(Microsoft Word - Magistrska naloga - Nina \212utar-kon\350na verzija)

Transkripcija

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO Oddelek za fiziko Magistrsko delo MODELIRANJE VPLIVA CIKLIČNEGA GVANOZIN MONOFOSFATA (cgmp) NA OD KALCIJA ODVISEN TONUS GLADKIH MIŠIČNIH CELIC ARTERIJ Oddelek za fiziko FNM Mentor: doc. dr. Aleš Fajmut Kandidatka: Nina Šutar Maribor, 2015

2 Zahvala Največja zahvala gre mojemu mentorju doc. dr. Alešu Fajmutu, ki ima glavne zasluge, da je to magistrsko delo ugledalo luč sveta. Hvaležna sem mu za ves čas, ki mi ga je posvetil in za vso znanje, ki sem ga prejela od njega. Zahvaljujem se staršem, ker so mi omogočili študij in me pri tem ves čas podpirali, kot to počno že ves čas. Hvala tudi fantu Urošu za vso podporo, potrpežljivost in vzpodbudo. Zahvalila pa bi se tudi svojim prijateljem, ki so pot do sem naredili zabavnejšo. HVALA!

3 IZJAVA Podpisana Nina Šutar, rojena , študentka Fakultete za naravoslovje in matematiko Univerze v Mariboru, študijskega programa Fizika, izjavljam, da je magistrsko delo z naslovom MODELIRANJE VPLIVA CIKLIČNEGA GVANOZIN MONOFOSFATA (cgmp) NA OD KALCIJA ODVISEN TONUS GLADKIH MIŠIČNIH CELIC ARTERIJ pri mentorju doc. dr. Alešu Fajmutu, avtorsko delo. V magistrskem delu so uporabljeni viri in literatura korektno navedeni; teksti in druge oblike zapisov niso uporabljeni brez navedbe avtorjev. Maribor, Podpis: III

4 Šutar N.: Modeliranje vpliva cikličnega gvanozin monofosfata (cgmp) na od kalcija odvisen tonus gladkih mišičnih celic arterij. Magistrsko delo, Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za fiziko, IZVLEČEK: V magistrski nalogi je izdelan in analiziran model za simulacijo od kalcija (Ca 2+ ) odvisnega razvoja sile v gladkih mišičnih celicah (GMC) arterij. Z modelom simuliramo vpliv povišane produkcije cikličnega gvanozin monofosfata (cgmp), ki v celici nastane kot posledica povišane ravni dušikovega oksida (NO) v endoteliju žil, na obliko signala Ca 2+ v citoplazmi GMC. NO lahko nastaja v endotelijski plasti žilne stene kot posledica povišane strižne napetosti krvi na stene arterij. NO iz endotelijskih celic difundira v gladko mišičnino, kjer stimulira produkcijo cgmp. V magistrskem delu je glavna tema modeliranje vpliva koncentracije tega sekundarnega prenašalca na od Ca 2+ odvisen razvoj sile v GMC. V modelu za kodacijo signala Ca 2+ v citoplazmi GMC upoštevamo vpliv molekule cgmp na od kalcija odvisne kanale za kalij (K + ) (KCa) in klor (Cl - ) (ClCa), izmenjevalce natrija (Na + ) in kalcija (Ca 2+ ) (NCX) in črpalke Na + in K + (Na/K). Poleg tega model vključuje še prehajanje Ca 2+ skozi napetostno odvisne kanale (VOCC), črpalke za Ca 2+ v celični membrani (PMCA) in v sarkoplazemskem retikulumu (SR) (SERCA), kanale, ki so odvisni od inozitol trifosfata (IP3) in Ca 2+ (ICICR). Model vključuje še pasivno prehajanje vseh ionov, t.j. ionov Cl -, Na +, K + in Ca 2+ preko membrane. Z električnimi tokovi teh ionov je pogojena tudi membranska napetost. V modelu upoštevamo še vezavo Ca 2+ na proteine v SR in v citoplazmi. Razvoj sile modeliramo s 4-stanjskim modelom interakcij med miozinom in aktinom, ki jih regulira aktivna oblika encima kinaze lahkih verig miozina (MLCK), ki je odvisna od Ca 2+. Razvoj sile modeliramo v območju koncentracije cgmp med 0 in mol/m 3. Pri vrednosti [cgmp] = mol/m 3 doseže povprečna vrednost koncentracije Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c,pov) svoj minimum. Ker [Ca 2+ ]c,pov močno korelira z razvito silo v GMC, pri enaki vrednosti [cgmp], doseže svoj minimum tudi sila, katere vrednost znaša 25% maksimalne sile, ki jo je celica sposobna razviti. Pri zelo nizki koncentraciji cgmp ([cgmp]=0, mol/m 3 ) pa znaša sila 61% maksimalne sile. Padec sile v odvisnosti od cgmp je pogojen s spremembo frekvence in amplitude oscilacij Ca 2+ v citoplazmi. Ključne besede: arterija, gladka mišična celica, kalcij, dušikov oksid, kontrakcija, membranska napetost, ionski tokovi, matematični model IV

5 Šutar N.: Modelling of the influence of cyclic guanosine monophosphate (cgmp) on the calcium dependent tone of arterial smooth muscle cells. Master thesis, University of Maribor, Faculty of Natural Sciences and Mathematics, Department of Physics, ABSTRACT: In the master thesis we study the influence of increased cyclic guanosine monophosphate (cgmp) levels on the cytosolic calcium (Ca 2+ ) by means of mathematical model accounting for the analysis of force development within vascular smooth muscle cell (SMC). cgmp levels in SMC might increase due to increased shear stress on vessel walls implicating the rise in nitric oxide (NO) production in endothelial cells. NO in turn activates enzyme soluble guanylate cyclase (sgc) producing cgmp in SMC. The main topic of the thesis is the modelling of the impact of cgmp on the Ca 2+ signal, and consequently also on the force development in SMC. Four targets of cgmp are considered for modelling: large conductance Ca 2+ -activated potassium (K + ) channels (KCa), Ca 2+ -dependent chloride (Cl - ) channels (ClCa), sodium (Na + ) and Ca 2+ exchanger (NCX) as well as Na + /K + -ATPase (Na/K). Model also takes into account mathematical descriptions of the voltage-operated Ca 2+ channels (VOCC), plasma membrane Ca 2+ - ATPase (PMCA) and background electric currents of Na +, Cl -, K + and Ca 2+ through plasma membrane. Electric currents of these ions imply the transmembrane potential. The intracellular Ca 2+ stores considered are sarcoplasmic reticulum (SR) and Ca 2+ buffering proteins. The mechanisms of Ca 2+ exchange between the cytosol and the SR taken into account are: Ca 2+ -ATPase (SERCA), IP3 and Ca 2+ dependent channels (ICICR), Ca 2+ leak as well as Ca 2+ buffering to proteins in the SR and the cytosol. Modelling of the force development in SMC is carried out with the 4-state latch bridge model upgraded with the Ca 2+ -dependent regulation of the myosin light chain kinase (MLCK) activity. The development of force in SMC is simulated for concentrations of cgmp ([cgmp]) ranging from 0 to mol/m 3. At mol/m 3, the mean cytosolic Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ]c,pov) reaches its minimum and correlates well with the minimum of force being 25% of the maximal developed force (Fmax). At rather low [cgmp] (i.e. 0, mol/m 3 ), the force reaches 61% of Fmax. The drop of force with respect to increased [cgmp] is due to changes in the frequency and the amplitude of the Ca 2+ signal. Key words: artery, smooth muscle cell, calcium, nitric oxide, contraction, membrane potential, ionic fluxes, mathematical model V

6 POGOSTO UPORABLJENE OKRAJŠAVE Ach ADP ATP CaM camp cgmp EDRF enos GMC GTP inos IP3 MHC MLC MLCK MLCP NO PKA PKG sgc SR VGMC acetilholin adenozin difosfat adenozin trifosfat kalmodulin ciklični adenozin monofosfat ciklični gvanozin monofosfat endotelijski relaksacijski faktor endotelijska sintaza NO gladka mišična celica gvanozin trifosfat inducibilna sintaza NO inozitol trifosfat težke verige miozina lahke verige miozina kinaza lahkih verig miozina fosfataza lahkih verig miozina dušikov oksid protein kinaza A protein kinaza G topna gvanilat ciklaza sarkoplazemski retikulum vaskularna gladka mišična celica VI

7 KAZALO 1 UVOD MEHANIZEM KRČENJA IN RELAKSACIJE GLADKIH MIŠIČNIH CELIC RAZVOJ MODELIRANJA KALCIJEVE DINAMIKE IZPELJAVA NEKATERIH OSNOVNIH ENAČB ZA MODELIRANJE KALCIJEVE DINAMIKE Modeliranje tokov skozi napetostno regulirane ionske kanale Modeliranje tokov preko transporterjev in črpalk MODEL ZA OD KALCIJA ODVISNI RAZVOJ SILE V GLADKI MIŠIČNI CELICI ARTERIJE Tokovi kalcija preko celične membrane JPM Električni tok skozi napetostno odvisne kalcijeve kanale IVOCC Električni tok skozi kalcijeve črpalke PMCA IPMCA Električni tok skozi izmenjevalce natrija in kalcija INCX Tokovi izmenjave kalcija z vezavnimi proteini v citoplazmi JPrC Tokovi kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma JSR Tok kalcija skozi kanale ICICR JICICR Tok kalcija skozi črpalke SERCA JSERCA Pasivni tok kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma JpasSR Tokovi izmenjave kalcija z vezavnimi proteini v sarkoplazemskem retikulumu JPrSR Električni tokovi ostalih ionov Električni tok preko od kalcija odvisnih klorovih kanalov IClCa Električni tok preko črpalk natrija in kalija INa/K Električni tok skozi od kalcija odvisne kalijeve kanale IKCa Pasivni električni tokovi ionov Ipas_x Modeliranje razvoja sile v gladki mišični celici FGMC REZULTATI IN DISKUSIJA ZAKLJUČEK VIRI

8 1 UVOD Že dolgo je znano, da ima nitroglicerin vazodilatorni učinek, kar se že več kot 100 let izkorišča za namene zdravljenja kardiovaskularnih bolezni, kot je npr. angina pektoris. Vazodilatorni učinek v nitroglicerinu ima pravzaprav molekula dušikovega oksida (NO), ki se sprošča iz nitroglicerina, kar pa je poznano precej manj časa. Prvi rezultati raziskav, ki povezujejo NO z relaksacijo žil, segajo približno 35 let nazaj. Tudi mnoga druga zdravila, ki imajo vazodilatorni učinek, temeljijo na sproščanju ali spodbujanju lastne produkcije NO v telesu. NO, ki je telesu lastna signalna molekula, se namreč producira tudi v endotelijskih celicah v stenah arterij (Slika 1). Endotelijska celica lahko prične proizvajati NO kot odgovor na strižno napetost tekočine (krvi) na stene žil. NO nato iz endotelijskih celic difundira preko membran v gladko mišično celico (GMC). V GMC se NO veže na topno gvanilat ciklazo (sgc) in tako stimulira produkcijo molekule ciklični gvanozin monofosfat (cgmp) iz gvanozin trifosfata (GTP). cgmp lahko direktno ali preko aktivacije encima protein kinaze G (PKG) vpliva na znižanje koncentracije intracelularnega kalcija preko različnih mehanizmov [1]. Slika 1. Prerez človeške arterije [2] 2

9 Nitroglicerin so kot zdravilo za relaksacijo arterij prvič uporabili v drugi polovici 19. stoletja. Ob samem začetku uporabe je bil njegov mehanizem delovanja popolnoma neznan. Odkrili so ga šele leta 1981 [3]. Glavno vlogo v procesu relaksacije gladkih mišičnih celic žil imata molekuli dušikov oksid (NO) in ciklični gvanozin monofosfat (cgmp). Še preden so NO spoznali za biološko pomembno molekulo, so že poročali o odkritju molekule cgmp v podganjem urinu leta 1963 [4]. Ob tem odkritju se je začelo množično raziskovanje njegove vloge. Leta 1969 so v tkivih sesalcev prvič odkrili encim topno gvanilat ciklazo (sgc) in njegovo vlogo kot katalizatorja pretvorbe gvanozin trifosfata (GTP) v cgmp in anorganski pirofosfat ob prisotnosti dvovalentnih kovinskih kationov, kot sta magnezij ali mangan [5]. Da cgmp deluje v relaksacijskih procesih, je bilo prvič nakazano, ko so ugotovili, da se ob naraščanju koncentracije cgmp v srcu, zmanjšuje njegova kontraktilnost. Do prvega konkretnejšega namiga, da cgmp sodeluje pri relaksaciji gladkih mišic, so prišli leta 1975 [6]. Odkrili so, da znani relaksanti gladkih mišic, kot so natrijev azid, hidroksil amin in natrijev nitrit, aktivirajo sgc in povišajo raven cgmp. Sledilo je še več raziskav, ki so podprle hipotezo, da je cgmp vključen v mehanizme relaksacije gladkih mišic. Leta 1979 so prvič izvedli eksperiment, ki je povezal NO s cgmp in relaksacijo gladkih mišic [7]. Ugotovili so, da NO aktivira encim sgc, ki je ključen pri tvorbi cgmp. Pokazali so, da imajo t.i. nitro spojine, iz katerih nastaja NO, vazodilatorni učinek. Prav tako so pokazali, da celo tobačni dim, ki vsebuje 800 ppm NO, aktivira sgc in povzroči relaksacijo gladkih mišic. Leta 1981 so dokazali, da nitrovazodilatorji (organski nitriti, nitriti estrov in anorganske nitro spojine) povzročijo relaksacijo vaskularnih gladkih mišic preko tvorbe NO [3]. Reakcija teh spojin s tioli namreč vodi do tvorbe S-nitrozitiolov, ki zaradi nestabilnosti razpadejo na NO in ostale spojine. V začetku osemdesetih let prejšnjega stoletja so tudi odkrili, da je relaksacija gladkih mišic odvisna od endotelija in od tedaj neznane molekule, ki izhaja iz endotelija in so jo na začetku poimenovali endotelijski relaksacijski faktor (EDRF) [8]. Šele 6 let kasneje je Louis J. Ignarro s sodelavci potrdil, da je EDRF dejansko molekula NO [9]. Za to odkritje je skupaj z Robertom F. Furchgottom in Feridom Muradom leta 1998 prejel Nobelovo nagrado [10]. To odkritje je sprožilo ogromno neodvisnih raziskav. Na omenjenem področju je veliko dela opravil tudi Salvador Moncada, ki pa ni bil med prejemniki Nobelove nagrade za svoje delo, kar je sprožilo številne burne odzive v znanstvenih krogih [11]. 3

