke. 4.2.8 KAPILARNA ELEKTROFOREZA Za analizo na kapilarni elektroforezi je treba dodati optimalno količino PCR-produkta. To količino smo določili na podlagi slike, ki smo jo dobili z agarozno elektroforezo. V večini primerov smo odpipetirali 1 µl PCR-pomožka in ga dodali k 40 µl formamida ter dodali 0,33 µl dolžinskega standarda. Na vrh smo dodali kapljico mineralnega olja. Zaradi optimizacije postopka smo hkrati analizirali več lokusov. Lokuse smo razvrstili v štiri skupine: CE1, CE2, CE3 in CE4. Skupina CE1 predstavlja lokuse A5, A102 in D110a. Skupina CE2 predstavlja lokuse D7, D110 in C112. V skupini CE3 sta lokusa D118 in A112, v skupini CE4 pa lokusa B119 in C105. 18

4.2.9 ANALIZA REZULTATOV Mere variabilnosti, ki smo jih vključili v analizo vrednotenja raznolikosti, so bile naslednje: število alelov na posamezen lokus; PI (probability of identity) verjetnost identitete oz. verjetnost enakih genotipov; pričakovana heterozigotnost (He); dejanska/opažena heterozigotnost (Ho). Dobljeni fragmenti so bili zabeleženi za prisotnost (1) ali za odsotnost (0) fragmenta. Iz teh podatkov (podatki o prisotnosti in odsotnosti določenega alela pri genotipu) smo sestavili binarno matriko. Binarna matrika se je uporabila za izračun koeficientov podobnosti po Dicu (Dice, 1945) s pomočjo računalniškega paketa DARWIN (Perrier in Jacquemond-Collet, 2005). Diceovi koeficienti podobnosti: kjer je: D(ij) = (b + c)/[(2a + (b + c))], a število spremenljivk, ki vsebujejo i + j; b število spremenljivk, ki vsebujejo i, ne pa tudi j; c število spremenljivk, ki vsebujejo j, ne pa tudi i. Za vsak mikrosatelitni lokus smo z računalniškim programom IDENTITY 1.0 (Wagner in Sefc, 1999) izračunali število alelov na lokus (n), frekvenco alelov, opazovano heterozigotnost (Ho), pričakovano heterozigotnost (He) in verjetnost enakih genotipov (PI). Povprečna razdalja med pristopnimi pari je bila pridobljena z upoštevanjem mikrosatelitskih podatkov. Genotipe smo v sorodnostne skupine razvrstili z uporabo metode z algoritmom NJ (angl. neighbour-joining tree). Nato smo z računalniškim paketom DARWIN (Perrier in Jacquemond-Collet, 2005) izdelali dendrogram. Za ugotavljanje podobnosti med vzorci smo izvedli korespondenčno analizo z odstranjenim trendom DCA (angl. Detrended Correspondence Analysis). Analizo smo izvedli s programsko opremo Canoco in CanoDraw avtorjev ter Braak in Šmilauer (2002). 19

5 REZULTATI Z DISKUSIJO 5.1 IZOLACIJE IN KONCENTRACIJE IZOLIRANE DNK V raziskavo smo vključili 45 vzorcev, 15 iz vsakega raziskovalnega območja. Petnajst vzorcev je bilo iz Slovenije (Bled). Označili smo jih kot SI1, SI2, SI3, SI4, SI5, SI6, SI7, SI8, SI9, SI10, SI11, SI12, SI13, SI14 in SI15. Petnajst vzorcev je bilo iz Avstrije. Označili smo jih AT1, AT2, AT3, AT4, AT5, AT6, AT7, AT8, AT9, AT10, AT11, AT12, AT13, AT14 in AT15. Ostalih petnajst vzorcev je bilo iz Švedske, označili smo jih SE1, SE2, SE3, SE4, SE5, SE6, SE7, SE8, SE9, SE10, SE11, SE12, SE13, SE14 in SE15. Preglednica 4 prikazuje izmerjene koncentracije DNK v posameznih vzorcih. Pri vseh uporabljenih vzorcih smo DNK z metodo CTAB uspešno izolirali. Izolacijo DNK smo preverili na agaroznem gelu. Dodano barvilo SyberGreen se je vezalo na fragmente DNK, zato so na gelu vidne frakcije, ki so pod UV-žarki fluorescentno osvetljene. Fotografiranje gela pod UV-žarki nam je dalo vpogled v količino in kakovost izolirane DNK (Sliki 5 in 6). Slika 5: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Proge: 1 15: vzorci izolirane severne linejevke iz Švedske, 16: velikostni standard DNK (1 kb DNK Ladder). 20

