Aspirinska intoleranca pri astmatičnih bolnikih Samo Maglica V seminarski nalogi je predstavljen matematični model presnove arahidonske kisline, s kat

Transkripcija

1 Aspirinska intoleranca pri astmatičnih bolnikih Samo Maglica V seminarski nalogi je predstavljen matematični model presnove arahidonske kisline, s katerim je mogoče preučevati vzroke za pojav astmatičnega napada pri astmatičnih bolnikih, kot nezaželenega stranskega učinka zaužitja aspirina in drugih nesteroidnih protivnetnih zdravil. Mentor: asist. mag. Andrej Dobovišek Maribor, 2010

2 Kazalo 1 Uvod Presnova arahidonske kisline Osnove encimske kinetike Matematični model presnove arahidonske kisline Analiza rezultatov Zaključek

3 1 Uvod Opazovanja, o katerih poročajo v kliničnih raziskavah [1,2], kažejo, da se pri 10% do 20% astmatičnih bolnikih 30 min do 60 min po zaužitju aspirina ali katerega drugega nesteroidnega protivnetnega zdravila kot neželen učinek pojavi astmatični napad. Ta pojav se imenuje aspirinska intoleranca, astmatični bolniki pa aspirinsko intolerantni astmatiki (AIA). Razumevanje aspirinske intolerance je iz medicinskega stališča izjemnega pomena takrat, ko je astmatične bolnike potrebno zdraviti z omenjenimi zdravili, npr. pri revmatoidnem artritisu. Čeprav je sam mehanizem učinkovanja nesteroidnih protivnetnih zdravil že dobro znan, pa mehanizma, ki privede do nastanka astmatičnega napada pri AIA, še ne znamo povsem natančno pojasniti. Znano je, da zdravilo učinkuje na celično presnovo arahidonske kisline (AA) v belih krvnih celicah kot so eozinofilci. V teh celicah zdravilo inhibira oz. zavre delovanje encimov prostaglandin sintaz 1 in 2 (PGHS1 in PGHS2) in s tem preusmeri celično presnovo AA po poti, v kateri se tvorijo t.i. cisteinil-leukotrieni (cys-lts), ki so znani kot snovi, ki povzročajo vnetje. Eksperimentalno je potrjeno, da je pri razvoju astmatičnega napada ključnega pomena cistenil leukotrien C 4 [3]. Vendar pa je opisan mehanizem značilen tako za astmatike, kakor tudi za neastmatike. Zakaj se torej astmatični napad pojavi le pri 10% do 20% astmatičnih bolnikov? Na to vprašanje še ne znamo natančno odgovoriti, obstajajo pa različne hipoteze zasnovane na eksperimentalnih podatkih, ki poskušajo to pojasniti. Klinična opažanja na astmatičnih bolnikih kažejo, da je po zaužitju zdravila koncentracija cys- LTs v urinu AIA kar 2-krat do 10-krat višja kot v urinu aspirinsko tolerantnih astmatikov (ATA) [1]. Po drugi strani pa biokemijske raziskave kažejo, da je ekspresija oz. totalna koncentracija encima leukotrien C 4 sintaza (LTC 4 S) pri AIA 5-krat višja kot pri ATA [1] in ekspresija encima PGHS2 kar 6-krat nižja [4]. Prav ti dve eksperimentalno odkriti dejstvi naj bi bili ključnega pomena pri razlagi aspirinske intolerance. Razlike v koncentraciji teh dveh encimov bi lahko povzročile neprimerno višjo koncentracijo cys-lts v belih krvnih celicah AIA in s tem tudi večji izpust vnetnih mediatorjev iz celic v kri. To je tudi osrednja hipoteza, ki jo raziskovalci na FNM UM raziskujejo z matematičnim modelom, da bi hipotezo ovrgli ali potrdili. V seminarski nalogi bom najprej opisal presnovo AA. Nato bom predstavili osnove encimske kinetike in celovit matematični model presnove AA, ter z njim preučeval učinkovanje nesterodinih protivnetnih zdravil na presnovo AA in tvorbo oz. sintezo LTC 4. Ob upoštevanju različnih modelnih pogojev bom simuliral stanje aspirinske tolerance oz. intolerance. Rezultate bom predstavili in komentiral v zadnjem poglavju. 2 Presnova arahidonske kisline Arahidonska kislina je esencialna maščobna kislina, ki se nahaja v celičnem tkivu človeškega telesa. Presnova AA poteka po dveh poteh, to sta t.i. ciklooksigenazna in lipoksigenzna pot, kot to prikazuje slika 1. Pretvorba AA v končne produkte poteka preko encimskih reakcij. V nadaljevanju bom opisali mrežo encimskih reakcij, ki tvorijo presnovo oz. metabolizem AA. 3