10 NO je signalna molekula, cgmp pa predstavlja sekundarnega prenašalca tega signala. cgmp z vezavo na enega izmed treh glavnih vrst efektorskih proteinov vpliva na (1) protein kinaze, ki so odvisne od cgmp in fosforilirajo proteine (npr. protein kinaza G), (2) proteine ionskih kanalov, preko katerih cgmp regulira pretok ionov in (3) fosfodiesteraze, ki vplivajo na razgradnjo cgmp. cgmp preko efektorskih proteinov sodeluje pri različnih fizioloških funkcijah, kot so že omenjena relaksacija gladkih mišic, inhibicija agregacije trombocitov, regulacija nevrotransmisije in izločanje klorida in vode v črevesju idr. [1]. Encim PKG je homodimer in ima na vsakem protomeru po dve vezavni mesti za ciklični nukleotid. To pomeni, da so za aktivacijo ene molekule PKG potrebne 4 molekule cgmp [12]. Odvisnost premera žile od pretoka krvi je prvič opisal Schretzenmayr že leta 1933 [13]. Šele 47 let kasneje sta Furchgott in Zawadzki odkrila pomembnost endotelija pri regulaciji vaskularnega tonusa [14]. Pokazala sta, da hemodinamika krvi vpliva na tonus vaskularnih gladkih mišic. Povečan pretok krvi preko spremembe strižne napetosti na endotelijske celice povzroči dilatacijo žil. Ta dinamski odziv pozitivno vpliva na učinkovitost hidravlične cirkulacije in perfuzije. Strižna napetost krvi na endotelijske celice stimulira membranske mehanoreceptorje, kar posledično vodi do aktivacije intracelularnih signalnih poti. Z večanjem povprečne strižne napetosti na endotelijsko celico, se povečuje tudi hitrost prenosa L-arginina v endotelijsko celico. L-arginin je substrat za encim endotelijska sintaza NO (enos ali NOS tipa III), ki producira NO. Večja razpoložljivost L-arginina omogoča večjo produkcijo NO. Na produkcijo NO prav tako vpliva frekvenca pulzirajočega pretoka zaradi srčnega utripa. Pri živalih, ki imajo večjo frekvenco srčnega utripa kot ljudje, so izmerili maksimalno vrednost izpusta NO pri frekvenci 5 Hz, kar sovpada z večjimi vrednostmi strižne napetosti. Frekvenca utripanja srca s pomočjo endotelija tako vpliva na perfuzijo organov [15]. Strižna napetost prav tako povzroči izpust raznih agonistov iz endotelija, kot so adenozin trifosfat (ATP), bradikinin (BK) in snov P. Agonisti potujejo do sosednih endotelijskih celic, kjer se vežejo na receptorje, povezane s proteinom G (GPCR) in jih aktivirajo. To vodi do produkcije inozitol trifostafa (IP3), ki ob vezavi na receptorje na kanalih za kalcij (Ca 2+ ) sprožijo izpust Ca 2+ iz kalcijevih shramb v citoplazmo celice. Povišana koncentracija Ca 2+ ([Ca 2+ ]) v citoplazmi povzroči odprtje kanalov imenovanih SOC (angl. 4

11 store operated channels), preko katerih iz zunajcelične tekočine vdre Ca 2+ v celico, kar vodi do aktivacije od Ca 2+ odvisnih kalijevih kanalov. Prevodnost celične membrane za kalij (K + ) se poviša, s čimer se zmanjša membranska napetost, kar še poveča elektrokemijski gradient za pritok Ca 2+ v celico skozi napetostno regulirane kanale (VOCC). Ob povišanih vrednostih Ca 2+ se le-ta veže na kalmodulin (CaM). Kompleks Ca 2+ CaM nato aktivira enos, ki se nahaja na membranski kaveoli endotelijske celice. Aktiviran encim enos proizvaja molekulo NO. enos v endoteliju ni edina oblika encima, ki sintetizira NO, saj poleg le-te NO proizvaja tudi encim inducibilna sintaza NO (inos ali NOS tipa II). inos lahko proizvede celo večje količine NO kot enos, njegova aktivnost pa naj ne bi bila odvisna od Ca 2+. Do aktivacije inos pride tako kot pri enos, preko stimulacije G proteina, vendar se signalizacijska pot od G proteina nadaljuje preko aktivacije encima adenilil ciklaze, ki katalizira pretvorbo ATP v ciklični adenozin monofosfat (camp). Le-ta aktivira encim protein kinazo A (PKA), ki posredno zviša koncentracijo inos. PKA pa tudi neposredno deluje aktivacijsko na enos tako, da ga fosforilira. [16]. Obe camp/pka aktivacijski poti vodita do povečane tvorbe NO. Molekula NO nato preko različnih signalnih poti znižuje povprečno koncentracijo Ca 2+ v GMC. Povišana koncentracija Ca 2+ v citoplazmi GMC vodi do kontrakcije celice, znižana pa do relaksacije [1]. Na ta način se lahko poveča ali zmanjša tonus žile, kar povratno vpliva na hemodinamiko. Signalna pot vpliva hemodinamike krvi na tonus GMC je shematsko prikazana na sliki 2. 5

12 KRI hemodinamika povišana strižna napetost aktivacija mehanoreceptorjev ENDOTELIJSKA PLAST povišan [Ca 2+ ] povišan [camp] vezava Ca 2+ na CaM aktivacija PKA aktivacija enos aktivacija inos produkcija NO NO GLADKO MIŠIČNA PLAST produkcija cgmp aktivacija sgc aktivacija PKG znižanje [Ca 2+ ] c / hiperpolarizacija celične membrane sprememba tonusa GMC (relaksacija žile) Slika 2. Shematični prikaz poti od hemodinamskega stimula v obliki povišane strižne napetosti do relaksacije GMC 2 MEHANIZEM KRČENJA IN RELAKSACIJE GLADKIH MIŠIČNIH CELIC V procesu krčenja in relaksacije gladkih mišičnih celic so ključna vlakna iz aktina in miozina, ki se razprostirajo vzdolž daljše osi celice. Na miozinskih vlaknih so t.i. prečni mostički, ki so sestavljeni iz stebla, vratu in dveh glav. Glavi in vrat sta sestavljeni iz težkega miozina (MHC), steblo pa je sestavljeno iz lahkega miozina (MLC). Pri procesu 6

13 krčenja se glavi pripneta na posebna aktivna mesta, ki se nahajajo na aktinskem vlaknu. Aktinsko in miozinsko vlakno sta prikazani na sliki 3 [17]. Slika 3. Zgradba aktinskega in miozinskega vlakna [18] Poleg miozinskega in aktinskega vlakna pri procesu krčenja GMC sodelujejo še protein kalmodulin (CaM), kalcijevi ioni (Ca 2+ ) in encim kinaza lahkih verig miozina (MLCK), pri tem pa se porablja adenozin trifosfat (ATP). Pri visoki koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi, se kalcijevi ioni vežejo na štiri vezavna mesta na kalmodulinu (CaM). Vezava kompleksa (Ca 2+ )4CaM z MLCK sproži razpad ATP na adenozin difosfat ADP in fosfatno skupino. Fosfatna skupina se pri tem veže na lahko verigo miozina (MLC) na steblu prečnega mostička. Ob fosforilaciji MLC se spremeni konformacija glave miozina in ob tem se glavi pripneta na aktivna mesta na aktinskem vlaknu. Za krčenje mišic je potrebna energija, ki jo priskrbi ATP z vezavo na vezavno mesto na glavah prečnega mostička, pri vezavi razpade na ADP in P. Ko se z glav odcepita ADP in P, se glavi pomakneta naprej in s seboj povlečeta aktinsko vlakno. Prečni mostički so med seboj neodvisni in med enim ciklom skrčijo celico za približno 1 nm. En prečni mostiček razvije silo približno N [17]. Toda, če je v citoplazmi premajhna koncentracija kalcija, fosfataza lahkih verig miozina (MLCP) defosforilira steblo prečnega mostička. To pomeni, da se fosfatna skupina odcepi z lahke verige miozina (MLC) in tako se glavi ne moreta pripeti na aktinska vlakna. To vodi do relaksacije mišice [17]. 7

14 3 RAZVOJ MODELIRANJA KALCIJEVE DINAMIKE Kalcijeve oscilacije spadajo med periodične fenomene, ki so eno izmed najpomembnejših odkritij iz konca prejšnjega stoletja. Kalcijeve oscilacije ali kalcijevi valovi služijo za komunikacijo med oddaljenimi deli v celici ali za komunikacijo med celicami. V primeru, ki ga obravnavamo, celica preko signala v obliki kalcijevih oscilacij»prejme ukaz«za kontrakcijo ali relaksacijo. Da igra Ca 2+ pomembno vlogo pri skrčitvi mišic, so prvič opazili leta 1947, ko so v mišico žabe vbrizgavali različne ione in je pri tem prišlo do kontrakcije mišice le pri vbrizgavanju Ca 2+. Kalcijeve oscilacije pa sta prvič eksperimentalno odkrila Cuthbertson in Cobbold leta 1985 v oplojenih jajčnih celicah miši [19]. Leto kasneje je Woods opazil kalcijeve oscilacije v hormonsko stimuliranih jetrnih celicah [20]. Tako so kalcijeve oscilacije postale ena izmed najbolj popularnih tematik za raziskovanje tistega časa. Dokaz za to so številni izdani članki na to temo [21-33]. Modele kalcijevih oscilacij ločimo na zaprte [34-38] in odprte [39-41]. Če je model odprt, pomeni, da upošteva prehajanje kalcijevih ionov skozi celično membrano celice. Prav tako jih ločimo glede na število kalcijevih shramb. Poznamo eno-shrambne [38-41] ali več shrambne [42-44] modele v smislu sarko- ali endo- plazemskega retikuluma (SR ali ER). Nekateri modeli upoštevajo tudi izmenjavo kalcija z mitohondriji [34, 35, 38] in/ali s proteini [34-37]. Prav tako poznamo modele z veliko spremenljivkami [45-47] in minimalne modele z le dvema spremenljivkama [44]. Ločimo jih tudi glede na delovanje stimula, ki je lahko posreden ali neposreden. Prvi matematični model kalcijevih oscilacij sta leta 1988 izdelala Meyer in Stryer [38]. V njunem modelu zunanji stimul povzroči proizvodnjo IP3, ki vpliva na izpust Ca 2+ iz intracelularnih shramb. Povišana koncentracija Ca 2+ v citoplazmi pozitivno vpliva na proizvodnjo IP3. Zaradi pozitivnega povratnega vpliva kalcija na njegov izpust iz shramb in periodičnega spreminjanja IP3, sistem sam vzdržuje oscilacije (pride do samovzdrževanih oscilacij). V modelu nastopajo tri spremenljivke: koncentracija IP3 ter koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi in v intercelularni shrambi. Tri leta kasneje sta model nadgradila z inhibicijo izpusta Ca 2+ iz shramb ob povišani koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi [30]. 8

15 Na koncu osemdesetih let prejšnjega stoletja so Dupontova, Goldbeter in Berridge zasnovali model z dvema kalcijevima shrambama [42-44]. Izpust Ca 2+ iz ene shrambe aktivira IP3, izpust Ca 2+ iz druge shrambe pa aktivira povišana koncentracija Ca 2+ v citoplazmi. Kalcijeve kanale, ki se odzivajo na spremembe koncentracije Ca 2+ v citoplazmi, na kratko označimo CICR (angl. Ca 2+ -induced Ca 2+ release). Različice tega modela združujejo obe omenjeni shrambi v eno, kar pomeni, da shramba vsebuje kanale občutljive na IP3 in kanale občutljive na Ca 2+ [48]. Obstajajo pa tudi modeli katerih shramba vsebuje eno vrsto kanalov, ki so občutljivi tako na IP3 kot na Ca 2+, imenovane ICICR (angl. IP3 and Ca 2+ induced Ca 2+ release) [45]. Novejši modeli, ki upoštevajo prehajanje Ca 2+ in drugih ionov preko napetostno reguliranih kanalov na celični membrani, upoštevajo tudi membransko napetost [45-47], medtem ko se večina starejših modelov osredotoča le na prehajanje Ca 2+ med citoplazmo in SR/ER [30, 38, 44]. 4 IZPELJAVA NEKATERIH OSNOVNIH ENAČB ZA MODELIRANJE KALCIJEVE DINAMIKE Računalniške simulacije so za raziskovanje fizioloških pojavov zelo pomembne. Različne dinamike in mehanizme sistema običajno opišemo z diferencialnimi enačbami. S simulacijami testiramo razne hipoteze o vlogah različnih mehanizmov. S simulacijami opazujemo, kako se določene spremenljivke spreminjajo s časom, kako začetni pogoji in parametri vplivajo na obnašanje modela, na kakšni časovni skali pride do sprememb itd. Rezultate računalniških simulacij lahko nato testiramo v laboratoriju. Dober model mora biti kar se da preprost in mora podati natančne rezultate. V našem primeru nas zanima, kako različne koncentracije cgmp preko različnih mehanizmov vplivajo na koncentracijo kalcija v citoplazmi in s tem na kontrakcijo GMC. V modelu upoštevamo le glavne mehanizme, ki vplivajo na koncentracijo kalcija in na membransko napetost. V obravnavanem modelu nastopajo tokovi ionov skozi ionske kanale, izmenjevalce in črpalke. Vse enačbe, ki opisujejo te tokove, izhajajo iz enačb, ki so na kratko opisane in izpeljane v naslednjih podpoglavjih. 9

16 4.1 Modeliranje tokov skozi napetostno regulirane ionske kanale Enačbe, ki opisujejo mehanizem odprtosti kanalov in toka skozenj, izhajajo iz preprostega dvostanjskega modela. Model upošteva, da so kanali lahko v zaprtem (C) ali odprtem (O) stanju. Hitrost prehajanja med obema stanjema določata hitrostni konstanti k + in k. k + je hitrostna konstanta prehajanja iz zaprtega v odprto stanje, k pa je hitrostna konstanta za prehod v nasprotni smeri: (1) Na plazemski membrani je običajno več tisoč kanalov istega tipa, zato nas zanima povprečno obnašanje vseh kanalov. Zakon o akciji mase pravi, da je hitrost procesa (iz zaprtega v odprto stanje ali obratno) premo sorazmerna s koncentracijo molekul, ki prehajajo v drugo obliko. Hitrost oz. tok prehoda iz zaprtega v odprto stanje (J+) je premo sorazmerna s koncentracijo molekul kanala v zaprtem stanju [C]: =. (2) Hitrost prehoda iz odprtega v zaprto stanje (J ) je analogna zgornji enačbi: =, (3) kjer je [O] koncentracija stanj kanala v odprtem stanju. V nadaljevanju koncentraciji obeh stanj kanala [O] in [C] nadomestimo z deleži odprtih in zaprtih kanalov, Po in Pc: =, (4) =, (5) kjer je No število odprtih kanalov, Nc število zaprtih kanalov in N celotno število kanalov: Velja: = +. (6) = 1 (7) 10

17 Hitrosti oz. toka procesa odpiranja in zapiranja kanalov lahko potemtakem izrazimo samo z deležem odprtih kanalov: = (8) = 1 (9) Hitrost spreminjanja deleža odprtih kanalov pa opisuje diferencialna enačba: Ko vstavimo izraza (8) in (9) v (10) dobimo: = (10) = + 1 = (11) = + +. (12) Definiramo novi konstanti: in = 1 + (13) Ko vstavimo ta dva izraza v enačbo (12) dobimo: = +. (14) =, (15) kjer predstavlja delež odprtih kanalov v ravnovesnem stanju, ki je doseženo v limiti neskončnega časa, τ pa predstavlja karakteristični čas za dosego ravnovesja. Manjši kot je τ, hitreje sistem doseže ravnovesno stanje. Rešitev diferencialne enačbe (15) je časovna odvisnost deleža odprtih kanalov: = + 0!, (16) kjer Po (0) predstavlja delež odprtih kanalov ob času t = 0. 11

