MED RAZGL 2000; 39: 3 21 RAZISKOVALNI ^LANEK Matev` Srp~i~ 1 Regeneracija po{kodovanega perifernega `ivca podgane brez celi~ne podpore distalno od mesta po{kodbe 2 Regeneration of Injured Peripheral Rat Nerve without Cellular Support Distally from the Site of Injury IZVLE^EK KLJU^NE BESEDE: suralni `ivec po{kodbe, `ivec regeneracija, Schwannove celice u~inki zdravil, mitomicini, aksoni, podgane Na{ namen je bil preveriti naslednje hipoteze: 1. Za~etna hitra elongacija aksonov, ki se po aksonotmezi regenerirajo brez celi~ne podpore, se kasneje upo~asni ali celo ustavi. 2. ^e dodatno zavremo {e proliferacijo Schwannovih celic v proksimalnem krnu, je upo~asnitev regeneracije po za~etnem obdobju relativne neodvisnosti od celi~ne podpore {e bolj izra`ena. 3. Predhodno kolateralno brstenje, med katerim so aksoni izpostavljeni vplivu NGF, ugodno vpliva na regenerativno sposobnost aksonov, upo~asnitev regeneracije med dolgotrajno izgubo celi~ne podpore distalno od po{kodbe je manj{a ali je celo ni. Za~etna hitra rast senzori~nih aksonov skozi brezceli~ni odsek se po 8 dneh ustavi. Ustavitvi sledi retrakcija aksonov in zmanj{anje {tevila aksonov distalno od po{kodbe. Kasneje se rast zopet vzpostavi, a je zelo po~asna. Aplikacija mitomicina, ki prepre~i proliferacijo Schwannovih celic v proksimalnem krnu, za~etne hitre rasti huje ne prizadene. Po ustavitvi rasti se aksoni umaknejo do mesta po{kodbe, rast se v 6 tednih po po{kodbi ne vzpostavi ve~. Izpostavitev nevronov NGF med predhodnim kolateralnim brstenjem pospe{i za~etno hitro rast v odsotnosti celi~ne podpore, odlo`i zastoj rasti in prepre~i retrakcijo aksonov. [tevilo aksonov distalno od po{kodbe ostane visoko vsaj {est tednov. Schwannove celice v distalnem krnu regenerirajo~im se aksonom zagotavljajo ugodno rastno podlago. Rastni dejavniki iz Schwannovih celic aksonom omogo~ajo elongacijo in prepre~ujejo retrakcijo tudi ~e se rastna podlaga neugodno spremeni. Ob ohranjeni rastni podlagi rastni dejavniki najbr` zmerno pospe{ijo elongacijo regenerirajo~ih se senzori~nih aksonov. 3 ABSTRACT KEY WORDS: sural nerve injuries, nerve regeneration, Schwann cells drug therapy, mitomycins, axons, rats The following hypotheses were examined: 1. Rapid initial elongation of the regenerating axons in crushed nerves observed even in the absence of distal cell support is later slowed down or stops altogether. 2. If, in addition, Schwann cell proliferation in the proximal nerve stump is prevented, the reduction of the axon elongation rate during the prolonged absence of cell support becomes more severe. 1 Matev` Srp~i~, {tud. med., In{titut za patolo{ko fiziologijo, Medicinska fakulteta, Zalo{ka 4, 1000 Ljubljana. 2 Objavljeno delo je bilo nagrajeno s Pre{ernovo nagrado za {tudente v letu 1999.
M. SRP^I^ REGENERACIJA PO[KODOVANEGA PERIFERNEGA @IVCA PODGANE MED RAZGL 2000; 39 3. Prior collateral sprouting which exposes neurons to higher NGF concentrations has a stimulatory effect on axon regeneration in the absence of cell support, therefore the axon regeneration rate is less affected. The rapid initial rate of sensory axon growth through acellular distal nerve segments decreases 8 days after axonotmesis. During the next three weeks, retraction of leading axons towards the site of the lesion occurs and the number of axons distal to the crush site is reduced. Axon growth is resumed thereafter, but at a much lower rate. Mitomycin application, which prevents Schwann cell proliferation in the proximal stump, does not prevent the initial rapid axon elongation in the absence of cell support, but later the axons retract all the way to the crush site and no further growth occurs over 6 weeks. Exposure of regenerating axons to NGF during collateral sprouting enhances the initial elongation rate in the absence of cell support, delays cessation of growth and prevents axon retraction. The number of axons distal to the lesion site remains high. Schwann cells in the distal nerve segment provide and maintain a favourable growth substratum for regenerating axons during a prolonged time period after nerve injury. Growth promoting substances secreted by Schwann cells seem to enable elongation or prevent retraction of axons even in the case of deterioration of the growth substratum. In the presence of good growth substratum, these substances moderately enhance the elongation rate of regenerating sensory axons. 4 UVOD Po{kodbe perifernih `ivcev so kljub izpopolnjeni kirur{ki tehniki {e vedno precej{en terapevtski izziv rekonstruktivni kirurgiji. Zdi se, da pomembnej{ih izbolj{av mikrokirur{kih tehnik danes ni ve~ pri~akovati, zato posku{ajo napredek v zdravljenju zagotoviti predvsem raziskave fiziolo{kih in patofiziolo{kih dogajanj v perifernem `ivcu med razvojem, ob po{kodbi `ivca in ob regeneraciji. Poleg klini~nih izku{enj so nepogre{ljive raziskave na poskusnih `ivalih in celi~nih kulturah. Dandanes veljata kot glavna problema, ki prepre~ujeta uspe{no regeneracijo perifernega `ivca po po{kodbi, usmerjanje aksonov proti napa~nim tar~am in njihova po~asna rast (1). Zato se raziskovalci najbolj posve~ajo ugotavljanju pomena morebitnih snovi, ki regenerirajo~e se aksone usmerjajo (nevro tropne snovi), in snovi, ki spodbujajo njihovo rast (angl. nerve growth promoting substances), torej snovem, ki nastajajo v mikrookolju, skozi katerega regenerirajo~i se aksoni rastejo. Po{kodba perifernega `ivca Po{kodb perifernega `ivca je glede na mehanizem po{kodbe in stopnjo okvare ve~ vrst (1, 2). Najla`ja po{kodba je lokalni metaboli~ni blok, pri katerem zaradi kompresije ali dra`enja `ivca pride do vnetnega odgovora, spremljajo~i edem pa okvari lokalno mikrocirkulacijo. Posledica je lokalen prevodni blok brez strukturnih sprememb aksonov. Huj{a kompresija `ivca lahko povzro~i nevrapraksijo, lokalni prevodni blok z razli~nimi stopnjami demielinizacije, a z ohranitvijo kontinuitete aksonov. Obe po{kodbi se relativno hitro pozdravita, saj ne pride do propada aksonov distalno od po{kodbe in se aksonom ni treba regenerirati. Mo~an stisk `ivca, pri katerem se aksoni prekinejo, imenujemo aksonotmeza. @ivec makroskopsko ni prekinjen, nevrilemske cevke iz bazalnih lamin Schwannovih celic tudi ne, aksoni pa distalno od po{kodbe propadejo. Ohranjenost nevrilemskih cevk omogo~a aksonom, da se regenerirajo vzdol` svojih prej{njih potekov in reinervirajo svoje nekdanje tar~e. Do napa~nega usmerjanja torej ne pride, ta vrsta po{kodbe ima zato ugodno napoved. Povsem druga~e pa je pri nevrotmezi, popolni prekinitvi `ivca, kjer so prekinjene tudi nevrilemske cevke. Tu morajo aksoni tudi po najnatan~nej{i mikrokirur{ki oskrbi prerasti vrzel med obema krnoma. Pri tem vstopajo v nevrilemske cevke distalnega krna naklju~no, zato funkcijsko okrevanje ni nikoli popolno, ne koli~insko (ne regenerirajo vsi aksoni) ne kakovostno (zaradi napa~ne usmeritve), pa tudi ~as do reinervacije je mo~no podalj{an.