4 Ciklooksigenzna pot poteka preko encimov PGHS1 in PGHS2. Ta encima sta nujna pri uravnavanju fizioloških in patofizioloških procesov pri vnetnih obolenjih. Pri normalnem poteku encimske reakcije se AA preko teh dveh encimov pretvori v vnetne in protivnetne prostanglandine (pipgs in aipgs). aipgs inhibirajo delovanje encima 5-lipoksigenaza (5-LO) in zato zavirajo presnovo AA po lipoksigenazni poti. S tem posledično zavirajo tudi nastanek leukotriena C 4 (LTC 4 ), prvega izmed cys-lts. Slika 1. Presnova AA. Vsaka puščica ponazarja kemijsko reakcijo. Nad puščicami so zapisane kratice encimov, ki katalizirajo te reakcije. Če nad puščico ni kratice encima, tedaj te reakcije ne katalizira encim. Inhibitorni učinek zdravila na encima PGHS1 in PGHS2, ter inhibitorni učinek aipgs na encim 5-LO je ponazorjen z znakom -. Z v j, kjer je j = 1 9, so označeni tokovi v presnovi AA. V lipoksigenazni poti encim 5-lipoksigenaza (5-LO) katalizira prvo reakcijo, v kateri se AA pretvori v molekulo leukotriena A 4 (LTA 4 ). Molekula LTA 4 se lahko naprej pretvori po dveh poteh. Ali se veže na encim leukotrien A 4 hidrolazo (LTA 4 H), pri čemer nastane molekula leukotriena B 4 (LTB 4 ), ali pa se veže na encim leukotrien C 4 sintazo (LTC 4 S), ki pa ob prisotnosti molekule glutationa (GSH), molekulo LTA 4 pretvori v molekulo LTC 4. Končni produkti obeh metaboličnih poti AA, to so aipgs, pipgs in LTC 4, se nato izločijo iz celic v kri. Kadar je v organizmu prisotno zdravilo, molekule zdravila prodrejo v notranjost celic, kjer zavirajo delovanje encimov PGHS1 in PGHS2, kar je s črtkano črto in znakom prikazano tudi na sliki 1. S tem se za določen čas prekine sinteza aipgs, posledično pa se presnova AA sprosti po lipoksigenazni poti, s čimer se pospeši sinteza LTC 4, ki se nato izloči iz celice. LTC 4 se veže na receptorje mišičnih celic dihalnih poti in povzroči njihovo krčenje. To se kaže kot astmatični napad. 4

5 2.1 Osnove encimske kinetike Hitrosti encimskih reakcij na sliki 1 opišemo s t. i. Michaelis-Mentenovo kinetiko. Najbolj preprosta encimska reakcija poteka po mehanizmu prikazanem na sliki 2a. Na sliki 2a je E molekula encima in S molekula substrata. Ti dve molekuli se vežeta v molekulo vmesnega produkta ES, ki nato razpade na encim E in končni produkt P [3]. Hitrost encimske reakcije je definirana kot časovni odvod koncentracije produkta P po času. Za mehanizem, ki je predstavljen na sliki 2a lahko pokažemo, da je hitrost v reakcije odvisna od koncentracije substrata v skladu z enačbo: v = # $%&[(] * $ +[(], (1) kjer je [S] koncentracija substrata in K m Michaelis-Mentenova konstanta. Z v max označimo maksimalno hitrost reakcije, ki je odvisna od totalne koncentracije encima [E] T : v./0 = k 2 [E] 4, (2) kjer je k 2 kinetična konstanta. Pod kinetično shemo na sliki 2a je prikazan tudi graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije substrata. V seminarski nalogi bomo obravnavali tudi reakcije, kjer določena substanca inhibira oz. zavira encimsko reakcijo. Takšno substanco imenujemo inhibitor. Kinetična shema encimske reakcije ob prisotnosti inhibitorja je prikazana na sliki 2b. V takšni reakciji inhibitor, v našem primeru zdravilo, s substratom 'tekmuje' za vezavno mesto na encimu. Gre za t. i. kompetitivno inhibicijo. Nesteroidna zdravila so prav kompetitivni inhibitorji encimov PGHS1 in PGHS2. Hitrost reakcije za tak primer je podana z enačbo: v = # $%&[(] * $ 5+[(], (3) pri čemer je: α = 1 + [9] * :, (4) kjer je [I] koncentracija inhibitorja, K i pa razmerje kinetičnih konstant k -i /k +i. Pod kinetično shemo na sliki 2b je prikazan tudi graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije inhibitorja. 5