18 Ekscitabilne celice prenašajo informacije med sabo večinoma s spreminjanjem električnega membranskega potenciala (napetosti). Do sprememb v električnem potencialu pride preko sprememb ionskih tokov skozi membranske kanale, izmenjevalce in črpalke, ionski tokovi pa hkrati vplivajo na vrednost membranske napetosti. Velikost toka posamezne vrste ionov je odvisna od razlik koncentracije tega iona na eni in drugi strani membrane ter od membranske napetosti. Velikost in smer toka (v ali iz celice) sta odvisni od rezultante sil na posamezni ion, ki nanj deluje zaradi gradienta električnega potenciala in gradienta koncentracij. Nernstov ravnovesni potencial pove, pri kolikšni membranski napetosti bo tok za specifičen ion pri določeni koncentracijski razliki enak nič. Membranska napetost je enaka Nernstovemu potencialu za določen ion takrat, kadar je vsota omenjenih sil na ta ion enaka nič. Enačba za Nernstov potencial se glasi: " # = $% & # ' ln* *, (17) kjer je [x]c koncentracija posamezne vrste iona v citoplazmi, [x]o je koncentracija iona zunaj celice, R je plinska konstanta, T je absolutna temperatura, zx je valenca posameznega iona in F je Faradayeva konstanta. Pri računalniških simulacijah celice so zelo pomembni opisi tokov čez kanale v celični membrani, saj le-ti določajo časovne spremembe membranske napetosti, hkrati pa membranska napetost vpliva na vrednosti tokov preko membrane. Za opis tokov preko membrane celice izhajamo iz Ohmovega zakona: + = " $ =,", (18) kjer je g = 1/R prevodnost kanala, R upornost kanala, I električni tok ionov in V napetost preko membrane. Najprej nas zanima, kako se prevodnost membrane za posamezno vrsto iona spreminja s časom. Na membrano celice lahko gledamo kot na električno vezje. Prvi, ki je membrano celice opisal kot električni krog, je bil K. S. Cole leta Coleovi osnovni elementi v električnem krogu so dvojna fosfolipidna plast, ki je analogna kondenzatorju, membranski kanali, ki so analogni električnim prevodnikom oz. upornikom in elektrokemijske gonilne sile, ki so analogne bateriji. Slika 4 prikazuje analogno električno vezje, s katerim modeliramo posamezne ionske tokove preko membrane. V vezju sta ionska baterija in upornik za posamezni ion vezana zaporedno, pari ionska baterija-upornik za posamezne ione pa so vzporedno vezani med seboj in s 12

19 kondenzatorjem, na katerem je napetost enaka razliki električnih potencialov znotraj in zunaj membrane (V). Slika 4: Celična membrana, prikazana z analogijo električnega vezja. Na sliki so prikazani ionski tokovi za natrij (INa), kalij (IK) in nespecifični tok (II), ki tečejo skozi napetostno odvisne upornike (RNa, RK in RI). Tokove poganja razlika napetosti med membranskim električnim potencialom (V) in ravnovesnim el. potencialom za posamezni ion (VNa, VK, VI). Cm je kapacitivnost membrane [49]. Tak analog električnega kroga je danes osnova vsem modelom, ki opisujejo električno aktivnost membrane. Za izračun časovnega razvoja membranske napetosti je potrebno preučiti dinamiko različnih tokov skozi membrano. Npr. tok skozi kanal za kalij (K + ) lahko po Ohmovem zakonu zapišemo kot: + - =, - " " -, (19) 13

20 kjer predpostavljamo, da je Nernstov potencial VK za K + ion konstanten in gk je prevodnost kanala. Predznak minus pred členom na desni je posledica definicije»zunaj«in»znotraj«. V VK predstavlja gonilno silo za tok K + preko membrane. Konstanten Nernstov potencial temelji na predpostavki, da črpalke na membrani sproti črpajo ione izven celice in vzdržujejo konstantno koncentracijo iona zunaj in znotraj celice. S črpalkami se prepreči, da bi se ionska baterija»iztrošila«. Poleg tega predpostavljamo, da je celica velika, kar pomeni, da ima majhno površino v primerjavi z volumnom. Zaradi tega majhne spremembe v koncentraciji iona zanemarljivo malo vplivajo na ravnovesni membranski potencial. Električni tok čez membrano je po Kirchhoffovem zakonu enak vsoti posameznih ionskih tokov: +./ = 0+. = 0,. " ". =, - " " -, 12 " " 12 (20) Ob predpostavki, da se membrana obnaša kot kondenzator, lahko zapišemo premikalni tok čez membrano kot: + 24 = 5 ", (21) kjer je Cm je kapacitivnost membrane celice in V membranska električna napetost oz. prekomembranski potencial. Velja: oz = +./ (22) 5 " = 0,." ". (23) Za izračun membranske električne napetosti moramo vedeti, kako se prevodnost gi posameznega kanala spreminja z membransko napetostjo (V) in s časom (t). Prevodnost kanala je neposredno povezana z odprtostjo kanala, ki pa je odvisna od membranske napetosti in od drugih dejavnikov [50]. Napetostno odvisni ionski kanali so transmembranski proteini. Navadno so sestavljeni iz štirih podenot, vsaka podenota pa se deli na šest transmembranskih segmentov. Glavni sestavni deli so senzor, pora in vrata. Senzorji so nabite aminokisline. Njihova postavitev je odvisna od membranske napetosti, kar narekuje, ali je kanal odprt ali zaprt. To pomeni, 14

21 da so hitrostne konstante za prehajanje iz zaprtega v odprto stanje kanala in obratno odvisne od napetosti. Kanal je popolnoma odprt po tem, ko so se vsi senzorji premaknili v odprto stanje. To pomeni, da so aktivirane vse štiri podenote [51]. Odvisnost hitrostnih konstant k + in k od el. potenciala na membrani se zapiše po analogiji z Arrheniusovo enačbo, ki podaja zvezo med hitrostno konstanto reakcije in aktivacijsko energijo (Ea): e 89 : ;< = (24) Pri definiciji hitrostnih konstant k + in k za tranzicijo med odprtim in zaprtim stanjem kanala se predpostavi, da je aktivacijska energija premo sorazmerna z membransko napetostjo, iz česar sledi: = >? (25) (26) kjer sta ko + in ko maksimalni vrednosti hitrostnih konstant, V je membranska napetost, α in β pa sta sorazmernostna faktorja. Če izraza (25) in (26) vstavimo v enačbi (13) in (14) za τ in, dobimo: in = 1 1+ >@? (27) = 1 1 >? 1+. >@? (28) Definiramo novi konstanti: in A = 1 B C "D = E ln B C (29) (30) 15

22 ter ju vstavimo v enačbi (27) in (28) in dobimo: = = >? 1 1+e F?? G/I L J K 1 1+e F?? G/I L J K (31) (32) Izraza (31) in (32) lahko preoblikujemo v obliko hiperboličnih funkcij: = 0,5F1+tanhF " " D/E 2A LL (33) = e F?>@ L E 2R coshf " " D/E 2A L (34) Parameter V1/2 predstavlja napetost, pri kateri je v ravnovesju odprt polovični delež kanalov ( = ½), kar je označeno s črtkano črto na slikah 5 in 6. Na sliki 5 so prikazani grafi (V) za različne vrednosti V1/2 ( 20 mv, 30 mv in 40 mv) pri konstantni vrednosti So = 2 mv. S spremembo parametra V1/2 se graf»pomika«levo oz. desno. Odvisnost od V pri različnih konstantnih vrednostih So (2 mv, 10 mv in 5 mv) in pri konstantni vrednosti V1/2 = 50 mv prikazuje slika 6. So določa strmino odvisnosti od V. Nižja kot je absolutna vrednost So, bolj strma je odvisnost (V). Pozitivne vrednosti So pomenijo naraščajočo funkcijo, negativne pa padajočo. Pri depolarizaciji celice (t.j. pri spremembi napetosti iz npr. 80 mv na 20 mv) bo pozitivni predznak parametra So pomenil odprtje kanalov, negativen predznak So pa zaprtje kanalov. 16

23 Slika 5. Graf (V) za različne vrednosti V1/2 pri So = 2 mv Slika 6. Graf (V) za različne vrednosti So pri V1/2 = 50 mv 17

24 Ker je prevodnost kanalov odvisna od deleža odprtih kanalov, lahko prevodnost g definiramo kot produkt deleža odprtih kanalov (Po), ki se s časom spreminja in maksimalne prevodnosti (, ):, =, (35) Ko ta izraz vstavimo v enačbo za posamezni ionski tok Ii (19), dobimo: +. =,. " ". =, " ". (36) kjer je Vi ravnovesni Nernstov potencial za i-to vrsto iona, ki je podan z enačbo (17), in je odvisen od ravnovesnih koncentracij i-tega iona znotraj in zunaj celice. Po(t) je podan z diferencialno enačbo (15): pri čemer sta in τ definirana z enačbama (33) in (34). =, (37) Z enačbami (35)-(37) v nadaljevanju fizikalno-matematično opišemo tokove skozi različne ionske kanale. 4.2 Modeliranje tokov preko transporterjev in črpalk Celice ne vsebujejo le kanalov, skozi katere potekajo pasivni ionski tokovi, temveč so razvile mnogo različnih transportnih proteinov za aktivni transport ionov in molekul čez membrano v smeri, ki je nasprotna gradientu koncentracij. V celici je potrebno vzdrževati določene vrednosti koncentracij ionov. Za to poskrbijo izmenjevalci in črpalke, ki premikajo ione v smeri, ki je nasprotna smeri pasivnih ionskih tokov, in poskrbijo za to, da se lahko membranska napetost s časom spreminja in niha. Črpalke črpajo ione v smeri proti koncentracijskemu gradientu in pri tem uporabljajo energijo ATP. Za prenos naboja 1 C preko membranske napetosti 1 V je potrebna energija 1 J. Ocenjeno je bilo, da skoraj 25% vsega ATP v telesu porabijo natrij-kalijeve črpalke za vzdrževanje nizke koncentracije natrija (Na + ) in visoke koncentracije kalija (K + ) v citoplazmi celice. Poleg črpalk membrane vsebujejo še razne so-prenašalce in izmenjevalce, ki selektivno prenašajo in izmenjujejo ione in manjše molekule preko membrane. Pri izmenjevalcih je 18

25 pomembna njihova stehiometrija, ki pove razmerje izmenjanih ionov, kar določa neto električni tok skozi membrano. Ca 2+ -ATPaza je črpalka, ki se nahaja v membrani sarko- oz. endo- plazemskega retikuluma (SR oz. ER) (črpalka SERCA), in porablja kemično energijo, shranjeno v molekuli ATP za prenos Ca 2+ iz citoplazme v SR oz. ER. Črpalke SERCA so primarni mehanizem za polnjenje kalcijevih shramb v SR oz. ER. Podobne črpalke najdemo tudi v celični membrani, ki prečrpavajo Ca 2+ iz citoplazme v izvencelično tekočino. Te črpalke se imenujejo PMCA (angl. plasma membrane Ca 2+ -ATPase). Hitrost prečrpavanja črpalk SERCA in PMCA je odvisna od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi. Večja kot je le-ta, hitreje delujejo črpalke. Z meritvami so ugotovili, da ima hitrost črpanja sigmoidalno odvisnost od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi s Hillovim koeficientom okoli 2. Hillov koeficient izhaja iz stehiometrije črpalk SERCA, ki je: 2Ca 2+ : 1ATP. Model za opis toka preko črpalk SERCA, temelji na predpostavki, da Ca 2+ prepušča samo aktivna oblika črpalke, ki se aktivira ob vezavi 2 ionov Ca 2+ iz citoplazme: 2W E ++ X (38) Ravnovesna disociacijska konstanta Kd * je definirana kot razmerje med hitrostnima konstantama za prehajanje proteina, ki tvori črpalko, iz aktivnega (A) v neaktivno (I) stanje in je podana z razmerjem posameznih reaktantov v ravnovesju: = Y Z = WE E +, (39) X kjer sta k in k + hitrostni konstanti za prehajanje proteina v aktivno (k + ) oz. neaktivno (k ) stanje, [Ca 2+ ]c pa označuje koncentracijo Ca 2+ v citoplazmi. V enačbi (39) koncentracijo aktivnih stanj [I] nadomestimo z [I] = [N] [A], kjer je [N] koncentracija vseh možnih stanj proteina, in izpostavimo koncentracijo aktivnih oblik proteina ([A]): X = WE E W E E +Y E, (40) 19

26 kjer je Y = RY Z. Pomen konstante K je, da je pri vrednosti [Ca 2+ ]c, ki je enaka vrednosti K, v ravnovesju v aktivni obliki polovica vseh razpoložljivih proteinov ([A] = ½[N]). Nizka vrednost K pomeni, da se črpalke odzovejo že pri nizkih vrednostih [Ca 2+ ]c. Hitrost prenosa Ca 2+ ionov v SR (v) je definirana kot produkt koncentracije aktivnih stanj in hitrostne konstante (k) prenosa Ca 2+ : \ = X = \ 52# W E E W E E +Y E, (41) kjer je vmax = k[n] maksimalna hitrost prenosa Ca 2+ ionov. To je enostaven model, ki upošteva, da ima SERCA dve vezavni mesti za Ca 2+, ne upošteva pa eksplicitne odvisnosti od ATP. V modelu privzamemo, da je količina ATP ves čas zadostna in konstantna. Enačbe tega tipa se pogosto uporabljajo za opis tokov preko črpalk, le da se med seboj lahko razlikujejo v vrednosti Hillovega koeficienta (n): \ = \ 52# W E / Y / +W E / (42) Višji kot je eksponent (n), bolj strma je odvisnost hitrosti prečrpavanja ionov Ca 2+ od [Ca 2+ ]c. Grafi na sliki 7 prikazujejo odvisnost relativne hitrosti črpalk glede na maksimalno hitrost od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi v/vmax([ca 2+ ]c) za različne vrednosti eksponentov (n = 1, 2 in 3) pri konstantni vrednosti K = 0, mol/m 3. Na sliki 8 so prikazani grafi v/vmax ([Ca 2+ ]c) za različne vrednosti konstant parametra K (0'05, 0'2 in 0' mol/m 3 ) pri konstantni vrednosti n = 2. Na slikah 7 in 8 je s črtkano črto označeno, pri katerih vrednostih [Ca 2+ ]c (oz. K), hitrost (v) doseže polovično vrednost maksimalne hitrosti (½vmax). Pri nižjih vrednostih konstante K je polovična hitrost dosežena pri nižji koncentraciji [Ca 2+ ]c. 20

27 Slika 7. Grafi v/vmax([ca 2+ ]c) za različne vrednosti Hillovega koeficienta (n) pri konstantni vrednosti K = 0, mol/m 3 Slika 8. Grafi v/vmax ([Ca 2+ ]c) za različne vrednosti K, pri konstantni vrednosti n = 2 21

28 5 MODEL ZA OD KALCIJA ODVISNI RAZVOJ SILE V GLADKI MIŠIČNI CELICI ARTERIJE Cilj magistrske naloge je določiti posredni vpliv molekule dušikovega oksida (NO) na tonus gladke mišične celice arterije (slika 9) preko vpliva signalne molekule cikličnega gvanozin monofosfata (cgmp) na potek kalcijevih oscilacij. Od Ca 2+ pa je odvisna skrčitev GMC. Da bi lahko izračunali časovno odvisnost sile, je najprej potrebno poznati obliko in mehanizme nastanka kalcijevega signala v GMC. Slika 9 prikazuje gladko mišično celico, izolirano iz podganje male jetrne arterije [45]. Slika 9. Gladka mišična celica, izolirana iz podganje male jetrne arterije [45] Do povišanja koncentracije Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c) v obliki oscilacij ali dvofaznega signala v citoplazmi celice ob holinergični stimulaciji pride, ko se acetilholin (Ach) veže na muskarinske receptorje, ki se nahajajo v plazemski membrani celice in so povezani z G proteinom (GPCR). Vezava Ach pospeši proizvodnjo signalne molekule inozitol trifosfata (IP3). IP3 z vezavo na receptorje, ki se nahajajo na membrani sarkoplazemskega retikuluma (SR), odpre kalcijeve kanale tipa ICICR (angl. IP3 and Ca 2+ -induced Ca 2+ release), kar vodi do izpusta Ca 2+ iz SR. To vodi do delne depolarizacije celice in do odprtja napetostno odvisnih kalcijevih kanalov (VOCC angl. voltage-operated calcium channels) na celični membrani, ki začnejo prepuščati Ca 2+ v citoplazmo. Povišana koncentracija Ca 2+ v citoplazmi odpre od Ca 2+ odvisne klorove kanale (ClCa) na celični 22