MED RAZGL 2000; 39 Spremembe v distalnem krnu Po prekinitvi aksona se v delu `ivca distalno od po{kodbe (distalni krn) spro`ijo zna~ilni procesi, ki jih je sredi prej{njega stoletja opisal Waller, po njem imenovani Wallerjeva degeneracija. Najprej propadejo aksoni: razpadejo mielinske ovojnice vlaken in aksoplazemski citoskelet (3). Drugi do tretji dan po po{kodbi sledi namno`itev celic v distalnem krnu, ki dose`e vrhunec {tirinajsti dan po po{- kodbi. Pride do proliferacije Schwannovih celic (SC) in vdora makrofagov iz cirkulacije (5, 6). [tevilo celic se {tirikrat pove~a, dve tretjini teh celic pa so proliferirajo~e SC (3, 7). Obe vrsti celic o~istita distalni krn ostankov aksonov in mielina. Namno`ene Schwannove celice se v starih ohranjenih cevkah bazalnih lamin razvrstijo v t. i. Büngnerjeve stolpi~e, stukture iz starih ohranjenih cevk bazalnih lamin, ki se napolnijo z dele~imi se SC. Cevke bazalne lamine in celice v njih so podlaga regenerirajo~im se aksonom, ki za~nejo vra{~ati v distalni krn. Poleg fagocitozne sposobnosti imajo Schwannove celice in omakrofagi tudi pomembno sekrecijsko vlogo. Makrofagom,»poklicnim«fagocitom telesa, so sekretorni pomen za~eli pripisovati {ele v zadnjem ~asu. Rezultati poskusov ka`ejo, da vplivajo na proliferacijo Schwannovih celic (8). Izlo~ajo namre~ interlevkin 1 (IL-1), ki spodbuja SC k izlo~anju `iv~nega rastnega dejavnika (angl. nerve growth factor, NGF) (9, 10). Poleg tega izlo~ajo {e druge beljakovine, med njimi 37 kd te`ki apolipoprotein E, ki verjetno sodeluje pri recikliranju lipidov v po{kodovanem `ivcu (11, 12), in trombocitni rastni dejavnik (angl. platelet-derived growth factor, PDGF) (13). Pomen Wallerjeve degeneracije za regeneracijo `ivcev so raziskovali na posebnem soju mi{i (C57BL/Ola), pri katerih sta degeneracija distalnega krna in vdor makrofagov po po{kodbi izjemno po~asna. Pokazala se je pomembna razlika med motori~nimi aksoni, ki so se kljub odsotnosti degeneracije prakti~no normalno regenerirali, in senzori~nimi aksoni, ki so se v takih razmerah regenerirali zelo po~asi (14, 15). Domnevajo, da regeneracijo senzori~nih aksonov pri teh `ivalih zavira neka komponenta distalnega krna, ki se pri normalnih laboratorijskih `ivalih med Wallerjevo degeneracijo odstrani, sicer pa je prisotna v normalnem perifernem `ivcu (16). Spremembe v proksimalnem krnu in telesu nevrona Po po{kodbi `ivca v proksimalnem krnu retrogradno atrofirajo {tevilni aksoni (17 19), Wallerjeva degeneracija pa zajame tudi majhen odsek prekinjenega aksona proksimalno od po{kodbe, vsaj do prvega Ranvierjevega za`emka (20, 21). Nekaj ur po po{kodbi se v 2 do 3 mm dolgem odseku proksimalno od po{kodbe za~ne pove~evati koli~ina DNA. V prvih 24 urah po po{kodbi se {tevilo jeder v proksimalnem krnu ne pove~a, torej pove- ~anje koli~ine DNA {e ne gre na ra~un vdora celic (22). Temu v 3 do 14 dneh sledi `ivahna proliferacija celic, ki so v `ivcu normalno prisotne (23) in vdor celic mielomonocitnega izvora, predvsem makrofagov iz krvnega obtoka (5, 6). Obseg sprememb v telesu nevrona je odvisen od starosti osebka, vrste nevrona, vrste po{kodbe in oddaljenosti po{kodbe od telesa nevrona (24, 25). ^e je po{kodba preblizu telesu nevrona, le-ta odmre. ^e pa nevron pre`ivi po{kodbo, se v celi~nem telesu spro`i niz funkcionalnih in morfolo{kih sprememb. Reakcija telesa nevrona omogo~i elongacijo aksonov ter morebitno reinervacijo izgubljenih tar~nih tkiv. Telo celice nabrekne, jedro se pomakne na periferijo in Nisslova substanca se razpr{i. To imenujemo tudi kromatoliza ali tigroliza in je posledica razpada zrnatega endoplazmatskega retikuluma na posamezne poliribosome (26). Omenjene spremembe odsevajo pove~ano sintetsko aktivnost nevrona, v katerem se za~nejo prepisovati geni za mnoge strukturne elemente (npr. tubulin in aktin) in nekatere proteine, povezane z rastjo (angl. growth associated proteins, GAP). Najbolj raziskan je GAP-43 (27, 28). Sinteza nevrofilamentov se zmanj{a, kar povzro- ~i zmanj{anje premera proksimalnih krnov po{kodovanih aksonov (25). Poskusi, v katerih so s kolhicinom zavrli retrogradni aksonski transport in tako izzvali reakcijo telesa, podobno tisti po po{kodbi, nakazujejo, da je prav sprememba v retrogradnem transportu dolo~enih snovi signal, ki spro`i omenjene spremembe (29). 5
M. SRP^I^ REGENERACIJA PO[KODOVANEGA PERIFERNEGA @IVCA PODGANE MED RAZGL 2000; 39 6 Dejavniki v perifernem `ivcu, ki omogo~ajo regeneracijo Regeneracija perifernega `ivca po po{kodbi je, ~e so razmere ugodne, lahko hitra in uspe{na. Za razliko od centralnega `iv~evja, v katerem se nevroni dolgih `iv~nih prog po po{kodbi ne regenerirajo, je mikrookolje, skozi katerega rastejo aksonski brsti v po{kodovanem perifernem `ivcu, za regeneracijo ugodno (30, 31). Ugodno mikrookolje v perifernem `ivcu so `e dolgo pripisovali predvsem prisotnosti in delovanju Schwannovih celic (32). Danes velja prepri~anje, da sta za regeneracijo aksona najpomembnej{a dejavnika ustrezna rastna podlaga in razli~ne rast spodbujajo~e molekule (11, 25, 33). Vpliv podlage Po po{kodbi perifernega `ivca vra{~ajo regenerirajo~i se aksoni v distalni krn tako, da rastejo med Schwannovimi celicami (SC) in notranjo povr{ino nevrilemskih cevk (34, 35). Zato prevladuje mnenje, da rastno podlago regenerirajo~im se aksonom v po{kodovanem `ivcu predstavljata notranja povr{ina cevk bazalnih lamin (BL) in plazmalema SC (36). Relativni pomen BL so ugotavljali v poskusih, v katerih so SC iz distalnega krna izlo~ili z zmrzovanjem. V teh poskusih so se aksoni regenerirali v ohranjene nevrilemske cevke brez `ivih celic. Pokazalo se je, da aksoni razmeroma hitro rastejo skozi notranjost cevk BL, hitrost rasti pa se je zmanj{ala le za okrog 30 %. ^e so s toplotno obdelavo poleg odstranitve SC {e denaturirali beljakovine v BL, se je selektivnost brstov za notranjo povr{ino BL izgubila, hitrost regeneracije pa se je zmanj{ala na 10 % normalne vrednosti (34, 37 39). Selektivnost aksonov za notranjo stran BL so pripisali predvsem lamininu, glikoproteinu, ki je normalna sestavina BL in za katerega so znani receptorji na aksolemi (integrini dru`ine β 1 ) (40). ^e so distalni krn izpostavili protitelesom proti lamininu so tudi ob ohranjeni BL ugotovili izgubo selektivnosti aksonov za notranjost cevk (38, 39). Tudi poskusi in vitro s celi~nimi kulturami so pokazali afiniteto rasto~ih aksonov za laminin, pa tudi za fibronektin in {e nekatere druge povr{inske molekule BL in SC (40 42). Laminin ima haptotakti~ni u~inek predvsem kot sestavina BL, kjer je vezan na kolagen tipa IV, saj so in vitro ugotovili, da je afiniteta brstov za laminin, ~e je ta vezan na druge podlage, npr. polilizin, manj{a (43). Fibronektin je molekula, za katero so receptorje (tudi integrini dru`ine β 1 ) (33) na{li tako na aksolemi kot na plazmalemi SC, niso pa ugotovili enake selektivnosti za rasto- ~e aksone kot za laminin (39). Vpliv rast spodbujajo~ih molekul (trofi~nih in tropi~nih dejavnikov) Rastni dejavniki, v angle{~ini se vse ve~ uporablja izraz growth promoting molecules, so snovi, ki na nevron delujejo vzpodbujevalno med razvojem, diferenciacijo in/ali regeneracijo po po{kodbi. Znanih je `e precej takih molekul, med njimi pa so najbolj raziskani `iv~ni rastni dejavnik (angl. nerve growth factor, NGF), mo`ganski nevrotrofni dejavnik (angl. brain-derived neurotrophic factor, BDNF), insulinu podobni rastni dejavniki (IGF-1, IGF-2), trombocitni rastni dejavnik (angl. platelet-derived growth factor, PDGF), fibroblastni rastni dejavnik (FGF), ciliarni nevrotropni dejavnik (CNTF), nevrotrofin 4/5 in levkemijo inhibirajo~i dejavnik (LIF) (33). Znanje o njihovem pomenu med regeneracijo, njihovih u~inkih in mehanizmih delovanja je {e zelo nepopolno. V grobem lahko njihove mo`ne u~inke po po{kodbi delimo na tri skupine: izbolj{anje pre`ivetja nevronov, spodbujanje regeneracije in indukcija kolateralnega brstenja (44). Na~ini, na katere lahko te molekule delujejo, so razli~ni. Po klasi~ni teoriji nevrotrofizma jih kot topne dejavnike izlo~ajo tar~ne celice in delujejo na nevrone prek receptorjev na membrani njihovih aksonskih kon- ~i~ev ter nato z retrogradnim transportom pridejo v telo celice. Modelna molekula je `iv~ni rastni dejavnik (NGF). Rita Levi-Montalcini je pokazala, da ima NGF mo~an spodbujevalni u~inek na rast senzori~nih in simpati~nih nevronov v pi{~an~jem embriu (45 47). Receptorje za NGF izra`ajo med razvojem `iv~evja na membranah senzori~ni, simpati~ni in tudi motori~ni nevroni, trofi~ni u~inek pa je izra`en le pri senzori~nih in simpati~nih, na motori~ne nevrone NGF takega vpliva nima (48 50). Normalno NGF
MED RAZGL 2000; 39 sintetizirajo in spro{~ajo tar~na tkiva senzori~nih in simpati~nih aksonov (51, 52, 54). Specifi~ni receptorji na membranah teh nevronov ve`ejo spro{~eni NGF, kompleks NGF-receptor se internalizira in prenese z retrogradnim transportom proti telesu nevrona (53), kjer modificira ekspresijo nekaterih genov in posttranslacijske dogodke (55, 56). Za NGF obstajata na membranah odraslih senzori~nih in simpati~nih nevronov dve vrsti receptorjev: NGF receptor z visoko afiniteto (trka) in receptor z nizko afiniteto (gp75), ki ni specifi~en za NGF, temve~ z enako afiniteto ve`e tudi BDNF in nevrotrofin-3 (57). Pomen NGF pri regeneraciji senzori~nih aksonov po po{kodbi perifernih `ivcev pa kljub {tevilnim raziskavam ni jasen, saj so si rezultati raziskav pogosto nasprotujo~i in jih ni mogo~e sestaviti v razvidno sliko. Po po{- kodbi aksona se dotok NGF iz tar~nih tkiv prekine. V distalnem krnu, kjer poteka Wallerjeva degeneracija, se mo~no pove~a tvorba NGF, ker dva do tri dni po po{kodbi makrofagi z izlo~anjem interlevkina-1 za~nejo spodbujati fibroblaste in SC k izlo~anju NGF (9, 10). Ekspresija obeh vrst receptorjev za NGF na aksolemi po{kodovanih nevronov pa se, presenetljivo, mo~no zmanj{a (58). Zato se kljub pove~ani tvorbi NGF v distalnem krnu med regeneracijo aksonov zmanj{a retrogradni transport kompleksa NGF-receptor v telo po{kodovanega nevrona (56). Poskusi z dodajanjem eksogenega NGF so pokazali, da tako dodani NGF zmanj{a izgubo nevronov po po{- kodbi (59, 60). Poskusi, v katerih so prepre- ~ili u~inek endogenega NGF med regeneracijo s protitelesi proti NGF, pa niso pokazali u~inka na pre`ivetje nevronov po aksonotmezi in hitrost regeneracije (61). Ne moremo torej izklju~iti mo`nosti, da je bil ugodni u~inek eksogeno dodanega NGF farmakolo{ki in ne fiziolo{ki, saj so bile koncentracije, dose`ene pri dodajanju, od fiziolo{kih mnogo vi{je. Poleg NGF kot difuzibilna molekula, za katero obstajajo receptorji na nevronski membrani, deluje tudi mo`ganski nevrotrofi~ni dejavnik (BDNF), ki pomaga pri pre`ivetju in dozorevanju senzori~nih nevronov in po{kodovanih motonevronov med razvojem (62). Novej{e raziskave ka`ejo, da se po po{kodbi perifernega `ivca v distalnem krnu pove~a tvorba BDNF v Schwannovih celicah (63), v proksimalnem krnu pa se v motonevronih pove~a ekspresija za BDNF specifi~nih receptorjev (trkb) (64). Na nepo{kodovanem odraslem motonevronu trkb receptorjev namre~ ni ve~, izra`eni so samo med embriogenezo (65). Insulinu podobna rastna dejavnika (IGF-1 in IGF-2) sta majhna polipeptida, ki delujeta zelo nespecifi~no, saj je njun receptor prisoten v skoraj vseh tkivih (66). Pomembna sta med razvojem organizma, v poskusih pa so dokazali, da po po{kodbi perifernega `ivca pospe{ujeta rast aksonov (67) in proliferacijo SC, ~e te migrirajo v brezceli~ni distalni krn (68). Aplikacija protiteles proti IGF-1 in/ali IGF-2 mo~no upo~asni regeneracijo aksonov (67). Levkemijo inhibirajo~i dejavnik (angl. leukemia inhibitory factor, LIF) je protein, katerega ekspresija se v distalnem krnu po po{kodbi `ivca pove~a, pove~a pa se tudi njegov retrogradni transport v telo nevrona. Izbolj{a pre`ivetje motori~nih in senzori~nih nevronov po po{kodbi (69). Kolateralno brstenje Kolateralno brstenje je izra{~anje dodatnih brstov iz nepo{kodovanega aksona kot odgovor na delno denervacijo tar~nega tkiva. Ob po{kodbi perifernega `ivca lahko njegovo funkcijo tako delno nadomestijo brsti sosednjih `ivcev. Opa`anje je v kliniki `e dolgo znano (70, 71). Opisano je brstenje senzori~nih (71 74), avtonomnih (75, 76) in motori~nih nevronov (77, 78). Kaj spro`i kolateralno brstenje? Prevladuje mnenje, da so za spro`enje odgovorne spremembe nastajanja nevrotrofi~nih dejavnikov v denerviranem tar~nem tkivu (79, 80). Ob po{kodbi enega od perifernih `ivcev se koli~ina NGF v denerviranem podro~ju ko`e mo~no pove~a (61, 81). Katere celice v denervirani ko`i pa proizvajajo NGF? To so keratinociti, fibroblasti in Schwannove celice, v katerih so na{li mrna za NGF in NGF sam (82, 83). Pove~ana koli~ina NGF v denervirani ko`i po po{kodbi perifernega `ivca je torej lahko posledica zmanj{anega privzema NGF v po{kodovane aksone ali pa pove~ane produkcije NGF zaradi denervacije (81, 84). Poskusi, v katerih so ugotavljali pomen NGF za brstenje aksonov iz sosednjega nepo{kodovanega perifernega `ivca, so pokazali, da se 7