6 a) b) Slika 2. a) Kinetična shema osnovne encimske reakcije (zgoraj) in graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije substrata (spodaj). b) Kinetična shema encimske reakcije ob prisotnosti inhibitorja (zgoraj) in graf hitrosti reakcije v odvisnosti od koncentracije inhibitorja (spodaj). 2.2 Matematični model presnove arahidonske kisline V tem poglavju bomo predstavili model presnove AA. Model tvori sistem šestih nelinearnih diferencialnih enačb 1. reda, ki opisuje časovno spreminjanje modelnih spremenljivk, ki so koncentracije [AA], [aipgs], [pipgs], [LTA 4 ], [LTB 4 ] in [LTC 4 ]. Časovno spreminjanje koncentracije arahidonske kisline opiše enačba: ;[<<] ;= = v > v A v B, (5) kjer so v 0, v 1, v 3 in v 5 hitrosti kemijskih reakcij v skladu s kinetično shemo, prikazano na sliki 1. Enačba, ki opisuje časovno spreminjanje metabolita [LTA 4 ], je: ;[C4< D ] ;= = v B v E v F, (6) kjer so v 5, v 6 in v 8 hitrosti encimskih reakcij 5, 6 in 8. Časovno spreminjanje [aipgs], [pipgs], [LTB 4 ] in [LTC 4 ] opišejo dodatne štiri diferencialne enačbe, ki imajo naslednjo obliko: ;[0] ;= = v G v G+@, (7) pri čemer smo modelno spremenljivko splošneje označili z x, hitrosti kemijskih reakcij pa smo opremili z indeksom j, ki zavzame vrednosti j = 1, 3, 6, 8. Pri tem velja: x = pipgs za j = 1, x = aipgs za j = 3, x = LTA 4 za j = 5, x = LTC 4 za j = 6 in x = LTB 4 za j = 8. V nadaljevanju bomo podali še opis hitrosti posameznih encimskih reakcij t.j. tokov, ki so označeni na sliki 1. Hitrosti reakciji 1, 3 in 5 opiše enačba [5,6]: 6

7 v G = # $%&H[<<] * $H 5 H +[<<], kjer je j = 1, 3 ali 5 in je v maxj maksimalna hitrost ustrezne encimske reakcije. K mj je Michaelis- Mentenova konstanta reakcij. Za j = 1 in 3 velja [5]: α = 1 + [9] + [9],, * :H * :H * :H kjer je [I] koncentracija zdravila K ij in K ij ' pa sta ravnovesni konstanti vezave zdravila na encima PGHS1 in PGHS2. Z j = 5 velja: α = 1 + [/IJKL] * :H, kjer je K i5 konstanta inhibicije encima 5-LO, [aipgs] pa koncentracija protivnetnih prostaglandinov. Reakcije 1, 3 in 5 smo torej v osnovi opisali z enačbama (3) in (4). Hitrost reakcij 8 in 9 opišemo z osnovnim nastavkom, ki je podan z enačbo (1) [7,8]: v F = # $%&H[0] * $H +[0], kjer je j = 8 in 9 in pri čemer velja: x = LTA 4 za j = 8 in x = LTB 4 za j = 9. Hitrosti reakcij 2, 4, 7 in 9 opišemo kar z linearno funkcijo [9,10], ki jo za j = 2, 4, 7, in 9 splošneje zapišemo kot: v G = k G [x], pri čemer so k j kinetične konstante z x pa smo ponovno splošneje označili metabolite, pri čemer velja: x = pipgs za j = 2, x = aipgs za j = 4, x = LTC 4 za j = 7 in x = LTB 4 za j = 9. Najbolj zanimivo in hkrati tudi najkompleksnejšo kinetiko ima reakcija 6. Hitrost te reakcije je podana z enačbo [11]: kjer so A, B in C konstante. v E = # $%&N [C4< D ] <+O[C4< D ]+P[C4< D ] Q, V modelu upoštevamo tudi časovno spreminjanje koncentracije zdravila, ki je podan z naslednjo funkcijo: [I](t) = V d [I]./0 W t Xt Y ; 0 < [I]./0 e _(=_=`)/b ; t kjer je [I] koncentracija zdravila. Vrednost koncentracije opazujemo na dveh časovnih intervalih. Čas, v katerem koncentracija zdravila v telesu naraste na maksimalno vrednost označimo s t 1. Pri 7