29 membrani. Ob depolarizaciji (pri nizki absolutni vrednosti membranske napetosti (Vm)) pričnejo le-ti prepuščati klorove ione (Cl - ) v citoplazmo. Depolarizirana celična membrana in povišana koncentracija Ca 2+ v citoplazmi nadalje vodita do pospešenega delovanja črpalk PMCA na celični membrani, ki črpajo Ca 2+ iz celice, in črpalk SERCA na SR, ki črpajo Ca 2+ nazaj v SR. Ob povišani koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi se odprejo tudi od Ca 2+ odvisni kalijevi kanali (KCa), ki prepuščajo kalij (K + ) iz celice, kar hiperpolarizira celico. Porast koncentracije Ca 2+ in znižanje membranske napetosti vplivata še na tok Ca 2+ iz celice preko izmenjevalca natrija in kalcija (Na + /Ca 2+ ) (NCX angl. Na + /Ca 2+ exchanger), kjer Ca 2+ teče iz celice, natrij (Na + ) pa v celico. Preko teh mehanizmov se celica polarizira in koncentracija Ca 2+ v citoplazmi se zniža, nakar se celoten proces lahko ponovi. Posamezni tokovi so podrobneje opisani v nadaljevanju. Za modeliranje vpliva molekule cgmp na kalcijev signal je potrebno poznati, na katere kanale/izmenjevalce/črpalke ta molekula vpliva in kako. Molekula cgmp vpliva na mehanizme, ki hiperpolarizirajo celico. Poviša prevodnost kanalov za Cl - in K + ter pospeši delovanje izmenjevalcev NCX in črpalk za Na + in K + (Na/K), ki jih imenujemo tudi Na + /K + -ATPaze. Na večino kanalov cgmp vpliva tako, da se ob prisotnosti cgmp kanal odpre pri nižji koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi, kot bi se sicer. To pomeni, da se mehanizmi za hiperpolarizacijo aktivirajo pri nižjih vrednostih [Ca 2+ ]c, kot bi se ob odsotnosti molekule cgmp. Ker gresta hiperpolarizacija in znižanje koncentracije Ca 2+ v citoplazmi z roko v roki, to pomeni, da koncentracija cgmp v citoplazmi vpliva na amplitudo in frekvenco oscilacij [Ca 2+ ]c in membranskega potenciala (Vm). Večja kot je koncentracija cgmp, manjšo amplitudo in frekvenco oscilacij [Ca 2+ ] ter večjo absolutno vrednost Vm bi pričakovali. Z meritvami je pokazano, da ima cgmp največji vpliv na kanale KCa, ki so ključni mehanizem za hiperpolarizacijo celice. Poleg tega, da cgmp vpliva na tok K +, vpliva še na tok Cl - preko kanalov ClCa, na črpalke in na izmenjevalce NCX, tako da se kanali in izmenjevalci aktivirajo pri nižjih vrednostih [Ca 2+ ]c, črpalke pa pri višjih absolutnih vrednosti Vm, kot bi se sicer. cgmp bi naj vplival tudi aktivacijsko na črpalke SERCA in PMCA ter zaviralno na produkcijo IP3. Ker so ti procesi povezani z aktivacijo proteina PKG, so počasnejši v primerjavi z direktnim vplivom na kanale in črpalke, in jih zato v modelu ne upoštevamo. Prav tako ti procesi niso dovolj dobro raziskani, da bi lahko modelirali vpliv cgmp na njihovo delovanje. Na sliki 10 je prikazan model gladke mišične celice z vsemi glavnimi komponentami za opis kalcijevih oscilacij, nakazan pa je tudi vpliv molekule cgmp na te mehanizme (rumena elipsa). Puščice 23

30 označujejo tokove posameznih ionov, krogi in elipse pa predstavljajo posamezne molekule ali ione. Rdeča barva predstavlja kalcijeve ione in tokove, modra kalijeve, rjava natrijeve in zelena klorove. Temno modri krogi predstavljajo molekulo IP3, rumene elipse cgmp, oranžne elipse pa vezavne proteine v citoplazmi in SR. SERCA Pr SR Pr SR Ach Receptor G protein + IP 3 ICICR PMCA Cl - cgmp Na + K + Na/K Ca 2+ Ca 2+ Cl Ca K Ca VOCC NCX Slika 10. Shematski prikaz tokov in mehanizmov izmenjave Ca 2+ in drugih ionov v GMC Namen modela je določiti vpliv molekule cgmp na potek časovne odvisnosti koncentracije Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c). Predvidevamo, da bo signal Ca 2+ oscilirajoč, saj so vaskularne GMC (VGMC) ekscitabilne celice. V večini znanstvenih člankov, kjer je modelirana signalizacija Ca 2+ v GMC, vpliva molekule cgmp ne upoštevajo [47, 52, 53]. V posameznih študijah pa upoštevajo zgolj nekatere izmed potrjenih mehanizmov, na katere ima cgmp vpliv [45]. Model, ki ga predstavljamo v magistrski nalogi, je deloma povzet po modelu Jacobsena in sod. [45]. Ker pa ta model upošteva vpliv molekule cgmp le na kanale ClCa in črpalke Na/K, vpliv cgmp na druge kanale povzamemo po modelu Kapele in sod. [46], nekatere mehanizme pa modeliramo sami. Kot vsak model ima tudi naš več privzetkov. V modelu ne upoštevamo difuzije Ca 2+ znotraj celice, temveč privzamemo, da so ioni ves čas homogeno razporejeni po citoplazmi. Prav tako privzamemo, da je membranska napetost (Vm) po celotni membrani 24

31 celice enaka. Med citoplazmo in zunajcelično raztopino ves čas, preko celične membrane, prehajajo ioni natrija (Na + ), kalija (K + ), klora (Cl - ) in kalcija (Ca 2+ ), vendar tokovi ne vplivajo bistveno na spremembe v njihovih koncentracijah v celici in izven nje, kar pa ne velja za koncentracijo Ca 2+ v citoplazmi. Zato vrednosti koncentracij K +, Cl - in Na + v in izven celice ter Ca 2+ izven celice privzamemo za konstantne. Njihove vrednosti so podane v tabeli 2. Model prav tako ne upošteva vseh kanalov, ki jih vsebuje GMC, temveč so upoštevani le tisti bistveni kanali, ki posredno ali neposredno vplivajo na koncentracijo Ca 2+ v citoplazmi. V modelu celice upoštevamo prehajanje ionov Na +, K +, Cl - in Ca 2+ med zunanjo in notranjo celično raztopino (citoplazmo), ki ju ločuje celična membrana, znotraj celice pa tudi prehajanje ionov Ca 2+ med citoplazmo in shrambami za Ca 2+. Shramba za kalcijeve ione je sarkoplazemski retikulum (SR), kjer se kalcijevi ioni vežejo na proteine za kalcij (PrSR). Podobni proteini (Prc) vežejo Ca 2+ tudi v citoplazmi. Poleg vseh ionov in proteinov v citoplazmi celice upoštevamo še učinkovanje molekul IP3 in cgmp. Zaradi poenostavitev modela ostalih organelov v celici ne upoštevamo. Ioni Na +, K +, Cl - in Ca 2+ se nahajajo tudi v zunanji celični raztopini. Med notranjo in zunajcelično raztopino prehajajo preko različnih kanalov, izmenjevalcev in črpalk, ki se nahajajo v celični membrani. Manjši delež ionov pa prehaja kar direktno pasivno preko celične membrane skozi pore. Razlika v koncentraciji pozitivnih in negativnih ionov na obeh straneh celične membrane pogojuje električni potencial na celični membrani (membranska napetost). Spremembe membranske napetosti služijo celici kot glavno sredstvo za prenos informacij v celici in za prenos informacij med celicami. Odprtost večine kanalov in izmenjevalcev v celični membrani je odvisna od membranske napetosti. Med SR in citoplazmo se izmenjujejo le kalcijevi ioni, ki prav tako tečejo preko kanalov in črpalk ali pa prehajajo direktno pasivno preko membrane SR v citoplazmo. Celica preko teh različnih mehanizmov uravnava in spreminja koncentracijo Ca 2+ v citoplazmi, ki regulira različne celične procese, med drugim tudi tonus arterije. 25

32 V modelu upoštevamo naslednje mehanizme za izmenjavo ionov: a) Električni tokovi preko celične membrane: 1) Tok Ca 2+ skozi napetostno regulirane Ca 2+ kanale (VOCC voltage-operated calcium channels) IVOCC. 2) Tok Cl - skozi od Ca 2+ odvisne Cl - kanale (ClCa) IClCa. 3) Tok K + skozi od Ca 2+ odvisne K + kanale (KCa) IKCa. 4) Tok Na + in Ca 2+ skozi izmenjevalce Na + in Ca 2+ (NCX) INCX. 5) Tok Na + in K + skozi črpalke Na + /K + -ATPaze (Na/K) INa/K 6) Tok Ca 2+ skozi črpalke Ca 2+ -ATPaze (PMCA plasma membrane Ca 2+ -ATPase) IPMCA. 7) Pasivni tokovi ionov Na + (IpasNa), K + (IpasK), Cl - (IpasCl) in Ca 2+ (IpasCa) preko celične membrane. b) Molarni tokovi kalcija preko membrane SR: 8) Tok Ca 2+ skozi od IP3 in od Ca 2+ odvisne kanale (ICICR IP3 and calciuminduced calcium release) JICICR 9) Tok Ca 2+ skozi črpalke Ca 2+ -ATPaze (SERCA Sarco-Endoplasmic reticulum calcium ATPase) JSERCA 10) Pasivni tok Ca 2+ v citoplazmo skozi pore v membrani SR JpasSR c) Izmenjava kalcija s proteini v citoplazmi in SR: 11) Vezava in disociacija Ca 2+ na/z vezavnih proteinov (Prc) v citoplazmi JPrC. 12) Vezava in disociacija Ca 2+ na/z vezavnih proteinov (PrSR) v SR JPrSR. Vsi našteti tokovi so prikazani in označeni z zaporednimi številkami iz zgornjega seznama na modelni shemi celice na sliki 11. Na tem mestu omenimo še, kako so podane smeri tokov, in za katere vrste tokov gre. Ker v enačbi za membransko napetost celice nastopajo električni tokovi (glej enačbe (20)- (23)), izražamo tokove preko celične membrane v smislu električnih tokov, ki so v nalogi označeni s simbolom I in imajo enoto amper (A). Pri tem nas zanimajo neto električni tokovi skozi kanale, izmenjevalce in črpalke na celični membrani. Predznak električnih tokov je izbran tako, da je električni tok pozitivno nabitih ionov iz celice (npr. tok K + skozi kanale KCa) pozitiven. To pomeni, da je električni tok ionov Cl - v celico prav tako pozitiven. 26

33 Ko modeliramo tokove Ca 2+ v in iz citoplazme, pa uporabimo tokove množine snovi na enoto volumna, ki se izražajo kot sprememba koncentracij po času z enoto 8 ]^_ s=. ]` Oznaka za te tokove je J. Vse spremenljivke in parametri so podani v standardnih (SI) enotah. Ker je ena izmed najpogosteje uporabljenih enot mol/m 3 nekoliko manj uporabna za primerjavo z izmerjenimi vrednostmi, jo v nalogi vedno zapisujemo kot 10 d ]^_ enoti 10 oz. µm. e c ]^_ ]`, kar je identično Izrazi za opis teh tokov so podani v naslednjih podpoglavjih, parametri pa so podani v tabelah 1-15 na koncu posameznih poglavij. Podobno kot v modelu Jacobsena in sod. [45], ima tudi v našem modelu gladka mišična celica obliko valja s stožcema na vsaki strani, kot je v prečnem prerezu prikazano na sliki 11. Celica ima dolžino Lc in polmer na sredini rc. Če celico razdelimo na tri enake dele, valj in 2 stožca, je dolžina posameznega dela 1/3 Lc. Volumen celice (Vc) je potemtakem: " = 5 9 gh E i (43) Vrednosti karakterističnih parametrov celice so zapisane v tabeli 1. Sama oblika celice v našem modelu nima pomena, imela pa bi ga, če bi upoštevali še difuzijo Ca 2+ po citoplazmi. [Na + ] o [K + ] o [Na + ] c [Cl - ] o [K + ] c [Cl - ] c [Ca 2+ ] o 6 [PrCa ] SR 12 [Pr] [Ca 2+ SR + ] SR + I PMCA V m J PrSR 9 SR J SERCA [IP 3 ] + J pas_sr J ICICR I VOCC citoplazma I NCX I pas_ca I 7 pas_k Ipas_Cl 8 [Ca 2+ J ] PrC c + [Pr] c 11 [PrCa ] c 10 [cgmp] I Na/K 3 I KCa 2 I pas_na I ClCa Slika 11. Modelni prikaz ionskih tokov v vaskularni gladki mišični celici 27

34 Tabela 1: Karakteristike celice Oznaka Vrednost Opis Lc m dolžina celice rc m polmer celice na sredini Cm F kapaciteta celotne celične membrane β 0,05 volumski delež SR v celici Glavne tri spremenljivke v modelu so koncentracija Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c), koncentracija Ca 2+ v SR ([Ca 2+ ]SR) in membranska napetost (Vm). Poleg teh treh pa so modelne spremenljivke še koncentracija prostih vezavnih proteinov v citoplazmi ([Pr]c) in v SR ([Pr]SR) ter koncentraciji proteinov, na katere je vezan Ca 2+ v citoplazmi ([PrCa]c) in v SR ([PrCa]SR). Za vsako izmed spremenljivk je v fizikalno-matematičnem modelu zapisana diferencialna enačba prvega reda, ki ponazarja hitrost spremembe posamezne spremenljivke 8 Z# =, kjer je x poljubna spremenljivka. Hitrost spremembe koncentracije Z Ca 2+ v citoplazmi F Zjk2Il m n L je enaka razliki vsote pritekajočih in odtekajočih tokov Ca 2+ Z v oz. iz citoplazme celice. Pritekajoči tokovi Ca 2+ v citoplazmo celice so: neto molarni tok Ca 2+ preko celične membrane (JPM), tok Ca 2+ preko kanalov ICICR na membrani SR (JICICR), pasivni tok Ca 2+ preko membrane SR (JpasSR) in tok sproščanja (JPrC_OFF) z vezavnih proteinov v citoplazmi. Odtekajoča tokova Ca 2+ iz citoplazme celice sta: tok vezave Ca 2+ na vezavne proteine v citoplazmi (JPrC_ON) in tok Ca 2+ preko črpalk SERCA (JSERCA). Zvezo opisuje naslednja navadna diferencialna enačba 1. reda: W E = o pq + rkrk; + 42stu + pvkwxx y o pvkwz + J9;k{ y (44) Hitrost spreminjanja koncentracije Ca 2+ v SR F Zjk2Il m tu L pa je enaka razliki vsote Z pritekajočih in odtekajočih tokov Ca 2+ v oz. iz lumna SR. Pritekajoča tokova Ca 2+ v lumen SR sta: tok Ca 2+ preko črpalk SERCA (JSERCA) in tok sproščanja Ca 2+ s proteinov v SR (JPrSR_OFF). Odtekajoči tokovi Ca 2+ iz lumna SR so: tok Ca 2+ preko kanalov ICICR (JICICR), pasivni tok Ca 2+ preko membrane SR (JpasSR) ter toka vezave Ca 2+ na proteine v SR (JPrSR_ON). Zvezo opisuje naslednja navadna diferencialna enačba 1. reda: 28