M. SRP^I^ REGENERACIJA PO[KODOVANEGA PERIFERNEGA @IVCA PODGANE MED RAZGL 2000; 39 8 v prisotnosti protiteles proti NGF kolateralno brstenje senzori~nih aksonov v ko`i ne inducira, oziroma se, ~e protitelesa dodamo po za~etku brstenja, brstenje ustavi (61, 85, 86). Brstenje senzori~nih aksonov je torej ves ~as kriti~no odvisno od u~inkovanja NGF. Ker se v senzori~nih nevronih, katerih aksoni brstijo, pove~a tudi ekspresija receptorjev za NGF (87), lahko upravi~eno domnevamo, da pride v telesa teh nevronov obilica NGF, mnogo ve~ kot v normalnem senzori~nem nevronu. V poskusih, ki so potekali na In{titutu za patolo{ko fiziologijo MF v Ljubljani v zadnjih letih, je bilo ugotovljeno, da predhodno kolateralno brstenje ugodno vpliva na regeneracijo senzori~nih nevronov po po{kodbi (88, 89). Predhodno brstenje je pospe{ilo regeneracijo najhitrej{ih aksonov in pove~alo obseg regeneracije po naknadni po{kodbi, a le v primeru, ko so aksoni vra{~ali v brezceli~ni distalni odsek. Hitrost regeneracije je bila v tem primeru enaka kot pri aksonih, ki niso predhodno brsteli, so pa imeli celi~no podporo distalno od mesta po{kodbe. Nasprotno pa predhodno brstenje ni pospe{ilo regeneracije, ~e je bila celi~na podpora v distalnem krnu ohranjena, se je pa pove~al obseg regeneracije (88). Namen in hipoteza naloge Po{kodbi perifernega `ivca sledi zna~ilen odziv Schwannovih celic v distalnem krnu. Mnenja o pomenu celi~ne podpore distalno od po{kodbe za uspe{no regeneracijo senzori~nih aksonov se v zadnjem ~asu spreminjajo, {e vedno pa obstajata dve pomembni vpra{anji, na kateri nimamo zadovoljivih odgovorov. Prvi~, kak{en je pomen pove~ane tvorbe razli~nih rast spodbujajo~ih snovi v SC distalnega krna po po{kodbi? Rezultati raziskav, predvsem glede pomena NGF pri regeneraciji po{kodovanih senzori~nih aksonov, so si nasprotujo~i, kar smo `e opisali. Drugi~, zanima nas, kak{en je pomen same podlage, po kateri regenerirajo~i se aksoni rastejo. Ali so cevke BL, ki jih tvorijo SC, po po{kodbi in odstranitvi `ivih SC iz distalnega krna z zmrzovanjem dovolj za uspe{no regeneracijo aksonov? Rezultati poskusov na na{em in{titutu so pokazali, da lahko regenerirajo~i se senzori~ni aksoni po aksonotmezi rastejo v nevrilemske cevke tudi v odsotnosti `ivih SC v prvih osmih dneh po po{kodbi in to dokaj hitro, saj se je hitrost regeneracije zmanj{ala le za okrog 30 % (37, 90). Poleg tega so ugotovili, da regenerirajo~i se aksoni lahko prerastejo 2 3 cm dolg brezceli~ni odsek `ivca in popolnoma obnovijo bole~insko ob~utljivost ko`e, ~eprav z manj{o zamudo (91). V poskusih, pri katerih so kot model poskusne po{kodbe uporabili nevrotmezo, torej popolno prekinitev `ivca, pa je bila regeneracija brez celi~ne podpore distalno od po{kodbe dosti slab{a. Ugotovili so, da za~nejo aksoni rasti v presajeni odsek perifernega `ivca precej kasneje kot v kontrolni presadek z ohranjenim celicami in da je njihova rast skozi brezceli~ni presadek dosti po~asnej{a (92, 93). Poro~ajo tudi, da aksone pri regeneraciji skozi brezceli~ni presadek spremljajo SC (92, 93). [e ve~, v primeru, ko so zavrli proliferacijo SC v proksimalnem krnu, aksoni v obdobju prvih petih tednov po po{kodbi prakti~no niso vra{~ali v brezceli~ni presadek (94). Na{tete razlike med rezultati omenjenih poskusov lahko do neke mere pripi{emo razli~nim poskusnim razmeram. Zdi se, da je vzrok zamude v za~etku regeneracije pri rasti regenererirajo~ih se aksonov v distalni krn v primeru nevrotmeze prav premostitev vrzeli med krnoma, za kar so o~itno nujne vitalne SC. Predpostavili smo, da je ~as, v katerem so regenerirajo~i se aksoni prikraj{ani za podporo `ivih SC, pomemben za nadaljnji uspeh regeneracije. Zato se nam je zdelo pomembno prou~iti, kak{na je regeneracija senzori~nih aksonov skozi dolg, popolnoma brezceli~ni segment med dalj{im ~asovnim obdobjem in ali je na to dogajanje mogo~e vplivati s spreminjanjem izpostavljenosti po{kodovanih nevronov trofi~nim dejavnikom. Postavili smo naslednje hipoteze: 1. Po kratkem za~etnem obdobju dokaj hitre rasti, ko so regenerirajo~i se senzori~ni aksoni relativno odporni proti pomanjkanju celi~ne podpore v distalnem krnu, se kasneje hitrost elongacije aksonov upo~asni ali celo ustavi.
MED RAZGL 2000; 39 2. ^e poleg uni~enja celic v distalnem segmentu dodatno zavremo proliferacijo Schwannovih celic v proksimalnem krnu, je upo~asnitev regeneracije po za~etnem obdobju relativne odvisnosti od celi~ne podpore {e bolj izra`ena. 3. Predhodno kolateralno brstenje, ki nevrone izpostavi pove~anim koli~inam rast spodbujajo~ih dejavnikov (predvsem NGF) (61), na regenerativno sposobnost aksonov vpliva pozitivno, upo~asnitev regeneracije med dolgotrajno izgubo celi~ne podpore v distalnem krnu je manj{a ali je celo ni. MATERIALI IN METODE Operativni postopki @ivali in anestezija Poskusi so potekali v laboratorijih In{tituta za patolo{ko fiziologijo MF Univerze v Ljubljani, ki ima dovoljenje Ministrstva za kmetijstvo za delo s poskusnimi `ivalmi ({t. odlo~be 326 07 26/98). Vse poskuse smo izvajali na samcih belih laboratorijskih podgan soja Wistar. @ivali so ob prvi operaciji tehtale od 180 do 260 gramov. Kot anestetik smo pri operacijah uporabili me{anico dihidrotiazina (Rompun, Bayer, Leverkusen, Nem~ija, 5 mg/kg) in ketamin-hidroklorida (Ketanest, Parke Davis GMBH, Berlin, Nem~ija, 90 mg/kg), ki smo jo vbrizgali intraperitonealno. Pri testu u{~ipa `ivca je bila potrebna plitvej{a anestezija, ki smo jo dosegli s pentobarbitalom (Vetanarcol, Veterinaria AG, Zürich, [vica, 20 mg/kg i. p.). Kirur{ki posegi @ivali smo razvrstili v {tiri poskusne in dve kontrolni skupini: Poskusna skupina A REGENERACIJA SKOZI BREZCELI^NI ODSEK @ivalim smo v globoki anesteziji s standardnim pristopom skozi ko`o, mi{ice in fascije stegna in goleni izpostavili podro~je podkolenske jame (fossa poplitea). Pribli`no 1 cm distalno od odcepi{~a n. suralisa od n. ischiadicusa smo drugi dve kon~ni veji n. ischiadicusa (n. tibialis in n. peroneus) ligirali in prerezali, da bi bile poskusne razmere ~im bolj podobne tistim v skupini B. Prerezali smo tudi medialno in lateralno ko`no vejo, n. cutaneus surae medialis in lateralis. N. suralis smo nato lo~ili od veziva in spremljajo~ih `il ~im bolj distalno v njegovem poteku v goleni. Distalno smo ga ligirali in prerezali, potem pa pribli`no 3 mm od odcepa od n. ischiadicusa napravili aksonotmezo. @ivec smo 30sek. stiskali z 2mm {irokim {ivalnikom z gladkima prijemalnima ploskvama, nato pa proksimalni rob po{kodbe ozna~ili s tankim {ivom skozi epinevrij. @ivec smo podlo`ili z gumijasto plo{~ico za za{~ito okolnega tkiva in ga s suhim ledom (CO 2, T = 40 C) zmrzovali, ga potem odtajali s fiziolo{ko raztopino sobne temperature in postopek ponovili {e dvakrat, tako, da je zmrzovanje in odtajanje trajalo pribli`no 3 minute. N. suralis smo reponirali v njegov normalni potek, konec distalne ligature pa s {ivom fiksirali v mi{ico triceps surae. Rano v mi{icah na stegnu smo za{ili, ko`o speli s sponkami in pustili `ival okrevati. Operirali smo v ~istih, ne pa sterilnih razmerah. V skupini je bilo 91 `ivali. Poskusna skupina B REGENERACIJA SKOZI BREZCELI^NI ODSEK PO PREDHODNEM BRSTENJU Pri tej skupini sta bili potrebni dve lo~eni operaciji. Pri prvi smo, da bi vzpodbudili kolateralno brstenje n. suralisa, po standardnem pristopu v podkolensko jamo izpreparirali n. peroneus in n. tibialis, ju ligirali in prerezali, prerezali pa smo tudi oba ko`na `ivca. N. suralis smo pustili nedotaknjen in se sploh trudili, da bi bili rana in po{kodba v podkolenski jami minimalni. Rano smo za{ili, ko`o speli s sponkami. Nato smo prikazali {e n. saphenus, ki poteka po medialni strani stegna tik pod ko`o. Lo~ili smo ga od spremljajo~e `ile, ga proksimalno ligirali in prerezali, nato pa odstranili {e pribli`no 1 cm `ivca v njegovem distalnem poteku. Rano v ko`i smo speli s sponkami. @ival smo pustili okrevati 14 dni in jo potem drugi~ operirali. Ta postopek je bil popolnoma enak kot pri skupini A, izpostavili smo n. suralis, ga 3 mm distalno od odcepa od n. ischiadicusa pretisnili s {ivalnikom in nato zmrzovali s suhim ledom distalno od po{kodbe. V skupini je bilo 39 `ivali. 9