8 večjih časih se koncentracija eksponentno zmanjšuje s karakterističnim časom, ki je podan v tabeli 1. Vrednosti modelnih parametrov so podane v tabeli 1. Parameter Opis parametra V rednost parametra Referenca Reakcija 1 v max1 Maksimalna hitrost reakcije 1 0,65 µms -1 [5,12] K m1 Michaelis-Mentenova konstanta 2,5 µm [5,12] K i1 Konstanta inhibicije PGHS 2 0,091 µm [5,12] K i1 ' Konstanta inhibicije PGHS 2 11,2 [5,12] Reakcija 2 k 2 Kinetična konstanta 0,0028 s -1 [9] Reakcija 3 v max3 Maksimalna hitrost reakcije 3 0,65 µms -1 [5,12] K m3 Michaelis-Mentenova konstanta 3,0 µm [5, 12] K i3 Konstanta inhibicije PGHS 1 10 µm [5,12] ' K i3 Konstanta inhibicije PGHS 1 0,0033 [5,12] Reakcija 4 k 4 Kinetična konstanta 0,0028 s -1 [9] Reakcija 5 v max5 Maksimalna hitrost reakcije 5 86 µms -1 [6] K m5 Michaelis Mentenova konstanta 25,4 µm [6] K i5 Konstanta inhibicije 0,03 µm [6] Reakcija 6 v max6 Maksimalna hitrost reakcije 6 0,23 µms -1 [11] A Konstanta 56 µm [11] B Konstanta 1,4 [11] C Konstanta 0,17 µm -1 [11] Reakcija 7 k 7 Kinetična konstanta 0,0015 s -1 [10] Reakcija 8 v max8 Maksimalna hitrost reakcije 8 3,7 µms -1 [7] K m8 Michaelis-Mentenova konstanta 27 µm [7] Reakcija 9 v max9 Maksimalna hitrost reakcije 9 5,74 µms -1 [8] K m9 Michaelis-Mentenova konstanta 239 µm [8] Ostali parametri v o Hitrost dotoka AA 0,7 µms -1 - [I] o Začetna koncentracija zdravila 0 - [I] max Maksimalna koncentracija zdravila 50 µm [13] 1 t Čas maksimalne koncentracije zdravila 300s [13] Karakteristični čas 1430 s Tabela 1: Opis in vrednosti modelnih parametrov 8