35 W E J; = 1 $ J;,? J9;k{ + pvj;wxx 1 $ J;,? rkrk; + 1 $ J;,? 42stu + pvj;wz (45) Molarne tokove Ca 2+ preko membrane SR (JSERCA, JICICR, JpasSR) v enačbi (45) normiramo s parametrom RSR,V, ki predstavlja razmerje volumnov SR in citoplazme: pri čemer je β definiran kot razmerje volumnov SR in celice: $ J;,? = B 1 B, (46) B = " J; " (47) RSR,V predstavlja faktor pretvorbe molarnega toka med vrednostjo le-tega v citoplazmi in med vrednostjo v SR zaradi razlik v volumnih posameznih shramb. Hitrost spreminjanja membranske napetosti na celični membrani 8 Z? = je odvisna od Z vsote vseh električnih tokov ionov v celico in iz nje: " 5 = 1 }+ 12/- ++ pqk{ ++ 1k~ ++?kk ++ k : ++ - : s ƒ, (48) 5 kjer so Ii (i = Na/K, PMCA, ) neto električni tokovi ionov preko črpalk Na/K in PMCA, izmenjevalcev NCX ter kanalov VOCC, ClCa in KCa. Ipas_x označuje pasivne ionske tokove, kjer x označuje vrsto posameznega iona. V modelu je predpostavljeno, da je Vm enak po vsej celici in da so ionski kanali, črpalke in prenašalci enakomerno porazdeljeni po celotni celični membrani. Prav tako predpostavljamo, da so vse koncentracije ionov, razen Ca 2+ v citoplazmi, konstantne. Njihove vrednosti so podane v tabeli 2. # 29

36 Tabela 2: Vrednosti ravnovesnih koncentracij ionov zunaj celice (indeks o) in znotraj celice (indeks c) Simbol Vrednost [mol/m 3 oz. mmol/l] Opis [Ca 2+ ]o 2 zunajcelična koncentracija kalcija [Na + ]o 140 zunajcelična koncentracija natrija [K + ]o 5 zunajcelična koncentracija kalija [Cl - ]o 112,5 zunajcelična koncentracija klora [Na + ]c 6 koncentracija natrija v citoplazmi [K + ]c 120 koncentracija kalija v citoplazmi [Cl - ]c 41,8 koncentracija klora v citoplazmi Velikost tokov ionov preko kanalov in izmenjevalcev v celični membrani je močno odvisna od razlike med trenutnim membranskim potencialom (Vm) in ravnovesnim (Nernstovim) potencialom za posamezni ion (Vx), ki je definiran kot: " # = $% & # ' ln* *, (49) kjer je R plinska konstanta, T absolutna temperatura, zx valenca posameznega iona in [x]c/[x]o razmerje koncentracij za posamezni ion v citoplazmi in zunaj celice. Vrednosti konstant so podane v tabeli 3, vrednosti ravnovesnih koncentracij pa v tabeli 2. Valenca (z) za Ca 2+ je +2, za Cl - 1, za Na + in K + pa +1. Ker privzamemo, da so koncentracije ionov Na +, K + in Cl - zunaj in znotraj celice konstantne, lahko na podlagi vrednosti, ki so podane v tabelah 2 in 3, izračunamo ravnovesni potencial za posamezni ion (tabela 4), katerega vrednost je v našem modelu ves čas konstantna. To pa ne velja za kalcijev ravnovesni potencial (VCa), saj se vrednost koncentracije Ca 2+ v citoplazmi ves čas spreminja. Zato privzamemo, da ob vsaki spremembi vrednosti [Ca 2+ ]c sistem takoj doseže ravnovesje in tako model sproti računa vrednost VCa glede na trenutno vrednost [Ca 2+ ]c. V tabeli 4 so podane vrednosti membranskih napetosti, pri katerih je tok posameznega iona skozi celično membrano enak 0. Npr. če je absolutna vrednost membranske napetosti manjša od 25 mv, se bodo ioni Cl - premikali iz izvencelične raztopine v citoplazmo. Ko bo membranski potencial dosegel vrednost 25 mv, bo tok 30

37 Cl - ionov skozi celično membrano enak 0. Pri višjih absolutnih vrednostih membranske napetosti pa bo tok Cl - ionov usmerjen izven celice. Tabela 3: Vrednosti splošnih parametrov Simbol Vrednost Opis R 8,314 J/Kmol plinska konstanta T 293,15 K absolutna temperatura F C/mol Faradayeva konstanta Tabela 4: Vrednosti ravnovesnih Nernstovih potencialov za koncentracije ionov, podane v tabeli 2. Vrednosti so izračunane po enačbi (49). Simbol Vrednost [mv] Opis VNa 80 Nernstov potencial za Na + VK 80 Nernstov potencial za K + VCl 25 Nernstov potencial za Cl Tokovi kalcija preko celične membrane JPM Neto tok Ca 2+ preko celične membrane je vsota vseh tokov Ca 2+ ionov preko celične membrane in se z električnimi tokovi, ki tečejo skozi različne mehanizme prenosa Ca 2+ preko celične membrane, izraža kot: pq = 2+ pqk{ 2+ 1k~ ++?kk ++ 42s : & k2 '" kr< (50) Z Ii (i = PMCA, NCX, VOCC in pasca) so označeni neto električni tokovi. Za izračun molarnega toka (JPM) je električni tok potrebno deliti z valenco iona, za katerega računamo molarni tok (zx), s Faradayevo konstanto (F) in z volumnom shrambe, v katero tok teče. Faktorja 2 pred električnima tokovoma IPMCA in INCX sta posledica dejstva, da se preko črpalk PMCA in izmenjevalcev Na + in Ca 2+ ne premikajo zgolj ioni Ca 2+ temveč tudi drugi ioni, kar je že upoštevano pri definiciji električnih tokov. V primeru PMCA ob 31

38 vsakem prečrpanem ionu Ca 2+ iz celice, v celico vdre en proton (H + ). To pomeni, da se ob premiku enega osnovnega naboja izven celice, v smeri iz celice premakne en ion Ca 2+. Ker je naboj iona Ca 2+ že upoštevan ob pretvorbi iz električnega v snovni tok z valenco zca = +2 v imenovalcu ulomka (50), stoji pred električnim tokom IPMCA faktor 2. V primeru izmenjevalcev NCX se preko membrane celice izmenjujejo ioni Na + in Ca 2+ v razmerju 3:1, pri čemer Na + vstopa, Ca 2+ pa izhaja iz celice. Pri izmenjavi 3 ionov Na + v celico in 1 iona Ca 2+ izven celice, se v celico premakne en osnovni naboj. Ker se ioni Ca 2+ pri tem premikajo izven celice stoji pred tokom INCX predznak, faktor 2 pa je tam iz istega razloga kot v primeru PMCA. Predznak pred celotnim ulomkom je posledica definicije električnega toka, ki je pozitiven v primeru prehajanja pozitivnih ionov iz celice Električni tok skozi napetostno odvisne kalcijeve kanale I VOCC Napetostno odvisni Ca 2+ kanali tipa L oz. VOCC (angl. voltage operated calciumchannels) imajo pomembno vlogo pri regulaciji mišičnega tonusa v mirovanju in pri vzdrževani kontrakciji. Čeprav je v mirovnem stanju tok Ca 2+ skozi te kanale majhen, lahko signifikantno vpliva na koncentracijo Ca 2+ v citoplazmi celice ob depolarizaciji [46]. Izrazi za el. tok skozi napetostno odvisne kalcijeve kanale so povzeti po modelu Jacobsena in sod. [45] in modelirani po vzoru enačbe (36) iz uvoda te naloge: +?kk =,?kk " 5 " k2, (51) kjer je gvocc prevodnost kanalov, (Vm VCa) je»gonilna sila«za tok Ca 2+ ionov preko membrane, produkt dl fl pa predstavlja od časa odvisen delež odprtih kanalov (podobno kot Po(t) v enačbi (36)). dl predstavlja dinamična aktivacijska vrata kanala, fl pa dinamična deaktivacijska vrata. Odvisnosti sta podani z enačbama (52) in (53). Tam in predstavljata ravnovesni vrednosti spremenljivk dl in fl in imata enak pomen kot v enačbi (15). Ker je proces aktivacije kanalov zelo hiter pojav, predpostavimo, da je spremenljivka dl vseskozi v ravnovesju, pri čemer se njena vrednost spreminja v odvisnosti od membranskega potenciala (Vm) po zgledu enačbe (31) iz uvoda: = = 1+e?? G Iˆ Š KŒ ˆ D, (52) 32

39 kjer V1/2A predstavlja vrednost membranskega potenciala, pri kateri ima vrednost ½ in kslopea podaja strmino odvisnosti od Vm. V enačbi (32) smo ta parametra označili z V1/2 in So. Omenimo še, da je vrednost kslopea pozitivna, saj gre za proces aktivacije kanalov. Deaktivacijski proces vključuje dinamično in nedinamično komponento, zato fl zapišemo kot: = 0,74 +0,26, (53) kjer ff predstavlja dinamično komponento v procesu deaktivacije, ki je podana z diferencialno enačbo po zgledu enačbe (15) iz uvoda: = k2, (54) kjer je karakteristični čas zapiranja kanala v odvisnosti od Vm podan kot: I k2 = c. e F? L + d. (55) in kjer je ravnovesna vrednost deaktivacijskih vrat podana kot: D = 1+e?? G I Š KŒ (56) Vrednost kslopei je tukaj negativna, saj gre za proces deaktivacije. Vrednosti konstant so podane v tabeli 5. 33

40 Tabela 5. Vrednosti parametrov za el. tok skozi kanale VOCC. Vrednosti so povzete po [45]. Simbol Vrednost Opis gvocc S maksimalna prevodnost celice za Ca 2+ skozi kanale tipa L V1/2A V1/2I 4, V 27, V potencial za dosego polovične vrednosti deleža odprtih kanalov potencial za dosego polovične vrednosti deleža zaprtih kanalov kslopea 6, V strmina odvisnosti v izrazu za aktivacijo kanalov kslopei 6, V strmina odvisnosti v izrazu za deaktivacijo kanalov k3i k4i k5i k6i 0,3 s 4, V V 23, s konstanta v odvisnosti karakterističnega časa od membranske napetosti konstanta v odvisnosti karakterističnega časa od membranske napetosti konstanta v odvisnosti karakterističnega časa od membranske napetosti konstanta v odvisnosti karakterističnega časa od membranske napetosti El. tok Ca 2+ skozi VOCC je odvisen le od razlike med membranskim in ravnovesnim potencialom za Ca 2+. Bolj kot je celica depolarizirana večji bo tok. Graf na sliki 12 prikazuje ravnovesno vrednost el. toka skozi VOCC v odvisnosti od membranske napetosti pri različnih konstantnih vrednostih koncentracije Ca 2+ v citoplazmi. El. tok je eksponentno odvisen od membranske napetosti, in sicer, bolj kot je celica depolarizirana, večji je tok ionov Ca 2+ v celico. Iz primerjave grafov na sliki 12 je razvidno, da spremembe v koncentraciji Ca 2+ skorajda ne vplivajo na odvisnost. Ob manjši koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi je tok nekoliko večji po absolutni vrednosti. 34

41 Slika 12. El. tok skozi Ca 2+ kanale tipa L oz. VOCC v odvisnosti od membranske napetosti (Vm) za različne konstantne vrednosti koncentracije Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c) Električni tok skozi kalcijeve črpalke PMCA I PMCA Črpalke PMCA (angl. Plasma membrane calcium-atpase) se nahajajo v celični membrani in ob povišanih koncentracijah Ca 2+, le-tega črpajo iz celice. Ker črpajo Ca 2+ proti koncentracijskemu gradientu, je za njihovo delovanje potreben ATP. Te črpalke imajo posebno vlogo pri zagotavljanju mirovne koncentracije Ca 2+ v citoplazmi [45, 46]. Enačba za el. tok skozi črpalke PMCA ima obliko, ki je analogna splošni enačbi za tok ionov skozi črpalke (42), ki pa vsebuje še dodatni faktor, ki opisuje odvisnost toka od membranske napetosti: + pqk{ = + pqk{52# W E W E + pqk{ 1+ " > (57) Izraz je povzet po [45]. Opisi in vrednosti parametrov so podani v tabeli 6. Vsi parametri razen parametra IPMCAmax so povzeti po [45]. Parameter IPMCAmax smo v procesu kalibracije 35

42 povečali. Uporabili smo vrednost, ki je primerljiva z vrednostmi iz modela Kapele in sod. [46]. Tabela 6. Vrednosti parametrov za el. tok skozi črpalke PMCA Simbol Vrednost Opis IPMCAmax A maksimalni tok Ca 2+ skozi črpalke PMCA kpmca 0, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za kalcij kβ kα 0,1 V 0,250 V konstanta v odvisnosti aktivnosti črpalk od membranske napetosti konstanta v odvisnosti aktivnosti črpalk od membranske napetosti Na sliki 13 so prikazane odvisnosti IPMCA od [Ca 2+ ]c za različne konstantne vrednosti membranskih napetosti ( 20 mv, 40 mv in 60 mv). Z grafa je razvidno, da se el. tok viša s [Ca 2+ ]c, saj je črpalka namenjena temu, da ob visokih koncentracijah Ca 2+ le-tega prečrpava iz celice. Prav tako je razvidno, da se tok ob depolarizaciji (t.j. znižanju absolutne vrednosti Vm) zviša. 36

43 Slika 13. Odvisnost IPMCA od [Ca 2+ ]c za različne konstantne vrednosti Vm Električni tok skozi izmenjevalce natrija in kalcija I NCX Izmenjevalci Na + in Ca 2+ (NCX) prenašajo ione Ca 2+ iz celice, ione Na + pa v nasprotni smeri v razmerju 3Na + : 1Ca 2+. V mirovnem stanju celice je sicer ključni mehanizem za črpanje Ca 2+ iz citoplazme v zunanjo raztopino črpalka PMCA. Ko pa je celica vzbujena, in je koncentracija Ca 2+ v citoplazmi visoka, je glavni mehanizem za prehod Ca 2+ iz celice izmenjevalec NCX. Na aktivnost izmenjevalca pozitivno vpliva cgmp [45, 46]. Enačba za tok ionov skozi izmenjevalec (INCX) je v osnovi povzeta po [45] vpliv cgmp na ta tok pa je povzet po [46]: + 1k~ = $ 1k~ qp, 1k~ W E W E + 1k~ " 5 " 12k2 (58) Tok poganja razlika med membranskim potencialom in ravnovesnim potencialom (VNaCa), ki je podan z enačbo: " 12k2 = 3" 12 2" k2, (59) in izhaja iz stehiometrije izmenjevalca NCX, ki izmenja 3 ione Na + z valenco +1 v celico za 1 ion Ca 2+ z valenco +2 iz celice. gncx v enačbi (58) predstavlja maksimalno prevodnost izmenjevalca, RNCXcGMP pa predstavlja faktor, ki v izrazu modulira prevodnost izmenjevalca v odvisnosti od cgmp, ki je povzet po modelu Kapele in sod. [46]: $ 1k~ qp = 1+h 1k~ š š+ 1k~ qp (60) Tok Ca 2+ preko izmenjevalcev NCX modulira tudi koncentracija Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c), kar je v enačbi (58) opisano s preprosto Hillovo odvisnostjo. Opisi in vrednosti parametrov so podani v tabeli 7 in so povzeti po obeh prej omenjenih referencah. Slika 14 prikazuje odvisnost INCX od [Ca 2+ ]c za dve različni konstantni vrednosti cgmp (0 in mol/m 3 ) ter dve vrednosti Vm ( 50 mv in 60 mv). Z grafov vidimo, da cgmp bistveno ne vpliva na velikost toka INCX, saj je med grafoma za vrednosti cgmp je 0 in mol/m 3 razlika reda velikosti 0,1 pa, kljub temu pa lahko opazimo, da cgmp prispeva k večji vrednosti toka INCX. Bolj kot cgmp na velikost toka vpliva membranska napetost (Vm). Bolj kot je celica depolarizirana (oz. manjša kot je absolutna vrednost 37