M. SRP^I^ REGENERACIJA PO[KODOVANEGA PERIFERNEGA @IVCA PODGANE MED RAZGL 2000; 39 lat. n. ischiadicus n. peroneus ligatura in transsekcija n. tibialis prox. med. dist. n. suralis P 2mm 6mm D1 mesto odvzetja proksimalnih preparatov mesto po{kodbe s {ivom za oznako na proksimalnem mesto odvzetja distalnih preparatov distalna ligatura in transsekcija Slika 1. Skica `ivca in mest odvzema vzorcev za histolo{ko analizo. 10 Poskusna skupina C REGENERACIJA SKOZI BREZCELI^NI ODSEK PO APLIKACI- JI CITOSTATIKA V MESTO AKSONOTMEZE Postopek je bil pri tej skupini enak kot pri skupini A, razen, da smo po po{kodbi in zmrzovanju n. suralisa na mesto po{kodbe z mikroinjekcijo (28 g) vbrizgali 5 ml citostatika mitomicina (Mutamycin, raztopina 400 μg/ml, Bristol Caribbean Inc., Mayaguez, Portoriko) (94). Raztopino smo vbrizgali pod epinevrij n. suralisa in v vezivo med n. suralisom in n. tibialisom. Pri tem smo zelo pazili, da mikroinjekcija ni po{kodovala suralisovih vlaken, da pa smo raztopino vbrizgali v vezivo v neposredni bli`ini aksonotmeze n. suralisa. V skupini je bilo 24 `ivali. Kontrolna skupina K1: REGENERACIJA PO AKSONOTMEZI V prvi kontrolni skupini smo `ivali operirali na enak na~in kot v poskusni skupini N, le da `ivca nismo zmrzovali, smo ga pa za 3 minute pustili na gumijasti plo{~ici za za{- ~ito tkiva in ga spirali s fiziolo{ko raztopino. V skupini so bile 4 `ivali. Kontrolna skupina K2: NORMALNI NEPO- [KODOVANI @IVEC V drugi kontrolni skupini so bile 4 neoperirane `ivali. Testiranja, meritve in {tetje Test u{~ipa `ivca Razdaljo, ki so jo najhitrej{i regenerirajo~i se senzori~ni aksoni dosegli v dolo~enem ~asu, smo ugotavljali s testom v{~ipa `ivca (pinch test, (93, 37)). V plitvi barbituratni anesteziji smo n. suralis izpostavili in lo~ili od veziva, nato pa smo ga s tanko pinceto rahlo {~ipali. Za~eli smo na distalnem koncu in z milimetrskimi koraki nadaljevali v proksimalni smeri proti ozna~enemu mestu aksonotmeze. Mesto na `ivcu, kjer smo ob v{~ipu prvi~ zaznali odgovor (refleksna skr~itev mi{ic na stegnu in v dimljah), smo ozna~ili s {ivom. @ival smo `rtvovali. Potem smo prerezali n. ischiadicus visoko v stegnu, ga polo`ili na ravnilo in izmerili razdaljo na n. suralisu med mestom aksonotmeze in mestom pozitivnega v{~ipnega testa. [tetje aksonov HISTOLO[KI PRIKAZ MIELINIZIRANIH AKSONOV V PROKSIMALNEM KRNU Po testu v{~ipa `ivca smo izolirani odsek `ivca pre~no prerezali z britvico 2mm proksimalno od {iva, ki je ozna~eval po{kodbo (to~ka P, slika 1), in 6 mm distalno od tega {iva (to~ka
MED RAZGL 2000; 39 Slika 2. Normalni suralni `ivec (pre~ni rez). Prikaz barvanja mielinskih ovojnic aksonov. Mielinizirani aksoni so vidni kot modro obarvani obro~ki. Slika 3. N. suralis, ki je predhodno kolateralno brstel, po 14 dneh regeneracije skozi brezceli~ni odsek (pre~ni rez skozi distalni krn). Prikaz imunihistokemi~ne reakcije na nevrofilament v aksonih. Nevrofilamente vsebujo~i aksoni so vidni kot rjave pege. D1, slika 1). Kratek del `ivca proksimalno od to~ke P in del distalno od to~ke D1 smo potopili v fiksativ (2 % glutaraldehid in 2 % paraformaldehid v veronal-acetatnem pufru, ph 7,4) za 12 ur. Fiksaciji je sledilo: spiranje v veronal-acetatnem pufru, dehidracija skozi alkohole nara{~ajo~ih koncentracij in vklapljanje v Epon. Po dveh dneh su{enja eponske smole smo vzorce pre~no narezali na poltanke rezine in jih obarvali z barvilom Azur II. Mielinizirani aksoni se na preparatu poka`ejo kot modro obarvani obro~ki. Te smo nato pre{teli na celotnem preseku `ivca. IMUNOHISTOKEMI^NI PRIKAZ NEVRO- FILAMENT VSEBUJO^IH AKSONOV V DI- STALNEM KRNU Drugi del izoliranega `ivca, odsek med to~kama P in D1, smo fiksirali v pufranem paraformaldehidu (ph 7,4) 24 ur, ga dehidrirali v alkoholni vrsti nara{~ajo~ih koncentracij in ga vklopili v parafin. Na proksimalnem in distalnem koncu (torej spet na to~kah P in D1) smo narezali pre~ne rezine debeline 2 5 μm. Za imunohistokemi~no ozna~evanje nevrofilamentov v rezinah smo uporabili aparat za avtomati~no imunohistokemi~no analizo TECHMATE 500. Uporabili smo metodo LSAB (streptavidin-biotinska metoda ozna~evanja). Antigene smo demarkirali z mikrovalovno predobdelavo (dvakrat po 5 minut) v citratnem pufru. Nato smo pri sobni temperaturi nanesli primarno protitelo NFMoAB (klon 2F11)-DAKO (Glostrup, Danska). Vsi uporabljeni reagenti so predpisani za uporabo aparata za avtomati~no imunohistokemi~no barvanje TECHMATE 500 in so proizvod firme DAKO, Danska. ANALIZA [TEVILA AKSONOV [tevilo mieliniziranih vlaken in NF-pozitivnih profilov v preparatih pre~nih rezov smo dolo- ~ali s pomo~jo ra~unalni{kega sistema za analizo slike s programom The microcomputer imaging device (MCID) verzija 2.0. Sistem sestavljajo: svetlobni mikroskop, videokamera, pretvornik za digitalizacijo slike, monitor, osebni ra~unalnik IBM PC AT in mi{ka. Z objektivom s 40-kratno pove~avo smo na izbranih rezih videli mielinizirane aksone kot modro obarvane obro~ke (slika 2), NF-vsebujo~e strukture pa kot rjave pege (slika 3). Z mi{ko smo s kazalcem na zaslonu ozna~ili pozitivne strukture, nato pa jih je program pre{tel. Statisti~ne metode Za analizo razlik med dvema vzorcema smo uporabljali Studentov t-test z Bonferronijevim popravkom. Skupine podatkov v poskusni skupini A smo analizirali s statisti~nim testom za analizo variance. Hitrost regeneracije v skupini A smo dolo~ili s formulo za izra- ~un naklona regresijske premice (94). Pri delu smo uporabljali ra~unalni{ki program Statist, razvit na In{titutu za patolo{ko fiziologijo, Ljubljana, in Microsoftov program Excel 97. 11