Slika 6: Izolirana DNK z elektroforezo v agaroznem gelu. Proge: 2 16: vzorci izolirane severne linejevke iz Avstrije, 1: velikostni standard DNK (1 kb DNK Ladder). Pri agarozni elektroforezi se fragmenti DNK pod vplivom električne napetosti skozi agarozni gel gibajo od negativnega proti pozitivno nabitemu polu. Potovanje fragmentov DNK nam razkriva okvirno dolžino baznih parov analizirane DNK. Preglednica 4: Izmerjena koncentracija DNK v posameznih vzorcih. Legenda: AT(1 15): Avstrija, SI(1 15): Slovenija in SE(1 15): Švedska. Vzorci Koncentracija, izmerjena s fluorimetrom (µg/ml) A1 68,75 A2 69,71 A3 79,63 A4 89,51 A5 98,16 A6 108,8 A7 112,4 A8 117,5 A9 119,5 A10 119,8 A11 129,8 A12 139,5 A13 140,3 A14 141,5 A15 157,5 SI1 53,34 SI2 55,03 SI3 55,19 SI4 56,01 SI5 57,77 SI6 59,71 21

SI7 61,49 SI8 64,67 SI9 70,21 SI10 71,47 SI11 81,79 SI12 83,71 SI13 86,57 SI14 97,12 SI15 134,2 SE1 29,11 SE2 32,23 SE3 32,3 SE4 37,29 SE5 38,09 SE6 39,33 SE7 40,9 SE8 46,75 SE9 46,75 SE10 48,63 SE11 54,65 SE12 55,28 SE13 66,12 SE14 67,05 SE15 120,6 5.2 NAMNOŽEVANJE S PCR IN MIKROSATELITI Za ugotovitev optimalne temperature prileganja začetnih oligonukleotidov v PCR-reakciji smo naredili temperaturni gradient s temperaturami 55 61 C (Sliki 7 in 8). Najboljšo amplifikacijo smo dosegli pri temperaturi 60,4 C (velja za vse začetne oligonukleotide). Pri enem izmed začetnih oligonukleotidov smo v PCR-produktu zaznali nespecifično namnožene fragmente DNK, zato smo ga izločili in delo nadaljevali z ostalimi devetimi začetnimi oligonukleotidi: A5, A102, D100a, D7, D110, D118, A112, B119 in C105. Za nadaljnje analize vseh 45 vzorcev smo uporabljali označene začetne oligonukleotide (Cy 5, Cy 5,5), ki omogočajo detekcijo fragmentov na kapilarni elektroforezi. Pri PCR-reakcijah lahko na uspešnost namnoževanja mikrosatelitskih lokusov vplivajo različni dejavniki: kakovost izolirane DNK, število ciklov, temperature prileganja, razmerja med količinami kemikalij, nenatančno pipetiranje itd. 22

Slika 7: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (lokus D110a), temperaturni gradient 55 61 C. Slika 8: Testiranje primerne temperature za prileganje začetnega oligonukleotida (lokus D7), temperaturni gradient 55 61 C. 23

5.3 KAPILARNA ELEKTROFOREZA Za natančno določitev dolžin fragmentov smo uporabili kapilarno elektroforezo (Beckman Coulter CEQ 8000, Kalifornija, ZDA). Slika 9 nam prikazuje elektroforetske krivulje, iz katerih odčitamo velikosti fragmentov v baznih parih (bp) za posamezen mikrosatelitski lokus. Z dodanim dolžinskim standardom (na sliki krivulja rdeče barve) računalnik izračuna dolžino namnoženih fragmentov. Na Sliki 9 sta prikazana vzorec Š14 in lokus D118 (modre barve, označen s Cy 5). 9 0 0 0 0 169.46 8 0 0 0 0 172.60 7 0 0 0 0 6 0 0 0 0 5 0 0 0 0 4 0 0 0 0 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 160 180 190 Dye Signal 1 0 0 0 0 0 153.19 155.63 155.18 157.91 157.75 159.17 158.88 161.05 160.98 161.85 162.68 163.64 165.36 166.87 166.34 167.91 168.98 169.88 155 160 165 170 175 180 185 190 S iz e ( n t) Slika 9: Dolžina fragmenta vzorca SE14 v obliki vrha na mikrosatelitskem lokusu D118; velikosti so podane v bp. 170.69 172.03 172.96 173.84 174.57 175.97 176.67 177.77 179.02 180.70 181.59 191.05 24