44 napetosti Vm), manjši je tok. To pomeni, da ko je celica močno depolarizirana (Vm > 0) in/ali ko je koncentracija Ca 2+ dovolj nizka, izmenjevalci delujejo v obratni smeri in prenašajo ione Ca 2+ v, ione Na + pa iz celice. Toda ne glede na koncentracijo cgmp in vrednost membranske napetosti je glavna determinanta velikosti tega toka koncentracija Ca 2+ v citoplazmi. Tabela 7. Vrednosti parametrov za el. tok Ca 2+ skozi izmenjevalce NCX Simbol Vrednost Opis gncx S maksimalna prevodnost celice za prehod Ca 2+ skozi izmenjevalce NCX rncx 0,55 brezdimenzijska konstanta, ki določa maksimalni vpliv cgmp na prevodnost izmenjevalce kncx 0, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za kalcij v Hillovi odvisnosti kncxcgmp mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za cgmp v modulacijskem faktorju RNCXcGMP [Ca 2+ ] c [x10-3 mol/m 3 ] I NCX [pa] [cgmp] = 0 x10-3 mol/m 3, V m = -50 mv [cgmp] = 6 x10-3 mol/m 3, V m = -50 mv [cgmp] = 6 x10-3 mol/m 3, V m = -60 mv Slika 14. Grafi funkcije INCX([Ca 2+ ]c) pri različnih konstantnih vrednostih cgmp (0 in mol/m 3 ) ter Vm ( 50 mv in 60 mv) 38

45 5.2 Tokovi izmenjave kalcija z vezavnimi proteini v citoplazmi JPrC Vezavni proteini v citoplazmi (Prc) imajo vlogo shrambe za Ca 2+. V modelu je približno polovica Ca 2+ v citoplazmi vezanega na vezavne proteine. V modelu upoštevamo vezavo Ca 2+ na proteine, ki imajo eno vezavno mesto za Ca 2+. Vloga teh proteinov je ublažitev previsokih porastov Ca 2+ v citoplazmi. Na ta način ti proteini vplivajo na višino, obliko in na frekvenco signala Ca 2+. V modelu je predpostavljeno, da so ti proteini homogeno porazdeljeni po celotni citoplazmi celice. Vezavo Ca 2+ na proteine in disociacijo z njih modeliramo z bimolekularno reakcijo: W E +h p p hw, (61) kjer je PrcCa kompleks Ca 2+ vezanega na protein. Toka vezave (JPrC_ON) in disociacije (JPrC_OFF) Ca 2+ na/s proteinov sta definirana kot: pvkwz = p h W E (62) pvkwxx = p hw, (63) pri čemer koncentracijo prostega proteina ([Pr]c) določa diferencialna enačba: h = pvkwxx pvkwz (64) Koncentracijo s Ca 2+ vezanih proteinov ([PrCa]c) lahko izračunamo iz ohranitvene enačbe za totalno koncentracijo proteina [Prtot]c v citoplazmi, ki zagotavlja, da je vsota koncentracij prostega in vezanega proteina ves čas konstantna: hw = h h (65) Vrednosti in opisi parametrov so podani v tabeli 8 in so povzeti po [45]. 39

46 Tabela 8. Vrednosti parametrov izmenjave Ca 2+ z vezavnimi proteini v citoplazmi Simbol Vrednost Opis [Prtot]c mol/m 3 totalna koncentracija vezavnih proteinov v citoplazmi kpc 1 (10-3 mol/m 3 ) -1 s -1 hitrostna konstanta formacije kompleksa PrCa v citoplazmi k-pc 10 s -1 hitrostna konstanta razpada kompleksa PrCa v citoplazmi 5.3 Tokovi kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma JSR V modelu je privzeto, da je SR enovita shramba, ki predstavlja 5 % volumna celice in vsebuje kanale, ki so občutljivi na Ca 2+ in IP3 (ICICR) ter črpalke SERCA, ki prečrpavajo Ca 2+ nazaj v SR. Ca 2+ lahko iz SR v citoplazmo prehaja tudi pasivno. V modelu upoštevamo tudi, da se v SR Ca 2+ veže na proteine [45, 46]. Fizikalno-matematični opis tokov Ca 2+ preko membrano SR povzamemo po modelu Jacobsena in sod. [45]. Za porast koncentracije Ca 2+ v citoplazmi ob holinergični stimulaciji je v glavnem odgovoren pritok Ca 2+ iz SR. Namreč, ko se sekundarni prenašalec IP3, ki se generira ob tovrstni stimulaciji, veže na receptorje, ki se nahajajo v membrani SR, se odprejo kanali za izpust Ca 2+ iz SR v citoplazmo. Na odprtost teh kanalov vplivata tudi koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c) in v SR ([Ca 2+ ]SR). Ob porastu [Ca 2+ ]c se aktivirajo črpalke SERCA, ki črpajo Ca 2+ nazaj v SR. Zaradi razlike v koncentracijah Ca 2+ le-ta ves čas tudi pasivno prehaja iz SR v citoplazmo [45]. Aktivnost črpalk SERCA odločilno vpliva na frekvenco in na amplitudo oscilacij koncentracije Ca 2+ v citoplazmi. Neto molarni tok Ca 2+ iz SR v citoplazmo je vsota tokov Ca 2+ preko kanalov ICICR (JICICR) in črpalk SERCA (JSERCA) ter pasivnega toka Ca 2+ (JpasSR): J; = rkrk; + 42s_J; J9;k{ (66) 40

47 5.3.1 Tok kalcija skozi kanale ICICR J ICICR Tok Ca 2+ skozi kanale ICICR poganja razlika v koncentracijah Ca 2+ med citoplazmo in SR: rkrk; = $ J;,? h rkrk; rkrk; W E J; W E, (67) kjer je RSR,V razmerje volumnov SR in citoplazme (en. 46), ricicr je hitrostna konstanta za izpust Ca 2+ iz SR, PICICR pa je verjetnost za odprtost kanalov ICICR, ki je odvisna od koncentracije IP3 v citoplazmi in koncentracije Ca 2+ v SR: rkrk; = { 1 r + c /rp` + c /rp` /rp` +rp` W E J; /J; W E J; /J; + J; /J; (68) Izraz je povzet po [45]. Verjetnost za odprtost teh kanalov je odvisna od mehanizma aktivacije in deaktivacije teh receptorjev. Ker je proces aktivacije hiter, je delež odprtih kanalov (fa) kar enak ravnovesni vrednosti tega deleža ( { ), ki pa je odvisen od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi na sledeč način: W { = E #ˆ { = W E #ˆ #ˆ + { (69) Proces inhibicije kanalov je počasnejši in je opisan z diferencialno enačbo po zgledu enačbe (15): r = r r, (70) r kjer je povprečna vrednost fi ( ) r definirana kot: r = W E # W E # + r # (71) Oba mehanizma, za aktivacijo (fa) in inhibicijo (fi), sta odvisna od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi. Pri višjih vrednostih [Ca 2+ ]c se aktivira mehanizem za inhibicijo kanalov, kar nakazuje tudi večja vrednost konstante ki v primerjavi s ka (tabela 9). Le-ti predstavljata konstanti polovične zasičenosti za Ca 2+ v izrazih (69) in (71). Vrednosti in opisi parametrov so podani v tabeli 9. Vsi parametri, razen ricicr, katerega vrednost smo spremenili zaradi prilagoditve modela, so povzeti po [45]. 41

48 Tabela 9. Vrednosti parametrov za tok Ca 2+ skozi kanale ICICR Simbol Vrednost Opis ricicr 30 s -1 hitrostna konstanta pretoka Ca 2+ iz SR skozi kanale ICICR nip3 4 Hillov koeficient v odvisnosti za odprtost kanalov od [IP3] kip3 0, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za [IP3] nsr 2 Hillov koeficient v odvisnosti za odprtost kanala od [Ca 2+ ]SR ksr 2 mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za [Ca 2+ ]SR xa 4 Hillov koeficient v mehanizmu aktivacije kanala v odvisnosti od [Ca 2+ ]c ka 0, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za [Ca 2+ ]c v procesu aktivacije xi 4 ki 0, mol/m 3 Hillov koeficient v mehanizmu inhibicije kanala v odvisnosti od [Ca 2+ ]c konstanta polovične zasičenosti za [Ca 2+ ]c v procesu inhibicije τi 6,0 s karakteristični čas inhibicije kanala ICICR Na sliki 15 je prikazana odvisnost PICICR od [Ca 2+ ]c pri konstantni vrednosti [Ca 2+ ]SR = mol/m 3 in [IP3] = mol/m 3. Z grafa je razvidna zvonasta odvisnost od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi. Pri koncentraciji [Ca 2+ ]c 0, mol/m 3 je odprto maksimalno število kanalov. Nad to vrednostjo prevladuje mehanizem za inhibicijo kanalov. 42

49 Slika 15. Odvisnost PICICR od [Ca 2+ ]c pri konstantni vrednosti [Ca 2+ ]SR = mol/m Tok kalcija skozi črpalke SERCA J SERCA Da se kalcijeva shramba SR povsem ne izprazni in da je omogočeno nihanje Ca 2+ v citoplazmi, poskrbijo tudi črpalke SERCA. Le-te pričnejo ob povišani koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi črpati Ca 2+ nazaj v SR. Izraz za tok je povzet po [45] in je analogen enačbi (42): W E 4 J9;k{ = $ J;,? h J9;k{ W E (72) J9;k{ Graf na sliki 16 prikazuje tok Ca 2+ skozi črpalke SERCA (JSERCA) v odvisnosti od [Ca 2+ ]c. Tok že pri dokaj nizkih koncentracijah Ca 2+ (0, mol/m 3 ) skoraj doseže svojo maksimalno vrednost. Mirovna koncentracija Ca 2+ v citoplazmi je približno 0, mol/m 3 in med osciliranjem lahko doseže vrednost 0, mol/m 3. Iz tega sledi, da črpalka, razen v mirovnem stanju celice, ves čas deluje s skoraj konstantno maksimalno hitrostjo. Vrednosti in opisi parametrov so podani v tabeli

50 Tabela 10. Vrednosti parametrov za tok Ca 2+ skozi črpalke SERCA Simbol Vrednost Opis rserca mol/m 3 s maksimalni tok Ca 2+ skozi črpalke SERCA p 2,5 Hillov koeficient v odvisnosti aktivnosti SERCA od [Ca 2+ ]c kserca 0, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za [Ca 2+ ]c Vsi parametri iz tabele 10, razen rserca, katerega vrednost smo prilagajali, so povzeti po [45]. Slika 16. Odvisnost JSERCA od [Ca 2+ ]c Pasivni tok kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma J passr Nobena membrana ni popolnoma neprepustna. To velja tudi za membrano sarkoplazemskega retikuluma. Ker je volumen SR veliko manjši od volumna citoplazme, totalna koncentracija Ca 2+ v njem pa velika, je koncentracija prostega Ca 2+ v SR, kljub 44

51 vezavi na proteine, tudi do tisočkrat večja kot v citoplazmi. Iz SR zato preko membrane uhajajo Ca 2+ ioni, njihov tok pa poganja razlika koncentracij Ca 2+ v SR in citoplazmi. Izraz za tok je povzet po [45]: 42stu = $ J;,? h 42sJ; W E J; W E, (73) kjer je rpassr hitrostna konstanta pasivnega toka Ca 2+ iz SR, katere vrednost je 2 s Tokovi izmenjave kalcija z vezavnimi proteini v sarkoplazemskem retikulumu JPrSR Kalcij se tudi v SR veže na vezavne proteine, za katere predpostavljamo, da so enakomerno razporejeni po celotni shrambi. Ti proteini imajo, podobno kot tisti v citoplazmi, eno vezavno mesto za Ca 2+. Vezavo Ca 2+ na proteine in disociacijo z njih zato modeliramo z bimolekularno reakcijo kot v primeru vezave Ca 2+ na proteine v citoplazmi: W E +h J; pj; pj; hw J; (74) PrSR predstavlja prosto obliko vezavnega proteina, PrCaSR pa predstavlja obliko proteina, na katerega je vezan Ca 2+ v SR [45]. Toka vezave (JPrSR_ON) in disociacije (JPrSR_OFF) Ca 2+ s proteini sta definirana kot: pvj;wz = pj; h J; W E J; (75) pvj;wxx = pj; hw J;, (76) Hitrost spreminjanja koncentracije PrSR ([Pr]SR) opiše sledeča diferencialna enačba: h = pvj;wxx pvj;wz (77) [PrCa]SR pa izračunamo iz ohranitvene enačbe za vezavne proteine v SR, kjer se totalna koncentracija vezavnih proteinov ([Prtot]SR) ne spreminja in je enaka vsoti [Pr]SR in [PrCa]SR: h J; = hw J; +h J; (78) Vrednosti in opisi parametrov so podani v tabeli 11 in so povzeti po [45]. 45

52 Tabela 11. Vrednosti parametrov za vezavo kalcija na vezavne proteine v SR Simbol Vrednost Opis [Prtot]SR 10 mol/m 3 totalna koncentracija vezavnih proteinov v SR kpsr 0,1 (10-3 mol/m 3 ) -1 s -1 hitrostna konstanta formacije kompleksa [PrCa] v SR k-psr 100 s -1 hitrostna konstanta razpada kompleksa [PrCa] v SR 5.5 Električni tokovi ostalih ionov Električni tok preko od kalcija odvisnih klorovih kanalov I ClCa V podganjih GMC so identificirali dve vrsti od Ca 2+ odvisnih klorovih kanalov (ClCa). Ena vrsta kanalov je od cgmp neodvisna in potrebuje za aktivacijo visoko koncentracijo Ca 2+ v citoplazmi. Druga vrsta pa je odvisna od cgmp in jih ob prisotnosti cgmp aktivira že zelo nizka koncentracija Ca 2+ ([Ca 2+ ]c < 0, mol/m 3 ) [46]. V modelu upoštevamo le slednje [46]. Izraz za električni tok (IClCa) skozi od Ca 2+ odvisne Cl - kanale, ki se nahajajo na celični membrani, povzamemo po [45]: + k k2 =, k k2 k k2 " 5 œ k, (79) kjer je gclca maksimalna prevodnost kanala, PClCa je dinamična mera odprtosti kanala, ki je podana z diferencialno enačbo po analogiji enačbe (15): k k2 = k k2 k k2 k k2 (80) kjer je k k2 vrednost prej omenjene mere v ravnovesju, ki pa je odvisna od [Ca 2+ ]c: CW E / k k2 = W E / +o k k2 1 C y /, (81) kjer kclca(1 α ρ) predstavlja modulirani koeficient polovične zasičenosti s Ca 2+ ioni, ki je odvisen od koncentracije cgmp. Faktor α se namreč spreminja v odvisnosti od koncentracije cgmp, ρ pa določa jakost te odvisnosti in ima lahko vrednost med 0 in 1. 46