M. SRP^I^ REGENERACIJA PO[KODOVANEGA PERIFERNEGA @IVCA PODGANE MED RAZGL 2000; 39 razdalja od po{kodbe (mm) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 (10) (10) (13) (12) (11) (10) (15) (10) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 ~as (dnevi) Slika 4. Razdalje, ki so jih dosegli najhitrej{i regenerirajo~i se aksoni po aksonotmezi in zmrzovanju/odtajanju `ivca distalno od po{kodbe (skupina A), izmerjene s testom u{~ipa `ivca. Prikazane so srednje vrednosti, standardni odkloni in v oklepajih {tevilo `ivali v posameznih vzorcih. 12 REZULTATI Elongacija senzori~nih aksonov po po{kodbi: regeneracija skozi brezceli~ni odsek Kot smo ugotovili s testom v{~ipa `ivca, so v poskusni skupini A (slika 1) aksoni rasli skozi {tevilo aksonov 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 a b c d e skupina Slika 5. Povpre~no {tevilo mieliniziranih aksonov, prikazanih z barvanjem mielinske ovojnice, v n. suralisu 3 mm proksimalno od po{kodbe. Skupine: a n. suralis 14 dni po aksonotmezi, brezceli~ni distalni krn; b n. suralis 28 dni po aksonotmezi, brezceli~ni distalni krn; c n. suralis 42 dni po aksonotmezi, brezceli~ni distalni krn; d n. suralis 28 dni po aksonotmezi, ohranjena celi~na podpora v distalnem krnu; e normalni n. suralis. Prikazane so srednje vrednosti in standardni odkloni (n = 4). brezceli~ni odsek n. suralisa distalno od po{kodbe do 8. dneva po po{kodbi s stalno hitrostjo (naklon regresijske premice 2,4 mm/dan). Med 8. in 11. dnem se je elongacija skoraj ustavila. Med 11. in 14. dnem se je razdalja od mesta aksonotmeze, na kateri je bilo s testom v{~ipa {e mo~ dokazati aksone, `e ob~utno zmanj{ala. Razlika v razdaljah med 11. in 14. dnem je bila statisti~no zna~ilna (p<0,001). Med 14. in 28. dnem po po{kodbi je bilo zmanj{anje razdalje, ki so jo dosegli senzori~ni aksoni, najbolj izrazito, povpre~na razdalja po 28 dneh je bila od najve~je, izmerjene 11. dan po po{kodbi, kraj{a za skoraj 11 mm. Tudi ta razlika je bila statisti~no zna~ilna (p < 0,001). V obdobju med 28. in 42. dnem pa smo ugotovili spet majhno, a statisti~no zna- ~ilno podalj{anje aksonov (p < 0,01). Dose`ene razdalje od 11. do 42. dneva smo analizirali s statisti~nim testom za analizo variance. Skupine smo nato med seboj primerjali s Studentovim t-testom, pri ~emer smo upo{tevali Bonferronijev popravek. [tevilo mieliniziranih aksonov proksimalno od po{kodbe V poskusni skupini A smo po barvanju mielinskih ovojnic pre{teli mielinizirane aksone
MED RAZGL 2000; 39 v pre~nih rezinah n. suralisa, odvzetih 3 mm proksimalno od po{kodbe (slika 2). Ugotovili smo, da se {tevilo aksonov v n. suralisu po 14, 28 in 42 dneh rasti skozi brezceli~ni distalni odsek ni statisti~no zna~ilno razlikovalo od {tevila aksonov v po{kodovanem `ivcu, katerega aksoni so se 28 dni regenerirali skozi distalni krn z ohranjeno celi~no podporo (p > 0,05 za vse pare). V nobenem `ivcu nismo videli delno razgrajenih mielinskih ovojnic, ki so zna~ilne za propadle aksone. Tudi med {tevilom aksonov v nepo{kodovanem n. suralisu in {tevilom aksonov v po{kodovanem `ivcu, katerega aksoni so se 4 tedne regenerirali skozi distalni krn z ohranjeno celi~no podporo, ni bilo statisti~no pomembne razlike (p > 0,05). Vse skupine vzorcev smo med seboj primerjali s Studentovim t-testom, pri ~emer smo. upo{tevali Bonferronijev popravek Elongacija senzori~nih aksonov po po{kodbi: regeneracija skozi brezceli~ni odsek po predhodnem kolateralnem brstenju ter po aplikaciji mitomicina v proksimalni krn V poskusni skupini B, kjer so se aksoni regenerirali skozi brezceli~ni odsek n. suralisa po predhodnem kolateralnem brstenju, smo s testom u{~ipa `ivca merili najve~jo razdaljo, ki so jo dosegli regenerirajo~i se aksoni, prvi~ 6 dni po po{kodbi (slika 4). Aksoni so tedaj povpre~no dosegli ve~jo razdaljo od mesta aksonotmeze (16 ± 1,0 mm) kot v skupini A (12±0,8mm). Razlika je statisti~no zna- ~ilna (p<0,01). Tudi 14 dni po po{kodbi je bila razdalja v skupini B statisti~no zna~ilno ve~ja kot v skupini A. V nasprotju s skupino A po 28 dneh nismo ugotovili zmanj{anja najve~je dose`ene razdalje. Razdalja od mesta aksonotmeze, ki so jo povpre~no dosegli aksoni 30 28 26 24 (13) (5) 13 22 razdalja od po{kodbe (mm) 20 18 16 14 12 10 (11) (10) (5) (6) 8 6 4 2 (11) (5) 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 ~as (dnevi) Skupina A Skupina B Skupina C Slika 6. Razdalje, ki so jih dosegli najhitrej{i regenerirajo~i se aksoni po aksonotmezi in zmrzovanju/odtajanju `ivca, izmerjene s testom u{~ipa `ivca. U~inek predhodnega brstenja (skupina B) ali aplikacije mitomicina v proksimalni krn ob po{kodbi (skupina C). Za primerjavo so vrisani tudi podatki za poskusno skupino A. Prikazane so srednje vrednosti, standardni odkloni in v oklepajih {tevilo `ivali v posameznih vzorcih. ([tevilo `ivali za vzorce skupine A zaradi preglednosti slike ni podano in je navedeno v sliki 3).
M. SRP^I^ REGENERACIJA PO[KODOVANEGA PERIFERNEGA @IVCA PODGANE MED RAZGL 2000; 39 1000 900 800 (6) (5) {tevilo aksonov 700 600 500 400 300 200 (4) (5) (7) (5) (4) 100 (6) (6) 0 14 28 42 ~as (dnevi) Skupina A Skupina B Skupina C Slika 7. [tevilo aksonov (nevrofilament vsebujo~ih profilov) 6 mm distalno od po{kodbe po 14, 28 oziroma 42 dneh. Prikazane so srednje vrednosti, standardni odkloni in v oklepajih {tevilo `ivali v posameznih vzorcih. 14 v skupini B, je bila 23 ± 3,9 mm in je bila statisti~no zna~ilno ve~ja kot razdalja po 6 dneh (p<0,01) v tej skupini in zna~ilno ve~ja od razdalje, na kateri je bilo mogo~e dokazati aksone po 28 dneh v skupini A (p < 0,01). Aksoni so torej pri `ivalih v skupini B skozi brezceli~ni odsek rasli tudi v tretjem in ~etrtem tednu po po{kodbi, ne pa ve~ med ~etrtim in {estim tednom po po{kodbi. Povpre~na razdalja 42. dan je bila pri skupini B 22 ± 2,6 mm, kar je sicer statisti~no zna~ilno ve~ kot v skupini A po 42 dneh (p < 0,01). V poskusni skupini C, kjer smo ob aksonotmezi z mitomicinom zavrli proliferacijo SC v proksimalnem krnu, so bili rezultati povsem druga~ni (slika 6). Osmi dan po po{kodbi so aksoni od mesta po{kodbe dosegli povpre~no razdaljo 12 ± 1,6 mm, do 14. dneva se je dose`ena razdalja `e statisti~no zna~ilno (p < 0,05) zmanj{ala na povpre~no 7 ± 2,4 mm. Obe razdalji sta statisti~no zna~ilno manj{i od razdalj, dose`enih pri ustreznih ~asih v skupini A (p<0,01). 28. dan po po{kodbi smo zaznali odziv na v{~ip n. suralisa distalno od po{kodbe samo pri treh `ivalih, pa {e to najve~ 2 mm od po{kodbe, pri osmih `ivalih pa odziva distalno od po{kodbe ni bilo. Proksimalno od po{kodbe je bil test u{~ipa pozitiven. Povpre~na razdalja, ki so jo dosegli aksoni, je bila statisti~no zna~ilno manj{a kot v skupini A po 28 dneh (p < 0,01). 42. dan po aksonotmezi nismo s testom u{~ipa distalno od po{kodbe zaznali odziva pri nobeni `ivali, proksimalno od po{kodbe pa je bil test pri vseh pozitiven. (slika 2) Razlike med skupinami smo ocenjevali s Studentovim t-testom, pri ~emer smo upo- {tevali Bonferronijev popravek. Obseg regeneracije aksonov Rezultati analize, pri kateri smo {teli tiste to~kaste strukture na pre~nem prerezu brezceli~nega distalnega segmenta po{kodovanega n. suralisa, ki so kazale imunohistokemi~no reakcijo na nevrofilament, so prikazani na sliki 7. V skupini A smo 14 dni po po{kodbi 6 mm distalno od po{kodbe na{teli povpre~no 380 ± 117 aksonov (NF pozitivnih profilov). Po 28 dneh smo aksone opazili le {e v dveh vzorcih `ivcev od petih, v ostalih treh aksonov nismo videli. Po 42 dneh je bilo aksonov povpre~no 249. Razlika med {tevilom aksonov po 14 dneh in 28 dneh je statisti~no zna~ilna (p<0,01), razlika med {tevilom po 28 in 42 dneh pa ne (p>0,05). V skupini B, kjer so aksoni n. suralisa predhodno brsteli, je bilo aksonov v brezceli~nem