5.4 PREŽIVETVENA SPOSOBNOST VRSTE Z analizo mikrosatelitov smo uspeli namnožiti skupaj 70 alelov na 9 mikrosatelitskih lokusih. Najmanj alelov smo odkrili na mikrosatelitskem lokusu A5 (4), na lokusu D118 (5), na lokusu D110 (6), na lokusih D110a, D7 in C105 (7), na lokusu A102 (10) in največ na lokusih A112 in B119 (12) (Preglednica 5). Preglednica 5: Parametri genetske variabilnosti posameznih mikrosatelitskih lokusov za analiziranih 45 genotipov L. borealis: število alelov (n), opažena stopnja heterozigotnosti (Ho) in pričakovana stopnja heterozigotnosti (He), verjetnost enakosti genotipov (PI). Lokus n Ho He PI A5 4 0,89 0,65 0,33 A102 10 0,82 0,84 0,09 D110a 7 0,87 0,63 0,29 D7 7 0,69 0,74 0,21 D110 6 0,51 0,76 0,17 D118 5 0,58 0,72 0,22 A112 12 0,93 0,86 0,06 B119 12 0,93 0,86 0,07 C105 7 0,98 0,75 0,18 Povprečje 7,78 0,80 0,76 5,15 10-8* * kombinirana verjetnost enakih genotipov (PI) v vseh lokusih (z množenjem) Parametri genetske variabilnosti 9 mikrosatelitskih lokusov so pokazali 70 polimorfnih alelov. Število alelov (Preglednica 5), ugotovljenih na lokusu, je bilo od 4 (A5) do 12 (A112 in B119), in sicer s povprečjem 7,78 alelov na lokus. Opažena heterozigotnost (H0) je znašala med 0,51 (lokus D110) in 0,98 (C105), in sicer s povprečjem 0,80. Pričakovana heterozigotnost (He) je znašala med 0,65 (A5) in 0,86 (lokusa A112 in B119), in sicer s 25

Lokus povprečjem 0,76. Razlike med opaženo in pričakovano heterozigotnostjo so bile preučene za vse preiskovane lokuse. Največja razlika je bila ugotovljena na lokusu D110 (0,25), najnižja pa na lokusu A102 (0,02). Povprečje opažene (0,80) in pričakovane (0,76) heterozigotnosti je bilo precej podobno. Pri 5 od 9 lokusov (A5, D110a, A112, B119 in C105) je bila opažena heterozigotnost višja od pričakovane, vendar pa je bila pri štirih lokusih (A102, D7, D110 in D118) H0 nižja od He. Najbolj informativni lokus za to skupino genotipov je bil A112, in sicer z verjetnostjo enakih genotipov (PI) 0,06, najmanj informativen lokus pa je A5, in sicer z verjetnostjo enakih genotipov (PI) 0,33. Kumulativna verjetnost pridobitve identičnih genotipov z uporabo vseh 9 lokusov je bila dokaj nizka (5,15 10-8 ) (Preglednica 5). Zaradi lažje genotipizacije smo alele na posameznem lokusu poimenovali s črkami A L. Črka A pripada alelu, ki je na lokusu najkrajši, črka B alelu, ki je naslednji najkrajši, do črke L, ki pripada alelu, ki je na lokusu najdaljši. Število alelov se ujema s številom črk. To velja za vsak lokus. Za posamezne alele smo izračunali dokaj nizke frekvence (Preglednica 6). Lokus A5 ima najpogosteje zastopan alel B (171 bp), lokus A102 ima najpogosteje zastopan alel A (184 bp), lokus D110a ima najpogosteje zastopan alel B (270 bp), lokus D7 ima najpogosteje zastopan alel D (160 bp), lokusa D110 in D118 imata najpogosteje zastopan alel C (221 in 175 bp), lokus A112 ima najpogosteje zastopan alel H (243 bp), lokus B119 ima najpogosteje zastopan alel G (222 bp), lokus C105 pa ima najpogosteje zastopan alel D (248 bp). Dolžine alelov (bp) so prikazane v Preglednici 6. Preglednica 6: Dolžina alelov (bp) in frekvenca alelov (v oklepajih) 45 genotipov L. borealis pri devetih mikrosatelitnih lokusih. Aleli A B C D E F G H I J K L A5 163 171 173 191 - - - - - - - - (0,19) (0,43) (0,36) (0,02) A102 184 186 200 202 204 206 208 210 218 220 - - (0,23) (0,02) (0,07) (0,22) (0,03) (0,01) (0,17) (0,04) (0,13) 0,07) D110a 264 270 278 282 284 290 302 - - - - - (0,01) (0,53) (0,17) (0,23) (0,02) (0,01) (0,02) D7 146 156 158 160 162 164 166 - - - - - (0,01) (0,04) (0,24) (0,36) (0,27) (0,07) (0,01) 26