53 C = š 5 š 5 + k qp 5 (82) Vrednosti parametrov in njihovi opisi se nahajajo v tabeli 12, vrednosti so povzete po [45]. Tabela 12. Vrednosti parametrov za el. tok skozi kanale ClCa Simbol Vrednost Opis gclca 3, S maksimalna električna prevodnost kanalov za klor kclca 0, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za kalcij ρ 0,9 n 3,0 m 3,3 konstanta jakosti vpliva cgmp na odprtost kanalov za klor Hillov koeficient v odvisnosti odprtosti kanalov za klor od kalcija Hillov koeficient v odvisnosti odprtosti kanalov za klor od cgmp kclcgmp 6, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za cgmp τclca s karakteristični čas za odprtje kanala za klor Slika 17 prikazuje odvisnosti PClCa od [Ca 2+ ]c za različne vrednosti cgmp (0 ter 5 in mol/m 3 ). Brez prisotnosti molekule cgmp so vsi kanali zaprti in el. tok je enak 0. Z višanjem koncentracije cgmp je odprtih več kanalov in večji je el. tok v ali iz celice. Pri absolutni vrednosti membranske napetosti višji od 25 mv, teče el. tok iz celice (< 25 mv), pri nižjih pa v celico (> 25 mv). To pomeni, da se pri vrednostih Vm > 25 mv ioni Cl - pomikajo v celico, pri vrednostih Vm < 25 mv pa izven celice. V prvem primeru se celica hiperpolarizira, v drugem pa depolarizira. To je razvidno s slike 18, ki prikazuje odvisnosti električnega toka (IClCa) od [Ca 2+ ]c za različni konstantni vrednosti [cgmp] (5 in mol/m 3 ) pri dveh vrednostih Vm ( 20 in 50 mv). Pri napetosti 20 mv ima tok IClCa drugačen predznak kot pri 50 mv, kar nakazuje na različne smeri toka (v oz. iz celice). 47

54 Slika 17. Odvisnost PClCa od [Ca 2+ ]c za različne konstantne vrednosti [cgmp] Slika 18. Odvisnost IClCa od [Ca 2+ ]c za različne kombinacije konstantnih vrednosti [cgmp] in Vm 48

55 5.5.2 Električni tok preko črpalk natrija in kalija I Na/K Črpalka za Na + in K + (Na/K), imenovana tudi Na + /K + -ATPaza, uravnava koncentracijo Na + in K + v citoplazmi. Njena aktivnost je odvisna od koncentracije Na + v citoplazmi, koncentracije K + zunaj celice in od membranske napetosti. Črpalka črpa Na + iz in K + v celico, kar je proti koncentracijskemu gradientu obeh vrst ionov, s stehiometrijo 3Na + : 2K + in s tem vzdržuje stalni gradient koncentracije za ione Na + in K +. Pri tem porablja energijo v obliki ATP. cgmp povečuje maksimalno aktivnost te črpalke [45, 46]. Opis za tok povzamemo po [45]: + 12/- = # Y W c/e Y W c/e c/e + " 5 +" D (83) " 5 +" E Dela enačbe, ki opisujeta odvisnost toka od koncentracij K + v zunajcelični raztopini in od Na + v citoplazmi, sta analogna tistim v enačbi (42). Toda, ker v modelu privzamemo konstantne vrednosti koncentracij K + zunaj in Na + v celici, sta ta dva dela enačbe dejansko konstantna in bi ju bilo moč nadomestiti z enim faktorjem. Aktivnost črpalk po navadi ni odvisna od membranske napetosti. Toda črpalke Na/K so izjema, zato v enačbi nastopa šibka odvisnost od Vm. Jacobsen in sod. [45] v svojem modelu upoštevajo odvisnost INaKmax, ki predstavlja maksimalno vrednost toka INa/K, od cgmp, vendar le v ozkem območju [cgmp]. V svojem modelu so uporabili kar linearno odvisnost, ki pa ne opiše dobro obnašanje sistema v večjem razponu koncentracij. Zato smo odvisnost INaKmax od cgmp modelirali sami, tako da je razpon delovanja črpalke v odvisnosti od [cgmp] opisan s Hillovo odvisnostjo: # = + 12-_ž2s2 + _12- š E š E +Y qp E (84) V izrazu INaK_basal predstavlja najmanjši možni maksimalni tok ob odsotnosti molekule cgmp. Večja kot je koncentracija cgmp, večja bo vrednost INaKmax in večji bo tok INa/K. To je prikazano tudi na sliki 19, ki prikazuje odvisnosti INa/K od membranske napetosti Vm pri različnih koncentracijah cgmp (0 ter 5 in mol/m 3 ). Z grafov je moč razbrati naraščanje toka INa/K z višanjem vrednosti Vm. Toda precej bolj kot Vm na vrednost toka vpliva [cgmp], ki močno poveča aktivnost črpalk. Vrednosti in opisi parametrov so podani v tabeli

56 Tabela 13. Vrednosti parametrov za električni tok skozi črpalko Na/K Simbol Vrednost Opis knak-k 1 mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za kalij knak-na 11 mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za natrij V1 V2 0,150 V 0,200 V konstanta v odvisnosti aktivnosti črpalk od membranskega potenciala konstanta v odvisnosti aktivnosti črpalk od membranskega potenciala INaK_basal 5, A bazalni maksimalni el. tok skozi Na/K črpalko dl-nak A maksimalni el. tok skozi Na/K črpalke v odvisnosti od cgmp KcGMP mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za cgmp Slika 19. Odvisnost INa/K od Vm za različne konstantne vrednosti [cgmp] 50

57 5.5.3 Električni tok skozi od kalcija odvisne kalijeve kanale I KCa Skozi od Ca 2+ odvisne kanale za K + (KCa) prehaja K + iz celice. Prepustnost teh kanalov pa je močno odvisna od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi. Povišan tok K + skozi celično membrano vodi do hiperpolarizacije. Ti kanali imajo ključno vlogo pri kontroli električnih in mehanskih aktivnosti GMC. Poleg koncentracije Ca 2+ v citoplazmi pa na odprtost teh kanalov, neposredno ali posredno preko cgmp, vpliva tudi koncentracija NO [46]. V modelu upoštevamo le posreden vpliv NO na odprtost kanalov. Izraz za tok preko kanalov za kalij (IKCa) je povzet po [45] in ima tipično obliko enačbe za tok skozi napetostno regulirane kanale (en. (36)). Fizikalno-matematični opis temelji na produktu maksimalne prevodnosti kanala (gkca), verjetnosti za odprtosti kanalov PKCa in gonilne sile, ki je podana kot razlika med membransko napetostjo (Vm) in Nernstovim ravnovesnim potencialom za K + (VK): + -k2 =, -k2 -k2 " 5 " -. (85) Vrednost PKCa se spreminja s časom: -k2 = -k2 -k2 -k2 (86) Vrednost -k2 predstavlja delež odprtih kanalov v ravnovesju, ki pa je odvisen od [Ca 2+ ]c in Vm na naslednji način: -k2 = W E k E W E E k +Ÿ e o?? G I : y ;. (87) Zgornji izraz ima analogno obliko enačbi (31), le da je dodana determinanta občutljivosti na napetost (δ). V1/2KCa ima enak pomen kot V1/2 v enačbi (31) in predstavlja napetost, pri kateri je v ravnovesju odprta polovica kanalov. RK ima enak pomen kot So in predstavlja strmino odvisnosti. V originalnem modelu Jacobsena in sod. [45] je vrednost V1/2KCa konstanta. Toda ker naj bi imel cgmp glavni vpliv prav na te kanale, smo iz modela Kapele in sod. [46] povzeli odvisnost V1/2KCa od cgmp: kjer je: " D E-k2 = " " D E-k2 qp $ qp, (88) 51

58 $ qp = š / : š / : +-k2 qp / : (89) Na podlagi rezultatov eksperimenta, v katerem so študirali vpliv cgmp na te kanale [54], smo povzeli vrednosti parametrov polovičnega potenciala maksimalne aktivacije (VB), maksimalne spremembe (V1/2KCacGMP), polovične zasičenosti (kkcacgmp) in Hillovega koeficienta (nkca). Zaradi sklopitve dveh modelov smo prilagodili še vrednosti determinante občutljivosti na napetost (δ) in strmino odvisnosti (RK). Opisi in vrednosti parametrov so podani v tabeli 14. Tabela 14. Vrednosti parametrov za tok skozi kanale KCa Simbol Vrednost Opis gkca S maksimalna električna prevodnost celice za tok skozi kalijeve kanale občutljive na Ca 2+ δ 10-8 (mol/m 3 ) 2 determinanta občutljivosti na napetost v izrazu za delež odprtih kanalov VB V polovični potencial maksimalne aktivacije V1/2KCacGMP V maksimalna sprememba V1/2KCa v odvisnosti od cgmp RK V strmina odvisnosti v izrazu za odprtost kanalov τkca 0,022 s karakteristični čas za dosego odprtosti kanalov kkcacgmp 1, mol/m 3 konstanta polovične zasičenosti za cgmp nkca 1 Hillov koeficient v odvisnosti odprtosti kanalov KCa od cgmp Slika 20 prikazuje odvisnost mere odprtosti kanalov (PKCa) od [Ca 2+ ]c pri membranski napetosti 50 mv za različne konstantne vrednosti [cgmp] (0 ter 3 in mol/m 3 ). Z grafov je razvidno, da koncentraciji Ca 2+ in cgmp močno vplivata na odprtost kanalov. Večja kot je koncentracija cgmp, višja je stopnja odprtosti kanalov pri isti koncentraciji Ca

59 Slika 20. Odvisnost PKCa od [Ca 2+ ]c za konstanto vrednost Vm ( 50 mv) in za različne konstantne vrednosti [cgmp] (0 ter 3 in mol/m 3 ) Slika 21 pa prikazuje odvisnost električnega toka (IKCa) od [Ca 2+ ]c pri različnih kombinacijah konstantnih vrednosti Vm ( 40 mv in 50 mv) in [cgmp] (0 in mol/m 3 ). Z grafov lahko razberemo, da ima poleg cgmp in Ca 2+, močan vpliv na električni tok tudi membranska napetost (Vm). In sicer, bolj kot je celica depolarizirana, večji je tok IKCa. 53

60 Slika 21. Odvisnost IKCa od [Ca 2+ ]c za različne kombinacije konstantnih vrednosti Vm ( 40 in 50 mv) in [cgmp] (0 in mol/m 3 ) Pasivni električni tokovi ionov I pas_x Skozi celično membrano tečejo električni tokovi tudi mimo kanalov, saj je le-ta deloma prepustna za ione in majhne hidrofobne molekule. Ti tokovi so pasivni in so odvisni zgolj od razlike potencialov. Izraze za pasivne tokove ionov Ipas_x povzamemo po [45]. Definirani so kot produkt prevodnosti za posamezni ion (gpas_x) in razlike med membranskim in Nernstovim potencialom za posamezni ion (Vm Vx): + 42s =, 42s " 5 " # (90) Oblika enačbe je za vse ione enaka, različne so le vrednosti parametrov. Z x je označena vrsta iona Na +, K +, Cl - in Ca 2+. Vrednosti parametrov so podane v tabeli

61 Tabela 15. Vrednosti el. prevodnosti za pasivne tokove različnih ionov preko celične membrane Simbol Vrednost Opis gpas_ca S bazalna prevodnost za Ca 2+ gpas_na S bazalna prevodnost za Na + gpas_k S bazalna prevodnost za K + gpas_cl S bazalna prevodnost za Cl - Smeri pasivnih ionskih tokov so odvisne od vrednosti trenutnega membranskega potenciala celice v primerjavi z ravnovesnim Nernstovim potencialom za posamezni ion, ki so podani v tabeli 4. V modelu je Nernstov potencial konstanten za vse ione, razen za Ca 2+, katerega vrednost se odvisno od [Ca 2+ ]c giblje med 90 in 130 mv. Ker v modelu nikoli niso dosežene pozitivne vrednosti membranskega potenciala, pasivni tok Ca 2+ vedno teče v celico. Enako velja za pasivni tok ionov Na +. Tok K + teče iz celice. Električni tok zaradi toka ionov Cl - pa lahko menja smer, saj trenutni membranski potencial celice lahko niha okrog vrednosti ravnovesnega potenciala za te ione ( 25 mv). 5.6 Modeliranje razvoja sile v gladki mišični celici FGMC Preko spremembe koncentracije Ca 2+ v citoplazmi celice poteka regulacija kontrakcije oz. relaksacije gladkih mišic. Ca 2+ z vezavo na kalmodulin (CaM) tvori kompleks Ca 2+ CaM, ki aktivira encim MLCK, le-ta pa fosforilira encim lahko verigo miozina (MLC), ki je del miozina (M). Fosforilirana oblika miozina (Mp) se nato veže na aktin (A). Vezava miozina na aktin tvori aktinsko-miozinski prečni mostiček (AMp), ki s svojim prepenjanjem in drsenjem ob aktinskem vlaknu generira silo v GMC. Za ponovno relaksacijo celice poskrbi fosfataza lahkih verig miozina (MLCP), ki defosforilira Mp in AMp. Pri tem se lahko ustvari nefosforiliran aktinsko-miozinski prečni mostiček (AM), ki vzdržuje silo, in se imenuje zaskočeni prečni mostiček (angl.»latch bridge«). Do te oblike prečnega mostička lahko vodi tudi veliko šibkejša in počasnejša interakcija med M in A. To pomeni, da defosforilacija miozina teži k relaksaciji. Kontrakcija GMC je torej pretežno odvisna od razmerja med aktivnostima encimov MLCK in MLCP, pri čemer pa je aktivnost MLCK posredno odvisna od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi celice. 55

62 Za opis od Ca 2+ odvisnega razvoja sile v GMC naš model kalcijevih oscilacij združimo z modelom Fajmuta in sod. za razvoj sile v GMC [55]. Njihov model opisuje aktivacijo MLCK in predstavlja nadgrajeni 4-stanjski model Haia in Murphyja [56], ki opisuje zgoraj predstavljene interakcije med aktinom in miozinom. Na sliki 22 je narisana kinetična shema modela Fajmuta in sod. [55]. Levi del slike (slika 22a) prikazuje kinetično shemo od Ca 2+ in CaM odvisne aktivacije MLCK v obliki kocke. V vsakem njenem oglišču je ena izmed osmih vrst CaM. Vrsto CaM določa zasedenost njegovih treh vezavnih mest. CaM ima namreč dve vezavni mesti (terminala) za vezavo dveh ionov Ca 2+ (terminala N in C) in eno vezavno mesto za vezavo MLCK (terminal M). Na shemi CaM _ označuje prost kalmodulin (»_«označuje prosto vezavno mesto), CaMn označuje kalmodulin, na katerega sta vezana dva iona Ca 2+ na terminalu N, CaM m označuje CaM, na katerega je vezan MLCK, itd. MLCK* predstavlja CaM na katerega so vezani štirje ioni Ca 2+ (dva na N in dva na C terminalu) in MLCK. Ca4CaM MLCK predstavlja aktivno obliko MLCK. Na kinetični shemi so ki (i = 1, 1, 2, 2, ) hitrostne konstante vezave ali disociacije 2 ionov Ca 2+ ali MLCK na oz. z različnih vrst CaM. Na sliki 22b je prikazana 4-stanjska kinetična shema interakcij med miozinom (M) in aktinom (A). Črtkana črta označuje povezavo obeh shem v en celovit model preko količine aktivnega encima MLCK (MLCK*), ki definira vrednosti parametrov k1 * in k6 *, ki predstavljata hitrosti fosforilacije M in AM. V nasprotni smeri fosforilacije poteka proces defosforilacije, ki je na sliki eksplicitno prikazan z encimsko reakcijo po vzoru: œ +A œa +œ, (91) kjer sta substrata (S) za reakcijo Mp in AMp, encim (E) je MLCP, vmesna kompleksa (ES) pa sta MLCPMp in MLCPAMp. kcat je hitrostna konstanta katalize encima, hitrostni konstanti k+ in k- pa predstavljata hitrost tvorbe oz. razpada kompleksov MLCPAMp in MLCPMp. Ostale hitrostne konstante v 4-stanjski shemi kj * (j = 3, 4, 7, 8) predstavljajo hitrosti interakcije med fosforiliranim ali nefosforiliranim miozinom (M in Mp) in aktinom (A). Le miozin vezan na aktin (AM in AMp) prispeva k razvoju sile, kar pomeni, da prispeva h kontrakciji mišice. Ostala stanja vodijo do relaksacije GMC. 56