MED RAZGL 2000; 39 odseku `ivca ve~ kot v skupini A v vseh ~asovnih obdobjih. Vse razlike med skupinama so bile statisti~no zna~ilne (p < 0,01). Najve~ aksonov smo v skupini B na{teli 14. dan po po{kodbi (povpre~no 723 ± 65), v 4. in 6. tednu pa je njihovo {tevilo upadlo za okoli 40 % in se pri obeh ~asih ni razlikovalo. Razlika med {tevilom aksonov po 14 in 28 dneh v skupini B je bila statisti~no zna~ilna (p < 0,01). V skupini C, kjer smo v proksimalni krn po{kodovanega n. suralisa vbrizgali mitomicin, se {tevilo aksonov v brezceli~nem distalnem krnu 14. dan po po{kodbi ni statisti~no zna~ilno razlikovalo od ustreznega {tevila v skupini A (p > 0,05). 28 dni po po{kodbi je bilo aksonov v skupini C statisti~no zna~ilno manj kot po 14 dneh (p < 0,01), 42 dni po po{kodbi pa aksonov 6 mm distalno od po{kodbe v skupini C nismo na{li. Vse razlike med vzorci smo med seboj primerjali s Studentovim t-testom, pri ~emer smo uporabili Bonferronijev popravek. RAZPRAVA Z zmrzovanjem dolgega odseka suralnega `ivca distalno od mesta aksonotmeze prav do mesta, kjer smo `ivec najbolj distalno prerezali in za{ili na mi{ico, smo uni~ili vse celice v tem odseku. S tem smo odstranili celi~no podporo regenerirajo~im se aksonom in distalni vir SC, ohranjena pa je ostala kontinuiteta bazalnih lamin nevrilemskih cevk. Rezultati testa u{~ipa `ivca v poskusni skupini A (regeneracija skozi brezceli~ni odsek) so potrdili na{o prvo hipotezo, da se po za~etnem obdobju dokaj hitre rasti aksonov skozi brezceli~ni segment, torej brez celi~ne podpore distalno od po{kodbe, regeneracija upo~asni. Hitrost rasti v prvih osmih dneh po po{kodbi v na{em poskusu se ujema z rezultati prej{njih poskusov (37, 88) in je pribli`no za 30% manj{a kot hitrost rasti senzori~nih aksonov v nezmrzovanih `ivcih (ob ohranjeni celi~ni podpori v distalnem krnu), po{kodovanih le z aksonotmezo (37, 88). Temu obdobju sorazmerne»odpornosti«proti pomanjkanju `ivih celic v distalnem krnu v na{em poskusu v drugem tednu sledi zastoj elongacije regenerirajo~ih se aksonov. V tretjem in ~etrtem tednu pa se je razdalja od mesta aksonotmeze do to~ke, na kateri je bilo s testom u{~ipa {e mogo~e zaznati aksone, skraj{ala z okrog 18 mm na povpre~no 7 mm. Tudi {tevilo regenerirajo~ih se aksonov 6 mm distalno od mesta aksonotmeze se je statisti~no zna~ilno zmanj{alo. Oboje bi bilo lahko posledica bodisi propada celih nevronov, katerih aksoni so v za~etni fazi regeneracije dosegli najve~je razdalje, ali pa umika (skraj- {anja, retrakcije) teh aksonov na kraj{o dol- `ino, ki jo v danih razmerah nevroni {e lahko vzdr`ujejo. Da bi ugotovili, kateri mehanizem je vpleten pri opa`enem pojavu, smo pre{teli mielinizirane aksone 3mm proksimalno od po{kodbe v poskusni skupini A in jih primerjali s {tevilom aksonov v kontrolnih suralnih `ivcih na ustreznih mestih (v `ivcih, pri katerih po aksonotmezi distalnega odseka nismo zmrzovali in so se aksoni regenerirali ob ohranjeni celi~ni podpori ter v nepo{kodovanem n. suralisu). ^e bi namre~ pri{lo do propada celih nevronov, bi se to moralo pokazati kot zmanj{anje {tevila aksonov proksimalno od po{kodbe v obdobju med 2. in 4. tednom po po{kodbi. [tevilo mieliniziranih aksonov proksimalno od po{kodbe v poskusni skupini A ni bilo statisti~no zna- ~ilno manj{e od {tevila aksonov v normalnem nepo{kodovanem n. suralisu, pa tudi ne od {tevila aksonov v n. suralisu, katerega aksoni so se regenerirali skozi distalni krn z ohranjeno celi~no podporo. Skraj{anje razdalje med mestom aksonotmeze in to~ko pozitivnega testa u{~ipa med 2. in 4. tednom regeneracije skozi brezceli~ni odsek je torej posledica skraj{anja (retrakcije) regenerirajo~ih se senzori~nih aksonov, ne pa propada celotnih nevronov, katerih aksoni so se regenerirali brez celi~ne podpore. V nadaljevanju regeneracije v petem in {estem tednu po po{kodbi smo opazili ponovno podalj{evanje aksonov, ki pa je bilo dosti po~asnej{e kot v prvi fazi regeneracije, saj se je njihova povpre~na dol`ina v 2 tednih pove~ala le za 2 3 mm. Iz opa`enega lahko sklepamo, da je regeneracija senzori~nih aksonov brez celi~ne podpore v distalnem krnu po aksonotmezi ve~fazna. Prvi fazi, v kateri regenerirajo~i se aksoni rastejo relativno hitro brez podpore `ivih celic, sledi v drugem tednu po po{kodbi faza zastoja rasti, nato pa faza retrakcije regenerirajo~ih se aksonov proti mestu po{- 15
M. SRP^I^ REGENERACIJA PO[KODOVANEGA PERIFERNEGA @IVCA PODGANE MED RAZGL 2000; 39 16 kodbe. Domnevamo, da postane v teh dveh fazah rast aksonov popolnoma odvisna od celi~ne podpore. V zadnji fazi se rast aksonov obnovi, vendar je hitrost elongacije zelo majhna. Razlogi za zaustavitev elongacije aksonov v drugi fazi Zdi se, da je rast senzori~nih aksonov v za~etni fazi od celi~ne podpore razmeroma neodvisna, da pa jo SC zmerno pospe{ujejo (37). Kaj se torej spremeni po prvem tednu, da se regeneracija senzori~nih aksonov ustavi? Ena mo`nost je, da se zmanj{a sposobnost samih senzori~nih nevronov, da bi vzdr`evali elongacijo svojih aksonov skozi brezceli~ni odsek, druga pa, da se rastna podlaga, po kateri se aksoni regenerirajo, s ~asom tako spremeni, da aksonom ve~ ne omogo~a rasti. Na In{titutu za patolo{ko fiziologijo MF so vzporedno z na{imi potekali poskusi, ki naj bi pojasnili, katera od obeh mo`nosti za ustavitev regeneracije je bolj verjetna. Ugotovili so, da so aksoni, ki so najprej en teden po aksonotmezi rasli v brezceli~ni odsek, v drugem tednu regeneracije rasli z enako hitrostjo kot prvi teden, ~e so jim zagotovili nespremenjeno rastno podlago v brezceli~nem krnu. To so dosegli tako, da so n. suralis podgane po{kodovali z aksonotmezo, njegove aksone pustili en teden regenerirati skozi brezceli~ni distalni krn. Potem so po testu u{~ipa isti `ivec {e enkrat po{kodovali z aksonotmezo pribli`no 20 mm proksimalno od prve po{kodbe, ga distalno od te druge po{kodbe zopet zmrzovali in opazovali regeneracijo. Razdalje, ki so jih aksoni dosegli drugi teden regeneracije, so bile v tem primeru enake kot v prvem tednu. To pomeni, da do ustavitve regeneracije v drugem tednu ne pride, ~e regenerirajo~im se aksonom zagotovimo enako rastno