D110 215 219 221 223 227 229 - - - - - - (0,01) (0,29) (0,31) (0,19) (0,13) (0,07) D118 169 172 175 178 182 - - - - - - - (0,28) (0,12) (0,39) (0,03) (0,18) A112 223 227 229 235 237 239 241 243 249 255 257 259 (0,02) (0,03) (0,17) (0,03) (0,04) (0,01) (0,18) (0,20) (0,11) (0,03) (0,14) (0,02) B119 198 202 204 209 211 218 222 224 226 232 234 238 (0,02) (0,09) (0,08) (0,02) (0,01) (0,02) (0,21) (0,02) (0,17) (0,17) (0,17) (0,02) C105 241 243 246 248 250 252 254 - - - - - (0,01) (0,06) (0,04) (0,33) (0,18) (0,31) (0,07) Vrednotenje genetske sorodnosti: s podatki, zabeleženimi za prisotnost (1) ali za odsotnost (0) določenega alela pri genotipu, smo sestavili binarno matriko, ki se je uporabila za izračun koeficientov podobnosti po Dicu (Dice, 1945) s pomočjo računalniškega paketa DARWIN (Perrier in Jacquemond-Collet, 2005). Genotipe smo v sorodnostne skupine razvrstili z uporabo algoritma NJ (angl. neighbour-joining tree) in za grafični prikaz izdelali dendrogram (Slika 11). Nato smo izdelali še multivariatno analizo (Slika 10). Modre številke na dendrogramu imajo vrednosti od 1 do 100. Višja, kot je številka, večja je verjetnost pravilne razporeditve. Multivariatna analiza (Slika 10) in dendrogram (Slika 11) sta razkrila tri ločene skupine (angl. cluster), od katerih vsaka označuje eno lokacijo, vendar so vzorci iz borealne lokacije prisotni v vseh treh skupinah. Vsi vzorci, ki smo jih nabrali na lokaciji v Avstriji, so tvorili svojo skupino, enako so vsi vzorci iz Slovenije razporejeni v svojo skupino. Čeprav smo se izognili vzorčenju istih vzorcev, smo v Sloveniji našli le 8 različnih genotipov (od 15 primerov), v Avstriji pa le 5 (od 15). Na Švedskem je bilo ugotovljenih 14 (od 15) genotipov. Ko opazujemo dolžino vodoravnih linij v dendrogramu, lahko opazimo najvišjo genetsko variabilnost med borealno populacijo kot pričakovano in zelo nizko raznolikost v obeh alpskih populacijah. Presenetljivo sta zelo tesno izolirani populaciji iz Avstrije in Slovenije popolnoma različni in z zelo visokimi variacijami med populacijama. Genetska varianca, ki temelji na devetih mikrosatelitnih lokusih, je pokazala zelo nizko genetsko variabilnost v dveh izoliranih populacijah, kar je bilo pričakovano zaradi relativno majhne pokritosti rastlin in še manjšega, zelo omejenega števila razlikovalnih klonov na obeh mestih. 27