63 Slika 22. a) Kinetična shema interakcij med Ca 2+, CaM in MLCK in b) 4-stanjska kinetična shema interakcij med aktinom (A) in miozinom (M) [55] Totalna koncentracija kalmodulina ([CaMtot]) je v sistemu konstanta in zanjo velja ohranitvena enačba, iz katere lahko izrazimo eno spremenljivko, npr. koncentracijo prostega kalmodulina ([CaM _]): jwš _ m Wš ojwš /_ mjwš _5 mjwš mjwš 5 m (92) jwš / mjwš /_] mšiy y Prav tako velja ohranitvena enačba za totalno koncentracijo encima MLCK ([MLCKtot]), iz katere lahko prav tako izrazimo eno spremenljivko, npr. koncentracijo prostega encima MLCK ([MLCK]): šiy šiy ošiy jwš _5 mjwš 5 mjwš /_] my (93) Spreminjanje koncentracij preostalih 7 neodvisnih spremenljivk v interakciji med Ca 2+, CaM in MLCK opišemo z dinamičnim sistemom, ki sestoji iz diferencialnih enačb prvega 57

64 reda. Časovno spreminjanje ene izmed teh spremenljivk, npr. CaM, na katerega so vezani 4 ioni Ca 2+ in encim MLCK, opišemo kot: šiy = D W E E jwš _5 m D šiy + E šiyjwš /_ m E šiy + W E E jwš / m šiy (94) Diferencialne enačbe za ostale spremenljivke (CaM_cm, CaMnc_, CaM_c_, CaM m, CaMn, CaMn_m) zapišemo analogno zgornji enačbi s pomočjo kinetične sheme na sliki 22a, ki prikazuje smeri poteka reakcij do posamezne spremenljivke, kar se odraža v predznakih posameznih členov. Vrednosti parametrov so podane v tabelah 16 in 17 in so povzete po [55]. Tabela 16. Kinetične konstante interakcij med Ca 2+, CaM in MLCK Simbol Vrednost Simbol Vrednost k1 30 µm -2 s -1 k-1 4 s -1 k µm -1 s -1 k-2 1 s -1 k3 100 µm -2 s -1 k s -1 k µm -1 s -1 k-4 60 s -1 k5 20 µm -2 s -1 k-5 0,2 s -1 k6 2,8 µm -2 s -1 k-6 6 s -1 k7 2,8 µm -2 s -1 k-7 6 s -1 k8 5 µm -2 s -1 k-8 0,2 s -1 k9 910 µm -1 s -1 k s -1 k µm -2 s -1 k s -1 k µm -1 s -1 k s -1 k µm -2 s -1 k-12 4 s -1 Tabela 17. Vrednosti totalnih koncentracij CaM in MLCK Simbol Vrednost Opis [CaMtot] 2 µm totalna koncentracija CaM [MLCKtot] 2 µm totalna koncentracija MLCK 58

65 V modelu velja tudi ohranitvena enačba za totalno koncentracijo miozina ([Mtot]), iz katere lahko prav tako izrazimo eno spremenljivko, npr. koncentracijo prostega miozina ([M]): š š š Xš Xššiš šixš (95) Z diferencialnimi enačbami prvega reda opišemo časovno spreminjanje ostalih spremenljivk (Mp, AMp in AM) v 4-stanjski shemi: š D š E š c š + Xš (96) Xš Xš = c š Xš Xš + d Xš (97) = Xš d Xš Xš+ š (98) Spremenljivki MLCPMp in MLCPAMp, ki predstavljata vmesna kompleksa med encimom in substratom, pa izrazimo iz predpostavke hitre vzpostavitve ravnovesja po vzoru encimske kinetike v modelu Michaelisa in Mentenove: šiš ši š Y 5ª Xš Xš (99) šixš ši Xš Y 5ª Xš Xš (100) kjer je [MLCPtot] totalna koncentracija encima MLCP in KmD Michaelis-Mentenina konstanta. V enačbah (96)-(98) parametra k5 * in k2 * predstavljata hitrosti defosforilacije na aktin pripetega oz. prostega miozina (AMp in Mp) in sta podani z izrazom: E = = 2ª šiy Y 5ª +Xš+Xš (101) Parametra k1 * in k6 *, ki predstavljata hitrosti fosforilacije, pa sta odvisni od deleža aktivne oblike MLCK: D = d = «šiy šiy, (102) 59

66 kjer k0 predstavlja maksimalno hitrost fosforilacije. Vrednosti in opisi parametrov interakcij med miozinom in aktinom iz 4-stanjske sheme so podani v tabeli 18 in so povzeti po referenci [55]. Tabela 18. Vrednosti in opisi parametrov v 4-stanjski shemi Oznaka Vrednost Opis k0* 1 s -1 kinetična hitrostna konstanta k3* 0,3 s -1 kinetična hitrostna konstanta k4* 0,1 s -1 kinetična hitrostna konstanta k7* 0,02 s -1 kinetična hitrostna konstanta k8* 0,001 s -1 kinetična hitrostna konstanta [Mtot] 30 µm totalna koncentracija miozina kcatd 16 s -1 katalitična konstanta KmD 16 µm Michaelis-Mentenina konstanta [MLCPtot] 2 µm totalna koncentracija encima MLCP Sila, ki jo razvije GMC (FGMC), je v modelu definirana kot razmerje koncentracij vseh možnih kompleksov miozina, vezanega na aktin (F) in koncentracij vseh možnih kompleksov miozina vezanega na aktin pri zelo visoki, supramaksimalni koncentraciji Ca 2+ v citoplazmi (npr mol/m 3 ) (Fmax): ' qk ' ' 52# Xš XššiXš Xš XššiXš 52# (103) Fmax je v modelu konstantna vrednost. Vrednost FGMC predstavlja delež maksimalne sile, ki jo je gladka mišična celica možna razviti. Na sliki 23 je prikazana odvisnost FGMC od [Ca 2+ ]c v ravnovesju. Z grafa je razvidna naraščajoča odvisnost ravnovesne vrednosti sile od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi, ki je povsem v skladu z meritvami. 60

67 Slika 23. Odvisnost FGMC od [Ca 2+ ]c 6 REZULTATI IN DISKUSIJA Cilj magistrske naloge je izračunati odvisnost sile, ki jo gladka mišična celica razvije, v odvisnosti od koncentracije molekule cgmp v citoplazmi te celice. Ker je vrednost sile neposredno odvisna od koncentracije Ca 2+ v citoplazmi ([Ca 2+ ]c) (slika 23), moramo poznati vpliv molekule cgmp na obliko signala Ca 2+. Sila, ki se razvije v odvisnosti od oscilirajočega signala Ca 2+, je odvisna tako od amplitude, kot tudi od frekvence oscilacij Ca 2+. Pod vplivom višje amplitude in višje frekvence se razvije višja sila. Molekula cgmp vpliva na [Ca 2+ ]c posredno preko vpliva na posamezne tokove ionov preko celične membrane. Fizikalno-matematični model za razvoj sile v vaskularni GMC predstavljajo enačbe (43)- (103), ki jih rešujemo z numerično metodo Runge-Kutta 4. reda v programu Berkeley Madonna. Vse vrednosti parametrov so podane v tabelah Začetne vrednosti posameznih spremenljivk so izbrane tako, da se sistem že ob času 0 nahaja v ravnovesju. 61

68 Simulacije so izvedene pri konstantni vrednosti koncentracije molekule IP3 ([IP3]), ki znaša mol/m 3. IP3 v citoplazmi nastaja ob holinergični stimulaciji, ki pa je eksplicitno ne modeliramo. V našem modelu smo nekatere vrednosti parametrov prilagajali. Izbrali smo jih tako, da je signal Ca 2+ v citoplazmi [Ca 2+ ]c v celotnem področju simulacij vpliva cgmp ustrezal tipičnim lastnostim signalov Ca 2+ v GMC arterij, t.j. minimalna vrednost [Ca 2+ ]c je približno 0, mol/m 3, maksimalna vrednost je reda velikosti mol/m 3, vrednost membranske napetosti je približno 50 mv ter frekvenca oscilacij je reda velikosti 10 min -1. V tem delu nas predvsem zanima vpliv koncentracije cgmp v celici na frekvenco in amplitudo oscilacij ter posledično na razvito silo. Ob odsotnosti cgmp je koncentracija Ca 2+ v citoplazmi v ravnovesni legi in sicer pri vrednosti 0, mol/m 3. Oscilacije [Ca 2+ ]c se v modelu pojavijo pri vrednosti [cgmp] = 0, mol/m 3. To je razvidno s slike 24, ki prikazuje odvisnosti maksimalne ([Ca 2+ ]c,max) (rdeča krivulja), minimalne ([Ca 2+ ]c,min) (modra krivulja) in povprečne ([Ca 2+ ]c,pov) (zelena krivulja) vrednosti koncentracije Ca 2+ od [cgmp]. Pri vrednostih [cgmp] manjših od 0, mol/m 3 so vse vrednosti enake, kar pomeni, da je sistem v ravnovesju in ne oscilira. V področju oscilacij je najmanjša vrednost [Ca 2+ ]c ([Ca 2+ ]c,min) vseskozi praktično konstantna in znaša 0, mol/m 3 (modra krivulja na sliki 24), kar je povsem v skladu z izmerjenimi signali Ca 2+ v GMC [57]. Maksimalna vrednost oz. magnituda oscilacij [Ca 2+ ]c ([Ca 2+ ]c,max) kaže drugačno odvisnost. Pri vrednosti [cgmp] = 0, mol/m 3, pri kateri se začne območje samovzdrževanih oscilacij, magnituda [Ca 2+ ]c najprej zelo strmo naraste do vrednosti [Ca 2+ ]c 0, mol/m 3, nakar z višanjem [cgmp] prične približno linearno padati do vrednosti [Ca 2+ ]c 0, mol/m 3, ki jo doseže pri [cgmp] mol/m 3, magnituda [Ca 2+ ]c ponovno strmo naraste do vrednosti 0, mol/m 3, nato pa z višanjem [cgmp] naraste do maksimalne vrednosti približno 0, mol/m 3, ki jo doseže pri [cgmp] mol/m 3. Pri višjih vrednostih [cgmp] od te, magnituda [Ca 2+ ]c postopoma pada. Analiza je opravljena do vrednosti [cgmp] = mol/m 3, ki je še fiziološko smiselna. Zelena krivulja na sliki 24 pa prikazuje povprečno vrednost [Ca 2+ ]c. Kot je razvidno s slike, le-ta ne korelira z magnitudo oscilacij [Ca 2+ ]c, kakor bi morda intuitivno pričakovali. V odvisnosti od [cgmp] se namreč spreminja tudi frekvenca oscilacij [Ca 2+ ]c, kar zelo močno vpliva na povprečno vrednost [Ca 2+ ]c. Odvisnost frekvence oscilacij [Ca 2+ ]c prikazuje graf na sliki 25. Odvisnost frekvence od [cgmp] je predstavljena na intervalu [cgmp] med 2 in mol/m 3. Namreč pri 62

69 vrednostih [cgmp] < mol/m 3 je frekvenca oscilacij zelo velika in ob začetku oscilatornega režima znaša kar 580 min -1. Na področju [cgmp] od 2 do mol/m 3 frekvenca oscilacij pada, po drugi strani pa magnituda oscilacij narašča. Vpliv frekvence oscilacij je tako močan, da na tem intervalu povprečna vrednost [Ca 2+ ]c pada, kar je razvidno s slike 24 (zelena krivulja). Pri vrednostih [cgmp] > mol/m 3 prične frekvenca oscilacij ponovno naraščati, magnituda pa padati, kar skupaj rezultira v postopnem višanju povprečne vrednosti [Ca 2+ ]c v odvisnosti od [cgmp]. Obnašanje odvisnosti [Ca 2+ ]c,pov od [cgmp] nakazuje tudi vpliv [cgmp] na razvoj sile v GMC. Povprečna vrednost [Ca 2+ ]c namreč močno korelira s silo. Slika 24. Odvisnosti najmanjše ([Ca 2+ ]c,min), največje ([Ca 2+ ]c,max) in povprečne ([Ca 2+ ]c,pov) koncentracije [Ca 2+ ]c od [cgmp] v področju režima oscilacij 63

70 Slika 25. Odvisnost frekvence oscilacij [Ca 2+ ]c (ν) od [cgmp] Slika 26 prikazuje časovno odvisnost [Ca 2+ ]c pri dveh različnih konstantnih vrednostih [cgmp] za dva različna režima oscilacij v prvem je amplituda visoka, frekvenca pa nizka, v drugem pa je frekvenca visoka in amplituda nizka. Črna krivulja na sliki 26 predstavlja oscilacije [Ca 2+ ]c pri vrednosti [cgmp] = mol/m 3, kar ustreza drugemu režimu oscilacij, rdeča krivulja pa pri vrednosti mol/m 3, kar ustreza prvemu režimu oscilacij. V prvem režimu je povprečna koncentracija ([Ca 2+ ]c,pov) nižja kot v drugem. Oscilirajoči signal [Ca 2+ ]c je vhodni podatek za napoved razvoja časovno odvisne sile v GMC. Model, s katerim računamo od [Ca 2+ ]c odvisen razvoj sile, je predstavljen z enačbami (91)-(103). Vpliv Ca 2+ na razvoj sile je aktivacijski, saj se ob povišani vrednosti Ca 2+ le-ta v večji meri veže na protein CaM, kompleks Ca4CaM pa aktivira encim MLCK, ki katalizira fosforilacijo lahkih verig miozina. Le-ta je potrebna za pripetje miozinskih glav na aktinska vlakna in njihovo prepenjanje ter drsenje ob njih, kar generira silo v celici. Velikost sile predstavimo z odstotki relativno glede na maksimalno možno razvito silo pod vplivom zelo visoke koncentracije Ca 2+ (npr mol/m 3 ). Razvita sila je v modelu premo sorazmerna z deležem na aktin pripetih miozinskih glav. Pri bazalni 64

71 vrednosti [Ca 2+ ]c, ki se giblje okoli 0, mol/m 3, razvije celica okoli 10% maksimalne možne sile. V naših simulacijah je začetna vrednost sile postavljena kar na vrednost 0, nato prične naraščati. Po približno 2 minutah doseže svojo končno velikost, ki je odvisna od vhodnega signala kalcija. Slika 27 prikazuje časovno odvisnost sile za prej predstavljena signala [Ca 2+ ]c (slika 26). S te slike je razvidno, da se v primeru signala [Ca 2+ ]c z višjo frekvenco in nižjo amplitudo oscilacij razvije višja sila kot v primeru oscilacij z višjo amplitudo in nižjo frekvenco. Višja razvita sila ustreza nižji vrednosti [cgmp], nižja sila pa višji vrednosti [cgmp]. Sila zaradi oscilirajoče vrednosti [Ca 2+ ]c prav tako oscilira, vendar so oscilacije zglajene in imajo zelo majhno amplitudo, tako da lahko praktično rečemo, da se pod vplivom oscilirajočega signala [Ca 2+ ]c razvije praktično konstantna sila z majhnimi oscilacijami. Slika 26. Odvisnost [Ca 2+ ]c od časa (t) pri dveh različnih konstantnih vrednostih [cgmp] (3 in mol/m 3 ) 65