9 Osnovne modelne enačbe (5), (6) in (7) numerično integriramo v programu Berkeley Madonna z integracijsko metodo Runge-Kutta 4. reda. Osredotočimo smo se na analizo časovnih potekov ključnega metabolita LTC 4. Namen matematičnega modela je simulirati stanje aspirinske tolerance oz. intolerance. V ta namen na osnovi vrednosti modelnih parametrov definiramo različna modelna stanja. Kot izhodiščno stanje izberemo stanje aspirinske tolerance ATA. To modelno stanje je definirano z vrednostmi modelnih parametrov, ki so podane v tabeli 1. Pri definiciji modelnih stanj, ki bi lahko ustrezala aspirinski intoleranci pa izhajamo iz naslednjih eksperimentalnih izhodišč: i) [LTC 4 S] T pri AIA je 5-krat višja kot pri ATA [1] in ii) [PGHS2] T pri AIA je 6-krat nižja kot pri ATA [4]. Parametra [LTC 4 S] T in [PGHS2] T v predstavljenem modelu sicer ne nastopata eksplicitno, ker pa je totalna koncentracija encima [E] T po enačbi (2) sorazmerna z maksimalno hitrostjo reakcije v max, je 5-krat povišano vrednost [LTC 4 S] T v modelnem stanju AIA možno simulirati s 5-krat višjo vrednostjo parametra v max6 v primerjavi z izhodiščnim modelnim stanjem ATA. Na enak način je z 6-krat nižjo vrednostjo parametra v max1 glede na stanje ATA možno simulirati tudi 6-krat nižjo vrednost [PGHS2] T v stanju AIA. Med posameznimi aspirinsko tolerantnimi in intolerantnimi modelnimi stanji bomo torej razlikovali glede na vrednosti parametrov v max1 in v max6. Glede na razpoložljive eksperimentalne podatke je možno definirati naslednja intolerantna stanja: AIA 1 - modelno stanje s 5-krat višjo [LTC 4 S] T, ki ga opišemo s 5- krat višjo vrednostjo parametra v max6 kot v stanju ATA. AIA 2 modelno stanje z 6-krat nižjo [PGHS2] T, ki ga opišemo s 6-krat nižjo vrednostjo parametra v max6 kot v stanju ATA. AIA 3 - stanje, v katerem upoštevamo oba efekta, t.j. povišano vrednost [LTC 4 S] T in znižano vrednost [PGHS2] T in je tako definirano s 5-krat višjo vrednostjo parametra v max6 in 6-krat nižjo vrednostjo parametra v max6 kot v stanju ATA. Za izhodiščno stanje so vsi parametri podani v tabeli 1, za stanja AIA 1, AIA 2 in AIA 3 pa so vrednosti modelnih parametrov v max1 in v max6 podane v tabeli 2, vsi ostali parametri pa so enaki kot v stanju ATA. Parameter A I A 1 A I A 2 A I A 3 v max1 0,65 μms -1 0,11 μms -1 0,11 μms -1 v max6 1,15 μms -1 0,23 μms ,15 μms -1-1 Tabela 2: Vrednosti parametrov v max1, v max6 v modelnih stanjih AIA 1, AIA 2 in AIA 3 9

10 3 Analiza rezultatov Časovni potek [LTC 4 ] v posameznih modelnih stanjih pred in med učinkovanjem zdravila so prikazani na sliki 3. Časovni signal zdravila smo sprožili ob času t = 125 min. Slika 3. Časovni potek [LTC 4 ] v celici za različna modelna stanja ATA (črna krivulja), AIA 1 (rdeča krivulja), AIA 2 (zelena krivulja) in AIA 3 (modra krivulja). Ko opazujemo časovne poteke [LTC 4 ] za različna modelna stanja, ugotovimo, da se pri vseh AIA stanjih [LTC 4 ] poveča v primerjavi z ATA po zaužitju zdravila. Pri AIA 1 in AIA 2 je maksimalna vrednost [LTC 4 ] praktično enaka, vendar [LTC 4 ] doseže maksimalne vrednosti ob različnih časih od začetka učinkovanja zdravila. Neprimerno višja, kot v stanjih ATA, AIA 1 in AIA 2 je maksimalna vrednost [LTC 4 ] pri AIA 3. Tako visoka vrednost [LTC 4 ] pri AIA 3 bi lahko sprožila astmatični napad. Poglejmo, če je časovna skala izračunanih rezultatov v skladu z eksperimentalnimi opažanji. Zanima nas čas od zaužitja zdravila do pojava astmatičnega napada. Po eksperimentalnih opažanjih [1] bi ta čas naj bil nekje med 30 min in 60 min. Po drugi strani pa v referenci [3] dobimo podatek, da se mišične celice dihalni poti skrčijo približno 15 min po tem, ko jih stimuliramo z LTC 4. Če privzamemo, da je stimulacija mišičnih celic z LTC 4 v človeškem telesu najintenzivnejša v trenutku, ko je vrednost [LTC 4 ] največja, tedaj lahko pričakovani čas do astmatičnega pojava v grobem ocenimo kot vsoto časovnega intervala od pričetka učinkovanja zdravila do trenutka, ko [LTC 4 ] zavzame maksimalno vrednost ( t max ) in časovnega intervala od stimulacije do razvoja sile v mišici t k. Vrednost t max lahko za posamezno intolerantno stanje odčitamo iz krivulj na sliki 3, za vrednost t k pa uporabimo podatek iz reference [3] in znaša t k = 15 min. Iz grafa za stanje AIA 3 odčitamo vrednost t max = 33 min. Če temu prištejemo še eksperimentalno določeno vrednost, dobimo za zakasnitev med zaužitjem zdravila in astmatičnim napadom končno izračunano vrednost t k + t max = 33 min + 15 min = 48 min, kar 10