Slika 10: DCA-ordinacijski diagram matrike 45 genotipov L. borealis pri 9 mikrosatelitnih lokusih. Lastne vrednosti DCA: os 1: 18,1; os 2: 26,1. Legenda: črni krogci: Avstrija; zeleni romboidi: Švedska in vijoličasti kvadrati: Bled. 28

Slika 11: Dendrogram, ki opisuje genetske povezave med 45 genotipi L. borealis s treh lokacij (AT = Avstrija, SI = Slovenija, SE = Švedska). 29

Ugotovili smo zelo veliko genetsko raznolikost med obema populacijama (slovensko in avstrijsko), čeprav je med njima le 73 km zračne razdalje. To kaže na zelo slabo razpršilno sposobnost ali pa je celo ni. Kljub temu pa ne smemo podcenjevati odsotnosti neprimernih habitatov. Tako lahko jasno sklepamo, da sta obe izolirani alpski populaciji populaciji glacialnih reliktov, kar menijo tudi raziskovalci Hensen in sod. (2010), Reisch in sod. (2002; 2003) ter Jermakowicz in sod. (2017). Ti raziskovalci pojasnjujejo visoko genetsko variabilnost med populacijami v smislu zaporednih ozkih grl in dolgoročne izolacije. V študiji, ki jo je izvedla Wróblewska (2013), je bila za L. borealis v Evraziji razkrita filogeografska struktura, ki je izhajala iz plastidne DNK, in zmerna raznolikost genoma, ocenjena z markerji AFLP. Identificiranih je bilo šest haplotipov v razponu od Škotske do gorovja Altai (Rusija) in od Norveške do Italije. Vendar je Wróblewska (2013) ugotovila, da čeprav je bila polovica preiskovanih populacij močno izolirana, se je ohranila podobna raven genetske raznovrstnosti v celotnem geografskem območju. Zraven tega ni našla nobene podpore za hipotezo, da sta ozko grlo in/ali križanje v sorodstvu spremljala habitatno razdrobljenost kot dejavnika, ki sta oblikovala genetsko raznolikost. Kar zadeva alpsko populacijo, je Wróblewska (2013) vzorce vzela le v zahodnih Alpah (Aosta, Italija, Les Allues, Francija) in osrednjih Alpah (Zernez, Švica). Vzorci so bili vzeti po razpredelnici distribucije Meusel in Jäger (2011), kjer pa distribucija ni točna (izolirane lise) kot v vzhodnem delu Alp, temveč je prikazana kot območje podrazreda. Vzhodno od črte Innsbruck-Wipp-Valley-BrennerPass-Eisack-Valley-Etsch-Valley obstajajo le raztresena najdišča, ki jih najdemo predvsem v gorovju Hohen Tauren. Od tam in po celotnih preostalih vzhodnih Alpah, z izjemo treh krajev na jugovzhodnih mejah Alp (Ernet in Franz, 2011), L. borealis ni bila najdena nikjer. To je morda razlog za prisotnost štirih od šestih halotipov na zgoraj navedenih lokacijah v zahodnih in osrednjih Alpah. Segrevanje je po koncu zadnje poledenitve v vsakem primeru vplivalo in povzročilo izgubo ustreznega habitata, kar je povzročilo bolj ali manj izrazito fragmentacijo alpske populacije. To je dokončno, vsaj v vzhodnih Alpah, pripeljalo do le nekaj preostalih prostih mest s specifičnimi življenjskimi pogoji, ki so povezani z veliko nadmorsko višino, severno izpostavljenostjo in posebnimi razmerami v tleh. Ernet in Franz (2011) omenjata pobočja, za katera je značilen hladen zrak, ki piha izpod balvanov v poletnem času. To je ravno značilnost Krških Alp na avstrijski lokaciji, še izrazitejša pa je ta značilnost za Sotesko Nomenj v Sloveniji, kjer na izredno nizki nadmorski višini (495 m) v času vegetacijske sezone piha iz lukenj pod ruševinami ledeno hladen zrak. Na strmih severnih pobočjih ni neposrednega 30