podlago, kot je tista prvi teden po po{kodbi (Bajrovi} 1998, neobjavljeni podatki, osebna komunikacija). Zato domnevamo, da ustavitev rasti aksonov po obdobju hitre rasti ni posledica zmanj- {ane rastne kapacitete regenerirajo~ih se aksonov, temve~ da je vzrok za ustavitev regeneracije po aksonotmezi ob dolgotrajni odsotnosti celi~ne podpore v distalnem krnu degeneracija rastne podlage. V prvi fazi rasti so po aksonotmezi in zmrzovanju v distalnem krnu ohranjene cevke BL, ki aksonom zagotavljajo ugodno rastno podlago (34, 37, 39). V odsotnosti SC, ki bazalno lamino nevrilemskih cevk v normalnem distalnem krnu tvorijo in obnavljajo (7), bi ustavitev regeneracije lahko pripisali degeneraciji BL nevrilemskih cevk do take mere, da regenerirajo~i se aksoni skoznje ne morejo ve~ rasti. Znano je namre~, da se rast regenerirajo~ih se aksonov skozi denaturirane nevrilemske cevke, v katerih so beljakovine BL denaturirane, zelo upo~asni (37). Poleg komponent ekstracelularnega matriksa imajo lahko na rast aksonov ugoden vpliv tudi razli~ni na ekstracelularni matriks vezani humoralni dejavniki, ki bi jih lahko izlo~ale SC (7, 97). Tudi na razpolo`ljivost teh dejavnikov regenerirajo~im se aksonom lahko dolgotrajna odsotnost SC vpliva negativno. Sklepamo torej lahko, da je velik pomen celi~ne podpore, torej namno`itve SC v distalnem krnu po{kodovanega perifernega `ivca v tem, da tvorijo in vzdr`ujejo ugodno rastno podlago za regenererirajo~e se aksone oziroma prepre~ijo njihovo degeneracijo. Razlogi za retrakcijo aksonov v tretji fazi Domnevamo lahko, da je za retrakcijo aksonov v tretji fazi regeneracije skozi brezceli~ni distalni krn kriva bodisi degeneracija rastne podlage, na katero se adherirajo aksoni, bodisi dalj{e obdobje odsotnosti trofi~nih dejavnikov, ki jih izlo~ajo celice distalnega krna v nezmrzovanem `ivcu, lahko pa tudi kombinacija obojega. Rezultati testa u{~ipa `ivca v poskusni skupini B, kjer so se aksoni regenerirali skozi brezceli~ni distalni krn po predhodnem kolateralnem brstenju, glede na dosedanje znanje bolj podpirajo drugo mo`nost. Ugotovili smo namre~, da po predhodnem kolateralnem brstenju, ki brste~e nevrone»zalo`i«z rastnimi dejavniki, predvsem NGF (61), do retrakcije aksonov v drugem tednu po po{kodbi ni pri{lo, pa tudi do konca opazovanega obdobja {estih tednov po po{kodbi retrakcije aksonov nismo opazili. Oddaljenost to~k pozitivnega testa u{~ipa suralnega `ivca od mesta aksonotmeze se je po 14 dneh {e nekoliko
MED RAZGL 2000; 39 pove~ala, nato pa se je ustalila. Tudi {tevilo aksonov 6 mm distalno od mesta aksonotmeze je ostalo visoko vseh 6 tednov po po{kodbi. Med kolateralnim brstenjem se v denervirani ko`i pove~ata ekspresija NGF (81) in ekspresija receptorjev za NGF na senzori~nih aksonih (61). Brstenje aksonov je intrinzi~no odvisno od NGF (61, 86). Upravi~eno domnevamo, da pove~an priliv NGF pomembno vpliva na brste~e senzori~ne nevrone. ^e bi bil ta u~inek dolgotrajen (do 6 tednov), bi morda to razlo`ilo, zakaj ti nevroni ne retrahirajo svojih aksonov. Domnevamo lahko, da dalj{e pomanjkanje NGF pri nevronih, ki niso predhodno brsteli, te nevrone prej privede do stanja, v katerem morajo retrahirati svoje aksone iz brezceli~nega segmenta, kjer ni rastnih dejavnikov, kot brste~e aksone. Teoreti~no bi bilo mo`no, da je tudi za retrakcijo primarni vzrok degeneracija rastne podlage in to tistega dela podlage, ki so ga regenerirajo~i se aksoni `e prerasli. Adhezija na podlago bi lahko popustila, ~e bi propadla ve~ina adhezijskih molekul v bazalnih laminah, aksoni bi se zato morali retrahirati. Vendar na{e poznavanje literature ne daje nobene razlage, kako bi lahko predhodno brstenje v ko`i naredilo BL nevrilemskih cevk bolj odporno na naknadno degeneracijo v brezceli~nem distalnem krnu, ~eprav tega tudi izklju~iti ni mogo~e. Zato domnevamo, da gre primarni u~inek predhodnega kolateralnega brstenja prek telesa nevrona. Mo`no pa bi bilo, da gre za kombinacijo obeh mehanizmov in da so na napredujo~e degenerativne spremembe podlage bolj ob~utljivi aksoni, ki nimajo trofi~ne podpore SC (aksoni, ki se regenerirajo skozi brezceli~ni krn brez predhodnega kolateralnega brstenja). Predhodno brste~i aksoni so zaradi dolgotrajnega vpliva rastnih dejavnikov, katerih so bili v obdobju kolateralnega brstenja dele`ni v pove~ani koli~ini, na neugodne spremembe rastne podlage bolj odporni, kar bi retrakcijo odlo`ilo. Aksoni v po{kodovanih suralnih `ivcih skupine C, kjer smo ob aksonotmezi in zmrzovanju `ivca z mitomicinom dodatno zavrli proliferacijo SC v proksimalnem krnu, so se v tretji fazi regeneracije, torej fazi retrakcije, umaknili prav do mesta aksonotmeze. To lahko pripi{emo skoraj popolni odsotnosti SC v distalnem krnu v celotnem opazovanem obdobju (mitomicin v takih pogojih zavre proliferacijo SC vsaj za 4 tedne, (94)) in posledi~no bolj izra`enemu pomanjkanju trofi~nih dejavnikov kot v skupini A, kjer so se od trenutka po{kodbe naprej SC v proksimalnem krnu razmno`evale in migrirale v brezceli~ni distalni krn. Zdi se, da se v razmerah, ko rastna podlaga regenerirajo~ih se aksonov degenerira, rastnih dejavnikov v okolici aksonskih kon~i~ev pa dlje ~asa primanjkuje, prej rasto~i aksoni retrahirajo prav do SC, ki so hkrati rastna podlaga in vir trofi~nih dejavnikov. Opazili smo namre~, da so se v primeru, ko so se SC iz proksimalnega krna lahko razmno`evale in migrirale, aksoni 28 dni po po{kodbi retrahirali na razdaljo pribli`no 7 mm distalno od po{- kodbe (razdaljo, ki so jo iz proksimalnega krna migrirajo~e SC v tem ~asu verjetno `e dosegle (98)). V poskusni skupini C, kjer 28 dni po po{kodbi v distalnem krnu verjetno ni bilo SC, so se aksoni umaknili prav do mesta po{kodbe. Za podkrepitev teh domnev bi bile potrebne nadaljnje morfolo{ke raziskave. Sklepamo torej lahko, da je pomen celi~ne podpore regenerirajo~im se aksonom v distalnem krnu po{kodovanega `ivca najbr` trojen: razmno`ene SC tvorijo in vzdr`ujejo ugodno rastno podlago za elongacijo in prepre- ~itev retrakcije aksonov, rastni dejavniki iz SC omogo~ijo regenerirajo~im se aksonom ve~jo odpornost na poslab{anje lastnosti rastne podlage, ob ohranjeni podlagi rastni dejavniki iz SC pospe{ijo elongacijo regenerirajo~ih se aksonov. Problem razlike med aksonotmezo in nevrotmezo glede regeneracije skozi brezceli~ni krn Podobnega opa`anja o ve~faznosti regeneracije senzori~nih aksonov v literaturi nismo zasledili. Vsi nam znani poskusi, v katerih so raziskovali u~inek dolgotrajne odsotnosti celi~ne podpore v distalnem krnu na regeneracijo, so namre~ kot model poskusne po{kodbe uporabili nevrotmezo, popolno prekinitev `ivca. Anderson in sodelavci so, ko so primerjali rast aksonov v celi~ni in brezceli~ni presadek, opazili rast aksonov v brezceli~ni presadek {ele 17