11 je v skladu s kliničnimi opažanji reference [1]. S tem lahko potrdimo, da je v okviru matematičnega modela izhodiščna hipoteza točna. Encima LTC 4 S in PGHS2 zares vplivata na povišano koncentracijo LTC 4. Še več, ko v modelu uporabimo eksperimentalne podatke, lahko precej natančno napovemo čas, ko bi lahko pričakovali astmatični napad. 4 Zaključek V seminarski nalogi sem predstavil matematični model, ki kvantitativno opisuje metabolizem arahidonske kisline v človeškem telesu. Z modelom je mogoče uspešno napovedati pojav astmatičnega napada pri bolnikih z AIA. S tem je tesno povezan pojav aspirinske intolerance, ki sem ga v seminarju tudi razložil. Literatura [1] A. Szczeklik, D. Stevenson, Aspirin-induced asthma: Advances in pathogenesis and management, Journal of Allergy and Clinical Immunology 104 (1), 5 (1999). [2] Zbornik sestanka: Aspirinska intoleranca in rinitis, Bolnišnica Golnik - Klinični oddelek za pljučne bolezni in alergijo, [3] H. Setoguchi, J. Nishimura, K. Hirano, S. Takahashi, H. Kanaide, Leukotriene C 4 enhances the contraction of porcine tracheal smooth muscle trough the activation of Y-27632, a rho kinase inhibitor, sensitive pathway, British Journal of Pharmacology 132 (1), 111 (2001). [4] C. Picado, J. C. Fernandez-Morata, M. Juan, J. Roca-Ferrer, M. Fuentes, A. Xaubet, J. Mullol, Cyclooxygenase-2 mrna is downexpressed in nasal polyps from aspirin-sensitive asthmatics, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 160 (1), 291 (1999). [5] O. H. Callan, O. Y. So, D. C. Swinney, The kinetic factors that determine the affinity and selectivity for slow binding inhibition of human prostaglandin H synthase 1 and 2 by indomethacin and flurbiprofen, Journal of Biological Chemistry 271 (7), 2548 (1996). [6] D. Aharony, R. Stein, Kinetic mechanism of guinea pig neutrophil 5-lipoxygenase, Journal of Biological Chemistry 261 (25), (1986). [7] Haeggström, T. Bergman, H. Jörnvall, O. Rådmark, Guinea-pig liver leukotriene A 4 hydrolase. Purification, characterization and structural properties, European Journal of Biochemistry, 174 (4), 717 (1988). [8] B. K. Lam, L. Gagnon, K. F. Austen, R. J. Soberman, The mechanism of leukotriene B 4 export from human polymorphonuclear leukocytes, Journal of Biological Chemistry 265 (23), (1990). [9] M. Gonchar, M. Sergeeva, A. Mevkh, S. Varfolomeyev, Kinetics of prostanoid synthesis by macrophages is regulated by arachidonic acid sources, European Journal of Biochemistry 265 (2), 779 (1999). 11

12 [10] W. F. Owen Jr., R. J. Soberman, T. Yoshimoto, A. L. Sheffer, R. A. Lewis, K. F. Austen, Synthesis and release of leukotriene C 4 by human eosinophils, Journal of Immunology 138 (2), 532 (1987). [11] N. Gupta, M. Gresser, A. Ford-Hutchinson, Kinetic mechanism of glutathione conjugation to leukotriene A 4 by leukotriene C 4 synthase, Biochimica et Biophysica Acta 1391 (2), 157 (1998). [12] O. Y. So, L. E. Scarafia, A. Y. Mak, O. H. Callan, D. C. Swinney, The dynamics of prostaglandin H synthases. Studies with prostaglandin h synthase 2 Y355F unmask mechanisms of time-dependent inhibition and allosteric activation, Journal of Biological Chemistry 273 (10), 5807 (1998). [13] G. A. Higgs, J. A. Salmon, B. Henderson, J. R. Vane, Pharmacokinetics of aspirin and salicylate in relation to inhibition of arachidonate cyclooxygenase and anti-inflammatory activity, Proceedings of the National Academy of Sciences 84 (6), 1417 (1987). 12